JPS63226288A - Novel gene, its manifestation plasmid dna and transformed microorganism - Google Patents
Novel gene, its manifestation plasmid dna and transformed microorganismInfo
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Abstract
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、新規遺伝子、その発現プラスミドDNA及び
形質転換微生物に関する。前記形質転換微生物を利用す
ると宿主中では木質的に比較的不安定な有用ポリペプチ
ドを効率良く生産して単離することができる。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION [Industrial Application Field] The present invention relates to a novel gene, its expression plasmid DNA, and transformed microorganisms. By using the transformed microorganism, useful polypeptides that are relatively lignically unstable in the host can be efficiently produced and isolated.
〔従来の技術〕
組換えDNA手法を用いて、ペプチドホルモンや酵素な
どのポリペプチドを、大腸菌、枯草菌、酵母などの微生
物細胞の利用により生産する方法は広く検討されてきて
いる。しかし、数多くの検討にもかかわらず、未だ幾か
の未解決の問題点を残しており、計画どおりのポリペプ
チドを生産して単離することは必ずしも容易ではない。[Prior Art] Methods for producing polypeptides such as peptide hormones and enzymes using microbial cells such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, and yeast have been widely studied using recombinant DNA techniques. However, despite numerous studies, there are still some unresolved problems, and it is not always easy to produce and isolate polypeptides as planned.
このような問題点の1つとして、宿主微生物細胞内には
本来存在しない異種ポリペプチドをコードする遺伝子を
その宿主細胞内で発現させた場合、生産されたポリペプ
チドが宿主細胞由来のプロテアーセにより分解されやす
いために、安定に生産されないという現象が見られるこ
とがある。One such problem is that when a gene encoding a heterologous polypeptide that does not naturally exist in host microbial cells is expressed in the host cell, the produced polypeptide may be degraded by host cell-derived proteases. Because of this, the phenomenon of unstable production may be observed.
このため、目的ポリペプチドの宿主細胞中での安定性を
強化する方法として、目的ポリペプチドをコートする遺
伝子を、宿主中で比較的安定に存在することが知られて
いる他のポリペプチドをコードする遺伝子と結合させ、
融合ポリペプチドとして発現させ、生産する方法が検討
されてきている。これらの方法では、生産された融合ポ
リペプチドから目的ポリペプチドの分離は、シアノケン
ブロマイド等を用いた化学的処理やトリプシン等の蛋白
質分解酵素を用いた処理によって実施している。ところ
が、目的ポリペプチド内にこれらの処理の基質となる切
断アミノ酸部位が存在すれば、その個所でペプチド鎖が
切断されてしまうので、計画どおりの目的ペプチドが得
られない。Therefore, as a way to enhance the stability of a polypeptide of interest in host cells, one method is to replace the gene encoding the polypeptide of interest with one that encodes another polypeptide that is known to exist relatively stably in the host. Combined with the gene that
Methods of expressing and producing fusion polypeptides have been studied. In these methods, separation of the target polypeptide from the produced fusion polypeptide is carried out by chemical treatment using cyanocene bromide or the like or treatment using a proteolytic enzyme such as trypsin. However, if a cleavage amino acid site that serves as a substrate for these treatments exists in the target polypeptide, the peptide chain will be cleaved at that location, making it impossible to obtain the target peptide as planned.
ところで、コラゲナーゼは、動物組織由来のコラーゲン
またはその変性物であるゼラチンを特異的に分解するペ
プチダーゼとして知られており、クロストリジウム(C
lostridium)属例えばクロストリジラム・ヒ
ストリチカム (C,…旦1処江叩)及びクロストリジ
ウム・ベルフリゲンス(旦。By the way, collagenase is known as a peptidase that specifically decomposes collagen derived from animal tissues or gelatin, which is a denatured product thereof, and
lostridium) genera, such as Clostridium histolyticum (C,...Dan1shojiang) and Clostridium verfrigerens (Dan1.
ハ這頂1ius )の菌体外から容易に人手することが
できる(voshida、 E、等、Biochim、
BiophS、Acta+105.562.1965)
。この酵素には免疫的に同質の2種のアイソザイム(コ
ラゲナーゼI及び■)が知られている。いずれも基質特
異性が高く、−プロリン−X−グリシン−プロリン−(
Xは任意のアミノ酸残基)のXとグリシンとの間のペプ
チド結合を特異的に加水分解することが知られている。can be easily manually harvested from outside the bacterial cell (Voshida, E., etc., Biochim,
BiophS, Acta+105.562.1965)
. Two immunologically homogeneous isozymes (collagenase I and ■) are known for this enzyme. Both have high substrate specificity, -proline-X-glycine-proline-(
It is known that the peptide bond between X and glycine (X is any amino acid residue) can be specifically hydrolyzed.
このため、融合ポリペプチドの加水分解にコラゲナーゼ
を用いる試みもこれまでに行なわれており、Germi
noらは、大腸菌プラスミドR6にの複製開始因子であ
るπ蛋白質をコードするシストロン遺伝子とβ−ガラク
トシダーゼをコードするIac’Z遺伝子との間にプロ
α2コラーゲン遺伝子の断片を挿入し、融合蛋白質を発
現させた後でコラゲナーゼ処理することにより、π蛋白
質を単離している(Germino、J、等、 Pro
、Natl、^cad、sci、UsA+81+469
2、1984)。For this reason, attempts have been made to use collagenase to hydrolyze fusion polypeptides, and Germi
No et al. inserted a fragment of the pro-α2 collagen gene between the cistron gene encoding the π protein, which is a replication initiation factor, and the Iac'Z gene encoding β-galactosidase into E. coli plasmid R6, and expressed the fusion protein. The π protein is isolated by treatment with collagenase (Germino, J. et al., Pro
, Natl, ^cad, sci, UsA+81+469
2, 1984).
〔発明が解決しようとする問題点〕
しかしながら、このGerminoの方法では、約25
0bpのプロα2コラ−ケン遺伝子の断片を挿入し7て
いるために本来のπ蛋白質のアミノ酸配列のC末端に少
なくとも5個のアミノ酸残基が付加した蛋白質が得られ
てしまい、結果的に天然型の蛋白質と異なる一次構造を
持つ蛋白質が生産されていた。[Problem to be solved by the invention] However, with this Germino method, approximately 25
By inserting a 0 bp fragment of the pro-α2 kolaken gene, a protein with at least 5 amino acid residues added to the C-terminus of the original π protein amino acid sequence was obtained, resulting in a protein with at least 5 amino acid residues added to the C-terminus of the original π protein amino acid sequence. A protein with a primary structure different from that of the original protein was produced.
従って、本発明の目的は、生産すべきポリペプチド構造
のC末端またはN末端がコラゲナーゼ切断部位となるよ
うな融合ポリペプチドをコードする遺伝子を提供し、こ
の遺伝子を微生物細胞内で発現させて融合ポリペプチド
を生成させ、続いてこれをコラゲナーゼ処理することに
より、目的の分子構造を持ったポリペプチドを容易にし
がも正確に生産できる手段を提供することにある。Therefore, an object of the present invention is to provide a gene encoding a fusion polypeptide in which the C-terminus or N-terminus of the polypeptide structure to be produced serves as a collagenase cleavage site, and to express this gene in microbial cells to perform fusion. The object of the present invention is to provide a means for easily and accurately producing a polypeptide having a desired molecular structure by producing a polypeptide and subsequently treating the polypeptide with collagenase.
前記の目的は、本発明により、一般式
%式%
(ここで、AおよびCはそれぞれ2個以上のアミノ酸残
基を持つポリペプチドを示し、Bは1個のアミノ酸残基
を示し、−はペプチド結合を示し、そしてプロリンはL
型であるものとする)で示されるポリペプチド′をコー
トする遺伝子、その遺伝子を含む発現プラスミドDNA
、及びその発現プラスミドによって形質転換された微生
物によって達成することができる。The above objective is achieved according to the present invention by the general formula % formula % (where A and C each represent a polypeptide with two or more amino acid residues, B represents one amino acid residue, and - indicates a peptide bond, and proline is L
A gene that coats the polypeptide' shown in
, and a microorganism transformed with its expression plasmid.
本発明による前記の遺伝子は、特には、生成ずべき目的
ポリペプチドをコートする遺伝子と、宿主中で比較的安
定に存在することが知られている他のポリペプチドをコ
ードする遺伝子との間に、コラ−ケン以外の天然ポリペ
プチド内にはほとんど切断部位の存在しないコラゲナー
ゼ切断部位を有するポリペプチドをコードするDNA断
片を挿入して連結させた構造の遺伝子である。この遺伝
子を含有しそして微生物内で発現させることのできる発
現プラスミドを作成し、更にこの発現ブラスミドを保持
する微生物を製造し、この微生物を培養して融合ポリペ
プチドを生成し、その生成物をコラゲナーゼ処理すると
、目的とするポリペプチドを得ることができる。The above-mentioned gene according to the present invention is particularly provided between a gene encoding a target polypeptide to be produced and a gene encoding another polypeptide known to exist relatively stably in the host. This gene has a structure in which a DNA fragment encoding a polypeptide having a collagenase cleavage site, which is almost absent in natural polypeptides other than Kolaken, is inserted and linked. An expression plasmid containing this gene and capable of expression in a microorganism is created, a microorganism carrying this expression plasmid is produced, the microorganism is cultured to produce the fusion polypeptide, and the product is synthesized by collagenase. Upon treatment, the desired polypeptide can be obtained.
以下、本発明を更に詳細に説明する。The present invention will be explained in more detail below.
本明細書において、アミノ酸、核酸塩基、その他に関し
て略号で表示する場合はItlPACの規定あるいは当
該分野における慣用記号に従う。その例を次に挙げる。In this specification, when amino acids, nucleobases, etc. are indicated by abbreviations, they follow the ItlPAC regulations or common symbols in the field. Here are some examples:
Ser : L−セリン、 Leu : L−ロイシ
ン、Arg:17−アルギニン、Cys:L−システィ
ン、Gln:■7−グルタミン、Tle:I−−イソロ
イシン。Ser: L-serine, Leu: L-leucine, Arg: 17-arginine, Cys: L-cysteine, Gln: ■7-glutamine, Tle: I--isoleucine.
Pro:I−−プロリン、Val:T、−バリン、Hi
s:L−ヒスチジン、 Met : T、、−メチオ
ニン、^la:17−lミニ1フーアラニン : 1.
、−フェニルアラニン。Pro: I--proline, Val: T,-valine, Hi
s: L-histidine, Met: T,, -methionine, ^la: 17-l mini 1-fualanine: 1.
, -phenylalanine.
c+y ニゲリシン、Asp:L−アスパラギン酸。c+y nigericin, Asp: L-aspartic acid.
^sn : L、−アスパラギン、Glu:L−グルタ
ミン酸、Trp:L−)リプトファン、Thr:T、−
スレオニン、Tyr:L−チロシン、X:上記アミノ酸
のいずれか1つ。^sn: L, -asparagine, Glu: L-glutamic acid, Trp: L-) liptophan, Thr: T, -
Threonine, Tyr: L-tyrosine, X: any one of the above amino acids.
:アデニン、T:チミン、Gニゲアニン、C:シトシン
、DNA :デオキシリポ核酸、RNA :リボ核酸、
ATP :アデノシンニリン酸。: adenine, T: thymine, Gnigeanine, C: cytosine, DNA: deoxyliponucleic acid, RNA: ribonucleic acid,
ATP: adenosine diphosphate.
dATP :デオキシアデノシン三すン酸、 dCTP
:デオキシシトシン三すン酸、 dGTP :デオキ
シグアニン三すン酸、 dTTP :デオキシチミン三
リン酸。dATP: Deoxyadenosine trisstate, dCTP
: deoxycytosine trisunate, dGTP: deoxyguanine trisunate, dTTP: deoxythymine trisphosphate.
ddATP ニジデオキシアデノシンニリン酸、dd
CTP ニジデオキシシトシン:リン酸、ddGTP
ニジデオキシグアニン三リン酸、ddTTP ニ
ジデオキシチミン三リン酸。ddATP Nidideoxyadenosine diphosphate, dd
CTP Nidideoxycytosine: phosphate, ddGTP
Nidideoxyguanine triphosphate, ddTTP Nidideoxythymine triphosphate.
bp:塩基対、t+bp:キロ塩基対、KDa:キロダ
ルトン、hCT:ヒト力ルシトニンit伝子、 HPl
、C:高速液体クロマトグラフィー、 RDTA :エ
チレンジアミンテトラ酢酸ナトリウム塩。bp: base pair, t+bp: kilobase pair, KDa: kilodalton, hCT: human lucitonin it gene, HPl
, C: High Performance Liquid Chromatography, RDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid sodium salt.
また、遺伝子の表示は、慣用的に用いられている方法に
従った(Bachmann、 B、J、 + Micr
obiol 、Rev。In addition, genes were displayed according to the conventionally used method (Bachmann, B, J, + Micr.
obiol, Rev.
47.180,1983.Mortimer、R,に、
等、旧crobio1.Rev。47.180, 1983. Mortimer, R.
etc., old crobio1. Rev.
49.18L1985)。49.18L1985).
前記のとおり、本発明に係る遺伝子は、C末端またはN
末端にコラゲナーゼ切断アミノ酸配列を持つポリペプチ
ドをコードする。従って、生産目的のポリペプチド−次
構造は、コラゲナーゼ切断アミノ酸配列を構成するのに
適した末端アミノ酸配列を持つものが好ましい。つまり
、目的ポリペプチドのC末端は−Pro−Xであり、N
末端はGly−Pro−であることが好ましい。このよ
うな末端アミノ酸配列を持ち、しかも工業的に有用なポ
リペプチドは数多く知られている。例えば、以下のよう
なポリペプチドがある。As mentioned above, the gene according to the present invention has a C-terminus or an N-terminus.
It encodes a polypeptide with a collagenase-cleaved amino acid sequence at the end. Therefore, the polypeptide-substructure to be produced preferably has a terminal amino acid sequence suitable for constructing a collagenase-cleaved amino acid sequence. In other words, the C-terminus of the target polypeptide is -Pro-X, and N
The terminus is preferably Gly-Pro-. Many industrially useful polypeptides having such terminal amino acid sequences are known. For example, there are the following polypeptides.
Crが−Pro−Xのポリペプチド
(I)血管収縮または血圧上昇薬として使用できるアン
ジオテンシン■(ウマ由来)
Asp−Arg−Val−Tyr−T 1e−His−
Pro−Phe(L、T、Skeggs等、 J、Ex
ptl 、Med、 、 106.439.1957)
(2)r[[l圧降下剤として知られているアンジオテ
ンシン■拮抗剤
5er−八rg−Val−Tyr−Val−11is−
Pro−^1a(3)、アンジオテンシン■
Arg−Val−Tyr−11e−llis−Pro−
Phe(Camphell、W、R,等、 5cien
ce、184,994.1974)(4)高カルシウム
血症治療薬として知られるカルシトニンのC末端グリシ
ン付加体(C末端アミド化のための前駆体)
(ヒト)
Cys−Gly−^sn−Leu−3er−Thr−C
ys−Met−Leu−Gly−Thr−Tyr−Th
r−Gln−^5p−Phe−^qn−1,ys−Ph
e−1(is−Thr−Phe−Pro−Gln−Th
r−Ala−11e−Gly−Val−Gly−^1a
−Pro−ly
(ブタ)
Cys−5er−^5n−1.eu−3er−Thr−
Cys−Val−Leu−5er−^1a−Tyr−T
rp−Arg−^5n−Leu−へ5n−Asn−Ph
e−旧s−Arg−Phe−Ser−Gly−Met−
G Iy−Phe−G l y−Pro−G Iu−T
hr−Pro−l5I
(ウシ)
Cys−3er−八5n−Leu−3er−Thr−C
ys−Val−Leu−5er−^1a−Tyr−Tr
p−Lys−Asp−Leu−Asn−^5n−Tyr
−His−^rg−Phe−5er−G Iy−Me
t−G ly−Phe−G Iy−Pro−G l u
−Thr−Pro−ty
(サケ)
Cys−3er−^5n−Leu−3er−Thr−C
ys−Val−1,eu−Gly−Lys−1,eu−
3er−Gln−Glu−Leu−旧5−Lys−Le
u−Gln−Thr−Tyr−Pro−^rg−Thr
−Asn−Thr−Gly−3er−Gly−Thr−
Pro−Gly
(ウナギ)
Cys−3er−Asn−1,eu−5er−Thr−
Cys−Va l −1,eu−G I y−1、ys
−Leu−5er−Gln−Glu−Leu−旧s−1
,ys−Leu−Gln−Thr−Tyr−Pro−A
rg−Thr−Asp−Va I−Gly−A Ia−
Gly−Thr−Pro−Gly
(トリ)
Cys−八Ia−5er−Leu−3er−Thr−C
ys−シal−Leu−Gly−Lys−Leu−5e
r−G I n−G lu−Leu−His−Lys−
Leu−G I n−Thr−Tyr−Pro−^rg
−Thr−Asp−Val−Gly−八Ia−Gly−
Thr−Pro−ly
(Lasmoles、F、等、 PRBS Iett、
180,113.1985)(5)メラニン細胞刺激作
用を持つメラニン細胞刺激ホルモン、α−MSH
Ser−Tyr−3er−Met−Glu−11is−
Phe−八rg−Trp−Gly−1、ys−Pro−
Val
(llarris、J、1.+等、 Nature、
179.1346.1957)(6)メラニン細胞刺激
ホルモン、β−MSH(ツノザメ)
Asp−Gly−Asp−八5p−Tyr−I、ys−
Phe−Gly−His−Phe−^rg−Trp−5
er−シal−Pro−Leu(Bennet+)1.
P、J、、等、 Biochem、J、 、 14L
439.1974)(7)トリプシンインヒヒター
(ヒト)
へ5p−3er−Leu−Gly−八rg−Glu−^
Ia−Lys−Cys−Tyr−八5n−Glu−Le
u−AsnへGl y−4:ys−Thr−Lys−r
le−Tyr−Asn−Pro−Val−Cys−Gl
y−Thr−八5p−Gly−Asp−Thr−Tyr
−Pro−八5n−Glu−Cys−νal−1、eu
−Cys−Phe−Glu−Asn−Arg−1,ys
−八rg−Gln−Thr−5er−Tle−1,eu
−Tle−Gln−I、ys−5er−Gly−Pro
−Cy3
(Bartel t、 n、c、 、等、 Arch、
Biochem、Biophys、。Polypeptide (I) in which Cr is -Pro-X Angiotensin (derived from horses) that can be used as a vasoconstrictor or blood pressure increasing drug Asp-Arg-Val-Tyr-T 1e-His-
Pro-Phe (L, T, Skeggs et al., J, Ex
ptl, Med, 106.439.1957)
(2) r[[lAngiotensin ■ antagonist 5er-8rg-Val-Tyr-Val-11is-
Pro-^1a (3), angiotensin■ Arg-Val-Tyr-11e-llis-Pro-
Phe (Camphell, W, R, et al., 5cien
ce, 184,994.1974) (4) C-terminal glycine adduct of calcitonin (precursor for C-terminal amidation) known as a hypercalcemia therapeutic agent (human) Cys-Gly-^sn-Leu- 3er-Thr-C
ys-Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-Th
r-Gln-^5p-Phe-^qn-1,ys-Ph
e-1(is-Thr-Phe-Pro-Gln-Th
r-Ala-11e-Gly-Val-Gly-^1a
-Pro-ly (pig) Cys-5er-^5n-1. eu-3er-Thr-
Cys-Val-Leu-5er-^1a-Tyr-T
rp-Arg-^5n-Leu- to 5n-Asn-Ph
e-old s-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-
G Iy-Phe-G ly-Pro-G Iu-T
hr-Pro-15I (Cow) Cys-3er-85n-Leu-3er-Thr-C
ys-Val-Leu-5er-^1a-Tyr-Tr
p-Lys-Asp-Leu-Asn-^5n-Tyr
-His-^rg-Phe-5er-G Iy-Me
t-G ly-Phe-G Iy-Pro-G lu
-Thr-Pro-ty (Salmon) Cys-3er-^5n-Leu-3er-Thr-C
ys-Val-1, eu-Gly-Lys-1, eu-
3er-Gln-Glu-Leu-old 5-Lys-Le
u-Gln-Thr-Tyr-Pro-^rg-Thr
-Asn-Thr-Gly-3er-Gly-Thr-
Pro-Gly (eel) Cys-3er-Asn-1, eu-5er-Thr-
Cys-Va l-1, eu-G I y-1, ys
-Leu-5er-Gln-Glu-Leu-old s-1
,ys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-A
rg-Thr-Asp-Va I-Gly-A Ia-
Gly-Thr-Pro-Gly (Bi) Cys-8Ia-5er-Leu-3er-Thr-C
ys-sial-Leu-Gly-Lys-Leu-5e
r-G I n-G lu-Leu-His-Lys-
Leu-G I n-Thr-Tyr-Pro-^rg
-Thr-Asp-Val-Gly-8Ia-Gly-
Thr-Pro-ly (Lasmoles, F., et al., PRBS Iett,
180, 113.1985) (5) Melanocyte stimulating hormone with melanocyte stimulating effect, α-MSH Ser-Tyr-3er-Met-Glu-11is-
Phe-8rg-Trp-Gly-1, ys-Pro-
Val (llarris, J., 1. + et al., Nature,
179.1346.1957) (6) Melanocyte stimulating hormone, β-MSH (horn shark) Asp-Gly-Asp-85p-Tyr-I, ys-
Phe-Gly-His-Phe-^rg-Trp-5
er-Sial-Pro-Leu (Bennet+)1.
P, J, et al., Biochem, J, , 14L
439.1974) (7) Trypsin inhibitor (human) to 5p-3er-Leu-Gly-8rg-Glu-^
Ia-Lys-Cys-Tyr-85n-Glu-Le
Gly to u-Asn y-4:ys-Thr-Lys-r
le-Tyr-Asn-Pro-Val-Cys-Gl
y-Thr-85p-Gly-Asp-Thr-Tyr
-Pro-85n-Glu-Cys-νal-1, eu
-Cys-Phe-Glu-Asn-Arg-1,ys
-8rg-Gln-Thr-5er-Tle-1,eu
-Tle-Gln-I, ys-5er-Gly-Pro
-Cy3 (Bartel t, n, c, , etc., Arch,
Biochem, Biophys.
179、189.1977)
(ウシ)
Asn−11e−Leu−Gly−へrg−Glu−へ
Ia−Lys−Cys−Thr−Asn−G 1 u−
Va l−Asn−G Iy−Cys−Pro−Arg
−T 1 e−Tyr −ASn−Pro−Val−C
ys−Gly−Thr−^5p−Gly−Val−Th
r−Tyr−3er−^5n−G Iu−Cys −L
eu−Leu−Cys−Met−G Iu−Asn−L
ys−G lu−八rg−GIn−Thr−Pro−V
aI−1,p、u−Ele−GIn−1,ys−Set
−GIy−Pro−Cys
(Greene、L、J、等、 J、Biol、Che
m、244,2646.1969)(8)カルシウム放
出作用のある副甲状腺ホルモン
(ブタ)
Ser−VaI−5er−Glu−rle−Gln−L
eu−Met−旧S−へ5n−Leu−Gly−[、y
s−His−Leu−5er−3er−Leu−Glu
−八rg−VaLGln−Trp−Leu−^rg−L
ys−Lys−Leu−Gln−Asp−シミl−11
is−Asn−Phe−Va I−A 1a−Leu−
G 1y−A Ia−3er−I Ie−Va 1−H
is−八rg−^sp−Gly−Gly−5er−Gl
n−Arg−Pro−八rg−1,ys−Lys−Gl
u−Asp−^5n−Val−Leu−Val−Glu
−3er−旧5−Gln−1,ys−5er−Leu−
Gly−Glu−Ala−Asp−1,ys−へ1a−
八1a−シa1−八5p−Val−Leu−11e−L
ys−Ala−Lys−1”ro−Gln(Brewe
r、H,R,等 、八mer、J0Med、、56,7
59.1974)(9)回避行動誘起下垂体ペプチド
(ブタ)
Cys−Tyr−Phe−Gln−Asn−Cys−P
ro−1,ys(Lande、 S、 、等、 J 、
Riol、Chem、 、 246.2058.197
1)(I0)プロインシュリンCペプチド
(ウシ)
G 1u−Val−G Iu−G Iy−Pro−Gl
n−Val、−G Iy−A Ia−1,eu−G I
u−1,eu−A 1a−G 1y−G 1y−Pr
o−Gly−A 1a−G 1y−G ly−Leu−
Glu−Gly−Pro−Pro−Gln(Salok
angas、A、等、Eur、J、旧ochem、、2
0,183゜N末圀麦m律印三■粉るポリペプチド
(I1)細胞成長促進因子として知られるインシュリン
様成長因子■
Gly−Pro−Glu−Thr−Leu−Cys−G
ly−八I a −G I u−L e u −Val
−へsp−へ1a−Leu−Gln−Phe−Val−
Cys−Gly−Asp−八rg−Gly−Phe−T
yr−Phe−八5n−Lys−Pro−Thr−Gl
y−Tyr−Gly−3er−5er−5er−へrg
−へrR−へIa−Pro−Gln−Thr−Gly−
11e−Val−^5p−Glu−Cys−Cys−P
he−^rIX−5er−Cys−Asp−1,eu−
Arg−Arg−Leu−G I u−Me 1.−T
yr−Cys−A la−Pro−1,eu−1,ys
−Pro−Ala4.ys−5er−Ala(Rin
derknecht、 E、等、 Proc、Natl
、Acad、Sci、llSへ。179, 189.1977) (Bovine) Asn-11e-Leu-Gly- to rg-Glu- to Ia-Lys-Cys-Thr-Asn-G 1 u-
Val-Asn-G Iy-Cys-Pro-Arg
-T 1 e-Tyr -ASn-Pro-Val-C
ys-Gly-Thr-^5p-Gly-Val-Th
r-Tyr-3er-^5n-G Iu-Cys-L
eu-Leu-Cys-Met-G Iu-Asn-L
ys-Glu-8rg-GIn-Thr-Pro-V
aI-1,p,u-Ele-GIn-1,ys-Set
-GIy-Pro-Cys (Greene, L, J, et al., J, Biol, Che
m, 244, 2646.1969) (8) Parathyroid hormone with calcium-releasing action (pig) Ser-VaI-5er-Glu-rle-Gln-L
5n-Leu-Gly-[,y
s-His-Leu-5er-3er-Leu-Glu
-8rg-VaLGln-Trp-Leu-^rg-L
ys-Lys-Leu-Gln-Asp-Simi l-11
is-Asn-Phe-Va I-A 1a-Leu-
G 1y-A Ia-3er-I Ie-Va 1-H
is-8rg-^sp-Gly-Gly-5er-Gl
n-Arg-Pro-8rg-1,ys-Lys-Gl
u-Asp-^5n-Val-Leu-Val-Glu
-3er-old 5-Gln-1,ys-5er-Leu-
1a- to Gly-Glu-Ala-Asp-1,ys-
81a-shea1-85p-Val-Leu-11e-L
ys-Ala-Lys-1”ro-Gln(Brewe
r,H,R,etc.,ocmer,J0Med,,56,7
59.1974) (9) Avoidance behavior-inducing pituitary peptide (pig) Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-P
ro-1,ys (Lande, S., et al., J.
Riol, Chem, 246.2058.197
1) (I0) Proinsulin C peptide (bovine) G 1u-Val-G Iu-G Iy-Pro-Gl
n-Val, -G Iy-A Ia-1, eu-G I
u-1, eu-A 1a-G 1y-G 1y-Pr
o-Gly-A 1a-G 1y-G ly-Leu-
Glu-Gly-Pro-Pro-Gln (Salok
angas, A, et al., Eur, J, old ochem,,2
0,183゜N Suekuni Mugi m Ritsuin 3■Kowal Polypeptide (I1) Insulin-like growth factor known as a cell growth promoting factor■ Gly-Pro-Glu-Thr-Leu-Cys-G
ly-8I a -G I u-L e u -Val
-hesp-he1a-Leu-Gln-Phe-Val-
Cys-Gly-Asp-8rg-Gly-Phe-T
yr-Phe-85n-Lys-Pro-Thr-Gl
y-Tyr-Gly-3er-5er-5er-to rg
-herR-heIa-Pro-Gln-Thr-Gly-
11e-Val-^5p-Glu-Cys-Cys-P
he-^rIX-5er-Cys-Asp-1, eu-
Arg-Arg-Leu-GIu-Me 1. -T
yr-Cys-A la-Pro-1,eu-1,ys
-Pro-Ala4. ys-5er-Ala(Rin
derknecht, E, etc., Proc, Natl
, Acad, Sci, llS.
73,4379.1976)
(I2)膵臓ポリペプチド
(トリ)
Gly−Pro−3et−Gln−Pro−Thr−T
yr−Pro−Gly−Asp−Asp−A 1a−P
ro−Va I−Glu−Asp−Leu−11e−A
rg7Phe−Tyr−^sp−^5n−Leu−Gl
n−Gln−Tyr−1,eu−八sn−νal−νa
l−Thr−^rg−旧s−Arg−Tyr
(Kimmel、J、R,等、 J、Riol、Che
m、、250,9369 。73, 4379.1976) (I2) Pancreatic polypeptide (chicken) Gly-Pro-3et-Gln-Pro-Thr-T
yr-Pro-Gly-Asp-Asp-A 1a-P
ro-Va I-Glu-Asp-Leu-11e-A
rg7Phe-Tyr-^sp-^5n-Leu-Gl
n-Gln-Tyr-1, eu-8sn-νal-νa
l-Thr-^rg-old s-Arg-Tyr (Kimmel, J, R, et al., J, Riol, Che
m,,250,9369.
以上に例示したC末端に−Pro−Xを持つポリペプチ
ドまたはN末端にGly−Pro−を持つポリペプチド
′について、コラゲナーゼ切断アミノ酸配列を介して他
のポリペプチドとの融合ポリペプチドをコードする遺伝
子を設計する。この場合、連結されるポリペプチドは、
各宿主で安定に生産されるポリペプチドであればその種
類は問わない。一般に、宿主細胞自身が多量に生産する
ポリペプチドが用いられる。例えば、宿主を大腸菌とし
た場合では、β−ガラクトシダーゼ、ガラクトキナーゼ
、デスチオビオチン合成酵素などを例示でき、また宿主
を酵母とした場合では、グルタルアルデヒド3リン酸デ
ヒドロゲナーゼ、ガラクトキナーゼなどを例示できる。A gene encoding a fusion polypeptide with another polypeptide via a collagenase-cleaved amino acid sequence for the above-exemplified polypeptides having -Pro-X at the C-terminus or polypeptides having Gly-Pro- at the N-terminus. design. In this case, the polypeptides to be linked are
The type of polypeptide does not matter as long as it is stably produced in each host. Generally, polypeptides that are produced in large quantities by the host cells themselves are used. For example, when the host is Escherichia coli, examples include β-galactosidase, galactokinase, and desthiobiotin synthase, and when the host is yeast, examples include glutaraldehyde triphosphate dehydrogenase and galactokinase.
また、C末端に−Pro−’Xを持つポリペプチドとN
末端にGly−Pro−を持つポリペプチドとを融合し
てもかまわない。In addition, polypeptides with -Pro-'X at the C-terminus and N
It may be fused with a polypeptide having Gly-Pro- at the end.
この融合ポリペプチドをコードする遺伝子のDNA塩基
配列は、各アミノ酸残基に対応する以下にボしたDNA
塩基配列から任意に選択することができる。The DNA base sequence of the gene encoding this fusion polypeptide is the DNA shown below corresponding to each amino acid residue.
It can be arbitrarily selected from the base sequences.
Phc: TTT、TTC。Phc: TTT, TTC.
1、eu : TTA、TTG、CTT、CTC,
CTA、CTG。1, eu: TTA, TTG, CTT, CTC,
CTA, CTG.
+1e : ATT、ATC,AT′A。+1e: ATT, ATC, AT'A.
Met:^TG。Met: ^TG.
Vat : GTT、GTC,GTA、GTG。Vat: GTT, GTC, GTA, GTG.
Ser : TCT、 TCC,TCA、 TCG、
AGT、 AGC。Ser: TCT, TCC, TCA, TCG,
AGT, AGC.
Pro : CCT、CCC,CCA、CCG。Pro: CCT, CCC, CCA, CCG.
Thr : 八CT、ACC,ACA、ACG。Thr: 8CT, ACC, ACA, ACG.
Ala : GCT、GCC,GCA、GCG。Ala: GCT, GCC, GCA, GCG.
Tyr : TAT、TAC。Tyr: TAT, TAC.
旧s : CAT、CAC。Old s: CAT, CAC.
Gin : CAA、CAG。Gin: CAA, CAG.
八sn : AAT、^AC。8th sn: AAT, ^AC.
1、ys :^^A、AAG。1, ys: ^^A, AAG.
Asp : GAT、GAC。Asp: GAT, GAC.
Gb+ : GAA、GAG。Gb+: GAA, GAG.
Cys : TGT、TGC。Cys: TGT, TGC.
Trp : TGG。Trp: TGG.
Arg : CGT、CGC,CGA、CGG、A
GA、AGG。Arg: CGT, CGC, CGA, CGG, A
GA, AGG.
cry : GGT、GGC,GGA、GGG 0前
記一般式(I)の融合ポリペプチドをコードする遺伝子
は、自然界からクローニングされた遺伝子の一部を充当
しても、または化学合成したDNA断片を充当しても良
い。多くの場合、コラゲナーゼ切断部位周辺に相当する
遺伝子には適当な制限酵素部位がないので、合成りNA
の挿入によって構成される。cry: GGT, GGC, GGA, GGG 0 The gene encoding the fusion polypeptide of general formula (I) may be a part of a gene cloned from nature or a chemically synthesized DNA fragment. It's okay. In many cases, the gene corresponding to the collagenase cleavage site does not have a suitable restriction enzyme site, so synthetic NA
Constructed by inserting .
合成T)NAは、ホスホアミダイド法またはホスホトリ
エステル法のいずれによっても良好に造成することがで
きるが、ホスホアミダイド法を用いたDNA自動合成機
による合成が一般的である。Synthesis T) NA can be successfully produced by either the phosphoamidide method or the phosphotriester method, but synthesis using an automatic DNA synthesizer using the phosphoamidide method is common.
DNAは1本鎖として合成されるので、常に相補鎖を合
成してアニーリングし、2本鎖DNAとして遺伝子とし
て用いる。Since DNA is synthesized as a single strand, complementary strands are always synthesized and annealed, and double-stranded DNA is used as a gene.
上述のようにして得られた本発明に係る遺伝子は、5′
未満と3′未満に適当な制限酵素部位を付加することに
より、大腸菌プラスミドptlc118またはpRI?
322などに容易にサブクローニングできる。The gene according to the present invention obtained as described above has a 5'
By adding appropriate restriction enzyme sites at the 3′ and 3′ ends of the E. coli plasmid ptlc118 or pRI?
It can be easily subcloned into, for example, 322.
さらに、それらのプラスミドを持つ大腸菌を培養した後
にプラスミドDNAを抽出して精製することによって容
易に該遺伝子を多量に得ることができる。Furthermore, the genes can be easily obtained in large amounts by culturing E. coli containing these plasmids and then extracting and purifying the plasmid DNA.
次に、本発明に係る遺伝子を、各宿主において開発され
ている発現ベクターの発現プロモーターの下流に連結す
ることにより、本発明に係る発現プラスミドDNAを得
ることができる。発現ベクターと本発明に係る遺伝子と
の連結は、従来公知の各種の方法、例えば、適当な制限
酵素の反応で適当に切断して得られたDNA断片をT4
DNAリガーゼで連結する方法などで行なうことができ
る。この場合に、発現効率を良くするなどの目的で、発
現ベクターと本発明に係る遺伝子との結合部分で、DN
Aの一部分を除去しても良いし、または適当なリンカ−
を挿入しても良い。さらに、翻訳開始のATG配列やS
D配列が必要な場合には、相当するDNA配列を挿入し
ても良い。これらに使用するDNA配列はDNA化学合
成により容易に得ることができる。Next, the expression plasmid DNA of the present invention can be obtained by ligating the gene of the present invention downstream of the expression promoter of the expression vector developed for each host. The expression vector and the gene according to the present invention can be linked by various conventionally known methods, for example, by appropriately cleaving the obtained DNA fragment with a reaction with an appropriate restriction enzyme.
This can be accomplished by a method such as ligation using DNA ligase. In this case, for the purpose of improving expression efficiency, etc., DN
You may remove part of A or use a suitable linker.
You may also insert . Furthermore, the ATG sequence of translation initiation and S
If a D sequence is required, a corresponding DNA sequence may be inserted. The DNA sequences used for these can be easily obtained by DNA chemical synthesis.
発現ベクターとしては、大腸菌糸、枯草菌系および酵母
系で開発されている発現ベクター系を使用することがで
きる。As the expression vector, expression vector systems developed for E. coli hyphae, Bacillus subtilis system, and yeast system can be used.
大腸菌糸の発現ベクター系としては、pOMPoまたは
pOP95−13(0,Mercerau−Puija
lon等、Nature。Expression vector systems for E. coli hyphae include pOMPo or pOP95-13 (0, Mercerau-Puija
lon et al., Nature.
275、505.1978)などの発現ベクターで代表
されるIacプロモーター系、p■223−3(I1,
八、de Boer等、Proc、Natl、Acad
、Sci、[ISA、80,21.1983)またはp
DR540(D、R,Ru5se1等、Gene、 2
0.231.1982)などの発現ベクターで代表され
るtacプロモーター系、ptrpLl (J、CJd
man等、Nature、291,503.1981)
またはpBN37(T、H,Frazer等、 Pro
c、Natl、八cad、Sci 、USA 。275, 505.1978), p223-3 (I1,
8. de Boer et al., Proc. Natl., Acad.
, Sci, [ISA, 80, 21.1983) or p
DR540 (D, R, Ru5se1 etc., Gene, 2
tac promoter system, typified by expression vectors such as ptrpLl (J, CJd
man et al., Nature, 291, 503.1981)
or pBN37 (T, H, Fraser et al., Pro
c, Natl, 8cad, Sci, USA.
75、5936.1978)などの発現ベクターで代表
されるtrpプロモーター系、pKT279(K、Ta
lmadge等、Proc、Natl、Acad、Sc
i、1ISA、77.398El、1980)またはp
KT287(K、Talmadge 等、 Proc
、Natl 、Acad、Sci、USA。75, 5936.1978), pKT279 (K, Ta
lmadge etc., Proc, Natl, Acad, Sc
i, 1ISA, 77.398El, 1980) or p
KT287 (K, Talmadge et al., Proc.
, Natl, Acad, Sci, USA.
77.3369.1980)などの発現ベクターで代表
されるbaaプロモーター系、pMl1621 (T、
Maniatis+Mo1ecular Clonin
g、 Co1d Spring 1larhor La
b。77.3369.1980), pMl1621 (T,
Maniatis+Mo1ecular Clonin
g, Co1d Spring 1larhor La
b.
1982)で代表されるompプロモーター系、plN
−1またはp1M4(V、Masui等、Experi
mentalManipulation of Gen
e Expression、 M、Inouye編。omp promoter system represented by (1982), plN
-1 or p1M4 (V, Masui et al., Experi
mentalManipulation of Gen
e Expression, edited by M. Inouye.
p15.^cademic Press、1983)な
どの発現ベクターで代表されルT、、 p pプロモー
ター系、pMCR−545(T 。p15. pMCR-545 (T), pMCR-545 (T), p p promoter system, pMCR-545 (T), pMCR-545 (T), pp promoter system, pMCR-545 (T), etc.
旧ki等、Mo1.Gen、Genet、 183.2
5.1981)で代表されるrecAプロモーター系等
を使用することができる。Old ki et al., Mo1. Gen, Genet, 183.2
5.1981) can be used.
枯争閑の発現ベクターとしては、ペニシリナーセのプロ
モーターを用いたpenP(D、Henner等、2n
d rnt、conferenceof Geneti
c、s and旧otech−nology of B
acilli、1983) 、(X−アミラーゼ遺伝子
のプロモーターとシグナルペプチド遺伝子領域を用いた
pKTII93(T、Pa1va等、Gene、 22
.229.1983)またはペニシリナーゼのプロモー
ターとシグナルペプチド遺伝子を用いた発現ベクター(
S、Chang等、Mo1ecular Clonin
g and Gene Regulation in+
1aci11i、p159.Academic Pre
ss、19B2)などを使用することができる。As an expression vector for the expression vector, penP (D, Henner et al., 2n
d rnt, conference of Geneti
c, s and old otech-nology of B
acilli, 1983), pKTII93 (T, Pa1va et al., Gene, 22
.. 229.1983) or an expression vector using a penicillinase promoter and signal peptide gene (
S, Chang et al., Molecular Clonin
g and Gene Regulation in+
1aci11i, p159. Academic Pre
ss, 19B2), etc. can be used.
酵母の発現ベクターとしては、グルタルアルデヒド3リ
ン酸デヒドロゲナーゼのプロモーターを用いたpGPD
lまたはpGPD2(G、A、Bitter等、Gen
e+32.263.1984)など、α1フアクターの
プロモーターとシグナルペプチド遺伝子を持つpMFα
8(八。As a yeast expression vector, pGPD using the promoter of glutaraldehyde 3-phosphate dehydrogenase is used.
l or pGPD2 (G, A, Bitter et al., Gen
e+32.263.1984), pMFα containing the α1 factor promoter and signal peptide gene.
8 (eight.
旧yajima等、Gene、37,155.1985
) 、アルコールデヒドロゲナーゼのプロモーターを用
いた^A115またはAI(5(G、Ammerer、
Methods in IEnzymology(R,
Wue等編) Vollol、p192.Acade
mic Press、1983)、GA116プロモー
ターを用いたYEp51またはYEp52(J、17゜
Broach等、Experimental Mani
pulation of GeneExpressio
n(M、Inouye 編) p83.Academ
ic Press。Former yajima et al., Gene, 37, 155.1985
), A115 or AI(5(G, Ammerer,
Methods in IEnzymology (R,
(Wue et al., eds.) Vollol, p192. Acade
mic Press, 1983), YEp51 or YEp52 (J, 17°Broach et al., Experimental Mani
pulse of GeneExpressio
n (edited by M. Inouye) p83. Academ
ic Press.
1983) 、G^1,7プロモーターを用いた発現ベ
クター(特開昭60−248181号)、抑制型酸性フ
ォスファターゼプロモーターを用いたpAT77または
96M82(^、Miyanohara等、Proc、
Natl、Acad、Sci、IIS^、80゜1 、
1983)などを使用することができる。1983), expression vector using G^1,7 promoter (JP-A-60-248181), pAT77 or 96M82 using repressible acid phosphatase promoter (^, Miyanohara et al., Proc.
Natl, Acad, Sci, IIS^, 80°1,
1983) etc. can be used.
上記の発現ベクター基でシグナルペプチド部分を持つも
のでは、シグナルペプチド遺伝子領域の3′末端に、本
発明に係る遺伝子部分を読みわく(コーディングフレー
ム)を合せて連結する必要がある。In the above expression vector group having a signal peptide portion, it is necessary to link the gene portion according to the present invention to the 3' end of the signal peptide gene region with the reading frame (coding frame) aligned.
このようにして得られた発現プラスミドDNAを宿主(
大腸菌等の微生物)に導入して本発明に係る形質転換株
を得る。The expression plasmid DNA thus obtained was transferred to the host (
microorganisms such as Escherichia coli) to obtain a transformed strain according to the present invention.
大腸菌の形質転換は、カルシウム処理法(Mandel
等、J、Mo1.Biol、53,159.1970)
に従って行うことができる。枯草菌の形質転換は、プロ
トプラスト法(S、Chang等、Mo1.Gen、G
er+et、 168. IIL 1979)に従って
行なう。また、酵母の形質転換は、スフ五ロブラスト法
(^、Hianen等、Proc、Natl、Acad
、Sci。Transformation of E. coli was performed using the calcium treatment method (Mandel
et al., J. Mo1. Biol, 53, 159.1970)
This can be done according to the following. Transformation of Bacillus subtilis was performed using the protoplast method (S, Chang et al., Mo1.Gen, G
er+et, 168. IIL 1979). In addition, transformation of yeast can be carried out using the Sulfoloblast method (^, Hianen et al., Proc, Natl, Acad
, Sci.
USA、75.1929.1978)及び塩化リチウム
法(I1,Ito等、J、Bacteriol、153
.163,1983)に従って行なう。USA, 75.1929.1978) and the lithium chloride method (I1, Ito et al., J. Bacteriol, 153
.. 163, 1983).
形質転換体は、それぞれの発現ベクターに組込まれた選
択マーカー(例えばアンピシリン耐性)により平板培地
上で選択することにより得られる。Transformants are obtained by selecting on a plate medium using a selection marker (eg, ampicillin resistance) incorporated into each expression vector.
得られた形質転換体の培養は以下のように実施する。The obtained transformant is cultured as follows.
大腸菌または枯草菌については、TYG培地(トリプト
ン0.5%、酵母エキス0.5%、ブドウ糖0.1%、
K2HPO40,1%)またはI−、B培地(トリプト
ン1%、酵母エキス0.5%、食塩1%)などの一般に
大腸菌または枯草菌が生育する培地に、発現プラスミド
DNAにコードされる選択マーカーである抗生物質(ア
ンピシリン、カナマイシン等)を適当量加えた培地を使
用して培養する。短時間の培養であれば、抗生物質は必
ずしも必要でない。培養は、25〜45℃の範囲で振と
うして行なう。平板培地上の形質転換株を5〜100
m7!の上記培地で1夜振とう培養し、50〜1001
00O00の培地に移し、10〜30時間培養を行なう
。For E. coli or Bacillus subtilis, use TYG medium (tryptone 0.5%, yeast extract 0.5%, glucose 0.1%,
A selection marker encoded by the expression plasmid DNA is added to a medium in which E. coli or Bacillus subtilis generally grows, such as K2HPO40.1%) or I-, B medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% salt). Culture is performed using a medium containing an appropriate amount of a certain antibiotic (ampicillin, kanamycin, etc.). Antibiotics are not necessarily required for short-term culture. Culture is performed at a temperature of 25 to 45°C with shaking. 5 to 100 transformed strains on a plate
m7! Cultured with shaking overnight in the above medium, 50-1001
Transfer to 00O00 medium and culture for 10 to 30 hours.
酵母については、最小培地「0.7%酵母窒素源ベース
(アミノ酸を含まない)、2%グルコース、20w/#
程度の各種核酸およびアミノ酸]を用い、各種発現プラ
スミドの持つ選択マーカー(例エバ、ウラシル、■、−
ロイシンなど)を除いた培地を作製して使用する。培養
は、25〜35℃の範囲で振とうして行なう。平板培地
−にの形質転換株は5〜100 mI!、の培地で1〜
2日振とう培養し、50〜10100O000の培地に
移し、1〜5日間培養を行なう。For yeast, minimal medium “0.7% yeast nitrogen source base (no amino acids), 2% glucose, 20w/#
various nucleic acids and amino acids] and selectable markers possessed by various expression plasmids (e.g. Eva, Uracil, ■, -
Prepare and use a medium that does not contain leucine, etc.). Culture is performed at a temperature of 25 to 35°C with shaking. The transformed strain on the plate medium is 5-100 mI! 1~
Culture with shaking for 2 days, transfer to 50-101000000 medium, and culture for 1-5 days.
培養によって得られた融合ポリペプチドの分離は次のよ
うに行なう。The fusion polypeptide obtained by culturing is separated as follows.
分泌ヘクター系で生産した融合ポリペプチドは、培養液
を遠心分離し、上清を得る。また、それ以外のヘクター
系では、菌体を得、さらに菌体を水で洗浄後、超音波処
理、フレンチプレス、Xプレス、ヒユープレス、ダウン
ス管等の細胞破壊装置を用いて菌体を破壊し、遠心分離
により上清液を得る。For the fusion polypeptide produced in the secretion Hector system, the culture solution is centrifuged to obtain a supernatant. In addition, for other Hector systems, the bacterial cells are obtained, and after washing the bacterial cells with water, the bacterial cells are destroyed using a cell destruction device such as ultrasonication, French press, X press, Hue press, Dounce tube, etc. , obtain the supernatant by centrifugation.
これらの上清をアセトン沈澱、限外濾過、凍結乾燥等に
より凝縮し、オープンカラムを用いたゲル濾過、および
イオン交換クロマトグラフィー等により部分精製し、さ
らに、IIPLc 、 PPI、C等を用いた高速流体
クロマトグラフィーによって精製する。These supernatants are condensed by acetone precipitation, ultrafiltration, freeze-drying, etc., partially purified by gel filtration using an open column, ion exchange chromatography, etc., and further purified using high-speed chromatography using IIPLc, PPI, C, etc. Purify by fluid chromatography.
このとき、目的融合ポリペプチドの性質を利用してその
ピークの特定を行なう。例えば、融合ポリペプチドが酵
素活性を持つものでは酵素活性を使用し、融合ポリペプ
チド中に特異的抗体が存在するものではラジオイムノア
ッセイなどを用ることができる。At this time, the peak is identified using the properties of the target fusion polypeptide. For example, if the fusion polypeptide has enzymatic activity, enzymatic activity can be used, and if a specific antibody is present in the fusion polypeptide, radioimmunoassay or the like can be used.
得られた融合ポリペプチドをコラゲナーゼ処理して目的
のポリペプチドを得る。コラゲナーゼは、一般にクロス
トリジウム・ヒストリチカス(Clostridium
紅旦虱旦江町)またはクロストリジウム・ベルフリ
ンジス(Clostridium 匹社1Lmlを培
養し、培養液を硫安分画した後でゲル濾過及びDEAE
−セルロースクロマトグラフィーにより精製して調製さ
れる(Yoshida等、 R4ochem。The obtained fusion polypeptide is treated with collagenase to obtain the target polypeptide. Collagenase is generally used in Clostridium histolyticus (Clostridium histolyticus).
1 Lml of Clostridium bellfringes (Clostridium) or Clostridium bellfringes was cultured, and the culture solution was fractionated with ammonium sulfate, followed by gel filtration and DEAE.
- prepared by purification by cellulose chromatography (Yoshida et al., R4ochem.
Biophys、Acta、105.5621965)
。コラゲナーゼ精製品は、市販されているものを使用す
れば良い。コラゲナーゼとの反応は特に特別なものでは
なく、p)17〜8の50mM程度の任意の緩衝液中で
、5mM程度のCa”イオンまたはC02゛イオンを添
加して、1■程度の基質(融合ペプチド)と100ユニ
ット程度のコラゲナーゼとを混合して37℃付近の温度
で実施すれば良い。このとき、非特異的ペプチダーゼ活
性阻害するために、10mM程度のN−エチルマレイミ
ドを添加することが好ましい。Biophys, Acta, 105.5621965)
. Commercially available collagenase purified products may be used. The reaction with collagenase is not particularly special, and about 5mM of Ca' ions or C02' ions are added to an arbitrary buffer solution of about 50mM in p) 17 to 8, and about 1. peptide) and about 100 units of collagenase may be mixed and carried out at a temperature of around 37°C.At this time, it is preferable to add about 10mM of N-ethylmaleimide to inhibit non-specific peptidase activity. .
反応律産物は、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィ
ー、1(PLC,FPLCなどにより容易に分離精製す
ることができる。Reaction products can be easily separated and purified by gel filtration, ion exchange chromatography, 1 (PLC, FPLC, etc.).
次に実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。な
お、本発明はこれによって限定されるものではない。Next, the present invention will be explained in more detail with reference to Examples. Note that the present invention is not limited to this.
以下の各側において用いるDNAに関する実験方法は、
特に明記しないかぎりは、Maniatis等の[モレ
キュラー・クローニング(MoleculareCIO
ning)J (Cold Spring Harbo
r Laboratory、19B2)記載の方法に従
った。また、制限酵素、T4DNAリガーゼ、DNAポ
リメラーゼ■ (クレノー断片)、S−1ヌクレアーゼ
等の修飾酵素類は、全酒造■、東洋紡■、二1−イング
ランド・バイオラブズ社より購入し、それぞれ推奨され
た反応条件により反応を行なった。The experimental methods for DNA used on each side are as follows:
[Molecular Cloning (Molecular CIO) by Maniatis et al., unless otherwise stated.
ning)J (Cold Spring Harbo)
r Laboratory, 19B2). In addition, modification enzymes such as restriction enzymes, T4 DNA ligase, DNA polymerase (Klenow fragment), and S-1 nuclease were purchased from Zenshuzo ■, Toyobo ■, and 21-England Biolabs, and the recommended reactions were performed. The reaction was carried out depending on the conditions.
1:ヒトカルシトニンー 1 ゛ 云−の 11ヒトカ
ルシトニンの前駆体(このC末端をアミド化してヒトカ
ルシトニンにする)を得るために、ヒトカルシトニン−
コラゲナーゼ切断部位ペプチド−β−ガラクトシダーゼ
融合ポリペプチドをコードする遺伝子を作製した。1: Human calcitonin - 1 ゛ In order to obtain a precursor of human calcitonin (the C-terminus is amidated to form human calcitonin), human calcitonin -
A gene encoding a collagenase cleavage site peptide-β-galactosidase fusion polypeptide was constructed.
(I)ヒトカルシトニンのC末端アミド化のための前駆
体のアミノ酸−次構造は次のとおりである。(I) The amino acid-substructure of the precursor for C-terminal amidation of human calcitonin is as follows.
Cys−Gly−Asn−Leu−3er−Thr−C
ys−Met−Leu−Gly−Thr−Tyr−Th
r−Gln−八5p−Phe−Asn−Lys−Phe
−旧5−Thr−Phe−Pro−Gln−Thr−A
la−11e−Gly−Val−Gly−八Ia−Pr
o−c+y 。Cys-Gly-Asn-Leu-3er-Thr-C
ys-Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-Th
r-Gln-85p-Phe-Asn-Lys-Phe
-Old 5-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-A
la-11e-Gly-Val-Gly-8Ia-Pr
oc+y.
これは、ヒトカルシトニンのC末端のアミド部分をグリ
シンに置換した構造の前駆体ポリペプチドであり、この
ポリペプチドをC末端アミド化酵素(Rradury、
八、Fo等、 Nature 298.686.198
2)によって処理すると、C末端がアミド化されたヒト
力ルシトニンが得られる。This is a precursor polypeptide with a structure in which the C-terminal amide moiety of human calcitonin is replaced with glycine.
8. Fo et al., Nature 298.686.198
2), human lucitonin with an amidated C-terminus is obtained.
大腸菌β−ガラクトシダーゼは、そのN末端に他のポリ
ペプチドを融合しても大腸菌内で安定に存在し、しかも
充分な酵素活性を持つことが知られている(Germi
no、Jo等、 Proc、Natl、^cad、sc
i。E. coli β-galactosidase is known to stably exist in E. coli even if other polypeptides are fused to its N-terminus, and to have sufficient enzymatic activity (Germi
no, Jo, etc., Proc, Natl, ^cad, sc
i.
115A 80,6848.1983)。そこで、ヒト
カルシトニンの前駆体を安定に生産するための融合ポリ
ペプチドをコードする遺伝子を作製した。115A 80, 6848.1983). Therefore, we created a gene encoding a fusion polypeptide for stably producing a precursor of human calcitonin.
設計した融合ポリペプチドのアミノ酸配列は以下のとお
りである。The amino acid sequence of the designed fusion polypeptide is as follows.
Cys−Gly−八sn−Leu−3er−Thr−C
ys−Met−Leu−Gly−Thr−Tyr−Th
r−Gln−^5p−Phe−^5n−Lys−Phe
−His−Thr−Phe−Pro−Gln−Thr−
八Ia−11e−Gly−Val−Gly−Ala−P
ro−Gly−Gly−Pro−Val−Gly−Pr
o−Ala−Asp−Pro−C以下、β−ガラクトシ
ダーゼN末端より8番目のアミノ酸残基からC末端のア
ミノ酸残基までのアミノ酸残基を配列〕。Cys-Gly-8sn-Leu-3er-Thr-C
ys-Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-Th
r-Gln-^5p-Phe-^5n-Lys-Phe
-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-
8Ia-11e-Gly-Val-Gly-Ala-P
ro-Gly-Gly-Pro-Val-Gly-Pr
o-Ala-Asp-Pro-C Below is the sequence of amino acid residues from the 8th amino acid residue from the N-terminus of β-galactosidase to the C-terminal amino acid residue].
このアミノ酸配列に対応するDNA塩基配列を、大腸菌
が優先使用するコドン(Ikemura、 T、等、
ColdSpring tlarbor Symp
、口uant、Bioβ、、47,1087.1983
)を中心に使用して、以下のように設計した。こごで、
翻訳開始のためのATGを5′末端に付加した。The DNA base sequence corresponding to this amino acid sequence is converted into codons (Ikemura, T, etc.) that are preferentially used by E. coli.
ColdSpring trough Symp
, Mouth uant, Bioβ, 47, 1087.1983
) was designed as follows. Here,
ATG for translation initiation was added to the 5' end.
列
A、TGAGTCCTG AAGTTGTTCA
AAGTATGGAA GGGTGTCTGTIac
’Z遺伝子は、プラスミドpMC874(Casada
bar++M、J、、等、 J、Bacteriol、
、143,971.1980)のBamHT−3all
DNA断片6.2Kbpを切り出して使用した。Column A, TGAGTCCTG AAGTTGTTCA
AAGTATGGAAGGGTGTCTGTIac
'Z gene was obtained from plasmid pMC874 (Casada
bar++M, J, etc., J, Bacteriol,
, 143,971.1980) BamHT-3all
A DNA fragment of 6.2 Kbp was cut out and used.
コラゲナーゼ切断部位を付加したカルシトニンをコード
する遺伝子は、DNA合成機(アプライド バイオシス
テムズ社製モデル3)+OA)を用いて、ホスフォアミ
ダイド法(Beaucage、S、L、、及びCaru
thers、M、H,+Tetrahedron L
ett、22,1859.1981)により合成を行な
った。合成遺伝子は、以下に示した7種の1本鎖DNA
として合成した。The gene encoding calcitonin with a collagenase cleavage site added was synthesized using a phosphoramidite method (Beaucage, S, L, and Caru) using a DNA synthesizer (Applied Biosystems Model 3 + OA).
thers, M, H, +Tetrahedron L
ett, 22, 1859.1981). The synthetic genes are seven types of single-stranded DNA shown below.
It was synthesized as
(i ) 5’−^ATTC八八AAへへCGGC
八八TTへへTCTACCTGCA−3′(31mer
)
(ii ) 5’ −TGCTAGGTACCTA
TACTCAGGACTTCAACAAGTTTCAT
ACCTTCCCACAGACA−3’ (53mer
)(iii ) 5’ −GCCATCGGTGTCG
GAGCTCCAGGTGGCCCAGTA(”、GC
にCAGCG−3’ (42mar)(iv ) 5
’ −GATCCGCTGGGCCTACTGGGCC
ACCTGGAGCT−3’(32mer)
(■) 5°−CCGACACCGATGGCTGTC
TGTGGG−3’ (24mer)(vi ) 5
’ −AAGGTATGAAACTTGTTGAAGT
CCTGAGTATAGGT^G−3’ (37mer
)
(■) 5’−CTAGCATGCAGGTAGAC
AAATTGCCGCACATTTTG−3’ (35
mer)
実際の合成は、それぞれ3′の末端の塩基1/1mol
を結合したCPGカラムを出発材料とし7て、それぞれ
5′方向に1塩基づつを付JJl′lシていった。(i) 5'-^ATTC 88AA to CGGC
To 88 TT TCTACCTGCA-3' (31mer
) (ii) 5'-TGCTAGGTACCTA
TACTCAGGACTTCAACAAGTTTTCAT
ACCTTCCCACAGACA-3' (53mer
)(iii) 5'-GCCATCGGTGTCG
GAGCTCCAGGTGGCCCAGTA(”, GC
CAGCG-3' (42mar) (iv) 5
' -GATCCGCTGGGCCTACTGGGCC
ACCTGGAGCT-3' (32mer) (■) 5°-CCGACACCGATGGCTGTC
TGTGGG-3' (24mer) (vi) 5
' -AAGGTATGAAAACTTGTTGAAGT
CCTGAGTATAGGT^G-3' (37mer
) (■) 5'-CTAGCATGCAGGTAGAC
AAATTGCCGCACATTTTG-3' (35
mer) The actual synthesis involves 1/1 mol of each 3' terminal base.
Using a CPG column bound with 7 as a starting material, one base was added in each 5' direction.
付加方法はアプライド・バイオシステム社製モデル38
〇へDNA合成機オペレーターズ・マニュアルに従って
行なった。予定どおりの塩基数が結合された合成りNA
は、5′末端のトリチル基をつけたままチオフェノール
で脱保護し、アンモニアを用いてCPGカラムから分離
し、そして捕集した。The addition method is Model 38 manufactured by Applied Biosystems.
It was performed according to the DNA synthesizer operator's manual. Synthetic NA with the predetermined number of bases combined
was deprotected with thiophenol with the 5'-terminal trityl group attached, separated from the CPG column using ammonia, and collected.
捕集したDNAは以下のように分離、精製した。The collected DNA was separated and purified as follows.
捕集液約1.5m7!に27%水酸化アンモニウム1m
lを加え、密封後、60°Cで10時間加熱し、塩基の
保護基をはずした。真空回転型の濃縮器で乾固後、10
mM TEAA緩衝液(pH7,5) (無水酢酸で
pH7,5に調整した10mMトリエチルアミン水溶液
〕100μpニ溶解し、HPLC(島津製作所製5Pr
l−6^型)により合成りNAを分離精製した。カラム
としてはODS系カラム(センタ1−パックNP−31
8,6φ)を用い、下記第1表のグラディエンドをかけ
、流速1.2 rrl /minで?容出させた。Collection liquid approximately 1.5m7! 1 m of 27% ammonium hydroxide
After sealing, the mixture was heated at 60°C for 10 hours to remove the base protecting group. After drying in a vacuum rotary concentrator, 10
Dissolve 100μp of mM TEAA buffer (pH 7.5) (10mM triethylamine aqueous solution adjusted to pH 7.5 with acetic anhydride), HPLC (Shimadzu 5Pr)
The synthesized NA was separated and purified using the 1-6^ type). The column is ODS type column (Center 1-Pack NP-31
8.6φ), apply the gradient end shown in Table 1 below, and set the flow rate to 1.2 rrl/min. I let it come out.
第 1 表
溶出パターンの一例〔前記1本鎖DNA (iv) )
を第1図に示した。この1本鎖DNA(iv)において
は、15分から20分付近に溶出するメインピークを分
取し、濃縮器で乾固した。乾固した試料に80%酢酸(
アセトニトリルで調製)100μβを加え、20分間室
温で良く混合し、5′末端のジメチルトリチル基をはず
して5′末端を水酸基とし、濃縮器で乾固した。10m
M TRAA(pH7,5) 100μlに溶解し、2
〜3回エーテル抽出を行なった。この溶液を再びHPI
、Cにかけ、合成りNAを分離した。溶出条件は、上記
の方法に準じ、グラディエンド条件のみ下記第2表のよ
うに変更した。Table 1 Example of elution pattern [single-stranded DNA (iv) above]
is shown in Figure 1. In this single-stranded DNA (iv), the main peak eluting around 15 to 20 minutes was fractionated and dried in a concentrator. 80% acetic acid (
100 μβ (prepared with acetonitrile) was added, mixed well for 20 minutes at room temperature, the dimethyltrityl group at the 5' end was removed to form a hydroxyl group at the 5' end, and the mixture was dried in a concentrator. 10m
Dissolve in 100 μl of M TRAA (pH 7,5) and add 2
~3 ether extractions were performed. HPI this solution again.
, C to separate the synthesized NA. The elution conditions were similar to the above method, except for the gradient end conditions, which were changed as shown in Table 2 below.
第 2 表
□
溶出パターンの一例〔前記1本鎖DNA (iv) )
を第2図に示した。この1本鎖DNA(iv)について
は10分付近に溶出するメインビークを分取し、濃縮器
で乾固した。この試料を合成りNA試料とした。前記の
各1本鎖DNAについてこれらの操作を行ない、最終的
に1本鎖DNAとしてそれぞれ100Dユニツト(25
0μg程度)以上の合成りNA試料を得た。Table 2 □ Example of elution pattern [single-stranded DNA (iv) mentioned above]
is shown in Figure 2. Regarding this single-stranded DNA (iv), the main beak eluting around 10 minutes was collected and dried in a concentrator. This sample was synthesized and used as an NA sample. These operations are performed on each of the single-stranded DNAs described above, and finally each single-stranded DNA has 100 D units (25
A synthesized NA sample with an amount of about 0 μg or more was obtained.
次に、これらの合成りNA試料を連結して、ヒトカルシ
トニン遺伝子を作製した。前記の合成りNA試料をそれ
ぞれ0.50 Dユニット程度用意し、50Iteスケ
ールでT4ポリヌクレオチドキナーゼ(宝酒造製)10
ユニツトを用し一1100μMATPにより5′末端水
酸基をリン酸化した。これら7種の1本鎖DNAをフェ
ノール処理し、エタノール沈澱後に乾固し、TE緩衝液
(I0mMl−リス塩酸緩衝液PII8.0 、1 m
M EDT^)100μnに溶解、混合し、65℃で2
0分間加熱後に徐々に室温まで冷却してアニーリングを
行なった。8%ポリアクリルアミドゲル電気泳動により
アニーリングが行なわれたかどうかを確認したところ、
約130bpのDNA断片が確認できた。そこで、この
DNA断片を含むポリアクリルアミドゲルを切り取り、
ダウンスホモジナイザー(Wheaton 5cien
tific社製)を用いてホモジナイズし、0.5 M
酢酸アンモニウム(ImMEDT八を含む)及び同量の
TR緩衝液飽和フェノール溶液を加えてDNAを抽出し
た。Next, these synthetic NA samples were linked to create the human calcitonin gene. Prepare approximately 0.50 D units of each of the above synthetic NA samples, and test with T4 polynucleotide kinase (Takara Shuzo Co., Ltd.) 10 on a 50ite scale.
The 5' terminal hydroxyl group was phosphorylated with 1100 μM ATP using a unit. These seven single-stranded DNAs were treated with phenol, precipitated with ethanol, dried, and mixed with TE buffer (I0mM l-Lis-HCl buffer PII 8.0, 1 m
M EDT^) Dissolve in 100 μn, mix, and incubate at 65℃ for 2 hours.
After heating for 0 minutes, annealing was performed by gradually cooling to room temperature. When it was confirmed whether annealing was performed by 8% polyacrylamide gel electrophoresis,
A DNA fragment of approximately 130 bp was confirmed. Therefore, we cut out the polyacrylamide gel containing this DNA fragment.
Dounce homogenizer (Wheaton 5cien)
homogenized using 0.5 M
DNA was extracted by adding ammonium acetate (containing ImMEDT8) and an equal volume of TR buffer saturated phenol solution.
遠心分離して水相をエタノール沈澱し、濃縮器によりD
NA断片を乾固した。After centrifugation, the aqueous phase was precipitated with ethanol, and D
The NA fragment was dried.
一方、プラスミドpUc119及びpHc118 (宝
酒造製)のDNAを制限酵素EcoRI及びflamH
Tで切断し、1%の低温ゲルアガロース(シグマ11タ
イプ■)で電気泳動を行ない、3.2 KbpのDNA
断片を切取り、70℃で5分加熱後にTp:緩衝液飽和
フlノールをほぼ同液量加え、よく混合し1、遠心分離
により水相を得た。この水相をエタノール沈殿し、濃縮
器によりDNA断片を乾固した。On the other hand, the DNA of plasmids pUc119 and pHc118 (manufactured by Takara Shuzo) was digested with restriction enzymes EcoRI and flamH.
Cut with T and perform electrophoresis on 1% low temperature gel agarose (Sigma 11 type ■) to obtain 3.2 Kbp DNA.
The fragments were cut out and heated at 70° C. for 5 minutes, then approximately the same amount of Tp:buffer saturated furanol was added, mixed thoroughly (1), and an aqueous phase was obtained by centrifugation. This aqueous phase was precipitated with ethanol, and the DNA fragments were dried using a concentrator.
合成りNAをアニールした前記の約130bpのDNA
断片約5μgとp[Ic119及びpUcll、8由来
の3.2KbpのDNA断片約1μGとを、宝酒造製D
NAライゲーションキットを用いて連結させた。The approximately 130 bp DNA annealed with synthetic NA
Approximately 5 μg of the fragment and approximately 1 μG of a 3.2 Kbp DNA fragment derived from p[Ic119 and pUcll, 8 were added to Takara Shuzo D
Ligation was performed using an NA ligation kit.
得られたプラスミドD N A pUcll9−hCT
及びpllcllB−hCTを用いて、大腸菌MV13
04株(,1(lac−pro AB)、thi、r
psL(strep’ )、erdA、shc 8
15.hspR4,Δ(srl−recA)306::
TnlO(tet’ ) CF’:traD36.p
roAB、 Iac IqZ AMI5 ) ) (
宝酒造より購入〕を形質転換した。形質転換は、カルシ
ウム法(Mandel、M、、等、J、Mo1.Bio
l、、53,109.1970)に準して行なった。5
0μg / m j!チアンシリンを含むL B固形培
地〔ハクトドリプトン(ディフコ社製)1%、バクト酵
母エキス(ディフコ社製)0.5%、塩化ナトリウム1
%、苛性ソーダでpH7,5に調整したアガロース(デ
ィフコ社製)1.5%〕プレート」−で成育する形質転
換株を拾った。The obtained plasmid DNA pUcll9-hCT
and pllcllB-hCT, E. coli MV13
04 strain (,1(lac-pro AB), thi, r
psL (strep'), erdA, shc 8
15. hspR4,Δ(srl-recA)306::
TnlO(tet')CF':traD36. p
roAB, Iac IqZ AMI5 ) ) (
[purchased from Takara Shuzo] was transformed. Transformation was performed using the calcium method (Mandel, M., et al., J. Mo1. Bio
1970). 5
0μg/mj! LB solid medium containing thiancillin [Hactodorypton (manufactured by Difco) 1%, Bacto yeast extract (manufactured by Difco) 0.5%, sodium chloride 1%
%, and agarose (manufactured by Difco) 1.5% plate adjusted to pH 7.5 with caustic soda.
(2)作製したプラスミドpUc119−hCT及びp
lJCllB−hCTが計画どおりのDNA塩基配列を
持つかどうかを確認するためにジデオキシ法(Mess
ing+J、+ Methods Enzymol、、
101,20.1983)により塩基配列を決定した。(2) Created plasmids pUc119-hCT and p
In order to confirm whether lJCllB-hCT has the planned DNA base sequence, we used the dideoxy method (Mess
ing+J,+Methods Enzymol,,
101, 20.1983).
形質転換したMV13Q4株を0.01%チアミン及び
150メ!g/mβアンピシリンを含む2XYT培地(
バタトトリブトン1.6%、ハクト酵母エキス1%、塩
化すI・リウム0.5%)に植菌し、37℃で振とう培
養を行なった。0Dbbaが0.1程度になるまで増i
Ahシた時点で、ヘルパーファージM13KO7(宝酒
造製)をm、o、i= 20程度加え、さらに37℃で
一晩培養を続けた。培養上清に20%PEG (ポリエ
チレングリコール6000) −2,5M塩化ナトリウ
ム液を17容量%加え、1本鎖DNAを沈澱させ、沈澱
をT F、緩衝液に溶解した後、フェノール処理し、水
相をエタノール沈澱した。The transformed MV13Q4 strain was treated with 0.01% thiamin and 150 ml! 2XYT medium containing g/mβ ampicillin (
Batato tributon 1.6%, Hakuto yeast extract 1%, I.lium chloride 0.5%) were inoculated and cultured with shaking at 37°C. Increase i until 0Dbba is about 0.1
At the time point, helper phage M13KO7 (manufactured by Takara Shuzo) was added to m, o, i = about 20, and the culture was further continued overnight at 37°C. 17% by volume of 20% PEG (polyethylene glycol 6000)-2.5M sodium chloride solution was added to the culture supernatant to precipitate single-stranded DNA. The precipitate was dissolved in TF and buffer, treated with phenol, and then dissolved in water. The phase was ethanol precipitated.
遠心分離後、乾固した1本鎖DNAについて、宝酒造製
M13シーケンスキット及びアマジャム社製(α−32
P) dCTP(400Ci/mmc)を用いて、ジ
デオキシヌクレオチド酵素法の反応を行なった。After centrifugation, the single-stranded DNA was dried using Takara Shuzo's M13 sequence kit and Amajam's (α-32
P) A dideoxynucleotide enzymatic reaction was performed using dCTP (400 Ci/mmc).
その反応の概略は次のとおりである。The outline of the reaction is as follows.
大腸菌+ a r、Z遺伝子のコーディング領域の一部
に相当する15bpのブライマーD N A (5’
−AGTCACGACGTTGTA−3’ )を上記の
1本積r)NAにアニールし、クレノー酵素を用いて、
プライマーからDNA伸長反応を行なった。このとき、
ラジオアイソトープラヘルのために〔α−”P) −d
CTPを取込ませた。また、チェーンターミネーション
のためにddATP 、 ddCTP ddGTPまた
はddTTPをそれぞれ加えた反応系を作って反応させ
た。それぞれのジデオキシヌクレオチドを加えた反応液
4つを1組として、7.5M尿素を含む8%ポリアクリ
ルアミドゲル(40cm長、0.3mm厚)にて、20
00 Vの定電圧で電気泳動した。泳動後、ゲルをワッ
トマン3MMペーパーに付着させ、ハイオラソド社製ゲ
ル乾燥器にてゲルを乾燥し、オートラジオグラフを行な
った。フジ写真フィルム社製X線フィルトRXOを用い
、室ン品で1晩霞出させてから現像しく41)
た。第3図にpllcllB−hCTのシーケンスラダ
ーを示す。第3図において、下部のRamHlが合成T
)NAの挿入部であり、その上部方向に合成りNA塩基
配列が存在していた。この結果、このプラスミドは計画
どおりの塩基配列を持つことが分かった。E. coli+a r, 15 bp brimer DNA (5') corresponding to part of the coding region of the Z gene
-AGTCACGACGTTGTA-3') was annealed to the above single product r) NA, and using Klenow enzyme,
A DNA extension reaction was performed from the primer. At this time,
For radioisotope rahel [α-”P)-d
Incorporated CTP. In addition, for chain termination, a reaction system was prepared in which ddATP, ddCTP, ddGTP, or ddTTP were added, and the reaction was carried out. A set of four reaction solutions containing each dideoxynucleotide was placed on an 8% polyacrylamide gel (40 cm long, 0.3 mm thick) containing 7.5 M urea for 20 min.
Electrophoresis was performed at a constant voltage of 00 V. After electrophoresis, the gel was adhered to Whatman 3MM paper, dried in a gel dryer manufactured by Hyorathod, and autoradiographed. Using X-ray filter RXO manufactured by Fuji Photographic Film Co., Ltd., the film was left to develop overnight in a room and then developed41). FIG. 3 shows the sequence ladder of pllcllB-hCT. In Figure 3, the lower RamHl is the synthetic T
) It is an insertion site of NA, and a synthetic NA base sequence was present in the upper direction. As a result, it was found that this plasmid had the planned base sequence.
同様にL7て、ptlcl19−hCTも計画どおりの
塩基配列を持つことが確認された。Similarly, it was confirmed that L7 ptlcl19-hCT also had the planned base sequence.
(3)得られたヒトカルシトニン遺伝子−コラゲナーゼ
切断部位に対応する遺伝子に、Iac、’Z遺伝子を連
結して、ヒトカルシトニン−1ac’Z遺伝子を作製し
7た(第4図参照)。(3) The Iac,'Z gene was linked to the obtained human calcitonin gene--the gene corresponding to the collagenase cleavage site to create the human calcitonin-1ac'Z gene (see Figure 4).
7” −7スミFpUC119−hCTを持ツMV13
04株を、77ピシリン50μg / m 1を含む■
、B培地(」1記のL R固形培養からアガロースを除
いた培地)で1昼夜37°Cで振とう培養して菌体を得
、アルカリ抽出法(Rirnboim、 11.c、等
、1luc1.^c、id Res、7゜1513、1
979)を用いてプラスミ)” D N Aを分離して
作製した。このDNAを制限酵素、RamHI及びΣ1
1で切断し、低温ゲルアガロースを用いた1%アガロー
スケル電気泳動により3.3KhpのDNA断片を確認
し、上述の方法によってそのDNA断片を分離精製した
。MV13 with 7”-7 Sumi FpUC119-hCT
04 strain containing 77 picillin 50μg/m1■
Bacterial cells were obtained by culturing with shaking at 37°C for one day and night in B medium (a medium obtained by removing agarose from the L R solid culture described in ``1''), followed by alkaline extraction method (Rirnboim, 11.c, etc., 1luc1. ^c, id Res, 7°1513, 1
979) was used to isolate and prepare plasmid DNA. This DNA was digested with restriction enzymes, RamHI and Σ1
1, a 3.3Khp DNA fragment was confirmed by 1% agarose gel electrophoresis using low-temperature gel agarose, and the DNA fragment was separated and purified by the method described above.
一方、プラスミドpMC874(Casadaban、
M、J、等、J、Bacteriol、143,97
1.1980) DNAを制限酵素旦amHI及びΣI
Iで切断し、同様な方法でlac’Z遺伝子を含む6.
2 KbpのDNA断片を得た。On the other hand, plasmid pMC874 (Casadaban,
M, J, et al., J, Bacteriol, 143,97
1.1980) DNA was treated with restriction enzymes amHI and ΣI.
6. Cut with I and contain the lac'Z gene in the same way.
A 2 Kbp DNA fragment was obtained.
これらの処理により得られた2つのDNA断片を上記ラ
イゲーションキットを用いて連結し、プラスミドpUC
119−hCT−1ac’Zを得た。The two DNA fragments obtained by these treatments were ligated using the above ligation kit to create plasmid pUC.
119-hCT-1ac'Z was obtained.
このプラスミドを用いて、大腸菌M15株(Δ(lac
−pro ) thi φ80d IacZM15.
ara、rpsL。Using this plasmid, E. coli strain M15 (Δ(lac
-pro) thi φ80d IacZM15.
ara, rpsL.
rec^) 〔アマジャム社より購入〕を上述の方法で
形質転換した。アンピシリン50μg/mllを含むL
B、形培地上で生育することのできるコロニーをアンピ
シリン50μg / m n添加I、 B 培地で充分
に生育させ、プラスミドDNAを得た。このプラスミド
DNAが制限酵素EcoRIで2か所、Σaclで2か
所、BamHIで1か所そして股U■で1か所切断され
ることは、それらの切断後にアガロース電気泳動により
確認した。また、このとき、及鵠R■では3.2 Kh
pと6.3 KhpのDNA断片、Σ赳lでは2. I
Kbpと7.4 KbpのDNA断片が得られた。こ
れらのことから、ヒトカルシトニン−1ac’Z遺伝子
が計画どおりに作製されていることが分かった。rec^) [purchased from Amajam] was transformed by the method described above. L containing ampicillin 50μg/ml
Colonies that could grow on the B and B medium were grown sufficiently on the I and B medium supplemented with ampicillin at 50 μg/mn, and plasmid DNA was obtained. It was confirmed by agarose electrophoresis after the cleavage that this plasmid DNA was cleaved at 2 sites with the restriction enzymes EcoRI, 2 sites with Σacl, 1 site with BamHI, and 1 site with U■. Also, at this time, 3.2 Kh in Oiku R■
p and 6.3 Khp DNA fragment, Σ赳l is 2. I
Kbp and 7.4 Kbp DNA fragments were obtained. These results revealed that the human calcitonin-1ac'Z gene was produced as planned.
12:ヒトカルシトニンー°” 云 の 四側1と同様
にしてヒトカルシトニンのアミド化用前駆体を得るため
に、ヒトカルシトニン−コラゲナーゼ切断部位ペプチド
−デスチオビオチン合成酵素融合ポリペプチドをコード
する遺伝子を作製した。例1と同様な考え方で、融合ポ
リペプチドのアミノ酸配列を以下のように設計した。12: Human calcitonin - In order to obtain a precursor for amidation of human calcitonin in the same manner as in 1, a gene encoding a human calcitonin-collagenase cleavage site peptide-desthiobiotin synthase fusion polypeptide was generated. Using the same concept as in Example 1, the amino acid sequence of the fusion polypeptide was designed as follows.
Cys−Gly−^sn−Leu−5er−Thr−C
ys−Met−Leu−Gly−Thr−Tyr−Th
r−Gln−^5p−Phe−八5n−Lys−Phe
−His−Thr−Phe−Pro−G In−Thr
−A la−11e−G Iy−Va l −G Iy
−A Ia−Pro−Gly−Gly−Pro−Leu
−Gln−(以下、デスチオビオチンのN末端より53
番目のアミノ酸残基からC末端(N末端より21111
番目アミノ酸残基までのアミノ酸残基を配列〕。Cys-Gly-^sn-Leu-5er-Thr-C
ys-Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-Th
r-Gln-^5p-Phe-85n-Lys-Phe
-His-Thr-Phe-Pro-G In-Thr
-A la-11e-G Iy-Va l -G Iy
-A Ia-Pro-Gly-Gly-Pro-Leu
-Gln- (hereinafter, 53 from the N-terminus of desthiobiotin
C-terminus from the amino acid residue (21111 from the N-terminus)
Sequence of amino acid residues up to the th amino acid residue].
このアミノ酸配列に対応する遺伝子を以下のように設計
した。なお、翻訳開始のA T Gを5′末端に付加し
た。A gene corresponding to this amino acid sequence was designed as follows. Note that ATG for translation initiation was added to the 5' end.
bio’D遺伝子はプラスミドpK)IN31 (特願
昭60−296646号、微工研菌寄第8586号)の
制限酵素を基1−11indTn断片600hpを使用
した。また、コラゲナーゼ切断部位を付加したカルシト
ニンをコードする遺伝子は、例1と同様にして化学合成
りNAを用いて構成した。For the bio'D gene, a restriction enzyme-based 1-11indTn fragment 600hp of the plasmid pK)IN31 (Japanese Patent Application No. 60-296646, Kaikoken Bibliography No. 8586) was used. Furthermore, a gene encoding calcitonin with a collagenase cleavage site added was constructed using chemically synthesized NA in the same manner as in Example 1.
融合遺伝子の作製は第5図に示す手順で行ない、実験操
作は例1に示した方法に準じて行なった。The fusion gene was prepared according to the procedure shown in FIG. 5, and the experimental operations were performed according to the method shown in Example 1.
得られたプラスミドDNAが計画どおりの遺伝子である
ことは、例1と同様な方法でDNA塩基配列を決定する
ことで確認した。It was confirmed by determining the DNA base sequence in the same manner as in Example 1 that the obtained plasmid DNA contained the gene as planned.
例1で作製したhCT−1ac’Z融合遺伝子を大腸菌
で発現させる発現プラスミドを作製した。大腸菌発現プ
ロモーターとしてはプラスミドpKK223−3(アマ
ジャム社製)由来のtacプロモーターを用いた。作製
の手順を第6図にまとめた。また、実験操作は例1に示
した方法に準じて行なった。An expression plasmid for expressing the hCT-1ac'Z fusion gene prepared in Example 1 in E. coli was prepared. As the E. coli expression promoter, the tac promoter derived from plasmid pKK223-3 (manufactured by Amajam) was used. The manufacturing procedure is summarized in Figure 6. Further, the experimental operation was performed according to the method shown in Example 1.
プラスミドpBR322(Peden、 K、 、 G
ene+ 22+ 277+ 1983)を制限酵素F
、coRTで切断し、クレノー酵素(宝酒造製)及び1
00mM dATP、 100mM dTTPを用い
て、切断部位を平滑末端とした。pBgl nリンカ−
[宝酒造製、d(pC−A−G−A−T−C−T−G)
]を切断点に挿入し、ライゲーションを行なった。こ
のとき、pBR322DNAとリンカ−1’)NAのモ
ル比は約1:100としく46)
た。得られたプラスミドpBR322・BgのBamH
r−盈11部位に、pMC874由来のIacZ遺伝子
を含むBamHI −Sal I断片6.2 kbpを
挿入してプラスミドpZT lを得た。Plasmid pBR322 (Peden, K., G.
ene+ 22+ 277+ 1983) with restriction enzyme F
, cleaved with coRT, Klenow enzyme (manufactured by Takara Shuzo) and 1
The cleavage site was made into a blunt end using 00mM dATP and 100mM dTTP. pBgl n linker
[Manufactured by Takara Shuzo, d(pC-A-G-A-T-C-T-G)
] was inserted at the cutting point and ligation was performed. At this time, the molar ratio of pBR322 DNA and linker-1')NA was approximately 1:10046). BamH of the obtained plasmid pBR322・Bg
A 6.2 kbp BamHI-Sal I fragment containing the IacZ gene derived from pMC874 was inserted into the r-bulb 11 site to obtain plasmid pZT1.
一方、tacのプロモーター(Ptac)を持つプラス
ミドpKK223−3のマルチプルクローニング部位の
EcoRI −Pst T部位に、ρUC119−hC
T−1ac’Z由来のhCT遺伝子旦並R1−1堕HI
断片130bpをプロモーターと同じ方向に挿入してプ
ラスミドpKK223−3hCTを得た。On the other hand, ρUC119-hC
T-1ac'Z-derived hCT gene tanran R1-1 fallen HI
The 130 bp fragment was inserted in the same direction as the promoter to obtain plasmid pKK223-3hCT.
次に、プラスミドpZT 1の堕II −Hi nd
IIT部位に、pKK223−3hCT由来のPtac
−hCT遺伝子を含む 。Next, the degradation of plasmid pZT1-Hind
At the IIT site, Ptac derived from pKK223-3hCT
- Contains the hCT gene.
且蛯H1−財皿lO,5Khp DNA断片を挿入して
pZT21とした。さらに、プラスミドpUC119−
hCT−Iac’Zより、コラゲナーゼ切断ペプチド部
位を含むに匣■−且亜HI 90bpD N A断片を
ポリアクリルアミドゲルから分離し、プラスミドpZT
21 のKLI −B atn HI 68位に挿入し
、ヒトカルシトニン−コラゲナーゼ切断部位ペプチド−
β−ガラクトシダーゼ融合ポリペプチドの大腸菌発現プ
ラスミドρ7.T31を得た。得られたプラスミドpZ
T31は、第6図に示した制限酵素部位が予想どおりの
位置に存在することで確認した。また、0.002%5
−ブロム−4−クロロ−3−インドリル−β−ガラクト
ピラノシドを含むL B固形培地上で、このプラスミド
を含む大腸菌M15株を生育させるとコロニーが青くな
ることから、β−ガラクトシダーゼが産律していること
も確認した。In addition, a 5Khp DNA fragment was inserted into pZT21. Furthermore, plasmid pUC119-
From hCT-Iac'Z, a 90 bp DNA fragment containing the collagenase cleavage peptide site was separated from polyacrylamide gel, and plasmid pZT was isolated from hCT-Iac'Z.
21 at KLI-B atn HI position 68, human calcitonin-collagenase cleavage site peptide-
Escherichia coli expression plasmid ρ7 of β-galactosidase fusion polypeptide. Obtained T31. The resulting plasmid pZ
T31 was confirmed by the presence of the restriction enzyme site shown in FIG. 6 at the expected position. Also, 0.002%5
- When E. coli strain M15 containing this plasmid is grown on an LB solid medium containing -bromo-4-chloro-3-indolyl-β-galactopyranoside, the colonies turn blue, indicating that β-galactosidase is the production regulator. I also confirmed that.
さらに、プラスミドρKK223−3hCTの丑並R1
切断部位に81ヌクレアーゼ(ベーリンガーマンハイム
社製)を働かせて平滑末端とし、これを再結合すること
により旦c、oRI認識部位のなくなったプラスミドp
KK233−3hCT (2)を得た。例1に示した4
塩基欠損した配列であった。この結果、pKK223−
3hCTでは、PtacのSD配列(de Boer、
It、八、1等、Proc、Nat、八cad、sci
、UsA、7B、21.1983) とhCTの間隔
が13bpであるのに対して、pKK233−3hCT
(2)では9bpとなった。このプラスミドpKK2
33−3hCT (2)を(4B)
用いて、第6図の手順に準じて、ヒトカルシトニン−コ
ラゲナーゼ切断部位ペプチド−β−ガラクトシダーゼ融
合ポリペプチドの大腸菌発現プラスミドpZT32を得
た。制限酵素地図は、p7.Ta2のptaC,とhC
T間のF、coRT部位がなくなったものである。得ら
れたプラスミドpZT32DNAを各制限酵素で切断す
ると、この制限酵素地図と一致した。Furthermore, Ushinami R1 of plasmid ρKK223-3hCT
By applying 81 nuclease (manufactured by Boehringer Mannheim) to the cleavage site to make blunt ends, and by religating the ends, the plasmid p, which lacks the oRI recognition site, is created.
KK233-3hCT (2) was obtained. 4 shown in example 1
It was a sequence with a base deletion. As a result, pKK223-
In 3hCT, the SD sequence of Ptac (de Boer,
It, 8, 1st class, Proc, Nat, 8 cad, sci
, UsA, 7B, 21.1983) and hCT, whereas pKK233-3hCT
In (2), it was 9 bp. This plasmid pKK2
Using 33-3hCT (2) (4B) and according to the procedure shown in FIG. 6, an Escherichia coli expression plasmid pZT32 of a human calcitonin-collagenase cleavage site peptide-β-galactosidase fusion polypeptide was obtained. The restriction enzyme map is on p7. ptaC of Ta2, and hC
The F between T and coRT sites are missing. When the obtained plasmid pZT32 DNA was digested with each restriction enzyme, the results matched this restriction enzyme map.
また、pZT31 と同様にβ−ガラクトシダーゼ活性
を示すことも確認した。It was also confirmed that it exhibited β-galactosidase activity like pZT31.
例2で作製したhCT−bio’D融合遺伝子を大腸菌
で発現させる発現プラスミドを作製した。作製の手順を
第7図にまとめた。実験操作は例1および例3に示した
方法に準じて行なった。An expression plasmid for expressing the hCT-bio'D fusion gene prepared in Example 2 in E. coli was prepared. The manufacturing procedure is summarized in Figure 7. Experimental operations were performed according to the methods shown in Examples 1 and 3.
Ptacを持つプラスミドpKK223−3の旦coR
I−。CoR of plasmid pKK223-3 carrying Ptac
I-.
HindII[部位に、プラスミドpUc119−hC
T−hio’ D由来のhCT−bio’ll融合遺伝
子すなわちEcoRI−Hind m O,7Khp
DNA断片を挿入し、ヒトカルシトニンーコラゲナーゼ
切断部位ペプチド−デスチオビオチン合成酵素融合ポリ
ペプチドの大腸菌発現プラスミドpBcT31を作製し
た。得られたプラスミドDNAは、第7図の制限酵素地
図に示すとおりの制限酵素部位をもっていることを確認
した。At the HindII site, plasmid pUc119-hC
hCT-bio'll fusion gene derived from T-hio' D, namely EcoRI-Hind m O,7Khp
The DNA fragment was inserted to create an Escherichia coli expression plasmid pBcT31 of a human calcitonin-collagenase cleavage site peptide-desthiobiotin synthase fusion polypeptide. It was confirmed that the obtained plasmid DNA had restriction enzyme sites as shown in the restriction enzyme map shown in FIG.
さらに、PtacとhCTの間に、大腸菌リポプロティ
ン遺伝子LI!Pのシグナルペプチドコード部分を挿入
して大腸菌分泌発現プラスミドを作製した。Furthermore, between Ptac and hCT, the E. coli lipoprotein gene LI! An E. coli secretory expression plasmid was prepared by inserting the signal peptide coding portion of P.
リポプロティンのシグナルペプチドは、下記のアミノ酸
配列であることが知られている(Inouye、 S。The signal peptide of lipoprotein is known to have the following amino acid sequence (Inouye, S.
等、 Proc、Natl、八cad、sr、i 、L
ISA、74,1004.1977)。etc., Proc, Natl, 8cad, sr, i, L
ISA, 74, 1004.1977).
Net−1、ys−八Ia−Thr−1,ys−Leu
−Val−Leu−Gly−Ala−Val−11e−
Leu−Gly−8er−Thr−Leu−Leu−八
1a−Gly−Cys−・=↑
シグナルペプチダーゼ切断部位
そこで、このシグナルペプチドのC末端にヒトカルシト
ニンを連結したポリペブチFの生産を検討した。シグナ
ルペプチド切断部位のグリシンの次にヒトカルシトニン
N末端のCysをつなげたポリベプチドをコートする遺
伝子を設計し、例1で示した方法に準じて、DNA合成
を行なった。ここで、hCTの紐1部位より3′側はプ
ラスミドpBcT31のものを使用したため、合成はX
yu部位より5′側について行なった。実際に合成した
DNAの塩基配列を以下に示した。Net-1, ys-8Ia-Thr-1, ys-Leu
-Val-Leu-Gly-Ala-Val-11e-
Leu-Gly-8er-Thr-Leu-Leu-81a-Gly-Cys-.=↑ Signal peptidase cleavage site Therefore, we investigated the production of polypeptide F in which human calcitonin was linked to the C-terminus of this signal peptide. A gene was designed to coat a polypeptide in which Cys at the N-terminus of human calcitonin was linked to glycine at the signal peptide cleavage site, and DNA synthesis was performed according to the method shown in Example 1. Here, since plasmid pBcT31 was used for the 3' side of the string 1 site of hCT, the synthesis was carried out with
The test was performed on the 5' side of the yu site. The base sequence of the DNA actually synthesized is shown below.
↑
1並R1切断末端
作製した合成遺伝子をプラスミド’pRCT3]のE
co RI −厘1部位に挿入し、ヒトカルシトニン−
コラゲナーゼ切断部位ペプチド−デスチオヒオチン合成
酵素融合ポリペプチドの大腸菌分泌発現プラスミドpB
CT33を作製した。pRCT33プラスミドの且亜R
1−凡旦I 180hpをpUc119の旦並RI−P
st1部位に組込み、例1に示した方法に準じてDNA
塩基配列を確認したとごろ、計画どおりの塩基配列が組
込まれていた。↑ The synthetic gene prepared with a parallel R1 cut end is inserted into the E of plasmid 'pRCT3].
coRI-1 site, human calcitonin-
Escherichia coli secretion expression plasmid pB of collagenase cleavage site peptide-desthiohyothine synthase fusion polypeptide
CT33 was produced. pRCT33 plasmid
1-Bandan I 180hp to pUc119's Tannami RI-P
st1 site and the DNA according to the method shown in Example 1.
When the base sequence was confirmed, the base sequence was incorporated as planned.
次に、例3と同様にして、PtacのSD配列と、hC
Tの翻訳開始^TG(pRcT31)またはlppの翻
訳開始ATG (pRCT33)との間隔を短かくした
発現プラスミド’pBCT32及びpBCT34を作製
した。塩基配列を確認した結果、pKK223−3hC
T(2)と同様に、いずれのプラスミドもF、coR1
部位に4bpの欠落が確認された。Next, in the same manner as in Example 3, the SD sequence of Ptac and hC
Expression plasmids 'pBCT32 and pBCT34 were constructed in which the interval between T translation initiation ^TG (pRcT31) or lpp translation initiation ATG (pRCT33) was shortened. As a result of confirming the base sequence, pKK223-3hC
Similar to T(2), both plasmids contain F, coR1
A 4 bp deletion was confirmed at the site.
例1で作製したhCT−1ac’7.融合遺伝子をサツ
カロミセス酵母で発現させる発現プラスミドを作製した
。酵母発現プロモーターとしては酵母GAL7(カラク
トース1リン酸ウリジルトランスフェラーゼをコードす
る遺伝子)プロモーター(特開昭60−248181号
)を用いた。酵母多コピープラスミドpMT34−3(
Taj ima、M等、 Mo1.Ce11.Riol
、、6,246゜1986)は、G A T、、 7遺
伝子の転写開始点上流271bpと下流3hpとからな
るG A L 7プロモーターを、B am HI −
旦dHで切出せる構造をしている。このプラスミドの4
n部位下流にhCT−1ac’Z融合遺伝子を連結して
酵母発現プラスミドを作製した。hCT-1ac'7. produced in Example 1. An expression plasmid was created to express the fusion gene in Saccharomyces yeast. As the yeast expression promoter, the yeast GAL7 (gene encoding caractose monophosphate uridyl transferase) promoter (Japanese Patent Application Laid-open No. 248181/1981) was used. Yeast multicopy plasmid pMT34-3 (
Tajima, M et al., Mo1. Ce11. Riol
, 6, 246° 1986), the GAL 7 promoter, which consists of 271 bp upstream of the transcription start point of the G AT 7 gene and 3 hp downstream, was converted into a Bam HI-
It has a structure that can be cut out with dH. 4 of this plasmid
A yeast expression plasmid was prepared by ligating the hCT-1ac'Z fusion gene downstream of the n site.
このプラスミド作製の手順の概略を第8図に示す。An outline of the procedure for producing this plasmid is shown in FIG.
実験操作は例1に示した方法に準じて行なった。Experimental operations were performed according to the method shown in Example 1.
プラスミドpRR322−Jで行なった方法に準して、
pUc119−hCTの月並R1部位をr<Irtに変
換したプラスミドpUc]19−hCT−Rgを作製し
た。p M T 34−3の几訃■−Σ11部位に、p
Uc119−hCT−BgD N A由来ノhCTを含
むBgl n −Sal I 130hpD N A
断片を挿入してpMT34−3hCTを得た。得られた
プラスミドのに凱T −S al T部位に、plIC
119−hCT−1ac’ZDNA由来のhCT−1a
c’Z iii伝子を含む相1−Sal T 6.3
Khpを挿入して、ヒトカルシトニン−コラゲナーゼ−
β−ガラクトシダーセ融合ポリペプチドの酵母発現プラ
スミl’ pMT]34−3を得た。According to the method performed with plasmid pRR322-J,
A plasmid pUc]19-hCT-Rg was prepared by converting the ordinary R1 site of pUc119-hCT to r<Irt. At the death ■-Σ11 site of p M T 34-3, p
Bgl n -Sal I 130hpDNA containing hCT derived from Uc119-hCT-BgDNA
The fragment was inserted to obtain pMT34-3hCT. In the NikaiT-SalT site of the obtained plasmid, plIC
hCT-1a derived from 119-hCT-1ac'Z DNA
Phase 1-Sal T 6.3 containing c'Z iii gene
By inserting Khp, human calcitonin-collagenase-
A yeast expression plasmid l'pMT]34-3 of the β-galactosidase fusion polypeptide was obtained.
DNA塩基配列を確認したところ、G A L 7遺伝
子の転写開始点下流16bpにhCTの翻訳開始ATG
の八が連結されていた。転写開始点からATGの塩基配
列は次のとおりであった。When the DNA base sequence was confirmed, the translation initiation ATG of hCT was located 16 bp downstream of the transcription start point of the G A L 7 gene.
Eight of them were connected. The base sequence of ATG from the transcription start point was as follows.
例3〜例5において作製した発現プラスミドpZT31
. pZT、’(2、pRcT31 、 pBcT32
、 pRc1’33及びpRCT34については大腸
菌で、そしてプラスミドp?lT134−3については
サツカロミセス酵母で発現を行なった。Expression plasmid pZT31 produced in Examples 3 to 5
.. pZT,'(2, pRcT31, pBcT32
, in E. coli for pRc1'33 and pRCT34, and in E. coli for plasmid p? lT134-3 was expressed in Saccharomyces yeast.
大腸菌はM2S株を用い、例3に示した方法で各プラス
ミドにより形質転換を行なった。形質転換株を、アンピ
シリン100 tt g / m Rを含む10mff
LR培地に植菌し、ODl、60が約1になるまで30
°Cで振とう培養した。培養液を5m7!づつ2本の試
験管に分け、一方には1mM TPTG(イソプロピル
−β−〇−チオガラクトピラノサイト添加し、他方はそ
のままで、30℃でさらに5時間振とう培養を続けた。E. coli strain M2S was used and transformed with each plasmid by the method shown in Example 3. The transformed strain was incubated with 10 mff containing ampicillin 100 tt g/mR.
Inoculate into LR medium and incubate for 30 minutes until ODl, 60 becomes approximately 1.
Cultured with shaking at °C. 5m7 of culture solution! The mixture was divided into two test tubes, and 1 mM TPTG (isopropyl-β-〇-thiogalactopyranocytes was added to one test tube), and the other was left as it was, and the shaking culture was continued at 30° C. for an additional 5 hours.
培養後、遠心分離により集菌し、滅菌水で1回洗浄して
、細胞懸濁液を得た。After culturing, the cells were collected by centrifugation and washed once with sterile water to obtain a cell suspension.
非分泌型プラスミドによる形質転換株の場合には、前記
の細胞懸濁液を10mM )リス塩酸緩衝液(pH8,
0) 1 mM EDTA −0,1mM DTT
(ジチオスレイトール)に加えて菌体を分散させた。懸
濁液を超音波処理し、菌体を破砕し、遠心分離により細
胞抽出液を得た。一方、分泌型プラスミドpBcT33
及びpBCT34による形質転換株については、ペリプ
ラズム分画を浸透圧ショック法で調製した。すなわち、
上記の水洗浄後の細胞懸濁液を遠心分離した後、20%
シヨ糖−30mM)リス塩酸緩衝液(pH8,0) −
1mMEDTAに分散させた。遠心分離により沈澱を得
、冷水に分散し、浸透圧ショックをかけた。In the case of a transformed strain using a non-secreting plasmid, the above cell suspension was diluted with 10mM) Lis-HCl buffer (pH 8,
0) 1mM EDTA -0,1mM DTT
(dithiothreitol) and the bacterial cells were dispersed. The suspension was sonicated to disrupt the bacterial cells, and a cell extract was obtained by centrifugation. On the other hand, secretory plasmid pBcT33
For the transformed strains using pBCT34 and pBCT34, periplasmic fractions were prepared by the osmotic shock method. That is,
After centrifuging the cell suspension after washing with water, 20%
Sucrose - 30mM) Lis-HCl buffer (pH 8,0) -
Dispersed in 1mM EDTA. A precipitate was obtained by centrifugation, dispersed in cold water, and subjected to osmotic shock.
遠心分離により上清液を得てペリプラズム分画とした。A supernatant was obtained by centrifugation and used as a periplasm fraction.
得られた抽出液について、次に示した定量試験を行なっ
た。The following quantitative test was conducted on the obtained extract.
(i)ヒトカルシトニンの定量
第1ラジオアイソトープ研究所製カルシトニンキット「
第1」を用いてラジオイムノアッセイにより定量した。(i) Quantification of human calcitonin Calcitonin kit manufactured by the First Radioisotope Research Institute
It was quantified by radioimmunoassay using "No. 1".
操作手順は使用説明書に従った。The operating procedure followed the instruction manual.
(ii )β−ガラクトシダーゼの定量0NPG(o−
ニトロフェニルガラクトピラノシド)を基質としたミラ
ーの方法(Miller、J、Il、+Exp、Mol
。(ii) Quantification of β-galactosidase 0NPG (o-
Miller's method (Miller, J, Il, +Exp, Mol
.
Gen、Co1d Spring tlarbor L
ab、Press Co1d Springtlarh
or、NJ、p352.1972)に従って定量した。Gen, Col1d Spring trough L
ab, Press Co1d Springtlarh
or, NJ, p352.1972).
活性は、1 nmoleの0NPGを28°C1分間で
分解するのに必要な酵素活性を1単位として示した。The activity was expressed as 1 unit of enzyme activity required to decompose 1 nmole of 0NPG in 1 minute at 28°C.
(iii )蛋白量の定量
ローリ−法(Lowry、0.H,、等、 J、Bio
l、Chem、 + 193+265、1951)によ
り定量した。検量線はウシ血清アルブミン(シグマ社製
、フラクション■)を用いて作製した。(iii) Quantification of protein amount by Lowry method (Lowry, 0.H, et al., J. Bio.
Chem, +193+265, 1951). A calibration curve was prepared using bovine serum albumin (manufactured by Sigma, fraction ■).
定量結果を第3表にまとめた。The quantitative results are summarized in Table 3.
一方、プラスミドpMT134−3をサツカロミセス酵
母MT8−1株(土、閃[、顧、恒バト1犯戊、屁)(
Tajima、M等、 Mo1.Ce11.Biol、
6.246.1986 )にに導入した。形質転換は
、塩化リチウム法(Ito、)I。On the other hand, plasmid pMT134-3 was transferred to Saccharomyces yeast MT8-1 strain (Sat, Sen [, Gu, Ko, Kobato 1 crime, Fart) (
Tajima, M et al., Mo1. Ce11. Biol,
6.246.1986). Transformation was performed using the lithium chloride method (Ito, )I.
等、 J、Bacteriol、、153,163.1
983)により行ない、ウラシルを含まない最小培地[
0,66%アミノ酸除去酵母窒素源ベース(ディフコ社
製)、0.5%カザミノ酸(ディフコ社製)、0.00
2%I、−トリプトファン、0.004%硫酸アデニン
、2%グリセロール、2%乳酸ナトリウム、2%アガロ
ース(以後、本培地をS Gly Lac固形培地と呼
び、アガロースを除いた培地をS Gly 1.ac培
地と呼ぶ)]で生育する株を拾った。得られた形質転換
株を、10m7!のS Gly Lac培地に植菌し、
30℃で振とう培養を行なった。菌体量が107/mβ
になるまで増殖させ、培養液を5mpづつに分け、一方
に2%ガラクトースを添加してさらに30℃で6時間培
養を続けた。培養後に集菌し、上記の大腸菌細胞抽出液
を得るのと同様な方法で細胞抽出液を得た。さらに、大
腸菌糸と同様に、(i)ヒトカルシトニンの定量、(I
1)β−ガラクトシダーゼの定量、及び(iii )蛋
白量の定量を行ない、その結果を第3表に示した。et al., J. Bacteriol., 153, 163.1
983) using minimal medium without uracil [
0.66% amino acid removed yeast nitrogen source base (manufactured by Difco), 0.5% casamino acids (manufactured by Difco), 0.00
2% I, -tryptophan, 0.004% adenine sulfate, 2% glycerol, 2% sodium lactate, 2% agarose (hereinafter, this medium will be referred to as S Gly Lac solid medium, and the medium without agarose will be referred to as S Gly 1. (referred to as ac medium)]. The obtained transformed strain was divided into 10m7! inoculated into S Gly Lac medium of
Shaking culture was performed at 30°C. Bacterial cell amount is 107/mβ
The culture solution was divided into 5 mp portions, 2% galactose was added to one portion, and the culture was further continued at 30° C. for 6 hours. After culturing, bacteria were harvested, and a cell extract was obtained in the same manner as the above-mentioned method for obtaining the E. coli cell extract. Furthermore, similar to E. coli hyphae, (i) quantification of human calcitonin, (I
1) Quantification of β-galactosidase and (iii) quantification of protein amount were carried out, and the results are shown in Table 3.
大腸菌及び酵母ともに、プロモーターの誘導により、カ
ルシトニン生産量が増大することが確認、された。また
、大腸菌分泌ベクター系でも、ペリプラズム分画へのカ
ルシトニン融合蛋白質の移行が示され、シグナルペプチ
ドが機能的に働いたことが分かった。It was confirmed that calcitonin production increases in both E. coli and yeast by promoter induction. Furthermore, in the E. coli secretion vector system, the calcitonin fusion protein was also shown to be transferred to the periplasmic fraction, indicating that the signal peptide was functional.
なお、本例で創製した形質転換体である大腸菌M2S株
(pZT32 )及び大腸菌M2S株(pBcT34’
1は、各々、工業技術院微律物工業技441研究所に寄
託した。受託番号は、各々、微王研菌寄第9266号及
び微工研菌寄第9267号である。The transformants created in this example, E. coli M2S strain (pZT32) and E. coli M2S strain (pBcT34'
1 have been deposited at the National Institute of Industrial Science and Technology 441, respectively. The accession numbers are Keioken Bokuyori No. 9266 and Keikoken Bikoyori No. 9267, respectively.
、1・余白
第3表:ヒトカルシ[ニン融合ポリペプチド発現プラス
ミドの大腸菌及び酵母による発現桝1士丸↓カルシトニ
ンーコラf史二叉屡斯里位プラスミドpZT32で形質
転換した大腸菌M15株を、5βジャーファーメンタ−
(丸菱01製)を用いて21培養した。, 1. Margin Table 3: Expression of human calcitonin fusion polypeptide expression plasmid by E. coli and yeast.Escherichia coli strain M15 transformed with calcitonin-cola f history 2 proximal plasmid pZT32 was transformed into 5β Jafa Mentor
(manufactured by Marubishi 01) and cultured for 21 days.
培地は、以下に示したものを使用した。The medium shown below was used.
Na211PO+ ’ 1211□0 1.8
%Kll□PO40,2%
(NI14)2S04 0.2%酵母
エキス 0.5%
ハクトペプトン(Dirco) 0.5%Mg5
Oa・71120 0.01%ブドウ#N
O,5%アンピシリン
150trrr / m j!アンピシリン150μ
g / m 7!を含むI−B培地で30℃1晩の前培
養をした菌液2m7!を前記の培地に植菌しで、30℃
で培養した。1 vvmで空気を通気し、苛性ソーダで
培地p++を7.0に調整しなから培養を続けた。4時
間培養してOD rho = 2となったときに、r
PTGを1mM?1度で添加した。さらに、6時間培養
を続け、0Db
ところで遠心分離により集菌した。滅菌水で洗浄した後
、菌体を10111Mトリス塩酸(pH8,0) −1
mMEDT^−0,1mM DTTに懸濁し、X−プレ
ス(八11 RIOX社製)を用いて菌体を破砕した。Na211PO+ ' 1211□0 1.8
%Kll□PO40,2% (NI14)2S04 0.2% Yeast extract 0.5% Hactopeptone (Dirco) 0.5% Mg5
Oa・71120 0.01% Grape #N
O, 5% ampicillin
150trrr/mj! Ampicillin 150μ
g/m 7! 2 m7 of bacterial solution pre-cultured at 30°C overnight in I-B medium containing was inoculated into the above medium and heated at 30°C.
It was cultured in The culture was continued after aeration with air at 1 vvm and adjusting the medium p++ to 7.0 with caustic soda. When OD rho = 2 after 4 hours of culture, r
1mM PTG? Added once. Furthermore, the culture was continued for 6 hours, and the bacteria were collected by centrifugation at 0 Db. After washing with sterile water, the bacterial cells were washed with 10111M Tris-HCl (pH 8,0) -1
The cells were suspended in mMEDT^-0 and 1mM DTT, and the cells were disrupted using an X-press (manufactured by Hachi11 RIOX).
遠心分離により得られた上清を細胞抽出液とした。The supernatant obtained by centrifugation was used as a cell extract.
β−ガラクトシダーゼ活性を指標として、ヒトカルシト
ニン融合ポリペプチドの精製を行なった。The human calcitonin fusion polypeptide was purified using β-galactosidase activity as an indicator.
まず、硫酸アンモニウムを40%飽和量添加し、4°C
で1晩放置後、遠心分離により沈澱を得た。First, ammonium sulfate was added in a 40% saturation amount, and the temperature was increased to 4°C.
After standing for one night, a precipitate was obtained by centrifugation.
この(0〜40%飽和)硫安分画にβ−ガラクトシダー
ゼ活性はほぼ100%回収され、比活性は約1.8倍に
上昇した。次に、ミリボア社製のタイプPTフィルター
を用いた限外濾過により脱塩し、さらにDEAR−セフ
ァロースC1,−6B(ファルマシア社製)を用いたイ
オン交換カラムクロマトグラフィーにより精製した。溶
出緩衝液は10mMトリス塩酸緩衝液(pH7,4)
10mMメルカプトエタノール10mM塩化マグネシ
ウムを用いた。第9図の溶出パターンに示すように、非
吸着蛋白質が溶出した時期に塩化ナトリウム(250m
n X 2 )で直線濃度勾配(第9図において破線で
示す)をかけて吸着蛋白質を溶出させた。第9図では、
ミラーの方法で測定したβ−ガラクトシダーゼ活性をA
4□。。Almost 100% of the β-galactosidase activity was recovered in this (0 to 40% saturated) ammonium sulfate fraction, and the specific activity increased approximately 1.8 times. Next, it was desalted by ultrafiltration using a type PT filter manufactured by Millibore, and further purified by ion exchange column chromatography using DEAR-Sepharose C1,-6B (manufactured by Pharmacia). Elution buffer is 10mM Tris-HCl buffer (pH 7.4)
10mM mercaptoethanol and 10mM magnesium chloride were used. As shown in the elution pattern in Figure 9, at the time when non-adsorbed proteins were eluted, sodium chloride (250 m
A linear concentration gradient (indicated by the broken line in FIG. 9) was applied to elute the adsorbed protein. In Figure 9,
A β-galactosidase activity measured by Miller's method
4□. .
(−)で示し、ローリ−法(Lowry 、 0 、
If 、等、J。(-) indicates the Lowry method (Lowry, 0,
If, et al., J.
Riol、Chem、、193,265.1951)で
測定した蛋白量をA75O11、(・−)で示した。ロ
ーリ−法の検量線はウシ面端アルブミン(シグマネ]製
、フラクション■)を用いて作製した。ワラクシジンN
0.30付近に活性のピークが認められた。そこで、フ
ラクション11h30及びNa31を精製蛍白分画とし
た。The protein amount measured by Riol, Chem, 193, 265.1951) is shown as A75O11, (.-). A calibration curve for the Lowry method was prepared using bovine edge albumin (manufactured by Sigman Co., Ltd., fraction ①). Varaxidin N
An activity peak was observed around 0.30. Therefore, fractions 11h30 and Na31 were treated as purified fluorescent fractions.
以上の処理による比活性の挙動を次の第4表に示した。The behavior of specific activity resulting from the above treatment is shown in Table 4 below.
以下余白
第4表
精製により比活性は約6倍に上昇し、160,000U
/■蛋白質となった。精製試料について、Laemml
iの方法(Laemmli、Il、に、、Nature
、227,680゜1970)に従って12%5DS−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SO3−PAGE)
を行なった。染色はクマシーブリリアントブルーで行な
った。分子量マーカーとしては、シグマ社製分子量マー
カーキソ) 30.000〜200,000を用いた。Table 4 in the margin below: Purification increased the specific activity by about 6 times to 160,000U.
/■ Became a protein. For purified samples, Laemml
i's method (Laemmli, Il., Nature
, 227,680°1970) 12%5DS-
Polyacrylamide gel electrophoresis (SO3-PAGE)
I did it. Staining was performed with Coomassie brilliant blue. As the molecular weight marker, a molecular weight marker (Kiso) 30,000 to 200,000 manufactured by Sigma was used.
第10図のDEAE −セファロース処理後(I)およ
び分子量マーカー(2)に示すように、かなり精製され
ていた。As shown in FIG. 10 after DEAE-Sepharose treatment (I) and molecular weight marker (2), it was significantly purified.
116KDa付近のハントは全蛋白質の50%以十であ
った。116KDaの分子量マーカーはβ−ガラクトシ
ダーゼである。融合蛋白質もほぼ同じ位置に認められた
。カルシトニンーコラゲナーセ切断部位ペプチドの分子
量は4 WDaなので、β−ガラクトシダーゼに融合す
るとほとんど分子量差が検出できなくなるためと考えら
れる。Hunt around 116 KDa accounted for more than 50% of the total protein. The molecular weight marker of 116 KDa is β-galactosidase. The fusion protein was also observed at almost the same location. This is thought to be because the molecular weight of the calcitonin-collagenase cleavage site peptide is 4WDa, so when it is fused to β-galactosidase, the difference in molecular weight becomes almost undetectable.
例7で精製したヒトカルシトニン−コラゲナーゼ切断部
位ペプチド−β−ガラクトシダーゼ融合ポリペプチドを
コラゲナーゼを用いて特異的に分解し、ヒトカルシトニ
ンC末端グリシン付加体を得た。コラゲナーゼは大野製
薬製のクロストリシームペプチダーゼを用いた。反応液
組成を以下に示した。The human calcitonin-collagenase cleavage site peptide-β-galactosidase fusion polypeptide purified in Example 7 was specifically degraded using collagenase to obtain a human calcitonin C-terminal glycine adduct. Clostricheme peptidase manufactured by Ohno Pharmaceutical was used as collagenase. The reaction solution composition is shown below.
5mM 塩化カルシウム
50mM トリス塩酸緩衝液pl+7.5200mM
塩化ナトリウム
10mMN−エチルマレイミF
IINZ/rl! 融合蛋白質精製標品100ユニツ
ト/mβ コラゲナーゼ
酵素反応を37℃で15時間行ない、Il 111.C
により反応生成物を確認した。■円、Cは、例1と同様
に、島津製作所製5PD−6Aを用い、カラムはODS
系の資生堂製カブシルバックC−184,6φを用いた
。溶出は、下記の第5表の条件で直線濃度勾配をかけて
、流速1.5 m l /minで行なった。5mM calcium chloride 50mM Tris-HCl buffer pl+7.5200mM
Sodium chloride 10mM N-ethylmaleimi F IINZ/rl! Purified fusion protein preparation 100 units/mβ Collagenase enzyme reaction was carried out at 37°C for 15 hours, and Il 111. C
The reaction product was confirmed. ■For circles and C, as in Example 1, 5PD-6A manufactured by Shimadzu Corporation was used, and the column was ODS.
Kabucilback C-184, 6φ manufactured by Shiseido was used. Elution was performed at a flow rate of 1.5 ml/min by applying a linear concentration gradient under the conditions shown in Table 5 below.
第5表
この条件で、ヒトカルシトニン標準試薬(シグマ社製)
は、15.9分後に溶出した。コラゲナーセ反応液の溶
出パターンを第11図に、そして未反応液(反応0分)
のものを第12図に示した。反応液のパターンでは、1
3.6分(ピークA) 、16.0分(ピークB)及び
17.9分(ピークC)に、未反応液のパターンでは見
られない反応分解物が検出された。ピークBの溶出時間
は、ヒト力ルシトニン標準試薬の溶出時間にほぼ一致し
た。さらに、ピークBの反応分解物を分取して凍結乾燥
した後、気相プロティンシーケンサ−(アプライドバイ
オシステムズ社製モデル470A)を用いてアミノ酸配
列を確認したところ、次のような配列であり、ヒトカル
シトニンC末端グリシン付加体に相当するものであるこ
とが分かった。Table 5 Under these conditions, human calcitonin standard reagent (manufactured by Sigma)
eluted after 15.9 minutes. Figure 11 shows the elution pattern of the collagenase reaction solution, and the unreacted solution (reaction 0 minutes).
The one shown in Fig. 12. In the reaction solution pattern, 1
At 3.6 minutes (peak A), 16.0 minutes (peak B), and 17.9 minutes (peak C), reaction decomposition products that were not seen in the pattern of the unreacted liquid were detected. The elution time of peak B almost matched the elution time of the human lucitonin standard reagent. Furthermore, after the reaction decomposition product of peak B was separated and freeze-dried, the amino acid sequence was confirmed using a gas phase protein sequencer (Model 470A manufactured by Applied Biosystems), and the sequence was as follows. It was found that it corresponds to a C-terminal glycine adduct of human calcitonin.
X−Gly−Asn−1,eu−5er−Thr−X−
Met−Leu−Gly−Thr−Tyr−Thr−G
ln−八5p−Phe−Asn−Lys−Phe−11
is−1゛hr−Phe−Pro−Gly−Thr−A
la−11e−Gly−シal−Gly−へ1a−Pr
o−Gly(Xは不明をあられす)。X-Gly-Asn-1,eu-5er-Thr-X-
Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-G
ln-85p-Phe-Asn-Lys-Phe-11
is-1゛hr-Phe-Pro-Gly-Thr-A
la-11e-Gly-sial-Gly-to 1a-Pr
o-Gly (X means unknown).
以上のように、ヒトカルシトニンC末端グリシン付加体
が効率良く得られた。このヒトカルシトニンC末端グリ
シン付加体は、C末端アミド化酵素(Bradury、
八、Fl等、Nature、298.686.1982
)で反応させることで、容易にヒトカルシトニンに変換
することができる。なお、ピークCの分解物について同
様にアミノ酸配列を確認したところ、N末端にメチオニ
ンの付加したヒトカルシトニンC末端グリシン付加体で
あった。As described above, a human calcitonin C-terminal glycine adduct was efficiently obtained. This human calcitonin C-terminal glycine adduct is produced by C-terminal amidation enzyme (Bradury,
8, Fl et al., Nature, 298.686.1982
) can be easily converted to human calcitonin. When the amino acid sequence of the degradation product of peak C was similarly confirmed, it was found to be a C-terminal glycine adduct of human calcitonin with methionine added to the N-terminus.
第1図は、例1の1本鎖DNA(iv)の保護基脱離後
の生成物についてのIIPLCの溶出パターンを示すグ
ラフである。
第2図は、第1図の試料を分取しそしてトリチル基を脱
離した後の生成物についてのIIPLcの溶出パターン
を示すグラフである。
第3図は、pUc118−hCTのシーケンスラダーを
示す図面に代る写真である。
第4図は、プラスミドpLIC119−hCT−(J
ac’Zの作製手順を示す説明図である。図中で、矢印
は転写の方向を示す。
第5図は、プラスミドpHc119−hCT−hio’
Dの作製手順を示す説明図である。
第6図は、ブラスミFpZT31の作製手順を示す説明
図である。
第7図は、プラスミドpBcT31 、 pRCT32
、 pBCT33 。
及びpBCT34の作製手順を示す説明図である。
第8図は、酵母発現プラスミドpMT134−3の作製
手順を示す説明図である。
第9図は、DEAE−セファロースCL−6Bイオン交
換カラムクロマトグラフィーの?容出パターンを示すグ
ラフである。
第10図は、カルシトニン融合ポリペプチド精製標品の
12%5DS−PAGEの結果を示す図面に代る写真で
ある。
第11図は、カルシI・ニン融合ポリペプチドをコラゲ
ナーゼ処理した試料についてのIIPl、Cの溶出パタ
ーンを示すグラフである。
第12図は、カルシトニン融合ポリペプチドのコラゲナ
ーゼ処理前の試料についての11P1、Cの溶出パター
ンを示すグラフである。
ori・・・大腸菌複製開始領域; 旧31G・・・M
13ファージ糾換え領域; Amp’・・・城虹遺伝
子; Km”・・・カナマイシン耐性遺伝子領域;
tet’・・・テトラサイクリン耐性遺伝子領域;
rrB・・・rrBリポソームRNAの転写終結領域;
2μori・・・酵母2μプラスミドの複製開始領域。
第10図
;粟11 叉FIG. 1 is a graph showing the IIPLC elution pattern of the product after deprotection of the single-stranded DNA (iv) of Example 1. FIG. 2 is a graph showing the elution pattern of IIPLc for the product after aliquoting the sample of FIG. 1 and removing the trityl group. FIG. 3 is a photograph in place of a drawing showing the sequence ladder of pUc118-hCT. Figure 4 shows plasmid pLIC119-hCT-(J
FIG. 2 is an explanatory diagram showing the procedure for producing ac'Z. In the figure, arrows indicate the direction of transcription. Figure 5 shows plasmid pHc119-hCT-hio'
It is an explanatory view showing a manufacturing procedure of D. FIG. 6 is an explanatory diagram showing the procedure for producing Blasumi FpZT31. Figure 7 shows plasmids pBcT31 and pRCT32.
, pBCT33. FIG. 3 is an explanatory diagram showing the procedure for producing pBCT34. FIG. 8 is an explanatory diagram showing the procedure for producing yeast expression plasmid pMT134-3. Figure 9 shows the results of DEAE-Sepharose CL-6B ion exchange column chromatography. It is a graph showing a discharge pattern. FIG. 10 is a photograph in place of a drawing showing the results of 12% 5DS-PAGE of a purified calcitonin fusion polypeptide sample. FIG. 11 is a graph showing the elution pattern of IIPl and C for a sample in which the calci I/nin fusion polypeptide was treated with collagenase. FIG. 12 is a graph showing the elution pattern of 11P1,C for a sample of calcitonin fusion polypeptide before collagenase treatment. ori... E. coli replication initiation region; old 31G...M
13 Phage recombination region; Amp'...Johong gene; Km"...Kanamycin resistance gene region;
tet'...tetracycline resistance gene region;
rrB...transcription termination region of rrB liposomal RNA;
2μori...Replication initiation region of yeast 2μ plasmid. Figure 10; millet 11 forks
Claims (1)
基を持つポリペプチドを示し、Bは1個のアミノ酸残基
を示し、−はペプチド結合を示し、そしてプロリンはL
型であるものとする) で示されるポリペプチドをコードする遺伝子。 2、AがカルシトニンのN末端より31アミノ酸残基ま
でのポリペプチドであり、Bがグリシン残基である特許
請求の範囲第1項記載の遺伝子。 3、AがヒトカルシトニンのN末端より31アミノ酸残
基までのポリペプチドであり、Bがグリシン残基である
特許請求範囲第1項記載の遺伝子。 4、Cが大腸菌β−ガラクトシダーゼをコードする¥l
acZ¥遺伝子である特許請求の範囲第1項から第3項
のいずれか1項に記載の遺伝子。 5、Cが大腸菌デスチオビオチン合成酵素をコードする
¥bioD¥遺伝子である特許請求の範囲第1項から第
3項のいずれか1項に記載の遺伝子。 6、一般式( I ) A−プロリン−B−グリシン− プロリン−C( I ) (ここで、AおよびCはそれぞれ2個以上のアミノ酸残
基を持つポリペプチドを示し、Bは1個のアミノ酸残基
を示し、−はペプチド結合を示し、そしてプロリンはL
型であるものとする) で示されるポリペプチドをコードする遺伝子を、発現プ
ロモーターの下流に連結して含むことを特徴とする発現
プラスミドDNA。 7、発現プロモーターが大腸菌¥tac¥プロモーター
である特許請求の範囲第6項記載の発現プラスミドDN
A。 8、発現プロモーターが酵母サッカロミセス・セレビジ
ェの¥GAL7¥プロモーターである特許請求の範囲第
6項記載の発現プラスミドDNA。 9、発現プロモーターと一般式( I )の遺伝子との間
に、微生物の分泌蛋白質のシグナルペプチド部分をコー
ドする遺伝子をコドン読みわくを合せて挿入する、分泌
型の特許請求の範囲第6項記載の発現プラスミドDNA
。 10、シグナルペプチド遺伝子が大腸菌リポプロテイン
蛋白質をコードする¥lpp¥遺伝子のものである特許
請求の範囲第9項記載の発現プラスミドDNA。 11、一般式( I ) A−プロリン−B−グリシン− プロリン−C( I ) (ここで、AおよびCはそれぞれ2個以上のアミノ酸残
基を持つポリペプチドを示し、Bは1個のアミノ酸残基
を示し、−はペプチド結合を示し、そしてプロリンはL
型であるものとする) で示されるポリペプチドをコードする遺伝子を発現プロ
モーターの下流に連結して含む発現プラスミドにより形
質転換された微生物。 12、微生物が大腸菌である特許請求の範囲第11項記
載の微生物。 13、微生物が酵母サッカロミセスセレビジェである特
許請求の範囲第11項記載の微生物。 14、一般式( I ) A−プロリン−B−グリシン− プロリン−C( I ) (ここで、AおよびCはそれぞれ2個以上のアミノ酸残
基を持つポリペプチドを示し、Bは1個のアミノ酸残基
を示し、−はペプチド結合を示し、そしてプロリンはL
型であるものとする) で示されるポリペプチド。 15、一般式( I ) A−プロリン−B−グリシン− プロリン−C( I ) (ここで、AおよびCはそれぞれ2個以上のアミノ酸残
基を持つポリペプチドを示し、Bは1個のアミノ酸残基
を示し、−はペプチド結合を示し、そしてプロリンはL
型であるものとする) で示されるポリペプチドをコードする遺伝子を、発現プ
ロモーターの下流に連結して含む発現プラスミドにより
形質転換された微生物を培養することを特徴とする、前
記一般式( I )のポリペプチドの生産方法。 16、一般式( I ) A−プロリン−B−グリシン− プロリン−C( I ) (ここで、AおよびCはそれぞれ2個以上のアミノ酸残
基を持つポリペプチドを示し、Bは1個のアミノ酸残基
を示し、−はペプチド結合を示し、そしてプロリンはL
型であるものとする) で示されるポリペプチドをコードする遺伝子を、発現プ
ロモーターの下流に連結して含む発現プラスミドにより
形質転換された微生物を培養して生成した一般式( I
)のポリペプチドをコラゲナーゼ処理して前記一般式(
I )中のBとグリシンとの間を切断することを特徴と
する、ポリペプチドの生産方法。 17、ヒトカルシトニンC末端グリシン付加体を生産す
る特許請求の範囲第16項記載の方法。[Claims] 1. General formula (I) A-proline-B-glycine-proline-C (I) (where A and C each represent a polypeptide having two or more amino acid residues, B represents one amino acid residue, - represents a peptide bond, and proline represents L
A gene encoding a polypeptide represented by 2. The gene according to claim 1, wherein A is a polypeptide up to 31 amino acid residues from the N-terminus of calcitonin, and B is a glycine residue. 3. The gene according to claim 1, wherein A is a polypeptide up to 31 amino acid residues from the N-terminus of human calcitonin, and B is a glycine residue. 4. C encodes E. coli β-galactosidase¥l
The gene according to any one of claims 1 to 3, which is the acZ\ gene. 5. The gene according to any one of claims 1 to 3, wherein C is the \bioD\ gene encoding Escherichia coli desthiobiotin synthase. 6. General formula (I) A-Proline-B-Glycine-Proline-C (I) (Here, A and C each represent a polypeptide having two or more amino acid residues, and B represents one amino acid residue. residue, - indicates a peptide bond, and proline indicates L
An expression plasmid DNA characterized in that it contains a gene encoding a polypeptide of the following type, linked downstream of an expression promoter. 7. Expression plasmid DN according to claim 6, wherein the expression promoter is E. coli\tac\ promoter
A. 8. The expression plasmid DNA according to claim 6, wherein the expression promoter is the \GAL7\ promoter of the yeast Saccharomyces cerevisiae. 9. Claim 6 of the secretory type patent, in which a gene encoding a signal peptide portion of a secretory protein of a microorganism is inserted between the expression promoter and the gene of general formula (I) with codon reading frames aligned. Expression plasmid DNA of
. 10. The expression plasmid DNA according to claim 9, wherein the signal peptide gene is from the \lpp\ gene encoding E. coli lipoprotein protein. 11. General formula (I) A-Proline-B-Glycine-Proline-C (I) (Here, A and C each represent a polypeptide having two or more amino acid residues, and B represents one amino acid residue. residue, - indicates a peptide bond, and proline indicates L
A microorganism transformed with an expression plasmid containing a gene encoding a polypeptide shown in (type) linked downstream of an expression promoter. 12. The microorganism according to claim 11, wherein the microorganism is Escherichia coli. 13. The microorganism according to claim 11, wherein the microorganism is the yeast Saccharomyces cerevisiae. 14. General formula (I) A-Proline-B-Glycine-Proline-C (I) (Here, A and C each represent a polypeptide having two or more amino acid residues, and B represents one amino acid residue. residue, - indicates a peptide bond, and proline indicates L
polypeptide of type ). 15. General formula (I) A-Proline-B-Glycine-Proline-C (I) (Here, A and C each represent a polypeptide having two or more amino acid residues, and B represents one amino acid residue. residue, - indicates a peptide bond, and proline indicates L
The above-mentioned general formula (I) is characterized in that a microorganism transformed with an expression plasmid containing a gene encoding a polypeptide represented by A method for producing a polypeptide. 16, General formula (I) A-Proline-B-Glycine-Proline-C (I) (Here, A and C each represent a polypeptide having two or more amino acid residues, and B represents one amino acid residue. residue, - indicates a peptide bond, and proline indicates L
A microorganism transformed with an expression plasmid containing a gene encoding a polypeptide of the general formula
) is treated with collagenase to form the polypeptide of the general formula (
I) A method for producing a polypeptide, which comprises cleaving between B and glycine. 17. The method according to claim 16 for producing a human calcitonin C-terminal glycine adduct.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP62060171A JPS63226288A (en) | 1987-03-17 | 1987-03-17 | Novel gene, its manifestation plasmid dna and transformed microorganism |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP62060171A JPS63226288A (en) | 1987-03-17 | 1987-03-17 | Novel gene, its manifestation plasmid dna and transformed microorganism |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS63226288A true JPS63226288A (en) | 1988-09-20 |
Family
ID=13134450
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP62060171A Pending JPS63226288A (en) | 1987-03-17 | 1987-03-17 | Novel gene, its manifestation plasmid dna and transformed microorganism |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS63226288A (en) |
-
1987
- 1987-03-17 JP JP62060171A patent/JPS63226288A/en active Pending
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