JPS62293148A - 検査試料からｄｎａを抽出する方法および装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発明の詳細な説明 発明の背景 発明の分野 本発明は検査試料、特にヒト全血から高分子量のＤＮＡ
　ｋ抽出する分野に関する。

発明の概要 本発明は、検査試料、特にヒト全血試料から比較的分子
量の大きいＤＮＡを抽出する方法および装置である。抽
出されたＤＮＡは使用できる量および濃度であシ、更に
精製を必要とせずに多数の酵素による従来の制限を許す
ほどの純度のものである。

この装置は電界において２枚の８マイクロメータのポリ
カーボネートフィルタの間に支えられた一般に厚さ５　
ｍｍ　＋直径３１ｍｍのアガロースゲルディスクを本来
含む。更に、この方法は適当に処理した血液試料をアガ
ロースゲルディスクの表面上にのせ電界を印加すること
を含む。処理された血液の構成要素部分のうちでＤＮＡ
分子は分子量からみて最大である。この結果、電界の力
をうけてＤＮＡ分子がアガロースゲルディスクを通過す
るのを妨げられる、処理された血液のその他のすべての
構成要素部分は速やかにディスクを通過し除去される。

次にＤＮＡが集められ、いつでも分析できるように適当
に貯蔵される。

背景情報 医学的診断の分野のなかで、診断検査用材料としてＤＮ
Ａ　’）用いる新らしい方法論が発達しつつある。

この種類の診断検査が商業的に競争力をもつためには、
ＤＮＡに基づいた検査の全体的費用が最小のものとなら
なければならない。費用を安くする１つの方法は、試料
からのＤＮＡの抽出とＤＮＡの検査を分析の両方ｔ−ｉ
む種々の手頚によって消費される労働のべ時間数を、特
にある程度の自動化を組込れることによってこれらの手
順の効率を高めることによって減少させることである。

勿論種々の検査手順が開発されてきていることは認めら
れる。しかし、技術上記述されているこれらの検査手順
のうちの一部は、適当な量でＤＮＡを得る能力に基づい
ている。例えば、ハメリン（Ｈａｍｅｌｉｎ　）に発行
された米国特許第４，３９１．６８８号を参照すると、
多数のアガロース平板ゲル用の電気泳動システムが開示
されている。このシステムはＤＮＡのような分子量の混
った分子の混合物の溶液を水平の平板ゲルに作られたく
ぼみ（ｙｅｌｌｓ　）に加え、その後そのゲルを電気泳
動によって処理して限局されたバンドを生じさせ、各バ
ンドは特定の分子量の特性を示す。

米国特許第４，３９１．６８８号に記述されている方法
又はシステムは、容易に利用できる十分な量および濃度
のＤＮＡ　ｔ−有することに依存している。しかし、診
断検査にＤＮＡを使用することが著しく困難なのは、正
に濃縮したＤＮＡが容易に利用できないことによる。こ
れは最も時間のかかるステップの１つがＤＮＡ　ｉその
ＤＮＡ源から抽出するのに用いられる手順であるからで
ある。

従って、本発明の基本的目的は検査試料からＤＮＡを抽
出する操作、特にヒト全血試料からのＤＮＡ抽田に固有
の処理時間を短縮することである。

もう１つの主要目的は、自動化によってＤＮＡ抽出手順
に厳しい品質管理を課することができるようにすること
である。このことは品質管理計画に通常伴う管理費を軽
減する。

もう１つの目的はＤＮＡ抽出手順Ｏ期間中のランダム処
理誤差の可能性を最小にすることである。

更にもう１つの目的は、比較的に複雑でなく、ＤＮＡに
基づいた医学的診断検査室における大量抽出に容易に拡
張できる装置を提供することである。

更にもう１つの目的は、ヒト全血以外の材料からＤＮＡ
　ｔ−抽出する目的に修正可能な抽出装置を作ることで
ある。

本発明の発明者達が行った設計実現可能性検討社、試料
の遠心分離に伴う多数のステップの故に、従来の抽出手
順の自動化は部分的にしか達成できないことを立証して
いる。一般的には、従来の抽出手順には４つ、又はそれ
以上の遠心分離ステップが伴う。更に種々の水相を広口
のピペットで除去し、もとの試料を保持しているプラス
チック管へ戻さなければならない。強調する必要がある
点は、従来の手）＠全完全に行うと約４日間かかるとい
う点である。

従って、本発明の他の主要目的は、ＤＮＡの抽出時間を
従来の方法による約４日間から約５時間に短縮するため
、遠心分離ステップの必要なしに最層重分析において全
血からＤＮＡを抽出できる手順および装置を開発するこ
とである。

ここで説明する種類の抽出は大規模に行われるので、人
間の間違いの確率が高くなる。従って、発明に対する基
準の条件は、ＤＮＡ抽出の新奇で安価なシステムを組入
れた装置を設計、製造することであシ、更に人間の間違
いの確率を低下させる装置を提供することである。

従って、本発明の更にそれ以上の目的は、自動化又は半
自動化できるシステムを提供し、操作を追跡、記録でき
るようにし、それによってプロセスの状態を丁度よい時
に監視できるようにすることであシ、またＤＮＡに基づ
いた診断検車が他の種類の検査と競争できるようにする
ために費用を安くすることである。

発明の要約 上記の、およびその他の目的は本発明のいくつかの特徴
によって達成され実施される。簡単に説明すると、本発
明のプロセスは検査試料、特に全血溶解産物試料を調製
するステップを含み、その後で試料を本発明によって開
発した装置内へ入れ、使用できる便利な量のＤＮＡを生
じさせる一連の操作を行うステップを含む。この装置は
一般に厚さ５ｍｍ、直径３１ｍｍのアガロースゲルディ
スクを少なくとも１個含む。そのようなディスクを一般
に８ミクロンの２枚のポリカーボネートフィルタの間に
支えて電気泳動緩衝液中に漬し、電界内に置く。従来の
電源に接続することによって必要とされる電界を生じさ
せる手段が備えられている。動作する場合には、適当に
処理された血液試料をアガロースゲルディスクの頂部表
面上に置き、電界を印加するとＤＮＡ分子以外の処理さ
れた血液の成分部分がゲルディスクを通して引き出され
除去される。ゲルディスクの下面と開放式溶出又は収集
カップとをインタフェースさせ、一般に分子量ｓｏ、ｏ
ｏｏをしゃ断する透析膜を配置することによって、ＤＮ
Ａ試料がそのような膜の上に集められる。

本発明の明確な特徴は、先づゲルディスクサブアセンブ
リを電気泳動緩衝液中の第ルベルに置くことによってＤ
ＮＡ以外の成分分子の除去を行９装置内の配置にある。

ディスクサブアセンブリの一部を形成する溶出カップを
この場合にはゲルディスクの底から離して置き、マニホ
ルドサブアセンブリ内に形成されている入れ物内に保持
する。

この結果、電界によってゲルディスクから引き出された
分子は緩衝液の層流によって押し流され、次に緩衝液祉
マニホルドサブアセンブリを通ることが許される。しか
し、その後ゲルディスクサブアセンブリが下方へ移動す
ると、ゲルディスクから引き出されたＤＮＡは直接に溶
出カップに入り、底に膜上で集められる。操作のこの時
点において、緩衝液はＤＮＡ　を押し流すことはできな
い。

本発明のその他の追加の目的、利点および特徴は添付の
図面とともに下記の明細書を参照することによって理解
される。添付の図面において同一部品には同一数字が付
けられている。

好ましい実施例の説明 好ましい実施例の詳細な説明に進む前に、本発明が基づ
いている原理は一般に大部分の粒子は正又は負の電荷を
帯びているということである点に注目すべきである。荷
電粒子が電界に導入されると、粒子は粒子を電界線に沿
ってその電界を生じさせる電極の一方又は他方の方向へ
移動させる力を経験する。

次に、何らかの種類の機械インピーダンス、例えばアガ
ロースゲルディスクを電界内に置くと、物理的により小
さい粒子はよシ大きい粒子よりも早くインピーダンスを
通って移動する。電葆、アガロースゲル、電界および操
作時間を適当に構成することによって、小さい粒子を除
去し大きい粒子を回収することが可能になる。本発明に
よ多素子を慎重に選択すると、血液試料中にあるＤＮＡ
分子以外のすべての分子をアガロースゲルディスクを通
して容易に引き出し、それによＪＤＮＡを上述したよう
に容易に抽出することができる。

本発明に用いるための全血溶解産物を調製するために、
溶解手順を実験的に開発した。基本的要件は、溶解産物
の成分はゲル基質を傷つけることなくアガロースゲルデ
ィスクを通過できるものでなければならないということ
でおる。ＤＮＡの断片はゲルを徐々に通過する分子量の
ものとすべきであり、制限された大きさのものとすべき
である。

蛋白質はゲルディスクを速やかに通過できる大きさの分
子に分解しなければならない。更に、分解産物は沈査金
含んでいてはならない。血液溶解平頂は全血０．５ｍＪ
金ＤＮＡ溶解緩衝液４．０ｍｌに加えることからなυ、
そのような緩衝液はｐＨ７，４のｔｒｉｓ−ＭＣＩ　１
０ｍＭ、　ＮａＣＡ！　１０ｍＰｄ、　ＥＤＴＡ　（エ
チレンジアニンテトラ酢酸）１０ｍＭｉ含む。更に全血
および溶解緩衝液に蛋白分解酵素Ｋ　１００ｍｃｇ／ｍ
Ｊ、およヒＳＤＳ　（ドデシル硫酸ナトリウム）１チを
加える。ここに明記した成分を逆さにして静かに混合し
、３７℃で２時間装置する。

上述した種類のものを静かに溶解すると、ＤＮＡは確実
に極く小さくせん断される。一定の電極および電界構成
の下では、非常に大きなりＮＡはゲルディスクを傷つけ
る。このため、機械をインタフェースをとる前に、ＤＮ
ＡをＤＮＡ分子の大きさを小さくする制御されたせん断
操作にかける。これらの断片はゲルディスクを傷つけず
にゲルディスクを通過する。

図面、即ち第１図〜第６口金参照すると、特に先づ第１
図を検討すると、申請者の発明の重要な、又は不可欠な
部品を含む抽出装置又はアセンブリがみられる。適当な
電源（第１図には示されていない）とともに加熱および
冷却装置および再循環ポンプ（第１図に概略的に示され
ている）が検査試料からＤＮＡ　６抽出する全体的オペ
レーティングシステムの一部を形成していることが説明
が進むにつれて理解される。

抽出装置１０はそのなかにそらせ板（ｂａｆｆｌｅ　）
手段１６が置かれている貯槽１４　（第３図）ヲ貧むた
めの容器１２ヲ含んでいる。また右手にみられるように
容器ｎ内には、負電極サブアセンブリ１８　、アガロー
スディスクサブアセンブリ美およびマニホルドサブアセ
ンブリ２２を含む抽出アセ／プリが含まれている。負電
極サブアセンブリ１８はサブアセンブリ２０の頂部にあ
てはまるよりに適合しておシ、２つの部品の一部はサブ
アセンブリｎ内に受は入れられている。サブアセンブリ
艶は頂部のマニホルド２２Ａ、底部のマニホルド２２Ｂ
および底部のブロック２２Ｃを含む。この底部のブロッ
クには、アパーチャｌによって底部のブロック２２Ｃの
レセプタクル２６および底部のマニホルド２２Ｂへ緩衝
液流を供給する個々のパイプ含金む配管系２４が置かれ
ている。底部のブロック２２Ｃにはまたその目的が明ら
かな正電極２８が備えられている。

好ましい実施例では二重の配置が備えられている、即ち
２つの試料から血液？抽出する２つの機構がシステムに
組入れられていることが判る。従って、１対の電極間が
負電極サブアセンブリ１８に含まれ、対になっているリ
セプタクル３２および讃が頂部のマニホルド２２Ａおよ
び底部のりセプタクル２２Ｂにそれぞれ含まれているこ
とが判る。同様に、ディスクサブアセンブリ四の各々は
対応する素子を含む。従って、抽出したＤＮＡ　を−集
めるための対になっている溶出カップＩが備えられてお
シ、また対になっている下方のゲルストップ羽ならびに
上方のゲルストップ４０も備えられている。この素子組
立体の頂部には１対の位置決めスリーブ４１およびスリ
ーブロケータ４２がある。

上述した素子のすべて、即ち溶出カップ、上方および下
方のゲルストップおよび位置決めスリーブおよびスリー
ブロケータはリセプタクル３２１７’３にはめ込まれる
ように適合している。１対の頂部および底部の位置決め
スリーブ躬は矢印で示されているようにそれぞれ頂部お
よび底部のマニホルド２２Ａおよび２２Ｂのりセグタク
ルの内側に置かれて頂部および底部のマニホルドの位置
を一緒に正確に決めるように設計されている。

本発明によるプロセスの実施には高純度のアガロースゲ
ルの使用が含まれ、そのようなゲルは回収後の試料の処
理を妨げるおそれのあるＤＮＡ汚染を最小にするのに役
立つディスクの形をしている。

そのようなゲルディスクは先づ位置決めスリーブ４１の
各々の端面にポリカーボネートフィルタｔｔいて作られ
る。特に第３図を参照すると、上方のポリカーボネート
フィルタカがみられる。ゲルディスクを作る場合には、
位置決めスリーブ４１は勿論第３図にみられる位置とは
逆の位置になっている。

前もって冷やしておいた造形用プラグ（図示されていな
い）ｔ−スリーブ４１の穴の中に挿入し、形を造る場合
にゲルを冷却する。上方のストップリング、即ちストッ
プリング４０をフィルタ犯の上に置いて下の方へ押しつ
けてフィルタを延びた状態に締めつける。次にストップ
リング４０ｔ一端面に近い第１肩に接するようにする。

次に熱いアガロースゲルをフィルタ製上に滴下させ、フ
ィルタとストップリング４０によって作られたくぼみを
満たす。

次にゲルを熱いゲルの上に置かれた別のフィルタ５２に
よって覆い、今度はこのフィルタ５２を下方のストップ
リング謔によってリング４０の円周に対して締めつける
。リング謔の下端はスリーブ４１の次の肩に接する。

最終的に生じるゲルディスクが詞に示されている。この
ゲルディスクの組成はＬＸ　Ｔｒｉｍ　Ｂｏｒａｔｅ（
硼酸塩）中に高純度アガロースを０．５％宣むことが好
ましい。ＩＸ　Ｔｒｉｓ　Ｂｏｒａｔｅの組成はＴｒｉ
ｓ−ＨＣＩ　９０　ｍＭ　、硼酸９０　ｍＭ　、　ＥＤ
ＴＡ　３　ｍＭでクシ、ｐＨ８，３である。

ゲルの上述のチはロードされる血液分解産物の量により
、使用される電界により変化することが判る。同様に、
ゲルディスクシの厚さも変化する。

これらの要因のすべては使用される操作時間を予め決定
する。

ゲルディスク全作るのに用いたのと同じ組成。

例えばＬＸ　Ｔｒｉ８Ｂｏｒａｔｅと同じ組成の緩衝液
を貯槽１４に満たす。追加のＳＤＳおよびＥＤＴＡ　ｔ
−加えて蛋白質の解離を助長し、ＤＮＡと鉄との間の有
害な反応を最小にする。緩衝液を混ぜ、装置１０ｆｔ通
して再循環させ、先づ公称３７℃にあたため、血液分解
産物のよシ小さい成分部分がゲルディスクを一層通り抜
けることができないようにする。

上述した素子、即ち位置決めスリーブ４１．ゲルディス
クシ、ストップリングあおよび４０および溶出カップ３
６ヲ含むアガロースディスクサブアセンブリ２０をマニ
ホルドｎ内にロードし、再循環している緩＠液が位置決
めスリーブ４１に殺致してゲルディスク５４ｔ−その中
に沈めるようにする。ゲルディスクの下に閉じこめられ
た泡があればそれを取シ除く。次に、調製された血液試
料をゲルディスクの頂部にロードする。即ち、２つの血
液試料會ゲルディスクヌの上方のスリーブ４１の内部に
範囲を限定されている受容室（ｒｅｃｅｐｔｉｖｅ　ｃ
ｈｅｍｂｅｒｓ　）に入れる。次に、負電極サブアセン
ブリ１８ヲそのサブアセンブリのそれぞれの位置決めス
リーブ４１の頂部の上に置く。次に、電圧を正および負
電極の両端に印加し、この段階においてアガロースディ
スクの全面の面積にわたって一様な電界を発生させる。

装置全動作させると、室印に含まれる血液分解産物は電
界の力の影響をうけてゲルディスクシ内に移動する。す
べてのＤＮＡがゲルディスクに入ったと思われる所定の
時間において、電界を取シ除いて緩衝液を交換する。

新らしい、汚染していない緩衝液全公称３２℃に維持し
続ける一本で今度は洗浄（ｆｌｕａｈ　）ステップを行
う。このステップの目的はゲルディスクシから血液粒子
を除去し、今は捨てられた緩衝液に以前に添加され今な
お表面上や組立てられた装置内のゲルディスクに存在し
ているかもしれない余分のＳＤＳおよびＥＤＴＡ　を希
釈することである。このステップの期間中には、第３図
にみられるゲルティスフサブアセンブリ加の位置決めス
リーブ４１は、アパーチャｎからの層流が底部のマニホ
ルド２２Ｂの長大８０を通り抜けてブロック２２Ｃのア
パーチャ８２によって外へ出ることができるような位置
に置かれている。

緩衝液が再循環しているので、緩衝液中に移動する血液
粒子がゲル内に再び運びこまれることがある。従って、
レベルを高めた電界での第２の洗浄ステップが必要とな
る。このステップでは新鮮な緩衝液が緩衝液中に残って
いる汚染粒子があればそれを更に希釈するのに用いられ
る。

第２の洗浄ステップの後では、ゲルディスクシからは目
にみえるヘムおよびその他の汚染物質はなくなシ、王に
血液分解産物からのＤＮＡ　？　ｔんでいる。緩衝液を
再び取シ替え、ゲルディスクの下面とそれぞれの溶出カ
ップ３６とを接触させる。第４図にみられるように、こ
の接触を行うために、位置決めスリーブ４１は今や第３
図におけるその以前の位置よシ下へ押しさげられている
。この結果、上述した層流路はふさがれる。溶出カップ
あよシも下のレベルに溶出カップあの各々に対応づけら
れた透析膜がある。透析膜は溶出カップあの口よ）下の
位置に置かれていて　％Ｑ″リング７２とプラスチック
製クランプリング７４によって固定されている。

次にこの手順のうちの溶出ステップが行われるが、この
溶出ステップは緩衝液を冷却し、その温度全公称２２’
Ｃに保つことを含む。このステップでは電極両端の電位
は１００ボルトに高められ、それによＪＤＮＡｉゲルデ
ィスクから速度を早めて溶出カップ内へ押しやる。次に
、溶出カップあの底に固定された透析膜上に直接に接触
している緩衝液中に懸濁されたＤＮＡの試料が使用で亀
る少量で回収される。

本発明の本質的な機構、即ちゲルディスクは既知の反復
可能な方法で確実に装置が動作するようにするためには
いくつかの支援システムを必要とする。第１に、このシ
ステムは、ゲルを通して分解産物を引き出す電界が連続
する抽出間において反復可能であることを必要とする。

この電界は（１）緩衝液のｐＨが電極付近で許容限度を
超えて変化すると、（２）電界における通路のインピー
ダンスがガスの泡が集ったために変化すると、（３）緩
衝液の温度が許容限度を超えて変化すると、予期できな
い変化をするおそれがちる。

使用する緩衝液はその組成については上述したＩＸ　Ｔ
ｒｉｓ　Ｂｏｒａｔｅである。この緩衝液は電流を伝導
しつつある電極にさらされても一定のｐＨをよく維持す
る“強力（ｓｔｒｏｎｇ　）”緩衝液と考えられる。

緩衝液を大量に絶えず再循環させると局所的ｐ膜化を最
小にする。装置１０は流れが下方の負電極の各々の上を
越えて移動し緩衝液は大きな貯槽１４内へ再循環するよ
うに構成されている。頂部の負電極の上を越える流れは
ない。従って、リセプタクル３２および印肉の緩衝液の
量は、ゲルディスクの上方で許容できるｐＨレベルを維
持するのに十分な量でなければならない。この上方の量
の流れがあるとゲルディスク上方の分解産物を乱し、ゲ
ルディスク上方の大量の所望しない材料を再循環させ、
そのため機械の操作時間を長くすることがおる。

図面にみられるようにこの装置は垂直構造であるので、
下方の正電極において発生したガスの泡は上昇してゲル
ディスクの下に集マシ、その後溶出段階の間に透析膜７
０の下に集まる。これらの２つの接触部分のいづれかに
大量のガスがたまると電極間を流れる電流を実際上減少
させ、システム内の特定されない場所において反復でき
ない電圧差を生じさせる。

泡の蓄積を防ぐために、下方の点電極（ｐｏｉＨ＋ｅｌ
ｅｃｔｒｏｄｅ　）上に緩衝液全急速にポンプで送シ込
む。この流れはそこで発生したガスを大きな貯槽内へ運
び、そこでそらせ板手段１６がガスをマニホルドｎへ再
循環させて戻す代わシに大気中へ逃がすことができるよ
うにする。

ゲルディスクおよび緩衝液中に散逸する力はそのうちに
、特に電界がより強くなる溶出段階の間に温度上昇を生
じさせ、これはゲルとＤＮＡ　をｉ傷つけるおそれがあ
る。この段階中の熱を除去するため、閉ループ冷却熱交
換機を通して緩衝液を再循環させる。この再循環は装置
内の温度平衡を維持する。

運転および洗浄中の電界強度は溶出段階中よ）弱く、こ
の結果運転および洗浄中の緩衝液およびゲル内への力の
散逸は減少する。このため、緩衝液は操作の最初の２段
階の間には外部熱交換によって加熱され、小さい血液分
解産物粒子のゲル通過を促進する。ゲルを通過するより
大きなりＮＡの移動はこの加熱によって９ける影響はよ
υ少ない。

当業者が本発明の技術を完全に理解し詳細に実施できる
ようにするために、ＤＮＡ抽出および測定プロトコルを
下記に述べる。

１、　造形用プラグを氷の上に童く。

２−　　”４　’　Ｘ　ｔ　’平方の大きさの５ＯＫ分
子量透析膜を単層に切る。ｄＨ２０で前処理する。

３、　０．５％高純度アガロース（インターナショナル
・バイオチクノロシイ社製）を用意する。

０．１２５　ｔを緩衝液２５　ｍｌに混ぜる。

４．　ゲルの形を造る。

Ａ、冷却した造形用プラグの上に位置決めスリーブを置
く。

Ｂ、造形用プラグの頂部に８ミクロンのポリカーボネー
ト膜を載せる。

Ｃ０上方のゲルストップ上を滑らせ、膜にプレストレス
をほどこす（ｐｒｅｔｅｎｓｉｏｎ　）。

Ｄ、フラスチックホールピペットを用い、上方のゲルス
トップの上方にわプ゛かなメニスカスができるまでゲル
を膜上に置く。（ゲルの一部がプラグを漏れて落下する
かもしれないので他の膜を置く前に数秒待つ。必要なら
ば気泡ができるのを防ぐためにメニスカスの形をかえる
。）Ｅ、慎重に別のＳｕｍポリカーボネート膜全ゲル上
に置き、下方のゲルストップの位置を決める。

再びゲルが平らになっていてプレストレスを与えられて
いることを確かめる。ゲルが凹面になっていてはならな
い。

Ｆ、固まるまで４℃の冷菫庫に入れておく。

５、　　ＩＸ　Ｔｒｉｓ　Ｂｏｒａｔｅ　（ＴＢ）　２
リツトルを貯槽にそそぎ入れる。ポンプ全オンにする。

６．２０％ドデシル硫酸ナトリウム０．２　％　（５Ｄ
Ｓ２ｏｎｅ）おヨヒ１０ｍＭエチレンジアミンテトラ酢
散（０，５Ｍ　ＥＤＴＡ　３６ｍ１　）を加え、ゲル金
量く前に１０分間循環させる。加熱／冷却装置に温水を
満たし、運転および洗浄期間中緩衝液温度ｉ３０〜諷℃
に保つ。

７、　予め切断し前処理した透析膜を溶出カップウェル
（ｗｅｌｌ）に入れ、”０”リングおよびプラスチック
リングを固定し、膜がぴんと張っていることを確かめる
。（とび出るのを防ぐためにプラスチックリングの内側
の周シにワセリンを必要とすることがある。）　機械の
底のブロックに入れ、位置決めスリーブを用いて底部お
よび頂部のマニホルドの位置を決める。

８、溶解産物の調製： Ａ、溶解した血液２．５ｍｌをピペットを用いて１０ｍ
ｊ管へ移す。

Ｂ、÷１０で１０秒間渦流を発生させる。

９、　造形用プラグを冷菫犀から取出す。注意してプラ
グを引出し、キムワイプ（Ｋｉｍｖｉｐ・＞′ｔ−用い
て内側から余分のゲルをぬぐいとる。位置決めスリーブ
の端にロケータスリーブを滑らせ、円滑な表面に対して
も目様ｒｊ操λ乍とイテなづ。

１０、　　スリーブを頂部のマニホルドに入れる。外側
の緩衝液はマニホルドより少し低くする。高すぎる場合
にはポンプを逆転させて一部の緩衝液を排出する。セル
内の緩衝液が低すぎる場合には、プラスチックホールビ
ペラ）ｔ−用いて貯槽からの緩衝液を用いて満たす。

１１、位置決めスリーブに負電極を入れる。（電極は接
続させない。） ν、プラスチックホールピペットを用いて各セルに溶解
産物２．５ｍｌを入れる。溶解産物が緩衝液中に散逸す
るのを防ぐために、分配する前にピペットヲできるだけ
ゲルに近づける。

１３、電圧計を用いて電圧（４０ボルト）をセットする
。記録計をオンにする。負電極を接続し、電極と位置決
めスリーブ頂部とが同じ高さになっていることを確かめ
る。

１４、　　日付、実験番号１時間、ボルトおよびミリア
ンペアを記録計に記録する。１時間運転する。

１５、電源を切る。記録計に時間を記録する。ポンプを
逆転させ緩衝液を排出する。負電極とスリー１を取除く
。ＩＸＴＢでゆすぐ。

１６、　　ＩＸ　ＴＢ　２１Ｊツトルを貯槽へ加え、緩
衝液のレベルを調節する。ポンプをオンにし、スリーブ
と負電極を取替える。

１７、電圧ｉ５Ｕボルトにセットする。電源を接続する
。時間、ボルトおよびミリアンペアを記録計に記録する
。（９）分間洗浄する。

１８、洗浄（ｆｌｕａｈ　）　＋　２でステップ１５〜
１７　を反復する。但し、溶解産物がゲルから出るまで
運転する。

１９、ステップ１５ｔ″反復する。位置決めロケータを
除去する。冷却装置中の温水を氷と交換する。

（溶出緩衝液を公称２２℃に維持する。）２０、　１Ｘ
　ＴＢ緩衝液を加え、レベルを調節する。

ポンプをオンにする。位置決めスリーブをセルのなかに
入れ、押しつけて溶出カップのなかへしつかシ入れる。

２１、電圧ｉ　１００ボルトにセットし、電源を接続す
る。時間、ボルトおよびミリアンペアを記録計に記録す
る。２時間運転する。

ｎ、電源および記録計をオフにする。時間を記録計に記
録する。ポンプを逆転させて緩衝液を排出する。慎重に
頂部および底部のマニホルドを除去し、スリーブと溶出
カップを１つにまとめて除去する。

羽、膜の間からゲルを除去し、頂部にかみそシの刃で切
れ目をつける。エチジウムプロミド（１００ｐ／ｍｌ）
で１００分間染色する。ＬＸ　ＴＢで１０分間着色を除
去する。ゲルを横に切シ紫外線で撮影する。

２４、プラスチックホールピペットを用いて溶出カップ
から上の方の緩衝液を除去して捨てる。端が広くなって
いるピペット先端で膜からＤＮＡ試料を除去し、０．５
ｍＡ’エツペンドルフ管へ入れる。実験番号および集め
た量を記入したラベルをはシ４℃で貯蔵する。

上述したプロトコルによって８つの試料を含む４回の代
表的な運転を行ったところ下記の量および収量がえられ
た。

１９２　Ｆ　　　　　　　　　　　５０　　　　　　　
　　　　２．４１９２　　Ｂ　　　　　　　　　　　６
０　　　　　　　　　　１４．９１９３　Ｆ　　　　　
　　　　　　５５　　　　　　　　　　１７．８１９３
　　Ｂ　　　　　　　　　　　７５　　　　　　　　　
　１７．０１９４　　Ｆ　　　　　　　　　　　６０　
　　　　　　　　　１０．４１９４　　Ｂ　　　　　　
　　　　　７５　　　　　　　　　　１２．３１９５　
　Ｆ　　　　　　　　　　　５５　　　　　　　　　　
１１．２１９５　　Ｂ　　　　　　　　　　　４５　　
　　　　　　　　１５．９本発明の好ましい実施例と現
在考えられるものを示し説明したが、そのような実施例
の変形も可能なことが当業者によって理解されると思う
。従って、本発明はこの実施例に限定されるものではな
いことが所望され、本発明の真の精神および範囲内に入
るすべてのそのような変形が添付の特許請求の範囲にお
いて含むことが意図されている。

以下本発明の実施の態様を列記する。

１、前記ＤＮＡ源がヒト全血である特許請求の範囲第１
項に定義されている装置。

２、抽出アセンブリを更に含み、電界を印加する前記手
段は前記アセンブリ上の間隔を位置に接続された正電極
および負電穫を含む特許請求の範囲第１項に定義されて
いる装置。

３、前記抽出アセンブリはゲルディスクサブアセンブリ
およびマニホルドサブアセンブリを含み、前記正電極は
前記ゲルディスクサブアセンブリに接続され、前記負電
極は前記マニホルドサブアセンブリに接続されている前
記第２項に定義されている装置。

４、　検査試料？配量する前記手段は前記ゲルマトリッ
クスの上方の面と前記試料との接続を特徴とする特許請
求の範囲第１項に定義されている装置。

５、　前記溶解緩衝液はＤＮＡ源の量の約４倍の量を有
する特許請求の範囲第２項に定義されている方法。

６、　前記ＤＮＡ源がヒト全血である特許請求の範囲第
２項に定義されている方法。

フ、検査試料が前記ゲルの上方の面に接触している特許
請求の範囲第２項に定義されている検査試料からＤＮＡ
　を分離する方法。

８、前記電気泳動緩衝液は更に前記溶解産物の所望しな
い成分部分を希釈し、ゲルの下に閉じ込められた気泡金
除去するように機能する前記第６項に定義されている方
法。

９、　前記ゲルは最初は前記電気泳動緩衝液内の所定の
レベルに置かれるので、ＤＮＡ以外のすべての分子はゲ
ルを通して引き出されて容易に一掃される特許請求の範
囲第２項に定義されている方法。

１０、ゲルを前記所定レベルよ）低いレベルに置き、十
分な磁界を与えてゲルからＤＮＡを除去し、ＤＮＡが一
掃されるのを防止しその代わシにＤＮＡ　を集めて今後
の検査に用いる前記第９項に定義されている方法。

１１、前記血液と混合された前記溶解緩衝液は本来ｐＨ
７，４のＴｒｉｓ−Ｈ（Ｊ　１０ｍＭ　、　ＥＤＴＡ　
１０ｍＭ　。

Ｎａ（Ｊ　１０　ｍＭ　、プロテイナーゼＫ　１００ｐ
ｆ／ｍｊ　　および１．ＯｄｅｇｒｅｅａｌｏＳＤＳか
らな夛前記溶屏産物を作る前記第６項に定義されている
方法。

１２、前記ゲルは本来ＩＸ　Ｔｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ中
に高純度アガロースを重量％でＯ，Ｓ　％含み、前記Ｉ
Ｘ　Ｔｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅは本来Ｔｒ　ｉｓ　−ＨＣ
Ｉ　９０　ｍＦｉ！　、硼酸９０　ｍＭ　、　ＥＤＴＡ
　３　ｍＭ　ｋ含みｐＨが８．３である前記第１１項に
定義されている方法。

１３、　　ＤＮＡのすべてがゲル内に入った時点におい
て、ステップ４により磁界を一時的に除去し、電気泳動
緩衝液を交換し、ステップ４による新鮮緩衝液の濃縮を
含む最初の洗浄ステップ（ｆｌｕｓｈａｔｅｐ）ｔ−行
う特許請求の範囲第１項に定義されている方法。

１４、追加の洗浄ステップを行ってゲルから溶解した血
液粒子を除去し、新鮮な電気泳動緩衝液を用いて緩衝液
中に残っている粒子を希釈する前記第１３項に定義され
ている方法。

１５、検査試料からすべての汚染物質を除去するステッ
プ全電界を生じさせて第１電位差で行い、ＤＮＡを集め
又は溶出するステップをよ）高い電位差で行う前記第１
４項に定義されている方法。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の好ましい実施例による装置の分解図
である。 第２図は、その装置の主要部品の斜視図である。 第３図は、第２図において斜視図でみられる装置の線２
−２に沿って切断した断面図であ）、ゲルディスクは第
ルベルにある。 第４図は、同じ断面図であるが、ゲルディスクは第２レ
ベルにある。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、電気泳動緩衝液の貯槽を提供する容器と、前記電気
   泳動緩衝液に漬したゲルマトリックスと、 電界を前記ゲルマトリックスに印加する手段と、検査試
   料をゲルマトリックスと接触させて置き、前記電界に応
   答して検査試料がゲルマトリックス内に引き込まれるよ
   うにする手段と、 ＤＮＡを除く検査試料のすべての構成要素分子を前記電
   界に応答して比較的低い分子量により前記ゲルマトリッ
   クスから選択的に除去する手段であつて、前記電気泳動
   緩衝液の流れによつて前記構成要素分子を一掃する手段
   を含む手段と、 前記電界に応答してゲルマトリックスからまだ残つてい
   るＤＮＡを除去してＤＮＡを集めるようにする手段とを
   含む、 ＤＮＡ源から得た検査試料からＤＮＡを分離する装置。 ２、溶解緩衝液とＤＮＡ源とを混ぜることによつて検査
   試料を組成する溶液を調製するステップと、ゲルを電気
   泳動緩衝液に漬すステップと、 検査試料をゲルと接触させて置き、電界を印加して検査
   試料がゲル内に引き込まれるようにするステップと、 前記電界を印加しながら前記電気泳動緩衝液を循環させ
   、ＤＮＡを除く検査試料のすベての構成要素分子をゲル
   から除去し前記電気泳動緩衝液の流れによつて一掃する
   ステップと、 別の電気泳動ステップを行つてまだ残つているＤＮＡを
   ゲルから除去するステップとを含む、試験試料からＤＮ
   Ａを分離する方法。