JPS62502939A - Identification of IgE binding proteins by molecular cloning - Google Patents

Identification of IgE binding proteins by molecular cloning

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JPS62502939A
JPS62502939A JP50232486A JP50232486A JPS62502939A JP S62502939 A JPS62502939 A JP S62502939A JP 50232486 A JP50232486 A JP 50232486A JP 50232486 A JP50232486 A JP 50232486A JP S62502939 A JPS62502939 A JP S62502939A
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protein
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binding protein
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JP50232486A
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リュー，フー・トン
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メディカル・バイオロジ−・インスティチュ−ト
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70535—Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64 (CD2314/705F)

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】 分子クローニングによるＩｇＥ結合蛋白質の同定発明の分野 この発明は、組換ＤＮＡ技術の分野に属し、より特定的には、見かけの分子量が 約３１．０００ダルトンであるＩｇＥに特異性を有する蛋・白質の生産方法に関 する。[Detailed description of the invention] Identification of IgE binding proteins by molecular cloning Field of the invention This invention belongs to the field of recombinant DNA technology, and more specifically, Concerning a method for producing a protein with specificity for IgE, which is approximately 31,000 daltons. do.

発明の背景 免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）分子の生成および作用の双方は、ＩｇＥ−結合蛋白 質に大きく依存している。１つの形式のＩｇＥ−結合蛋白質は、マスク細胞、好 塩基性細胞、リンパ球および他の細胞の細胞表面レセプタを含む（１゜２）。マ スク細胞おｊび好塩基性細胞上のレセプタは、ＩｇＥにより媒介される速（、か つ高感度の反応（３，４）に応答することができ、他方、リンパ球上のレセプタ は、ＩｇＥ抗体応答（５，５）の調整において重要な役割を果たしている。他の 形式のＩｇＥ−結合蛋白質は、ＩｇＥ抗体産生を促進したり、あるいは抑圧する ように作用する、リンフ才力インを含む（，５）。ＩｇＥ系を充分に理解するた めには、これらの蛋白質のに、ｉ造的関連性、これらの各蛋白質の１１′４造− 作用の関係ならびにこれらの遺伝子表現の規定を確立することが重要である。そ れゆえに、この発明の基本的な目的は、これらの関連の蛋白質に対してＤＮＡを 分子クローニングすることを創案することにある。Background of the invention Both the production and action of immunoglobulin E (IgE) molecules are dependent on IgE-binding proteins. Much depends on quality. One type of IgE-binding protein is Contains cell surface receptors on basic cells, lymphocytes and other cells (1°2). Ma Receptors on skeletal and basophilic cells induce IgE-mediated (3,4) and on the other hand, receptors on lymphocytes. plays an important role in regulating IgE antibody responses (5,5). other Forms of IgE-binding proteins promote or suppress IgE antibody production Contains phosphorus, which acts like a lymph (, 5). In order to fully understand the IgE system, In order to explain the structural relationship of these proteins, the 11'4 structure of each of these proteins. It is important to establish the relationship of effects as well as the regulation of these gene expressions. So Therefore, the basic objective of this invention is to provide DNA for these related proteins. The goal is to invent molecular cloning.

ラットの好塩基性白血病細胞（ＲＢＬ）は、好塩基性細胞およびマスト細胞上に 存在する高い親和性を有するＩｇＥレセプタを研究するのに幅広く用いられてき た細胞であり、この細胞から、既にＩｇＥ−結合蛋白質が分離されており、かつ 特徴づけられている（１，４．７の文献においてレビューされている。）。１つ の充分に研究されたＩｇＥ−結合蛋白質は、Ｍ−１５５，０００の糖蛋白質であ り、ｒ これは多数の研究所において研究されてきた（８．　９．　１０）。この蛋白質 が、ＲＢＬ細胞、マスク細胞および好塩基性細胞の表面において発現され、かつ これらの細胞の高い親和性を有するＩｇＥ−結合特性に応答することが明らかに 確立されている。Rat basophil leukemia cells (RBL) are found on basophil cells and mast cells. It has been widely used to study the high affinity IgE receptors that exist. cells from which IgE-binding proteins have already been isolated, and (reviewed in the literature 1, 4.7). one A well-studied IgE-binding protein is the M-155,000 glycoprotein. ri, r This has been studied in numerous laboratories (8.9.10). this protein is expressed on the surface of RBL cells, mask cells and basophil cells, and It is clear that these cells respond to IgE-binding properties with high affinity. Established.

高い親和性を有する１ｇＥレセプタの生化学的性質は、このレセプタをＲＢＬ細 胞から生成しようとして他の蛋白質成分の同定により該レセプタの多元−副単位 性を表わす場合、幾分罠雑なものとなる。成るグループの科学者達は、ＩｇＥ− レセプタ錯体のアフィニティによる生成において、Ｍ−３３，０００（１１，１ ２）およびＭ−１０，０００−トー「 （１３）の２ｆｉｌｉの付加的な蛋白質を分離した。また、彼等は、二官能性の 架橋剤でＲＢＬ細胞あるいは細胞溶解質を処理することによりζＭ−約５５，０ ００の糖蛋白質とな１−「 るように、これらの２つの蛋白質が化学架橋することができることを示し、それ ゆえに、これらの蛋白質を、高い親和性を有するＩｇＥレセプタのそれぞれβお よびγ副ユニットと規定し、Ｍ−約５５．０００の糖坦白質をα副二二ｒ ットと規定した。The biochemical properties of the 1gE receptor with high affinity make it unique to RBL cells. Identification of other protein components that may be generated from the receptor's multiple subunits When expressing gender, it becomes somewhat complicated. Scientists from the group consisting of IgE- In the affinity generation of receptor complexes, M-33,000 (11,1 2) and M-10,000-To' (13) 2fili additional proteins were isolated. They also have bisensual By treating RBL cells or cell lysates with a cross-linking agent, ζM-approximately 55,0 00 glycoprotein and 1-" We show that these two proteins can be chemically cross-linked, as shown in Therefore, these proteins have high affinity for IgE receptors β and β, respectively. and the γ accessory unit, and the M-approximately 55,000 carbohydrate white matter is defined as the α accessory unit. It was defined as a cut.

別のグループの科学者達は、ＩｇＥ免疫吸着剤を用いた反復性アフィニティ・ク ロマトグラフィによるＲＢＬ　ＩｇＥレセプタの生成において、Ｍ−５５，００ ０の糖蛋白ｒ 質に加えてＭ−３０，０００〜３３，０００の蛋白質を分−「 離した。この蛋白質は、・β副ユニットと名付けられた蛋白質と類似した性質を 分は合うものであるが、これらの正確な関係は、なお強固に確立されたままであ る。のみならず、いずれかの蛋白質の分離が、ＩｇＥを独立に結合する能力に基 づき得るものであるか否かを決定することが残っている。最近になって、β副ユ ニットと異なるが、ＩｇＥ−結合特性ををする、Ｍ−３０，０００〜３３，００ ０の蛋白ｒ 質がＲＢＬ細胞内で同定されている（１７）。Another group of scientists has conducted repeated affinity tests using IgE immunosorbents. In the generation of RBL IgE receptor by chromatography, M-55,00 0 glycoprotein r In addition to quality, M-30,000 to 33,000 proteins are separated. I let go. This protein has properties similar to a protein named β subunit. although the exact relationships between them remain firmly established. Ru. Not only that, the separation of either protein is based on its ability to independently bind IgE. It remains to be determined whether this is possible. Recently, β secondary M-30,000-33,00 which is different from knit but has IgE-binding properties 0 protein r have been identified within RBL cells (17).

この発明の主たる目的は、約３１．０００ダルトンの分子量を有するＩｇＥ特異 性蛋白質を生産する組換ＤＮＡ分子を作り出し、かつ培養することにある。長い 範囲の目的としては、このｉｎ、’ｖｉｔｒｏで得られた蛋白質を用いて、Ｉｇ Ｅ系蛋白質のも＋ζ造的関連性、各蛋白質の構造−作用の関係、ならびにこれら の遺伝子表現の規定を確立する下記の参考文献の内容は、当業者にとっての背景 として、前述した説明に記載されているとおり、前述した明細書中に援用する。The main object of this invention is to provide an IgE-specific The goal is to create and culture recombinant DNA molecules that produce sexual proteins. long For a range of purposes, using this in vitro obtained protein, Ig Mo+zeta-structural relationships of E-based proteins, structure-action relationships of each protein, and these The contents of the following references establishing the definition of gene expression for is incorporated herein by reference as set forth in the foregoing description.

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１、Ｃｈｅｍ、第２５５巻第９０６０頁〜第９０６６頁（１９８０）。1, Chem, Vol. 255, pp. 9060-9066 (1980).

３２、ピーコウド、エイ、アール、（Ｐ　ｅ　ｃ　ｏ　ｕ　ｄ、Ａ。32, Pecoud, A, R, (Pe c o u d, A.

Ｒｏ）、ルディ、ニス（Ｒｕｄｄｙ、Ｓ、）およびコンラッド、ディー、エイチ 、（Ｃｏｎｒａｄ、Ｄ、Ｈ，）のＪ。Ro), Ruddy, S., and Conrad, D. H. , J. (Conrad, D.H.).

Ｉｍｍｕｎｏｌ、第１２６巻第１６２４頁〜第１６２９頁（１９８１）。Immunol, Vol. 126, pp. 1624-1629 (1981).

３３、　ゲッツェ、エイ、（Ｇｏｅｔｚｅ、Ａ、）、カネロポウロス、ジェイ（ Ｋａｎｅｌｌｏｐｏｕｌｏｓ、Ｊ、）、ライス、ディー（Ｒｉｃｅ、Ｄ、）およ びメツゲル、エイチ（Ｍｅ　ｔ　ｚｇｅ　ｒ、　Ｈ，）のＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔ ｒヱ第２０巻第６３４１頁〜第６３４９頁（１９８１）。33. Goetze, A., Kanellopoulos, J. Kanellopoulos, J.), Rice, D. and Biochemist of Metzger, H, r, Vol. 20, pp. 6341-6349 (1981).

３４、リバニー、ビー（Ｒｉｖｎａｙ、Ｂ、）、ワンク。34, Rivnay, B., Wank.

ニス、エイ、　（Ｗａｎｋ、Ｓ、Ａ、）　、ポイ、ジー、（Ｐｏｙ、Ｇ、）およ びメツゲル、エイチ（Ｍｅｔｚｇｅｒ。Wank, A, (Wank, S, A,), Poy, G, (Poy, G,) and Metzger, H.

Ｈ，）のＢｌｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第２１巻第６９２２頁〜第６９２７頁（１９ ８２）。Blochemistry Vol. 21, pp. 6922-6927 (19 82).

３５、シーガル、ディー、エム、（Ｓｅｇａ　ｌ、Ｄ、Ｍ。35, Sega l, D, M.

）、シャＯ−、１ス、オー、（Ｓｈａｒｒｏｗ、Ｓ、Ｏ，）、ジョーンズ、ジエ イ、エフ、（Ｊｏｎｅｓ、Ｊ、Ｆ、）およびシラガニアン、アール、ピー、（Ｓ ｉｒａｇａｎｉａｎ、　Ｒ，Ｐ、　）のＪ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、第１２６巻第１３ ８頁〜第１４５頁（１９８１）。), Sharrow, S, O, (Sharrow, S, O,), Jones, Jie Jones, J.F., and Shiraganian, R.P., (S. iraganian, R,P, ) J, Immunol, Vol. 126, No. 13 8-145 (1981).

３６、タイホーファー。ジー（Ｍａｙｒｈｏｆｅｒ、Ｇ。36, Tyhofer. Mayrhofer, G.

）、ベイジン、エイチ（Ｂａｚｔｎ、Ｈ，）およびゴーワンズ　ジエイ、エル、 （Ｇｏｗａｎｓ　Ｊ、Ｌ、）の旦且ｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ１．第６巻第５３７頁 〜第５４５頁（１９７６）。), Baztn, H, and Gowans G, L. (Gowans J, L,) and r, J, Immuno1. Volume 6, page 537 ~Page 545 (1976).

３７、スズキ、ティー　（Ｓｕｚｕｋ　Ｌ、Ｔ、）　、タキ。37, Suzuki, Taki (Suzuk L, T,), Taki.

ティー　（Ｔａｋ　ｔ、’ｒ、）　、”チミネ、ケイ（Ｈａｃｈｉｍｉｎｅ、に 、およびサダジバン、アール（Ｓａｄａｓｉｙａｎ、Ｒ，）のＭｏ１．Ｉｍｍｕ ｎｏｌ、第１８巻第５５頁〜第６５頁（１９８１）。Tak t, 'r, ``Hachimine, Kei (Hachimine, ni) , and Sadasiyan, R., Mo1. Immu nol, Vol. 18, pp. 55-65 (1981).

３３、　ハフ、ティー、エフ、（）Ｉｕｆ　ｆ、Ｔ、Ｆ、）、ウィーデ、ティー （Ｕｅｄｅ、Ｔ、）およびイシザカ、ケイ（Ｉｓｈｉｚａｋａ、　Ｋ、　）のＪ 、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、第１２９巻第５０９頁〜第５１４頁（１９８２）。33, Huff, T, F, ()Iuf f, T, F,), Wiede, T (Uede, T.) and Ishizaka, K. (J. , Immunol, Vol. 129, pp. 509-514 (1982).

３９、　ヘンプステツド、ビー、エル、（Ｈｅｍｐｓｔｅａ　ｄ、Ｂ、Ｌ、　） 　、クルシジイシキー、エイ、ジュニア（Ｋｕｌｃｚｙｃｋｉ、Ａ、、Ｊｒ、） およびパーカー。39, Hempstead, B, L, (Hempstea d, B, L,) , Kulczycki, A., Jr. and Parker.

シー、ダブリｘ、（Ｐａｒｋｅｒ、Ｃ，Ｗ、）のＢｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙ ｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、第９８巻第８１５頁〜第８２２頁（１９８１）。Biochem, Biophy of C, Dubx, (Parker, C, W,) s, Res, Commun, Vol. 98, pp. 815-822 (1981).

（以下余白） 発明の概要 見かけの分子量が３１．０００ダルトンのＩｇＨに特異的な蛋白質の翻訳可能な 最終生成物を有する組換ＤＮＡ分子が生産される。分子クローニングのために、 二重鎖のＣＤＮＡを、蔗糖勾配で分画されたＲＢＬ　ｍＲＮＡから合成し、ベク ター・プラスミド内に挿入し、かつ受容菌ホスーニングすることにより、分子ｆ ｆ１３１，０００のＩｇＥ−結合蛋白質をコードしたｍＲＮＡにハイブリッドさ れたＣＤＮＡを含むいくつかの遺伝子を同定した。これらのクローン化されたｃ ＤＮＡの１のＤＮＡ配列を決定し、かっこの蛋白質の部分に対応するアミノ酸配 列を推定した。このクローン化されたｃＤＮＡは、ＲＢＬ細胞内で同定された分 子！３１．０００のＩｇＥ−結合蛋白質をよくコードしられていると思われ、か つこれらの細胞は、好塩基性細胞で重要な役割を膏し得る。(Margin below) Summary of the invention A translatable IgH-specific protein with an apparent molecular weight of 31,000 Daltons A recombinant DNA molecule with a final product is produced. For molecular cloning, Double-stranded CDNA was synthesized from RBL mRNA fractionated on a sucrose gradient, and vector The molecule f hybridized to the mRNA encoding the IgE-binding protein of f131,000. We identified several genes that contain the same CDNAs. These cloned c Determine the DNA sequence of DNA 1 and find the amino acid sequence corresponding to the protein part in parentheses. The column was estimated. This cloned cDNA was identified in RBL cells. Child! It is thought that 31,000 IgE-binding proteins are commonly encoded; These cells may play an important role in basophil cells.

この発明は、翻訳生成物として選択的にＩｇＥを結合するポリペプチドを有する ｃＤＮＡ分子を生産する方法を含み、この方法は下記の工程を備える。すなわち 、分子量約３１．０００ダルトンであり、ＲＢＬ　ｍＲＮＡの翻訳生成物から免 疫沈降され、かつ正常のウサギの血清によっては沈澱されない、ＩｇＥ−結合ポ リペプチドをコードしている遺伝材料を分離する工程、ベクタ内に上記遺伝材料 を組込む工程、受容菌となる生体内にベクタを移す工程、ＩｇＥ−結合蛋白質表 現を有するホスト細胞の選択およびクローニングする工程、ならびに得られた蛋 白質を回収する工程。This invention has a polypeptide that selectively binds IgE as a translation product. A method of producing a cDNA molecule is included, the method comprising the following steps. i.e. , has a molecular weight of approximately 31,000 daltons, and is isolated from the translation product of RBL mRNA. IgE-binding proteins that are precipitated by epilepsy and are not precipitated by normal rabbit serum. A step of isolating the genetic material encoding the repeptide, placing the genetic material in the vector. step of incorporating the vector, step of transferring the vector into the recipient organism, IgE-binding protein table the process of selecting and cloning host cells harboring the protein The process of collecting white matter.

上述の方法により生産されたＩｇＥ−結合蛋白質は、抗−εＢＰ抗血清と特異的 に反応し、かつＩｇＥ−セファローズ４Ｂと結合する。The IgE-binding protein produced by the method described above has a specific interaction with anti-εBP antiserum. and binds to IgE-Sepharose 4B.

上述の方法により生産されたＩｇＥ−結合蛋白質は、少なくとも５個のメチオニ ン残基を有する分子として、潜在的なＮ−グリコジル化位置を有しない分子とし て、ならびに分子！５５．０００ダルトンのＩｇＥ−結合蛋白質から独立に分離 され得る分子として特徴づけられる。The IgE-binding protein produced by the method described above contains at least five methionyl atoms. As a molecule with a N-glycosylation residue, as a molecule with no potential N-glycosylation positions. And molecules! Separated independently from the 55,000 Dalton IgE-binding protein It is characterized as a molecule that can be

また、この発明は、約３１，０００ダルＩ・ンのＩｇＥ−を特異的に結合する蛋 白質の製造により特徴づけられるＣＤＮＡを含む。The present invention also provides a protein that specifically binds IgE of about 31,000 Daltons. Contains CDNAs characterized by white matter production.

のＩｇＥ−結合蛋白質であり、少なくとも５個のメチオニン残基を有する分子で あり、Ｎ−グリコジル化位置を有しない分子であり、さらに５５，０００ダルト ンのＩｇＥ蛋白質から独立に分離され得る分子である。is an IgE-binding protein with at least 5 methionine residues. molecule with no N-glycosylation positions and an additional 55,000 Daltons. It is a molecule that can be separated independently from the normal IgE protein.

このｃＤＮＡは、分子量約３１．０００ダルトンのＩｇＥ結合蛋白質の製造方法 によっても特徴づけられ、すなゎ抗イプシロンＢＰ抗血清と特異的に反応する分 子であり、かつＲＢＬ細胞からｒｎＲＮＡと特異的に交雑する分子である。This cDNA is a method for producing an IgE binding protein with a molecular weight of approximately 31,000 daltons. It is also characterized by the ability to react specifically with anti-epsilon BP antiserum. It is a molecule that specifically hybridizes with rnRNA from RBL cells.

分子量約３１，０００ダルトンのＩｇＥ結合蛋白質の生産により特徴づけられる ｃＤＮＡであり、がっ前記ｃＤＮＡのカルボキシル基末端の半分のアミノ酸コー ド配列が実質的に下記のとおりであるｃＤＮＡ： 八ＣＡ　ＣＴＧ　ＡＣＡ　ＧＴＧ　ＣＣＣ’Ｔ八ＣＧ入へ　ＡＴＣＣＣＣＴＴＧ 　ＣＣＴ　ＧＣＡ　ＧＧＡ　ＧＴＣＡＣＣＣＣＴ　ＣＧＣＡＴＧ　ＣＴＧ　ＡＴ ＣＡＣＡ　ＡＴＣＡＴＡ　ＧＧＣＡＣＡ　ＧＴＧ　八人Ｇ　ＣＣＣＡＣＣＧＣＡ 　八人ＣＡＧＴ　ＡＴＣ，ＡＣＴ　ＣＴＧ　入入Ｔ　ＴＴＣ入ＡＧ　八人λ　Ｇ ＧＧ　八人ＣＧＡＣＡＣＣＧＣＣＴＴＣＣＡＣＴＴＴ、ＡＡＣＣＣＣＣＧＣＴＴ Ｃλ入Ｔ　ＧＡＧ　八人ＣＡＡＣへＧへ人ＧＡ　ＧＴＣＡＴＣＧＴＧ　ＴＧＣ八 人ＣＡＣＧ　ＡＡＣＣＡＧ　ＣＡＣ八人Ｔ　入入ＣＴＧＧ　ＧＧＧＡＣＧ　ＧＡ Ａ　ＧＡＡ　八ＧＡ　ＣＡＧ、ＴＣＡ　ＧＣＴ　ＴＴＣＣＣＣＴＴＴ　ＧＡＧ　 ＡＧＣＧＧＣＡＡ入八ＣＡ　ＴＴＣへ°Ａへ　ＡＴＡ　ＣＡＧ　ＧＴＣＣＴＧ　 ＧＴＴ　ＧＡＡ　ＧＣＣＧＡＣＣＡＣＴＴＣ八人ＧＧ’ｒＴ　ＧＣＧ　ＧＴＣ八 人Ｔ　ＧＡＴ’　ＧＴＴ　ＣへＴ　ＣＴＧ　ＴＴＧ　ＣＡＧ　ＴＡＴ　ＡＡＣＣ へＴ　ＣＧＧＡＧＣ八人Ｇ　八人ＣＣＴＣＡＧＧ　ＧＡＡ　ＡＴＣ八ＧＣＣ八人 　ＣＴＧ　ＧＧＧ　ＡＴＣＡＴＴ　ＧＧＴＧ入ＣＡＴＡ　八ＣＣＣＴＣＡＣＣ， ＡＣＣＧＣＴ　ＴＣＣＣＡＣＧＣＣ入ＴＧ　入ＴＣＴ八人　ＧＣＣ八Ｇへ　へＧ Ｇ　ＧＧＴ　ＧＧＧ　ＣＣＧ　ＣＣＡ　ＣＣＡ　ＧＡＡ　ＣＴＧ　ＣＣＣＴＧＴ 　ＧＴＧ　ＴＴＡ　ＴＧ八八ＣＧ　ＧＣＡ　八人ＣＴＴＴ　ＧＣＡ　ＴＴＴ　Ｃ ＴＣＴＣＴ　ＣＣＴ　ＴＡＴ　ＡＣＴ　ＴＣＴ　ＴＧＴ　八人ＧへＣＡ　ＴＣＣ 八ＴＴ　Ｔ八人　Ｔ八人　八ＧＴ　ＣＴＣＧＴＧ　ＣＴＧ　ＡＧＡ　ＧＡＡ　八 人λ　へ人入　八ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ 上述のような特徴づけられたｃＤＮＡは下記の蛋白質をコード化する： ＴＨＲＬＥｔＪ　ＴＩＩＲＶＡＬ　ＰＲＯＴＹＲ入ＳＰ　ＭＥＴ　ＰｌＮｏ　Ｌ ＥＩＪ　ＰＲＯＧＬＹ　ＧＬＹ　ＶＡＬＩＬＥ　ＡＬＡ　ＰＩＩＥ　ＨＩＳ　Ｐ ＨＥ　ＡＳＮ　ＰＲＯＡＲＧ　ＰＨＥ　ＡＳＮ　ＧＬＵ　ＡＳＮ　ＡＳＮ　ＡＲ ＧＡＲＧ　ＶＡＬ　ＩＬＥ　ＶＡＬ　ＣＹＳ　ＡＳＮ　ＴＨＲＬＹＳ　ＧＬＮ　 ＡＳＰ　ＡＳＮ　ＡＳＮ　’ＴＲＰ　ＧＬＹＡＲＧ　ＧＬＬＩ　ＧＬｔＪ　ＡＲ Ｇ　ＧＬＮ　ＳＥＲＩＡＬＡ　ＰＩＫＥ　ＰＲＯＰＨＥ　ＧＬＵ　ＳＥＲＧＬＹ 　ＬＹＳＰｒｔＯＰ）ＩＥ　ＬＹＳ　ＩＬＥ　ＧＬＮ　ＶＡＬ　ＬＥＵ　ＶＡＬ ’　ＧＬＵ　ＡＬＡ　ＡＳＰ　）ＩＩＳ　ＰＨＥ　ＬＹＳＶＡＬ　ＡＬＡ　ＶＡ Ｌ　ＡＳＮ　ＡＳＰ　ＶＡＬ　ＨＩＳ　ＬＥＵ　ＬＥＤ　ＧＬＮ　ＴＹＲＡＳＮ 　ＨＩＳ　ＡＲＧＭεＴ　ＬＹＳ　ＡＳＮ　ＬＥＵ　ＡＲＧ　ＧＬＬｌ　ＩＬＥ 　ＳＥＲＧＬＮ　ＬＥｔＪ　ＧＬＹ　ＩＬＥ　ＩＬＥ　ＧＬＹＡＳＰ　ＩＬＥ　 ＴＨＲＬＥＤ　ＴＨＲＳＥＲＡＬＡ　ＳＥｎ　ｌｌｌ５　ＡＬＡ　ＭＥＴ　ＩＬ Ｅ　ｉｌｌこのｃＤＮＡ分子は、分子量約３１．０００ダルトンのＩｇＥ結合蛋 白質の年産により特徴づけられており、前記ｃＤＮＡもまた、３．゛の翻訳され ていない領域内に１２１個の核酸を有する分子であり、ポリ（Ａ）付加位置の前 に典型的にはＡＡＴＡＡＡ配列の１５〜２１個の塩基を有する分子であり、膜透 過配列（ＴｒａｎｓＩＩｌｅｍｂｒａｎｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ）を何ら有しな い配列の分子であり、Ｎが結合された炭水化物接合位置を有しない配列の分子で あり、さらに親水性を示す分子である。Characterized by the production of an IgE binding protein with a molecular weight of approximately 31,000 daltons It is a cDNA, and contains the amino acid code of half of the carboxyl group terminal of the cDNA. cDNA whose code sequence is substantially as follows: 8 CA CTG ACA GTG CCC’T 8 CG entry ATCCCCCTTG CCT GCA GGA GTCACCCCT CGCATG CTG AT CACA ATCATA GGCACA GTG Eight G CCCACCGCA Eight people CAGT ATC, ACT CTG entering T TTC entering AG Eight people λ G GG Eight people CGACACCGCCTTCCACTTT, AACCCCCGCTT Cλ entering T GAG 8 people CAAC to G GA GTCATCGTG TGC 8 Person CACG AACCAG CAC Eight T Enter CTGG GGGACG GA A GAA 8GA CAG, TCA GCT TTCCCCTT GAG AGCGGCAA Enter Hachi CA To TTC °A ATA CAG GTCCTG GTT GAA GCCGACCACTTC eight GG'rT GCG GTC eight Person T GAT' GTT C to CTG TTG CAG TAT AACC ToT CGGAGC 8 people G 8 people CCTCAGG GAA ATC 8 GCC 8 people CTG GGG ATCATT GGTG entry CATA 8CCCTCACC, ACCGCT TCCCAC GCC entered TG entered TCT 8 people to GCC 8G to G G GGT GGG CCG CCA CCA GAA CTG CCCTGT GTG TTA TG 88 CG GCA 8 people CTTT GCA TTT C TCTCT CCT TAT ACT TCT TGT Eight G to CA TCC 8 TT 8 T 8 T 8 GT CTCGTG CTG AGA GAA 8 Enter person λ 8CCCCCCCCCCCC The characterized cDNAs described above encode the following proteins: THRLEtJ TIIRVAL PROTYR SP MET PlNo L EIJ PROGLY GLY VALILE ALA PIIE HIS P HE ASN PROARG PHE ASN GLU ASN ASN AR GARG VAL ILE VAL CYS ASN THRLYS GLN ASP ASN ASN’TRP GLYARG GLLI GLtJ AR G GLN SERIALA PIKE PROPHE GLU SERGLY LYSPrtOP) IE LYS ILE GLN VAL LEU VAL ' GLU ALA ASP) IIS PHE LYSVAL ALA VA L ASN ASP VAL HIS LEU LED GLN TYRASN HIS ARGMεT LYS ASN LEU ARG GLLl ILE SERGLN LEtJ GLY ILE ILE GLYASP ILE THRLED THRSERALA SEn lll5 ALA MET IL E ill This cDNA molecule contains an IgE binding protein with a molecular weight of approximately 31,000 daltons. The cDNA is also characterized by the annual production of white matter. Translated by ゛ It is a molecule that has 121 nucleic acids in a region without poly(A) addition. It is a molecule that typically has 15 to 21 bases in the AATAAA sequence, and has a membrane permeability. Does not have any oversequences (Trans II lembrane 5 sequences) A molecule of a sequence that does not have an N-linked carbohydrate junction. Furthermore, it is a molecule that exhibits hydrophilic properties.

このｃＤＮＡ分子は、前記分子がＲＢＬ細胞がらのＲＮＡ種と特異的に反応する 、分子量約３１．ｏｏｏのＩｇＥ結合蛋白質の製造によっても特徴づけられる。This cDNA molecule reacts specifically with RNA species found in RBL cells. , molecular weight approximately 31. ooo is also characterized by the production of IgE binding proteins.

る翻訳生成物から分離されたＩｇＥ−結合蛋白質のＮａＤｏｄｓｏ、−ＰＡＧＥ 分析の表現である。Ａ）ＲＢＬポリ（Ａ）＋　ＲＮＡを、１０〜３０％の蔗糖勾 配上で分画した（各フラクションにおけるＲＮＡ沈降係数については参考文献２ ２を参照されたい）。また、個々のフラクションを、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで卵訳し た。次に、翻訳生成物中のＩｇＥ−結合蛋白質をＩｇＥ−セファローズ４Ｂを用 いて分離した。Ｂ）蔗糖勾配上で分画されたＲＮＡ　（フラクション１３〜１６ のプール）からのｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける翻訳生成物を、ウサギの抗−εＢＰ 血清（レーンＡ）あるいは正常のウサギの血清（レーンｂ）での免疫沈降にさら した。この蛋白質を、１０％のポリアクリルアミドゲル上で分析した。NaDodso, -PAGE of IgE-binding proteins isolated from translation products. It is an expression of analysis. A) RBL poly(A) + RNA was added to a 10-30% sucrose gradient. (See Reference 2 for RNA sedimentation coefficients in each fraction. 2). In addition, individual fractions were translated in vitro. Ta. Next, the IgE-binding protein in the translation product was isolated using IgE-Sepharose 4B. and separated. B) RNA fractionated on sucrose gradient (fractions 13-16 In vitro translation products from a pool of rabbit anti-εBP Immunoprecipitation with serum (lane A) or normal rabbit serum (lane b) did. The protein was analyzed on a 10% polyacrylamide gel.

第２図は、クローン化されたｃＤＮＡに対してハイブリッドされたｍＲＮＡから のｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける翻訳生成物のＮａＤｏｄＳＯ，−ＰＡＧＥ分析の表 現である。Figure 2 shows the results from mRNA hybridized to cloned cDNA. Table of in vitro translation products of NaDodSO,-PAGE analysis of It is current.

ニトロセルロースフィルタに固定された１３６Ｃ９，１３ｃＤＮＡと交雑してい るｍＲＮＡは、ｉｎ　ｖｉｔｒ。hybridized with 136C9,13 cDNA immobilized on a nitrocellulose filter. The mRNA is in vitro.

において翻訳され、かつ翻訳生成物はＢＳＡ　Ｃレーンａ）を結合されたセファ ローズ４Ｂと、マウスのモノクローナル性１ｇＧ＋　（レーンｂ）あるいはマウ スのモノクローナルＩｇＥ（レーンＣ）と反応され、あるいはウサギの抗−εＢ Ｐ血清（レーンｄ）もしくは正常のウサギの血清（レーンｅ）との免疫沈降にさ らされた。分離された圧白質を、１０％のポリアクリルアミドゲル上で分析した 。and the translation product is a Sepha Rose 4B and mouse monoclonal 1gG+ (lane b) or mouse monoclonal IgE (lane C) or rabbit anti-εB For immunoprecipitation with P serum (lane d) or normal rabbit serum (lane e). was forced to Isolated white matter was analyzed on a 10% polyacrylamide gel. .

第３図は、クローン化されたｃＤＮＡ１３６ｃ９．１３の核酸配列を示す。この 核酸配列から予想されるアミノ酸は、このコード配列の下方に示されている。FIG. 3 shows the nucleic acid sequence of cloned cDNA136c9.13. this The amino acids predicted from the nucleic acid sequence are shown below this coding sequence.

第４図は、クローン化された１３６Ｃ９，１３ｃＤＮＡプローブと様々な細胞系 からのＲＮＡについてのノーザン　プロット　交雑分析（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　ｂ ｌｏｔ　ｂｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ）の結果を示す。５種の 細胞系、すなわちマウスのＩｇＥ−分泌性雑種（２６，８２：　レーンａ）、マ ウスのＩｇＧ、−分泌性雑種（１０９，３，Ｌ／−ンｂ）　、ＲＢＬ（レーンｃ ）、マウスの肥満細胞腫Ｐ８１５（レーンｄ）ならびにラットのリンパ腫ｌＲ９ ８３ＦＣレーンｅ）がらの全体のポリ（Ａ）”　ＲＮＡ　（それぞれ５μｇ）を グリオキシル化し、２％のアガロースゲル上で電気泳動し、ニトロセルロース・ フィルタを通過させ、かっ　Ｐでラベリングした１３６Ｃ９，，１３プローブで 交雑した。交雑条件は、２×デンハーツ（Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ）／２５ｍＭ　Ｐ ＩＰＥＳ、ｐＨ６，８／２５ｍＭ　ＥＤＴＡｌｏ、７５ＭＮａＣ店１５０％ホル ムアルデヒド１０．２％のＮａＤ。Figure 4 shows the cloned 136C9,13 cDNA probe and various cell lines. Northern blot hybridization analysis for RNA from The results of lot bybridization analysis are shown. 5 types Cell lines, i.e. mouse IgE-secreting hybrid (26,82: lane a), mouse Mouse IgG, -secretory hybrid (109,3,L/-n b), RBL (lane c ), mouse mastocytoma P815 (lane d) and rat lymphoma IR9 Total poly(A)” RNA (5 μg each) from 83FC lane e) Glyoxylated and electrophoresed on a 2% agarose gel, nitrocellulose Pass through a filter and use a 136C9,,13 probe labeled with Kap. Interbreeded. Crossing conditions were 2×Denhardts/25mM P IPES, pH 6,8/25mM EDTAlo, 75M NaC store 150% hol NaD with maldehyde 10.2%.

ｄ　Ｓ　Ｏ４／　５０　ｕ　ｇ　／　ｍ　１１．の熱変性されたｔ　ＲＮＡ１５ ０μｇ／ｍ　Ｑ、の熱変性された鮭の精子由来のＤＮＡ　：　４２℃。d S O4/50 u g/m 11. Heat-denatured tRNA15 of DNA from heat-denatured salmon sperm at 0 μg/m Q: 42°C.

１６時間。洗浄条件は、１５ｍＭ　ＮａＣＱ、／１．５ｍＭのクエン酸ナトリウ ム１０．１％のＮａＤｏｄＳＯ４，５１℃。16 hours. Washing conditions were 15mM NaCQ/1.5mM sodium citrate. 10.1% NaDodSO4, 51°C.

第５図は、ＲＢＬ細胞からの　Ｉで標識したＩｇＥ−結合蛋白質のＮａＤｏ’ｄ ＳＯ，−ＰＡＧＥ分析の表現である。Figure 5 shows NaDo'd of I-labeled IgE-binding protein from RBL cells. This is a representation of SO,-PAGE analysis.

（Ａ）ＲＢＬ　（レーンａ）、Ｐ１３１５（レーンｂ）またはラットのリンパ腫 （レーンＣ）からの細胞溶解質を、実施例１に記載されているよ・うに、ＩｇＥ −セファローズ４Ｂで反復性アファニティにより精製した。アフィニティによる 精製の第１サイクルの終了時に、蛋白質を　■で標識化した。（Ｂ）ＲＢＬ細胞 溶解質を、ＩｇＥ−セファローズ４Ｂでアフィニティにより生成し、結合蛋白質 をヨウ化し、溶質し、かつレンズ豆レクチンーセファ０−ズ４Ｂで処理した。結 合されていない拐料を、次に、１）ＩｇＥ−セファローズ４Ｂと反応させ（レー ンａ）、あるいは２）ウサギの抗−εＢＰ（レーンｂ）もしくは正常のウサギの 血清（レーンＣ）で免疫沈降させた。分離された蛋白質を、１０％のポリアクリ ルアミドゲル上で分析した。(A) RBL (lane a), P1315 (lane b) or rat lymphoma Cell lysates from (Lane C) were purified with IgE as described in Example 1. - Purified by recurrent affinity on Sepharose 4B. By affinity At the end of the first cycle of purification, the protein was labeled with ■. (B) RBL cells The lysate is generated by affinity with IgE-Sepharose 4B and the binding protein was iodinated, soluted, and treated with lentil lectin-Sephas 4B. Conclusion The uncombined pellets are then 1) reacted with IgE-Sepharose 4B (reacted with lane a) or 2) rabbit anti-εBP (lane b) or normal rabbit Immunoprecipitation was performed with serum (lane C). The separated protein was washed with 10% polyacrylate. Analyzed on a Ruamide gel.

この発明の詳細な説明 この発明は、ＩｇＥ結合蛋白質の製造方法、ならびに組換ＤＮＡ技術において用 い得るｃＤＮＡ分子の製造方法を含む。より特定的には、この発明は、分子二約 ３１，０００ダルトンのＩｇＥ結合蛋白質を生産するＣＤＮＡの形成、ならびに この蛋白質を生産し得る宿主／受宕菌生体の製造方法を含む。Detailed description of this invention This invention provides a method for producing IgE binding proteins, and a method for producing IgE binding proteins, as well as methods for use in recombinant DNA technology. This includes methods for producing cDNA molecules that can be produced. More specifically, the invention relates to the molecular Formation of a CDNA that produces a 31,000 Dalton IgE binding protein; It includes a method for producing a host/recipient organism capable of producing this protein.

ＲＢＬ　ｍＲＮＡのｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける翻訳生成物内の３１ＫＩｇＥ−結 合蛋白質の同定９８表ＢＨ６２−５０２９３９（７） 先に、我々は、ＲＢＬ　ｒｎＲＮＡで注入されたキセノスブの卵母細胞の表面上 のＩｇＥ−結合活性の表現を表わし、かつこれらの卵母細胞がらＩｇＥ免疫吸着 剤を用いて３１　Ｋ翻訳生成物を分離した（２２）。ＩｇＥレセプタの予想され たα副ユニット・に比べてのＮａＤｏｄＳＯ，−ＰＡＧＥゲル上の３１に蛋白質 帯の異常な強度は、この蛋白質が本来的にＩｇＥ７結合活性を有するがもじれな いことを示唆した。Ｌｉｙ糖勾配で分画されたＲＢＬ　ｍＲＮＡを、ウサギの網 状赤血球の溶解質系においてｉｎ　ｖｉｔｒ。31KIgE-binding within the in vitro translation product of RBL mRNA Identification of synthetic proteins 98 Table BH62-502939 (7) Previously, we showed that on the surface of xenobu oocytes injected with RBL rnRNA. represents the expression of IgE-binding activity of (22) Expected IgE receptor 31 proteins on the NaDodSO,-PAGE gel compared to the alpha subunit. The abnormal intensity of the band may be due to the fact that this protein inherently has IgE7 binding activity. He suggested something. RBL mRNA fractionated with a Liy sugar gradient was transferred to rabbit reticulum In vitro in the lysate system of erythrocytes.

で翻訳した。この翻訳生成物（様々な翻訳された蛋白質からなるが・・・データ は示さず）は、ＩｇＥ免疫吸着剤を用いたアフィニティによる精製にょ７て試験 した。第１Ａ図から明らかなように、３１Ｋｆｆｌ白質を、１３〜１４Ｓ　ＲＮ Ａの翻訳生成物からの他の正白質を実質的に含まないように分離した。Translated by . This translation product (consisting of various translated proteins...data (not shown) was tested by affinity purification using an IgE immunosorbent. did. As is clear from Figure 1A, the 31Kffl white matter is The translation product of A was isolated substantially free of other white matter.

他の高分子量の蛋白質に加えて、Ｍ−３０，０００〜３−と ３．０００の蛋白質を、ＩｇＥ免疫吸着剤を用いてＲＢＬ細胞溶解質から分離し た（１４〜１６）。これらの蛋白質に対して隆起されたポリクローナル性のウサ ギの抗血清は、双方の蛋白質成分と反応するように思われることが報告されてい た（１５）。上で検出された３１にの蛋白質は、小サナＭ　−３０，ＯＯＯ〜３ ３．　’ＯＯ０（７）蛋白質ニ４ｉとんどｒ 対応しており、かっこの抗血清が３１　Ｋの蛋白質の研究を容品とするのに有用 であることが仮定されていた。しだがって、この血清による翻訳生成物の反応性 を試験した。In addition to other high molecular weight proteins, M-30,000-3- 3.000 proteins were separated from RBL cell lysates using an IgE immunoadsorbent. (14-16). Polyclonal rabbits raised against these proteins It has been reported that the antiserum of G. elegans appears to react with protein components of both. (15). The protein at 31 detected above is Kosana M-30, OOO~3 3. 'OO0(7) Protein d4itondr The antiserum in parentheses is useful for research on 31K proteins. It was assumed that. Therefore, the reactivity of translation products with this serum was tested.

（単純化のために、この抗血清を、抗−ＩｇＥ結合蛋白質：抗−εＢＰと規定す る）。第１Ｂ図に示すように、３１に蛋白質は、抗−εＢＰ血清（レーンａ）の 翻訳生成物から免疫沈降されるが、正常なウサギの血清（レーンｂ）によっては 免疫沈降されなかった。３１　Ｋ蛋白質帯が、免疫沈降物中の主要な蛋白質であ ることが明らかであり、かつ特異的に免疫沈降される１＋ｌｉ−の蛋白質である ことを注意すべきである。(For simplicity, this antiserum is defined as anti-IgE binding protein: anti-εBP. ). As shown in Figure 1B, the protein at 31 was expressed in the anti-εBP serum (lane a). immunoprecipitated from translation products, but not by normal rabbit serum (lane b). Not immunoprecipitated. 31 The K protein band is the main protein in the immunoprecipitate. 1+li- protein that is clearly immunoprecipitated and specifically immunoprecipitated. It should be noted that

３１ＫＩｂＥ−結合蛋白質をコードするｃＤＮＡのクローニング 蔗糖密度勾配フラクション１４〜１６からのＲＢＬ　ｍＲＮＡを、ＩｇＥ−結合 蛋白質をコードする遺伝子のためｒｙ）を発生させるために用いた。約１，００ ０個の遺伝子から、１個の陽性の遺伝子（１３６Ｃ９，１３）を同定ＩｇＥを結 合するが（レーンｃ）　、ＢＳＡ　Ｃレーンａ）もしくはＩｇＧ１（レーンｂ） を結合しない３１に蛋白質に翻訳され得るＲＢＬ’細胞からのｍＲＮＡに交雑さ れる。さらに、翻訳された蛋白質は、抗−εＢＰ抗血清と特異的に反応すること が示された（レーンｄ対レーンｅ）。挿入分有することを示した。Cloning of cDNA encoding 31KIbE-binding protein RBL mRNA from sucrose density gradient fractions 14 to 16 was combined with IgE-conjugated ry) was used to generate the protein-encoding gene. Approximately 1,00 One positive gene (136C9,13) was identified from 0 genes. (lane c), BSA C lane a) or IgG1 (lane b) hybridized to mRNA from RBL' cells that can be translated into protein to 31 that does not bind It will be done. Furthermore, the translated protein specifically reacts with anti-εBP antiserum. was shown (lane d vs. lane e). It was shown that it has an insert.

１３６Ｃ９，１３ｃＤＮＡの核酸配列を決定し、かつ単一の開いた読取フレーム を同定した。第３図に示すように、このｃＤＮＡは、この蛋白質のカルボキシル 基末端のほぼ半分を表現している１３８個のアミノ酸に対するコード配列を宵す る。このｃＤＮＡ配列は、３′の翻訳されていない領域ならびにポリ（Ａ）付加 位置の前の典型的なＡＡＴＡＡＡ配列の１５〜２１個の塩基からなる１２１個の 核酸をも含む。この核酸のデータベースについての相同性の調査は、その配列が 先に述べられており、かつ他の公知の蛋白質やＤＮＡ配列に何ら相同性を示さな いことを示した。この蛋白質は、親水性プロット（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔ ｙ　ｐｒｏ、ｔ）により示されるように、むし６親水性である（２９）。この配 列の検査は、潜在的な膜透過（ｔｒａｎｓｍａｍｂｒａｎｃ）配列あるいはＮの 結合された炭水化物接合位置を何ら同定しない。The nucleic acid sequence of 136C9,13 cDNA was determined and a single open reading frame was identified. As shown in Figure 3, this cDNA The coding sequence for 138 amino acids representing approximately half of the terminal end is shown. Ru. This cDNA sequence contains the 3' untranslated region as well as the poly(A) addition. 121 bases of 15 to 21 bases of a typical AATAAA sequence before the position Also includes nucleic acids. Homology searches for this nucleic acid database are based on the sequence mentioned above and which does not show any homology to other known proteins or DNA sequences. It was shown that This protein is shown on the hydropathic plot. Mushi 6 is hydrophilic, as shown by y pro, t) (29). This arrangement Inspection of the arrays for potential transmamble sequences or N It does not identify any attached carbohydrate junctions.

３１ＫＩｇＥ−結合が、レセプタを欠く細胞ではなく、ＲＢＬ細胞により独特に 表現される。31KIgE-binding is uniquely expressed by RBL cells but not by cells lacking the receptor. expressed.

１３６Ｃ９，１３のｃｔ）、ＮＡを確信をもってＲＢＬ細胞のＩｇＥ−結合特性 に関連づけるために、このｃＤＮＡがＲＢＬ細胞中に存在するｍＲＮＡ種を検出 するが、ＩｇＥレセプタを欠く他の細胞中では検出しないことを最初に示すべき である。ノーザン・プロット・交雑実験を行なった。136C9, 13 ct), the IgE-binding properties of RBL cells with confidence that NA This cDNA detects the mRNA species present in RBL cells in order to associate it with However, it should be shown first that it is not detected in other cells lacking IgE receptors. It is. Northern plot crossbreeding experiments were conducted.

その結果を第４図に示す。１３６Ｃ９，１３のＣＤＮＡは、ＲＢＬ細胞から大き さ１．１１ｃｂおよび１．６ｋｂのｍＲＮＡで特異的にハイブリッドした（レー ンＣ）。より厳しい条件下で、１．２ｋｂのｍＲＮＡ帯のみが検出された。The results are shown in FIG. 136C9,13 cDNA is largely isolated from RBL cells. specifically hybridized with 1.11 cb and 1.6 kb mRNAs (ray C). Under more stringent conditions, only a 1.2 kb mRNA band was detected.

また、１．６ｋｂ帯ではなく１．１ｋｂ帯が、マウスの肥満細胞腫系Ｐ８１５か らのｍＲＮＡ中でより低い強度で検出された（レーンｄ）。これらの２個のｍＲ ＮＡは、いずれもラットのリンパ腫（レーンｅ）あるいは２個のマウスのハイブ リドーマを分泌するＩｇＥ（レーンａ）および１ｇＧ＋（レーンｂ）のいずれに おいても見い出されなかった。また、１．ｌｋｂのｍＲＮＡは、マウスの肥満細 胞腫細胞系ＣＸＢＧ　ＡＧＭＣＴ−１では検出されたが、マウスの大食細胞系Ｐ ３８８Ｄ１では検出されなかった（データは示さず）。In addition, the 1.1 kb band, not the 1.6 kb band, is derived from the mouse mast cell tumor line P815. (lane d). These two mR All NAs are from rat lymphoma (lane e) or two mouse hives. Both IgE secreting ridoma (lane a) and 1gG+ (lane b) However, it was not found. Also, 1. lkb mRNA is expressed in obese mouse cells. Although it was detected in the cystoma cell line CXBG AGMCT-1, it was detected in the mouse macrophage cell line P. It was not detected in 388D1 (data not shown).

３１ＫＩｇＥ−結合蛋白質をコードするＲＢＬ　ｍＲＮＡの発見は、この蛋白質 がＩｇＥを結合する成る種細胞系においてｉｎ　ｖｉｖｏで現実に翻訳されたこ とを証明するように我々を促した。ＲＢＬ細胞の溶解質は、ＩｇＥ−セファロー ズで吸着され、かつ結合蛋白質が溶化され、溶出され、ＩｇＥ−セファローズで 再度吸着された場合、の蛋白質に加えて分離された。ＩｇＨに非特異的に結合す る蛋白質を除去するためには、２サイクルのアフイニテイによる精製手順が必要 であることがわかった（１４．１５）。この方法と組合わせて、アフィニティに よる精製の第１回目のサイクルの終了時に正白質を放射性元素でラベリングする ことが都合が良く、それによって特異性の高いラジオ活性を示す蛋白質を得る。The discovery of RBL mRNA encoding the 31KIgE-binding protein indicates that this protein is actually translated in vivo in a seed cell system that binds IgE. He urged us to prove that. The lysate of RBL cells is IgE-Sepharose. The bound proteins are solubilized and eluted, and the IgE-Sepharose When re-adsorbed, the proteins were separated in addition to. Binds non-specifically to IgH A two-cycle affinity purification procedure is required to remove the proteins It was found that (14.15). In combination with this method, affinity At the end of the first cycle of purification, the white matter is labeled with a radioactive element. It is advantageous to obtain a protein exhibiting highly specific radioactivity.

マウスの肥満細胞ＪＨｒｉＰ８１５細胞（レーンｂ）およびラットのＢリンパ腫 細胞（レーンＣ）のいずれからも蛋白質が分離されず、双方の蛋白質がＲＢＬ細 胞に固有のものであることを示した。Mouse mast cell JHriP815 cells (lane b) and rat B lymphoma No protein was isolated from either cell (lane C) and both proteins were present in RBL cells. It was shown that it is unique to the cell.

次に、上述のよう、にして検出されたＲＢＬ細胞由来の３１に蛋白質がＩｇＥ− 結合蛋白質であることを立証するこら分離されることを議論し得るので、この正 白質がより分子量の大きな成分から独立に分離され得ることを示す必要がある。Next, as described above, the protein 31 derived from RBL cells was detected as IgE- It can be argued that the protein is isolated to prove that it is a binding protein. It is necessary to show that white matter can be separated independently from higher molecular weight components.

後者の蛋白質（α副ユニット）、これは非常に強くグリコジル化されているもの であるが、が様々なレクチンに結合することが知られており（３０）　、他方、 グリコジル化されていない（あるいは軽くグルコシル化されている）ＩＫＫ蛋白 質レクチンに極めて弱く結合し、あるいは全く結合されないので、上記の立証は 、レクチン吸着剤を用いることにより行なわれた。したがって、上述した第１の ＩｇＥ−セファローズ４Ｂに結合されており、かつ次にこれから溶出された゛蛋 白質は、レンズ豆　レクチン−セファローズ４Ｂと反応することが可能とされて おり、かつ結合されていない材料がＩｇＥ免疫吸着剤により処理された。the latter protein (alpha accessory unit), which is very heavily glycosylated However, is known to bind to various lectins (30); on the other hand, Non-glycosylated (or lightly glycosylated) IKK protein The above proof is due to the fact that it binds very weakly or not at all to lectins. , was carried out by using a lectin adsorbent. Therefore, the first Proteins bound to IgE-Sepharose 4B and then eluted from it It is believed that white matter can react with lentil lectin-Sepharose 4B. The free and unbound material was treated with IgE immunoadsorbent.

第５Ｂ図（レーンａ）に示すように、３１に蛋白質は、実際に、ＩｇＥ−セファ ローズ４Ｂにより分離された主要な蛋白質であった。この結果は、ＲＢＬ細胞中 に見られた３ｖｉｔｒｏにおいて翻訳された３　１　Ｋ蛋白質における場合と同 様に、それだけで抗−εＢＰ抗血清と反応することεＢＰ血清による免疫沈降に さらし、かつ３１　Ｋ蛋白質が特異的に免疫沈降されていることがわかった（第 ５Ｂ図、ｖｉｔｒｏで翻訳された生成物中において同定された蛋白質に対する関 連性を強（支持する。As shown in Figure 5B (lane a), the protein at 31 is actually IgE-Sepha It was the main protein isolated by Rose 4B. This result shows that in RBL cells This is the same as the case for the 31K protein translated in vitro, which was observed in As such, it alone reacts with anti-εBP antiserum, leading to immunoprecipitation with εBP serum. It was found that the 31K protein was specifically immunoprecipitated (see Figure 5B, relationships for proteins identified in vitro translated products. Strengthen (support) the connection.

実施例１ この発明の実施例は、下記のステージに分割される：１、　ＲＮＡの調製ならび にＲＮＡのｉｎ　ｖｉｔｒ。Example 1 Embodiments of this invention are divided into the following stages: 1. Preparation of RNA; RNA in vitro.

における翻訳 Ｉｌ、　ｃＤＮＡのクローニングならびにスクリーニング■、　免疫沈降 （Ａ）　ＩｇＥ−セファローズ４ＢによるＩｇＥ−結合正白質の分離：ｉｎ　ｖ ｉｔｒｏにおける翻訳生成物について用いた１回の方法。translation in Il, cDNA cloning and screening ■, immunoprecipitation (A) Separation of IgE-bound normal white matter by IgE-Sepharose 4B: inv One time method used for translation products in itro.

ニティによる精製によるＩｇＥ−結合蛋白質の分離：細胞溶解質に対して用いた 。Separation of IgE-binding proteins by purification using .

（Ｃ）　ウサギの抗−εＢＰ血清による免疫沈降。(C) Immunoprecipitation with rabbit anti-εBP serum.

ＣＤ）　電気泳動、ノーザンプロット交雑およびＤＮＡ配列の分析。CD) Electrophoresis, Northern blot hybridization and DNA sequence analysis.

細胞系および試薬：使用した細胞系は、ＲＢＬ　［１８゜ナショナル・インステ ィチュート・オブ・ヘルスのメツガ−（Ｍｅｔｚｇｅｒ）博士の好意により提供 されたちの］、マウスの肥満細胞１１ｉｌＩｉＰ８１５（１９）、ラットのリン パ腫ＩＲＱ８３Ｆ　［２０，本来ベイジン（Ｂａｚｉｎ）ｔ’！７士に由来する ものであり、かつメディカル・バイオロジー・インスティチュートのザネッティ 　（Ｚａｎｅｔｔｉ）博士により提供されたちの］、ならびに抗ジニトロフェニ ル（ＤＮＰ）ＩｇＥまたは１ｇＧ、を分泌するマウスのハイブリドーマ（２１） である。ＤＮＰに対して特異的なマウスのモノクローナルＩｇＥ　（Ｈｌ−ＤＮ Ｐ−ε−２６，８２）およびＩｇＧ、（ＩＩ−ＤＮＰ−α１−１０９．３）（２ １）、ヤギの坑−ウサギＩｇＧ　（ＧＡＲＧ）抗体（２１）ならびにＩｇＥ免疫 吸着剤（抗−εＢＰ：１５）上で反復クロマトグラフィによりＲＢＬ細胞からア フイニテイにより精製された蛋白質に対して調整されたウサギの抗血清は、先に 説明した。免疫吸着剤は、１０　ｕｌｇの蛋白質を１ｇ（乾燥ｍ　Ｑ　）のＣＮ Ｂｒで活性化したセファローズ４Ｂ（薬学紙のもの）に接合することにより調製 した。Cell lines and reagents: The cell lines used were RBL [18° National Institute Kindly provided by Dr. Metzger, Institute of Health ], mouse mast cell 11ilIiP815 (19), rat phosphorus Poma IRQ83F [20, Originally Bazin t'! Originated from 7 samurai Zanetti of the Medical Biology Institute (provided by Dr. Zanetti) and anti-dinitrophenic Mouse hybridomas secreting 1gG (DNP) IgE or 1gG (21) It is. Mouse monoclonal IgE specific for DNP (Hl-DN P-ε-26,82) and IgG, (II-DNP-α1-109.3) (2 1) Goat anti-rabbit IgG (GARG) antibody (21) and IgE immunization was extracted from RBL cells by repeated chromatography on adsorbent (anti-εBP:15). Rabbit antiserum adjusted against the protein purified by Finity was previously explained. The immunoadsorbent was prepared by combining 10 ulg of protein with 1 g (dry mQ) of CN. Prepared by bonding to Sepharose 4B (from Pharmaceutical Paper) activated with Br. did.

ＲＮＡの調製ならびにＲＮＡのｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける翻訳 標準的なフェノール／クロロホルム法による様々な細胞源からの全細胞質性ＲＮ Ａの抽出、オリゴ（ｄＴ）−セルロース　アフィニティ、・クロマトグラフィに よるポリ（Ａ）１の分離ならびにＲＢＬポリ（Ａ）”　ＲＮＡの蔗糖密度勾配分 画のすべては報告されている（２２）。ｍＲＮＡのｉｎ　ｖｉｔｒｏおける翻訳 は、［Ｓ］メチオニンの存在下においてウサギの網状赤血球溶解室系［ニューイ ングランド−１−５−クリア（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）］を 用いて行なった。Preparation of RNA and in vitro translation of RNA Total cytoplasmic RN from various cellular sources by standard phenol/chloroform method Extraction of A, oligo(dT)-cellulose affinity, chromatography separation of poly(A)1 and RBL poly(A)'' RNA by sucrose density gradient All images have been reported (22). In vitro translation of mRNA was performed using a rabbit reticulocyte lysis chamber system [New York] in the presence of [S]methionine. New England Nuclear] It was done using

ｃＤＮＡのクローニングおよびスクリーニング。二重鎖のｃＤＮＡを、蔗糖勾配 で分画されたＲＢＬ　ｍＲＮＡから調製し、ｐＢＲ３２２の旦」」工１位置に挿 入し、かつ旦ｌＣｏ１１　Ｃ６００を形質転換するのに用いた（２３）。cDNA cloning and screening. Transfer double-stranded cDNA to a sucrose gradient. Prepared from RBL mRNA fractionated with and used to transform lCo11C600 (23).

交雑−選択／ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける翻訳方法を、陽性の遺伝子に対してスク リーニングするのに用いた（２４）。Cross-selection/in vitro translation methods are screened for positive genes. used for leaning (24).

要約すれば、１２個のキメリック（ｃｈ　ｉｍｅ　ｒ　ｉ　ｃ）プラスミドの群 をニトロセルロース・フィルタに結合し、該フィルタを全ＲＢＬ、承り（Ａ）” 　ＲＮＡとともにインキュベートシ、交雑されたＲＮＡを溶出しかつｉｎ　ｖｉ ｔｒＯにおいて翻訳した。翻訳生成物を、免疫沈降させて（以下を参照）ＩｇＥ ＝結合蛋白質を検出した。陽性の群の個々の遺伝子について同一の方法で処理す ることにより、早足されているこの細胞系は、アメリカン　タイプ　カルチャー 　コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃ ｔｉｏｎ）に第５３１０７として寄託されており１．ブダペスト条約の条件の下 に入手可能なものであろう。In summary, a group of 12 chimeric (chimeric) plasmids to a nitrocellulose filter and convert the filter into a complete RBL Incubate with RNA, elute the hybridized RNA and in vitro Translated in trO. Translation products are immunoprecipitated (see below) with IgE =Bound protein detected. Treat each gene in the positive group in the same way. This cell line, which has been rapidly developed by American type culture Collection (American Type Culture Co11ec tion) as No. 53107 and 1. Under the terms of the Budapest Treaty It will be available in

を、２２６のトリトンｘ−ｉｏｏを含む等量の２ＸＴＥＮＴ（Ｉ　ＸＴＥＮＴ− ２０ｍＭ）リス−ＨＣｕ、ｐＨ７，５／１０ｍＭ　ＥＤＴＡ／１５０ｍＭ　Ｎａ ＣＱ、／１％トレーシイロール（Ｔｒａｓｙｌｏｌ））で希釈し、かつ４℃で１ 時間の間、５０μ店（充填容積で）のウサギのγグロブリン（ＲγＧ）−セファ ローズ４Ｂと混合した。次に、上澄みを５０μ痣のＩｇＥ−セファローズ４Ｂと ４℃で３時間混合した。このビーズを、４ｍ（ｌのＴＥＮＴ−１％トリトンＸ− １００で４回洗浄し、さらに４ｍＱ、のＴＥＮＴ−０゜０５％のＮａＤｏｄＳＯ ４で１度洗浄した。結合蛋白質を、３分間沸騰させることにより、７５μ込の６ ２．５ｍＭトリス−ＨＣ史、ｐ、Ｈ６，８／２％ＮａＤｏｄＳＯ，／１０％グリ セロール１５％の２−メルカプトエタノールで溶出した。, an equal amount of 2XTENT (IXTENT- 20mM) Lis-HCu, pH 7,5/10mM EDTA/150mM Na CQ, diluted with 1% Trasylol) and 1% at 4°C. Rabbit gamma globulin (RγG)-Sepha Mixed with Rose 4B. Next, the supernatant was mixed with 50μ of IgE-Sepharose 4B. Mixed for 3 hours at 4°C. The beads were added to 4 mL of TENT-1% Triton X- Wash 4 times with 100% NaDodSO and an additional 4 mQ of TENT-0°05% NaDodSO. Washed once with 4. The bound protein was prepared by boiling for 3 minutes. 2.5mM Tris-HC, p, H6, 8/2% NaDodSO,/10% glyc Elution was performed with 2-mercaptoethanol containing 15% Serol.

（Ｂ）　ＩｇＥ−セファローズ４Ｂを用いた反復性アフィニティ精製によるＩｇ Ｅ−結合蛋白質の分離：細胞溶解質に対して用いられたもの。この方法は、先に 報告された方法（１４，１５）と本質的に同一であり、（２２）の文献に述べら れているように若干変形されたものであり、これらの文献の内容を援用すること により本明細書に合体させる。要約すれば、細胞溶解質（典型的には５Ｘ１０７ 個の細胞）を、（Ａ）で述べたように第１回目のアフィニティにより精製し、か つ結合蛋白質を、それぞれ、２００！１什の０．５Ｎの酢酸／１％のトリトンＸ −１００を用いて３度溶出し、７５μαの２Ｍのトリス−Ｈ（４，ｐＨ８゜８／ １　トリトンＸ−１００で中和し、さらに第２回目のアフィニティによる精製を 行なった。この研究では、第１回目のアフィニティによる精製の終了時に、クロ ラミン−Ｔ法（２５）により、ＩｇＥ−セファローズ４Ｂになお結合ｚｒ している間に、蛋白質を、１ｍＣ１のＮａ　Ｉおよび１０μｇのクロラミン−Ｔ を３０μ地の０．１Ｍリン酸ナトリウム液、ｐＨ７，５に溶解したものを用い、 ４°Ｃで６０秒間かけて放射性元素でラベリングした。このビーズを、さらに４ 　ｍ迂のＴＥＮＴ−１％のトリトンて３度洗浄し、かつ結合蛋白質を上述のよう にして溶出した。(B) IgE-Ig by repeated affinity purification using Sepharose 4B Separation of E-binding proteins: used on cell lysates. This method first It is essentially the same as the reported method (14, 15) and described in the literature (22). The contents of these documents may not be cited. is incorporated herein by. In summary, cell lysate (typically 5X107 cells) were purified by the first affinity as described in (A), and 200!1 portion of 0.5N acetic acid/1% Triton-X, respectively. Elute three times with 75μα of 2M Tris-H (4, pH 8°8/ 1. Neutralize with Triton X-100 and perform a second affinity purification. I did it. In this study, at the end of the first affinity purification, Still bound to IgE-Sepharose 4B by the Lamin-T method (25), zr While preparing the protein, the protein was treated with 1 mCl of NaI and 10 μg of chloramine-T. using a solution of 30μ 0.1M sodium phosphate solution, pH 7.5, Labeling with radioactive elements was performed at 4°C for 60 seconds. Add 4 more beads Wash the TENT-1% Triton three times and remove the bound proteins as described above. It was eluted.

（Ｃ）　ウサギの抗−εＢＰ血清を用いた免疫沈降。！ｇＥーセファローズ、４ Ｂ（２００μＱ．）を用いてＲＢＬ細胞から分離されたｉｎ　ｖｉｔｒｏにおけ る翻訳生成物（２０μ店）または蛋白質に、３μ込の正常なウサギ血清（ＮＲＳ ）を加えた。この混合物を、１時間の間インキュベートし、次に１時間の間ＧＡ ＲＧーセファ０ーズ４Ｂ（５０μｌ）と反応させた。この上澄みを１時間の１μ ｍ３μ込のウサギ抗−εＢＰ血清と反応さ汁、次に１時間の間ＧＡＲＧーセファ ０ーズ４Ｂ（５０μ込）と混合した。このビーズを洗浄し、かつ結合蛋白質を上 述のようにして溶出した。上記のすべての方法は、４°Ｃで行なった。(C) Immunoprecipitation using rabbit anti-εBP serum. ! gE-Sepharose, 4 In vitro isolated from RBL cells using B (200 μQ.) Normal rabbit serum (NRS ) was added. This mixture was incubated for 1 hour, then GA for 1 hour. It was reacted with RG-Sephazer 4B (50 μl). 1μ of this supernatant for 1 hour. React with rabbit anti-εBP serum containing m3μ, then GARG-Sepha for 1 hour. It was mixed with 0's 4B (50μ included). Wash the beads and remove the bound proteins. It was eluted as described above. All methods described above were performed at 4°C.

ＩｇＥ−セファ０ーズ４Ｂに結合されており、ヨウ化されており、かつ上記の方 法（Ｂ）で記載したように溶出された蛋白質を、レンズ豆レシチンーセファロー ズ４Ｂ（薬学級．１０ｍＭＩーリス−ＨＣＱ．、ｐＨ７．４１０．１５ＭＮａＣ ｌ／１　トリトンＸ−１００中に懸濁された１対１の懸／ｆ：Ｊ液１００μＬ” ）と４℃で１時間混合した。IgE-bound to Cepharose 4B, iodinated, and The eluted proteins as described in method (B) were transferred to lentil lecithin-Sepharo 4B (pharmaceutical grade. 10mMI-Lis-HCQ., pH 7.410.15M NaC 1/1 1:1 suspension suspended in Triton X-100/f: 100 μL of J solution” ) and mixed for 1 hour at 4°C.

（Ｅ）　電気泳動、ノーザンプロット交雑およびＤＮＡ配列の分析。蛋白質のＮ ａＤｏｄＳＯ＊／ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を、引用することにより 本明細書に合体されるライエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）装置（２６）をｒ 用いて行なった。　Ｓでラベリングされた正白質を含むゲルヲ、放射能写真エン ハンサ（ＥＮ”　）ＩＡＮＣＥ，二二一ｌ２９　一 つ螢光写真を撮った：　Ｉでラベリングした蛋白質を含むゲルを乾燥し、かつ放 射能写真を撮影した。ノーザン・プロット分析のために、ＲＮＡをグリオキシル 化し、２％のアガロースゲル上で電気泳動し、ニトロセルロースフィルタを通過 させ、かつ本明細書に引用することにより合体されるニックの翻訳法（２７）に より　ＰでラベリングされたｃＤＮＡプローブにより交雑した。このＤＮＡの配 列を、引用することにより本明細書に合体されるジデオキシプライマー拡張法（ ２８）により決定した。(E) Electrophoresis, Northern blot hybridization and DNA sequence analysis. protein N aDodSO*/polyacrylamide gel electrophoresis analysis, by citing The Laemmli apparatus (26) incorporated herein is r It was done using Gel containing normal white matter labeled with S, radioactive photographic engraving Hansa (EN”) IANCE, 221 l29 1 Fluorescence photography was taken: The gel containing the protein labeled with I was dried and released. I took radiation photos. RNA was glyoxylated for Northern blot analysis. electrophoresed on a 2% agarose gel and passed through a nitrocellulose filter. in Nick's Translation Method (27), which is incorporated by reference herein. Hybridization was performed using a cDNA probe labeled with P. This arrangement of DNA Dideoxy Primer Extension Method ( 28).

産業上の応用 利用性については、本明細書の先の部分においてｆｉｌｊＱした。特定的には、 （１）３１にのＩｇＥ−結合蛋白質がＲＢＬ　ｍＲＮＡからｉｎ　ｖｉｔｒｏに おいて翻訳されることができ、かつ同定されたこと：　（２）この蛋白質をコー ドするｃＤＮＡが新規なものであると分かったこと：ならびに（３）この蛋白質 がＩｇＥ−特異性レセプタを有するように公知の成る種の細胞型において特異的 に発現することが示されたことが発見された。予想した配列の特定の部分に対応 する合成ペプチドに対する抗体ならびにｃＤＮＡプローブを用いる研究は、さら に、ＩｇＥ−レセプタの陽性細胞内における説明した遺伝子の特異的な発現、こ れらの細胞内におけるこの蛋白質の局在、ならびにＩｇＥで媒介される好塩基性 細胞およびマスト細胞の活性化においてこの蛋白質が果たす役割を確立すべきで ある。したがつて、この蛋白質は、アレルギー反応を取扱うに際し、ＩｇＥ５． Ｊ製剤あるいはＩｇＥを吸収するのに、すなわち「■ｇＥ吸収体」として用いら れ得る。industrial applications The availability was discussed earlier in this specification. Specifically, (1) The IgE-binding protein of 31 is transferred from RBL mRNA in vitro. (2) A protein encoding this protein has been identified. The cDNA encoding the protein was found to be novel: and (3) this protein. specific in cell types of species known to have IgE-specific receptors. It was discovered that it was shown to be expressed in Corresponds to a specific part of the expected array Further research using antibodies and cDNA probes against synthetic peptides In addition, the specific expression of the described gene in IgE-receptor positive cells, localization of this protein within these cells and IgE-mediated basophilia. The role of this protein in cellular and mast cell activation should be established. be. Therefore, this protein is useful in treating allergic reactions as IgE5. J preparation or used to absorb IgE, that is, as a "gE absorber" It can be done.

本願発明の範囲から離れることなく、当業者にとって自明な変形をなすことがで きる。たとえば、ｃＤＮＡを形成するために用いられる遺伝材料を、ＩｇＥ−特 異性結合レセプタを含む他の人細胞型を導入することにより、あるいはＲＢＬ　 ｍＲＮＡ以外の他の細胞性材料を用いることにより導入してもよい。Modifications that are obvious to those skilled in the art may be made without departing from the scope of the claimed invention. Wear. For example, genetic material used to form cDNA may be IgE-specific. by introducing other human cell types containing isomeric binding receptors or RBL It may also be introduced using other cellular materials other than mRNA.

この発明は、ラットのＩｇＥ−結合蛋白質に関して説明したが、この方法は１． 関連の人の等価な蛋白質あるいはシデロフォン（ｓｉｄｅｒｏｐｈｏｎｅｓ）を 検出するのに有効なｃＤＮＡを生産するのにも等しく応用し得る。Although this invention has been described with respect to rat IgE-binding proteins, the method includes: 1. Related human equivalent proteins or siderophones It is equally applicable to producing cDNA useful for detection.

ＦＩＧＬＪＩＩＥ　ｌ ｂ −９３に −６９に −４６に １３１４１５１６１７　ｍ、ＢＰ　ＮＲ８フラフションアンバー ＦＩＧＵｎＥｌ：　２ 久施−屓扱猪ｔ；翻胡４ル落眸 ｂｃｄｅ ３１に−−−−− ＢＳＡ　、１９Ｇ１１ｃＩＥ城εＢＰ　ＮＲＳ免、ａ畷羞剤 １”ＩＧＵＩ（Ｅ　４ ２．１２− １．５７− ！２１Ｃ；ＵＩＩＥ　５ 手続補装置 昭和６１年１０月２１日FIGLJIIE l b -93 to -69 to -46 to 1314151617 m, BP NR8 Fraction Amber FIGUnEl: 2 Kuse - 屓handling boar t; translation 4 le drop bcde To 31------ BSA, 19G11cIE castle εBP NRS exemption, a anti-inflammatory agent 1” IGUI (E 4 2.12- 1.57- ! 21C; UIIE 5 procedural aids October 21, 1986

Claims (10)

【特許請求の範囲】[Claims] １．翻訳生成物として、選択的にＩｇＥを結合するポリペプチドを有するｃＤＮ Ａ分子を生産する方法であって、分子量約３１，０００ダルトンであり、ＲＢＬ ｍＲＮＡの翻訳生成物から免疫沈降され、かつ正常のウサギの血清によっては沈 澱しないＩｇＥ−結合ポリペプチドをコードする遺伝子材料を分離し、 上記遺伝子材料をベクタ内に導入し、 前記ベクタを受容菌生体に移し、 前記１ｇＥ−結合蛋白質の表現を帯びる宿主細胞を選択しかつクローニングし、 遺伝子を生産し、 得られた蛋白質を回収する各ステップを備える方法。1. cDN having a polypeptide that selectively binds IgE as a translation product A method for producing molecule A, which has a molecular weight of approximately 31,000 Daltons and has an RBL immunoprecipitated from mRNA translation products and precipitated by normal rabbit serum. isolating genetic material encoding a non-stallable IgE-binding polypeptide; Introducing the above genetic material into a vector, transferring the vector to a recipient organism; selecting and cloning a host cell bearing expression of said 1gE-binding protein; produce genes, A method comprising steps of recovering the obtained protein. ２．抗−εＢＰ抗血清と特異的に反応し、かつ１ｇＥ−セファローズ４Ｂと結合 する、請求の範囲第１項記載の方法により生産されるＩｇＥ−結合蛋白質。2. Reacts specifically with anti-εBP antiserum and binds to 1gE-Sepharose 4B An IgE-binding protein produced by the method according to claim 1. ３．少なくとも５個のメチオニン残基を有する分子として、 潜在的なＮ−グリコシル化位置の実質的に存在しない分子として、ならびに ５５，０００ダルトンのＩｇＥ蛋白質から独立に分離され得る分子として特徴づ けられる、請求の範囲第１項記載の方法により生産されるＩｇＥ−結合蛋白質。3. As a molecule with at least 5 methionine residues, as a molecule substantially free of potential N-glycosylation positions, and Characterized as a molecule that can be isolated independently from the 55,000 Dalton IgE protein. 2. An IgE-binding protein produced by the method according to claim 1. ４．約３１，０００ダルトンのＩｇＥ−特異性結合蛋白質の製造方法により特徴 づけられるｃＤＮＡ。4. Characterized by the method for producing an IgE-specific binding protein of approximately 31,000 daltons cDNA that can be attached. ５．翻訳生成物の製法により特徴づけられるｃＤＮＡであって、前記翻訳生成物 は、 約３１，０００ダルトンのＩｇＥ−結合蛋白質であり、少なくとも５個のメチオ ニン残基を有する分子であり、Ｎ−グリコキシル化位置を有しない分子であり、 ならびに ５５，０００ダルトンのＩｇＥ蛋白質から独立に分離され得る分子である、ｃＤ ＮＡ。5. A cDNA characterized by a method for producing a translation product, said translation product teeth, IgE-binding protein of approximately 31,000 Daltons with at least 5 methio A molecule having a nin residue and no N-glycosylation position, as well as cD, a molecule that can be isolated independently from the 55,000 dalton IgE protein N.A. ６．分子量約３１，０００ダルトンのＩｇＥ結合蛋白質の製法により特徴づけら れるｃＤＮＡであり、少なくとも５７０個の塩基対を有する分子であり、抗イプ シロンＢＰ抗血清と特異的に反応する分子であり、かつ ＲＢＬ細胞からｍＲＮＡを特異的に交雑する分子であることを特徴とする、ｃＤ ＮＡ。6. Characterized by a method for producing an IgE binding protein with a molecular weight of approximately 31,000 Daltons. cDNA with at least 570 base pairs; A molecule that specifically reacts with Chiron BP antiserum, and A cD characterized by being a molecule that specifically hybridizes mRNA from RBL cells. N.A. ７．分子量約３１，０００ダルトンのＩｇＥ結合蛋白質の製法により特徴づけら れるｃＤＮＡであって、前記ｃＤＮＡのカルボキシ基末端の半分のアミノ酸配列 が実質的に 【配列があります】 であることを特徴とするｃＤＮＡ。7. The IgE-binding protein with a molecular weight of approximately 31,000 Daltons was characterized by the production method. the amino acid sequence of the carboxy terminal half of the cDNA is substantially [There is an array] A cDNA characterized by: ８．分子量約３１，０００ダルトンのＩｇＥ結合蛋白質の製法により特徴づけら れるｃＤＮＡから翻訳される蛋白質であって、前記蛋白質のカルボキシ基末端の 半分のアミノ酸配列が実質的に、 【配列があります】 であることを特徴とする蛋白質。8. Characterized by a method for producing an IgE binding protein with a molecular weight of approximately 31,000 Daltons. A protein that is translated from a cDNA containing Half of the amino acid sequence is essentially [There is an array] A protein characterized by: ９．分子量約３１，０００ダルトンのＩｇＥ結合蛋白質の製注により特徴づけら れているｃＤＮＡ分子であり、３の翻訳されていない領域内に１２１個の核酸を 有する分子であり、 ポリ（Ａ）付加位置の前に典型的にはＡＡＴＡＡＡ配列の１５〜２１個の塩基を 有する分子であり、トランスメンブレン配列を有しない配列を有する分子であり 、 Ｎで結合される炭水化物接合位置を有しない配列を有する分子であり、かつ 親水性を示す分子であることを特徴とする、ｃＤＮＡ分子。9. Characterized by the preparation of an IgE binding protein with a molecular weight of approximately 31,000 Daltons. It is a cDNA molecule that contains 121 nucleic acids within 3 untranslated regions. A molecule with The poly(A) addition site is typically preceded by 15 to 21 bases of the AATAAA sequence. A molecule with a sequence that does not have a transmembrane sequence. , a molecule having a sequence that does not have an N-linked carbohydrate attachment position, and A cDNA molecule characterized by being a molecule exhibiting hydrophilicity. １０．分子量約３１，０００ダルトンのＩｇＥ結合蛋白質の製法により特徴づけ られ、ＲＢＬ細胞からのＲＮＡ種と特異的に反応することを特徴とする、ｃＤＮ Ａ分子。10. Characterized by the production method of an IgE binding protein with a molecular weight of approximately 31,000 Daltons cDNA characterized by specifically reacting with RNA species from RBL cells. A molecule.
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