JPS6137095A - Method of separating enzyme analog to trypsin - Google Patents
Method of separating enzyme analog to trypsinInfo
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- JPS6137095A JPS6137095A JP16010684A JP16010684A JPS6137095A JP S6137095 A JPS6137095 A JP S6137095A JP 16010684 A JP16010684 A JP 16010684A JP 16010684 A JP16010684 A JP 16010684A JP S6137095 A JPS6137095 A JP S6137095A
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Abstract
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、トリプシン類縁酵素および/″!fたはその
前駆体の分離方法に関する。さらに詳しくは、クロマト
グラフィーによりトリプシン類縁酵素および/またはそ
の前駆体を分離する方法において、全多孔質の吸着体を
用いることを特徴とする上記分離方法に関する。Detailed Description of the Invention [Field of Industrial Application] The present invention relates to a method for separating trypsin-related enzymes and/or their precursors.More specifically, the present invention relates to a method for separating trypsin-related enzymes and/or their precursors by chromatography. The present invention relates to the separation method described above, characterized in that a completely porous adsorbent is used in the method of separating precursors.
トリプシン類縁酵素とは、アルギニンおよびリジン残基
のペプチド結合のほかに、エステル結合に対して特異性
を有する加水分解酵素である0上記の酵素はトリプシン
、プラスミン、ウロキナーゼ、トロンビン等を含む。Trypsin-related enzymes are hydrolytic enzymes that have specificity for ester bonds in addition to peptide bonds of arginine and lysine residues.The above enzymes include trypsin, plasmin, urokinase, thrombin, and the like.
生化学や医学等の領域で上記の酵素および/またはその
前駆体を、それを含む混合物から分離分析することは、
重要な課題の一つである。In fields such as biochemistry and medicine, separating and analyzing the above enzymes and/or their precursors from mixtures containing them is
This is one of the important issues.
例えば、トリプシンは膵臓で特異的につくられる酵素で
あるが、膵障害時には血中に逸脱するため、血清中トリ
プシンの測定は膵疾患の診断上大きな意義を有すると考
えられている。For example, trypsin is an enzyme that is specifically produced in the pancreas, but it escapes into the blood when pancreatic disorders occur, so measurement of trypsin in serum is considered to have great significance in diagnosing pancreatic diseases.
また、プラスミン、ウロキナーゼ、トロンビン等の血液
凝固や線溶に関係する諸酵素およびプラスミンの前駆体
であるプラスミノーゲンけ、例えば、いくつかの疾患に
おいては体液中の存在量、存在状態等を知ることは非常
に重要なこととなっている。In addition, we also know the amount and status of enzymes involved in blood coagulation and fibrinolysis, such as plasmin, urokinase, and thrombin, as well as plasminogen, the precursor of plasmin, in body fluids in some diseases. This has become extremely important.
上記酵素および/またはその前駆体を分離する方法とし
ては、現在多くの方法が用いられている。Many methods are currently used to separate the enzyme and/or its precursor.
例えば、l)溶解度差を利用する方法1.り電荷の差を
利用する方法、3)分子の大きさ、あるいは形状の差を
利用する方法、り化学的または物理的親和力の差を利用
する方法などが挙げられる。また、生物学的に特異的親
和性を利用して分離する方法は、選択性が高く汎用され
ている。特にアフィニテイを示す物質の一方(以下、配
位子分子という)を不溶性担体に固定化して他方を選択
的に分離するアフィニティクロマトグラフィーは操作性
の点から広く普及している(千畑一部、土佐哲也、松尾
雄志著“アフィニティクロマトグラフィー”講談社参照
)。For example, l) Method using solubility difference 1. (3) a method that utilizes a difference in molecular size or shape; and (3) a method that utilizes a difference in chemical or physical affinity. Furthermore, separation methods that utilize biologically specific affinity have high selectivity and are widely used. In particular, affinity chromatography, in which one of the substances exhibiting affinity (hereinafter referred to as a ligand molecule) is immobilized on an insoluble carrier and the other is selectively separated, is widely used due to its operability (Chibata, Tosa (See “Affinity Chromatography” by Tetsuya and Yushi Matsuo, Kodansha).
従来、アフイニテイクロマトグラフィー用の不溶性担体
として、特にアガロースが広く用いられてきた(例えば
、商品名セファローズ、ファルマシア社、スウェーデン
)。しかし、アガロースは以下のような欠点を有する。Hitherto, agarose, in particular, has been widely used as an insoluble carrier for Affinity chromatography (for example, trade name Sepharose, Pharmacia, Sweden). However, agarose has the following drawbacks.
すなわち、アガロースは保持し得る水の量が極めて多く
湿潤時の強度が不十分なために操作上の制約が多い。例
えば、活性化、固定化等の操作中に破壊されやすい。That is, agarose has many operational limitations because it can hold an extremely large amount of water and has insufficient strength when wet. For example, they are susceptible to destruction during operations such as activation, immobilization, etc.
また、例えば、体液中の存在量を知ることKよシ、病態
の診断や治療等に役立てるために上記酵素を分析する場
合には、微量の試料量で分析できること、迅速性、簡便
性等が要求される。しかし、従来のアフィニティクロマ
トグラフィーでは、例えば、アガロースを用いた場合は
、その強度が不十分なために、カラムに充填した場合に
分離すべき物質を含む液体を高流速で流すことができな
い、また分離された成分の検出を溶出と同時に連続的に
行なうととが困難である等の欠点を有するため迅速性、
簡便性に欠けている。In addition, for example, it is important to know the amount present in body fluids, but when analyzing the above enzymes to aid in the diagnosis and treatment of pathological conditions, it is important to be able to analyze with a small amount of sample, to be quick, and to be simple. required. However, in conventional affinity chromatography, for example, when agarose is used, its strength is insufficient, so when it is packed in a column, it is not possible to flow the liquid containing the substance to be separated at a high flow rate. Continuous detection of separated components at the same time as elution has disadvantages, such as the difficulty of detecting separated components.
It lacks convenience.
そこで、従来のアフィニティクロマトグラフィーの上記
のような欠点を解消すべく鋭意検討の結果、主として高
速アフィニティク四マドグラフィーにより上記酵素を迅
速、かつ簡便に分離分析する方法を開発し、本発明に至
った。Therefore, as a result of intensive studies to resolve the above-mentioned drawbacks of conventional affinity chromatography, we developed a method for quickly and conveniently separating and analyzing the enzymes mentioned above mainly by using high-speed affinity chromatography, which led to the present invention. Ta.
すなわち、本発明は、トリプシン類縁酵素を液体クロマ
トグラフィーにより分離する方法において、アルコール
性水酸基および該酵素に対して親和性のある配位子基を
有する全多孔質の吸着体を、固定相として用いることを
特徴とするトリプシン類縁酵素の分離方法に関する。That is, the present invention uses a fully porous adsorbent having an alcoholic hydroxyl group and a ligand group having affinity for the enzyme as a stationary phase in a method for separating trypsin-related enzymes by liquid chromatography. The present invention relates to a method for separating trypsin-related enzymes, which is characterized by the following.
本発明におけるトリプシン類縁酵素には、通常のトリプ
シン型式酵素のほかにその前駆体も含まれる。通常のト
リプシン型式酵素とは、アルギニ−,1−
ンおよびリジン残基のペプチド結合のほかに、エステル
結合に対して特異性を有する加水分解酵素のことで、例
えば、トリプシン、プラスミン、ウロキナーゼ、トロン
ビン等が挙げられる。また、その前駆体とは、生体内で
通常のトリプシン型式酵素になる前の物質で、例えば、
トリプシノーゲン、プラスミノーゲン等が挙げられる。Trypsin-related enzymes in the present invention include not only normal trypsin-type enzymes but also their precursors. Ordinary trypsin-type enzymes are hydrolases that have specificity for ester bonds as well as peptide bonds of arginine, 1- and lysine residues, such as trypsin, plasmin, urokinase, and thrombin. etc. In addition, its precursor is a substance that has not yet become a normal trypsin-type enzyme in vivo, for example,
Examples include trypsinogen and plasminogen.
本発明のりpマドグラフィーの固定相には、アルコール
性水酸基およびトリプシン類縁酵素に対して親和性のあ
る配位子基を有する全多孔質の吸着体が用いられる。吸
着体中のアルコール性水酸基は、吸着体乾燥重量あたり
/、0−/4/、θmmol/fの範囲で存在する。ア
ルコール性水酸基をこの範囲で含むことKより、この吸
着体からなる充填剤は親水性を有し、水中において多く
の水溶性物質に対して疎水的吸着や分配を示さない。水
酸基の量は、実用上はt!〜t /、 Ommol/f
の範囲にあるのがよい。アルコール性水酸基の中ではビ
ニルアルコール単位に由来する水酸基が特に好ましい。A fully porous adsorbent having an alcoholic hydroxyl group and a ligand group having an affinity for trypsin-related enzymes is used as the stationary phase in the adhesive pmography of the present invention. The alcoholic hydroxyl group in the adsorbent is present in the range of /, 0-/4/, θmmol/f per dry weight of the adsorbent. Since the alcoholic hydroxyl group is contained within this range, the filler made of this adsorbent has hydrophilic properties and does not show hydrophobic adsorption or distribution to many water-soluble substances in water. The amount of hydroxyl groups is practically t! ~t/, Ommol/f
It is good that it is within the range of . Among the alcoholic hydroxyl groups, hydroxyl groups derived from vinyl alcohol units are particularly preferred.
水酸基の量は、水酸基を無水酢酸と反応させてJ −
消費した無水酢酸の量、または吸着体の重量変化を測定
することにより求めることができる。この時、生体成分
吸着用担体上の官能基も反応する場合は、該官能基を保
護した後、上記の方法により求めることができる。乾燥
した吸着体/fが/ m mo 1の無水酢酸と反応し
た時の水酸基の量を/mmol/rとする。The amount of hydroxyl groups can be determined by reacting the hydroxyl groups with acetic anhydride and measuring the amount of acetic anhydride consumed or the change in weight of the adsorbent. At this time, if the functional groups on the carrier for adsorbing biological components also react, the reaction can be determined by the above method after protecting the functional groups. Let /mmol/r be the amount of hydroxyl groups when the dried adsorbent /f reacts with /mmol 1 of acetic anhydride.
以下の物性測定においても、測定条件下で吸着体上の官
能基が反応する場合には、水酸基量の測定の時と同様に
官能基を保護して測定することにより物性を知ることが
できる。In the physical property measurements described below, if the functional groups on the adsorbent react under the measurement conditions, the physical properties can be determined by protecting the functional groups and measuring them in the same way as when measuring the amount of hydroxyl groups.
吸着体上の配位子基は、共有結合によシ固定化されてお
り、o、o O/ 〜3o o o μmol/f %
好ましくは、0.001〜230μmol/fの範囲で
存在する。配位子基がこの範囲で存在することにより、
本発明で用いられる吸着体は高速アフイニテイクロマト
グラフイーに適した充填剤となる。The ligand groups on the adsorbent are immobilized by covalent bonds, with o,o O/ ~3o o o μmol/f%
Preferably, it is present in a range of 0.001 to 230 μmol/f. By the presence of the ligand group in this range,
The adsorbent used in the present invention is a suitable packing material for high-speed affinity chromatography.
本発明で用いられる吸着体上の配位子基は、アミジノ基
またはグアニジノ基を有する。配位子基は、トリプシン
類縁酵素に対して親和性を有することのほかに、l)化
学的に安定であること1.2)非特異的相互作用がない
か、または少ないことなどの特性が望まれる。配位子分
子は、配位子基のほかに、固定化反応に利用できる適当
な官能基を持つことが望まれる。好ましくは、次式で表
わされる構造を有する化合物であることが望まれる。The ligand group on the adsorbent used in the present invention has an amidino group or a guanidino group. In addition to having affinity for trypsin-related enzymes, the ligand group also has properties such as: 1) being chemically stable; 2) having no or little non-specific interactions; desired. It is desirable that the ligand molecule has, in addition to the ligand group, a suitable functional group that can be utilized for the immobilization reaction. Preferably, a compound having a structure represented by the following formula is desired.
Aはフェニル基または適当な脂肪族化合物であり、Rは
アミノ基、カルボキシル基、水酸基等の活性水素を有す
る求核反応基である。〕
具体的々配位子分子の例としては、m−またはp−アミ
ノペンツアミジン、m−4*はp−アミノフェニルグア
ノシン、アルギニン、弘−アミノブチルグアニジン、t
rans−#−アミノブチルグアニジン、trans−
41−アミジノメチルシクロヘキサンカルボン酸、tr
ans−II−グアニジノメチルシクロヘキサンカルポ
ン酸、trans−≠−アミノメチルシクロヘキサンカ
ルボン酸またはリジンの中から選ばれ、2種以上の組合
わせでもよい。A is a phenyl group or a suitable aliphatic compound, and R is a nucleophilic reactive group having active hydrogen such as an amino group, a carboxyl group, or a hydroxyl group. ] Specific examples of ligand molecules include m- or p-aminopenzamidine, m-4* is p-aminophenylguanosine, arginine, Hiro-aminobutylguanidine, t
trans-#-aminobutylguanidine, trans-
41-amidinomethylcyclohexanecarboxylic acid, tr
It is selected from ans-II-guanidinomethylcyclohexanecarboxylic acid, trans-≠-aminomethylcyclohexanecarboxylic acid, or lysine, and may be a combination of two or more.
配位子基は活性基と直接またはスペーサーを介して活性
基と共有結合している。活性基とは、配位子分子または
スペーサー分子のアミノ基、カルボキシル基、水酸基、
チオール基等の活性水素を有する求核反応基と置換およ
び/または付加反応し得る基を言い、具体的にはイミダ
ゾリルカルバメート基、イミドカーボネート基、シアネ
ートエステル基、エポキシ基、カーボネート基、ブロモ
アセチル基、ハロゲン化トリアジン基等が挙げられ、好
ましくは、イミダゾリルカルバメート基、イミドカーボ
ネート基、シアネートエステル基およびエポキシ基等で
あシ、特に好tL<けイミダゾリルカルバメート基であ
る。スペーサーは、線状分子の両端にある強イオン性基
でない親水性官能基が、それぞれ配位子分子および活性
基と共有結合した構造を有し、配位子基と目的とする物
質とが十分相互作用し得る長さであることが好ましい。The ligand group is covalently bonded to the active group either directly or via a spacer. The active group refers to the amino group, carboxyl group, hydroxyl group of the ligand molecule or spacer molecule,
Refers to a group that can undergo substitution and/or addition reaction with a nucleophilic reactive group having active hydrogen such as a thiol group, and specifically includes an imidazolyl carbamate group, an imidocarbonate group, a cyanate ester group, an epoxy group, a carbonate group, and a bromoacetyl group. , a halogenated triazine group, etc., preferably an imidazolyl carbamate group, an imidocarbonate group, a cyanate ester group, an epoxy group, etc., and an imidazolyl carbamate group is particularly preferred. A spacer has a structure in which hydrophilic functional groups that are not strongly ionic groups at both ends of a linear molecule are covalently bonded to a ligand molecule and an active group, respectively, so that the ligand group and the target substance are sufficiently connected. Preferably, the length is such that they can interact.
該線状分子はたとえば両末端の親水性官能基の間に、メ
チレン鎖、アミド結合、エーテル結合−ター
などを有し、炭素数/〜/θに相当する分子長の分子よ
りなる。具体的には、t−アミノヘキサン酸、β−アラ
ニン−/、/、/、J−ジアミノヘキサン、ビス(3−
アミノプロピル)アミン、グリシン、グリシルクリシン
、クリシルグリシルグリシン、スクシンアミドエチルア
ミン、スクシンアミドブチルアミン、アミノエタノール
、2.!−ジアミノジエチルエーテル表どが挙げられる
。好ましくは、t−アミノヘキサン酸、/、J−ジアミ
ノヘキサン、グリシルグリシンなどである。スペーサー
は単一種でもまた二種以上の共存でもよい。The linear molecule has, for example, a methylene chain, an amide bond, an ether bond, etc. between the hydrophilic functional groups at both ends, and has a molecular length corresponding to the number of carbon atoms / to /θ. Specifically, t-aminohexanoic acid, β-alanine-/, /, /, J-diaminohexane, bis(3-
Aminopropyl) amine, glycine, glycylclycine, chrysylglycylglycine, succinamidoethylamine, succinamidobutylamine, aminoethanol, 2. ! -diaminodiethyl ether etc. Preferred are t-aminohexanoic acid, J-diaminohexane, glycylglycine, and the like. A single type of spacer or two or more types of spacers may be used together.
固定化された配位子基およびスペーサーの量ハ次のよう
にして求めることができる。例えば、配位子分子が紫外
および/またけ可視領域に吸収を持つ物質である場合に
は、生体成分吸着用担体をt規定塩酸等で加水分解した
後、上澄の吸光度を測定することにより固定化された配
位子基の量を求めることができる。この時、例えば、上
記の線状分子がアミノ基を有する物質である場合には、
上記の上澄をアミノ酸分析計等で分析するととにより固
定化されたスペーサーの量を求めることができる。固定
化された配位子基の量を知るためのより簡便な方法とし
て、配位子分子の固定化反応時に固定化されずに残る配
位子分子を回収し、吸光度測定などから、その量を求め
ることにより固定化された配位子基の量を推定する方法
も可能である。また、固定化されたスペーサーの量を知
るためのより簡便々方法として、スペーサーの末端に、
アミン基やカルボキシル基等の滴定可能な官能基が存在
する場合には、スペーサーを固定化した段階で滴定によ
り求める方法もある。The amount of immobilized ligand groups and spacers can be determined as follows. For example, if the ligand molecule is a substance that absorbs in the ultraviolet and/or visible regions, the carrier for adsorbing biological components can be hydrolyzed with tN hydrochloric acid, etc., and then the absorbance of the supernatant can be measured. The amount of immobilized ligand groups can be determined. At this time, for example, if the above linear molecule is a substance having an amino group,
The amount of immobilized spacer can be determined by analyzing the above supernatant using an amino acid analyzer or the like. A simpler method for determining the amount of immobilized ligand groups is to collect the ligand molecules that remain unimmobilized during the immobilization reaction of the ligand molecules, and determine the amount by measuring absorbance, etc. It is also possible to estimate the amount of immobilized ligand groups by determining . In addition, as a more convenient method for determining the amount of immobilized spacer, at the end of the spacer,
If a titratable functional group such as an amine group or a carboxyl group is present, there is also a method of determining it by titration at the stage where the spacer is immobilized.
本発明で用いられる吸着体は架橋共重合体よりなる。架
橋構造は特に限定されないが、トリアジン環を有する架
橋性単量体単位によって架橋された構造、または、エピ
クロルヒドリンやビスエポキシ化合物が水酸基と結合し
て形成する構造が好ましい。中でも、トリアリルイソシ
アヌレートやトリアリルシアヌレート等のトリアジン環
を有する架橋性単量体単位によって架橋された構造が好
壕シイ。トリアジン環を有する架橋性単量体単位とは、
次式(4)、(B)で示される単量体が重合または共重
合して形成する構造を表わす。The adsorbent used in the present invention is made of a crosslinked copolymer. The crosslinked structure is not particularly limited, but a structure crosslinked by a crosslinkable monomer unit having a triazine ring, or a structure formed by bonding epichlorohydrin or a bisepoxy compound to a hydroxyl group is preferable. Among these, structures crosslinked by crosslinkable monomer units having a triazine ring, such as triallyl isocyanurate and triallyl cyanurate, are preferred. A crosslinkable monomer unit having a triazine ring is
It represents a structure formed by polymerization or copolymerization of monomers represented by the following formulas (4) and (B).
(A) (B)
(ただし、R1、R2およびR3はそれぞれ独立に−C
H2CH=CH2、−CH2c=ca又は−CH2−C
= CH2を示す。)CH3
中でも式(4)において、RI XR2およびR3がす
べて−CH2CH=CH2であるトリアリルイソシアヌ
レートは特に好ましい。(A) (B) (However, R1, R2 and R3 are each independently -C
H2CH=CH2, -CH2c=ca or -CH2-C
= indicates CH2. )CH3 Among these, triallylisocyanurate in which RI XR2 and R3 are all -CH2CH=CH2 in formula (4) is particularly preferred.
吸着体を形成する全単量体単位中の架橋性単量体単位の
割合は、次式(1)で表わされる範囲にあるのが好まし
い。The proportion of crosslinkable monomer units in all monomer units forming the adsorbent is preferably within the range expressed by the following formula (1).
(ただし、aは吸着体中の架橋性単量体単位を除く単量
体単位のモル分率、bは架橋性単量体単位のモル分率、
nは架橋性単量体7分子が有する重合可能人ビニル基等
の官能基の数である。)高速アフイニテイクロマトグラ
フイー用充填剤のようK特に機械的強度を必要とする場
合は、(1)式の左辺は0.2であることがさらに好ま
しい。(However, a is the mole fraction of monomer units excluding crosslinkable monomer units in the adsorbent, b is the mole fraction of crosslinkable monomer units,
n is the number of functional groups such as polymerizable vinyl groups that the seven molecules of the crosslinkable monomer have. ) When high mechanical strength is required, such as a packing material for high-speed affinity chromatography, it is more preferable that the left side of equation (1) is 0.2.
吸着体からなる充填剤の分離能と強度をバランスさせる
ためKは、保水量を適正な範囲に保つことが必要である
。従来、架橋アガロースや架橋デキストランから々る充
填剤は、前述のように含水量が高くて機械的強度が小さ
く、その傾向はポアサイズの大きい充填剤で特に大であ
った。本発明で用いられる吸着体から得られる充填剤は
ポアサイズにかかわらず含水量がO1!〜1Aot7り
、好ましくけO1j〜3.0 t/lの範囲にあり、高
速アフイニテイクロマトグラフイー用充填剤に本用い得
る十分女強度を有する。吸着体の保水量は、吸着体重量
あたりの量で表わされ、水中で十分膨潤させた共重合体
をフィルター付の遠沈管に入れ、共重合体表面の付着水
を遠心分離したのち共重合体を乾燥して、乾燥前後の重
量変化から求め得る。In order to balance the separation ability and strength of the adsorbent filler, it is necessary to maintain the water retention amount of K within an appropriate range. Conventionally, fillers such as cross-linked agarose and cross-linked dextran have high water content and low mechanical strength, as described above, and this tendency is particularly large for fillers with large pore sizes. The filler obtained from the adsorbent used in the present invention has a water content of O1! regardless of the pore size. It is in the range of ~1 Aot7, preferably O1j ~3.0 t/l, and has sufficient strength to be used as a packing material for high-speed affinity chromatography. The water retention capacity of an adsorbent is expressed as the amount per adsorbed weight.The copolymer that has been sufficiently swollen in water is placed in a centrifuge tube equipped with a filter, and the water adhering to the surface of the copolymer is centrifuged. It can be determined by drying the aggregate and determining the weight change before and after drying.
吸着体の比表面積は、通常、j〜/ 000 rr?/
fの範囲にある。す力わち、本発明で用いられる吸着体
はパーマネントボアを有し、硬質であるため乾燥した場
合、ボアは多少収縮するものの膨潤時の状態をほとんど
維持する。The specific surface area of the adsorbent is usually j ~ / 000 rr? /
It is in the range of f. In other words, the adsorbent used in the present invention has permanent bores and is hard, so when it dries, the bores shrink somewhat but maintain almost their swollen state.
比表面積の測定法はいろいろあるが、本発明では最も一
般的々窒素ガスによるBET法で求めた。Although there are various methods for measuring the specific surface area, in the present invention, the most common method is the BET method using nitrogen gas.
また、比表面積測定に用いるサンプルは十分乾燥してお
かねば万らない。本発明の担体は親水性が大で乾燥しに
くいので、水にぬれた担体をアセトンと平衡にした後t
o℃以下で減圧乾燥するのがよい。In addition, the sample used for specific surface area measurement must be sufficiently dried. The carrier of the present invention has high hydrophilicity and is difficult to dry, so after equilibrating the water-wet carrier with acetone,
It is preferable to dry under reduced pressure at a temperature below 0°C.
本発明で用いられる吸着体の形状は特に限定されること
はなく、使用方法に応じて粒状、膜状、糸状、塊状等任
意の形状をとり得る。高速アフイニテイクロマトグラフ
イー用充填剤として用いる場合は、粒状または球状が好
ましい。その場合の粒径は特に限定されないが、通常は
重量平均粒径で3〜!OOμmの範囲にある。高速アフ
イニテイクロマトグラフイー用充填剤として用いる場合
は、−7μ−
3〜20 pm 、さらに実用的には3〜/!pm
の範囲にあるのが好ましい。The shape of the adsorbent used in the present invention is not particularly limited, and can take any shape such as granules, membranes, threads, and lumps depending on the method of use. When used as a filler for high-speed affinity chromatography, it is preferably granular or spherical. In that case, the particle size is not particularly limited, but the weight average particle size is usually 3~! It is in the range of OOμm. When used as a packing material for high-speed affinity chromatography, -7μ-3~20 pm, more practically 3~/! pm
It is preferable that it is in the range of .
次に、本発明で用いられる吸着体の製造法の一例を示す
。Next, an example of a method for manufacturing the adsorbent used in the present invention will be described.
本発明で用いられる吸着体は、例えばカルボン酸ビニル
エステルとトリアジン環を有する架橋性単量体より々る
共重合体のエステル基の70〜♂Oチを、ケン化または
エステル交換反応によって水酸基に変換せしめたのち、
水酸基の一部と活性化試薬とを反応させることにより得
られる活性化担体の活性基に直接配位子分子を反応させ
固定化することによ沙、または、活性化担体の活性基と
スペーサー分子とを反応させスペーサー分子付担体とし
た後に、該スペーサー分子付担体上のスペーサー分子末
端に配位子分子を固定化することにより得ることができ
る。また、あらかじめスペーサー分子と配位子分子とを
反応させ、スペーサー分子の末端に配位子分子が共有結
合により結合した化合物を合成しておき、該化合物と活
性化担体の活性基とを反応させることにより得る方法も
可能である。In the adsorbent used in the present invention, for example, 70 to ♂O of the ester groups of a copolymer consisting of a carboxylic acid vinyl ester and a crosslinkable monomer having a triazine ring are converted into hydroxyl groups by saponification or transesterification. After converting,
By directly reacting and immobilizing a ligand molecule with the active group of an activated carrier obtained by reacting a part of the hydroxyl group with an activation reagent, or by directly reacting and immobilizing the active group of the activated carrier with a spacer molecule. It can be obtained by reacting with the carrier to form a spacer molecule-attached carrier, and then immobilizing a ligand molecule at the end of the spacer molecule on the spacer molecule-attached carrier. Alternatively, a spacer molecule and a ligand molecule are reacted in advance to synthesize a compound in which the ligand molecule is covalently bonded to the end of the spacer molecule, and the compound is reacted with the active group of the activated carrier. It is also possible to obtain it by
ここでカルボン酸ビニルエステルとは、重合可能なカル
ボン酸ビニルエステル基を一つ以上有する化合物のこと
で、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、酪酸ビニル、吉
草酸ビニルおよびピバリン酸ビニルの中から選ばれ、単
独またV!、、2種以上の組合わせで用いられる。中で
も重合やエステル交換またはケン化および入手の容易さ
から酢酸ビニルやプロピオン酸ビニルが特に好ましい。Here, the carboxylic acid vinyl ester refers to a compound having one or more polymerizable carboxylic acid vinyl ester groups, and is selected from vinyl acetate, vinyl propionate, vinyl butyrate, vinyl valerate, and vinyl pivalate. Alone again V! ,, used in combination of two or more types. Among them, vinyl acetate and vinyl propionate are particularly preferred from the viewpoint of ease of polymerization, transesterification, saponification, and availability.
また、トリアジン環を有する架橋性単量体とは、前述の
式(Alまたけ(Blで表わされるものである。中でも
(4)において、R1、R2およびR3がすべてCH2
CH””CI(2であるトリアリルイソシアヌレートは
酢酸ビニルとの共重合性が良く、かつエステル交換また
はケン化に対して安定性が大きいので架橋剤として好ま
しい。In addition, the crosslinkable monomer having a triazine ring is one represented by the above-mentioned formula (Al straddling (Bl). Among them, in (4), R1, R2 and R3 are all CH2
Triallylisocyanurate, which is CH""CI (2), is preferred as a crosslinking agent because it has good copolymerizability with vinyl acetate and high stability against transesterification or saponification.
カルボン酸ビニルエステルとトリアジン環を有する架橋
性単量体よりなる共重合体を得るだめの重合は、懸濁重
合、塊状重合あるいは乳化重合等の通常の重合方法で行
ない得る。高速アフイニテイクロマトグラフイー用充填
剤を得る場合は懸濁重合が好ましい。The polymerization to obtain a copolymer composed of a vinyl carboxylic acid ester and a crosslinkable monomer having a triazine ring can be carried out by a conventional polymerization method such as suspension polymerization, bulk polymerization, or emulsion polymerization. Suspension polymerization is preferred when obtaining fillers for high speed affinity chromatography.
カルボン酸ビニルエステルやトリアジン環を有する架橋
性単量体以外の単量体を、共重合体の物性にほとんど影
響しない程度に併用し共重合させることは本発明で用い
られる吸着体を得るうえで何ら支障ない。In order to obtain the adsorbent used in the present invention, it is important to copolymerize monomers other than carboxylic acid vinyl ester and crosslinkable monomers having a triazine ring to the extent that they hardly affect the physical properties of the copolymer. There is no problem.
また、カルボン酸ビニルニステルトトリアジン環を有す
る架橋性単量体とを共重合させる際に、単量体を溶解す
る有機溶媒の1種以上を単量体に加えることにより得ら
れる共重合体にパーマネントボアを形成させると共に、
そのボアの孔食、孔径あるいは孔径分布を制御する。単
量体を溶解する有機溶媒とけ具体的には、トルエン、キ
シレン等の芳香族炭化水素類、ヘプタン、オクタン、シ
クロヘキサン、デカリン等の脂肪族炭化水素類、酢酸n
−ブチル、酢酸1lIo−ブチル、酢酸n−ヘキシル、
アジピン酸ジオクチル等の脂肪族エステル類、フタル酸
ジメチル、フタル酸ジオクチル、安息香酸メチル等の芳
香族エステル類、ブタノール、ヘプタノール、オクタツ
ール等のアルコール類等のと七である。懸濁重合を行な
う場合は水に溶解しにくい溶媒が好ましい。これらの有
機溶媒は単量体100重量部に対して、20〜300重
量部の範囲で用いられる。特に機械的強度を必要とする
高速アフイニテイクロマトグラフイー用充填剤の製造に
際しては、有機溶媒の量は30〜100重量部の範囲に
あるのがよい。In addition, when copolymerizing a crosslinkable monomer having a carboxylic acid vinyl nystertotriazine ring, a copolymer obtained by adding one or more organic solvents that dissolve the monomer to the monomer. Along with forming a permanent bore,
Control the pitting corrosion, pore size or pore size distribution of the bore. Organic solvents that dissolve monomers include aromatic hydrocarbons such as toluene and xylene, aliphatic hydrocarbons such as heptane, octane, cyclohexane, and decalin, and acetic acid.
-butyl, lIo-butyl acetate, n-hexyl acetate,
These include aliphatic esters such as dioctyl adipate, aromatic esters such as dimethyl phthalate, dioctyl phthalate, and methyl benzoate, and alcohols such as butanol, heptanol, and octatool. When carrying out suspension polymerization, a solvent that is difficult to dissolve in water is preferred. These organic solvents are used in an amount of 20 to 300 parts by weight based on 100 parts by weight of the monomer. In particular, when producing a filler for high-speed affinity chromatography that requires mechanical strength, the amount of organic solvent is preferably in the range of 30 to 100 parts by weight.
吸着体の孔径や孔径分布を制御するために、あるいは吸
着体の柔軟性を増すために単量体混合物に溶解する線状
重合体やゴムを単量体混合物に添加してもよい。単量体
混合物に溶解する線状重合体やゴムとは、例えば、ポリ
酢酸ビニル、ポリスチレン、クロロプレンゴム、ブタジ
ェンゴム等のことで、単量体10θ重量部に対して20
重量部以下、好ましくは10重量部以下で用いられる。Linear polymers or rubbers that are soluble in the monomer mixture may be added to the monomer mixture to control the pore size and pore size distribution of the adsorbent or to increase the flexibility of the adsorbent. Linear polymers and rubbers that dissolve in the monomer mixture include, for example, polyvinyl acetate, polystyrene, chloroprene rubber, butadiene rubber, etc.
It is used in an amount of not more than 10 parts by weight, preferably not more than 10 parts by weight.
重合に際して用いられる開始剤の種類や量は、重合方法
に合わせて任童に選び得る。通常の懸濁重合や塊状重合
では一般的なラジカル重合開始剤、例えば、2.2’−
アゾビスイソブチロニトリル、−/♂−
λ、2′−アゾビスーC,24−ジメチルバレロニトリ
ル)等のアゾ系の開始剤や、過酸化ベンゾイル、過酸化
ラウロイル等の過酸化物系の開始剤を用いることができ
る。The type and amount of the initiator used during polymerization can be selected depending on the polymerization method. In normal suspension polymerization and bulk polymerization, common radical polymerization initiators, such as 2.2'-
Azo-based initiators such as azobisisobutyronitrile, -/♂-λ, 2'-azobis-C,24-dimethylvaleronitrile), and peroxide-based initiators such as benzoyl peroxide and lauroyl peroxide. can be used.
重合によって得られた共重合体のエステル交換またはケ
ン化反応は、水やアルコールまたはその混合液を溶媒と
して酸またはアルカリを用いて行なわれる。ただし、十
分な機械的強度を有する充填剤を得るためにはエステル
基が水酸基へ変わった割合、つまり反応率が10−♂o
%の範囲になるようにコントロールするのがよい。反応
率のコントロールは反応溶媒、反応温度または反応時間
を変えることより適当な条件を選び得る。Transesterification or saponification of the copolymer obtained by polymerization is carried out using an acid or alkali in water, alcohol, or a mixture thereof as a solvent. However, in order to obtain a filler with sufficient mechanical strength, the ratio of ester groups to hydroxyl groups, that is, the reaction rate, must be 10-♂o.
It is best to control it within a range of %. The reaction rate can be controlled by selecting appropriate conditions by changing the reaction solvent, reaction temperature, or reaction time.
ケン化および/またはエステル交換によって得られた共
重合体に活性基を導入して、活性化担体を得る方法とし
ては、以下の方法を挙げることができる。ケン化および
/またはエステル交換によって得られた共重合体の水酸
基に、例えば、/、/’−カルボニルジイミダゾールを
反応させてイミダゾリルカルバメート基を有する活性化
担体を得る。Examples of methods for obtaining activated carriers by introducing active groups into copolymers obtained by saponification and/or transesterification include the following methods. The hydroxyl groups of the copolymer obtained by saponification and/or transesterification are reacted with, for example, /,/'-carbonyldiimidazole to obtain an activated carrier having imidazolyl carbamate groups.
イミダゾリルカルバメート基の結合量は、/、/’−カ
ルボニルジイミダゾールの量や、反応温度等でコントロ
ールできる。The amount of imidazolyl carbamate groups bonded can be controlled by the amount of /, /'-carbonyldiimidazole, reaction temperature, etc.
スペーサー分子を固定化する場合にけ、上記のようにし
て得られた活性化担体の活性基とスペーサー分子とを次
の方法で反応させることによりスペーサー分子付担体を
得る。すなわち、スペーサー分子の溶液を適当な田に調
整し、該溶液に上記の活性化担体を加えて懸濁し、攪拌
することにょF) 、x ヘーサー分子の固定化された
スペーサー分子付担体を得ることができる。In the case of immobilizing spacer molecules, the spacer molecule-attached carrier is obtained by reacting the active group of the activated carrier obtained as described above with the spacer molecule in the following manner. That is, by adjusting a solution of spacer molecules to an appropriate temperature, adding the above-mentioned activated carrier to the solution, suspending, and stirring, x) to obtain a carrier with spacer molecules immobilized thereon. I can do it.
このようにして得られたスペーサー分子付担体に配位子
分子を固定化する方法としては、次の方法を挙げること
ができる。As a method for immobilizing a ligand molecule on the thus obtained spacer molecule-attached carrier, the following method can be mentioned.
一例として、配位子分子としてp−アミノペンツアミジ
ンを固定化した担体は、次の方法で得ることができる。As an example, a carrier on which p-aminopenzamidine is immobilized as a ligand molecule can be obtained by the following method.
固定化されたスペーサー分子の末端にカルボキシル基を
有するスペーサー分子付担体を得て、該担体、配位子分
子およびカルボジイミド等の縮合剤を含む懸濁液を、適
当な…に調整し、攪拌することKより得ることができる
。A carrier with a spacer molecule having a carboxyl group at the end of the immobilized spacer molecule is obtained, and a suspension containing the carrier, a ligand molecule, and a condensing agent such as carbodiimide is adjusted to an appropriate... and stirred. It can be obtained from KotoK.
次に1このようにして得られた吸着体を用いる本発明の
分離方法の一例を示す。Next, an example of the separation method of the present invention using the adsorbent thus obtained will be described.
前記吸着体を充填したカラムに移動相となる溶媒を通液
しつつ該酵素を含む試料を注入し、酵素を吸着体に選択
的に吸着させたのち、移動相を他の溶媒に変更して通液
し酵素を吸着体から溶離して、カラムから分離溶出でき
る。溶出した酵素の確認は検出器と記録計を用いて行な
う。これらの一連の操作は通常の高速液体クロマトグラ
フを用いて行なうことができる。A sample containing the enzyme is injected while passing a solvent serving as a mobile phase through a column filled with the adsorbent, and after the enzyme is selectively adsorbed to the adsorbent, the mobile phase is changed to another solvent. The enzyme can be separated and eluted from the column by passing a liquid through it to elute the enzyme from the adsorbent. Confirm the eluted enzyme using a detector and recorder. A series of these operations can be performed using a conventional high performance liquid chromatograph.
ここでカラムの形状、大きさ、材質は特に限定されず、
通常液体クロマトグラフィーで用いられるステンレス製
やガラス製のカラムでよい。移動相の溶媒には、通常は
塩や緩衝剤を溶解した水溶液が用いられ、その組成は試
料や固定相に応じて選択し得る。塩や緩衝剤の具体例と
しては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硝酸ナトリウ
ム、硝酸カリウム、硫酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、
酢酸、リン酸水素/ナトリウム、リン酸水素コナ−,2
/−
トリウム、トリス塩酸塩等、通常水溶媒系の液体クロマ
トグラフィーで生体成分を分離する際に用いられるもの
が挙げられる。酵素を吸着体から溶離させる時の移動相
としては、その前に用いる移動相に対して、例えば、/
)イオン強度や声等を変えたもの、2)尿素や塩酸グア
ニジン等の蛋白質変性剤を加えたもの、3)吸着した酵
素の競争阻害剤を加えたもの等を挙げることができる。The shape, size, and material of the column are not particularly limited;
A stainless steel or glass column commonly used in liquid chromatography may be used. The solvent for the mobile phase is usually an aqueous solution in which salts and buffers are dissolved, and its composition can be selected depending on the sample and stationary phase. Specific examples of salts and buffers include sodium chloride, potassium chloride, sodium nitrate, potassium nitrate, sodium sulfate, sodium acetate,
Acetic acid, hydrogen phosphate/sodium, hydrogen phosphate, 2
/-Thorium, tris hydrochloride, etc., which are usually used when separating biological components by aqueous solvent liquid chromatography, can be mentioned. The mobile phase used to elute the enzyme from the adsorbent is different from the mobile phase used before elution, for example, /
2) added a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride; and 3) added a competitive inhibitor of adsorbed enzymes.
溶離溶媒の2種以上を組合わせて多段階に連続的、また
は段階的に切替えて用いることもできる。また、注入し
た酵素を固定相に吸着させずに、吸着体との弱い相互作
用により遅れて溶出させるような移動相を最初に用いる
ことも可能である。It is also possible to use a combination of two or more types of eluent solvents, changing them continuously or stepwise in multiple stages. It is also possible to initially use a mobile phase that does not allow the injected enzyme to be adsorbed to the stationary phase, but rather causes it to be eluted with a delay due to weak interaction with the adsorbent.
溶出された成分は紫外吸収あるいは螢光検出器等を用い
ることにより、溶出と同時に連続的に検出し、記録計に
よシ記録することができる。オた溶出された成分の酵素
活性の有無や活性の大小等は、次のような方法で該成分
の溶出とほとんど同時に知ることが可能である。すなわ
ち、上記の検出器を出たあとの溶出液を流路内で目的と
する酵−ココ−
素に特異的な基質と混合し反応させることにより、例え
ば、螢光物質を結合した合成基質を用いて混合した場合
には、遊離される螢光物質を螢光検出器で検出するとと
により知るととができる。The eluted components can be continuously detected at the same time as they are eluted using an ultraviolet absorption or fluorescence detector, and recorded using a recorder. The presence or absence of enzymatic activity and the magnitude of the activity of the eluted component can be determined almost simultaneously with the elution of the component by the following method. That is, by mixing and reacting the eluate after exiting the above-mentioned detector with a substrate specific for the target enzyme cocoin in the flow path, for example, a synthetic substrate bound to a fluorescent substance can be produced. When the fluorescent substance is used and mixed, the released fluorescent substance can be detected by a fluorescence detector.
本発明で用いられる吸着体は硬質であり、高速アフイニ
テイクロマトグラフイー用充填剤として用いた場合、溶
離液を高流速で流すととができ、迅速分析が可能になる
。また、本発明で用いられる吸着体は、広い…範囲で安
定であり、例えば、シリカゲルを骨格とする吸着体では
適用できカいアルカリ条件下でも変質がなく安定に使い
得るメリットを有している。さらに1本発明で用いられ
る吸着体は、多量の水酸基を有するため十分な親水性を
有し、生体成分等に対し疎水的吸着が少々い利点を有し
ている。The adsorbent used in the present invention is hard, and when used as a packing material for high-speed affinity chromatography, it allows the eluent to flow at a high flow rate, making rapid analysis possible. In addition, the adsorbent used in the present invention is stable over a wide range, and has the advantage that it can be stably used without deterioration even under alkaline conditions, which is not applicable to adsorbents with a silica gel skeleton, for example. . Furthermore, the adsorbent used in the present invention has sufficient hydrophilicity because it has a large amount of hydroxyl groups, and has the advantage that hydrophobic adsorption to biological components and the like is slightly low.
本発明の分離方法は、上記の吸着体を充填剤とする高速
アフイニテイクロマトグラフイーによるため、トリプシ
ン類縁酵素を迅速かつ簡便に分離分析することが容易に
kる。本発明の分離方法によると、プラスミンの前駆体
であるプラスミノーゲンの血中での主な存在形態である
Glu−プラスミノーゲンとLIyB−プラスミノーゲ
ンを特異的に分離することができるため、血液凝固線溶
系の疾患の診断あるいは各種のプラスミノーゲン試料の
純度検定等への応用が可能となる。Since the separation method of the present invention uses high-speed affinity chromatography using the above-mentioned adsorbent as a packing material, trypsin-related enzymes can be easily and quickly separated and analyzed. According to the separation method of the present invention, it is possible to specifically separate Glu-plasminogen and LIyB-plasminogen, which are the main forms of plasminogen, which is a precursor of plasmin, in blood. Applications such as diagnosis of blood coagulation and fibrinolytic diseases and purity testing of various plasminogen samples are possible.
以上のように、本発明の分離方法は生化学や医学の分野
における寄与が著しく大きい。As described above, the separation method of the present invention has made a significant contribution to the fields of biochemistry and medicine.
以下の実施例において、本発明をさらに詳細に説明する
が、本発明は実施例に何ら限定されるものではない。The present invention will be explained in more detail in the following examples, but the present invention is not limited to the examples at all.
実施例/
酢酸ビニル100?、)リアリルイソシアヌレートグよ
グ2、酢酸n−ブチル ざOり、デカリングOfおよび
、2..2’−アゾビスイソブチロニトリル3.≠1よ
りなる均一混合液と、少量のポリビニルアルコールおよ
びリン酸ナトリウムを溶解した水gOO−とを還流冷却
器、窒素導入管、撹拌棒な備えた3ノの三つロフラスコ
に入れ十分攪拌したのち、乙!℃で/r待時間さらに7
5℃で5時間加熱して懸濁重合を行々い粒状共重合体を
得た。次に1p過、水洗、ついでアセトン抽出後、カセ
イソーダ 6!tを溶解したメタノール、21と共に還
流冷却器、窒素導入管、撹拌棒を備え九jl三つロフラ
スコ中で71℃で2θ時間攪拌して共重合体のケン化反
応を行なったのち粒子を濾過、水洗、さらに乾燥した。Example/ Vinyl acetate 100? ,) Realyl isocyanurate group 2, n-butyl acetate solution, decaling and, 2. .. 2'-Azobisisobutyronitrile 3. ≠ 1 and water gOO− in which a small amount of polyvinyl alcohol and sodium phosphate were dissolved were placed in a three-necked flask equipped with a reflux condenser, a nitrogen inlet tube, and a stirring bar, and stirred thoroughly. , otsu! ℃/r waiting time additional 7
Suspension polymerization was carried out by heating at 5° C. for 5 hours to obtain a granular copolymer. Next, pass 1p, wash with water, then extract with acetone, and add caustic soda 6! The copolymer was saponified by stirring for 2θ hours at 71°C in a 9-jl three-necked flask equipped with a reflux condenser, a nitrogen inlet tube, and a stirring bar together with methanol in which T was dissolved, and the particles were filtered. Washed with water and further dried.
該粒子 10fを5OO−のビーカーに入れ、モレキュ
ラーシープ4ZAで乾燥したジオキサン!00m1、へ
/′−カルボニルジイミダゾール3.211fを加えて
攪拌しつつ、室温でlj分間反応を行々い、イミダゾリ
ルカルバメート基を活性基として有する活性化担体とし
た。該活性化担体は、上記の乾燥ジオキサンで洗浄した
のち、吸引−過した。該活性化担体を、t−アミノヘキ
サン酸λA、、2fを含む1M炭酸ナトリウム水溶液(
pH10,0)2θOdK加え振盪しつつ、グ℃で2を
時間反応させるととにより、スペーサー分子として2−
アミノヘキサン酸を固定化したスペーサー分子付担体を
得た。該ス−,lk−
ペーサ−分子付担体に固定化されたスペーサー分子の量
はグθμrlol/fスペーサー分子付担体であった。The particles 10f were placed in a 5OO- beaker and dried with Molecular Sheep 4ZA!Dioxane! 00ml and 3.211f of he/'-carbonyldiimidazole were added and the reaction was carried out at room temperature for 1j minutes with stirring to obtain an activated carrier having an imidazolyl carbamate group as an active group. The activated carrier was washed with the above dry dioxane and then suction-filtered. The activated carrier was dissolved in a 1M aqueous sodium carbonate solution containing t-aminohexanoic acid λA, 2f (
By adding 2θOdK (pH 10, 0) and reacting with 2 for an hour at 3°C while shaking, 2-
A carrier with spacer molecules on which aminohexanoic acid was immobilized was obtained. The amount of spacer molecules immobilized on the su-, lk-spacer molecule-attached carrier was ≧θμrlol/f spacer molecule-attached carrier.
上記のようにして得られたスペーサー分子付担体を乾燥
させたもの2fを30tttlビーカーに入れ、さらw
、o、xyr2− (N−モルホリノ)エタンスルホン
酸水溶液(…lA7オ)/jtd、/−エチル−3−(
3−ジメチルアミンプロピル)カルボジイミド塩酸塩0
.27fを加え、室温で30分間攪拌した。Place 2f of the dried carrier with spacer molecules obtained above in a 30tttl beaker, and
, o, xyr2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid aqueous solution (...lA7o)/jtd, /-ethyl-3-(
3-dimethylaminepropyl)carbodiimide hydrochloride 0
.. 27f was added and stirred at room temperature for 30 minutes.
との懸濁液にp−アミノペンツアミジン塩酸塩、2J:
lrfを加え、声を4L、7jtK調整したのち、懸濁
液を700−の三角フラスコに移し、室温で、2J時間
振盪して、スペーサー分子としてt−アミノヘキサン酸
、配位子分子としてp−アミノベンツアミジンを有する
生体成分吸着用担体を得た。得られた生体成分吸着用担
体は、水、0.0jN水酸化ナトリウムを含む7M塩化
ナトリウム水溶液、o、osH塩酸を含む7M塩化ナト
リウム水溶液、水の順で洗浄した。洗液を回収してその
コタunmにおける吸光度から算出したp−アミノベン
ツアミジンの固−2を−
定化量は乾燥した生体成分吸着用担体/1あたり/3μ
mol であった。なお、該生体成分吸着用担体の平
均粒径は5!Oμm、水酸基密度は弘りmmo!/?生
体成分吸着用担体、保水量は/、 9 f水/2生体成
分吸着用担体、比表面積は4’Orr?/f生体成分吸
着用担体であった。p-aminopenzamidine hydrochloride, 2J:
After adding lrf and adjusting the volume to 4L and 7jtK, the suspension was transferred to a 700-Erlenmeyer flask and shaken at room temperature for 2J hours to dissolve t-aminohexanoic acid as a spacer molecule and p- as a ligand molecule. A carrier for adsorbing biological components containing aminobenzamidine was obtained. The obtained biological component adsorption carrier was washed in the following order: water, a 7M aqueous sodium chloride solution containing 0.0jN sodium hydroxide, a 7M aqueous sodium chloride solution containing o,osH hydrochloric acid, and water. The solid amount of p-aminobenzamidine calculated from the absorbance at nm after collecting the washing solution was 3μ per dry biological component adsorption carrier.
It was mol. In addition, the average particle size of the carrier for adsorbing biological components is 5! Oμm, hydroxyl group density is Hiroshi mmo! /? Carrier for adsorption of biological components, water holding capacity is /, 9 f water/2 Carrier for adsorption of biological components, specific surface area is 4'Orr? /f It was a carrier for adsorbing biological components.
上記のようにして得られた吸着体を、パイレックスガラ
ス製カラム(内径AwX長さ/θcrn)K充填し、j
θ娼リン酸ナトリウムと100mM塩化ナトリウムを含
む水溶液(pH7りを移動相として、室温、流速o、s
d/viaで牛トリプシンo、!μmを注入したところ
、トリプシン活性を持つ蛋白質は溶出しなかった。続い
て、移動相を30mM +)ン酸ナトリウム、100m
M塩化ナトリウムおよび20rrMt−アミノヘキサン
酸を含む水溶液(…71iL)に切替えると、トリプシ
ン活性を持つ一つの蛋白質を主成分とする成分が溶出し
た。The adsorbent obtained as described above was packed in a Pyrex glass column (inner diameter Aw x length/θcrn), and
Aqueous solution containing θ sodium phosphate and 100 mM sodium chloride (pH 7 as mobile phase, room temperature, flow rate o, s)
Bovine trypsin o with d/via! When μm was injected, no protein with trypsin activity was eluted. Subsequently, the mobile phase was changed to 30mM +) sodium chloride, 100mM
When switching to an aqueous solution (...71 iL) containing M sodium chloride and 20 rr Mt-aminohexanoic acid, a component mainly composed of one protein with trypsin activity was eluted.
なお、移動相送液ポンプとしては、KHU−2J 3A
(協和精密■)、検出器としては、蛋白質の検出にはR
F−330(N高滓製作所)励起波長、2Ltnm。In addition, as a mobile phase liquid sending pump, KHU-2J 3A
(Kyowa Seimitsu ■), as a detector, R is used for protein detection.
F-330 (N Takasugi Seisakusho) Excitation wavelength, 2Ltnm.
検出波長3≠θnm、酵素活性の検出にはFD−/10
(日本分光工業■)励起波長3Ajnm、検出波長≠A
Ovanを用いた。トリプシン活性の検出には、合成基
質t−ブトキシカルボニル−L−グルタミル−L−リシ
ル−し−リシングーメチルグマリル−7−アミドがトリ
プシンにより分解されることにより遊離される7−アミ
ツーゲーメチルクーq IJ yの螢光を利用した。Detection wavelength 3≠θnm, FD-/10 for enzyme activity detection
(JASCO Corporation ■) Excitation wavelength 3Ajnm, detection wavelength ≠A
Ovan was used. For detection of trypsin activity, 7-amizuge methyl, which is released by decomposition of the synthetic substrate t-butoxycarbonyl-L-glutamyl-L-lysyl-lysing-methylgumaryl-7-amide by trypsin, is used. The fluorescence of Kuq IJ y was utilized.
実施例λ
実施例1で充填したカラムに、50mM !I ン酸ナ
トリウムと100mM塩化ナトリウムを含む水溶液(p
H7弘)を移動相として、室温、流速0.! tnt/
yginでヒトプラスミノーゲン(ミドリ十字) 10
ptを高分子量型ウロキナーゼ(ミドリ十字)/jU
を用いて、3分間、37℃で活性化した混合物を注入
した。酵素活性を持たないプラスミノーゲンが素通多部
分に溶出したのみであったが、続いて移動相をjOrr
Mリン酸ナトリウム、100mM塩化ナトリウムおよび
20mM l、−アミノヘキサン酸を含む水溶液(ff
174’)K切替えると、プラスミン活性を持つ蛋白質
が溶出した。なお、装置、合成基質等は実施例1と同じ
ものを用いた。Example λ To the column packed in Example 1, 50mM! I Aqueous solution containing sodium chloride and 100mM sodium chloride (p
H7 Hiromu) as the mobile phase at room temperature and at a flow rate of 0. ! tnt/
Human plasminogen (green cross) with ygin 10
pt is high molecular weight urokinase (green cross)/jU
The activated mixture was injected for 3 minutes at 37° C. using Plasminogen, which does not have enzymatic activity, was only eluted in the transparent area, but then the mobile phase was
An aqueous solution (ff
When 174')K was switched, a protein with plasmin activity was eluted. Note that the same equipment, synthetic substrates, etc. as in Example 1 were used.
実施例3
実施例/で得られた粒状共重合体のケン化反応を行なっ
たのちの粒子10fを夕0θdのビーカーに入れ、モレ
キュラーシーブ≠Aで乾燥したアセトン100yd、/
−/′−カルボニルジイミダゾール1AOj fを加え
て攪拌しつつ、室温でlj分間反応を行ない、イミダゾ
リルカルバメート基を活性基として有する活性化担体と
した。実施例1と同様の方法でスペーサー分子としてt
−アミノヘキサン酸を該活性化担体と反応させて、t−
アミノヘキサン酸が固定化されたスペーサー分子付担体
を得た。固定化されたt−アミノヘキサン酸のJut/
/りμmol/lスペーサー分子付担体であった。Example 3 After saponifying the granular copolymer obtained in Example 1, 10f of particles were placed in a beaker at 0θd, and 100yd of acetone, dried with molecular sieve≠A, was added.
-/'-carbonyldiimidazole 1AOj f was added and the reaction was carried out at room temperature for lj minutes with stirring to obtain an activated carrier having an imidazolyl carbamate group as an active group. t as a spacer molecule in the same manner as in Example 1.
-aminohexanoic acid is reacted with the activated carrier, t-
A spacer molecule-attached carrier on which aminohexanoic acid was immobilized was obtained. Immobilized t-aminohexanoic acid Jut/
/μmol/l spacer molecule-attached carrier.
実施例1と同様にして、配位子分子としてp−アミノベ
ンツアミジンを固定化した。p−アミノベンツアミジン
塩酸塩の量をざ9..2vatiとしたほかはすべて実
施例/と同様とした。固定化されたp−アミノベンツア
ミジンの量は、乾燥した生体成分−コター
吸着用担体/2あたりlrzμmo1であった。In the same manner as in Example 1, p-aminobenzamidine was immobilized as a ligand molecule. 9. Calculate the amount of p-aminobenzamidine hydrochloride. .. Everything was the same as in Example/, except that 2vati was used. The amount of immobilized p-aminobenzamidine was lrz μmol per 2 dry biological component-Cotter adsorption carriers.
上記の吸着体をパイレックスガラス製カラム(内径t1
1IK×長さ/ Octn)に充填し、jOrrMリン
酸ナトリウムと100mM塩化ナトリウムを含む水、溶
液(pH7≠)を移動相として、室温、流速o、rψ−
で牛トリプシンO1夕μfを注入したところ、トリプシ
ン活性を持つ蛋白質は溶出しなかった。続いて移動相を
j OmMリン酸ナトリウム、100mM塩化ナトリウ
ムおよび20rrM乙−アミノヘキサン酸を含む水溶液
(pH1)に切替えたが、蛋白質は溶出しなかった。次
に、移動相をjOmMリン酸ナトリウム、1100rn
塩化ナトリウム、20rnN(A−アミノヘキサン酸お
よび3M尿素を含む水溶液(f z+)に切替えると、
トリプシン活性を持つ2つの蛋白質を主成分とする成分
が溶出した。なお、装置、合成基質等は実施例/と゛同
じものを用いた。The above adsorbent was placed in a Pyrex glass column (inner diameter t1
1IK x length/Octn), and using a water solution (pH 7≠) containing jOrrM sodium phosphate and 100mM sodium chloride as the mobile phase, at room temperature, flow rate o, rψ-
When bovine trypsin O1 μf was injected, no protein with trypsin activity was eluted. Subsequently, the mobile phase was switched to an aqueous solution (pH 1) containing OmM sodium phosphate, 100mM sodium chloride, and 20mM O-aminohexanoic acid, but no protein was eluted. Next, the mobile phase was changed to jOmM sodium phosphate, 1100rn
When switching to an aqueous solution containing sodium chloride, 20rnN (A-aminohexanoic acid and 3M urea (f z+),
A component consisting mainly of two proteins with trypsin activity was eluted. Note that the same equipment, synthetic substrates, etc. as in Examples were used.
実施例グ
実施例1で得られた粒状共重合体のケン化反応を打力っ
たのちの粒子2.11を100dのビーカーに入れ、モ
レキュラーシーブ4IAで乾燥したアセ−30=
トン、2!−1/、l′−カルボニルジイミダゾール、
lJ’4Mを加えて、実施例1と同様にしてイミダゾリ
ルカルバメート基を活性基として有する活性化担体とし
たのちにt−アミノヘキサン酸が固定化されたスペーサ
ー分子付担体を得た。固定化された2−アミノヘキサン
酸の量は3tりμmol/fスペーサー分子付担体であ
った。Example G After saponifying the granular copolymer obtained in Example 1, particles 2.11 were placed in a 100 d beaker and dried with a molecular sieve 4IA of ace-30 = tons, 2! -1/, l'-carbonyldiimidazole,
lJ'4M was added to obtain an activated carrier having an imidazolyl carbamate group as an active group in the same manner as in Example 1, and a spacer molecule-attached carrier on which t-aminohexanoic acid was immobilized was obtained. The amount of immobilized 2-aminohexanoic acid was 3 t/μmol/f spacer molecule attached carrier.
実施例/と同様にして、配位子分子としてp−アミノペ
ンツアミジンを固定化した。p−アミノペンツアミジン
塩酸塩の量を2g9./;s9としたほかは、すべて実
施例1と同様とした。固定化されたp−アミノペンツア
ミジンの量は、乾燥した吸着体/fあたシフ3グμrn
o1であった。In the same manner as in Example, p-aminopenzamidine was immobilized as a ligand molecule. The amount of p-aminopenzamidine hydrochloride was 2 g9. Everything was the same as in Example 1 except that /;s9 was used. The amount of immobilized p-aminopenzamidine was determined by
It was o1.
上記の吸着体をステンレス製カラム(内径Aws×長さ
10 cm )’ K充填し、JOmM リン酸ナト
リウムと1100rr塩化ナトリウムを含む水溶液(f
fl 74’)を移動相として、室温、流速/、 Og
d/rmでGlu−プラスミノーゲンZjμ2およびI
ys−プラスミノーゲン3.θμ2を含む試料液を注入
したところ、Glu−プラスミノーゲンが素通り部分よ
り遅れて溶出した。続いて、移動相をjOrrMリン酸
ナトリウム、100mM塩化ナトリウムおよび、20t
nM6−アミノヘキサン酸を含む水溶液(pH74’)
に切替えると、Lys−プラスミノーゲンが溶出した。The above adsorbent was packed in a stainless steel column (inner diameter Aws x length 10 cm)'K, and an aqueous solution containing JOmM sodium phosphate and 1100rr sodium chloride (f
fl 74') as the mobile phase, room temperature, flow rate /, Og
Glu-plasminogen Zjμ2 and I in d/rm
ys-plasminogen 3. When a sample solution containing θμ2 was injected, Glu-plasminogen eluted later than the portion that passed through. Subsequently, the mobile phase was changed to jOrrM sodium phosphate, 100mM sodium chloride and 20t
Aqueous solution containing nM 6-aminohexanoic acid (pH 74')
When switched to , Lys-plasminogen was eluted.
なお、検出された蛋白質はいずれもプラスミン活性を持
たなかった。また、装置は移動相送液ポンプとしてTW
INCLE (日本分光工業−)を用いたほかは、実施
例1と同じものを用いた。Note that none of the detected proteins had plasmin activity. In addition, the device can also be used as a mobile phase pump.
The same material as in Example 1 was used except that INCLE (JASCO Corporation) was used.
Claims (4)
により分離する方法において、アルコール性水酸基およ
び該酵素に対して親和性のある配位子基を有する全多孔
質の吸着体を固定相として用いることを特徴とするトリ
プシン類縁酵素の分離方法。(1) A method for separating trypsin-related enzymes by liquid chromatography, characterized in that a fully porous adsorbent having an alcoholic hydroxyl group and a ligand group having an affinity for the enzyme is used as a stationary phase. A method for isolating trypsin-related enzymes.
合体重量あたり、アルコール性水酸基1.0〜14.0
mmol/gおよび配位子基0.001〜3000μm
o1/gを有し、保持し得る水の量が0.5〜4.0g
/gおよび比表面積が5〜1000m^2/gである特
許請求の範囲第1項記載の分離方法。(2) The fully porous adsorbent is made of a crosslinked copolymer, with 1.0 to 14.0 alcoholic hydroxyl groups per polymer weight.
mmol/g and ligand group 0.001-3000μm
o1/g and the amount of water that can be held is 0.5 to 4.0 g
2. The separation method according to claim 1, wherein the specific surface area is 5 to 1000 m^2/g.
ルアルコール単位に由来する水酸基である特許請求の範
囲第1項または第2項記載の分離方法。(3) The separation method according to claim 1 or 2, wherein the alcoholic hydroxyl group of the fully porous adsorbent is a hydroxyl group derived from a vinyl alcohol unit.
はグアニジノ基を有するものである特許請求の範囲第1
項ないし第3項のいずれかに記載の分離方法。(4) Claim 1, wherein the fully porous adsorbent has an amidino group or a guanidino group.
The separation method according to any one of Items 1 to 3.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP16010684A JPS6137095A (en) | 1984-07-30 | 1984-07-30 | Method of separating enzyme analog to trypsin |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP16010684A JPS6137095A (en) | 1984-07-30 | 1984-07-30 | Method of separating enzyme analog to trypsin |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6137095A true JPS6137095A (en) | 1986-02-21 |
JPS642358B2 JPS642358B2 (en) | 1989-01-17 |
Family
ID=15707978
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP16010684A Granted JPS6137095A (en) | 1984-07-30 | 1984-07-30 | Method of separating enzyme analog to trypsin |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS6137095A (en) |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5135481A (en) * | 1974-09-18 | 1976-03-25 | Fujiwa Kako Kk | KOJUNDOHITOROKINAAZE NO SEIHO |
JPS5135483A (en) * | 1974-09-18 | 1976-03-25 | Fujiwa Kako Kk | Hitorokinaaze no noshukuseiseiho |
JPS57190003A (en) * | 1981-05-18 | 1982-11-22 | Asahi Chem Ind Co Ltd | Wholly porous activated gel |
-
1984
- 1984-07-30 JP JP16010684A patent/JPS6137095A/en active Granted
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5135481A (en) * | 1974-09-18 | 1976-03-25 | Fujiwa Kako Kk | KOJUNDOHITOROKINAAZE NO SEIHO |
JPS5135483A (en) * | 1974-09-18 | 1976-03-25 | Fujiwa Kako Kk | Hitorokinaaze no noshukuseiseiho |
JPS57190003A (en) * | 1981-05-18 | 1982-11-22 | Asahi Chem Ind Co Ltd | Wholly porous activated gel |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS642358B2 (en) | 1989-01-17 |
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