JPS63209598A - Nonoclonal rheumatoid factor of igg type and preparation thereof - Google Patents
Nonoclonal rheumatoid factor of igg type and preparation thereofInfo
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Abstract
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明はＩｇＧ型モノクローナルリウマトイド因子及び
その調製法に係り、殊に自己免疫疾患モデルマウスであ
るＭＲＬ／Ｍｐ−１ｐｒ／ １２ ｐｒ？ウス由来の１
ｇＧ型モノクローナルリウマトイド因子及びその調製法
に係る。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION (Field of Industrial Application) The present invention relates to an IgG type monoclonal rheumatoid factor and a method for preparing the same, and particularly relates to an autoimmune disease model mouse, MRL/Mp-1pr/12pr? 1 derived from Usu
This invention relates to gG-type monoclonal rheumatoid factor and its preparation method.
本発明によるＩｇＧ型モノクローナルリウマトイド因子
は自己免疫疾患等において病因の１つとして問題となっ
ている免疫複合体の測定に利用し得る可能性がある。The IgG type monoclonal rheumatoid factor according to the present invention may be used to measure immune complexes, which are a problem as one of the causes of autoimmune diseases.
（従来の技術）
リウマトイド因子（Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ Ｆａｃｔｏ
ｒ）は主に慢性関節リウマチ患者の血清中に見られる物
質であって、自己、同種又は異種のＩｇＧに対する抗体
であり、各免疫グロブリンクラス（ＩｇＧ、 ＩｇＭ、
ＩｇＡ。(Prior art) Rheumatoid factor
r) is a substance mainly found in the serum of patients with rheumatoid arthritis, and is an antibody against autologous, homologous or foreign IgG, and is an antibody against each immunoglobulin class (IgG, IgM,
IgA.
ＩｇＥ及びＩｇＤ ）に存在することが知られるに至っ
ている。It has come to be known that it exists in IgE and IgD).
リウマトイド因子は抗原抗体結合物と特異的に反応する
ことから、自己免疫疾患等の病因の１つとして問題にな
っている抗原抗体結合物の測定法に、このリウマトイド
因子を使用した測定法がアプローチされて来ている。特
に、ワルデンストローム・マクログロブリネミア（Ｗａ
１ｄｅｎｓ ｔｒａｍｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎｅ
ｍｉａ）の患者血清中にはモノクローナルリウマトイド
因子が存在し、このモノクローナルリウマトイド因子を
使用する抗原抗体結合物の測定法は他の抗原抗体結合物
測定法と比較して感度が良好であり、又広範囲の抗原抗
体結合物を測定し得るので、各種の抗原抗体物の正確な
測定法の１つとして期待されている。しかしながら、こ
の場合にはりウマトイド因子として患者血清由来のもの
が用いられ、従って入手が容易とは云えず、又血清を得
た患者に依存してリウマトイド因子の免疫グロブリンク
ラス、力価及び反応性に差があることから、常に一定の
りウマトイド因子を得ることは不可能であるために、上
記の抗原抗体結合物測定法は一般化されるに至っていな
い。Since rheumatoid factor specifically reacts with antigen-antibody combinations, this measurement method using rheumatoid factor is an approach to measuring antigen-antibody combinations, which have become a problem as one of the causes of autoimmune diseases. It's been happening. In particular, Waldenstrom macroglobulinemia (Wa
1dens trammacroglobuline
Monoclonal rheumatoid factor is present in the serum of patients with mia), and the method for measuring antigen-antibody complexes using this monoclonal rheumatoid factor has better sensitivity than other methods for measuring antigen-antibody complexes, and can be used over a wide range. This method is expected to be an accurate method for measuring various antigen-antibody compounds because it can measure antigen-antibody combinations. However, in this case, rheumatoid factor derived from patient serum is used, and therefore it is not easy to obtain, and the immunoglobulin class, titer, and reactivity of rheumatoid factor depend on the patient from whom the serum was obtained. Because of the differences, it is impossible to always obtain a constant level of rheumatoid factor, so the above-mentioned method for measuring antigen-antibody complexes has not become generalized.
一方、免疫されたマウスの脾細胞を抗体産生細胞とし、
これとミエローマ細胞とを細胞融合させることにより得
られるハイブリドーマを用いることにより単−且つ均質
な抗体を製造でき、従ってこのような抗体を安定に供給
し得ることがミルシュタイン等により報告（ｒＮａｔｕ
ｒｅＪ第２５６＠、第４９５頁、１９７５年）されて以
来、種々の抗原に対するモノクローナル抗体についての
報告がなされており、各種のモノクローナル抗体の作製
技術も既に一般化されるに至っている。On the other hand, splenocytes of immunized mice were used as antibody-producing cells,
Milstein et al. reported that a single and homogeneous antibody can be produced by using a hybridoma obtained by cell fusion with myeloma cells, and that such antibodies can be stably supplied (rNatur
reJ No. 256@, p. 495, 1975), reports have been made on monoclonal antibodies against various antigens, and techniques for producing various monoclonal antibodies have already become commonplace.
そこで常に一定の性質を有し且つ安定に供給可能なりウ
マトイド因子を得るために、自己免疫異常を呈しヒトの
慢性関節リウマチに類似した関節炎を発生することが知
られており、しかもヒトのりウマトイド因子と同様な反
応性を示すリウマトイド因子を血清中に保有しているＭ
ＲＬ／Ｍｐ−βｐｒ／６ｐｒマウスに着目し、このマウ
スからモノクローナルリウマトイド因子産生細胞株を樹
立することが試みられて来た。このＭＲＬ／Ｍｐ−１ｐ
ｒ／ ｌ ｐｒ？ウス由来のモノクローナルリウマトイ
ド因子に関しては既に幾つかの報告がなされているが〔
「Ｊ。Therefore, in order to obtain the eumatoid factor, which always has certain properties and can be stably supplied, it is known that the human rheumatoid factor exhibits autoimmune abnormalities and develops arthritis similar to human rheumatoid arthritis. M, which has rheumatoid factor in its serum that shows similar reactivity to
Focusing on the RL/Mp-βpr/6pr mouse, attempts have been made to establish a monoclonal rheumatoid factor-producing cell line from this mouse. This MRL/Mp-1p
r/l pr? Several reports have already been made regarding monoclonal rheumatoid factors derived from mice.
“J.
Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、」第１５８巻第９０１〜９１９頁（１
９８３年）、ｒｌｂｉｄＪ第１５９巻１４２９〜１４４
０頁（１９８４年）、「第２９回日本リウマチ学会会報
」第１７４頁（１９８５年）〕、これらに報告されてい
るモノクローナルリウマトイド因子は全てＩｇＭ型のも
のである。Exp, Med,” Vol. 158, pp. 901-919 (1
(983), rlbidJ Vol. 159, 1429-144
0 (1984), "The 29th Annual Bulletin of the Japanese Society of Rheumatology", p. 174 (1985)], all of the monoclonal rheumatoid factors reported therein are of the IgM type.
（発明が解決しようとする問題点乃至発明の目的）従来
報告されて来たモノクローナルリウマトイド因子はＩｇ
ＦＩ型であるために、その応用例えば免疫複合体の測定
に利用するに際して難点がある。(Problem to be solved by the invention or purpose of the invention) The monoclonal rheumatoid factor that has been reported so far is Ig
Since it is of the FI type, there are difficulties in its application, for example, in the measurement of immune complexes.
即ちＩｇＭ型のものとは、長くて重いポリペプチド鎖（
Ｈ鎖）２本と、短くて軽いポリペプチド鎖（Ｌ鎖）２本
とが結合して形成されるＹ字状構造体が５つ複合したも
のであり、構造安定性が低いからである。In other words, the IgM type is a long and heavy polypeptide chain (
This is because it is a composite of five Y-shaped structures formed by combining two (H chains) and two short and light polypeptide chains (L chains), and has low structural stability.
従って、本発明の目的は、ＭＲＬ／ Ｍｐ−（！ ｐｒ
／ （！ ｐｒマウス由来のモノクローナルリウマトイ
ド因子であって、構造安定性の高いモノクローナルリウ
マトイド因子並びにその調製法を提供することにある。Therefore, the object of the present invention is to calculate MRL/Mp-(! pr
/ (!prAn object of the present invention is to provide a mouse-derived monoclonal rheumatoid factor with high structural stability and a method for preparing the same.
（問題点を解決し目的を達成する手段及び作用）本発明
によれば、ＭＲＬ／ Ｍｐ−１ｐｒ ／ Ｉｔ ｐｒマ
ウス由来のものであって、変性ヒト ＩｇＧに対して強
い反応性を示し、免疫複合体と特異的に反応し、免疫グ
ロブリンクラスがＩｇＧ型である、ＩｇＧ型モノクロー
ナルリウマトイド因子により上記の問題点が解決される
と共に上記の目的が達成される。(Means and effects for solving the problem and achieving the object) According to the present invention, the MRL/Mp-1pr/Itpr mouse is derived from mice, exhibits strong reactivity to denatured human IgG, and is highly reactive to immune complexes. A monoclonal rheumatoid factor of the IgG type, which reacts specifically with the body and whose immunoglobulin class is the IgG type, solves the above problems and achieves the above objects.
即ち、本発明によるモノクローナルリウマトイド因子は
単一のＹ字状構造体からなるＩｇＧ型のものであるため
に構造安定性が高いのである。That is, the monoclonal rheumatoid factor according to the present invention has high structural stability because it is an IgG type consisting of a single Y-shaped structure.
本発明方法によれば、このＴｇＧ型モノクローナルリウ
マトイド因子はＭＲＬ ／ Ｍｐ−１ｐｒ ／ Ｉ！
ｐｒ ’？マウス脾細胞とミエローマ細胞とを細胞融合
させてハイブリドーマを作製し、各ハイブリドーマを選
択培養し、培養により生育した各ハイブリドーマについ
て変性ヒ日ｇＧ及び抗原抗体結合物に対する反応性を調
べることによりリウマトイド因子産生ハイブリドーマを
特定しクローン化してモノクローナルリウマトイド因子
を安定に産生ずる細胞株を取得し、この細胞株を培地で
培養するか、又はマウスの腹腔内に移植し増殖させてモ
ノクローナルリウマトイド因子を産生させ、次いで培養
物又は腹水を採取し分離精製することにより調製するこ
とができる。According to the method of the present invention, this TgG monoclonal rheumatoid factor is MRL/Mp-1pr/I!
pr'? Hybridomas are produced by cell fusion of mouse splenocytes and myeloma cells, each hybridoma is selectively cultured, and each hybridoma grown in culture is examined for reactivity to denatured human gG and antigen-antibody conjugates to determine rheumatoid factor production. A hybridoma is identified and cloned to obtain a cell line that stably produces monoclonal rheumatoid factor, and this cell line is cultured in culture medium or implanted intraperitoneally into a mouse and allowed to proliferate to produce monoclonal rheumatoid factor. It can be prepared by collecting culture or ascites and separating and purifying it.
本発明方法を実施する場合に、ミエローマ細胞としては
マウスミエローマ細胞であるＰ、−ＮＳＩ−１−Ａｇ４
−１細胞を用いることができる。ハイブリドーマの選択
培養はＨＡＴ選択法又は無血清培地を用いた培養により
行うことができ、又クローン化は限界希釈法により実施
することができる。When carrying out the method of the present invention, the myeloma cells used are mouse myeloma cells P, -NSI-1-Ag4.
-1 cells can be used. Selective culture of hybridomas can be performed by the HAT selection method or culture using a serum-free medium, and cloning can be performed by the limiting dilution method.
（発明の効果）
本発明によるモノクローナルリウマトイド因子はＩｇＧ
型のものであるために構造安定性が高く、本発明による
その調製法は自体周知の技術方法を利用するものであっ
て実施が容易であると云う利点を有している。尚、本発
明によるリウマトイド因子はモノクローナルリウマトイ
ド因子産生細胞株から得られるものであり、従って常に
一定の性質を有しており且つ安定に供給することができ
る。(Effect of the invention) The monoclonal rheumatoid factor according to the present invention is an IgG
Since it is a type, it has a high structural stability, and the method for its preparation according to the present invention has the advantage of being easy to carry out as it utilizes a technique known per se. The rheumatoid factor according to the present invention is obtained from a monoclonal rheumatoid factor-producing cell line, and therefore always has constant properties and can be stably supplied.
（実施例等）
次に、実施例及び試験例に関連して本発明を更に詳細に
説明する。(Examples, etc.) Next, the present invention will be described in further detail with reference to Examples and Test Examples.
去謄炎
ａ） モノクローナルリウマトイド因子産性細胞株の作
製
自己免疫疾患モデル動物であるＭＲＬ／Ｍｐ−１！ ｐ
ｒ／βｐｒマウスであって血中にリウマトイド因子を産
生じているマウスを選択し、これらのマウスから肺臓を
摘出し、常法により脾細胞懸濁液を調製した。この脾細
胞？ｗｑ Ｓ液と、マウスミエローマ細胞（Ｐ３−ＮＳ
Ｉ−１−八ｇ４−１）の懸濁液とを１０対１の細胞比と
なるような割合で混合し、遠心処理した後に５０％ポリ
エチレングリコール（メルク社製、分子ｊ１４０００）
を滴下し２分間反応させて上記の壁細胞を融合させた。A) Preparation of monoclonal rheumatoid factor-producing cell line MRL/Mp-1, an autoimmune disease model animal! p
Mice that were r/βpr mice and produced rheumatoid factor in their blood were selected, lungs were removed from these mice, and a splenocyte suspension was prepared by a conventional method. This splenocyte? wq S fluid and mouse myeloma cells (P3-NS
I-1-8g4-1) suspension at a cell ratio of 10:1, centrifuged, and then mixed with 50% polyethylene glycol (Merck, Molecule J14000).
was added dropwise and reacted for 2 minutes to fuse the above wall cells.
得られた細胞を無血清培地（日水製薬株式会社製のＳＦ
Ｍ−１０１）に懸濁させて培養を行うことにより融合細
胞の選択を行なった（この融合細胞の選択は自体公知の
ＨＡＴ選択法により実施することもできる）。融合細胞
の培養１４日目位に培養上清に関し変性１ｇＧ及び抗原
抗体結合物に対する反応性についてラテックス凝集法及
びＥＩＡにより検討し、リウマトイド因子産生の有無を
調べた。次に、リウマトイド因子を産生じている融合細
胞について、限界希釈法によるクローニングを行って単
個細胞由来のクローンとなし、このクローニングにより
モノクローナルリウマトイド因子を安定に産生ずる細胞
株（ｒｌＶ３−５株」と命名）を得た。The obtained cells were cultured in a serum-free medium (SF manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.).
The fused cells were selected by suspending them in M-101) and culturing them (selection of the fused cells can also be carried out by the HAT selection method known per se). On about the 14th day of culture of the fused cells, the culture supernatant was examined for reactivity to denatured 1gG and antigen-antibody conjugates by latex agglutination method and EIA, and the presence or absence of rheumatoid factor production was examined. Next, the fused cells producing rheumatoid factor are cloned by limiting dilution method to obtain a clone derived from a single cell, and this cloning creates a cell line (rlV3-5 strain) that stably produces monoclonal rheumatoid factor. ) was obtained.
ｂ） モノクローナルリウマトイド因子の産生、精製及
び免疫グロブリンタイプの決定
上記の■３−５細胞株を上記の無血清培地により培養さ
せてモノクローナルリウマトイド因子を産生させた。次
いで培養上清を採取して濃縮し、５０％飽和硫安を用い
て分画ずれば精製モノクローナルリウマトイド因子が得
られる。b) Production and purification of monoclonal rheumatoid factor and determination of immunoglobulin type The above cell line 3-5 was cultured in the above serum-free medium to produce monoclonal rheumatoid factor. The culture supernatant is then collected, concentrated, and fractionated using 50% saturated ammonium sulfate to obtain purified monoclonal rheumatoid factor.
尚、モノクローナルリウマトイド因子の産生はマウスの
腹腔内に投与することによっても行うことができ、この
場合の精製は腹水を採取し、これをプロティンＡカラム
クロマトグラフィーにかけることにより実施することが
できる。Note that monoclonal rheumatoid factor can also be produced by intraperitoneally administering it to mice, and purification in this case can be performed by collecting ascites fluid and subjecting it to protein A column chromatography.
このようにして得られたモノクローナルリウマトイド因
子の免疫グロブリンクラスを、抗原として変性ヒトＩｇ
Ｇを感作させたプレートを用いて検討した。即ち■３−
５株を用いて得られたモノクローナルリウマトイド因子
培養液の希釈系列を作成し、上記の感作プレートの抗原
とそれぞれ２時間反応させた後に洗浄し、次いで上記の
感作抗原とモノクローナルリウマトイド因子とが反応し
たか否かを、アルカリホスファターゼ標識抗マウスＩｇ
Ｇ、ＩｇＭ及びＩｇＡ血清を用いて調べたのである。The immunoglobulin class of monoclonal rheumatoid factor thus obtained was used as an antigen for denatured human Ig.
The study was conducted using a plate sensitized with G. That is, ■3-
A dilution series of the monoclonal rheumatoid factor culture solution obtained using the 5 strains was prepared, and each was reacted with the antigen on the above sensitization plate for 2 hours, then washed, and then the above sensitization antigen and monoclonal rheumatoid factor were To determine whether or not there was a reaction, use alkaline phosphatase-labeled anti-mouse Ig.
The investigation was carried out using G, IgM and IgA serum.
結果は第１図に示される通りであり、■３−５株由来の
モノクローナルリウマトイド因子と変性ヒＩｉｇＧとの
反応は抗マウスＩｇＧ血清を用いることにより確認でき
ることから、このモノクローナルリウマトイド因子の免
疫グロブリンクラスは、ＩｇＧ型であることが判明した
。The results are shown in Figure 1. ①The reaction between the monoclonal rheumatoid factor derived from strain 3-5 and denatured human IIgG can be confirmed by using anti-mouse IgG serum, indicating that the immunoglobulin class of this monoclonal rheumatoid factor was found to be of the IgG type.
尚、」二足モノクローナルリウマトイド因子の免疫グロ
ブリンクラスのサブタイプを抗マウスイムノグロブリン
サブタイプ血清（マイルス社製及びシグマ社製）を用い
たオフタロニー法により、並びに酵素標識抗マウスイム
ノグロブリンサブタイプ血清（大日本製薬株式会社）を
用いたＥＩＡ法により調べた結果、ＩｇＧ １であるこ
とも判明した。The subtype of the immunoglobulin class of bipedal monoclonal rheumatoid factor was determined by the Ophthalony method using anti-mouse immunoglobulin subtype serum (manufactured by Miles and Sigma) and enzyme-labeled anti-mouse immunoglobulin subtype serum ( As a result of the EIA method using Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd., it was found to be IgG1.
Ｉ狙
（ヒトＩｇＧに対する反応性）
ａ） 目 的
実施例で得たＩｇＧ型モノクローナルリウマトイド因子
のヒｔ−ＩｇＧ （無処理及び変性１ｇＧ ）に対す
る反応性をＥＩＡ法により検討する。Aim (reactivity to human IgG) a) Purpose To examine the reactivity of the IgG-type monoclonal rheumatoid factor obtained in Example to human IgG (untreated and denatured 1gG) by EIA method.
ｂ） 操作方法
精製１ｇＧ型モノクローナルリウマトイド因子を９６穴
プレー１− （ＨＩＡ用）に４℃で２４時間放置し、次
いで洗浄した後に０．１ ％ＢＳＡ／ＰＢＳ（−）によ
りブロッキングしてＩｇＧ型モノクローナルリウマトイ
ド因子感作プレートを作製する。b) Procedure Purified 1g G-type monoclonal rheumatoid factor was left in a 96-well plate 1- (for HIA) at 4°C for 24 hours, then washed and blocked with 0.1% BSA/PBS(-) to form IgG-type monoclonal factor. Create a rheumatoid factor sensitized plate.
次いで、この感作プレートに各Ｆｉ度の無処理ヒトＩｇ
Ｇ及び変性ヒＩ・ＩｇＧを加えて２時間放置した後に洗
浄し、それらが反応したか否かをアルカリホスファター
ゼ標識抗ヒＩ・ＩｇＧにより調べる。Next, untreated human Ig of each Fi degree was added to this sensitized plate.
After adding G and denatured human I.IgG and leaving it for 2 hours, the mixture is washed, and whether or not they have reacted is examined using alkaline phosphatase-labeled anti-human I.IgG.
Ｃ）結果及び考察
結果は第２図に示されている通りであり、このＩｇＧ型
モノクローナルリウマトイド因子は変性ヒトＩｇＧに対
しては強い反応性を示すが、無処理ヒトＩｇＧに対して
は殆ど示さなかった。C) Results and Discussion The results are as shown in Figure 2. This IgG-type monoclonal rheumatoid factor shows strong reactivity against denatured human IgG, but almost no reactivity against untreated human IgG. There wasn't.
このことから、ＭＲＬ／ Ｍｐ−１ｐｒ／ （ｌ ｐｒ
？ウス由来のＩｇＧ型モノクローナルリウマトイド因子
は、変性１ｇＧに対して強い反応性を示し且つ無処理Ｉ
ｇＧに対しては反応性を示さないヒトリウマトイド因子
と同様の活性を有していることが判明した。From this, MRL/ Mp-1pr/ (l pr
? The IgG-type monoclonal rheumatoid factor derived from mouse shows strong reactivity to denatured 1gG and is highly reactive to untreated IgG.
It was found that it has an activity similar to that of human rheumatoid factor, which shows no reactivity to gG.
試澹」Ｕ
（各種動物のＩｇＧとの反応性）
ａ） 目 的
実施例で得たＩｇＧ型モノクローナルリウマトイド因子
が種々の動物のＩｇＧに対して示す反応性をＥＩＡ法に
より検討する。(Reactivity with IgG of various animals) a) Purpose To examine the reactivity of the IgG type monoclonal rheumatoid factor obtained in the example with IgG of various animals by EIA method.
ｂ） 操作方法
試験例１におけると同様にモノクローナルリウマトイド
因子感作プレートを作製し、この感作プレートに各濃度
の変性させたヒト、山羊、家兎、馬及びマウスＩｇＧを
加え、ＩｇＧ型モノクローナルリウマトイド因子とこれ
らの変性ＩｇＧとの反応性をアルカリホスファターゼ標
識抗ヒトＩｇＧ、抗山羊１ｇＧ、抗家兎ＩｇＧ、抗馬Ｉ
ｇＧ及び抗マウスＩｇＧにより調べる。b) Procedure: Prepare a monoclonal rheumatoid factor sensitized plate in the same manner as in Test Example 1, add various concentrations of denatured human, goat, rabbit, horse, and mouse IgG to this sensitized plate, and add IgG type monoclonal rheumatoid factor. The reactivity of the factors with these denatured IgGs was determined using alkaline phosphatase-labeled anti-human IgG, anti-goat 1 IgG, anti-rabbit IgG, and anti-horse I IgG.
Tested with gG and anti-mouse IgG.
尚、対照としてＭＲＬ／ Ｍｐ−１ｐｒ／ （２ｐｒ？
ウスの脾細胞より作製したＩｇＭ型モノクローナルリウ
マトイド因子産性細胞から得た１、Ｍ型モノクローナル
リウマトイド因子についても同様の検討を行う。As a control, MRL/Mp-1pr/(2pr?
Similar studies will be conducted on 1 and M type monoclonal rheumatoid factor obtained from IgM type monoclonal rheumatoid factor-producing cells prepared from mouse splenocytes.
Ｃ）結果
結果は下記の表に示される通りであり、ＩｇＧ型リウす
トイド因子は変性ヒト、家兎及び馬ＩｇＧと反応するが
変性山羊及びマウスＩｇＧには反応せず、一方ＩｇＭ型
すウマトイド因子は変性ヒト、山羊、馬及びマウスＩｇ
Ｇに対して反応するが変性家兎１ｇＧには反応しないこ
と、即ちここで得たＩｇＧ型とＩｇＭ型のモノクローナ
ルリウマトイド因子は反応性がそれぞれ異なることが判
明した。C) Results The results are as shown in the table below. IgG type rheumatoid factor reacts with denatured human, rabbit and horse IgG but does not react with denatured goat and mouse IgG, while IgM type rheumatoid factor reacts with denatured goat and mouse IgG. Factors include modified human, goat, horse and mouse Ig
It was found that the IgG-type and IgM-type monoclonal rheumatoid factors obtained here have different reactivities, respectively.
拭題％Ｊ７
（抗原抗体結合物との反応性）
ａ） 目 的
実施例で得たＩｇＧ型モノクローナルリウマトイド因子
がヒトの抗原抗体結合物に対して示す反応性をＥＩＡ法
により検討する。Summary %J7 (Reactivity with antigen-antibody conjugates) a) Purpose To examine the reactivity of the IgG type monoclonal rheumatoid factor obtained in the example with human antigen-antibody conjugates by EIA method.
ｂ） 操作方法
試験例１におけると同様に感作プレートを作製し、この
感作プレートに各濃度のヒト抗原抗体結合物を加え、Ｉ
ｇＧ型モノクローナルリウマトイド因子と抗原抗体結合
物との反応性をアルカリホスファターゼ標識抗ヒ目ｇＧ
により調べる。b) Procedure: Prepare a sensitized plate in the same manner as in Test Example 1, add human antigen-antibody conjugates at various concentrations to this sensitized plate, and add I.
The reactivity of the gG type monoclonal rheumatoid factor with the antigen-antibody conjugate was determined using alkaline phosphatase-labeled anti-gG
Check by.
尚、対照としてＣ１ｑ及びＩｇＭ型モノクローナルリウ
マトイド因子（試験例２で言及のもの）についても同様
の検討を行う。Incidentally, as a control, C1q and IgM type monoclonal rheumatoid factor (mentioned in Test Example 2) are also examined in the same manner.
Ｃ）結果
結果は第３図に示される通りであり、ＩｇＧ型モノクロ
ーナルリウマトイド因子は、Ｃ１ｑ及びＩｇＭ型モノク
ローナルリウマトイド因子と同様に、抗原抗体結合物の
濃度上昇に伴い反応性が強くなることが認められるので
、抗原抗体結合物に対して特異的に反応しているものと
推定された。C) Results The results are shown in Figure 3, and it was observed that the reactivity of IgG type monoclonal rheumatoid factor increases as the concentration of the antigen-antibody conjugate increases, similar to C1q and IgM type monoclonal rheumatoid factor. Therefore, it was presumed that the antibody specifically reacted with the antigen-antibody complex.
第１図は各種濃度の本発明によるＩｇＧ型モノクローナ
ルリウマトイド因子とヒト変性ＩｇＧとを接触させ、そ
の反応性を抗マウスＩｇＧ 、 ＩｇＭ及びＩｇＡで調
べた結果を示すグラフ、第２図は本発明によるＩｇＧ型
モノクローナルリウマＩ・イド因子と無処理及び変性ヒ
トＩｇＧとの反応性を調べた結果を示すグラフ、第３図
は本発明によるＩｇＧ型モノクローナルリウマトイド因
子と抗原抗体結合物との反応性を調べた結果を示すグラ
フであり、Ｃ１ｑ及びＩｇＭ型モノクローナルリウマト
イド因子と抗原抗体結合物との反応性を調べた結果を対
照として併せて示すグラフである。
ヒト１９Ｇ濃度（、ａｇ／ｍ１）
Ｈ掟ピトＩｇＧ
ト→ だ処理ヒト１９Ｇ
第３図
！イニ１≦ζ（ミゾｊ七１！貧゛ｉｊ吃（７ｉＪＩｊＥ
Ｃ−シｒｇ／ｍｌ）←−→Ｃ１ｑ
σ−−＜ ＩｇＭ型 モノグローＴｌｌ、＋リウマト
イド因子Δ−ｍ−へ ７９Ｇ雪： モＪ’７１１−丁ル
リウマトイド蓼子手続補正書く自発）
昭和６２年６り／／日
持詐庁長官 黒１）明雄 殿
１、事件の表示
昭和６２年特許願第４２７４７号
２、発明の名称
ＩｇＧ型モノクローナルリウマトイド因子及びその調製
法３、補正をする者
事件との関係 特許出願人
東京都豊島区巣鴨２丁目１１−１
日水製薬株式会社
代表者小林 泰明
４、代理人 〒１０５
東京都港区虎ノ門１丁目１１番７号
第２文成ビル
明細書の「特許請求の範囲」、「発明の詳細な説明」「
図面の簡単な説明」の各欄及び図面
［Ｉ］本願明細書中下記の補正を行う。
（１）第１頁第５行乃至第２頁第１５行く特許請求の範
囲）を別紙の通りに補正する。
（２）下記の個所における「抗原抗体結合物」をｒ免疫
複合体１と補正する。
第３頁第１４行、同頁第１６行、第４頁第２行、同頁第
３行、同頁第４行、同頁第１２−１３行、第７頁第１θ
行、第９頁第１５行、第１５頁第２行、同頁第５行、同
頁第１１行、第１６頁第１行、同頁第２−３行及び同頁
第１６行
（３）第４頁第５行に「抗原抗体物」とあるをｒ免疫複
合体」と補正する。
（４）第９頁第８行に「量細胞」とあるを１両細胞１と
補正する。
［１１１本願の図面第３図を別紙の通りに補正する （
「抗原抗体結合物」を「免疫複合体ｊと補正）。
２、特許請求の範囲
（１） ｋｉＲＬ／Ｎｐ−１ｐｒ／ノｐｒマウス由来の
ものであって、変性ヒトＩｇＧに対して強い反応性を示
し、免疫複合体と特異的に反応し、免疫グロブリンクラ
スがＩｇＧ型であることを特徴とする、ＩｇＧ型モノク
ローナルリウマトイド因子。
（２） ＭＲＬ／Ｍｐ−？ｐｒ＃ｐｒマウスの牌細胞と
ミエローマ細胞とを細胞融合させてハイブリドーマを作
製し、各ハイブリドーマを選択培養し、培養により生育
した各ハイブリドーマについて変性ヒトＩｇＧ ＆区立
１１１木片対する反応性を調べることによりリウマトイ
ド因子産生ハイブリドーマを特定しクローン化してモノ
クローナルリウマトイド因子を安定に産生ずる細胞株を
取得し、この細胞株を培地で培養するか、又はマウスの
腹腔内に移植し増殖させてモノクローナルリウマトイド
因子を産生させ、次いで培養物又は腹水を採取し分離精
製することを特徴とする、ＩｇＧ型モノクローナルリウ
マ１へイド因子の調製法。
（３）ミエローマ細胞がマウスミエローマ細胞である
Ｐ、−ＮＳＩ−Ａｇ４−１細胞であることを特徴とする
特許請求の範囲第２項に記載のＩｇＧ型モノクローナル
リウマ１−イド因子の調製法。
り４）ハイブリドーマの選択培養をＨＡＴ ｇ択法又は
無血清培地を用いた培養により行うことを特徴とする特
許請求の範囲第２又は３項に記載のＩｇＧ型モノクロー
ナルリウマトイド因子の調製法。
（５）クローン化が限界希釈法により行われることを特
徴とする特許請求の範囲東２−４ 、の何れか１つに
記載のＩｇＧ型モノクローナルリウマトイド因子の調製
法。
弛夜推会体捲戻（２）９如０
←−→Ｃ１ｑ
シー−ｏ ７ｇＭ型 モノグロー７３１．＋リウマト
イＦ四子さ一一噛 ｉｇＧ＝ モ）／７０−Ｔルリウマ
阿ド蓼子手続補正書く自発）
昭和６２年６月１６日Figure 1 is a graph showing the results of contacting various concentrations of the IgG type monoclonal rheumatoid factor according to the present invention with human denatured IgG, and examining the reactivity with anti-mouse IgG, IgM and IgA. A graph showing the results of examining the reactivity of IgG type monoclonal rheumatoid factor I and untreated and denatured human IgG, and FIG. This is a graph showing the results of the test, and also shows, as a control, the results of examining the reactivity of C1q and IgM monoclonal rheumatoid factors with antigen-antibody conjugates. Human 19G concentration (,ag/ml) H-Pito IgG → Da-treated human 19G Figure 3! Ini 1≦ζ (Mizoj71! Poor゛ij吃(7iJIjE
C-Sirg/ml) ←-→C1q σ--< IgM type monoglow Tll, + rheumatoid factor Δ-m- to 79G snow: MoJ'711-cho Rheumatoid Tateko procedure correction spontaneous writing) June 1986 ri//Chief of the Japan Loan Fraud Agency Black 1) Mr. Akio 1, Indication of the case 1988 Patent Application No. 42747 2, Name of the invention IgG type monoclonal rheumatoid factor and its preparation method 3, Person making the amendment Relationship with the case Patent Applicant: 2-11-1 Sugamo, Toshima-ku, Tokyo Nissui Pharmaceutical Co., Ltd. Representative: Yasuaki Kobayashi 4, Agent "Scope", "Detailed Description of the Invention", "
The following amendments will be made in each column of "Brief Description of Drawings" and in the specification of drawing [I]. (1) Claims from line 5 on page 1 to line 15 on page 2 are amended as shown in the attached sheet. (2) Correct "antigen-antibody conjugate" in the following location to rimmune complex 1. Page 3, line 14, page 16, page 4, line 2, page 3, line 4, page 12-13, page 7, line 1θ
line, page 9, line 15, page 15, line 2, page 5, line 11, page 16, line 1, page 16, lines 2-3, and page 16, line 3 ) On page 4, line 5, the words ``antigen-antibody'' have been corrected to read ``r-immune complex.'' (4) In the 8th line of page 9, correct the word "quantity cell" to 1 and 1. [111 Figure 3 of the drawing of the present application is amended as shown in the attached sheet (
"Antigen-antibody conjugate" is corrected as "immune complex j". 2. Claims (1) kiRL/Np-1pr/nopr mouse-derived product with strong reactivity to denatured human IgG IgG type monoclonal rheumatoid factor, which exhibits specific reaction with immune complexes and whose immunoglobulin class is IgG type. (2) MRL/Mp-?pr#pr mouse tile cells and myeloma Hybridomas were produced by fusion with cells, each hybridoma was selectively cultured, and each hybridoma grown by culture was examined for reactivity to denatured human IgG & 111 wood chips to identify and clone rheumatoid factor-producing hybridomas. A cell line that stably produces monoclonal rheumatoid factor is obtained, and this cell line is cultured in a medium or transplanted into the peritoneal cavity of a mouse and allowed to proliferate to produce monoclonal rheumatoid factor, and then the culture or ascites is collected. A method for preparing IgG type monoclonal rheumatoid factor 1 Heid factor, which is characterized by separation and purification. (3) The myeloma cells are mouse myeloma cells.
The method for preparing IgG type monoclonal rheumatoid factor according to claim 2, characterized in that the cells are P, -NSI-Ag4-1 cells. 4) The method for preparing an IgG-type monoclonal rheumatoid factor according to claim 2 or 3, wherein the selective culture of the hybridoma is carried out by HAT g selection method or culture using a serum-free medium. (5) The method for preparing an IgG type monoclonal rheumatoid factor according to any one of claims 2-4, wherein the cloning is performed by a limiting dilution method. Relaxing night motion body rewind (2) 9-0 ←-→C1q C-o 7gM type Monoglow 731. + Ryumatoi F Yotsuko Saichiichibite igG = Mo) / 70-T Ruriuma Ado Takako Procedural Correction (Written on his own initiative) June 16, 1985
Claims (5)
であって、変性ヒトＩｇＧに対して強い反応性を示し、
免疫複合体と特異的に反応し、免疫グロブリンクラスが
ＩｇＧ型であることを特徴とする、ＩｇＧ型モノクロー
ナルリウマトイド因子。(1) It is derived from MRL/Mp-lpr/lpr mice and shows strong reactivity to denatured human IgG,
An IgG-type monoclonal rheumatoid factor that specifically reacts with immune complexes and is characterized by having an IgG-type immunoglobulin class.
ミエローマ細胞とを細胞融合させてハイブリドーマを作
製し、各ハイブリドーマを選択培養し、培養により生育
した各ハイブリドーマについて変性ヒトＩｇＧ及び抗原
抗体結合物に対する反応性を調べることによりリウマト
イド因子産生ハイブリドーマを特定しクローン化してモ
ノクローナルリウマトイド因子を安定に産生する細胞株
を取得し、この細胞株を培地で培養するか、又はマウス
の腹腔内に移植し増殖させてモノクローナルリウマトイ
ド因子を産生させ、次いで培養物又は腹水を採取し分離
精製することを特徴とする、ＩｇＧ型モノクローナルリ
ウマトイド因子の調製法。(2) MRL/MP-lpr/lpr mouse splenocytes and myeloma cells are fused to produce hybridomas, each hybridoma is selectively cultured, and each hybridoma grown by culture is treated with denatured human IgG and antigen-antibody conjugates. Rheumatoid factor-producing hybridomas are identified and cloned by examining their reactivity to monoclonal rheumatoid factor to obtain a cell line that stably produces monoclonal rheumatoid factor. This cell line is then cultured in culture medium or transplanted intraperitoneally into mice to proliferate. 1. A method for preparing an IgG type monoclonal rheumatoid factor, which comprises producing monoclonal rheumatoid factor by producing monoclonal rheumatoid factor, and then collecting and separating and purifying the culture or ascites.
＿３−ＮＳ１−１−Ａｇ４−１細胞であることを特徴と
する、特許請求の範囲第２項に記載のＩｇＧ型モノクロ
ーナルリウマトイド因子の調製法。(3) P where the myeloma cells are mouse myeloma cells
_3-NS1-1-Ag4-1 cells, the method for preparing an IgG type monoclonal rheumatoid factor according to claim 2.
血清培地を用いた培養により行うことを特徴とする、特
許請求の範囲第２又は３項に記載のＩｇＧ型モノクロー
ナルリウマトイド因子の調製法。(4) The method for preparing an IgG monoclonal rheumatoid factor according to claim 2 or 3, characterized in that selective culture of hybridomas is carried out by HAT selection method or culture using a serum-free medium.
徴とする、特許請求の範囲第２〜３項の何れか１つに記
載のＩｇＧ型モノクローナルリウマトイド因子の調製法
。(5) The method for preparing an IgG type monoclonal rheumatoid factor according to any one of claims 2 to 3, wherein the cloning is performed by a limiting dilution method.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62042747A JP2575015B2 (en) | 1987-02-27 | 1987-02-27 | IgG-type mono-nal rheumatoid factor and method for preparing the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62042747A JP2575015B2 (en) | 1987-02-27 | 1987-02-27 | IgG-type mono-nal rheumatoid factor and method for preparing the same |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63209598A true JPS63209598A (en) | 1988-08-31 |
| JP2575015B2 JP2575015B2 (en) | 1997-01-22 |
Family
ID=12644603
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62042747A Expired - Lifetime JP2575015B2 (en) | 1987-02-27 | 1987-02-27 | IgG-type mono-nal rheumatoid factor and method for preparing the same |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2575015B2 (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05103562A (en) * | 1991-10-11 | 1993-04-27 | Yukitake Kaneshiro | Nephritic and autoimmune-diseased mouse |
| JP2017184730A (en) * | 2016-03-31 | 2017-10-12 | 東ソー株式会社 | Methods for producing denatured antibody measuring reagent |
| CN114277079A (en) * | 2021-12-30 | 2022-04-05 | 安徽环球基因科技有限公司 | Active blocking agent for eliminating rheumatoid factor immune interference and preparation method thereof |
-
1987
- 1987-02-27 JP JP62042747A patent/JP2575015B2/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ACTA.HISTOCHEM.CYTOCHEM.=1983 * |
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| CN114277079A (en) * | 2021-12-30 | 2022-04-05 | 安徽环球基因科技有限公司 | Active blocking agent for eliminating rheumatoid factor immune interference and preparation method thereof |
| CN114277079B (en) * | 2021-12-30 | 2024-03-22 | 安徽环球基因科技有限公司 | Active blocking agent for eliminating immune interference of rheumatoid factors and preparation method thereof |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2575015B2 (en) | 1997-01-22 |
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