JPS6131098A - Reagent for determining choline esterase - Google Patents

Reagent for determining choline esterase

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JPS6131098A
JPS6131098A JP15474984A JP15474984A JPS6131098A JP S6131098 A JPS6131098 A JP S6131098A JP 15474984 A JP15474984 A JP 15474984A JP 15474984 A JP15474984 A JP 15474984A JP S6131098 A JPS6131098 A JP S6131098A
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acetylcholine
choline esterase
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博幸 坪田
Takashi Ochi
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Abstract

PURPOSE:To improve the stability of the titled reagent for determining choline esterase using acetylcholine as a substrate, by keeping the first reagent consisting of acetate kinase, adenosine triphosphate, etc. and the second reagent of acetylcholine respectively at specific pH values. CONSTITUTION:A reagent for determining choline esterase, obtained by incorporating the first reagent, prepared by dissolving acetate kinase, adenosine triphosphate and reduced form beta-nicotinamide adenine dinucleotide as principal components in a buffer solution, and adjusting the pH of the resultant solution to 8-10 with the second reagent prepared by dissolving acetylcholine as a principal component in a buffer solution, and adjusting the pH of the resultant solution to 3.5-5.5 at a specific ratio in measuring the choline esterase.

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、コリンエステラーゼ(以下ChEと略す、)
定量用試薬に関するものである。
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention provides cholinesterase (hereinafter abbreviated as ChE)
This relates to quantitative reagents.

現在臨床検査室などで用いられているChEの定量方法
には。
ChE quantification methods are currently used in clinical laboratories.

(1)アセチルコリンを基質として、pH変化を測定す
る方法。
(1) A method of measuring pH changes using acetylcholine as a substrate.

(2)基質にチオコリンエステルを用い、遊離するSH
基を測定する方法。
(2) SH released using thiocholine ester as a substrate
How to measure groups.

(3)ベンゾイルコリンなどを基質とし、遊離するコリ
ンをコリンオキシダーゼを用い、 Hz(hとして測定
する方法。
(3) A method that uses benzoylcholine as a substrate and uses choline oxidase to measure the liberated choline as Hz (h).

などがある。これらのうち、(1)の方法が古くから検
査室に取り入れられている標準的な方法であるが、至適
poを維持できないとか、 pH変化が必ずしも指示薬
の変色程度と平行しないことなどのために着炭が悪< 
、 <21. (slの方法にとってかわられつつある
のが現状である。しかし、(2)では共存SH化合物に
よる誤差、(3)ではHっ0□定量にまつわる諸問題や
発色系のフェノールによる妨害などの問題があり、現在
のところいずれも満足できるまでに至っていない。
and so on. Among these methods, method (1) is a standard method that has been used in laboratories for a long time, but it is difficult to maintain optimal po, and the pH change does not necessarily parallel the degree of discoloration of the indicator. It is bad to arrive at the coal <
, <21. (Currently, it is being replaced by the sl method. However, in (2) there are errors due to coexisting SH compounds, and in (3) there are problems such as various problems related to H0□ determination and interference by phenol in the coloring system. However, none of them have reached the point where we are satisfied at present.

このような観点から、特開昭58−155099号公報
には、アセチルコリン、酢酸キナーゼ、アデノシン三リ
ン酸を含有するChE定量用試薬が1案されている。こ
の試薬を説明すると、基質としてアセチルコリンを使用
し、生体試料中のChEを作用させると、基質は酢酸と
コリンとに分解する。
From this point of view, JP-A-58-155099 proposes a ChE quantitative reagent containing acetylcholine, acetate kinase, and adenosine triphosphate. To explain this reagent, acetylcholine is used as a substrate, and when ChE in a biological sample acts, the substrate is decomposed into acetic acid and choline.

ここに、酢酸キナーゼを作用させるとアデノシンニリン
酸(以下ATPという。)を補基質として酢酸は、アセ
チルリン酸に変化する。この反応式を下記に示す。
When acetate kinase acts on this, acetic acid is converted to acetyl phosphate using adenosine diphosphate (hereinafter referred to as ATP) as a cosubstrate. This reaction formula is shown below.

+アデノシンニリン酸 この酢酸キナーゼの作用は、酢酸のみに基質特異性を有
するものであって、他の有機酸、無機酸などを共存して
いても作用するものではない。次いで、ここで生成した
アセチルリン酸又はアデノシンニリン酸(以下ADPと
いう。)を定量すればChEの定量は完了する。この際
、アセチルリン酸は適当な色源体と反応させれば、可視
部の比色法で定量可能であり、 ADPはピルビン酸キ
ナーゼと乳酸脱水素酵素との共役酵素系を使用すること
により定量可能である。特に、後者の方法は全反応系を
酵素系として行うものであり、共存物質の影響を受けに
(く1極めて有利な方法である。この場合の反応式を下
記に示す。
+Adenosine diphosphate The action of acetate kinase has substrate specificity only for acetic acid, and does not work even when other organic acids, inorganic acids, etc. are present. Next, the determination of ChE is completed by quantifying the acetyl phosphate or adenosine diphosphate (hereinafter referred to as ADP) produced here. At this time, acetyl phosphate can be quantified by visible colorimetry by reacting with an appropriate chromogen, and ADP can be determined by using a coupled enzyme system of pyruvate kinase and lactate dehydrogenase. Quantifiable. In particular, the latter method is an extremely advantageous method in which the entire reaction system is an enzyme system and is not affected by coexisting substances.The reaction formula in this case is shown below.

ADP+ホスホエノールピルビン酸 ピルビン酸キナーゼ ーーーーーーーーー→ATP+ピルビン酸(ただし、 
NADHは還元型β−ニコチンアミド−アデニン・ジヌ
クレオド、  NAD+は、酸化型β−ニコチンアミド
−アデニン・ジヌクレオドを表す。)このNADHの紫
外部(340nm)の吸光度を測定することにより、極
めて容易に高精度の定量を行うことができる。また、ピ
ルビン酸キナーゼの作用により生成ADPに再生するこ
とができるので、酢酸キナーゼの酢酸に対する作用が増
強され5極めて高感度の測定が可能となる。
ADP + Phosphoenolpyruvate Pyruvate Kinase ---> ATP + Pyruvate (However,
NADH represents reduced β-nicotinamide-adenine dinucleotide, and NAD+ represents oxidized β-nicotinamide-adenine dinucleotide. ) By measuring the absorbance of this NADH in the ultraviolet region (340 nm), highly accurate quantification can be performed extremely easily. In addition, since ADP can be regenerated by the action of pyruvate kinase, the action of acetate kinase on acetate is enhanced, making extremely sensitive measurement possible.

この試薬を実際的に製品化するにあたっては。How to actually commercialize this reagent.

酢酸キナーゼ、 ATP、 NADHを主成分とする試
薬(以下第一試薬と呼ぶ。)と、基質であるアセチルコ
リンを主成分とする試薬(以下第二試薬と呼ぶ。)を各
々調整し、 ChE測定の両試薬を混合しており。
A reagent containing acetate kinase, ATP, and NADH as the main components (hereinafter referred to as the first reagent) and a reagent containing the substrate acetylcholine as the main component (hereinafter referred to as the second reagent) were prepared respectively, and the ChE measurement was performed. Both reagents are mixed.

第一試薬のpoはChEの至適pHである7、0〜8.
0の間に管理されており、また第二試薬のpHは特に管
理されておらず、中性付近である。
The po of the first reagent is 7.0-8.0, which is the optimum pH of ChE.
The pH of the second reagent is not particularly controlled and is around neutral.

この場合には、第一試薬においては、 NADHに由来
する340n+wにおける吸光度が、試薬保存中に低下
する傾向があり、また第二試薬においては、保存中にア
セチルコリンの自然分解が起こる傾向があった。このア
セチルコリンの自然分解が起こると、酢酸が生じ、第一
試薬と第二試薬とを混合した際に反応が進行し、 34
0nmにおける吸光度が低下することになる。
In this case, in the first reagent, the absorbance at 340n+w derived from NADH tended to decrease during reagent storage, and in the second reagent, spontaneous decomposition of acetylcholine tended to occur during storage. . When this natural decomposition of acetylcholine occurs, acetic acid is produced, and when the first reagent and the second reagent are mixed, the reaction proceeds, 34
The absorbance at 0 nm will decrease.

すなわち、上記試薬の測定原理は、最終的に340nm
における吸光度の減少速度を測定するものであるから、
第一試薬と第二試薬との混合時の第一試薬の吸光度及び
第一試薬と第二試薬とを混合したときの吸光度が少なく
とも1.0であることが望まれており、 340nmに
おける吸光度は通常の分光光度針の性能上2.0が限界
であるので、2.0の吸光度が1.0付近まで低下する
期間が、調製後の試薬の使用期間ということになり、前
記した試薬は。
That is, the measurement principle of the above reagent is ultimately 340 nm.
Because it measures the rate of decrease in absorbance at
It is desired that the absorbance of the first reagent when the first reagent and the second reagent are mixed and the absorbance when the first reagent and the second reagent are mixed are at least 1.0, and the absorbance at 340 nm is Since 2.0 is the limit due to the performance of a normal spectrophotometer needle, the period during which the absorbance of 2.0 decreases to around 1.0 is the period of use of the reagent after preparation.

この点が十分でなく、一度の調製でできるだけ長期間使
用可能な試薬が望まれている。
This point is not sufficient, and there is a desire for a reagent that can be prepared once and used for as long as possible.

本発明者らは、このような要求を満足すべく鋭意研究を
重ねた結果、第一試薬、第二試薬のそれぞれのpHを特
定の範囲に管理することにより2両試薬の調製後の安定
性が飛躍的に向上することを見出し1本発明に到達した
のである。
As a result of extensive research to satisfy these requirements, the present inventors have found that by controlling the pH of each of the first and second reagents within a specific range, the stability of both reagents after preparation can be improved. The present invention was achieved by discovering that this can be dramatically improved.

すなわち2本発明は酢酸キナーゼ、 ATP、 NAD
Hを主成分とする第一試薬とアセチルコリンを主成分と
する第二試薬とからなり、かつ第一試薬のpHが8.0
〜10.0であり、第二試薬のpHが3.5〜5.5で
あることを特徴とするChE定量用試薬である。
That is, two aspects of the present invention include acetate kinase, ATP, and NAD.
It consists of a first reagent containing H as a main component and a second reagent containing acetylcholine as a main component, and the pH of the first reagent is 8.0.
~10.0, and the second reagent has a pH of 3.5 to 5.5.

本発明の試薬は1例えば以下のように構成されている。The reagent of the present invention is configured as follows, for example.

+11酵素試薬(凍結乾燥品) 酢酸キナーゼ3 ピルビン酸キナーゼ、乳酸脱水素酵素
、 ATP、ホスホエノルピルビン酸、 NADH(2
)基質剤(粉末) アセチルコリン、硫酸アンモニウム (3)酵素試薬溶解液 緩衝液、マグネシウム塩、カリウム塩、防腐刻 (4)基質剤熔解液 緩衝液、防腐剤 第一試薬、第二試薬を調製するには、(3)で(1)を
+11 Enzyme reagent (lyophilized product) Acetate kinase 3 Pyruvate kinase, lactate dehydrogenase, ATP, phosphoenolpyruvate, NADH (2
) Substrate agent (powder) Acetylcholine, ammonium sulfate (3) Enzyme reagent solution buffer, magnesium salt, potassium salt, preservative (4) Substrate agent solution buffer, preservative For preparing the first reagent and second reagent is (1) with (3).

(4)で(2)を溶解することによって行えばよ<、C
hE測定特定時一試薬、第二試薬を所定の比率で混合す
ればよい。
This can be done by dissolving (2) in (4) <,C
When hE measurement is specified, the first reagent and the second reagent may be mixed at a predetermined ratio.

本発明において、第一試薬、第二試薬調製後のpHは前
者が8.0〜10.0に、後者が3.5〜5.5に管理
することが必要である。
In the present invention, it is necessary to control the pH of the first reagent and the second reagent after the preparation of the former to 8.0 to 10.0 and the latter to 3.5 to 5.5.

このpHからはずれると、第一試薬においては。When deviating from this pH, in the first reagent.

340r++++における吸光度の低下が著しく、また
第二試薬においては、アセチルコリンの自然分解が多く
観察されるのである。この第一試薬のpoを8.0〜1
0.0に、第二試薬のpHを3.5〜5.5に管理する
には1例えば次の緩衝剤を用いて行うことができる。第
一試薬において使用する緩衝剤としては。
The absorbance at 340r++++ significantly decreased, and a large amount of spontaneous decomposition of acetylcholine was observed in the second reagent. The po of this first reagent is 8.0-1
In order to control the pH of the second reagent to 3.5 to 5.5, for example, the following buffer can be used. As a buffer used in the first reagent.

例えばトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン−II
cL )リス(ヒドロキシメチル)アミノメタン−マレ
イン酸、N−2−ヒドロキシエチルピペラジン−N゛−
エタンスルホン酸、NaOH,グリシン−Mo1.)リ
エタノールアミン塩酸−NaOHなど通常の使用範囲が
p)I e、o〜10.0のものであればよい。
For example, tris(hydroxymethyl)aminomethane-II
cL) Lis(hydroxymethyl)aminomethane-maleic acid, N-2-hydroxyethylpiperazine-N゛-
Ethanesulfonic acid, NaOH, glycine-Mo1. ) Liethanolamine hydrochloric acid-NaOH, etc., as long as the range of normal use is p)I e, o to 10.0.

また、第二試薬に使用する緩衝剤としては1例えば、フ
タル酸水素カリウム−)ICI、クエン酸−クエン酸ナ
トリウム、マレイン酸−NaOH+ グリシン−HCl
 、 3.3’−ジメチルグルタル酸−NaOH,乳酸
−乳酸ナトリウムなど通常の使用範囲がpH3,5〜5
゜5のものであればよい。
Buffers used in the second reagent include 1, for example, potassium hydrogen phthalate-)ICI, citric acid-sodium citrate, maleic acid-NaOH+glycine-HCl
, 3.3'-dimethylglutaric acid-NaOH, lactic acid-sodium lactate, etc. The usual range of use is pH 3.5 to 5.
It is sufficient if it has a value of 5°.

その他の試薬の使用量としては、アセチルコリン20〜
200mM、酢酸キナーゼ5〜100 u/ml、 A
TP 1.5〜15a+M、  ピルビン酸キナーゼ3
〜50 u/ml、乳酸脱水素酵素1〜20 u/ml
、 NADHO,1〜1.0mM、 NADHO11〜
1゜抛り程度が適当である。
The amount of other reagents used is acetylcholine 20~
200mM, acetate kinase 5-100 u/ml, A
TP 1.5-15a+M, pyruvate kinase 3
~50 u/ml, lactate dehydrogenase 1-20 u/ml
, NADHO, 1-1.0mM, NADHO11-
Approximately 1° is appropriate.

次にChEを定量するには、一定の比率で第一試薬と第
二試薬とを混合した後に目的物質であるChEの至適p
Hである7、0〜8.0の間になるように第一試薬と第
二試薬を混合すればよい。
Next, in order to quantify ChE, after mixing the first reagent and the second reagent at a certain ratio, the optimal p of ChE, which is the target substance, is
The first reagent and the second reagent may be mixed so that H is 7.0 to 8.0.

そのときの第一試薬と第二試薬の使用時の液比は、使用
するオートアナライザーによって異なるが、好ましくは
第一試薬;第二試薬がz:i −10:l (容量比、
以下同じ。)であり9さらに好ましくは2:1〜8:1
であり、最も好ましくは2:1〜5:1である。また、
第一試薬、第二試薬の緩衝剤の濃度としては9例えば第
一試薬、第二試薬の液比を2:1〜5:1.第一試薬の
pHが8.0〜10.0.第二試薬のpnが3.5〜5
.5であり、さらに第一試薬、第二試薬を混合した時の
pHが7.0〜8.0の間であるという条件を設定すれ
ば、N単な実験によって求めることができる。例えば、
第一試薬にトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン−
マレイン酸を、第二試薬にクエン酸−NaOHを用いた
場合、前者が25〜70mM、後者が90〜130mM
とすればよい。
At that time, the liquid ratio of the first reagent and the second reagent varies depending on the autoanalyzer used, but preferably the first reagent and the second reagent are z:i -10:l (volume ratio,
same as below. ) and 9 more preferably 2:1 to 8:1
The ratio is most preferably 2:1 to 5:1. Also,
The concentration of the buffer for the first reagent and the second reagent is 9. For example, the liquid ratio of the first reagent and the second reagent is 2:1 to 5:1. The pH of the first reagent is 8.0 to 10.0. The pn of the second reagent is 3.5-5
.. 5, and if the condition is set that the pH when the first reagent and the second reagent are mixed is between 7.0 and 8.0, N can be determined by a simple experiment. for example,
The first reagent is tris(hydroxymethyl)aminomethane.
When maleic acid is used as the second reagent and citric acid-NaOH is used, the former is 25-70mM and the latter is 90-130mM.
And it is sufficient.

次に1本発明を実施例により具体的に説明する。Next, one embodiment of the present invention will be specifically explained using examples.

実施例1 +l)酵素試薬(凍結乾燥品) 酢酸キナーゼ     2X10’ユニツトピルビン酸
キナーゼ  lXl0’ユニツト乳酸脱水素酵素   
 1×103ユニ7)ATP            
     1    grホスホエノールピルビン酸 
 0.05 grNADH0,14gr (2)基質剤(粉末) アセチルコリン       1.4  gr硫酸アン
モニウム      0.33 gr(3)酵素試薬溶
解液 トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン−)IcI 
(ρ)19.0)      30 mM/L硫酸マグ
ネシウム      15 mM/L塩化カリウム  
      50 mM/Lアジ化ナトジナトリウム 
  10 +IIM/L(4)基質側溶解液 マレイン酸−NaOH(pH4,5)    95 m
M/Lアジ化ナトジナトリウム    5 mM/L酵
素試薬(1)を(3)の酵素試薬溶解液100m1で溶
解して第一試薬を調製し、また基質剤(2)を(4)の
基質側溶解液25+slで溶解して第二試薬を調製した
。両試薬を10℃恒温槽中に7日間放置し、第一試薬の
340nmにおける吸光度を調製直後ものと比較した。
Example 1 +l) Enzyme reagent (lyophilized product) Acetate kinase 2X10' unit pyruvate kinase lX10' unit lactate dehydrogenase
1×103 Uni 7) ATP
1 gr phosphoenolpyruvate
0.05 grNADH0,14gr (2) Substrate agent (powder) Acetylcholine 1.4 gr Ammonium sulfate 0.33 gr (3) Enzyme reagent solution Tris(hydroxymethyl)aminomethane-) IcI
(ρ) 19.0) 30 mM/L magnesium sulfate 15 mM/L potassium chloride
50 mM/L sodium azide
10 +IIM/L (4) Substrate side solution maleic acid-NaOH (pH 4,5) 95 m
M/L sodium azide 5mM/L The first reagent was prepared by dissolving the enzyme reagent (1) in 100 ml of the enzyme reagent solution of (3), and the substrate agent (2) was added to the substrate of (4). A second reagent was prepared by dissolving with 25+sl of the side lysis solution. Both reagents were left in a thermostat at 10° C. for 7 days, and the absorbance of the first reagent at 340 nm was compared with that immediately after preparation.

また、7日間放置後の第一試薬、第二試薬を4対1の液
量比で混合した時、アセチルコリンの分解で生じた酢酸
による340nmにおける初期吸光度の低下を測定し、
同じく調製直後ものと比較した。
In addition, when the first reagent and the second reagent were mixed at a liquid volume ratio of 4:1 after being left for 7 days, the decrease in the initial absorbance at 340 nm due to acetic acid caused by the decomposition of acetylcholine was measured,
A comparison was also made with the one immediately after preparation.

その結果を表1に示す。The results are shown in Table 1.

なお、ll製後の第一試薬、第二試薬のp)Iは3それ
ぞれ溶解液の緩衝剤のpHである9、0.4.5となり
3両試薬混合後のpHは7.5であった。
In addition, the p)I of the first reagent and the second reagent after 11 production is 9 and 0.4.5, respectively, which are the pH of the buffer of the dissolution solution, and the pH after mixing the three reagents is 7.5. Ta.

表1 実施例2 酵素試薬の溶解液の緩衝剤をトリス(ヒドロキシメチル
)アミノメタン−マレイン酸pH8,55−30III
に、また基質剤の溶解液の緩衝剤をグリシン−11CI
 pH4,0−75+++Mを用いた以外はすべて実施
例1と同じ試薬を用い、実施例1と同様の安定性テスト
を行ったところ5表2に示す結果となった。
Table 1 Example 2 The buffer for the enzyme reagent solution was tris(hydroxymethyl)aminomethane-maleic acid pH 8,55-30III.
In addition, the buffer for the solution of the substrate agent was added to glycine-11CI.
The same stability test as in Example 1 was conducted using all the same reagents as in Example 1 except that pH 4.0-75+++M was used, resulting in the results shown in Table 2.

表2 なお、調製後の第一試薬、第二試薬のpHはそれぞれの
溶解液の緩衝剤のpnである8、5.4.0となり1両
試薬混合後のpHは7.3となった。
Table 2 The pH of the first reagent and the second reagent after preparation was 8.5.4.0, which is the pn of the buffer of the respective solution, and the pH after mixing both reagents was 7.3. .

比較例1 酵素試薬の熔解液の緩衝剤をN−2−ヒドロキシエチル
ピペラジン−No−エタンスルホンfil−NaOHp
H7,5−100mMを用い、基質剤の溶解液は緩衝剤
を使用せず水溶液とした以外はすべて実施例1と同じ試
薬を用い、実施例1と同様の安定性テストを行った。そ
の結果を表3に示す。
Comparative Example 1 The buffer for the enzyme reagent solution was N-2-hydroxyethylpiperazine-No-ethanesulfonefil-NaOHp.
The same stability test as in Example 1 was conducted using the same reagents as in Example 1 except that H7,5-100 mM was used and the substrate agent solution was an aqueous solution without using a buffer. The results are shown in Table 3.

なお、第一試薬のpHは7.5で、第二試薬のpHは7
.0で1両試薬混合後の98は7,5となった。
Note that the pH of the first reagent is 7.5, and the pH of the second reagent is 7.5.
.. 0 and 98 after mixing both reagents became 7.5.

表3 以上のごとく1本発明の試薬は、試薬調製後の安定性が
飛躍的に向上し5 これを長期間保存することができる
Table 3 As shown above, the reagent of the present invention has dramatically improved stability after preparation, and can be stored for a long period of time.

特許出願人  ユニチカ株vc会社 株式会社ヤトロンPatent applicant: Unitika Co., Ltd. VC company Yatron Co., Ltd.

Claims (1)

【特許請求の範囲】[Claims] (1)酢酸キナーゼ、アデノシン三リン酸、還元型β−
ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドを主成分と
する第一試薬とアセチルコリンを主成分とする第二試薬
とからなり、かつ第一試薬のpHが8.0〜10.0で
あり、第二試薬のpHが3.5〜5.5であることを特
徴とするコリンエステラーゼ定量用試薬。
(1) Acetate kinase, adenosine triphosphate, reduced β-
It consists of a first reagent whose main component is nicotinamide adenine dinucleotide and a second reagent whose main component is acetylcholine, and the pH of the first reagent is 8.0 to 10.0, and the pH of the second reagent is 8.0 to 10.0. A reagent for quantifying cholinesterase, which has a pH of 3.5 to 5.5.
JP15474984A 1984-07-25 1984-07-25 Reagent for determining choline esterase Granted JPS6131098A (en)

Priority Applications (1)

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JP15474984A JPS6131098A (en) 1984-07-25 1984-07-25 Reagent for determining choline esterase

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JPS6131098A true JPS6131098A (en) 1986-02-13
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