JPS6248396A - Production of glutathione - Google Patents
Production of glutathioneInfo
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- JPS6248396A JPS6248396A JP18501785A JP18501785A JPS6248396A JP S6248396 A JPS6248396 A JP S6248396A JP 18501785 A JP18501785 A JP 18501785A JP 18501785 A JP18501785 A JP 18501785A JP S6248396 A JPS6248396 A JP S6248396A
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Abstract
Description
【発明の詳細な説明】
(産業上の利用分野)
本発明はグルタチオンの製造方法、特に糸状性好温性ラ
ン藻を利用した生合成によるグルタチオンの製造方法に
関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION (Industrial Application Field) The present invention relates to a method for producing glutathione, particularly to a method for producing glutathione by biosynthesis using filamentous thermophilic cyanobacteria.
グルタチオンは生体内でタンパク質などの生体分子のス
ルフヒドリル基(SH基)の保護や、正常な酸化還元電
位の維持、またアミノ酸の能動輸送などに関与する生化
学的に重要なトリペプチドである。さらに最近になって
グルタチオンは細胞分裂の制御に関与しているとの知見
も報告され、抗癌性の面からも注目されている。事実、
現在グルタチオンは、臨床的に強い解毒作用を有してい
ることもあって、強肝剤として医薬品にも採用されてい
る。Glutathione is a biochemically important tripeptide that is involved in protecting sulfhydryl groups (SH groups) of biomolecules such as proteins, maintaining normal redox potential, and active transport of amino acids in living organisms. Furthermore, recently it has been reported that glutathione is involved in the control of cell division, and it is also attracting attention from the aspect of anti-cancer properties. fact,
Glutathione is currently used in pharmaceuticals as a liver tonic, partly because it has clinically strong detoxifying effects.
(従来の技術)
このような有用性の高いグルタチオンの生産方法に関し
ては、これまでに化学合成法、生合成法等が工業化され
ているが、その反応工程や経済性の面で多くの欠点を有
している。また酵素法による合成方法も開発されている
が、高価なATPを必要とするため、グルタチオンの製
造にあたってATPの利用効率を如何に高めるか、また
如何に効率良< ATPを再生、再回転利用し得るかが
大きな問題点となっている。(株)化学同人発行、化学
増刊103号(1984年6月20日)第123〜13
6頁に木材光らは、遺伝子操作技術によりグルタチオン
生産能を高めた大腸菌株を開発し、この利用と有用性と
について報告している。彼等の報告によると、最適条件
下の培養によって収穫されるグルタチオンの最高収量は
、培養液1リツトルあたり2%内外であるとされている
。大腸菌の培養は操作上管理は容易であるとは言え、無
菌操作を必要とし、また培地中に栄養源として多種類の
炭水化物、アミノ酸、ビタミン類などの添加が必要であ
り、さらに木材らの実施例ではグルタチオンの生産量を
高めるために、外部からのATPの供給が必要とされて
いる。(Prior art) Chemical synthesis methods, biosynthesis methods, etc. have been industrialized to date to produce highly useful glutathione, but they have many drawbacks in terms of reaction steps and economic efficiency. have. An enzymatic synthesis method has also been developed, but since it requires expensive ATP, the question is how to increase the efficiency of ATP use in the production of glutathione, and how to efficiently regenerate and reuse ATP. The big question is how to get it. Published by Kagaku Dojin Co., Ltd., Kagaku Special Edition No. 103 (June 20, 1984) No. 123-13
On page 6, Mokumitsu et al. have developed an Escherichia coli strain with enhanced glutathione-producing ability through genetic engineering technology, and report on its use and usefulness. According to their report, the maximum yield of glutathione obtained by culturing under optimal conditions is around 2% per liter of culture solution. Although culturing E. coli is easy to manage operationally, it requires aseptic operation, and it is necessary to add various types of carbohydrates, amino acids, vitamins, etc. as nutrients to the culture medium. In this example, an external supply of ATP is required to increase the production of glutathione.
(発明が解決しようとする問題点)
本発明者らは、上述の如き従来の各種グルタチオンの製
造法に付帯する多くの問題点に鑑み鋭意研究の末、特定
の糸状性好温性ラン藻フォルミジウム(Phormid
ium)属菌のグルタチオン生合成能を利用することに
よって、これら既往の問題点を悉く解決することに成功
し、本発明に到達したものである。(Problems to be Solved by the Invention) In view of the many problems associated with the conventional production methods of various glutathione as mentioned above, the present inventors have conducted intensive research and discovered that a specific filamentous thermophilic cyanobacterium Phormidium (Phormid
By utilizing the glutathione biosynthesis ability of bacteria of the genus M.ium, we have succeeded in solving all of these existing problems, and have arrived at the present invention.
即ち、本発明の目的は、生合成法により、高価な外部エ
ネルギーの添加を要することなく、また煩瑣な滅菌操作
や厳重な無菌管理を必要とせず、容易・安価に且つ高収
率を以てグルタチオンを取得するにある。That is, the object of the present invention is to produce glutathione easily, inexpensively, and with high yield using a biosynthetic method without requiring the addition of expensive external energy, complicated sterilization operations, or strict sterile control. There is a way to get it.
(問題点を解決するための手段)
上述の目的は、糸状性好温性ラン藻フォルミジウム属菌
を、原料基質であるし一グルタミン酸、L−システィン
およびグリシンを添加した培養液中で培養し、生合成・
蓄積したグルタチオンを採取することを特徴とするグル
タチオンの製造方法によって達成される。(Means for Solving the Problems) The above object is to cultivate a filamentous thermophilic cyanobacterium Phormidium in a culture solution to which monoglutamic acid, L-cysteine and glycine are added as raw material substrates, Biosynthesis/
This is achieved by a method for producing glutathione, which is characterized by collecting accumulated glutathione.
更に具体的には、本発明は糸状性好温性ラン藻フォルミ
ジウム属菌の生細胞を生物材料として用い・フイツツジ
エラルド(Fitzgerald)改変培地等の各種人
工培地または天然の温泉水培養液あるいはリン酸緩衝液
等を基本培地とし、明条件または暗条件、好ましくは明
条件下で、L−グルタミン酸、L−システィンおよびグ
リシンを供給して、好ましくはホウ酸塩の存在下にグル
タチオンを生合成させ、培養液および細胞内にグルタチ
オンを生産蓄積させこれを採取するグルタチオンの製造
方法である。More specifically, the present invention uses living cells of a filamentous thermophilic cyanobacterium of the genus Phormidium as a biological material, various artificial media such as Fitzgerald's modified medium, natural hot spring water culture solution, or Glutathione is biosynthesized using a phosphate buffer or the like as a basic medium, supplying L-glutamic acid, L-cysteine, and glycine under light or dark conditions, preferably light conditions, preferably in the presence of borate. This is a method for producing glutathione, in which glutathione is produced and accumulated in the culture medium and cells, and then collected.
一般にラン藻類は大腸菌と同じく原核性生物であるが、
光合成能を有しており、外部エネルギーとしては光エネ
ルギーのみで生育・増殖することができる。即ち好気・
明条件下、炭酸ガスを固定して増殖してゆくので、生育
のための必要因子としては、光エネルギー、炭酸ガス、
水および無機塩類で十分である。Generally, cyanobacteria are prokaryotic organisms like E. coli, but
It has photosynthetic ability and can grow and multiply using only light energy as external energy. That is, aerobic
Under light conditions, it grows by fixing carbon dioxide gas, so the necessary factors for growth are light energy, carbon dioxide gas,
Water and inorganic salts are sufficient.
本発明者らは、かかるラン藻類について種々研究を重ね
た結果、松江温泉泉源地帯より採取し単離した糸状性好
温性ラン藻フォルミジウム属菌が、好気・明および暗条
件下、光合成的に能率よくグルタチオンを生産・蓄積す
る性能を具えていることを確認し、それをフォルミジウ
ムーPM(以下、本菌と略称する)と命名した。As a result of various studies on such cyanobacteria, the present inventors have found that filamentous thermophilic cyanobacteria Phormidium spp., collected and isolated from the Matsue Onsen hot spring source area, are photosynthetic under aerobic light and dark conditions. It was confirmed that Phormidium PM has the ability to efficiently produce and accumulate glutathione, and it was named Phormidium-PM (hereinafter abbreviated as this bacterium).
本閑の工業技術院微生物工業技術研究所への菌寄託番号
は微工研菌寄第8332号(昭和60年7月6日寄託)
であり、次のような菌学的諸性質を有している。The bacterial deposit number at Honkan's Institute of Microbial Technology, Agency of Industrial Science and Technology is Microtechnology Research Institute No. 8332 (deposited on July 6, 1985)
It has the following mycological properties.
■、各培地における成育状態
1、液体培養
(1)温泉水強化培地
温度47℃;空気通気量、培養液1リツトル・1分間あ
たり1.5リットル;光強度、2.000ルクスの培養
条件下、10〜14日で定常状態となる。本培地はこれ
までに用いた培地中で最も良好な成育を示すものである
。ラン原塊は皮膜状またはマント状を呈し、基物に付着
し、または水中に浮遊するが、適当な攪拌を行なうこと
により、はぼ均一に培養することができる。■ Growth status in each medium 1. Liquid culture (1) Hot spring water enriched medium Temperature: 47°C; Air aeration rate: 1 liter of culture solution/1.5 liters per minute; Light intensity: Culture conditions of 2.000 lux , a steady state is reached in 10 to 14 days. This medium shows the best growth among the media used so far. The orchid mass has a film-like or mantle-like shape, and is attached to a substrate or floats in water, but it can be cultured more or less uniformly by proper stirring.
(2)フイッッジエラルド改変培地 温泉水強化培地と同程度に生育良好である。(2) Figgeerard modified medium The growth rate is as good as the hot spring water enriched medium.
その他ダイヤ(Dyer)とガフオード(Gaffor
d)の改良培地、BG−11培地でも生育可能であるが
、上記(1)、(2)の場合に比べると生長状況は若干
劣る。Other diamonds (Dyer) and gaffor (Gaffor)
Although it is possible to grow on the improved medium d) and the BG-11 medium, the growth situation is slightly inferior compared to cases (1) and (2) above.
2、寒天平面培養
(1)温泉水強化培地
ラン藻生細胞(種菌)をシャーレ内の寒天平面に塗布後
、4〜5日で肉眼的に生育を確認することができる。更
に10〜14日後には良好な生育を示す。なおこの際の
光強度は1. (1)と同様2.000ルクスである。2. Agar flat culture (1) Hot spring water enriched medium After applying living cyanobacterial cells (inoculum) to an agar flat surface in a petri dish, growth can be visually confirmed in 4 to 5 days. Further, good growth is shown after 10 to 14 days. The light intensity at this time is 1. Same as (1), it is 2,000 lux.
■各種生理的、生態的性質
1、最適生育条件
最適成育pH7,8〜8.8
最適温度 45〜50℃
最適光強度 2.000〜3.000ルクス最適C
D□濃度 5%程度
2、生育可能な条件
pH5〜10
温度 10〜55℃
光強度 500〜30.000ルクス3、顕著
な特徴
炭酸ガス(CD□)以外は炭素源とならない。■Various physiological and ecological properties 1, optimal growth conditions Optimum growth pH 7.8-8.8 Optimum temperature 45-50℃ Optimum light intensity 2.000-3.000 lux Optimum C
D□ concentration: about 5%2, conditions for growth: pH 5-10, temperature: 10-55°C, light intensity: 500-30,000 lux3, notable characteristics: Only carbon dioxide gas (CD□) is used as a carbon source.
チッ素源としてNO3態、N02態およびNH4態のい
ずれも利用可能ではあるが、NO+ =が生育に対して
は最も良好な成績を与える。Although any of the NO3, N02 and NH4 nitrogen sources can be used as a nitrogen source, NO+ gives the best results for growth.
生細胞の状態で2.6.ジクロロフェノールインドフェ
ノールあるいはメチルビオロゲン等の酸化還元色素の光
還元が可能である。2.6 in the state of living cells. Photoreduction of redox dyes such as dichlorophenol indophenol or methyl viologen is possible.
クロロフィルとしてはクロロフィルaのみを有し、クロ
ロフィルbは含まれていない。As for chlorophyll, it has only chlorophyll a and does not contain chlorophyll b.
■、形態的性質
温泉水強化培地により生育したラン藻生細胞について、
普通検鏡標本により観察を行なつたところ、藻体はトリ
コームと称する糸状体からなり、分岐せず、外生胞子も
内生胞子も作らず、ヘテロシストも存在しない。トリコ
ームは真直か、または僅かに屈曲し、幅1.5μm程度
であり、細胞と細胞との連結部にもくびれの状態は見ら
れない。細胞の長さは3〜6μmと生育段階によって異
なり、糸状性細胞群の尖端は細くなることはなく、一般
に円い。細胞内容は均質で顆粒はほとんどみられない。■, Morphological properties Regarding living cyanobacterial cells grown in hot spring water enriched medium,
Observation using ordinary microscopic specimens revealed that the algal bodies consist of filamentous bodies called trichomes, do not branch, do not produce exospores or endospores, and do not have heterocysts. The trichomes are straight or slightly bent, with a width of about 1.5 μm, and no constrictions are observed at the junctions between cells. The length of the cells varies from 3 to 6 μm depending on the growth stage, and the tips of filamentous cell groups do not become thin and are generally round. The cell content is homogeneous with few granules.
上記諸性質から本菌はフォルミジウム ラピデウム(P
hormidium lapideum) に属する
と考えられる。Based on the above properties, this bacterium is Phormidium rapideum (P
hormidium lapideum).
■培地組成 いずれもpH8,0に調整して用いる。■Medium composition Both are used after being adjusted to pH 8.0.
1、温泉水強化培地
KNO31g
K2HPO40,02g
Mg5L ・7H200,25g
Fe50. o、 005g温泉水
1 リットル
2.フイッツジェラルド改変培地 1す、ノトルあたり
、
KNO31g
K21(Pct4Q、 03g
!、I g S 04 ・7H200,25gcac
+2・2L0 0.036gNaHCO30,8
40g
Na2S+03・9H200゜058gクエン酸鉄
0.006g
クエン酸 0.006g
εDTA 0.001gA3溶液
1,0m1
3、ダイヤ−とガフオードの改良培地
(好温性ラン藻用無機培地)
MgSL 0.15g
KH,Po、0.25g
K2+1PO40,25g
NaN03o、 5g
KNO30,5g
CaCL 0.06g83B
O30,034g
εDT八 ・ Na
0.03g(NH4) 6Mo7024 ・旧1
20 0.022gFeC1:+ ・6H2
0θ、016g1,1nc12・41−120
0.004gCu5O< ・5820
0.0019g2nSO4・7820
0.00066gCo(NO3)2・6H201,5
xlO−5g蒸溜水 1リツトル
4、8G−11
NaNO+ 1.5gK2HP0
. 0.04g!J g S O4・
7H200,075gCaCL ・’2H2Q
O,(136gクエン酸 0.
006gクエン酸鉄アンモニウム 0.006gEDT
A −Mg 0.001gNa2C0
3o、 02g
A、溶液 1mβ
蒸溜水 1 リットル本菌は、47〜
50℃附近の温度に適応しており、このため本菌をこの
温度で培養する際には、大腸菌のときのように厳重な滅
菌操作・無菌的管理を必要としないし、またATPを光
リン酸化反応にて自己生産し、自己再生し得る。1. Hot spring water enriched medium KNO31g K2HPO40.02g Mg5L ・7H200.25g Fe50. o, 005g hot spring water
1 liter2. Fitzgerald's modified medium 1 cup per knot, KNO31g K21 (Pct4Q, 03g!, IgS04 7H200, 25gcac
+2・2L0 0.036gNaHCO30,8
40g Na2S+03.9H200゜058g iron citrate
0.006g Citric acid 0.006g εDTA 0.001g A3 solution
1,0m1 3, Dia and Gafoud improved medium (inorganic medium for thermophilic cyanobacteria) MgSL 0.15g KH, Po, 0.25g K2+1PO40,25g NaN03o, 5g KNO30,5g CaCL 0.06g83B
O30,034g εDT8・Na
0.03g (NH4) 6Mo7024 ・Old 1
20 0.022gFeC1:+ ・6H2
0θ, 016g1,1nc12・41-120
0.004gCu5O<・5820
0.0019g2nSO4・7820
0.00066gCo(NO3)2.6H201,5
xlO-5g Distilled water 1 liter 4,8G-11 NaNO+ 1.5gK2HP0
.. 0.04g! J g S O4・
7H200,075gCaCL ・'2H2Q
O, (136g citric acid 0.
006g Iron ammonium citrate 0.006g EDT
A -Mg 0.001gNa2C0
3o, 02g A, solution 1mβ distilled water 1 liter This bacteria is 47~
It is adapted to temperatures around 50°C, and therefore, when culturing this bacterium at this temperature, strict sterilization and aseptic control are not required as with E. coli, and ATP is not photophosphorized. It can self-produce and regenerate through oxidation reactions.
本発明方法においては、本閑の生細胞を前記フイツツジ
エラルド等の人工培養液、松江温泉水等の天然培養液の
強化培地、またはリン酸緩衝液などの緩衝液中に菌体濃
度約200〜500mg/mlになるように懸濁し、好
ましくはpH7,0〜8.0附近で好気培養する。In the method of the present invention, living cells of the present invention are placed in an enriched medium such as an artificial culture medium such as the above-mentioned Fitzgierard, a natural culture medium such as Matsue hot spring water, or a buffer solution such as a phosphate buffer at a bacterial cell concentration of approximately Suspend to a concentration of 200 to 500 mg/ml and culture aerobically, preferably around pH 7.0 to 8.0.
グルタチオンの生合成・蓄積を促進するためには、約1
5+nM乃至約Loom!、l 、好適には約30mM
J度程度のホウ酸塩を培養液に添加することが好ましい
。To promote the biosynthesis and accumulation of glutathione, approximately 1
5+nM to about Loom! , l, preferably about 30mM
It is preferable to add about J degree of borate to the culture solution.
ホウ酸塩は、培養液にホウ酸を加えることにより、培養
液が含有する塩基性物質あるいはpH,JI整のために
添加される塩基によって、液中において形成することが
できる。ホウ酸塩の例としては、ホウ酸ナトリウム(四
ホウ酸ナトリウム)、ホウ酸カリウム(四ホウ酸カリウ
ム)、ホウ酸アンモニウム等が挙げられる。A boric acid salt can be formed in a culture solution by adding boric acid to the culture solution, using a basic substance contained in the culture solution, or a base added to adjust pH and JI. Examples of borates include sodium borate (sodium tetraborate), potassium borate (potassium tetraborate), ammonium borate, and the like.
上記培養液には、グルタチオンの構成アミノ酸単位であ
るし一グルタミン酸、L−ンスティンおよびグリシンを
原料基質として添加する。適当な添加量はそれぞれ5〜
20mM濃度相当量である。To the above culture solution, monoglutamic acid, L-instine, and glycine, which are amino acid units constituting glutathione, are added as raw material substrates. The appropriate amount to add is 5~
The amount corresponds to a concentration of 20mM.
このように調製した培養液中に懸濁した菌体は、暗条件
下でも可成りの量のグルタチオンを産生ずるが、明条件
下において生合成能が著増する。従って、本発明方法に
おいては、菌体培養中に培養液を可視光源、例えば昼光
色蛍光燈、植物栽培用蛍光燈、タングステン白熱電球あ
るいは太陽光などの断続的または連続的光照射に曝すこ
とが最も好ましい。照射する可視光源の光強度は1,0
00〜10、000ルクス程度、好ましくは2.000
〜3.000 ルクスの範囲が良い。また、良好な結果
を得るためには光照射中の培養液の温度を常温乃至約5
5 ℃の中高温の範囲に保持することが肝要である。Although the bacterial cells suspended in the culture medium thus prepared produce a considerable amount of glutathione even under dark conditions, their biosynthetic ability increases markedly under light conditions. Therefore, in the method of the present invention, it is best to expose the culture solution to intermittent or continuous light irradiation during cell culture, such as a visible light source, such as a daylight fluorescent light, a fluorescent light for plant cultivation, a tungsten incandescent light bulb, or sunlight. preferable. The light intensity of the irradiating visible light source is 1.0
About 00 to 10,000 lux, preferably 2,000
A range of ~3,000 lux is good. In addition, in order to obtain good results, the temperature of the culture solution during light irradiation should be kept at room temperature to about 5
It is important to maintain the temperature within a medium to high temperature range of 5°C.
上記の如き明条件下に好気培養例えば振盪、通気、攪拌
培養などを施すと、菌体はグルタチオンを活発に生成し
、菌体細胞内および培養液中に蓄積する。When aerobic culture, such as shaking, aeration, stirring culture, etc., is carried out under the above-mentioned light conditions, the bacterial cells actively produce glutathione and accumulate it within the bacterial cells and in the culture solution.
本発明方法にあっては、水閘はATPの自己生産能力を
有するために、特に外部エネルギーとしてATPを供給
する必要はないが、ATPを約2m)4程度添加するこ
とによりグルタチオンの収量、特に暗条件下における収
量を向上することができる。In the method of the present invention, there is no need to supply ATP as external energy because water locks have the ability to self-produce ATP, but by adding about 2 m) of ATP, the yield of glutathione, especially in the dark, can be improved. The yield under the conditions can be improved.
かくして得られるグルタチオンの全合成量の70%は、
培養液中に分泌蓄積されているので、用いた生細胞を穏
かに分別することによって容易にグルタチオンを収穫す
ることができる。また細胞内に蓄積されたグルタチオン
は、菌体より熱水抽出することによって簡単に効率良く
収穫することができる。また、熱水抽出を施さないとき
には、この生細胞を再び反応槽に戻し、上記同様の条件
で再びグルタチオンの生産に用いることができる。70% of the total amount of glutathione synthesized in this way is
Since glutathione is secreted and accumulated in the culture solution, glutathione can be easily harvested by gently fractionating the living cells used. Furthermore, glutathione accumulated in cells can be easily and efficiently harvested by hot water extraction from bacterial cells. Furthermore, when hot water extraction is not performed, the living cells can be returned to the reaction tank and used again to produce glutathione under the same conditions as above.
(作 用)
本発明方法の実施にあたっては、前述の如く、水閘生細
胞の適量を上記培養液に懸濁し、ホウ酸、苛性アルカリ
、アンモニア水などを用いて好適なpH範囲に調整した
上、所定量の原料基質、即ちL−グルタミン酸、L−シ
スティンおよびグリシンを添加する。この液に前述の如
き可視光源より適度な強度の光照射を連続的または断続
的に与えつつ振盪培養または曝気・攪拌等を伴うタンク
培産法等により好気培養を施す。培養中は前記適温に保
持し、またpHを適正値に維持するよう定期的に3周整
する。(Function) In carrying out the method of the present invention, as described above, an appropriate amount of hydrophilic cells is suspended in the above culture solution, the pH is adjusted to a suitable range using boric acid, caustic alkali, aqueous ammonia, etc., and Add predetermined amounts of raw substrates, namely L-glutamic acid, L-cystine and glycine. This liquid is subjected to aerobic culture by shaking culture or a tank culture method involving aeration, stirring, etc. while continuously or intermittently irradiating the solution with moderate intensity light from a visible light source as described above. During cultivation, the temperature is maintained at the appropriate temperature, and the pH is periodically adjusted three times to maintain the pH at an appropriate value.
上記操作中に、本菌はその光合成能により培養液中の無
機塩類を栄養源とし光エネルギーで炭酸ガスを固定して
生育・増殖してゆくと共に、培養液中のリン酸根が関与
した光リン酸化反応などによって自己生産しまた自己再
生したATPを利用しながら、原料基質であるアミノ酸
類の生合成を行ない、細胞内にグルタチオンを生成蓄積
し、同時に培養液中にもそれを分泌蓄積してゆくのであ
る。During the above operation, this bacterium uses the inorganic salts in the culture solution as a nutrient source and uses light energy to fix carbon dioxide gas, using its photosynthetic ability to grow and multiply. Utilizing self-produced and self-regenerated ATP through oxidation reactions, it biosynthesizes amino acids as raw material substrates, produces and accumulates glutathione within cells, and at the same time secretes and accumulates it in the culture medium. I am going.
上記の生合成反応は、暗条件下におでも成程度行なわれ
るが、暗条件下のグルタチオン収量は、例えば、2.5
00ルクス照射下の明条件下の時の収量の45〜55%
に過ぎず、従って上記光照射の反応機作に与える作用が
如何に大きいかが首肯されよう。The above biosynthetic reaction can be carried out to some extent under dark conditions, but the yield of glutathione under dark conditions is, for example, 2.5
45-55% of the yield under light conditions under 00 lux irradiation
Therefore, it can be seen that the effect of the above-mentioned light irradiation on the reaction mechanism is large.
また、ホウ酸塩は無添加であっても上記グルタチオンの
生成反応は進行するが、ホウ酸塩は強力な反応促進作用
を有し、例えば、30mM程度のホウ酸の添加によって
グルタチオン収量は無添加の場合の170〜180%に
まで上昇することが確認されている。In addition, although the above-mentioned glutathione production reaction proceeds even without the addition of borate, borate has a strong reaction promoting effect, and for example, the addition of about 30mM boric acid reduces the glutathione yield without the addition of boric acid. It has been confirmed that this increases to 170-180% of that in the case of
更に、既述の通り、水閘はATPの自己生産能および自
己再生能を有するた必、従来法と異なり特にATPの添
加を必要としないが、それを添加すれば収量増大に寄与
することも判明している。例えば、2 m !、1のA
TPの添加により、2.500ルクスの光照射下ではグ
ルタチオン収量が無添加の場合の107〜108%に上
昇し、一方、暗条件下では約155%程度に上昇するこ
とが経験された。Furthermore, as mentioned above, since water locks have the ability to self-produce and self-regenerate ATP, unlike conventional methods, addition of ATP is not particularly required, but it has been found that adding it contributes to increased yield. are doing. For example, 2 m! , 1 A
It was experienced that the addition of TP increased the glutathione yield to 107-108% of that without the addition under 2.500 lux light irradiation, while it increased to about 155% under dark conditions.
このようにしてラン環である水閘を生物材料として光合
成的に高収率でグルタチオンを製造することができるの
であるが、グルタチオン生産量としては、通常、培養時
間約20時間で、ラン藻湿重量1グラムあたり約3ミリ
グラムである。この際の基質転換率は10%を越えてお
り、またラン藻乾物重量あたりで約6%となり、これは
従来用いられている酵母法における収率の約3倍・にも
達するものである。In this way, glutathione can be produced photosynthetically at a high yield using the orchid ring, or water lock, as a biological material. Approximately 3 milligrams per gram. The substrate conversion rate in this case exceeded 10%, and was about 6% based on the dry weight of cyanobacteria, which is about three times the yield in the conventional yeast method.
(実施例) 本発明を更に以下の実施例について述べる。(Example) The invention will be further described with reference to the following examples.
実施例1
本菌の生細胞、約300mgをリン酸緩衝液(最終濃度
50mM、 pH7,5,10m1) に懸濁し、コ
コニL −グルタミン酸10mM5L−システィン5m
N(、グリシン10mM、ホウ酸塩30mM (いずれ
も最終濃度)を加えて、振盪培養装置〔大洋科学工業(
株)製、商品名、タイヨーモノシンII’ 〕のし型試
験管中、48℃、2.500ルクス(ナショナノベホモ
ルクス螢光燈)にて穏かに振盪しながら24時間培養し
た。Example 1 Approximately 300 mg of living cells of this bacterium were suspended in phosphate buffer (final concentration 50 mM, pH 7, 5, 10 ml), and 10 mM Coconi L-glutamic acid 5 L-cysteine 5 m
Add N (10mM glycine, 30mM borate (all final concentrations), and use a shaking culture apparatus [Taiyo Kagaku Kogyo Co., Ltd.].
Co., Ltd., trade name, Taiyomonocin II'] was cultured for 24 hours at 48° C. and 2.500 lux (National Nano Behomolux Fluorescent Light) with gentle shaking.
培養終了後、藻菌体を遠心分離し、その上澄液について
定量したところ、藻菌体1グラム(湿重量)あたり2.
5ミIJグラムのグルタチオンの生産蓄積が認められた
。また用いた藻菌体に熱水抽出処理を行なったところ、
更にグルタチオン1ミリグラムが得られた。After the cultivation was completed, the algal cells were centrifuged and the supernatant liquid was quantified, and it was found that 2.0% of the algal cells per gram (wet weight) of the algal cells.
Accumulated production of glutathione of 5 μIJ grams was observed. In addition, when the algal cells used were subjected to hot water extraction treatment,
An additional 1 milligram of glutathione was obtained.
実施例2
上記実施例1と同様の水閘を、松江温泉水培地に懸濁し
た。この温泉水培地は松江温泉源より得た天然泉水1リ
ツトルあたりに、第一リン酸カリ0.02グラム、硝酸
カリ1グラム、硫酸マグネシウム0.25グラムおよび
硫酸第一鉄0.005グラムを添加しpH8,0に調整
したものである。実施例1と同様にホウ酸塩、L−グル
タミン酸、L−システィン、グリシンを添加して、クイ
ヨーモノジン[A。Example 2 The same water lock as in Example 1 above was suspended in a Matsue hot spring water medium. This hot spring water medium contains 0.02 g of potassium monophosphate, 1 g of potassium nitrate, 0.25 g of magnesium sulfate, and 0.005 g of ferrous sulfate per liter of natural spring water obtained from the Matsue hot spring source. The pH was adjusted to 8.0. In the same manner as in Example 1, borate, L-glutamic acid, L-cystine, and glycine were added to prepare Quiyomonodine [A.
L型試験管中、48℃にて10.000ルクス(タング
ステン白熱電球)で光照射した。反応過程ではときどき
pHが8付近に留まるように調整した。12時間後、反
応上澄液を遠心分離して得、調べたところ藻菌体1グラ
ム(湿重量)あたり2ミリグラムのグルタチオンが得ら
れた。また、藻菌体を熱水抽出すると1ミリグラムのグ
ルタチオンが得られた。Light was irradiated at 48° C. with 10.000 lux (tungsten incandescent bulb) in an L-shaped test tube. During the reaction process, the pH was adjusted at times to remain around 8. After 12 hours, the reaction supernatant was obtained by centrifugation, and when examined, it was found that 2 milligrams of glutathione was obtained per gram (wet weight) of algal cells. Furthermore, when the algal cells were extracted with hot water, 1 milligram of glutathione was obtained.
しかしこのとき藻菌体を熱水処理せずに、再び最初と同
様のアミノ酸、ホウ酸を含む培地に戻して2、500ル
クスの光照射下、グルタチオンの生産反応を進めると、
再反応8時間口で再び反応液中より2ミリグラム(湿重
量1グラムのラン藻菌体あたり)のグルタチオンが収穫
された。However, at this time, without treating the algal cells with hot water, they were returned to the same medium containing amino acids and boric acid as in the beginning and the glutathione production reaction proceeded under light irradiation of 2,500 lux.
After 8 hours of re-reaction, 2 milligrams (per wet weight of 1 gram of blue-green algae cells) of glutathione was harvested from the reaction solution.
(発明の効果)
本発明方法の出現により、生化学的に重要なトリペプチ
ドであり、また医薬品として有用で特に抗癌性の面から
も注目を浴びているグルタチオンを工業的に極めて容易
且つ経済的に頗る有利に製造することができるようにな
った。(Effects of the Invention) With the advent of the method of the present invention, glutathione, which is a biochemically important tripeptide and is useful as a pharmaceutical and is attracting attention especially from the viewpoint of anticancer properties, can be produced industrially with great ease and cost. It has become possible to manufacture it with great advantage.
即ち、本発明方法に適用される水閘は、安価な光エネル
ギー、炭酸ガス、水および無機塩類のみを生育必要因子
として固有の光合成能により生育・増殖すると共に自己
生産し自己再生したATPを利用しつつ原料基質アミノ
酸を効率よく生合成し、蓄積してゆくから、従来の酵素
法や遺伝子操作による変性大腸菌利用等の生化学的方法
において大きい難点とされていた各種栄養源など外部エ
ネルギーの培地への添加が不要であり、特に高価なAT
Pの添加を要せずして著しい高収率を以てグルタチオン
の効率的生産を可能としたことは、本発明方法が特別な
滅菌操作や無菌管理の煩わしさから解放された安易な工
程を提供し得ることと相俟って、生産性の向上、即ち生
産コストの低減に大きく寄与するものである。That is, the water lock applied to the method of the present invention grows and multiplies by its inherent photosynthetic ability using only inexpensive light energy, carbon dioxide gas, water, and inorganic salts as necessary growth factors, and uses self-produced and self-regenerated ATP. Since it efficiently biosynthesizes and accumulates raw material substrate amino acids, it can be used as a medium for external energy such as various nutrient sources, which has been a major drawback in conventional enzymatic methods and biochemical methods such as the use of modified Escherichia coli through genetic manipulation. does not require the addition of AT, which is particularly expensive.
The fact that the method of the present invention enables efficient production of glutathione at a significantly high yield without requiring the addition of P is that the method of the present invention provides an easy process free from the trouble of special sterilization operations and aseptic control. Together with this, it greatly contributes to improving productivity, that is, reducing production costs.
Claims (1)
質としてL−グルタミン酸、L−システィンおよびグリ
シンを添加した培養液中で培養し、生合成・蓄積したグ
ルタチオンを採取することを特徴とするグルタチオンの
製造方法。 2、前記培養を可視光源の照射下で行なう特許請求の範
囲第1項記載のグルタチオンの製造方法。 3、前記可視光源の光強度が1,000〜10,000
ルクスである特許請求の範囲第2項記載のグルタチオン
の製造方法。 4、前記培養液がフイッツジェラルド人工培地である特
許請求の範囲第1項乃至第3項の何れかに記載のグルタ
チオンの製造方法。 5、前記培養液が松江温泉水強化天然培地である特許請
求の範囲第1項乃至第3項の何れかに記載のグルタチオ
ンの製造方法。 6、前記培養液がリン酸緩衝液である特許請求の範囲第
1項乃至第3項の何れかに記載のグルタチオンの製造方
法。 7、前記原料基質がそれぞれ5〜20mM添加される前
記特許請求の範囲各項の何れかに記載のグルタチオンの
製造方法。 8、前記培養をpH7.0〜8.0、および常温乃至5
5℃の温度で行なう前記特許請求の範囲各項の何れかに
記載のグルタチオンの製造方法。 9、前記培養液がホウ酸塩を含有する前記特許請求の範
囲各項の何れかに記載のグルタチオンの製造方法。 10、ホウ酸塩が約15mM乃至約100mM含有され
る特許請求の範囲第9項記載のグルタチオンの製造方法
。 11、前記培養液にATPを添加する前記特許請求の範
囲各項の何れかに記載のグルタチオンの製造方法。 12、培養液中に蓄積されたグルタチオンを生細胞の分
別によって採取し、且つ菌体細胞内に蓄積されたグルタ
チオンを熱水抽出により採取する前記特許請求の範囲各
項の何れかに記載のグルタチオンの製造方法。[Claims] 1. A filamentous thermophilic cyanobacteria of the genus Phormidium is cultivated in a culture medium to which L-glutamic acid, L-cysteine and glycine are added as raw material substrates, and biosynthesized and accumulated glutathione is collected. A method for producing glutathione, characterized by: 2. The method for producing glutathione according to claim 1, wherein the culturing is performed under irradiation with a visible light source. 3. The light intensity of the visible light source is 1,000 to 10,000.
The method for producing glutathione according to claim 2, which is lux. 4. The method for producing glutathione according to any one of claims 1 to 3, wherein the culture solution is a Fitzgerald artificial medium. 5. The method for producing glutathione according to any one of claims 1 to 3, wherein the culture solution is a natural medium enriched with Matsue hot spring water. 6. The method for producing glutathione according to any one of claims 1 to 3, wherein the culture solution is a phosphate buffer. 7. The method for producing glutathione according to any one of the claims, wherein each of the raw material substrates is added in an amount of 5 to 20 mM. 8. The above culture is maintained at pH 7.0 to 8.0 and at room temperature to 5.
A method for producing glutathione according to any one of the preceding claims, which is carried out at a temperature of 5°C. 9. The method for producing glutathione according to any one of the claims, wherein the culture solution contains borate. 10. The method for producing glutathione according to claim 9, wherein borate is contained in a range of about 15mM to about 100mM. 11. The method for producing glutathione according to any one of the claims, wherein ATP is added to the culture solution. 12. Glutathione according to any of the preceding claims, wherein glutathione accumulated in the culture solution is collected by fractionation of living cells, and glutathione accumulated in bacterial cells is collected by hot water extraction. manufacturing method.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP18501785A JPS6248396A (en) | 1985-08-24 | 1985-08-24 | Production of glutathione |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
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JPS6248396A true JPS6248396A (en) | 1987-03-03 |
JPS6253159B2 JPS6253159B2 (en) | 1987-11-09 |
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ID=16163312
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JP18501785A Granted JPS6248396A (en) | 1985-08-24 | 1985-08-24 | Production of glutathione |
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JP (1) | JPS6248396A (en) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2010526792A (en) * | 2007-05-10 | 2010-08-05 | ロレアル | Methods for preparing active ingredients in hot spring water and compositions containing them |
-
1985
- 1985-08-24 JP JP18501785A patent/JPS6248396A/en active Granted
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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JP2010526792A (en) * | 2007-05-10 | 2010-08-05 | ロレアル | Methods for preparing active ingredients in hot spring water and compositions containing them |
US11371010B2 (en) | 2007-05-10 | 2022-06-28 | L'oréal | Process for the preparation of active principles on thermal water and compositions comprising them |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS6253159B2 (en) | 1987-11-09 |
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