JPS62259592A - 突然変異株の、突然変異遺伝子のおよび対応野生型遺伝子の単離法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、突然変異株を単離するのみならず、その突然
変異遺伝子およびそれに対応する非突然変異遺伝子をも
単離するきわめて簡単な方法に関するものである。

本発明の方法では、突然変異を起こす原菌株中で複製が
可能で、温度感受性であり、さらに選択マーカーを有す
るプラスミドを用いる。例えば、抗生物質耐性のような
選択マーカーの導入か一般に知られて以来、唯一存在す
る制約は、オリジナルのプラスミドの宿主域に関連する
ものである。

温度感受性のプラスミドをハイドロキシルアミンを用い
て作成できることは既に公知である（Ｔ。

ハシモトら、Ｊ、ＢａｃＬｅｒｌｏｌ　、、＋２７（３
）１５６１−１５８２．１９７６　：Ｒ，アイヘンラウ
プ、試験管内（インビトロ）におけるハイドロキシルア
ミン変異による抑制突然変異株の分離、ｒＡｄｖａｎｃ
ｅｄ　Ｍｏ１．Ｇｅｎｅｔｌｃｓ　Ｊ編集者、Ａ、ピュ
ーシー、Ｋ、ティミス、スプリンガーフェルラク出版、
ハイデルベルグ、　ｐｐ、１０８−１１０゜１９８４　
、　Ａ、Ｗ、バーチ、Ｊ、カルム、Ｊ　、Ｇｅｎ、Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ　、。

１．３＋　、１．２９９−１３０３．１９８５　、　Ｄ
、Ｔ、キンゲスバリーら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　７４，１
７−３１．１９７３　；　Ｒ，Ｐ、ノウィクら、Ｐｒｏ
ｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ　、ＵＳＡ、７９．４１０
Ｂ−４１１２，１９８２；Ａ、Ｐ、プロゾロフら、Ｇｅ
ｎｅ、３４．３９−４０．１９８５）。

本発明の以下の記載は、たんに簡略化の目的のみからス
トレプＩ・ミセス変異についてなされている。しかし、
以上述べたことから明らかなように、本発明は他の微生
物にも拡張応用できる。

原プラスミドとしては公知のプラスミドであるｐＩＪｌ
ｏｌまたはＳｌ、Ｐｉ、　　２　（米国特許４．３６０
．５９７号明細書）　、ｐＳＧ２　（欧州特許出願６６
．７０１号および米国特許４．６２１．．０６１号各明
細書）、ｐＳＧ５（欧州特許出願１．５８，８７２号お
よび １５８．２０１号各明細書）またはｐｓＶＨｌ（欧州特
許７０，５２２号明細書）などが用いられるが、これら
は、たんに例としてあげられたものである。例えば、欧
州特許出願１．５８，２０１号および１．５８，８７２
号各明細書に記載されているように、これら原プラスミ
ドの大きさを種々の処理を行なう前に縮小して用いるこ
ともできる。

マーカー遺伝子の導入自体は、同様に欧州特許出願１５
８，２０１号および１５８，８７２号各明細書に記載さ
れており、さらには、Ｔ、キーザーら（Ｍｏｌ　、Ｇｅ
ｎ、Ｇｅｎｅｔ、　、眼５　、ｏａ−２ａｓ、ｔ９ｇ２
）およびＣ１Ｊ、）ンプソンら（Ｇｅｎｅ、２０．５１
−［ｉ２．１９８１）によっても記述されている。詳細
な説明はまた「ストレプトミセス（Ｓｔ　ｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓ）の遺伝子操作、実験室マニュアル」　（ジョ
ン・インネス・ファンデーシヨン、ノーリッチ、＋９８
５）の中にも記載されているが、これには導入方法の他
のステップについても詳しく述べられている。

適切なマーカー遺伝子の例としては、チオストレプトン
耐性遺伝子ｔ　ｓ　ｒ、ネオマイシン耐性遺伝子ａｐｈ
ｌおよびメラニン産生遺伝子ｍｅ１などかあげられる。

このようにして得られたマーカー遺伝子を持つプラスミ
ドは、複製を温度感受性にする方法のように、それ自体
よく知られた方法で突然変異させることができる。例え
ば、プラスミドｐｌＪ７０２は温度感受性複製突然変異
プラスミドｐＭＴ６６０　（Ａ、Ｗ、バーチら、前出）
に変換され、これはストレプトミセスΦリビダンス（Ｓ
ｔｒｅｐｔｏ−ｍｙｃｅｓ　ｌ１ｖｌｄａｎｓ）中で３
９°Ｃで消失することが見出されている。

本発明の突然変異株（…ｕｔａｎｔｓ）の作成方法は、
原菌株からの全ＤＮＡの単離、そのＤＮＡの小フラグメ
ント（断片）への変換、およびそれらＤＮＡを、マーカ
ーを持ち、温度感受性であり、原菌株中で複製できるプ
ラスミドへ導入することからなる。その結果化じた複合
プラスミド群（ｈｙｂｒｌｄ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）
を原株中に移入させ、プラスミドマーカーを適当に選択
することによって形質転換体のみが生残るようにする。

温度を温度感受性プラスミドの閾値以」二に」二げるこ
とによって、全ての自律性複合プラスミドは排除され、
さらに、プラスミドマーカーの新たな選択によって、突
然変異株が選択され、これらが突然変異した遺伝子の単
離あるいは変異遺伝子に対応する野生型株の単離に利用
される。

本発明の他の特徴および適切な実施例は、以下に詳細に
説明され、特許請求の範囲に記載されている。

まず、突然変異を起こさせようとする株から全ＤＮＡを
単離する。このＤＮＡを、適切な制限酵素によって適当
に消化すると、その結果、プロモーター域も翻訳停止信
号も含まない類フラグメントが他のフラグメントととも
に生じる。制限のために、ＤＮＡを多数の部位で切断す
るような制限酵素、例えば、５ａｕ３ＡあるいはＴａｑ
Ｉを用いると有利である。次いで、マーカー遺伝子を持
つ温度感受性プラスミドを適切な制限酵素によって直線
状にし、突然変異させる株由来のＤＮＡの制限酵素切断
フラグメント群と連結させる。その結果として、原株由
来の種々の小ＤＮＡフラグメントを含むプラスミド群（
ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）が多数得られる。

こうして得られたプラスミド群を公知の方法で原株に導
入する。ストレプトミセスの場合には、ポリエチレング
リコールにより誘発されるプロトプラストの形質変換が
適切である。

マーカー遺伝子の選択によって得られた形質転換株を、
温度感受性プラスミドの閾値温度より低い適切な温度で
培養すると、形質転換株が増殖する。その後、温度を閾
値温度より高温にすると自律性プラスミドの増殖は停止
する。ここで、プラスミドマーカーの有無の選択を行な
うと、プラスミドＤＮＡをクロモソームに取り込んだ細
胞のみが得られる。プラスミドＤＮＡのクロモソームへ
＝　　７　− の取り込みは、挿入されたフラグメントのクローン相同
配列を介してよく起こり、一般に、対応遺伝子の不活性
をまねく。このように、閾値温度より高い温度で増殖で
き、適切なプラスミドマーカーを有する細胞は全て突然
変異株である。

このように、本発明は突然変異株の簡単な作成のみなら
ず、直接的でしたがって非常に効率的な単離をも可能に
する。通常の突然変異の方法では突然変異株の出現率は
ほんのわずかにすぎないので、一つの突然変異株を検出
するのに多くの非突然変異株をも調べる必要がある。本
発明の方法によると、この苦労が排除される。さらに、
本発明の注目すべき利点は、プラスミドＤＮＡのゲノム
への挿入による突然変異遺伝子の物理的なマーク付けが
ある。この遺伝子はしたがって容易に同定され、突然変
異株の全ゲノム中でハイブリダイゼイションによって検
出される。

さらに、特定のクローニング方法を使った分解によって
、突然変異を起こさせた遺伝子を突然変異株のＤＮＡか
ら直接に得ることも可能である。

次いで、突然変異遺伝子は適切な野生型遺伝子バンクか
ら単離できる。

突然変異のクローニングについては上記の参考書にファ
ージベクターφＣ３１を用いたものが記載されているが
、今日まで、ストレプトミセス・コリコラ−（Ｓ、ｃｏ
ｅｌ　Ｉｃｏｌｏｒ）のみへの挿入が記載されているに
すぎない。これに対して、本発明の方法は、マーカーを
持ち、温度感受性であるプラスミドを受入れる株に広く
一般的に適用することが可能である。さらに、ファージ
ゲノムではクロモソーム当りのコピー数が限定されてお
り、事実、通常はただ一個である。これに対して、コピ
ー数が多いプラスミドが挿入されると組換えの確率、従
って突然変異率、が増加する。さらには、ファージゲノ
ムにはクローニングに適した制限部位がわずかしか含ま
れないが、これに対して、適切なプラスミドを選択する
場合にはそのような部位が多数利用できる。また、ファ
ージφＣ３１を用いる方法は、短いＤＮＡフラングメン
トの単離に限定される。これらの限定条件は本発明の方
法には適用されないので、例えば、突然変異遺伝子と共
に隣接した非突然変異遺伝子をも一緒に単離することが
可能である。このように、本発明の方法はあらゆる点で
より効果的である。

本発明を以下の諸例で詳細に説明するが、例中のパーセ
ント表示は特に記載がない限り重量パーセントである。

例１ （全ＤＮＡの単離） メラニン非産生性（ｍｅｌ−）のストレプトミセス株の
ストレプトミセスφガネンシス（！ｌｌｉ、ｇｈａ−ｎ
ａｅｎｓｉｓ）（ＡＴＣＣ１４８７２；米国特許３．６
７４，８６６号）の均質化３日培養物から得られた菌糸
体０．１ｇを１．５ｍｌのエッペンドルフ反応管に入れ
、エッペンドルフ遠心機で１分間遠心してペレットにし
、これを０．５ｍｌのＴＥ（１０ｍＭ）リス−ＨＣｌ、
１ｍＭ　　ＥＤＴＡ（ｐＨ８）　、１０％のシュークロ
ース）で１回洗浄する。その後、ペレットを０．５ｍｌ
のリゾチーム溶液（０，３Ｍシュークロース、２５ｍＭ
トリス−ＨＣｌ　（ｐＨ８）　、２５ｍＭ　　ＥＤＴＡ
。

１１０ｌｌ１／ｍ＋リゾチーム）に再分散して３７℃で
６０分間インキュベートする。５％ＳＤＳ溶液０．２ｍ
ｌを加え、その溶液を混合した後、６５℃で１０分間イ
ンキュベートし、冷却して再び室温に戻す。次いで、フ
ェノール９クロロフオルム混液１００μｌ　（フェノー
ル５ｇ１クロロフオルム５ｍｌ、８−ヒドロキシ−キノ
リン５■、０．１Ｍトリス（ｐＨ８）１ｍｌ）を加え、
混液をシェーカー（ポルテックス、商標）で均質になる
まで激しく混合する。次ぎに、混合液をエッペンドルフ
遠心機で５分間遠心し、得られた上層の水層を新たな反
応管に移す。３ＭのｐＨ非緩衝酢酸ナトリウム７０μｍ
およびイソプロパツール７００μｌをこのＤＮＡ含有溶
液に加える。これを混合して室温で１５分間インキュベ
ートした後、エッペンドルフ遠心機にて５分間遠心して
ＤＮＡのベレッＩ・を得る。−！−澄液は定温的に除か
れる。このＤＮＡをＴＥ３００μｍに再分散させ、ＲＮ
ａｓｅ溶液（５０，ｃｚｇＲＮａｓ　ｅ／ｍｌ水）を加
えて３７℃で４５分間インキュベートする。ＲＮａｓｅ
をフェノール・クロロフォルム混液１００μｍで失活さ
せ、この変性タンパク質をエッペンドルフ遠心機で５分
間遠心してベレットにする。ＤＮＡ含有溶液を再度イソ
プロパツール処理する（３Ｍ酢酸ナトリウム３０μｌお
よびイソプロパツール４００μｍを加えて室温で１５分
間インキュベート）。

遠心後得られたＤＮＡベレットは７０％濃度エタノール
で２回洗浄し、再びベレットにする。風乾してエタノー
ルを除いた後、得られたＤＮＡをＴＥ３００μｍに溶解
し、次の操作に用いる。

例２ （全ＤＮＡの５ａｕ３Ａによる切断） ＤＮＡ　１　ｔｔ　ｇを１単位の５ａｕ３Ａ　（ＢＲＬ
−ギブコ社製、カールスルーエ）を含む切断緩衝液（５
０ｍＭ）リス・ＨＣｌ　　（ｐＨ８）　、１０ｍＭＭｇ
Ｃ１２，５０ｍＭ　　ＮａＣ１）で３７℃で１時間イン
キュベートする。反応をフェノール処理で停止し、ＤＮ
Ａをエタノール沈澱法で精製する。

例３ （全ＤＮＡフラグメント群のｐＭＴ６６０（ｐ　Ｉ　Ｊ
　７０２の温度感受性複製突然変異プラスミド）におけ
るクローニング） ｐＭＴ６６０　（バーチら、前出）を例２と同様に、Ｂ
ｇｌＩｒで完全に直線状にする。ふたつのＤＮＡ試料を
切断緩衝液中で混合し、７０℃で加熱した後、メルカプ
トエタノール（最終濃度１０ｍＭ）およびＡ　Ｔ　Ｐ　
（０、１ｍ　Ｍ　）を加えてリガーゼ反応条件を整える
。この混合物を１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（バーリン
ガーΦマンハイム社製）の存在下で４℃で１２時間イン
キュベートする。次ぎに、この混合物を原株のプロトプ
ラストに形質変換させて、再生プレートにブレーティン
グする。約２０時間の後、プレート中の最終濃度が５０
μｇ／ｍ＋になるような充分量のチオストレプトンを含
む軟寒天をプレートに重層する。

例４ （突然変異株の作成および選択） 形質変換株はＳ培地（ホブウッドら、前出）で２８℃で
約３６時間振とう培養する。その後、温度を３９℃に上
げ、この温度でさらに約３６時間培養を行なう。培養液
を汚染のないように集菌し、１０％のシュークロースを
含むＴＥで洗浄した後、チオストレプトン（２Ｏｎ＋ｇ
／ｌ）を含む完全培地で３９℃でさらに４８時間培養す
る。このようにして生成した突然変異株をブレーティン
グし、その性質を調べる。その際、培養は常に３９℃で
行なう。

例５ （突然変異ＤＮＡの単離） 例］に記載したような方法で突然変異株からＤＮＡを単
離し、組み込まれたプラスミドには切断部位がない制限
酵素で切断し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで再び連結させる。

その結果、突然変異遺伝子を含むに至った複合プラスミ
ドが、複製可能な唯一の環状ＤＮＡである。ストレプト
ミセス・リビダンスのような適切な株への再形質転換を
行ない、次いでチオストレプトン耐性を選択し、突然変
異遺伝子を持つプラスミドを形質転換株から単離する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、全ＤＮＡを原菌株から単離し、当該 ＤＮＡを短フラグメントにし、当該短フラグメントを、
   選択マーカーを持ち、温度感受性であり、原菌株中で複
   製できるプラスミドに取り込ませ、その結果生じる複合
   プラスミド群を原菌株に形質転換し、マーカーによって
   形質転換株を選択し、温度感受性プラスミドの閾値温よ
   り高温にすることによって、複合プラスミドを除き、突
   然変異株を新たに選択マーカーで選択することを特徴と
   する、突然変異株の作成方法。 ２、原菌株がストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏ−ｍ
   ｙｃｅｓ）に属する、特許請求の範囲第１項記載の方法
   。 ３、プラスミドが選択マーカーとして抗生物質耐性を有
   する、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４、ハイドロキシルアミン処理により温度感受性にした
   プラスミドを使用する、特許請求の範囲第１項記載の方
   法。 ５、ハイドロキシルアミン処理によって温度感受性にし
   たプラスミドを用いる、特許請求の範囲第２項記載の方
   法。 ６、ハイドロキシルアミン処理によって温度感受性にし
   たプラミスドを用いる、特許請求の範囲第３項記載の方
   法。 ７、特許請求の範囲第１項の方法により得られる突然変
   異株のＤＮＡを単離し、当該ＤＮＡを当該プラスミドを
   切断しない制限酵素で切断し、生じた切断フラグメント
   を連結して、突然変異遺伝子を含むに至った原プラスミ
   ドが唯一の複製可能環状ＤＮＡとなるようにし、このプ
   ラスミドを選択して、このプラスミドから突然変異遺伝
   子を単離することを特徴とする、突然変異遺伝子の単離
   方法。 ８、特許請求の範囲第７項に記載の方法で得られた突然
   変異遺伝子と野生型株のゲノムＤＮＡとのハイブリダイ
   ズさせることを特徴とする、突然変異遺伝子に対応する
   野生型遺伝子の検出方法。 ９、特許請求の範囲第７項に記載の方法で得られた突然
   変異遺伝子を用いて、野生型ＤＮＡの遺伝子バンクをス
   クリーニングすることを特徴とする、突然変異遺伝子に
   対応する野生型遺伝子の単離方法。