【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
本発明は微生物の産生する毒性物質およびワク
チン類に柿渋を添加することを特徴とする微生物
の産生する毒性物質の不活化およびワクチン類の
弱毒化方法に関するものである。
病原微生物の産生する毒性物質より製する無毒
化毒素（トキソイド）および死菌より製するワク
チンのような生物学的製剤は、感染病の予防の目
的で、人体および動物を自動的に免疫するために
用いられる免疫原であるが、病原微生物を使用し
て製造され、またその品質の試験の大部分は動物
を使つて行なわれる関係から、その製造方法や試
験方法は他の薬品には見られない独特の技術を要
し、さらにその保存方法などの取扱いにもより厳
重な注意を必要とするものである。このため法律
においてもこの製剤に関して特に規則を設けてそ
の均一性、有効性並びに安全性などの品質の確保
を図つている。
それにもかかわず、生物学的製剤の副作用は、
現状では依然として避けられないものであり、時
には予防接種の際の医療事故も発生している。例
えば百日せきワクチンは、疫学的には特に東南ア
ジア、アフリカ諸国などの発展途上地域において
は必要不可欠であると見なされているにもかかわ
らず、その副作用として接種局所の腫脹、疼痛、
全身症状としての発熱、嘔吐、まれにはシヨツク
症状あるいは重篤な脳症状などが報告されてお
り、その予防効果を残して副作用を除くことは現
在ではなお不充分であると云われている。
一方、従来のより柿渋はその収斂作用に基いて
用途が広く、例えば雨合羽、渋うちわあるいは清
酒濁りの清澄化などに用いられてきている。〔柴
田桂太編：資源植物事典、100頁（昭36年、第６
版、北陸館発行）〕
本発明者等は多年にわたり、柿渋の生物活性並
びに医薬としての応用研究を行なつてきたが、柿
渋を各種の生物学的製剤に添加したところ、微量
でその毒性物質の不活化および副作用物質の弱毒
化に対して予測しえなかつたすぐれた効果を発現
することを見い出し、しかも目的とする抗原性を
損なわないことを確認して本発明を完成した。
本発明に使用される柿渋としては、原料植物で
あるカキノキ科のDiospyros属植物の例えばカキ
（Diospyros kaki Thumb・）、マメガキ
（Diospyros lotus Ｌ・）あるいはコクタン
（Diospyros ebenum Koenig）などの果実を用い
て常法（前記の資源植物事典、100頁）に従つて
製造したものが用いられるが、さらに好適には以
下に例示する方法によつて抽出、精製したものを
使用することができる。
すなわち、その抽出精製方法は原料未熟柿を磨
砕し、アセトンを加えて室温で浸漬し過して
後、液よりアセトンを留去し、残液にメタノー
ルさらにエーテルを添加して析出した沈澱を取
する。得られた沈澱を蒸留水に溶解し、なお残留
する有機溶剤を留去し、透析した後、過して
液を加熱滅菌し、次いで凍結乾燥することによつ
て、淡褐色の微細粉末として得ることができる。
このようにして得られる粉末状の柿渋の性状
は、水、含水メタノール、含水エタノール、含水
アセトンなどに易溶性で、熱に対して安定であ
り、その0.1乃至0.5％水溶液はほゞ中性付近を示
し、塩化第二鉄反応は陽性である。
その毒性は、0.5％柿渋水溶液0.1mlをウイスタ
ーイマミチ系雄ラツト（体重200〜250ｇ）の腹腔
内に注射しても腹腔刺戟症状（腹水の貯留または
腹膜の癒着など）はなく、１乃至５％の水溶液の
腹腔内注射では死亡例はないが、腹膜刺戟症状が
見られる。さらに、１％の水溶液0.1mlをラツト
の尾静脈に注射しても、死亡せず、２％以上の水
溶液0.1mlを同様に静脈内注射すると死亡する。
また1.25％の柿渋水溶液0.05mlをddY系雄マウス
（５週令）の足蹠に注射しても局所刺戟（腫脹）
作用はない。しかるに局方タンニン酸水溶液は
0.1％でもはるかに刺戟が強い。
次に毒性物質の不活化および副作用物質の弱毒
化における柿渋の活性は、以下の試験方法によつ
て求めることができる。
柿渋の活性試験法
(a) エラブ海蛇毒40γ／0.1ml蒸留水に対して同
量の柿渋水溶液を加えて試験管内で中和し、
ddY系雄マウス（５週令）の腹腔内に投与した
場合には0.039％の濃度でエラブ海蛇毒の致死
作用は不活化される。他方、局方タンニン酸で
は1.25％以上でないと、致死作用は不活化し得
ない。
(b) ハブ毒20γ／0.1ml蒸留水に対して0.1mlの柿
渋水溶液を加える試験管内試験では、0.078％
以上の濃度で家兎の皮内出血作用を抑制する。
他方、同様の抑制作用は局方タンニン酸では５
％以上の濃度が必要である。
(c) 柿渋と結合した海蛇毒あるいはハブ毒は、遠
心による分離はおこらず、抗血清との間のゲル
内沈降反応でも沈降線は見られない。他方、局
方タンニン酸は一たん結合した蛇毒でも遠心に
よつて分離して、毒性が復元する。またゲル内
沈降反応でも沈降線を生ずる。
このような活性を表わす柿渋を本発明の目的で
ある生物学的製剤に適用する好適例としては、微
生物例えば百日咳菌、ジフテリア菌、破傷風菌、
ポツリヌス菌あるいはブドウ球菌のような細菌の
毒素の不活化およびワクチン例えば腸チフス、パ
ラチフス、コレラ、百日咳、せん疫あるいは炭疽
のような菌のワクチンの副作用物質の弱毒化があ
げられる。
その添加量は目的の生物学的製剤によつて異な
るが、通常は0.1％以下の濃度の水溶液を微量添
加することで充分である。
本発明の柿渋を用いる生物学的製剤の弱毒化方
法の特徴としては、
(1) 毒作用の不活化が強く、従つて極めて微量で
効力を表わし、その結果柿渋そのものの毒性は
ほとんど問題にならないこと
(2) 水溶液で熱安定であること
(3) 毒性物質との結合が不可逆的であること
(4) 毒性を不活化あるいは副作用物質を弱毒化し
ても、目的の抗原性は失われないこと
(5) 原料の入手が容易であり、抽出が簡便で収量
もよいこと
などがあげられる。
次に実施例をあげて本発明の方法をさらに具体
的に説明する。
実施例 １
菌体外毒素の無毒化
(1) ジフテリア毒素の無毒化
実験方法：
精製ジフテリア毒素を200倍より3200倍まで
倍数希釈し、それぞれの希釈液に0.2％の柿渋
（上記の方法によつて精製したもの、実施例１
−(2)乃至５においても同様）水溶液を等量混合
したもの並びに生理食塩水を等量混合した対照
について無毒化試験を行なつた。
体重300ｇ±10ｇのハートレー系雄モルモツ
トを１群３匹として用い、その背部皮下に検体
0.2mlを注射し、７日間生死の観察を行なつ
た。
実験成績：
対照は200および400倍希釈液注射で24時間以
内、800倍で48時間以内に動物の死亡が認めら
れ、1600倍より薄い濃度では生き残つた。
柿渋水溶液混合群ではすべての動物が生存し
た。
対照の死亡例のモルモツトを解剖した結果
は、何れも副腎に顕著な出血が認められた。
(2) 破傷風毒素の無毒化
実験方法：
破傷風毒素ならびに柿渋水溶液の等量混合液
を室温で10分間放置後、体重23±２ｇのRFVL
系雌マウスを１群３匹として用い、その皮下に
0.4mlずつ注射して無毒化を検討した。
(a) 柿渋水溶液を希釈し、毒素を一定量とした
実験結果：
破傷風毒素量を150MLDとした時、対照の
毒素液のみの注射群は24時間以内に死亡し、
柿渋水溶液0.75％混合のものは全例生存し、
0.375％混合のものは全例死亡した。
(b) 毒素を希釈し、柿渋の濃度を一定量とした
実験結果：
柿渋の濃度を0.1％とした時、破傷風毒素
量100MLDで全例生存し、200MLDで３例中
２例死亡し、50MLDで全例死亡した。
以上の成績により、柿渋による破傷風毒素の
無毒化作用は、毒素希釈法の方が強い傾向が認
められた。
実施例 ２
ブドウ球菌アルフア毒素の無毒化
実験方法：
毒素は体重25ｇ±２ｇのRFVL系雄マウスに対
する最少致死量（MLD）0.55mcgのものを使用し
た。
1.1mcg／0.1ml（2MLD）の毒素に0.5％より
0.0019％まで倍数希釈を行なつた柿渋水溶液を等
量混合して10分間室温で放置後、１群３匹の前記
マウスの静脈内に0.2mlずつ注射し、注射後48時
間にわたり生死を観察した。
実験成績：
柿渋水溶液0.0078％混合のものは全例生存し、
0.0039％以下のものは全例死亡し、0.0039％混合
の平均死亡時間は130分であつた。
参考として局方タンニン酸による成績は0.1％
混合のものでも24時間後までに全例死亡した。
実施例 ３
百日咳菌毒素の無毒化
実験方法：
使用毒素は200mcg/mlの生菌体を超音波破砕
し、10000Gである30分間冷凍遠心した上清を使
用した。本毒系液はその1000倍希釈液0.05mlをモ
ルモツトの皮内に注射しても注射局所に出血が認
められるものである。
原毒素液を100倍希釈溶液とし、各種濃度の柿
渋水溶液と等量混合して10分間放置後、モルモツ
トの皮内に0.1ml注射し、24時間後に出血の有無
を観察し、無毒化を検討した。
実験成績：
柿渋水溶液0.125％混合のものは出血は認めら
れず、0.031％では僅かに出血が認められた。
0.031％混合のものの出血斑の大きさは対照であ
る100倍希釈液の出血斑より小さかつた。
実施例 ４
百日咳ワクチンの白血球増加の軽減
百日咳ワクチン注射による副作用と考えられる
白血球増加を柿渋水溶液を使用することにより、
軽減し得るか否かを検討した。
実験方法：
百日咳菌液（ワクチン）は1/10000濃度チメロ
サール加の40ピリオン／ml含有リン酸塩緩衝懸濁
液を使用し、菌液と種々の濃度の柿渋水溶液を等
量混合し室温で10分間放置後、混合液を0.5ml、
ddY系雄マウス（４週令）の腹腔内に注射し、72
時間後にそれぞれの動物の末梢白血球数の測定を
行なつた。
対照はリン酸塩緩衝液により２倍希釈した菌液
を注射したものとリン酸緩衝液のみを注射したも
のの２群とした。
実験成績：
The present invention relates to a method for inactivating toxic substances produced by microorganisms and attenuating vaccines, which comprises adding persimmon juice to the toxic substances produced by microorganisms and vaccines. Biological products such as detoxified toxins (toxoids) made from toxic substances produced by pathogenic microorganisms and vaccines made from killed bacteria automatically immunize humans and animals for the purpose of preventing infectious diseases. However, because it is manufactured using pathogenic microorganisms and most of its quality tests are conducted using animals, its manufacturing and testing methods are not found in other drugs. It requires unique techniques, and requires even greater care when handling and preserving methods. For this reason, laws have also established special regulations regarding this preparation to ensure quality such as its uniformity, effectiveness, and safety. Despite this, the side effects of biologics are
Currently, it is still unavoidable, and medical accidents sometimes occur during vaccinations. For example, pertussis vaccines are epidemiologically considered indispensable, especially in developing regions such as Southeast Asia and African countries, but the side effects include swelling and pain at the vaccination site.
Systemic symptoms such as fever, vomiting, and in rare cases shock symptoms or serious brain symptoms have been reported, and it is currently said that it is still insufficient to eliminate side effects while retaining their preventive effects. On the other hand, conventional persimmon tannin has a wide range of uses based on its astringent action, and has been used, for example, in raincoats, astringent fans, and for clarifying cloudy sake. [Edited by Keita Shibata: Dictionary of resource plants, p. 100 (1961, No. 6)
(edition, published by Hokurikukan)] The present inventors have been conducting research on the biological activity of persimmon juice and its application as a medicine for many years, and when they added persimmon juice to various biological preparations, they discovered that the toxic substances were detected in trace amounts. The present invention was completed by discovering that the present invention exhibits unexpected and excellent effects on the inactivation of drugs and the attenuation of side-effect substances, and also confirmed that the target antigenicity is not impaired. The persimmon juice used in the present invention is made from the fruit of the Diospyros genus plant of the Arcanaceae family, such as persimmon (Diospyros kaki Thumb.), Japanese persimmon (Diospyros lotus L.), or ebony (Diospyros ebenum Koenig), which is a raw material plant. Those produced according to the conventional method (the above-mentioned Dictionary of Plant Resources, p. 100) are used, but more preferably those extracted and purified by the methods exemplified below can be used. In other words, the extraction and purification method involves grinding the raw material, immature persimmons, adding acetone, soaking them at room temperature, distilling off the acetone from the liquid, and adding methanol and ether to the remaining liquid to remove the precipitate. take. The resulting precipitate is dissolved in distilled water, the remaining organic solvent is distilled off, the solution is dialyzed, the filtered solution is sterilized by heating, and then freeze-dried to obtain a pale brown fine powder. be able to. The properties of the powdered persimmon juice obtained in this way are easily soluble in water, aqueous methanol, aqueous ethanol, aqueous acetone, etc., and stable against heat, and its 0.1 to 0.5% aqueous solution is approximately neutral. The ferric chloride reaction is positive. Its toxicity is 1 to 5, with no peritoneal irritation symptoms (such as ascites accumulation or peritoneal adhesions) even when 0.1 ml of 0.5% persimmon astringent aqueous solution is injected intraperitoneally into male Wistar imamichi rats (weight 200-250 g). Intraperitoneal injection of % aqueous solution has not caused death, but peritoneal irritation symptoms have been observed. Furthermore, if 0.1 ml of a 1% aqueous solution is injected into the tail vein of a rat, the rat will not die, but if 0.1 ml of a 2% or higher aqueous solution is similarly intravenously injected, the rat will die.
In addition, local irritation (swelling) occurred when 0.05 ml of 1.25% persimmon tannin aqueous solution was injected into the footpads of ddY male mice (5 weeks old).
It has no effect. However, the pharmacopoeial tannic acid aqueous solution
Even 0.1% is much more stimulating. Next, the activity of persimmon juice in inactivating toxic substances and attenuating side effects substances can be determined by the following test method. Activity test method for persimmon juice (a) Add the same amount of persimmon juice solution to Elab sea snake venom 40γ/0.1ml distilled water to neutralize it in a test tube.
When administered intraperitoneally to ddY male mice (5 weeks old), the lethal effect of Elab's sea snake venom is inactivated at a concentration of 0.039%. On the other hand, the lethal effect of pharmacopoeial tannic acid cannot be inactivated unless the concentration is 1.25% or more. (b) In an in vitro test in which 0.1 ml of persimmon astringent solution was added to 0.1 ml of distilled water, the concentration was 0.078%.
Concentrations above suppress intradermal bleeding in domestic rabbits.
On the other hand, a similar inhibitory effect was observed with pharmaceutical tannic acid.
% or more concentration is required. (c) Sea snake venom or habu venom combined with persimmon astringent is not separated by centrifugation, and no sedimentation line is observed in the in-gel sedimentation reaction with antiserum. On the other hand, once bound to snake venom, pharmaceutical tannic acid can be separated by centrifugation, restoring its toxicity. In-gel sedimentation reactions also produce sedimentation lines. Preferred examples of applying persimmon juice exhibiting such activity to the biological preparations that are the object of the present invention include microorganisms such as Bordetella pertussis, Bordetella diphtheriae, Clostridium tetani,
Examples include inactivation of toxins of bacteria such as Clostridium potulinum or Staphylococcus and attenuation of side effects of vaccines such as typhoid, paratyphoid, cholera, whooping cough, influenza or anthrax. Although the amount added varies depending on the target biological preparation, it is usually sufficient to add a small amount of an aqueous solution with a concentration of 0.1% or less. The characteristics of the method of attenuating biological preparations using persimmon astringent of the present invention are as follows: (1) The inactivation of the toxic effect is strong, and therefore, the efficacy is expressed in extremely small amounts, and as a result, the toxicity of persimmon astringent itself is hardly a problem. (2) It is thermostable in aqueous solution. (3) The binding with toxic substances is irreversible. (4) The target antigenicity is not lost even if the toxicity is inactivated or the side effects are attenuated. (5) Raw materials are easily available, extraction is simple, and yields are good. Next, the method of the present invention will be explained in more detail with reference to Examples. Example 1 Detoxification of bacterial exotoxin (1) Experimental method for detoxification of diphtheria toxin: Purified diphtheria toxin was diluted multiple times from 200 times to 3200 times, and 0.2% persimmon juice (persimmon juice) was added to each dilution (using the method above). Example 1
-(2) to 5) A detoxification test was conducted on a mixture of equal amounts of aqueous solutions and a control mixture of equal amounts of physiological saline. Hartley male guinea pigs weighing 300g±10g were used in groups of 3, and samples were placed subcutaneously on their backs.
0.2 ml was injected, and life and death were observed for 7 days. Experimental results: In the controls, animals died within 24 hours after injection of 200-fold and 400-fold dilutions, within 48 hours after injection at 800-fold dilutions, and survived at concentrations lower than 1600-fold. All animals survived in the persimmon tannin aqueous solution mixed group. Autopsies of the dead control guinea pigs revealed significant bleeding in the adrenal glands in all cases. (2) Test method for detoxification of tetanus toxin: After leaving a mixture of equal amounts of tetanus toxin and persimmon juice solution at room temperature for 10 minutes, RFVL with a weight of 23 ± 2 g was
A group of three female mice was used, and the injection was administered subcutaneously.
We investigated detoxification by injecting 0.4ml each. (a) Experimental results using a diluted persimmon juice solution and a constant amount of toxin: When the amount of tetanus toxin was set at 150 MLD, the control group injected with only the toxin solution died within 24 hours;
All cases of the mixture containing 0.75% persimmon tannin aqueous solution survived.
All cases of the 0.375% mixture died. (b) Results of an experiment where the toxin was diluted and the concentration of persimmon juice was kept constant: When the concentration of persimmon juice was set to 0.1%, all cases survived with a tetanus toxin dose of 100MLD, 2 out of 3 cases died with a dose of 200MLD, and 50MLD. All cases died. Based on the above results, it was confirmed that the detoxification effect of tetanus toxin by persimmon juice tends to be stronger in the toxin dilution method. Example 2 Experimental method for detoxification of Staphylococcus alpha toxin: The toxin used had a minimum lethal dose (MLD) of 0.55 mcg for RFVL male mice weighing 25 g±2 g. From 0.5% to 1.1mcg/0.1ml (2MLD) of toxins
Equal volumes of persimmon astringent aqueous solution diluted to 0.0019% were mixed, left at room temperature for 10 minutes, and 0.2 ml was injected intravenously into each group of 3 mice, and their survival was observed for 48 hours after the injection. . Experimental results: All cases of persimmon juice mixed with 0.0078% aqueous solution survived.
All cases with concentrations below 0.0039% died, and the average time of death for the 0.0039% mixture was 130 minutes. For reference, the result using pharmacopoeial tannic acid is 0.1%.
Even in the mixed case, all cases died within 24 hours. Example 3 Experimental method for detoxification of Bordetella pertussis toxin: The toxin used was the supernatant obtained by ultrasonically disrupting viable bacterial cells at 200 mcg/ml and freezing and centrifuging them at 10,000 G for 30 minutes. Even if 0.05ml of this 1000-fold diluted solution is injected into the skin of a guinea pig, bleeding is observed at the injection site. Make a 100-fold dilution of the original toxin solution, mix it with equal amounts of persimmon juice aqueous solutions of various concentrations, leave it for 10 minutes, then inject 0.1ml intradermally into the guinea pigs, observe the presence or absence of bleeding after 24 hours, and consider detoxification. did. Experimental results: No bleeding was observed with the mixture of 0.125% persimmon juice aqueous solution, and slight bleeding was observed with 0.031%.
The size of bleeding spots in the 0.031% mixture was smaller than that in the 100-fold diluted solution as a control. Example 4 Reduction of white blood cell increase due to pertussis vaccine By using persimmon tannin aqueous solution, white blood cell increase, which is considered to be a side effect of pertussis vaccine injection, was reduced.
We examined whether it could be reduced. Experimental method: For the pertussis bacteria solution (vaccine), use a phosphate buffer suspension containing 40 pyrion/ml with 1/10000 concentration thimerosal added, and mix equal amounts of the bacteria solution and persimmon astringent aqueous solutions of various concentrations and incubate for 10 minutes at room temperature. After standing for a minute, add 0.5ml of the mixture,
Injected intraperitoneally into ddY male mice (4 weeks old), 72
After a period of time, each animal's peripheral leukocyte count was measured. Two control groups were used: one injected with a bacterial solution diluted two times with phosphate buffer, and the other injected with phosphate buffer alone. Experimental results:
【表】
以上の成績より柿渋の濃度0.1％で白血球増加
を完全に押え、0.004％でも白血球増加の副作用
を約1/3軽減することを認めた。
実施例 ５
柿渋添加による百日咳ワクチンの抗原性におよ
ぼす影響
実験方法および結果：
実施例４に使用した菌液に0.04％の柿渋水溶液
を等量混合した。対照はリン酸塩緩衝液を用いて
菌液の２倍希釈を行なつた。
上記２種のワクチンをそれぞれ５倍、25倍およ
び125倍に希釈し、これを抗原としてddY系雄マ
ウス（４週令）の腹腔内に0.5mlずつ注射し、10
日後に脳内に生菌攻撃を行ない、以後14日間にわ
たり生死の観察を行なつた結果、柿渋水溶液処理
免疫群および対照（未処理）免疫群の生存数は1
８／３０、19/30と差異はなかつた。攻撃生菌は５×
104個とし、その注射量は0.03mlとした。なお攻
撃菌の毒力は接種菌量の1/4で全例死亡、1/20で
10例中８例の死亡、1/100で10例中６例の死亡の
強さであつた。
以上の成績より柿渋処理による抗原性の低下は
ほとんど無いものと考えられ、免疫の目的は充分
達成できた。[Table] From the above results, it was confirmed that a persimmon tannin concentration of 0.1% completely suppressed the increase in white blood cells, and even at a concentration of 0.004%, the side effect of increased white blood cells was reduced by about 1/3. Example 5 Effect of addition of persimmon astringent on the antigenicity of pertussis vaccine Experimental method and results: The bacterial solution used in Example 4 was mixed with an equal amount of 0.04% persimmon astringent aqueous solution. As a control, the bacterial solution was diluted twofold using phosphate buffer. The above two vaccines were diluted 5 times, 25 times and 125 times, respectively, and 0.5 ml of this was injected intraperitoneally into a ddY male mouse (4 weeks old) as an antigen.
After 1 day, the brain was challenged with live bacteria, and the survival was observed for 14 days. As a result, the number of survivors in the persimmon juice aqueous solution-treated immunized group and the control (untreated) immunized group was 1.
There was no difference between 8/30 and 19/30. Attacking live bacteria is 5x
The injection volume was 104 and the injection volume was 0.03ml. The virulence of the attacking bacteria was 1/4 of the amount of inoculated bacteria, resulting in death in all cases, and 1/20 of the amount of inoculated bacteria.
The intensity was such that 8 out of 10 cases died, and 6 out of 10 cases died at 1/100. From the above results, it is thought that there is almost no decrease in antigenicity due to persimmon astringent treatment, and the purpose of immunization was fully achieved.