JPS6188137A - 化学種の水性電解溶液中濃度の定量法及び定量装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、化学的分析法、更に詳しくはイオン透過性脂
質膜の使用による化学種の水性電解液中濃度の定量に関
する。

イオン透過性脂質膜は生化学分野及び化学分野において
周知である。これらの脂質膜は本来は複雑な生物膜、例
えば生命の基本的要素であるダブルユニット細胞膜（ａ
ｏｕｂｌｅ　ｕｎｉｔ　ｃｅｌｌｍｅｍｂｒａｎｅｓ）
及び内部細胞構造を人工的に構造すべく開発されたもの
である。一般に、これらは対称に、しかし対向して配向
された全厚が約６〜８ｎｍの２つの隣接する脂質単層か
ら成る二重層脂質膜（ｂｉｌａｙｅｒｌｉｐｉｄ　ｍｅ
ｍｂｒａｎｅ　：　ＢＬＭ）である。化学的には、その
構造として、非極性炭化水素の中央領域を有し、その両
側に脂質の頭部基の極性シー）　（ｐｏｌａｒｓｈｅｅ
ｔｓ）　　を結合している。これらのイオン透過性脂質
膜は支持用水性電解液中で形成され、かつ維持され、そ
のため脂質の頭部基は水和されている。水中の非極性領
域は疎水性引力でその膜構造を一体に保持している。こ
れらの脂質膜は安定剤を添合すべく化学的に変性するこ
とができる。単層の脂質膜も公知であるが、これらは余
シ一般的には作られても、使用されてもいない。これら
は水中で球形配置を取るか、又はその基質−水界面にお
いて他の基質を被覆してしまう傾向があるのである。二
重層脂質膜の製造と性質については教科会及び文献に詳
しく述べられている。例えば、マーセル・デツカ−社（
ＭａｒｃｅＩＤｅｋｋｅｒ、Ｊｎｃ、）にュー・ヨーク
）から１９７４年に刊行されたＨ、Ｔｉ　Ｔｉｅｎ署”
Ｂ１１ａｙｅｒ　Ｌｉｐｉｄ　Ｍｅｍｂｒａｎｃｅｓ（
ＢＬＭ）Ｔｈｅｏｒｙ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ’を
参照されたい。

二重層脂質膜構造体を横断して直流電位を印加すると、
膜を通して小さいが、一定のイオン電流が流れる。安定
なりＬＭについての典形的なイオン電流−電圧曲線は約
−６０〜＋６０　ｍＶの範囲にわたって抵抗応答を有し
、そのときイオン電流は５０　ｍＶにおいて１Ｏ−９Ａ
／ｃｍ２のオーダーである。

本発明は定常透膜イオン束（ｓｔａｎａｉｎｇｔｒａｎ
ｓｍｅｍｂｒａｎｅｉｏｎ　ｆｌｕＸ）を変える分子あ
るいは複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）の添合及びそれらとの
膜の相互作用は分析可能信号を発生させるという事実に
基づく。結合現象を透膜イオン束に置き換える。即ち膜
のコンダクタンスを変える膜結合リセプター／ステイミ
ュラン）　（ｓｔｉｍｕｌａｎｔ）即ち刺激剤の相互作
用をそのステイミュラントの感応性及び選択性電気化学
的センサーとして利用するのである。

本発明によれば、水性電解液に浸漬されているイオン透
過性脂質膜の諸パラメーターの試験下にある化学種の存
在によって引き起こされる変化を測定することによって
それら化学種の存在が感知され、かつそれらの濃度が示
される。更に詳しくは、化学種（ステイミュラント）に
よって引き起こされる膜のパラメーターの変化が膜のイ
オン城電率を変化させるのである。化学種の濃度を定量
するために、透膜イオン運動のだめの駆動力を適用する
ことによって変化している導電率を直接測定することが
できる。試験下の化学種は膜上に、又は膜中に配置され
た、膜のイオン導電率を変化させる複合化剤（リセプタ
ー）によシ選択的な化学的複合化を受ける。かくして、
本発明の方法は複合化反応の生起、生成物の形成濃度測
定あるいは選択的反応の二次生成物の同様の測定にはよ
らないものである。本発明の方法は信号の発生について
一次あるいは主たる複合化現象を利用するものであって
、この結果感度が上が９、応答時間が速まシ、検出限界
が低くなシ、規模が小さくなり、そして機能上の耐用年
数が潜在的に長くなると言う利点が得られる。

本発明によれば、ある選ばれた化学種の水性電解溶液中
濃度を定量又は半定量する方法が提供される。本発明の
方法は、イオン伝導性支持体に付着され、かつ化学種と
選択的に相互作用して透膜イオン運動を増進する複合化
剤を添合することによって変性された脂質膜から、及び
それら化学種を含有する水性電解溶液から電気化学セル
を形成することを含む。この変性された膜にはこれを横
断して電位差が印加され、それによってそれら化学種は
膜添合複合化剤と相互作用して透膜イオン運動に基づく
分析信号を発生させるようになる。

この分析信号を測定し、その測定された分析信号から化
学種の濃度を定量する。

本発明によればまた、透膜イオン運動に感応する支持さ
れた、膜ベースの、即ち膜を具有する装置が提供される
。この装置はある選ばれた化学種と選択的に相互作用し
て透膜イオン運動を増進する複合化剤の添合によって変
性された脂質膜が付着されているイオン伝導性の支持体
を含む。

本発明はイオン透過性脂質膜のイオン透過度／導電率の
変化を利用するもので、それらの変化は試験種又はステ
イミュ２ントとの複合化によって引き起こされる。本発
明の方法における使用にとってＢＬＭは天然産で、安定
な膜をもたらし、かつＢＬＭが浸漬される電解液のｐＨ
が中性のとき有効電荷（ｎθｔ　ｃｈａｒｇｅ）がない
膜を与える脂質から調製するのが好ましい。

本発明において使用するＢＬＭの形成に適した脂質とし
ては、リン脂質類、例えばホスファチジン酸、ジホスフ
ァチジルグリセロール、ホスファチジルグリセロール、
ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミ
ン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトー
ル及びモノ−又はジ−バルミトイル、モノ−又はジ−ミ
リストイル、モノ−又はゾーンイタノイル、モノ−又は
ジ−ステアロイル及びモノ−又はジ−オレオイルのよう
なアシル鎖を持つホスファチジル化合物；シフインゴ脂
質類（ｓｙｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄ）、例えばセラミド
類及びセレブロシド類；糖脂質類、例えばモノ−又はジ
ーガラクトシルジクリセリビ；並びに他の脂質又は脂質
同族体、例えばグリセロールモノ−オレエート、酸化コ
レステロール及ヒ卵−ホスファチジルコリンが挙げられ
る。

これら化合物の化学的組成及び長さに関して、その疎水
鎖部は、適当な膜安定性及び疎水ゾーンについて適当な
厚さを得る目的で選択されなければならない。本発明の
方法において、疎水ゾーンはイオン流、即ち導電率の１
つの障壁又は変調器として作用するから、疎水ゾーンの
適切な厚さはある程度分析プロセスで測定されるべき最
低電流に左右される。普通、疎水ゾーンは約４．０〜約
７、Ｏｎｍの厚さを持つ。これは、好ましくは、脂質の
頭部基土の鎖長としてＣＩ４〜Ｃ２４のアシル鎖、例え
ば約Ｃ１８の鎖長を持つ卵ホスファチジルコリンで与え
られる。

添附図面の第１図を参照して説明すると、常用の二重層
脂質膜は極性のある親水性の脂質頭部１０．１２と疎水
性の有機尾部１４．１６を有する分子から成る。これら
分子は自から水性電解液中で二重層配置で、有機相領域
１８を形成するようにそれら疎水性尾部を隣接させ、ま
た２つの分離された水性相領域２０．２２を形成するよ
うにそれら親水性脂質頭部を分離させて配列している。

実際、有機相１８はイオンの膜通過に対して１つの障壁
として作用する。膜のコンダクタンス特性はかくして有
機相１８の性質と組成を変えることによって変えること
ができる。これは分子の有機尾部１４．１６を化学的に
変性することによって行うことができる。

例えば、疎水鎖１４．１６に極性基を含めると、疎水鎖
部に相互静電折力をもたらし、拡開効果を引き起こして
その密度を下げ、従ってまたイオンの通過に対して有機
相１８の透過性を高める。同時に、有機相１８に極性化
学基が存在すると、その中にエネルギーが低い、そして
イオン性試験種が比較的容易に動き得るゾーンができる
。更に、有機相１８中の極性基は結合サイトとしても作
用し、イオン性の試験種を引き付け、それらを有機層中
に保持することもでき、そのためその全極性が犬きくな
シ、従ってまたイオン流に対するそのコンダクタンスが
高まる。この高くなったコンダクタンスはイオンの濃度
測定に対して膜の感度を上げる効果を持つ。

脂質の頭部基１０．１２の“充填密度１をコントロール
すれば、イオンの透過度、従ってＥＬＭのコンダクタン
スもまた調整することができるようになる。これはＢＬ
Ｍにステロイド、例えばコレステロールのような分子が
個々の頭部基１０．１２間に介在する安定剤物質を添合
することで達成することができる。このような物質はＢ
ＬＭの有機相１８と相溶性がある分子鎖を持ち、そのた
めそれら物質は有機相と、頭部基とＢＬＭの頭部基１０
，１２間に介在させて整列する。ＢＬＭ　としての使用
にホスファチジルコリンを選ぶ場合、色々な酸化された
コレステロール種が脂質の頭部基の充填密度を下げる目
的でＢＬＭに添合するのが好ましい。この安定剤の添合
はそれをＥＬＭ調整成分中に含めることによって達成す
ることができる。ホス７アチジルコリンの疎水鎖１４．
１６は炭素−炭素不飽和を含有していてもよく、その不
飽和は疏水鎖の中に極性基を導入する化学的変性のため
のサイトとなる。これらの方法を組み合せることによっ
て、ＢＬＭ透過度とイオンコンダクタンスを調整、制御
して試験種（ステイミュラント）−リセプター反応のＢ
ＬＭのイオンコンダクタンスに対する効果を可能なかぎ
り顕著なものにすることができる。ＢＬＭ　コンダクタ
ンスは選択されたステイミュラントーリセプターの対に
応じて色々なレベルに調整することもできる。

有機化合物が測定されるべき試験種である場合、本発明
で用いられるＢＬＭはステイミュラント（試験種）との
ＢＬＭ上又はＢＬＭ中での、そのイオン透過度を変化さ
せる反応のためのリセプターを含有している。リセプタ
ーは膜に物理的に埋入されていてもよいし、あるいは膜
に化学的に結合されていてもよい。永久的分析系又は装
置における使用には、リセプターは膜から簡単に抽出さ
れ得るようなものであってはならない。適切なリセプタ
ーを選択すると、特定の選ばれたステイミュランドの分
析に対し本発明の方法を高度に選択性なものにする。選
択されるリセプターは、分析が行われている、そして膜
を通る流れが膜のコンダクタンスとして測定されるべき
ものである電解液のイオンと感知できる程度には反応し
ないものであるのが好ましい。言い換えると、リセプタ
ーは有機ステイミュラントに対して選択性を持たなけれ
ばならない。リセプターはＢＬＭを調整する時点で電解
液中のＢＬＭ形成成分にそのリセプターを包含せしめる
ことによって、あるいはその膜に水溶液から吸着させる
ことによってＢＬＭに添合することができる。一般的に
は、リセプターは天然の生成物で特に生化学的又は生物
学的スティミュラントが測定されるべきとき、そうであ
る。

無機ステイミュラントを測定すべき場合、ＢＬＭを、適
当には、以下において検討されるように、複合化形態及
び／又はイオン形態にされた無機ステイミュラントの通
過に対して選択透過性にすることができる。このような
場合、試験中の実際のステイミュラント、即ち複合化イ
オン形態のステイミュラントに対する膜のコンダクタン
スが本発明の方法で測定される。

添附第２図はイオン種Ｍ”十が印加電位下でＢＬＭを通
して移動する機構を略図的に説明するものである。ＢＬ
Ｍ３は無機イオンＭｎ＋を含有する電解液８に浸漬され
ている。前記の脂質分子１に加えて、ＢＬＭ３は、更に
、頭部基層の密度及び透過度を変えるステロール、界面
活性剤又はポリマーのような膜構造変性剤２を含んでい
る。電気化学的測定用電極７例えばＡ　ｇ／Ａ　ｇ　Ｃ
ｌ参照電極が電解液８中、ＢＬＭ３　の両側に置かれて
いる。外部回路９はイオン駆動力を与え、かつ膜の電気
特性、例えばイオン電流、抵抗又はキャパシタンスを測
定する。

４の位置に示されているイオ／７ｉＭ　　　の場合、こ
れはそれ自体濃度の測定されるべきステイミュラノトで
ある。それは複合化により疎水性イオンを形成すること
によって膜３を通じて行われる。

この機構において、イオンＭｎ＋は疎水性種と複合体を
形成し、そのため極性イオ／Ｍ　　は非極性の内部膜構
造から遮蔽される。この結果、疎水性ゾーンへのイオン
注入に要するホルンエネルギー　（Ｂｏｒｎ　ｅｎｓｒ
ｇｙ）要件が低下する。形成された複合体は疎水性イオ
ンでちって、その膜を通る拡散はその表面電位又は双極
子ポテンシャル及び膜の流動度によシ著しい影響を受け
る。適当な複合化試剤の例として、イオン複合化性抗生
物質、例えばパリノマイシン及びノナクチン（ｎｏｎａ
ｃｔｉｎ）　；及びクラウンエーテル類がある。ある選
択された無機イオンＭｎ＋に対して極めて選択性である
複合化剤を選ぶことによって、その選択された無機イオ
ンＭｎ＋の電解液８中濃度はそのイオン流によって感知
された膜ＢＬＭの導電率の変化から定量することができ
る。リセプター又は複合化剤は、好ましくは関心のある
イオンに対して背景電解質に対するよシも少なくともｌ
Ｏ３Ｏ３上選択性でなければならず、その選択性の差が
イオン濃度の検出限界を決める。複合化剤は膜に外部か
ら供給することもできるし、あるいはＢ　Ｌ　Ｍの形成
成分に含めることもできる。それらはＢＬＭの表面に与
えてもよいし、その中央非極性領域の内国部分に埋入し
てもよいし、あるいは外部電解液に含めてもよい。多く
の場合、それらは無機イオンのための外側有機６被覆“
となり、ＢＬＭの非極性中央領域を通るイオンの輸送を
促進すると考えられる。

分析のための」り定を行う前に、既知量のイオン種Ｍｎ
＋と一定量の複合化剤（ＢＬＭ　に添合、飽和させるこ
とができる量で与えるのが好ましい）の存在下で膜のコ
ンダクタンスを測定することによって系を校正する。こ
の機構のイオン電流（無機若しくは有機、カチオン若し
くはアニオン）は固有の二重層双極子ポテンシャル又は
分子の充填特性を改変する任意の選択的相互作用によっ
てコントｏ−ルされ、また変えられる。

適当なイオン種及びイオン種に対する選択的複合化剤の
例にカリウムイオン−パリノマイシン及びアンモニウム
イオ／−ノナクチンがある。かくして、パリノマイシン
はナトリウムイオンＮａ＋に対してよりもに＋に対して
１０４以上大きい選択団を持つ。アンモニウムイオンー
グラミシジ／Ａはもう１つの適当な選択性削及びイオン
であるが、以下で検討される別の機構で作用するもので
ある。

第２図の５に示されるイオン種Ｍｎ＋は膜３の中のポリ
ペブタイド又は蛋白質のチャンネル５ａを通過して膜３
を移動する。チャンネル又は細孔５ａは２つの水性電解
溶液の隔室を結合している。

細孔の外面は一般に疎水性で、そのため非極性コアへの
添合が促進される。細孔の内面は極性で、イオンの輸送
を助ける。細孔は化学的なンセプター鍾である。このよ
うなイオン選択性リセプタ一種の適当な例は抗生物質の
アンホテリシンＢ及びグラミシジンＡ、Ｂ及びＣである
。このようにしてできだ細孔は多くの場合無機イオンに
対して極めて選択性で、イオンがイオン電流としてＢＬ
Ｍを直接通過することによって、本発明により無機イオ
ンステイミュラントの濃度を測定する際の使用に適した
イオン選択性の膜をもたらす。

適当なイオン種及びそれらに対する選択性細孔の例に前
記のアンモニウムイオ／−グラミシジンＡがある。この
後者の細孔系において、有機の選択性の化学的リセプタ
一種をＢＬＭにその表面において添合されている蛋白質
又はホリペプチドと最初会合させてもよい。この有機リ
セプターが試験種（ステイミュラント）に印加静電界の
影響下で結合すると、リセプターは細孔のコンホメーシ
ョン又は静電特性を変化させ、そのようになったときイ
オン選択性チャンネルの流路を開き、続いてイオン流が
流れるのを可能にする。従って、このステイミュラ／ト
ーレセプターの反応は細孔の機能を活性化し、ＢＬＭの
イオン流特性を変化させる。この糎ゲーティング丙機構
、即ち開閉機構（”ｇａｔｉｎｇ’　ｍｅｃｈａｎｉｓ
ｍ）により作用する化学種の特定の例にある種の酵素−
基質反応、例えばアセチルコリンエステラーゼ−アセチ
ルコリン、抗体−抗原補体及びオーキシンーリセプター
がある。

電解液中の非反応性輸送イオンによる通過流の測定から
得られる膜中の電導度変化の動きはかくして電解液中の
これら有機ステイミュラントの濃度を測定するのに用い
ることができる。

第２図の６に示されるイオン種Ｍｎ＋は拡散磯溝でＢＬ
Ｍ　を通って移動する。このイオン伝導は分子の流動性
／非極性コア及び頭部基領域の充填状況、及び静電位に
よって非常に大きな影響を受ける。イオン伝導は膜の流
動度を上げると向上する。

極性のイ・■及び極性基の炭化水素コアに導入は低エネ
ルギーの結合サイトを与え、ホルンエネルギー要件を下
げ、流動度を上げ、そして充填を少なくしてイオン伝導
を助ける。かくして、ＢＬＭ　中に酸化ステロールのよ
うな安定他剤物質が存在すると、また脂質の炭化水素尾
部鎖中に極性基が存在すると、これらの機構によってイ
オン伝導が影響を受ける。

この機構で作用するステイミュラントとリセプターの対
の特定の例にトリプシン−阻割剤及びコンカナバリンＡ
−サツカライドゝがある。

本発明による与えられたいかなるＢＬＭ分析法において
も前記機構の１つだけが用いられることが分かるだろう
。その選択はステイミュラントの性質、従ってオ目補的
に選ばれるリセプターの性質に基づく。当該方法で行わ
れる機構のタイプはＢＬＭの組成で決まる。

添附第３図を参照して説明すると、第３図は特に有機ス
テイミュラントを感知、測定するために本発明において
用いるＢＬＭ中のリセプター／ステイミュラント系を略
図的に説明するものである。

ＢＬＭ　　３はその中に、電解液中に存在する有機ステ
イミュラン）１２ａとの反応に対して選択性である適当
な化学的リセブタ−１１を埋入している。

リセプターとステイミュラントが反応すると、ＢＬＭ内
に複合体１３ａが形成され、複合体が形成されるとそれ
はその影響領域１４ａ内でＢＬＭ３のコンダクタンスを
変える。その結果、電解液内に存在するイオン種Ｍｎ＋
は複合体１３ａの形成前とは異なる速度、エネルギー等
でＢＬＭ３　通シ、領域１４ａを通って流れることがで
きるようになる。得られるＢＬＭのイオンコンダクタン
スにおける変化は形成された複合体１３ａの量に関係し
、それはまた電解液中のステイミュラント１２ａの濃度
の；−７〕数でもある。

二重層の頭部基ゾーン（吸着水を含む）中に固有の双極
子種が存在すると、頭部基ゾーンに静電界ができる。そ
れは有効双極子種の真整列（ｎｅｔ　ｏｌｉｇｎｍｅｎ
ｔ）に由来する。これはイオンが膜に入る容易さを一部
制御する静的状況である。選択複合化プロセスはこの静
的状況を攪乱するように計画することができる。例えば
頭部基の攪乱による真脂質双極子（ｎｅｔ　１ｉｐｉｄ
　ｄｉｐｏｌｅ）　の変質、静電界に対する初期リセプ
ター双極子の寄与の変質、ステイミュラントに基因する
複合化による双極子の導入、又はリセプター／ステイミ
ュラント複合体中に存在する双極子の再繋列に基因する
双極子の導入である。分子の充填密度を下げて膜のイオ
ン透過度を高めるステイミュラントーリセプターの複合
化の結果得られる分析信号はこのプロセスを双極子ポテ
ンシャルの低下と結び付けることによって増幅させるこ
とができる。

この機構で作用するステイミュラントとリセプターの対
の幾つかの例を挙げると、コンカナバリンＡ−サツカラ
イド９、コンカナバリンＡ−サツカライドゝ−ノナクチ
ンである。

以上の説明から、殆んどの場合、膜を通って輸送され、
膜の電流及びコンダクタンスの尺度を与えるイオンはス
テイミュラント又は試験様ではなくて、単に電流インジ
ケーターとして作用しているだけであることが分かるだ
ろう。広範囲の無機イオンがこの目的のために用いるこ
とができ、そしてこれには−価のイオン、例えばカリウ
ムイオン、ナトリウムイオン等が好ましい。他のケース
では、無機ステイミュララントがそれ自体イオン性で、
適切なリセプターと複合化してイオン複合体を形成し、
そしてその複合体がそれが膜を通して移動してイオン電
流を与えるごとく自から監視される。

本発明による方法を実施する際、標準の方法でＢＬＭを
まず水溶液中に組み立て、選択した安定剤、リセプター
等を吸着させる。リセプターはその水溶液からＢＬＭへ
の侵入の容易さのために適当な親水性／疎水性のバラン
スを持っているのが好ましい。

膜は膜が使用されるべき電気化学セルの中で作ってもよ
いし、あるいは別の離れた場所で作シ、水性電解液に安
定な状態に保ち、次いでその分析用セルに入れてもよい
。

添附第４図は本発明において使用する電気化学セルの１
形態を略図的に説明するものである。セルは有機ガラス
のハウジング４０を有し、ノ・ウジ７グ４０はＢＬＭ３
　　を支持するのに用いられる直径１　ｍｒｎの円形の
開口４４を有する厚さ０．１朋のテフロン７−トで２つ
のブロックに分けられるように形成されている。寒天塩
橋が延びるＡ　ｇ／Ａ　ｇ　Ｃｌ単接合の２つの参照電
極４６．４８の間の膜３を１黄切って外部直流電位を印
加する。外部回路構成ば電極４６に接続されたＤＣ電力
供給源と電極４８に接続されたデーター人手用のマイク
ロプロセッサ−で制御された多重チャンネルデジタル電
位計から成る。冷化ハロゲンー石英繊維オプテツクスイ
ルミネーターと広角２０倍率の顕微鏡から成る光学系を
電気化学的研究のだめのＢＬＭ形成を調べ、監視するの
に用いてもよい。電解液セルと敏感な電子装置は井戸に
接地したファラデーケージに入ｎて適切に隔離する。

フリーの膜は機械的衝撃に対して極めて敏感である。こ
のため本発明ではこれを使用する前にＢＬＭを安定化す
るのが好ましい。安定化するのに幾つかのやシ方がある
。１つの方法においては、ポリマー、例えばフリエチレ
ン又はポリ塩化ビニルをＢ　Ｌ　Ｍが沈積せしめられる
炭化水素溶剤に約５％Ｗ／Ｖ以下の量で添加する。ポリ
マーはＢＬＭに混和してＢＬＭに構造安定性を与える。

第二の方法では、界面活性剤、例えばヘキサデシルトリ
メチルアンモニウムブロマイド 界面活性剤はＢＬＭへの混和のために前記のステロール
と実質的に同じようにして加えることができる。更に別
の安定化法に内部重合法がある。この方法では、膜の内
部アシル鎖が化学的に共有結合することができる官能基
を含み、それによってコントロールされているが、しか
し永久的な密度変化を引き起こす。

特に好ましい安定化法は、しかしながら、膜を支持体に
付着させる方法でちる。この方法では、支持膜を与える
薄膜付着法で配向した脂質膜を固体サブストレート又は
安定なゲルサブストレートのいずれかのイオン伝導性支
持体上に付着させることができる。１つの特定の方法に
おいて、膜は電気化学的参照電極上で物理的に安定化さ
れたヒドロゲルに付着される。

本発明における使用のためのこのような支持された膜に
おいて、加えられる機械的強度のために、膜の脂質頭部
基を支持体に共有結合させるか、又は支持体に物理的に
吸着させることができる。このような組立では、二重脂
質膜の代りに単層脂質膜を調製し、使用することができ
る。

ＢＬＭの形成 ｎ−デカン（アルミナカラムで精製し、分子ふるいで乾
燥した）及び脂質／コレステロールを２％１０．２５％
〜２％／４％（重量対容量）のデカン比範囲で含有する
溶液からＢＬＭを作った。即ち、脂質含有溶液をまず超
音波浴に１分間式れて確実に均質にし、次いでテンの細
い毛のヘアブラシで直径１朋のテフロン開口に導入した
．０．１Ｍの電解質を含有する容積５　ｍｌの２つの水
溶液の隔室間の開口に閉じ込められた、得られた脂質プ
ラグは同時に薄化（ｔｈｉｎ）　して、ＢＬＭから成る
、過剰の脂質と溶媒のトーラスで囲まれた領域を形成す
る。膜の薄化のプロセスは小さい電位又は機械的衝撃を
加えて刺徴することによって促進することができた。Ｂ
ＬＭの形成は透膜電荷の通過を電気的に監視するか、又
は表面の光学的反射特性で直接観察することができた。

テフロン支持体の予備処理は、開口を直接取り囲むポリ
マー表面の両側に膜形成性連夜の薄いコート層を適用し
、そのフィルムを風乾させて行った。テフロンは強塩基
処理とクロム酸処理を用いて清浄にした。膜は＋５〜＋
５Ｑｍ’Ｖの範囲の印加直流電位下で形成し、検査を行
う前に最低１０分間安定化させた。

次の実験においては脂質としてホスファチジルコリアを
用いた。ホスファチジルコリンは容易に安定なりＬＭを
作シ、結晶法及び分光分析法で十分に特性が求められる
。卵由来のホスファチジルコリンについて、炭化水素残
基の分布の代表例を以下に示す。

１　６、０　　　　　　　　３　３．０１　６、１　　
　　　　　　　２．１ １　８、０　　　　　　　　１５．４ １８、１　　　　　　　　３　１．７ １８、２　　　　　　　　１　７．８ ２　０、４　　　　　　　　　４．３ ２２、６　’　　　　　　　　１．７ その相転移温度はこれらの実験で用いられた全ての支配
的条件においてＢＬＭが生成するそのような温度である
。前記ブラシ法でテフロン開口に脂質溶液を導入するの
がＢＬＭ　を創製することができる最も容易な方法であ
った。この研究で用いられたフリーのＢＬ）４は直接的
な光学的観察及び電気的観察で特徴を定めるのが簡単で
ある。構造上の変化、例えば表面積や、あるいは未薄化
脂質／溶剤プラグの存在はかくして速やかに同定される
。

フリーの膜を使用するに当っての１つの重要な欠点は膜
が機械的又は電気的衝撃に対して極めて敏感なことであ
る。後者の条件下では、ＢＬＭの存在がはつきりしなく
なる。膜に一体性を得る１つの方法はコレステロールの
使用によるもので、そｏ　ｔｙ　合＝＋レスチロールは
膜の構造をよシ濃密なものにし、衝撃による破壊に対し
て抵抗性にする。

コレステロールはこの目的に対して（脂質濃度を２％ｗ
／ｖとして）溶液中０．２５〜４　％　ｗ／ｖの範囲に
わたって有効である。同時に、コレステロールの添加は
電気的−化学的構造の諸関係を調べるだめの、膜を色々
変える都合のよい方法を提供する。コレステロールとホ
スファチジルコリントハ未音波処理溶液中Ｃ／ＰＣの最
大モル比１／１で結合することができ、しかも明らかに
均質な膜を作る。更に高ステロール含量も得ることがで
きるが（最大Ｃ／ＰＣ：２／１）、均質分散を得るため
には混合物を音波処理しなければならず、また混合物は
脂質の脂肪酸組成と環境温度の影響を受けて分離を受は
易くなる。従って２／１比が達成可能比であるが、１／
１　比が好ましい。コレステロール２０襲モル分率以上
で、単離したステロールリッチのゾーンが突然結合して
ＢＬＭ　を横断する格子ネットワークを形成する。この
ような結合区域はイオン拡散コントロール性及び膜の分
子吸着性に関してかなシの分岐構造を持つことができる
。

脂質／溶剤プラグの薄化プロセスの光学的観察結果は干
渉像をもたらす可視光の反射の臨界角に左右される。そ
の着色した像はＢＬＭが膜の前面及び背面からの反射光
の破壊的干渉のだめに形成するとき消失する。それは３
Ｑｎｍ以下で面が分離するようになり、かつその２つの
平面からの反射の位相角が位相から外れだ１８０°であ
るからである。膜は幅対のバッククランドがその構造を
全く照らさないときだけ黒く見える。包摂とそれに続＜
　ＢＬＭの形成は２つのステップで進む。最初の暗銀−
灰色反肘は直径約３０　ｎｍの多層に薄化が起こると現
われる。更に薄化が進むと、ＢＬＭが形成され、黒色膜
が現われる。その色は典形的には二次黒色と称される。

薄化が起こる時間の長さは溶剤の粘度と脂質／コレステ
ロールの成分の純度との関数である。後者の化学的分解
が起こると、膜の薄化速度が実質的に遅くなる。従って
、それを観察することが膜組成の非常に定性的な判明法
として有用である。

Ｂ　Ｌ　）、４は気相で起こる７石鹸気泡（ｓｏａｐ　
ｂｕｂｂｌｅ）’化学の類縁水溶液と考えてもよい。同
様系列の条ヒにと１ｌｉｌｌ限がＢＬＭ　の形成と安定
性を決める。最も重要な特徴は水性支持相における脂質
溶剤の溶解性を中心にしてその周囲にある。溶剤が水に
可溶であると、膜からの抽出が連：洸プロセスとなり、
かつＢＬＭの特性を連続的に変化させ、そしてそればか
りでなく最後には構造破壊を引き起すことがある。これ
はメタノール／クロロホルムのような溶剤系について真
であり、これは避けるべきである。オクタンからヘキサ
デカンまでの炭化水素溶剤がＢＬＭ形成用の脂質の溶剤
として最良の特性を与えるが、但しオクタンとノナンは
若干水溶性である。溶剤炭化水素の鎖長と膜の炭化水素
領域の庫≦の間には直接的な相関関係がちシ、従ってよ
り大きな機械的安定性を持つ厚い膜を作るのにその関係
を利用することができる。短鎖長の炭化水素は一番大き
な直径の膜を与えるが、一方ヘキサデカンから形成させ
る膜はほとんど溶剤を含−まず、往々にしてトーラス（
ｔｏｒｕｓ）　、すなわち円環体には簡単には凝集しな
い無数の未薄化脂質／溶剤の９レンズ“を含有する。溶
剤を賢明に選択することによって、膜の炭化水素の厚さ
は１００弼もの倍率まで変えることができる。後記実力
ｍし：］で用いられているリン脂質は炭化水素溶剤中で
は集合体を形成する。溶剤中における脂質の存在はコレ
ステロールの溶解性を著しく高めるが、これは多分コレ
ステロールが集合体内部に配向した形で詰め込まれるこ
とによるだろう。これらの団塊は溶剤のトーラスへの排
液が起り得るようになる前に水性相／脂質−溶剤プラク
界面に移行して拡がり、単層を形成するようにならなけ
ればいけない。このプロセスは下記によって速められる
。

１）並進運動を速める一層高温で操作する、２）その混
合物を音波処理し、その後に集合体の大きさを最小にす
べく使用する、及び３）乾燥脂質を付着させるべく；漠
支持体表面（テフロン）を予備処理し、溶剤プラグ／′
ｌＫ性界面を横断して洗い流して脂質／溶剤が開口に導
入されるとき単層を形成するようにする。

これらの例において溶剤としてデカンを選ぶと、膜厚、
粘度及びレンズ形成の制限の間に最適の妥協点が得られ
る。

テフロン支持体を、適正に予備処理するのがＢＬＭの安
定性と寿命を決めるかぎとなる。開口のまわシのポリマ
ー表面に脂質／溶剤溶液を塗布する。

その溶剤を蒸発させると乾燥残留脂質の被膜が残る。こ
のプロセスの成功はポリマー清浄化技術と密接に関係す
る表面の湿潤性に関係する。脂質／溶剤の液滴のポリマ
ーに対する接角虫角の測定が湿潤性の定量的尺度を与え
る。走査電子顕微鏡及びＸ−線光電子分光分析法を組み
合せると、このような接触角のメジャーは、強酸化性媒
体、例えばクロム酸によるテフロンのエツチングが湿潤
特性を最適なものにする炭素−酸素含有種により覆われ
た物理的に点蝕された咀い組織を作ることを示した。

安定なりＬＭはコレステロールと脂質の両者を０．１％
ｗ／ｖ程度の少量で含有するデカン溶液から調製するこ
とができ、そして２襲比までが脂質／溶剤プラグの排液
時間と最終の電気的安定性を高める最適濃度を与える模
様である。前記の比に関係なく、浸漬された開口に対す
る脂質／溶剤の適用でＢＬＭの安定性が直接的に決ま９
得る。過剰の溶剤は、、６１Ｊマーを吸収し、かつその
表面を濡らして膜を支持するトーラスが形成されないよ
うにするから、最少量の炭化水素系が適用されるべきで
ある。テフロンを横断してゆっくり拡げることによって
組織された脂質構造体に横方向の力が加わる表面吸収混
合物で膜が代りに支持されると、最後には不安定化され
てしまう。

次の実施例は本発明を限定するものではない。

実施例 薄膜付着法で配向した脂質膜を安定なゲルサブストレー
トに面結合させた。ヒドロゲルに付着させた、電気化学
的参照電極で物理的に安定化された。脂質ベースの変換
器を作シ、試験した。１×４×０．１ｃｍのきれいなガ
ラスウェーファーを真空チャンバーに入れ、そして厚さ
２０　ｎｍのＴｉ／Ｗコーティングで被覆してそのガラ
スサブストレートに更に設けられる１　００　ｎｍのＡ
ｇ金属付着層の接着性を改良した。ウェーファーを次に
更に処理して参照電極表面を作った。この作製は１つの
ケースでばＩＭＦｅＣＩＪｓ水溶液（ゆるく結合した、
高度に導電性のＡｇ／ＡｇＣｇ）　　中に放置して、ま
たもう１つのケースではＱ、１ＭＨ（Ｊ溶液（コンパク
トな相対的に非導電性のＡｇ／Ａｇ（Ｊ）中で塩素化処
理することによって達成され、核形成の問題を予防する
ために大過渡電流で開始され、そして直流密度５　ｍＡ
Ａｍ２において完結される電着法で行われた。ガラスウ
ニ−ファーの疎水性、非導電性エポキシ樹脂による部分
的カプセル化はゲルを保持する溜めを形成することがで
き、かつ均質な脂質の被覆をウェーファーの端縁部にお
いて起り得る不完全さを無くすことによって最適化する
ように行った。エポキシ樹脂は１００部のエポン（Ｅｐ
ｏｎ）　８２５　（シェル社（５ｈｅ１１〕）と３７部
のシェフアミン（Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ）Ｄ　−２３０（
テキサコ社（ＴｅｘａＣ○〕）、それに加えてＯ〜１２
優の疎水性チキントロープシラノンクス（ｈｙｄｒｏｐ
ｈｏｂよ。

ｔｈｉＸａｔｒｏｐ８５ｉ１ａｎｏｘ）　（カボット社
（ｃａｂｏｔＣｏｒｐｊ、ボストン、ＭＡ）　　を混合
することによって製造した。この調製物は、被覆ウェー
ファーを外囲室条件で１２時間放置し、続いて６０℃で
３日間ベーキングすることによって硬化させた。

ポリアクリルアミドのヒドロゲルの製造のために、アク
リルアミビ、Ｎ、Ｎ／−メチレンービスーアクリルアミ
）”、Ｎ、Ｎ、Ｎ、Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミ
ン（ＴＭＥＤ）及びリボフラビン−５′−ホスフェート
（パイオーラド・ラボラトリーズ社（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ミツシンーガＣＭｉｅｓ
ｉｓｓａｕｇａ）、ＯＮ）を次のようにして調製した。

モノマー溶液は０．１Ｍホスフェート緩衝ノ１り（ｐＨ
７）中にアクリルアミド″″／ビスーアクリルアミドを
１９　：　１　（ｗ／ｗ）　　で含有する２０％Ｗ／Ｖ
の全モノマー濃度から成っていた。リボフラビン−５７
−ホスフェートは上記と同じホスフェート緩衝液中０．
０１％（Ｗ／ｖ）溶液として調製した。

これら溶液は全て酸素を含まず、そして窒素下で貯蔵し
た。０．５　ｍｌのモノマー溶液、１０ｍｅのＴＭＥＤ
溶液及び０，５，１ｇのりボフラビン溶液を窒素でパー
ジした小壜に次ぎ次ぎに加えた。この反応混合物の少容
量を次にウェーファー（窒素下に貯蔵）上の溜めに移し
、２５４ｎｍの光（ランプモデルＵＶＧＬ−２５、ウル
トラバイオレット・プロダクツ社（Ｕｌｔｒａｖｉｏｌ
ｅｔ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、サンｅガービエル（Ｓａｎ
　Ｇａｒｂｉｅｌ〕、ＯＡ）を１時間照射して重合を誘
発させた。その水はＱ、ＩＭＫ（Ｊ溶液に少なくとも１
時間たくわえた。

卵由来のホスファチジルコリン（アバンチ・バイオケミ
カルス社（Ａｖａｎｔｉ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、
Ｉｎｃ、〕、バーミンガム（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ）、
ＡＬ）とＢＬＭの実験で常用されるコレステロール（シ
グマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃ
ｏ、）、セント、　／Ｌ／イス（Ｓｔ　、Ｌｏｕｉｓ　
）、ＭＯ）　　との１＝１重量比の混合物をｎ−ヘキサ
ン中で調製し、その受容量ｔテフロンのラングミュア−
プロジェット・トラフ（Ｌａｎｇｍｕｉｒ−Ｂｌｏａｇ
ｅｔｔ　ｔｒｏｕｇｈ）中の０．ＩＭＫ（Ｊ　　　　’
のサブフェース（ｓｕｂｐｈａｓｅ）上に徐々に拡げた
。

表面のフィルムを少なくとも３０ｍＮ−ｍ−”　の圧力
が得られるまで移動スイープ・ブーム（ｓｗｅｅｐｂｏ
ｏｍ）で圧縮した。ウェーファーを次に圧縮された脂質
フィルムにより一定圧（変動０．１　ｍＮ−ｎ””）で
０．５　ｃｍ１分の速度で繰９返し浸漬した。この操作
において、最初はサブフェースに浸漬し、次いで引き出
し、最後に再浸漬した。電気的接続の１点としてガラス
ウェーファー上に最初に付着させだ非処理のきれいな金
属の小部分を用い、電気的回路を作った。Ａｇ／ＡｇＣ
／単接続参照電１・返（オリオン・リサーチ社（Ｏｒｉ
ｏｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｉｎｃ、）ケンブリッジ（ｃ
ａｍｂｒｉｄｇｅ　）、ＭＡ）、＋２５ｍＶ　　のＤＣ
電力供給装置及びディジタル電位計（ケースレテイー・
モデル（Ｋｅｉｔｈｌｓｔｙ　Ｍｏｄｅｌ）　６１６、
クリープラントゝ（ｃ１θｖｅｌａｎｄ、ｌ、ＯＨ）　
が付着脂質層を介してイオン電流測定用回路を完成させ
た。電気化学的プローブとしてのフロレチン（３−（４
−ヒトゝロキシフェニル）−１−（２４，６−）リヒビ
ロキシフェニル〕−１−プロパノン）とパリノマイシン
（シグマ社）を前記トラフのサブフェースに対してウェ
ーファーの近辺に儂メタノール性１６　Ｗとして導入し
て変換器操作を評価した。

電気化学的に上首尾のＢＬＭのキャスティングが電気回
路中のイオン電流においてＩＱＯＯＯ倍又はそれ以上の
低下として容易に観察された。最終電流値は１０−９〜
１Ｏ−１０ＡＡｒｎ２のオーダーの大きさを有し、また
電気的妨害を下げるためにファラデー・ケージ・アッセ
ンブリーを備える特別の電気的シールドを用いた。ゲル
表面に一区安定化されたＢＬＭが明らかに付着されると
、膜の２種の有機活性剤の使用によって膜の電気化学的
探査作用が達成された。パリノマイシンはカチオンを中
央の極性キャビティーに複合化してゆき得る抗生物質（
ＧＭＷ−１ｔ　１１　）で、疎水性の蛋白質の鞘で取り
囲まれている。このような抗生物質のこの顕著な特徴に
よって、パリノマイシンは容易に非硬性媒体に溶解して
ゆき、そのイオンを疎水ゾーンに運ぶことができる。こ
の能力は中性キャリヤー電極の発生に利用され、そして
イオン輸送のホルンエネルギー要件を下げることによっ
てＢＬＭ　ｉ介してのイオン電流に実質的な増加をもた
らす。

急速に消失する所局的に濃くなったパリノマイシンを添
加すると、不明確な構造の脂質膜を制限するイオン電流
の存在と一致する過渡イオン電流が観察された。興味あ
る第二のプローブは双極子性種の７０レチンである。こ
の小さい有機１ｆｆ　（ＧＭＷ−２７４）はＢＬＭの固
有双極子場に対して整列することができる５、６Ｄの大
きな双極子能率を持つ。

この後者の双極子場はフロレチンが作用して電流を増加
させるように透膜カチオン電流を制限する配向のもので
ある。フロレチンの電気的活性は、双極子効果が表面現
象で、単層構造又は二重層脂質構造してついてだけ重要
であると期待されるという理由から重要なものである。

上記のプローブ類で寮；、′Ａされた電気的活性は、イ
オン伝導性サブストレートに連続して脂質単層を付着さ
せることが可能であって、電気化学的に応答し得る組織
された構造を創生ずるということを証明している。この
本質的に同じ技術を用いると、支持された単層脂質膜を
調製することができ、そしてそれは同じように作用する
。単層については、それに適当なより疎水性のサブスト
レートが用いられる。ウェーファーは単層を形成すべく
ラングミュア−プロジェット・トラフ中の脂質フィルム
（てよ９１回だけ浸漬される。

【図面の簡単な説明】

第１図は標準的な二重層脂質膜の概略断面図であり、第
２図は本発明（でよるプロセスにおいてイオンがＢＬＭ
を通って輸送される色々な機構の１既１１１１５説明図
で４ちり、第３図は本発明によるプロセスにｊ−′いて
ＭＬＭ　内で起こる複合化反応を示す第２図と同様の説
明図であり、そして第４図は本発明の方法を液相中で実
°施する装置の概略断面図である。 １・・・脂質分子　２・・・膜構造変性剤　３・・・二
重層脂質膜（ＢＬＭ）　　５ａ・・・膜のチャンネル　
７・・・電極８・・・電解液　１０１１２・・・脂質頭
部　１１・・・リセｉター１２ａ・・・有機ステミュラ
ン）　　１３ａ・・・複合体　１４．１６・・・脂質尾
部　１４ａ・・・複合体の影響領域　１８・・・有機相
領域　２０１２２・・・水性相領域　４０・・・ハウジ
ング　４２・・・ＢＬＭの支持体　４４・・・開口　４
６．４８・・・参照電極（外４名） 第３図 ＭｎＴ 第４図 手続袖正升（方式） 昭和ｂｏ年１１月７日 王事件の表示 昭和ＬＯ年ン薫う願第　／り／フ／Ｊ　　号ｒ−＜ｓｉ
　　ｙ　　ｔｔ　　Ｉｔ　￥ｈ４　４ｚ；ａ　＃　−；
（ａ　／）　２　デ’（二３．　　Ｌ　’ｔ、”・二量
ス１ ３補正をする者 事件との関係　　　出　頭　人 住所 ｌ／＋４′１．ニニノ・−レテイ　才）　トＯ／トイノ
ンヘイ′／Ｄ　’／　’ＺフＴフ７７’−’、　：ｉ　
／ ４代理人 ５補正命令の日付　　昭和６０年　７．１）月２−７日
（発送日）６；山王の対象 図　　　　面

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. （１）（ａ）（１）イオン伝導性支持体に付着され、か
   つ選ばれた化学種と選択的に相互作用して透膜イオン運
   動を増進する複合化剤を添合することによって変性され
   た脂質膜及び（２）水性電解溶液から電気化学セルを形
   成し；（ｂ）該変性膜を横切って電位差を印加し、それ
   によって該化学種が膜添合複合化剤と相互作用して該透
   膜イオン運動に基づく分析信号を出すようにし；（ｃ）
   該分析信号を測定し；そして（ｄ）測定された分析信号
   から該化学種の濃度を定量することを特徴とする選択さ
   れた化学種の水性電解溶液中濃度を定量又は半定量する
   方法。
2. （２）透膜イオン電流を測定する特許請求の範囲第（１
   ）項記載の方法。
3. （３）該化学種が有機化合物である特許請求の範囲第（
   １）項記載の方法。
4. （４）該化学種が無機イオンである特許請求の範囲第（
   １）項記載の方法。
5. （５）選ばれた化学種と選択的に相互作用して透膜イオ
   ン運動を増進する複合化剤を添合することによって変性
   された脂質膜が付着しているイオン伝導性支持体から成
   ることを特徴とする透膜イオン運動に感応する支持され
   た膜ベースの装置。
6. （６）該イオン伝導性支持体が安定なゲルサブストレー
   トである特許請求の範囲第（５）項に記載の装置。
7. （７）該イオン伝導性支持体がヒドロゲルである特許請
   求の範囲第（５）項記載の装置。
8. （８）該脂質膜が二重層脂質膜である特許請求の範囲第
   （５）項記載の装置。
9. （９）該脂質膜が単層脂質膜である特許請求の範囲第（
   ５）項記載の装置。
10. （１０）該複合化剤が有機化合物に対して選択性のリセ
    プターである特許請求の範囲第（５）項記載の装置。
11. （１１）該複合化剤が無機イオンに対して選択性である
    特許請求の範囲第（５）項記載の装置。