JPS6283883A - 肝細胞及び処理された肝上皮細胞の同時培養 - Google Patents

Abstract

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め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 正常な無傷肝蔵から直接使用される肝細胞の初代培養は
動物または人の肝細胞特異機能の研究に魅力的な方法で
ある。

肝臓の潅流法によって成長したラットの肝細胞または最
近ではヒトの肝細胞を容易に分離することができる。分
離した細胞は生存のために２．３時間以上の間に付着す
るようにならねばならない。普通の培養条件下で細胞は
最高１〜２週間生存することができるが、高度に分化し
た機能（参考文献１）、例えば（ａ）　　アルブミン、
トランスフェリン、酸α。

−グリコプロテインおよびグロブリンを包含する血清プ
ロティンの分泌 （ｂ）　　胆汁酸塩の生成による薬剤および他の外生物
物質の水溶性中間代謝物への完全な生物転化 （ｃ）　　成人イソ酵素形 （ａ）　　特定のホルモン類に対する酵素応答およびア
シアログリコプロティンのような細胞外タンパク質の認
識に対する特定の膜受容体を急速に失う。

その結果、肝機能特に酵素活性の調節は通常の培養系で
は２．３日以上の間研究することができない。

正常な肝細胞の表現型培養の維持を改良する目的で種々
の方法が検討されている。ホルモン類（インシュリン、
グルカゴン、糖’ｌ＋ルチコイド類など）および成長因
子のような補足と培地を選択的に供給することは肝細胞
の生存率と機能に幾分影響を及ぼす。また細胞外間質の
化合物も試験されている。細胞付着および生存は細胞を
別のコラーゲン（参考文献２）、フィブロネクチン（参
考文献３）で肝臓の結合生体間充質（参考文献４）で、
牛の角膜内皮細胞（参考文献５）によって分泌される細
胞外物質でおよび線維芽細胞（参考文献６）、胚細胞（
参考文献７）または相同類洞内皮細胞（参考文献８）で
平板培養することによって改良されている。しかしなが
ら培養条件にかかわらず肝細胞の表現型は培養の数日後
に高度に分化した機能を部分的にまたは完全に失ってい
る。

本発明は肝細胞を分裂能力が適当な処理によって永久に
抑制されている上皮タイプ肝細胞と同時培養することを
特徴とする特異機能の全機性を維持することができる肝
細胞の培養方法に関するものである。

適当な処理とは照射または加熱のような物理的処理であ
ることができ、特にγ放射線を使用することができる。

処理は化学的であることもでき、この目的として抗有系
分裂薬剤、特にマイトマイシン−Ｃを使用することがで
きる。

実際に最近の所見（参考文献８〜１２）は確かに毛細胆
管に由来するラットの肝臓の上皮細胞系統と連合して培
養されたラットまたはヒトの肝細胞が生物転化過程の様
々な代表的経路によるアルブミンの分泌または薬剤の代
謝のような肝臓の特異機能を数日間および実質的なレベ
ルで維持することが示されている。

同時培養系の重要な特徴はその高い特異性にあり・その
ため上皮細胞の源は肝（確かにヘーリング管に由来する
）でなければならず条件的培地または細胞抽出物（１３
）に置き換えることができない。この系はヒトの肝細胞
をラットの肝臓上皮細胞（参考文献１０）と連合して培
養する場合匹敵する結果が得られることから種特異性で
はなく、さらにこの系はコルチステロイド依存である（
参考文献１４．１５）。

それにもかかわらずこの系は主な問題点、即ち上皮細胞
系自体と連係している。この細胞系は、新生ラットの肝
臓に由来し、トリプシンで肝臓を消化させた後得られる
。特定の条件下で細胞が分裂し、コロニーが形成し、継
代培養することができる。細胞は培養で徐々に増殖する
。しかしながら数回の継代の後、細胞は漸次形質転換を
受は癌細胞の特徴を示す・形質転換されたラットの上皮
細胞は肝細胞と同時培養する特性および利点を失う。

従って本発明は獲得される同時培養の利点の全てを可能
にししかもＡＴＣＣまたは他のコレクションで市販で入
手し得る形質転換された（様々な程度に）上皮細胞を使
用する新規な方法に関する。全上皮タイプ肝細胞の中か
らチャン肝細胞が迅速な分裂、単層での発育、細胞付着
などの発育特性に対して選択されている・同時培養の利
点に不利益な増殖を防止するためにチャン肝細胞はγ放
射線および／または抗有系分裂薬剤に委ねられる。この
特殊処理は細胞を増殖のない状態に維持し、ラット肝細
胞と連合して培養することができる。

同様にチャン肝細胞はヒトの肝細胞と連合して培養する
ことができる。

本発明による同時培養法は次の段階を包含し、肝細胞の
由来はネズミまたはヒトであることができる。

値）培地の調製 一上皮タイブ細胞の培養用培地または上皮培地 一肝細胞の培養用培地 （ｂ）　　チャン肝細胞の培養 （ｃ）　　同時培養実験のためのチャン肝細胞の調製 （ｄ）　　肝細胞の分離 （ｅｌ　　肝細胞の単培養（比較のための段階）（ｆｌ
　　肝細胞どチャン細胞の同時培養次の略号は説明の過
程で使用される。

ＨＥＯＥＳ＝４−　（２−ヒドロ牛ジエチル）−１−ピ
ペリジンエタンスルホン酸 ＥＧＴＡ＝エチレングリコールビス（β−７ミノエチル
エーテル）テトラ酢酸 Ｆｅ２　　＝ウシ胎児血清（５６℃で３０分間加熱する
ことによって不活性化） ＨＢＳＳ＝ハンクス液 使用される種々の材料の由来は次の表に列挙される。

（ａ）　　培地 ２５　ｍＭ　ＮａＨＣＯ，，２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　、
　２　ｍＭグルタミン、ストレプトマイシン１００μｔ
／ｄおよびペニシリン１００　Ｕ／ｙを含有する最少必
須培地（アールの塩）から上皮培地を生成しｔそれに必
須アミノ酸の１チ溶液と加熱不活性化ウシ胎児血清（Ｆ
ｅ２）を添加した。

ラットまたはヒトの肝細胞を培養するだめの培地（ＤＥ
培地）は４０　ｍＭ　ＮａＨＣＯ３，２０ｍＭ　ＨＥＰ
ＥＳ　、　４　ｍＭグルタミン、２０ｍＭグルコース、
ストレプトマイシン１ｏｏμｙ／ｍｌおよびペニシリン
１００　Ｕ／ｒｎｌを含有するイーグルによって修飾し
たダルベツコ培地からなる。この培地にＦＣ８１０ｉイ
ンシュリン１０μ２／ゴおよびヒドロフルチジンへミス
タシネート５Ｘ１０−’Ｍ（単培地）またはヒドロフル
チジンヘミスクシネート ３、５　Ｘ　ｌ　０−６Ｍ　（同時培地）を添加した。

（ｂ）　　チャン肝細胞の培養 １９５４年Ｒ，Ｓ、チャン（Ｐｒｏｃ、　Ｓｏｃ、　Ｅ
ｘｐ。

Ｂｉｏｌ、　Ｍｅｄ、第８７巻、４４０頁１９５４年）
がチャン肝細胞系をヒトの非悪性肝臓から樹立し、ＡＴ
ＣＣＣＣＬ１３として寄託した。

細胞を１７５　ｔｒｉプラスチック組織培養瓶（Ｔ１７
５　）中ＣＯ２／空気比１０　：　９０　（ｖ／ｖ）と
水で飽和した雰囲気中３７℃で培養し、上皮培地を１週
間につき３回補充した。細胞が７〜９日毎に集密した時
に継代培養した。継代培養した培養は、細胞単層をトリ
プシン０．０５係（重量／容量）とＦＪＤＴＡ混合液０
．０２％（重量／容量）を包含しているトリプシン−Ｅ
ＤＴＡ混合液でトリプシン処理することによって調製し
た。このために培地を除去し、１０　ｍＭリン酸塩緩衝
液ｐＨ７，４を含有する食塩溶液で洗浄し、そしてトリ
プシン−ＥＤＴＡ溶液と３７℃で１０分間保温した。

細胞を上皮培地に再浮遊させピペットを用いて細胞浮遊
液を激しく繰り返し引っ込めることによって細胞集合体
を分解した。細胞浮遊液を新しい瓶に継代培養比１：１
０で付着させた。

！ ラットの肝細胞と同時培養する前に増殖を阻止し、単層
として維持するためにチャン細胞を放射線に抗有糸分裂
剤（例えばマイトマイシン−Ｃ）にまたはその両方に委
ねた。

集密的細胞を継代培養に記載した通りトリプシン−ＥＤ
ＴＡ処理によって再浮遊させた。

細胞を上皮培地で希釈し、４００Ｘｒで５分間遠心分離
した後同時培地で再浮遊させた。

計数の後、細胞の数を同一培地で５Ｘ１０’細胞／ｄに
調節した。

この細胞浮遊液２ｄを含有する管をセシウム−２３７源
で１０００〜４０００ラドに変化する線量で照射した。

抗有糸分裂剤での細胞処理に対しては細胞浮遊液（合計
１０７細胞）２ｒｎｌを１５ｄ管に移し、マイトマイシ
ン−ＣＣシグマ）と同時培地を混合して１管につき合計
容Ｆｆｉ　５　ｍｌ中（５〜１５μり）薬剤／ｄの濃度
を得た。最終細胞濃度を１−につき２Ｘ１０’に調節し
た。その混合液を頻繁に攪拌しながら３７℃で３０分間
保温した。

混合処理の場合には、細胞を５０Ｑまたは１０００ラド
の線量で継続的に照射し、上記の通りマイトマイシ＞−
Ｃ／ｄ５μ２と保温した。

各々処理した後細胞を培地中で１回洗浄しＴ１７５瓶（
１管につき１瓶）中間時培地で２４時間培養した。

ラットの肝細胞で同時培養する１週間前に細胞をトリプ
シン処理した同時培地に再浮遊させ、血球計数器で計数
した。生菌数はトリパンブルー排除試験によって定量し
た。細胞を同一培地で希釈して０．６Ｘ１０’生存細胞
／　ｍｅを得た。

ヒトの肝細胞と同時培養実験のためのチャン肝細胞を放
射線にのみかけた。ヒトの肝細胞の場合には集密的チャ
ン肝細胞を３０００ラドの線量で照射し、これは培養皿
で直接実施した。次に細胞を再浮遊させ、計数した後ラ
ット肝細胞で記載した通り同時培養した。

＊ラット肝細胞の分離 ラット肝細胞を体重２５０りのウィスターラットからリ
メント等によって記載される（　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、　　１９８２年、第１２５巻、４３７〜４
４３頁）肝臓をコラ−ゲナーゼ溶液で海流することによ
って分離した。

簡単に言えば、肝臓をまずハンクスから誘導されるＣａ
２＋イオンを含有せず、０．５　ｍＭＥＧＴＡを添加し
た緩衝液３００−で流動速度３０−７分で池流し、０□
／Ｃｏ２（９５：　５ｖ／ｖ　）混合液で連続して酸素
添加した。次に２、．５ｍＭカルシウム、コラ−ゲナー
ゼ溶液（ベーリンガー、マンハイム％ＧＦＲ）１８０〜
を酸素添加しながら添加しだハンクス液３００−で潅流
した。３０分後側胞をさらにハンクス液中０．１　％　
（ｗ／ｖ　）　　コラ−ゲナーゼ１００ｒｎｌ中で１５
分間酸素添加しながら分離した。細胞浮遊液を孔サイズ
１００μｍ６３μｍおよび２８μｍの継時パーロンフィ
ルターで濾過し、沈殿操作のために２０分間氷に放置し
た。細胞残層、さらに血液細胞および類洞細胞を含有す
る上澄を除去した後、沈殿物を氷で冷却した完全培地（
ＩＯＩＦＣ８を添加したＤＥ培地）と５０×２で２分間
遠心分離によって３回洗浄した。

細胞の生死判別を位相差顕微鏡でトリパンブルー排除試
験によって推定した。計数後肝細胞を１０６細胞／ｒｎ
Ｉ！で完全培地に浮遊させた。

＊ヒトの肝細胞の分離 ヒトの肝試料は肝臓が移殖（内在原因受容者の不足など
）に使用できない腎提供者あるいは、一部肝別除（肝移
殖、−次または二次癌腫などでの切除〕を受けた患者の
いずれかに由来する。移殖材料をカリウムに富んだ冷却
食塩溶７ｙ、（ユーローコリンス型）で予め潅流する。

切除材料を外科的手術の後に間抜に浸漬する。試料は使
用時まで氷に貯蔵スフ＞。

少なくとも２面がグリソン鞘によって通じる肝小葉、小
尾葉または肝臓のあらゆる部分の枝を肝細胞の分離に使
用する。小葉の部分で識別され挿管される１個以上の門
脈枝をコラ−ゲナーゼで海流することによって細胞を分
離する。

簡単に言えば肝臓ピースをカルシウムまだはマグネシウ
ムが存在せず、２５　ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（Ｉ（ＢＳＳ）
を含有し、０．５ｍＭｇＧＴＡが添加されているハンク
スの食塩溶液（ｐｎ７．２）で１０分間、次にＦＪＧＴ
Ａが存在しない）（ＢＳＳ培地で１０分間流動速度１０
ｏｒｎｌ／分で再循環させずに順次潅流し、Ｏ、／　Ｃ
ｏ　。

（９５：　５　ｖ／ｖ　）混合で連続的に酸素添加した
。潅流系による熱損失を調整するために循環水を３８〜
４０℃に維持した。次に肝臓ピースを５　ｍＭ　Ｃａα
２およびコラ−ゲナーゼ０．０５チ（ウオーシングトン
、ＣＬＳＩ型、１４０〜１６０　Ｕ／ｑ）　（分離溶液
）を含有するＨＢＳＳ培地で潅流する。分離開始後２．
３分間潅流液を再循環させる。使用合計量は５００　ｒ
ｎｌである。分離を２５〜４５分間続ける。次に肝臓ピ
ースを分離溶液を含有するペトリ皿に移す。ピースを莢
膜からはずし分離した細胞をへらまたは曲がった鉗子で
分散した。そうして得た細胞浮遊液を１００ｄ瓶に移し
、３分間ガスを出し、次に１００μｍ　フィルターで濾
過する。所望により集合体および分離されないピースを
分離溶液１ｏｏｒｎｉ中３７℃で１５分度再保温し、次
に再濾過する。

次いで細胞浮遊液を６０μｍと２８μｍフィルターに順
次通過させる。次に細胞を５０５’で３分間遠心分離し
た後、ＦＣ８１ｏ％を含有するＤＥ培地で２回洗浄する
（１分４５秒Ｘ５０Ｆ）。

この方法によって９０％以上の生存し得る肝細胞が肝臓
１７当だ＃）５〜２０Ｘ１０’肝細胞の細胞収量で得ら
れる。

普通培養（単培養）としてラット肝細胞を２０ｉペトリ
ペルム皿またはコラーゲンで被覆しだプラスチックペト
リ皿で密度を１皿当たり３〜３．３ＸｌＯ’細胞で平板
培養した。

この被覆はｐＨ７，４の１０　ｍＭ　リン酸塩緩衝食塩
溶液の１５μｔ／ｄ　で可溶性ウシ皮膚コラーゲン２．
５−と３７℃で１６時間ペトリペルム皿を保温し、次に
同一緩衝液で洗浄することによって得た。プラスチック
皿に対してはコラーゲン溶液（０，０１３ＭＨα食塩溶
液′６０μｆ／ｍ）０．５７！を各皿に注ぎ入れ、３７
℃で一晩乾燥させておき使用１時間前に培地とすすいだ
。細胞を水で飽和した雰囲気中Ｃ０２／空気比１０　：
　９０　（ｖ／ｖ　）を用いて３７℃で培養した。細胞
付着に必要とされる３〜４時間後培地を付着しないまた
は死んだ細胞を除き、１皿当たシ単培地２．５ｍｌ！で
置き換えた。肝細胞を集合するまで続け、２０時間後、
位相差光学顕微鏡試験で示される通シ、肝タイプと毛細
胆管が架橋している単分子層を形成した。培地を毎日新
しくし、次の分析のために固定貯蔵した。

＊ヒト肝細胞の場合 上記で記載した方法によって分離したヒト肝細胞をラッ
ト肝細胞で展開した系に従って培養する。

ヒト肝細胞を１皿当たりコラーゲン１００μ７　（ビト
ロゲン１００）とヒトのフィブロネクチン５０μ２で被
覆したプラスチックペトリ皿２０ｍ１上で平板培養した
。細胞密度は普通（単培養）系で１皿当たり５Ｘ　１０
’細胞である。

同時培養として１．８〜２Ｘ１０’分離実質細胞を普通
培養と同一条件下で接種した。４時間後、培地を同時培
地２．５−に浮遊した１、５Ｘ１０’チヤン肝上皮細胞
（照射および／またはマイトマイシン−Ｃで処理した）
に取り替えた。肝細胞は細胞の集合、拡散およびストラ
ンドを生成するまで続き、一方、上皮細胞はおいている
領域すべてを占有した。

ラットの肝細胞を単培養と同じ条件下で培養した。ヒト
の肝細胞の場合には細胞密度は同時培養系として１皿当
たＤ３Ｘ１０’細胞である。

従って普通培養条件下で、肝細胞は２週間以上生存せず
、高い分化機能を失う。肝細胞と確かに毛細胆管の細胞
に由来する別の肝細胞タイプの同時培養の組み合わせは
肝細胞の分化機能の高率を維持する。肝細胞と多くの継
代で形質転換されしかし特殊処理に委ねられたヒトの計
上皮様細胞系との組み合わせは肝細胞の特異作用の維持
が等しく改良される。

この新規な同時培養系は、肝臓生理学、薬剤毒性および
肝臓発癌などに特定の特異的研究が実施されるようにな
りまたは微生物（原生動物の寄生虫またはウィルス）に
対する試験管内培養系など特定産生物が調製されるよう
になる。

この同時培養系は、診断手段としても利用できる。

最後にこれらの同時培養物は、当業者によって知られた
。冷却等の条件下で貯蔵され、それゆえにただちに使用
することができる。

本発明による方法の利点および特徴は次の実施例でさら
に詳細に研究される。

■　ラット肝細胞の場合 実施例１ ラット肝臓の潅流はすべて好結果の培養を生成し、普通
および混合培養で同様の結果を得た。生存率８５〜９５
チの生存率は通常コラ−ゲナーゼを用いる分離技術によ
って原位置のまま得られた。形態学的観察はすべて位相
差顕微鏡下生きている標本であるいは光学顕微鏡によっ
てヘマトキシリン／エオシンで染色した細胞で行なわれ
た。

３時間以下で分離した肝細胞は基質に付着し、集合し、
細胞単層を生成した。付着した細胞を分散し、細胞脱離
が培養の３週間後に起こるガス透過性膜（ペトリペルム
皿）よりプラスチック膜で長期間以外は効果的に培養し
た。普通培養および同時培養に毎日添加されるヒドロコ
ルチゾンヘミスクシネートの濃度は最大細胞生存および
最大アルブミン合成を得た。同時培養実験では最も良好
な細胞濃度は２０ｃｒｌペトリ皿当たり１．８Ｘ１０’
肝細胞および１．５　Ｘ　１０　’チャン肝細胞であっ
た。

普通培養条件下で、肝細胞の生存はいくつかの標本で汚
染細胞の周囲で生育したいくつかの肝細胞ストランドは
さらに長く生存することができるが完全培地で１２日お
よび単培地（ホルモン類を含有する培地）で２０日を超
えなかった。肝細胞は、代表的な構造例えば非常に個体
化しだ１または２個の小さな屈折核を有する多面細胞を
５または６日間だけは保持した。次に漸次変性して１個
の大きな核と多くの多核細胞を有するさらに小さなサイ
ズの細胞だけを生成した後、２〜３週間で完全に消失し
た。

肝細胞を処理チャン肝細胞（３操作で処理）の存在下で
培養した際、接種後集密的細胞単層が２４時間内に観察
された。上皮細胞は肝細胞柱間のおいている空間を占有
し、後者と密接な接触を獲得しだ°。数週間Ｃ少なくと
も４週間）の間に、肝細胞は柱または小さな島で組織さ
れ、稠密な仁と顆粒状の細胞質を包含する１または２個
の小さな円形の屈折核を含有する典型的な長両立方体形
態を維持した。

毛細胆管は肝細胞間柱の全てに存在した。脂質小滴も見
られ、その数は年令と共に増加した。この現象は培地を
毎日の代かりに１週間に２回新しくした場合に可逆的で
ある。同時培養の肝細胞は一般に肉眼で十分に見えるが
、゛死んだ細胞、血清タンパク質沈降物および脱離チャ
ン肝細胞は培養１週間後に表面で見７ることができる。

この欠点は特別の予防措置が肝細胞の分離中に（細胞濾
過後傾瀉して線維芽細胞および他の汚染細胞を除去する
）さらに細胞培養中に（Ｆｅ２を濾過、各皿を攪または
培地を供給する前に十分洗浄して細胞残層を除去し、３
７℃で培地を供給し、この供給頻度を１週間に２回に減
らす）とられるならば克服することができる。

培養におけるラット肝細胞のチャン肝細胞との最良の比
較実験は、ヒトの上皮細胞を次の条件に委ねる場合に得
られた。

１．３０００ラドの線量で照射する０）２、マイトマイ
シン−Ｃと同時培地１−につき薬剤１０μ２の最終濃度
で保温する（ＩＩ）３．５００ラドの線量で照射した後
マイトマイシン−Ｃ５μｔ／ｍｌ　　と保温する（ｍ）
これらの条件は少なくとも４週間有益な肝細胞の維持を
保証した。さらに長い培養期間に対しては培養３〜４週
間後、最初に記載した通り、しかし、低密度（１０６細
胞／皿）で処理し、死んだ内皮細胞によってあいたまま
の肝細胞間の空間を覆うように新しく処理したチャン肝
細胞（条件■および■に対して）を添加することがしば
しば必要である。

照射（条件Ｔ）または混合処理（条件■）に委ねたチャ
ン肝細胞の形態学的外観は同時培養中劇的に変化した。

細胞数が培養時間と共に減少する一方、２個またはそれ
以上の核を有する細胞は大きくなった。肝細胞に最初に
添加した細胞の３０係以下が３週間後で培養に存在した
ままであった。チャン肝細胞をマイトマイシン−Ｃで処
理した場合、未処理細胞にさらに類似した外観を保持し
、細胞の約２０係が平板培養後３週間生存していた。

平常なチャン肝細胞を肝細胞に添加した場合、細胞は連
続して拡大し、７日後肝細胞柱はすべて最終的に覆われ
た。同様の結果が上皮細胞を２５００ラドまたはそれ以
下の線量でまたはマイトマイシン−Ｃの濃度８μｆ／ｍ
！以下で照射した際にたびたび得られた。

実施例２ 泌の維持 １）実験 培地に肝細胞が分泌したアルブミンとトランスフェリン
の量をＡＢＢＯＴＴ自己検光子系（ウィースバデンーデ
ルケンハイム （Ｗｅｅｓｂａｄｅｎ　−Ｄｅｌｋｅｎｈｅｉｍ　）、
ＧＦＲ）を用いる免疫比濁法によって定量した。ラット
アルブミンおよびトランスフェリンおよび培地の標準溶
液をポリエチレングリコール６０００を４チ含有する０
、　１　Ｍリン酸塩緩衝液中ラットアルブミンおよびラ
ットトランスフェリンに対するウサギの抗体の適当な希
釈と混合し、光拡散によって測定しながらアルブミンに
対して１２分間、トランスフェリンに対して３０分間２
５℃で保温した。特異抗体はＵＳＢコーポレーション（
クレベランド、オハイオ）からのものであった。試験の
感受性の低限は１ｒｎｌ当だりアルブミンまたはトラン
スフエリン２〜３μ７であった。

２）結果 成長ラットの肝細胞を通常の条件下完全培地で培養した
際、最大レベルのアルブミン分泌が平板培養した日に得
られた。この後、平均分泌が急速に減少し、肝細胞が培
養から消失するまで（約１０日）、４日で低平均値に達
した。トランスフェリンの分泌の同様のプロフィルが観
察され、この場合の平均値は非常に低いと、いう違いが
あった。アルブミンとトランスフェリン分泌レベルは、
肝細胞がプラスチックペトリ皿かあるいはコラーゲンで
被覆したペトリペルム皿で平板培養されるにかかわらず
同じであった。

肝細胞を単培地で培養した際、アルブミンとトランスフ
ェリンの分泌は１０日以上の間高レベルで維持され、次
に徐々に衰退し、約１８日の肝細胞の死まで安定したま
まであった。

アルブミンおよびトランスフェリンの分泌はしばしば２
週間後に観察された。これらの標本では有益な肝細胞は
ほとんど観察されず、これらはクローンで多量に増殖し
ている上皮゛株細胞によって取り囲まれている。これら
のタンパク質分泌は肝細胞単独または増殖シサらに血漿
タンパク質の産生のような特定の肝機能を表わすことが
できることが知られている（参考文献１６）他の汚染細
胞と併用して産生される。゛ 同時培養ではアルブミンの最適分泌が培養の数日後に得
られ普通培養で観察されるより高レベルに達した。平均
値は培養２４時間中肝細胞１０１′当たシ分泌タンパク
質約２５〜７５μ２であった（通常の培養条件下２４時
間中タンパク質／１０６肝細胞１０〜２５μ２）。タン
パク質の分泌を増加する断続的な高まシが観察された。

分泌レベルは６週間の培養の後に徐々に減退する傾向が
あった。

トランスフェリンの分泌にも同様のプロフィルが観察さ
れた。チャン肝細胞の調製がどのような条件であっても
著しい変化は観察されなかった。アルブミンあるいはト
ランスフェリンのいずれも２週間の培養中純粋な（処理
または未処理の）チャン肝細胞の培地に分泌されないこ
とを見い出した。

実施例３ 素の分泌 １）実験 乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、γ−グルタミルトラ
ンスペプチダーゼ（γ−ＧＴ）、グルタミン酸オキサロ
酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）およびグルタミン酸
ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）のようなシト
ソールの可溶性酵素および培地に存在する尿素をアボッ
ト（ＡＢＢＯＴＴ　）特殊診断装置を用いて定量した。

２）結果 細胞質に存在する可溶性酵素の分泌に使用され、その結
果細胞の死で放出される試験は同時培養実験で特に確実
ではなかった。

尿素の産生は細胞生存率の評価に感受性のあるパラメー
ターであった。尿素の産生および培地への分泌は細胞の
状態を直接表わす。

この分泌はアルブミンの分泌および普通培養の形態学的
観察と同時に減少した。対照的に同時培養系ではさらに
高レベルで長期間尿素を分泌した。

実施例４ 薬剤代謝 １）実験 普通または同時培養条件下でラットの肝細胞によって分
泌される薬剤の生物転化作用を参照薬剤としてアステミ
ゾール、Ｈ８抗ヒスタミンＣヒオマノルオブジャンセン
ファーマスーチカ、ベーアセ、ベルギー）を用いて定量
した。この薬剤の代謝はラットの別の代謝がよく知られ
ていることからこれらの肝細胞の薬剤代謝の研究に選択
された。

実際には別に培養した後細胞をトリチウム標識アステミ
ゾール１０μり／−を含有する培地２．５−の存在下３
７℃で２４時間保温した。保温の終わりに培地を１００
０Ｘ７で１０分間遠心分離して細胞沈渣を除去し、残り
の上澄み液をＩ（ＰＬＣ分析で処理した。培地に存在す
るアステミゾールとその代謝物を放射能検出器を使用す
るＨＰＬＣ技術によって定量した。

２）結果 細胞を接種した後アステミゾール（ＡＳＴ）と２４時間
保温したラットの肝細胞の培養は培地に次の代謝物を産
生じた。デメチル−ＡＳＴ、５−ヒドロキシ−ＡＳＴ、
６−ヒドロキシ−ＡＳＴ、６−ヒトロキシデメチルーＡ
ＳＴ、そのグルクロン酸抱合体、および４−ヒドロキシ
−α−４−メトキシフェニル酢酸または一フェニルアセ
ツル酸のような劣量の代謝物。

これらの異なった代謝物は生体内に見られる代謝経路の
産出に相当する。主要経路であル還元、脱メチル化およ
びグルクロニド化経路は純培養まだは上皮細胞を有する
混合培養で肝細胞の代謝作用を推定するために使用した
。

普通培養１４日後薬剤の７０チおよび８４チが代謝され
、肝細胞を完全培地または単培地の各々で培養する場合
、添加した全薬剤の２０チおよび５０俤だけに関してグ
ルクロニド化が生じる。

肝細胞を３０００ラドの線量で照射したチャン肝細胞と
同時培養した場合には、２週間の培養の後に７ステミゾ
ールの９０チ以上がグルクロニドとしてさらに抱合され
た。

未処理のチャン肝細胞の純培養では、２４時間保温した
後薬剤の２３チ以下しか代謝されず、グルクロニド抱合
体の生成はなかった。

実施例５ １）実験 種々の時間培養した後、細胞単層をトリチウム標識ヒト
血清アルブミンまたはガラクトシル化とトアルブミン２
０μｆ／−を含有する単培地または同時培地１−と保温
した。ヒトアルブミンの標識およびガラクトシル化は以
前に記載されているように行なった〔シュナイダー等、
１９８４年Ｃｉｂｌａｇｅ　ｄｅｓｍｅｄｉｃａｍｅｎ
ｔｓ　ｐａｒ　ｌ’ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｉｒｅ　ｄｅ
ｓｒｅｃｅｐｔｅｕｒｓ　　（受容体による薬剤の標的
）グレゴリアゾイス　ジー、ポステジー、セニア　ジエ
ー、およびドロウエト　ニー。

（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ　Ｇ、　ＰｏａｔｅＧ、　５
ｅｎｉｏｒＪ、およびＴｒｏｕｅｔ　Ａ、　）編集プレ
ナムプレス１〜２５頁〕３７℃で２４時間保温した後、
２５チ（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸（最終濃度）てタンパ
ク質を４℃で３０分間沈降させ、１０００Ｘｆで３０分
間遠心分離し、上澄みを放射能で試験してから分解産生
物の存在を試験した。

同時に細胞を４℃において１０　ｍＭリン酸塩で緩衝し
た食塩溶液ｐＨ７，４，２，５−で２回完全培地２．５
−で１回および同じリン酸塩緩衝食塩溶液２．５　ｍｌ
で３回洗浄し、ｐＨ１１，３において１　％　（ｗ／ｖ
　）デオキシコール酸ナトリウム１−に溶解し、放射能
および細胞タンパク質の濃度を試験した。

特異的摂取は蓄積（細胞会合タンパク質）と消化Ｃ培地
に存在する標識分解産生物）の和を表わす。

２）結果 生活菌においてタンパク質を脱シアリル化またはガラク
トシル化したタンパク質は肝細胞によって選択的に認識
され、細胞受容体によるエンドサイト−シスによって取
り込まれる（１７）。これらの受容体は肝細胞によって
特別に表わされる。これらの肝細胞の非常に特異的な機
能の維持はトリチウム標識活性のまたはガラクトシル化
ヒトアルブミンを用いる普通または同時培養系で試験さ
れた。３つの実験の結果はアルブミン摂取に対するガラ
クトシル化アルブミン摂取の比率の形で表わした（特異
比率）。

１日経だ肝細胞の存在下で２４時間培養した後、ホルモ
ン類を含有するまたは含有しない各培地を肝細胞に供給
した際の特異比率は１２０または２５０であった。完全
培地および単培地での普通培養では８日培養しだ後４以
下に急速に低下する。３０００ラドで照射したチャン肝
細胞での同時培養系では８日の培養で特異比率は５０以
上であシ、少なくとも２週間高いままであった。

チャン肝細胞単独（照射したまたは別の方法の）は特異
的受容体は有しない。いくつかの肝細胞標本では特異比
率は記載したより低いが、同時培養系に対しては普通培
養に対するより常に高かった。これは肝細胞標本の差異
を表わしたのであシ恐らくコラ−ゲナーゼ処理の結果で
ある。

２つの系（普通培養および同時培養）によって培養され
る肝細胞の特異機能を特徴付ける形態学的特徴、細胞の
生存および別のパラメーターを研究した。肝細胞に特異
的な特徴の評価に関係する一般的方法は、アルブミンお
よびトランスフェリンを検出するためのヒト抗血清の使
用とは別にラット肝細胞の場合に使用した方法と同じで
ある。

ヒト肝細胞と照射したチャン肝上皮細胞の同時培養系は
また形態学的特徴と細胞の生存すべてを６週間以上の培
養と同時に維持されることができた。肝細胞はその典型
的な長両立体形態を維持し、毛細胆管が形成される小柱
で組織される。通常の系では肝細胞はわずか８〜１２日
間典型的構造を維持する。その後細胞は順次変性し、３
週間後にほとんど完全に消失する。

同時培養系ではアルブミンおよびトランスフェリンのよ
うな肝細胞によって％異的Ｋｉ生されるタンパク質が形
態学的特徴を維持すると同時に最適レベルで分泌される
。対照的に単培養では、２週間後に分泌が減退し、肝細
胞が死ぬ捷でそのままである。

尿ｚの分泌は、アルブミンの分泌と形態学的観察と同時
に変化し、また培養においてヒト肝細胞にチャン肝上皮
細胞の有益な効果を示した・ またアシアログリコプロティンに特異的な膜受容体の作
用を２つの系で研究した。肝細胞による特異的摂取比率
、即ち変性していないアルブミン摂取に対するガラクト
シル化アルブミン摂取の比率は２３日の同時培養後は５
以上であるが、８日の単培養後は１．７に低下する。肝
細胞培養を始めて２４時間後、開始値は１２であった。

薬剤代謝に関しては８日間培養のヒト肝細胞をアステミ
ゾールの存在下で２４時間保温した。薬剤の９０係が普
通培養で肝細胞によって代謝され、グルクロニド化はわ
ずか２５チに関して生じる。肝細胞を照射チャン肝細°
胞と同時培養する場合には、アステミゾールの９０％以
上が代謝され薬剤の７０チがグルクロニドとして抱合さ
れる。

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ム（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅａ、　
Ｃｏｍｍ、）第１０９巻、５０７頁 Ｃ１５）ギュギュアンーギルゾ・シー （ＧＵＧＵＥＮ　−ＧＵＩＬＬＯＵＺＯｌＣ，＋等１９
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２１１頁 Ｃ１６）グリジャム・ジエー・ダブりニー（ＧＲＩＳＨ
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カド・サイ（Ａｎｎ。

Ｎ、　Ｙ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　）第３４９巻１２
８頁（１７）　７シユウエル・シー　（ＡＳＨＷＥＬＬ
　％Ｇ、　）およびモレル・ニー・ジーｒＭＯＲＥＬＬ
　。

Ａ、Ｇ、）１９７４年、アドヴ・エンサイモル（Ａｄｖ
、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　）第４１巻、９９〜１２８頁 手続ネ市正書　（方式） 昭和６１年１０月３１日 特許庁長官　　黒　１）明　雄　　殿 １、事件の表示　昭和６１年特許願第１８１２１５号２
、発明の名称　　肝細胞及び処理された計上皮細胞の同
時培養３、補正をする者 ・ト件との関係　　　特許出願人 名　称　　イー・エール・ニーーセルタールク　ニス、
アー４、代理人 住所　〒１００ 東京都千代田区丸の内３−２−３．富士ビル２０９号室
電話（２１３）１５６１（代表） ５、補正命令の日付 昭和６１年ｌＯ月８日（発送日：昭和６１年１０月２８
日）６、補正の対象　　　（１）「　　願　　　　　ｇ
　」（２）「委　任　状」

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、肝細胞を分裂能力が適当な処理によつて永久に抑制
   されている上皮タイプ肝細胞と 同時培養することを特徴とする特異機能の 全機性を維持することができる肝細胞の培 養方法。 ２、肝細胞が噛歯類動物肝細胞である特許請求の範囲第
   １項記載の方法。 ３、肝細胞がヒト肝細胞である特許請求の範囲第１項記
   載の方法。 ４、使用される上皮タイプ肝細胞が毛細胆管の細胞から
   得られる系統に由来する特許請 求の範囲第１項記載の方法。 ５、上皮タイプ肝細胞がチヤン細胞である特許請求の範
   囲第１項および第２項記載の方 法。 ６、チヤン細胞を単層で培養する特許請求の範囲第５項
   記載の方法。 ７、適当な処理が物理的な種類である特許請求の範囲第
   １項記載の方法。 ８、γ放射線を使用する特許請求の範囲第７項記載の方
   法。 ９、適当な処理が化学的な種類である特許請求の範囲第
   １項記載の方法。 １０、マイトマイシン−Ｃのような抗有系分裂薬剤を使
   用する特許請求の範囲特９項記載 の方法。 １１、適当な処理がγ放射線とマイトマイシン−Ｃの組
   み合わせである特許請求の範囲第 １項記載の方法。 １２、特許請求の範囲第１〜１１項のいずれかに記載さ
   れる方法を実施することによつて 培養を得る肝細胞と上皮タイプ肝細胞の同 時培養。