JPS6221791B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は抗菌活性、発育促進活性を有する新規
な抗生物質A73Aならびにその製造方法に関す
る。本抗生物質は、同化可能な炭素源および窒素
源を包含する水性栄養培地で深部好気条件下に、
実質的な抗生物質が培地に付与されるまで、スト
レプトマイセス・ビリデイフアシエンス
（Streptomyces viridifaciens）MA―4864
〔ATCC31495（微工研菌寄第5245号）〕を生育さ
せることによつて製造される。 抗生物質は菌糸体を去することにより醗酵培
地から採取される。液を適当な樹脂に吸着さ
せ、溶離させる。更に精製は蒸発、抽出、沈殿お
よび（または）クロマトグラフイーによつて行わ
れ、実質的に純粋なA73Aを生じる。 A73Aはグラム陽性菌および限られたグラム陰
性菌に対して有効な抗生物質であり、また動物の
感染症の処置に使用し得る。更に、A73Aは例え
ばひなや子豚のような動物の発育促進剤としても
使用し得る。 更に詳しくは、本発明は有用な抗生物質の醗酵
による生産および単離に関する。更に詳しくは、
本発明は、調節した条件下でストレプトマイセ
ス・ビリデイフアシエンス（Streptomyces
viridifaciens）を培養し、次いで抗生物質A73A
を単離することによる抗生物質A73Aの製造に関
する。 抗生物質A73Aは調節された条件下で微生物、
ストレプトマイセス・ビリデイフアシエンスを醗
酵ブロス（broth）中で生育させることによつて
得られる。醗酵は懸濁栄養物を含む培地または主
として実質的に懸濁栄養物を含有していない澄明
な培地中で実施される。 広汎な分類学上の検討を基にして、ストレプト
マイセス・ビリデイフアシエンスは放線菌と同定
され、ニユー・ジヤージー（New Jersey）、ロウ
エイ（Rahway）、メルク・アンド・カンパニ
ー・インコーポレーテツド（Merck＆Co.，Inc.
）の菌株コレクシヨンでMA―4864と命名され
た。この培養物はメリーランド（Maryland）
20852、ロツクヴイレ（Rockville）、パークロー
ン・ドライブ（Parklawn Drive）12301、アメリ
カン・タイプ・カルチユア・コレクシヨン
（American Type Culture Collection）の菌株コ
レクシヨンに恒久的に自由寄託され、受理番号
ATCC31495が付与されている。また同培養物
は、通産省工業技術院微生物工業技術研究所にス
トレプトマイセス・ビリデイフアシエンス
（Streptomyces viridifaciens）MA―4864（微工
研菌寄第5245号）として保管されている。 ストレプトマイセス属の分類検索表およびスト
レプトマイセス種の培養説明はバージエイズ・マ
ニユアル・オブ・デタミネイテイブ・バクテリオ
ロジー（Bergey′s Manual of Determinative
Bacteriology）〔第８版、1974年、ウイリアムズ
およびウイルキンズ〕およびインターナシヨナ
ル・ジヤーナル・オブ・システマテイツク・バク
テリオロジー（International Journal of
Systematic Bacteriology）、第18巻、第138頁
（1968年）にみられ、MA―4864に類似の形態学
的および培養特性を有するストレプトマイセス種
についてこれらの資料を検索した。これらの分類
参考資料では、ストレプトマイセス・ビリデイフ
アシエンスはA73A―生産培養物MA―4864と類
似の形態学的および培養特性を示している。従つ
て、MA―4864はストレプトマイセス・ビリデイ
フアシエンスと称される。 ストレプトマイセス・ビリデイフアシエンス
MA―4864の形態学的および培養特性を以下の表
に示す。 形態学的性質：胞子体は、先端が往々にかぎ形
で、１―３のゆるやかなコイルの開環を伴う屈
曲した胞子連鎖を有する分枝した構造をなして
いる。胞子は長円形乃至円筒形であり、1.2μ
×1.7μ（970倍）である。胞子は電子顕微鏡下
で観察すると滑かな表面である。 （以下Ｖ＝栄養成育、Ａ＝気菌糸、SP＝可溶
性色素である） オートミル・寒天（ISP培地３） Ｖ：裏面―赤味を帯びた灰色がかつた茶色 Ａ：粉末状、白色の混つた灰色（3ig） SP：なし ツアペツク・ドツクス・寒天（スクロース・硝酸
塩・寒天） Ｖ：無色 Ａ：まばら、灰色を帯びた白色 卵アルブミン・寒天 Ｖ：裏面―灰色を帯びた黄褐色 Ａ：灰色と白色との混合色 SP：なし グリセリン・アスパラギン・寒天（ISP倍地５） Ｖ：裏面―赤味を帯びた黄褐色 Ａ：粉末状、灰色と白色との混合色 SP：なし 無機塩―でんぷん・寒天（ISP倍地４） Ｖ：裏面―赤味を帯びた灰色がかつた茶色 Ａ：粉末状、白色の混つた灰色（3ig） SP：なし イーストエキス―デキストロース＋塩寒天 Ｖ：裏面―赤味を帯びた黄褐色 Ａ：灰色と白色との混合色 SP：なし イーストエキス―麦芽エキス寒天（ISP倍地２） Ｖ：裏面―赤味を帯びた褐色 Ａ：粉末状、灰色（3ig）、白色でくまどり SP：なし ペプトン―鉄―イーストエキス寒天 Ｖ：黄褐色 Ａ：なし SP：なし メラニン：なし H₂S生成：なし 栄養チロシン寒天 Ｖ：黄褐色 Ａ：なし SP：培地が多少褐色に着色 チロシンの分解：陽性 栄養でんぷん寒天 Ｖ：黄褐色 Ａ：なし SP：なし でんぷんの加水分解―良好 栄養ゼラチン寒天 Ｖ：黄褐色 Ａ：なし SP：なし ゼラチンの液化―良好 脱脂牛乳寒天 Ｖ：黄褐色 Ａ：なし SP：非常に明るい褐色 カゼインの加水分解：陽性 リトマスミルク Ｖ：黄褐色成長リング Ａ：なし 凝固および（または）ペプトン化：ペプトン
化、アルカリ性となる。 炭素源の同化性 プリドハム・ゴトリーブ基本培地＋１％炭素源
＋＝成育；±＝成育貧弱もしくは疑わしい； −＝負の対照（炭素源なし）に比して成育しな
い グルコース ＋ アラビノース ＋ セルロース − フルクトース ＋ イノシトール − ラクトース − マルトース ＋ マンニツト − マンノース ± ラフイノース − ラムノース − スクロース ＋ キシロース ＋ 温度範囲（イーストエキス―デキストロース＋塩
寒天）： 28℃―胞子形成を伴う良好な成育 37℃―中程度の栄養成育 50℃―成育しない 酸素要求（イーストエキス―デキストロース＋塩
寒天穿剌培養）：好気性 他に指示のない限り、いずれも28℃で３週間後
に読み取つた示度。倍地のPHはいずれもほぼ中性
（6.8―7.2）。 カラーナンバー指示は「カラー・ハーモニー・
マニユアル」（Color Harmony Manual）、1958
年、第４版、イリノイ州、シカゴ、コンテナー・
コーポレーシヨン・オブ・アメリカ（Container
Corporation of America）による。 懸濁した栄養物を含む培地で醗酵を実施する場
合、抗生物質は主として過ブロス中に存在す
る。抗生物質は過ブロスから抗生物質を適切な
樹脂に吸着させ、溶離することによつて単離され
る。 懸濁した栄養物を含まない培地では、A73Aの
大部分は全体的に澄明な醗酵ブロス中に存在す
る。 本発明の抗生物質を得るための好適な方法は、
調節した条件のもとで微生物、ストレプトマイセ
ス・ビリデイフアシエンスMA―4864を懸濁した
栄養物を含む培地または懸濁した栄養物を実質的
に含まない澄明な培地で成育させ、そして過ブ
ロスを適切な樹脂に吸着させ次に溶離することで
ある。溶離液を濃縮し、濃縮液を酸性PHに調節し
次に水非混和性有機溶媒を加えて抽出する。溶媒
層をとり出し、真空蒸発させる。残渣を適切な極
性有機溶媒例えば酢酸エチルに再溶解し、非極性
有機溶媒例えばヘキサンに滴加する。生成した沈
殿物をシリカゲルでクロマトグラフを行うと抗生
物質A73Aが得られる。 抽出を水非混和性極性有機溶媒で実施する上記
方法において、この溶媒の代表的な例として、低
級アルカン酸のアルキルエステル例えばギ酸メチ
ル、ギ酸エチル、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸
ｎ―ブチル、酢酸イソブチル、プロピオン酸エチ
ル；ケトン例えばシクロヘキサノン；またはハロ
ゲン化低級炭化水素例えばクロロホルム、メチレ
ンクロライド、四塩化炭素、二塩化エチレン、１
―クロロ―２，２―ジメチルプロパン、テトラク
ロロエチレンおよびブロモホルム等を挙げること
ができる。 醗酵ブロスから単離された抗生物質A73Aは表
面活性な吸着剤に吸着、クロマトグラフイーで精
製される。適当な表面活性な吸着剤はジビニルベ
ンゼンで架橋結合されたポリスチレンの疎水性非
イオン性巨大多孔性共重合体であり、このものは
ローム・アンド・ハース（Rohm and Haas）社
から商品名アンバーライト（Amberlite）XAD―
１からXAD―12までとして知られている。A73A
精製に好ましい樹脂はXAD―２である。吸着さ
れたA73Aを溶出するのに適当な溶媒はアセトン
の水溶液および低級アルカノールの水性有機溶媒
溶液例えばメタノール、エタノール、イソプロパ
ノール、ブタノール等の水溶液である。XAD―
２樹脂からA73Aを溶出するための好ましい溶媒
は75％アセトンの水溶液である。更に精製するた
めに、シリカゲルが適当な表面活性な吸着剤であ
る。 ストレプトマイセス・ビリデイフアシエンス
MA―4864はA73Aの生産に使用し得る微生物の
菌株のタイプを単に例示するものであり、本発明
はこれらの特別な記載に適合した微生物に限定さ
れるものではないことは言うまでもない。本発明
は、その他の微生物の使用を包含し、これらの微
生物には自然界から単離されるかまたは突然変異
で得られる放線菌の菌株、例えば自然淘汰で得ら
れる菌株または突然変異剤例えばＸ線照射、紫外
線照射、ナイトロジエンマスタード等で生産され
る菌株が包含されるこれらの菌株は適当な条件下
でA73Aを生産し得るものである。 A73Aは、微生物ストレプトマイセス・ビリデ
イフアシエンスMA―4864の接種を経て、調節さ
れた条件下に適当な水性栄養培地で好気醗酵を行
う過程で生産される。水性培地例えば他の抗生物
質の生産に使用される培地が抗生物質A73Aの生
産に適している。このような培地は微生物に同化
可能な炭素、窒素および無機塩の供給源を含有し
ている。培地の選定は限定的なものではなく、醗
酵は懸濁した栄養物を含む培地または培地が懸濁
した栄養物を実質的に含んでいない全体的に澄明
な培地で実施することができる。 一般に、炭水化物、例えばデキストロース、グ
ルコース、アラビノース、マルトース、ラフイノ
ース、キシロース、マンニトール等の糖類およ
び、例えば大麦、ライ麦、コーンスターチ、ばれ
いしよ等の穀類等のでんぷん類を単独あるいは組
合せて栄養培地での同化炭素源として使用し得
る。培地で利用する炭水化物源の正確な量はある
程度は培地その他の成分で左右されるが、一般に
は炭水化物の量は通常培地の約１〜６重量％に変
化し得る。これらの炭素源は個別に使用し得る
が、これらの炭素源をいくつか培地で組合せても
よい。一般に、数多くの蛋白質性材料を醗酵プロ
セスでの窒素源として使用し得る。適当な窒素源
には例えば栄養ブロス、イーストエキス、イース
ト加水分解物、酵母そのもの、大豆粉、綿実粉、
カゼイン加水分解物、コーン・ステイープ・リカ
ー（corn steep liquor）、ジスチラーゼ・ソリユ
ブルズ（distiller′s solubles）またはトマトペー
ストが包含される。窒素源は単独または組合せて
水性培地の約0.2〜６重量％の範囲の量で使用さ
れる。 実施例に記載の培地は使用し得る種々の培地の
単なる例示であり、制限を企図しているものでは
ない。 醗酵は約20〜37℃の範囲の温度で実施される。
しかし、醗酵を約24〜32℃の温度で実施するのが
最適の結果を得るのに好適である。ストレプトマ
イセス・ビリデイフアシエンスMA―4864培養物
を成育させ、抗生物質A73Aを生産するのに適し
た栄養培地のPHは約6.0〜8.0の範囲である。 抗生物質の小規模醗酵は、適当な栄養培地に抗
生物質生産性培養物を接種し、次に生産培地に移
した後、醗酵を数日間振盪機で約28℃の恒温で進
行させることによつて好都合に実施される。培養
期間が終ると、醗酵ブロスを過し、抗生物質を
適切な樹脂に吸着させ、溶離させる。 小規模な醗酵は滅菌フラスコ内で１段階、２段
階、３段階または４段階の種発育を経て実施せし
める。種段階のための栄養培地は炭素源および窒
素源の任意の適当な組合せであつてもよい。種フ
ラスコを１〜２日間の間約28℃で恒温室中で振盪
し、得られた成育物の若干量を使用して第２段階
種培地または生産培地に接種する。中間段階種フ
ラスコを用いる時は本質的に同じ方法で生育させ
る。すなわち、フラスコの内容物の一部を生産培
地に接種するのに使用する。接種したフラスコを
数日間恒温で振盪し、培養期間の終了後、抗生物
質A73Aを先に述べたようにして単離する。 大規模な生産には、撹拌機および醗酵培地に通
気する手段を備えた適当なタンクで醗酵を行うの
が好ましい。この方式によれば、栄養培地をタン
ク内で調製し、約120℃までの温度に加熱して滅
菌する。冷却して、滅菌培地に生産培養物の予め
成育させた種を接種し、それから栄養培地をかく
はんおよび（または）通気しかつ約28℃の温度に
維持しながら例えば２―４日間の如く数日の間醗
酵を進行せしめる。A73Aの収量は一般にはバイ
オアツセー（bioassay）で検定して生産ブロス１
当り20mg〜200mgである。 物理的性質 抗生物質A73Aは薄層クロマトグラフイー
（CH₂Cl₂，CH₃OH，濃NH₄OH；90：10：５）で
精製すると無定形の若干潮解性の黄色粉末とな
る。元素分析値、C₄₄H₆₂N₂O₁₀に対する計算値と
しては、Ｃ，67.84；Ｈ，8.02；Ｎ，3.60および実
験値としては、Ｃ，67.05；Ｈ，8.11；Ｎ，3.39で
あつた。トリメチルシリル誘導体の質量スペクト
ルはｍ／e1210（M⁺）に至るピークを示し、これ
はC₄₄H₆₂N₂O₁₀、分子量778のヘキサトリメチル
シリル誘導体に一致する。スペクトルは本出願人
の米国特許第4264607号に記載の関連抗生物質
A40Aと本質的に同一の断片パターンを示す。 抗生物質A73Aの構造は次のとおりである。 上記構造において、ピランはその不整中心にお
いて次の立体配置を有している。すなわち、ヘミ
ケタール２でＳ、水酸基炭素４でＲ、そしてペン
タジエニル側鎖担有炭素６でＳである。 上記溶媒系で薄層クロマトグラフイーをくりか
えすとA73Aが２種の接近して流れるバンドに分
別される。すなわち、Ｒ_f0.25、A73A₁およびＲ_f
0.30、A73A₂である。両者共に上記分子量に一致
するフイールド吸収マススペクトルを示す。これ
らの赤外スペクトルは実質的に同一であるが、こ
の２種の¹H NMRスペクトルは脂肪族領域で顕著
な差異を示す。A₁およびA₂の塩基接触作用によ
る相互変換はNMRで実証することができる。ス
ペクトルデータを、アミドカルボニル基に隣接す
るエチル担有メチンにおいて立体化学の相互変換
の見地から解析する。第１図の部分構造に対する
データを第表に示す。スペクトルはCD₃OD溶
液で得られたものであり、化学シフトは括弧内に
示したカツプリング定数と共にテトラメチルシラ
ンを基準にとつた低磁場側のピークの相対位置を
ppmで表示した。抗生物質A40Aは水酸基担有メ
チンＣ―４においてその立体化学が２種のA73A
と異つている。A40A部分構造に対する¹H NMR
データも比較のために第表に示す。

【表】 抗生物質活性の検定操作 アツセーは0.95cm（3/8インチ）紙デイスク
―プレート方法で行う。アツセープレートはPH
6.0に緩衝化したデイフコ（Difco）ブレイン・ハ
ート・インフユージヨン寒天を寒天10ml／プレー
トで用いて調製する。検定菌、バチルス・サーキ
ユランス（Bacillus circulans）（MB264）の胞子
懸濁液を無菌生理食塩水で希釈して波長660ｍμ
で透過率45％を有する懸濁液とする。この懸濁液
を、プレートに注加する前の寒天培地に寒天培地
１当り33.3mlで加える。 アツセープレートを使用するまで（最高５日）
４℃に保持する。抗生物質飽和アツセーデイスク
を適用した後、プレートを16―24時間28℃で培養
する。阻止域をmm直径で読み取る。これらの阻止
域を相対力価の測定、即ち精製参考標準品と比較
した場合μｇ／mlでの力価の測定に使用する。醗
酵ブロス、菌糸および醗酵ブロスから分離した懸
濁栄養物中また固形分を含まないブロス中の
A73AのアツセーをA73Aを適当な溶媒中に抽出
した後に行う。0.95cm（3/8インチ）デイスクを
用いてA73A200μｇ／mlを含む溶液のアツセー
では阻止域16mmを示す。このアツセーを定量方式
で行つた場合、抗生物質100―200μｇ／mlが検出
される。 A73Aはグラム陽性菌に対して活性を示すが、
グラム陰性菌に対して限られた活性しか示さな
い。試験管内で、A73Aはサルチナ・ルテア
（Sarcina lutea）（ATCC9341）、ストレプトコツ
カス・フエシウム（Streptococcus faecium）
（MB2820）およびストレプトコツカス・アガラ
クテイエ（Streptococcus agalactiae）
（MB2875）に対して有効である。また、ビブリ
オ・ペルコランス（Vibrio percolans）
（ATCC8461）、クレブシエラ・ニユーモニエ
（Klebsiella pneumoniae）（MB1264）、キサント
モナス・ヴエシカトリア（Xanthomonas
vesicatoria）（MB815）、バチルス・スブテイリ
ス（Bacillus subtilis）（ATCC6633）およびアル
カリゲネス・フエカリス（Alcaligenes
faecalis）（ATCC213）に対しても活性がみられ
る。 A73Aは抗生物質としてまた動物の発育促進剤
として有用である。 A73Aを抗生物質として使用する場合、動物に
投与するのに使用される特定の手段は限定的であ
り、感染動物または感染症にかかりやすい動物の
処置に対しては現在使用されているかまたは利用
し得る方法のうちのいくつかのみが好都合であ
る。 A73Aは例えば製薬製剤の形態で抗生物質とし
て使用することができ、これらの製剤は経腸、非
経口または局所適用に達した無機または有機、固
体また液体製薬賦形剤と混和または一緒にA73A
を含有している。適当な賦形剤としては、抗生物
質と反応しない物質、例えば、水、ゼラチン、乳
糖、でんぷん、ステアリルアルコール、ステアリ
ン酸マグネシウム、タルク、植物油、ベンジルア
ルコール、ガム、プロピレレングリコール、ポリ
アルキレングリコール、白色ワセリン、コレステ
ロールまたはその他の医薬用賦形剤があげられ
る。製薬製剤は例えば錠剤、糖衣錠、軟膏、クリ
ームまたはカプセル剤あるいは液状形態溶液、懸
濁液または乳剤であつてよい。これらの製剤は滅
菌されていてもよく、かつ（または）補助剤例え
ば防腐剤、安定剤、湿潤剤または乳化剤；溶解促
進剤、滲透圧調整のための塩または緩衝剤を含有
していてもよい。 抗生物質を乾燥固形単一投与量形態で投与する
ことが所望される場合、所望量の抗生物質を含有
するカプセル剤、丸剤また錠剤を使用する。これ
らの投与量形態は活性成分を適当な微粉砕希釈
剤、充てん剤、分散剤および（または）結合剤例
えばでんぷん、乳糖、タルク、ステアリン酸マグ
ネシウム、植物性ガム等と緊密かつ均一に混和し
て調製する。このような単一投与量処方はその全
重量およびA73Aの含量に関し例えば処置すべき
宿主動物、感染症の程度およびタイプおよび宿主
の体重のような要素に基いて大巾に変えることが
できる。抗生物質は一日基準で約５―100mg／体
重Kgで投与することができる。 本発明にはA73Aの無毒性製薬上許容し得る
塩、例えばアルカリおよびアルカリ土類金属塩例
えばナトリウム、カリウム、およびカルシウムか
ら誘導される塩、アンモニウム塩または有機塩基
例えばトリエチルアミン、Ｎ―エチルピペリジ
ン、ジベンジルエチレンジアミンとの塩も包含さ
れる。 抗生物質としての用途に加えて、A73Aは動物
例えばひな、羊、および牛の発育を可能とする飼
料添加物として有用である。A73Aの使用により
動物を成育せしめ市販し得る体重とするのに必要
な時間が短縮される。 A73Aを動物の発育促進剤として使用する際
は、動物の飼料の成分として投与することができ
るし、また飲料水に懸濁させてもよい。 A73Aを動物飼料の成分として使用する場合は
まず飼料補助剤として処方する。このような飼料
補助剤では、A73Aは不活性担体もしくは希釈剤
に均質に分散された比較的濃厚な量で存在してい
る。飼料補助剤を飼料に添加するかまたは中間希
釈もしくは配合工程でプレミツクスとすることが
できる。不活性担体とは抗生物質と反応せず、か
つ動物に安全に投与し得るものを意味する。好ま
しくは、担体は動物飼料の成分であるかまたは成
分になり得るものである。この組成物に適した代
表的な担体または希釈剤としては、例えばジスチ
ラーズ・ドライド・グレイン（distillers’
dried grains）、コーンミール、かんきつミー
ル、醗酵残渣、粉砕かき殻、小麦シヨーツ
（wheat shorts）、糖密可溶分、とうもろこし穂
軸ミール、食用豆粉飼料、あらびき大豆、粉砕石
灰石等を挙げることができる。抗生物質は例えば
粉砕、撹拌、製粉、混転などの方法によつて担体
全体に均質に分散させる。抗生物質約５―50重量
％を含む組成物が飼料補助剤として特に適当であ
る。 固体担体に分散されたA73Aを含む代表的な飼
料補助剤の例は次のとおりである。 Kg (A) A73A 2.3（５ポンド） 小麦標準粗粉 43.1（95ポンド） (B) A73A 23（50ポンド） コーン・ジスチラーズ・グレインズ（corn
distiller’ｓ grains） 23（50ポンド） これらの飼料補助剤および類似のものは抗生物
質を担体と均一に混和することによつて調製され
る。 飼料補助剤は飼料に直接添加することができる
し、また経口摂取可能な担体との中間希釈もしく
は配合工程によりプレミツクスとすることができ
る。抗生物質を0.03―５重量％含有する組成物が
プレミツクスとして特に適当である。これらのプ
レミツクスは抗生物質を経口摂取し得る担体と均
一に混和することによつて調製される。 このような補助剤またはプレミツクスは発育促
進に所望されるA73Aの濃度が最終飼料に付与さ
れ量で動物飼料に添加される。ひなでは、A73A
を所望の発育促進結果を達成するために飼料１ト
ン当り10―100ppmの最終濃度で供給する。子豚
の場合、マイコプラズマ・ヒオルヒニス
（Mycoplasma hyorhinis）（PPLO）に感染した
子豚を含めてA73Aは同じ濃度レベルで飼料によ
り投与してよい。 本発明について前述したように、A73Aを飼料
補助剤、所謂プレミツクスまた最終飼料において
食用担体と混和した固形組成物に特に重きをおい
てきた。これがA73Aを投与する好適な方法であ
るからである。代替方法は動物の飲料水にA73A
を懸濁させることである。好ましくない沈殿を起
さずに水に懸濁し得る量は制約される。沈殿を起
さないようにするためには乳化剤または界面活性
剤を使用してもよい。 同じく、A73Aを含む特定の飼料補助剤処方物
および最終動物飼料はビタミン類、その他の抗生
物質および発育促進剤ならびにその他の栄養物質
をも包含し得る。このことは当業者ならば理解し
得る。 A73Aは５―100mg／Kgの範囲で家禽PPLOに対
して有効である。単一適用量の好ましい範囲は35
―45mg／Kgである。便宜上、PPLOの処置に抗生
物質を投与するための好適な方法はA73Aを動物
飼料と混和することである。PPLOのための好適
な範囲は飼料の0.0055―0.02重量％である。 次に実施例をあげて本発明の生産物を得る方法
を具体的に説明する。本発明の方法は種々の変
化、変形が可能であり、それ故適宜の多少の逸脱
および拡張は当業者の技術範囲内にあり、また本
発明の範囲内にあるものとみなされる。 実施例 １ 振盪フラスコ醗酵 次の組成を有するMA―4864を含む斜面培地の
一部を用いて以下の組成を有するKW種培地50ml
の入つたじやま板つき250ml三角フラスコに接種
する。 ペプトン 5.0ｇ グルコース 10.0ｇ 肉エキス 5.0ｇ NaCl 3.0ｇ 寒 天 15.0ｇ 蒸留水 1000 ml PH 7.0 培地KW デキストロース 20.0ｇ バクト（Bacto）ペプトン 5.0ｇ デイフコ・ミート・エキス 5.0ｇ NaCl 5.0ｇ 酵母そのもの 3.0ｇ 蒸留水 1000 ml PH 7.0 次にCaCO₃ 3.0ｇ 上記フラスコを28℃で３日間220rpm振盪機
〔偏心距離５cm（２インチ）〕を用いて振盪する。
この種フラスコからの成育物を用いて３個の別々
の250ml三角フラスコに接種体２ml／フラスコ
（５％）を用いて接種する。各フラスコには培地
KH，JHおよびJTが40mlそれぞれ入つている。 培地KH トマトペースト 20.0ｇ 酵母そのもの 10.0ｇ CPC工業用変性でんぷん 20.0ｇ CoCl₂・6H₂O 5.0ｇ 蒸留水 1000ml NaOHでPH7.2―7.4 培地JH コーンミール 20.0 ｇ ジスチラーズ・ソリユブルズ 10.0 ｇ 大豆粉 15.0 ｇ クエン酸ナトリウム 4.0 ｇ CaCl₂・2H₂O 0.5 ｇ MgSo₄・7H₂O 0.1 ｇ CoCl₂・6H₂O 0.01ｇ FeSO₄・7H₂O 0.01ｇ ポリグリコールＰ―2000 2.5 ml 蒸留水 1000 ml PH 6.5 培地JT トマトペースト 20.0ｇ 酵母そのもの 5.0ｇ グリセリン 20.0ｇ NaCl 2.5ｇ 蒸留水 1000 ml NaOHでPH 7.2 これらのフラスコを28℃で96時間220rpm振盪
機〔偏心距離５cm（２インチ）〕で振盪する。ア
ツセイによれば、試験管内でE.コリ（E.coli）お
よびB.スブチリス（B.subtilis）に対して抗菌活
性を示した。 実施例 ２ MA―4864の凍結乾燥品の取り扱い操作 凍結乾燥管中のS.ビリデイフアシエンスを、追
加の凍結乾燥品の調製のためまたは大規模生産の
接種体に成育させるために、次のように処理す
る。 １ 凍結乾燥管からのペレツトを0.85％食塩水
1.0mlに懸濁する。 ２ この懸濁液0.2mlを用いて次の組成の斜面培
地４本のそれぞれに接種する。 アルダミン（Ardamine）（自己分解イース
ト） 10.0ｇｍ グルコース 10.0ｇｍ MgSO₄・7H₂O ．05ｇｍ 寒 天 20.0ｇｍ 蒸留水 1liter PHを6.5―6.8に調節 ３ 斜面培地を胞子形成が十分となるまで28℃で
培養する。 ４ ４本の斜面培地からの成育物をBBLスキム・
ミルク・パウダーで調製した15％滅菌スキム・
ミルク溶液５mlに懸濁する。 ５ 懸濁液0.15ml秤取量を凍結乾燥アンプルに入
れ、次に凍結乾燥する。 実施例 ３ 抗生物質A73Aの生産 実施例２、工程４の如くにして製造した凍結乾
燥品の内容物を用いて培地KE50mlの入つた250ml
じやま板つき三角フラスコに接種する。フラスコ
を、220rpm回転振盪機で振盪しながら、28℃で
48時間培養する。 24時間後、上記フラスコからの10ml試料を培地
KE500mlの入つた２じやま板つき三角フラスコ
に加える。この２フラスコを150rpm回転振盪
機で28℃72時間培養する。 72時間後、２フラスコからのブロス500mlを
次の組成を有する培地KE160の入つた189容
量のステンレス鋼培養タンクに加える。 培地KE デキストロース（グルコース） 160 ｇｍ でんぷん変性CPC 1600 ｇｍ 肉エキス 480 ｇｍ アルダミンPH 800 ｇｍ NZアミンタイプＥ 800 ｇｍ 硫酸マグネシウム―MgSO₄・7H₂O ８ ｇｍ 第一リン酸カリウム―KH₂PO₄ 29.1ｇｍ 第二リン酸ナトリウム―Na₂HPO₄ 30.4ｇｍ 容 量 160 liters NaOHを用いてPH7.0―7.2とする。 炭酸カルシウム―CaCO₃を加える 80 ｇｍ ステンレス鋼培養タンクを48時間通気量0.085
m³／分〔３立方フイート／分（cfm）〕およびか
くはん速度150rpmを用いて28℃の温度で運転す
る。ブロスの培養状況は次のとおりである。 経時（時間） ０ 24 48 PH 7.2 6.7 7.7 24時間後、上記ステンレス鋼培養タンクからの
43を次の組成を有する培地KH467の入つた
756容量のステンレス鋼培養タンクに入れる。 培地KH トマトペースト 9.34Kg（20.6lbs） 酵母そのもの 4.67Kg（10.3lbs） 変性でんぷんCPC 9.34Kg（20.6lbs） 塩化コバルト―CoCl₂・6H₂O 2.3ｇｍ ポリグリコール2000 150 ml 容 量 467liters NaOHを用いてPH7.2―7.4とする。 培養タンクを28℃の温度で96時間通気量0.28
m³／分（10cfm）およびかくはん速度130rpmを
用いて運転する。培養タンクに0.1％を超えない
ポリグリコール2000を加える。 培養状況は次のとおりである。

【表】 ブロス全体（16）を室温でPH6.7からPH9.0に
調節する。ブロス全量を予めセライトで板を作
つたブフナー（Buchner）漏斗で過する。過
ブロスを20分の接触時間でXAD―２の１に吸
着させる（カラムの寸法は内径４cm×長さ80cmで
ある）。次に、カラムを１カラム分の容量の脱イ
オン水で洗う。活性分を75％アセトンと25％脱イ
オン水の混合物2.0で溶離する。溶離液を30℃
で減圧濃縮し625mlにする。PHを7.2から4.0に調
節し、酢酸エチル625mlで２回抽出する。抽出液
を合し、30℃で真空蒸発させると油状残渣が得ら
れる。残渣を酢酸エチル100mlに再溶解し、この
溶液をはげしくかくはんしながらヘキサン500ml
に滴加する。生成した黄色沈殿を調製用TLCプ
レート（シリカゲル）でクロマトグラフを行うと
純粋なA73Aが得られる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 構造式 （式中、ピランはその不整中心において次の立
   体配置を有する。すなわちヘミケタール２におい
   てＳ、水酸基担有炭素４においてＲそしてペンタ
   ジエニル側鎖担有炭素６においてＳ）を有する化
   合物A73Aまたはその製薬上許容し得る塩もしく
   はエステル。 ２ 同化可能な炭水化物源、窒素源および無機塩
   源を含有する醗酵ブロスで好気条件下にストレプ
   トマイセス・ビリデイフアシエンスのA73A生産
   菌株を醗酵ブロス中に実質的な量のA73Aが生産
   されるまで培養し、そして該抗生物質を採取する
   ことを特徴とするA73Aの製造方法。 ３ ストレプトマイセス・ビリデイフアシエンス
   がストレプトマイセス・ビリデイフアシエンス
   （Streptomyces viridifaciens）MA―4864
   〔ATCC31495（微工研菌寄第5245号）〕と指定さ
   れている特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４ 醗酵ブロスを過し、過ブロスを水非混和
   性極性有機溶媒で抽出する特許請求の範囲第２項
   記載の方法。 ５ 抽出溶媒がギ酸メチル、ギ酸エチル、酢酸メ
   チル、酢酸エチル、酢酸ｎ―ブチル、酢酸イソブ
   チル、プロピオン酸エチル、メチルエチルケト
   ン、シクロヘキサノン、クロロホルム、メチレン
   クロライド、四塩化炭素、二塩化エチレン、１―
   クロロ―２，２―ジメチルプロパン、テトラクロ
   ロエチレン、ブロモホルムおよびｎ―ブタノール
   からなる群から選択される特許請求の範囲第４項
   記載の方法。 ６ 抗菌的に有効な量のA73Aまたはその製薬上
   許容し得る塩および主にブロス中に存在する無毒
   性の製薬上許容し得る賦形剤よりなる組成物。 ７ 発育促進量のA73Aまたはその製薬上許容し
   得る塩および不活性担体からなる動物発育促進に
   有用な組成物。