JPS613066A - チオ−ル基反応性基の定量法 - Google Patents
チオ−ル基反応性基の定量法Info
- Publication number
- JPS613066A JPS613066A JP12383484A JP12383484A JPS613066A JP S613066 A JPS613066 A JP S613066A JP 12383484 A JP12383484 A JP 12383484A JP 12383484 A JP12383484 A JP 12383484A JP S613066 A JPS613066 A JP S613066A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- group
- thiol
- dinitrophenyl
- reacting
- amount
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
ピ）産業上の利用分野
本発明は、チオール基反応性基の新規な定量法に関する
。更に詳しくは、チオール基反応性基を含有する物質に
、Ｎ −（２，４−ジニトロフェニル）システィンを反
応せしめ、得られる反応生成物中のＮ −２，４−ジニ
トロフェニル基に由来する吸光度を測定することを特徴
とする、該物質に含有されるチオール基反応性基の量を
定量する方法に関する。
。更に詳しくは、チオール基反応性基を含有する物質に
、Ｎ −（２，４−ジニトロフェニル）システィンを反
応せしめ、得られる反応生成物中のＮ −２，４−ジニ
トロフェニル基に由来する吸光度を測定することを特徴
とする、該物質に含有されるチオール基反応性基の量を
定量する方法に関する。
（ロ） 従来の技術
従来、チオール基反応性基の定量法には、■核反応性基
含有物質に２−メルカプトエチルアミン等のチオール化
合物を一定量反応せしめ、次いで残存チオール化合物の
量を特定の手段により定量して、上記反応において消費
されたチオール化合物の誠を求め、それとの対応でチオ
ール基反応性基の１を決定する方法（例えば、ジャーナ
ル・オグ・イムノロシイ（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｌ第１
１６巻・第６号・第１５５４員、１９７６年）、■可視
部吸光性基をもつし一７ラニンー４−ニトロアニリドを
該反応性基含有物質忙反応せしめ、得られる反応生成物
をアルカリ加水分解に処し、発生する４−二トロアニリ
ンを定量し、それとの対応で＃反応性基の量を決定する
方法（フエデレーショノ・オブ・ヨーロツピアン・）・
イオケミカルーンサエテイ・レタース（ＦＥＢＳ Ｌｅ
ｆｔ、）第２６巻、第５３ｊｊ、 １９７２年）、■
放射活性元素を組み込んだチオール反応性基を使用しく
例工ば、〔３ＨＪ−ヨードアセチル基）、該チオール反
応性基を含有する物質の比放射活性を測定して、該物質
中のチオール反応性基の量を定量する方法（インターナ
ショナル・ジャーナルーオブ・キャンサー（Ｉｎｔ、Ｊ
。
含有物質に２−メルカプトエチルアミン等のチオール化
合物を一定量反応せしめ、次いで残存チオール化合物の
量を特定の手段により定量して、上記反応において消費
されたチオール化合物の誠を求め、それとの対応でチオ
ール基反応性基の１を決定する方法（例えば、ジャーナ
ル・オグ・イムノロシイ（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｌ第１
１６巻・第６号・第１５５４員、１９７６年）、■可視
部吸光性基をもつし一７ラニンー４−ニトロアニリドを
該反応性基含有物質忙反応せしめ、得られる反応生成物
をアルカリ加水分解に処し、発生する４−二トロアニリ
ンを定量し、それとの対応で＃反応性基の量を決定する
方法（フエデレーショノ・オブ・ヨーロツピアン・）・
イオケミカルーンサエテイ・レタース（ＦＥＢＳ Ｌｅ
ｆｔ、）第２６巻、第５３ｊｊ、 １９７２年）、■
放射活性元素を組み込んだチオール反応性基を使用しく
例工ば、〔３ＨＪ−ヨードアセチル基）、該チオール反
応性基を含有する物質の比放射活性を測定して、該物質
中のチオール反応性基の量を定量する方法（インターナ
ショナル・ジャーナルーオブ・キャンサー（Ｉｎｔ、Ｊ
。
Ｃａｎｃｅｒ） 、第３１巻、第６６１頁、１９８３年
）等が知られている。
）等が知られている。
（→ 発明が解決しようとする問題点
これらの方法は、それぞれ有用な方法ではあるが、次の
様な欠点を有する。即ち■の方法では、チオ−４・化合
物を使用するが、用いるチオール化合物が空気酸化を受
けて部分的にジスルフィド化（三量化）しやすく、誤差
を防ぐためＫは実験の都度検量線を作製する必要があり
、そのため操作が煩雑である。■の方法は、反応生成物
の加熱を伴うアルカリ加水分解が必要であり、やはり操
作が煩雑である。■の方法は放射活性物質をとり扱うの
で、その原料の入手と、実験施設の用意、操作の点で一
般的ではない、郷である。
様な欠点を有する。即ち■の方法では、チオ−４・化合
物を使用するが、用いるチオール化合物が空気酸化を受
けて部分的にジスルフィド化（三量化）しやすく、誤差
を防ぐためＫは実験の都度検量線を作製する必要があり
、そのため操作が煩雑である。■の方法は、反応生成物
の加熱を伴うアルカリ加水分解が必要であり、やはり操
作が煩雑である。■の方法は放射活性物質をとり扱うの
で、その原料の入手と、実験施設の用意、操作の点で一
般的ではない、郷である。
本発明者らは、これらの欠点を有せず、簡便に使用でき
、工業的生産の場にも充分応用可能なチオール基反応性
基の再現性の良い新規定量法を開発すべく鋭意研究の結
果、チオール基反応性基を含有する物質に、先づ充分量
のＮ −（２，４−ジニトロフェニル）システィンを反
応せしめ、次いで過剰の試薬を除い九後、反応生成物中
のＮ −２，４−ジニトロフェニル基に由来する吸光度
を測定することＫより、該反応性基を定量できるという
知見を得、本発明に到達した。
、工業的生産の場にも充分応用可能なチオール基反応性
基の再現性の良い新規定量法を開発すべく鋭意研究の結
果、チオール基反応性基を含有する物質に、先づ充分量
のＮ −（２，４−ジニトロフェニル）システィンを反
応せしめ、次いで過剰の試薬を除い九後、反応生成物中
のＮ −２，４−ジニトロフェニル基に由来する吸光度
を測定することＫより、該反応性基を定量できるという
知見を得、本発明に到達した。
に）問題点を淋決するための手段
本発明は、チオール基反応性基を含有する物質に、Ｎ−
（２，４−ジニトロフェニル）システィンを反応せしめ
、得られる反応生成物中のＮ −２，４−ジニトロフェ
ニル基に由来する吸光度を測定することを特徴とする、
該物質に含有されるチオール基反応性基の定量法である
。
（２，４−ジニトロフェニル）システィンを反応せしめ
、得られる反応生成物中のＮ −２，４−ジニトロフェ
ニル基に由来する吸光度を測定することを特徴とする、
該物質に含有されるチオール基反応性基の定量法である
。
本発明において、チオール基反応性基とはり
応性多重結合基、ヨードアセチル基（ＩＣＨＩＣｏ ）
。
。
ブロモアセチル基（ＢｒＣＨｔＣＯ−） 、クロミツセ
チル基（ＣＪＣＨ，Ｃｏ−） 、等のハロゲン化アセチ
ル基等、チオール基と容易に反応し得る官能基な意味す
るが、これらの例に限定されるものではない。チオール
基反応性基な含有する物質とは、例えば、上記の例のチ
オール基反応性基を元来有するか、新たに導入された物
質であり、例えば、水溶性蛋白質、糖蛋白、天然及び合
成ペプチド、天然及び合成重合体等の高分子物質、及び
例えば、上記の例のチオール基反応性基をその分子構造
の部分構造として含有する低分子化合物を意味する。
チル基（ＣＪＣＨ，Ｃｏ−） 、等のハロゲン化アセチ
ル基等、チオール基と容易に反応し得る官能基な意味す
るが、これらの例に限定されるものではない。チオール
基反応性基な含有する物質とは、例えば、上記の例のチ
オール基反応性基を元来有するか、新たに導入された物
質であり、例えば、水溶性蛋白質、糖蛋白、天然及び合
成ペプチド、天然及び合成重合体等の高分子物質、及び
例えば、上記の例のチオール基反応性基をその分子構造
の部分構造として含有する低分子化合物を意味する。
高分子物質にチオール基反応性基な導入するためには、
一般的にはチオール基反応性基導入剤を高分子物質に作
用させればよい。この目的に使用し得るチオール基反応
性基導入剤は多岐に渡るが、例えば、下記の如きものが
ある。
一般的にはチオール基反応性基導入剤を高分子物質に作
用させればよい。この目的に使用し得るチオール基反応
性基導入剤は多岐に渡るが、例えば、下記の如きものが
ある。
Ｎ−サクンンイミジル４−（Ｎ−マレイミドＪベンゾエ
ート Ｎ−サクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミド）ブチレー
ト Ｎ、Ｎ’−０−フェニレンジマレイミドｐ−ベンゾキノ
ン す Ｎ−サクンンイミジノ１ヨードアセテートチオール基反
応性基をその分子構造の部分構造として含有する低分子
化合物の例としては、抗腫瘍剤ダウノマイシンを臭素化
して得られる、１４−ｊロモダウノマイシンがある。
ート Ｎ−サクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミド）ブチレー
ト Ｎ、Ｎ’−０−フェニレンジマレイミドｐ−ベンゾキノ
ン す Ｎ−サクンンイミジノ１ヨードアセテートチオール基反
応性基をその分子構造の部分構造として含有する低分子
化合物の例としては、抗腫瘍剤ダウノマイシンを臭素化
して得られる、１４−ｊロモダウノマイシンがある。
本発明において使用するＮ −（２，４−ジニトロフェ
ニル）システィンは、例えば次の方法により工業的に容
易に製造され得る物質である。即ち、ンスチン（１体、
６体又はｄｉ体でもよい）Ｋアルカリ存在下２．４−ジ
ニトロフルオロベンゼンを作用してＮ、Ｎ’−ビス（２
，４−ジニトロフェニル）シスチンヲ得、次いでこれを
過剰の２−メルカプトエタノール又はトリフェニルホス
フィンで還元して、目的物であるＮ −（２，４−ジニ
トロフェニル）システィンを得る。
ニル）システィンは、例えば次の方法により工業的に容
易に製造され得る物質である。即ち、ンスチン（１体、
６体又はｄｉ体でもよい）Ｋアルカリ存在下２．４−ジ
ニトロフルオロベンゼンを作用してＮ、Ｎ’−ビス（２
，４−ジニトロフェニル）シスチンヲ得、次いでこれを
過剰の２−メルカプトエタノール又はトリフェニルホス
フィンで還元して、目的物であるＮ −（２，４−ジニ
トロフェニル）システィンを得る。
Ｈ
（へ）発明の作用及び効果
次に本発明の方法の手順を説明する。例えば蛋白質、糖
蛋白質、ペプチド、合成ポリマー等の高分子物質に、例
えば、マしイミド基。
蛋白質、ペプチド、合成ポリマー等の高分子物質に、例
えば、マしイミド基。
ハロゲノアセチル基等のナオー７１基反応性基が導入さ
れた物質（（おける、該−Ｆ７−・−ル基反応性基の量
を定量する場合、一部の試料を溶解した溶液（例えば、
適当な緩衝液を用いた溶液）に、チオール基反応性基の
予想される当ｔの１倍以上の量のＮ−（２，４−ジニト
ロフェニル）システィンを、固体のまま又は、水又は有
機溶媒中の溶液として加え、反応させる。反応けは２〜
１２１反応温度は−１０゜〜＋５０℃２反応時間は１分
〜６時間が望ましい。該試薬の添加量は、当量か又は過
剰であることが必要であるが、好ましい量は１．５〜１
００倍量である。反応終了後、例えば、セファデックス
Ｇ−２５を用いるゲル濾過カラムクロマトグラフィーや
、透析等の方法により、過剰の試薬を除去すると、２，
４−ジニトロフェニル基が導入されたことにより黄色を
呈する試料が得られる。得られた試料に導入すｈ＊Ｎ−
（２，４−／ニトロフェニル）システィンの景は、３６
０ｎｍの吸光度を測定して、次の式により算出されろ（
日本生化学会編。
れた物質（（おける、該−Ｆ７−・−ル基反応性基の量
を定量する場合、一部の試料を溶解した溶液（例えば、
適当な緩衝液を用いた溶液）に、チオール基反応性基の
予想される当ｔの１倍以上の量のＮ−（２，４−ジニト
ロフェニル）システィンを、固体のまま又は、水又は有
機溶媒中の溶液として加え、反応させる。反応けは２〜
１２１反応温度は−１０゜〜＋５０℃２反応時間は１分
〜６時間が望ましい。該試薬の添加量は、当量か又は過
剰であることが必要であるが、好ましい量は１．５〜１
００倍量である。反応終了後、例えば、セファデックス
Ｇ−２５を用いるゲル濾過カラムクロマトグラフィーや
、透析等の方法により、過剰の試薬を除去すると、２，
４−ジニトロフェニル基が導入されたことにより黄色を
呈する試料が得られる。得られた試料に導入すｈ＊Ｎ−
（２，４−／ニトロフェニル）システィンの景は、３６
０ｎｍの吸光度を測定して、次の式により算出されろ（
日本生化学会編。
生化学実験講座ｌ、タンパク質の化学■、第第１テ７
照）。
Ｎ−（２．４−ジニトロフェニル）システィン基の量−
ｋ）吸光度Ｘ溶媒容量（ｊ） 分子吸光係数（ｇ＝１．７Ｘ１０’ｊ／ｍｏｋ）得られ
た値は、試料中のチオーノし基反応性基の量を表わすも
のである。この時１反応精製後の試料の量（ｍｏｌｅ）
が定量されれば、試料１モルに含有されるチオール基反
応性基の量（ｍｏｌｅ）は、次の式により算出される。
ｋ）吸光度Ｘ溶媒容量（ｊ） 分子吸光係数（ｇ＝１．７Ｘ１０’ｊ／ｍｏｋ）得られ
た値は、試料中のチオーノし基反応性基の量を表わすも
のである。この時１反応精製後の試料の量（ｍｏｌｅ）
が定量されれば、試料１モルに含有されるチオール基反
応性基の量（ｍｏｌｅ）は、次の式により算出される。
試料１モルに含有されるチオール基反応性基の景試料中
のチオール基反応性基の３１（ｍｏ ｌｅ ）試料の量
（ｍｏｌｅ） 試料が、チオール基反応性基をその分子構造の一部とす
る低分子化合物の場合も、同じ手順で定量することがで
きる。この場合、１剰の試薬の分離操作には例えば、シ
リカゲルカラムクロマトグラフィーや、高速液体クロマ
トグラフィーなどの吸着もしくは分配クロマトグラフィ
ーが好ましく用いられろ。
のチオール基反応性基の３１（ｍｏ ｌｅ ）試料の量
（ｍｏｌｅ） 試料が、チオール基反応性基をその分子構造の一部とす
る低分子化合物の場合も、同じ手順で定量することがで
きる。この場合、１剰の試薬の分離操作には例えば、シ
リカゲルカラムクロマトグラフィーや、高速液体クロマ
トグラフィーなどの吸着もしくは分配クロマトグラフィ
ーが好ましく用いられろ。
（へ）実施例
以下、実施例により、本発明な詳述するが本発明はこれ
に限定されない。
に限定されない。
実施例１
高い腫瘍選択性が期待される抗ａｍ抗体−マイトマイシ
ンと複合体の体製と、その工程における免疫グロブリン
Ｇ （ＩｇＧ）蛋白質に導入されたマレイｊ）基の定量
。
ンと複合体の体製と、その工程における免疫グロブリン
Ｇ （ＩｇＧ）蛋白質に導入されたマレイｊ）基の定量
。
反応工程
ＩｇＧ：抗し］２３０ウサギＩｇＧ
１−＾
１−←）マレイミド基を導入したＩｇＧ抗体の調製及び
マレイミド基の定量。
マレイミド基の定量。
マウス白血病Ｌ１２１０細胞で免疫した家兎の血清より
精製して得られたウサギＩｇＧ ３０■を、０．１Ｍす
／酸緩衝液−０，１Ｍ廖化ナトリウム（以後ＮａＣ１と
省略する） （ＰＨ７，０） １．０ｍｌの溶液とし、
これにＮ−サクシイミジルｍ−マレイミドベンゾエート
（以下ＳＭＢと略す）の１００ｍＭジメチルホルムアミ
ド（以下ＤＭＦと省略）溶液２０μｌを室温下に加え、
３５分間ゆっくり攪拌し次のち、素速くセファデックス
Ｇ−２５のカラム（１，ＯＸ ４０ｃｍ、 ０．１
Ｍリン酸緩衝液Ｎ１６．５）に通し、低分子を除くと、
マレイミド基を導入され九ウサギＩｇＧを含む溶液９．
５ ｍｌが得られた（１−１）。
精製して得られたウサギＩｇＧ ３０■を、０．１Ｍす
／酸緩衝液−０，１Ｍ廖化ナトリウム（以後ＮａＣ１と
省略する） （ＰＨ７，０） １．０ｍｌの溶液とし、
これにＮ−サクシイミジルｍ−マレイミドベンゾエート
（以下ＳＭＢと略す）の１００ｍＭジメチルホルムアミ
ド（以下ＤＭＦと省略）溶液２０μｌを室温下に加え、
３５分間ゆっくり攪拌し次のち、素速くセファデックス
Ｇ−２５のカラム（１，ＯＸ ４０ｃｍ、 ０．１
Ｍリン酸緩衝液Ｎ１６．５）に通し、低分子を除くと、
マレイミド基を導入され九ウサギＩｇＧを含む溶液９．
５ ｍｌが得られた（１−１）。
かくして得られた溶液に含有される蛋白質の量及び、Ｉ
ｇＧ分子に導入されたマレイミド基の数は下記の如くに
定量した。
ｇＧ分子に導入されたマレイミド基の数は下記の如くに
定量した。
ＩｇＧの量は２８０ｎｍの吸光度測定より２９．２■で
あった。
あった。
ＩｇＧの分子に導入されたマレイミド基の数は下記の如
く、適当量のサンプル中のＩｇＧ及びマレイミド基の量
な定量して求めた。溶液１．０ｒＤＩヲ取り、Ｎ−（２
，４−ジニトロフェニル）システィン（以下ＤＮＰシス
ティンと省略）１００ｍＭ ＤＭＦ溶液５Ａｊを加え
、４°で一夜放置した。反応液なセファデックスＧ−２
５（０，０１Ｍ−リン酸ナトリウム緩衝液−０，１４Ｍ
ＮａＣｌＳ７．０）に０．０１ Ｍ−リン酸ナトリ
ウム緩衝液−０，１４Ｍ ＮａＣｊで通し、蛋白溶出
部をプールした。２８０ｎｍの吸収偽大よりＩｇＧの濃
度を、３６０ｎｍの吸収極大より、マレイミド基に反応
したＤＮＰ−システィン残基の濃度を求めた。
く、適当量のサンプル中のＩｇＧ及びマレイミド基の量
な定量して求めた。溶液１．０ｒＤＩヲ取り、Ｎ−（２
，４−ジニトロフェニル）システィン（以下ＤＮＰシス
ティンと省略）１００ｍＭ ＤＭＦ溶液５Ａｊを加え
、４°で一夜放置した。反応液なセファデックスＧ−２
５（０，０１Ｍ−リン酸ナトリウム緩衝液−０，１４Ｍ
ＮａＣｌＳ７．０）に０．０１ Ｍ−リン酸ナトリ
ウム緩衝液−０，１４Ｍ ＮａＣｊで通し、蛋白溶出
部をプールした。２８０ｎｍの吸収偽大よりＩｇＧの濃
度を、３６０ｎｍの吸収極大より、マレイミド基に反応
したＤＮＰ−システィン残基の濃度を求めた。
ただし、ＤＮＰ−システィン残基の２８０ｎｍＫおける
吸光度は、３６０ｎｍの極大値の２８．１％として、Ｉ
ｇＧ濃度の算出値を補正した。
吸光度は、３６０ｎｍの極大値の２８．１％として、Ｉ
ｇＧ濃度の算出値を補正した。
以上の手続きにより、ＩｇＧ分子に導入されたＤＮＰ−
システィンと反応性のマレイミド基の数を求めた。
システィンと反応性のマレイミド基の数を求めた。
一方、マレイミド基量の定量に用いたＤＮＰＮシーテイ
ンの１ｇＧへの非特異的吸着による測定値誤差を修正す
るために、次の実験を行なっ九。
ンの１ｇＧへの非特異的吸着による測定値誤差を修正す
るために、次の実験を行なっ九。
ウサギＩｇＧ ３．１５ ｑｆ） ０．１ Ｍ リンｒ
ＩＩ緩衝液０．１４ Ｍ ＮａＣｌ （ＰＨ６，５）
１．０ｍ４ Ｋ、上記ＤＮＰＮシーテイン溶液５．０
μｊを加え、４°で１夜放置したのち、セファデックス
Ｇ−２５で、上記と同様に分離し、蛋白質溶出部をまと
めた。２８０ｎｍと３６０ ｎｍの吸光度より、ＩｇＧ
１分子に吸着したＤＮＰ−システィンの数を求めると。
ＩＩ緩衝液０．１４ Ｍ ＮａＣｌ （ＰＨ６，５）
１．０ｍ４ Ｋ、上記ＤＮＰＮシーテイン溶液５．０
μｊを加え、４°で１夜放置したのち、セファデックス
Ｇ−２５で、上記と同様に分離し、蛋白質溶出部をまと
めた。２８０ｎｍと３６０ ｎｍの吸光度より、ＩｇＧ
１分子に吸着したＤＮＰ−システィンの数を求めると。
この値によって、上で求めたマレイミド基数な補正する
と、３．５２−０．１９＝３．３３即ち、ＩｇＧ分子に
導入されたマレイミド基の数は３．３３コである。
と、３．５２−０．１９＝３．３３即ち、ＩｇＧ分子に
導入されたマレイミド基の数は３．３３コである。
１− （０） ２−ピリジルジチオ基を含有する牛崩清
アルブミンの調製 牛血清アルブミン（以下ＢＳＡと省略する）の結晶（市
販品）１３２■を０．１ Ｍリン酸ナトリウム緩衝液−
０，１Ｍ ＮａＣｊ −１ｍ ＭＥＤＴＡ溶液（ｐｌ
＋ ７．０ ） ５．０ｍ／に溶解し、２−ピリジルジ
スルフィド４．４■をＤ Ｍ Ｆ Ｏ，１ｍｌに溶解し
た溶液を添加し、４°で一夜反応した。反応液をセロフ
ァンチューブに入れ、４℃にて２日間、０．０１Ｍ リ
ン酸緩衝液−０，４Ｍ ＮａＣｌ −１ｍ ＭＥＤＴＡ
（ｎ７．０）Ｋ対して透析した。透析回収液をセファ
デックスＧ−２５（０，０１Ｍリン酸緩衝液−０−１４
Ｍ ＮａＣＪ １ ｍ ＭＥＤＴＡ ＊ Ｐ’ ７
−０ ） （１ｃｍＩＸ ４０ ｏｘ ）のカラムに通
し、蛋白質溶出部１０．２ｍｌを得た。回収ＢＳＡ量は
９６．３１部ｇ （２８０ｎｍの吸光度による）であっ
た。
アルブミンの調製 牛血清アルブミン（以下ＢＳＡと省略する）の結晶（市
販品）１３２■を０．１ Ｍリン酸ナトリウム緩衝液−
０，１Ｍ ＮａＣｊ −１ｍ ＭＥＤＴＡ溶液（ｐｌ
＋ ７．０ ） ５．０ｍ／に溶解し、２−ピリジルジ
スルフィド４．４■をＤ Ｍ Ｆ Ｏ，１ｍｌに溶解し
た溶液を添加し、４°で一夜反応した。反応液をセロフ
ァンチューブに入れ、４℃にて２日間、０．０１Ｍ リ
ン酸緩衝液−０，４Ｍ ＮａＣｌ −１ｍ ＭＥＤＴＡ
（ｎ７．０）Ｋ対して透析した。透析回収液をセファ
デックスＧ−２５（０，０１Ｍリン酸緩衝液−０−１４
Ｍ ＮａＣＪ １ ｍ ＭＥＤＴＡ ＊ Ｐ’ ７
−０ ） （１ｃｍＩＸ ４０ ｏｘ ）のカラムに通
し、蛋白質溶出部１０．２ｍｌを得た。回収ＢＳＡ量は
９６．３１部ｇ （２８０ｎｍの吸光度による）であっ
た。
得られた２−ピリジルジチオ基を有するＢＳＡ上の活性
ジスルフィド残基の量は、１部のサンプルｗ４剰のジチ
オスレイトールを作用させ、遊離したチオピリドンの秒
数極大値（３４３ｎｍ）における吸光度を測定して定量
した。一方、該サンプル中のＢＳＡの量は、２８０ｎｍ
ｌＣおける吸光度を測定して求めた。Ｂ５Ａｌ分子に存
在する活性ジスルフィド残基の数は、これらの測定値の
比で表わされる。即ち、濃度比で表わせば、 １−（→マイトマイシンーＣＣ以後ＭＭＣと省略）を結
合し九ＢＳＡ（１−２）の！Ｉｌ！！！ｌ−（ロ）で得
られ皮２−ピリジルジチオ基を有するＢ Ｓ Ａ Ｉ
４．１■を溶解しｆ：、０．０３Ｍ−リン酸緩衝液−０
，０３Ｍ ＮａＣｌ（ｎ ７．６ ） １．５ｍ／に、
１ａ−（４−サクシンイミシルオキン力ルボニルフ゛チ
リン）−７−アミ／−９ａ−メトキンマイトサン４．１
１■をＤＭＦ ５０μＡＩＫ溶解して加え、４°Ｃで５
時間攪拌した後、同じバッファーに溶かし、た】Ｍジチ
オスレイトール４．２８μｌを加えて、１．５時間４℃
に保った。反応液を０．０】Ｍｉｖ酸緩酸液Ｓ液、１４
Ｍ ＮａＣｌ −Ｃ１，０１ｍＭＥＤＴＡ（ＰＨ５，
２５）に対して４℃で１７時間透析した。
ジスルフィド残基の量は、１部のサンプルｗ４剰のジチ
オスレイトールを作用させ、遊離したチオピリドンの秒
数極大値（３４３ｎｍ）における吸光度を測定して定量
した。一方、該サンプル中のＢＳＡの量は、２８０ｎｍ
ｌＣおける吸光度を測定して求めた。Ｂ５Ａｌ分子に存
在する活性ジスルフィド残基の数は、これらの測定値の
比で表わされる。即ち、濃度比で表わせば、 １−（→マイトマイシンーＣＣ以後ＭＭＣと省略）を結
合し九ＢＳＡ（１−２）の！Ｉｌ！！！ｌ−（ロ）で得
られ皮２−ピリジルジチオ基を有するＢ Ｓ Ａ Ｉ
４．１■を溶解しｆ：、０．０３Ｍ−リン酸緩衝液−０
，０３Ｍ ＮａＣｌ（ｎ ７．６ ） １．５ｍ／に、
１ａ−（４−サクシンイミシルオキン力ルボニルフ゛チ
リン）−７−アミ／−９ａ−メトキンマイトサン４．１
１■をＤＭＦ ５０μＡＩＫ溶解して加え、４°Ｃで５
時間攪拌した後、同じバッファーに溶かし、た】Ｍジチ
オスレイトール４．２８μｌを加えて、１．５時間４℃
に保った。反応液を０．０】Ｍｉｖ酸緩酸液Ｓ液、１４
Ｍ ＮａＣｌ −Ｃ１，０１ｍＭＥＤＴＡ（ＰＨ５，
２５）に対して４℃で１７時間透析した。
回収液１．６０ｍ１に含有されるＭＭＣ結合ＢＳＡの量
は、２８０ｎｍでの吸光度測定により１４■であった。
は、２８０ｎｍでの吸光度測定により１４■であった。
さらに、回収液に含有されるＭＭＣ結合ＢＳＡ（１−２
）について、回収液の一部を使って下記の定量を行なっ
た。
）について、回収液の一部を使って下記の定量を行なっ
た。
■ ＢＳＡ分子に結合したＭＭＣの数（ＭＭＣ／ＢＳＡ
）ＭＭＣの吸収極大３６０ｎｍにおける吸光度よりＭＭ
Ｃ残基量を、ＢＳＡの吸収極大２８０ｎｍにおける吸光
度よりＢＳＡ量を求めた。
）ＭＭＣの吸収極大３６０ｎｍにおける吸光度よりＭＭ
Ｃ残基量を、ＢＳＡの吸収極大２８０ｎｍにおける吸光
度よりＢＳＡ量を求めた。
ただし、２８０ｎｍにおけるＭＭＣの吸光度は極大値３
６０ｎｍの吸収の４．１憾として、ＢＳＡの吸光度を補
正した。その結果 〔ＭＭＣ残基）／［’ＢＳＡ″に一色旦旦１邑＝７．０
１３７βＭ ■ ＢＳＡ分子に再生したチオールの数（）ＩＳ−／Ｂ
ＳＡ） 反応生成物の１部を０．１ＭＩＪン酸緩衝液
−０．１Ｍ ＮａＣＪ −１ｍ ＭＥＤＴＡ （ｍ ７
．６ ）の溶液中、過剰の５．５′−ジチオビス−（２
−ニド。
６０ｎｍの吸収の４．１憾として、ＢＳＡの吸光度を補
正した。その結果 〔ＭＭＣ残基）／［’ＢＳＡ″に一色旦旦１邑＝７．０
１３７βＭ ■ ＢＳＡ分子に再生したチオールの数（）ＩＳ−／Ｂ
ＳＡ） 反応生成物の１部を０．１ＭＩＪン酸緩衝液
−０．１Ｍ ＮａＣＪ −１ｍ ＭＥＤＴＡ （ｍ ７
．６ ）の溶液中、過剰の５．５′−ジチオビス−（２
−ニド。
安息香ｍ ） ｒＤＴＮＢ） を加え、４℃で一夜反
応し良。反応液をセファテックスＧ〜２５ （０，０１
Ｍ−リン酸ナトリウムｍ％液−０，１，４Ｍ ＮａＣ
１−１ｍ ＭＥＤＴＡ ） Ｋ通し、蛋白部をプールす
る。
応し良。反応液をセファテックスＧ〜２５ （０，０１
Ｍ−リン酸ナトリウムｍ％液−０，１，４Ｍ ＮａＣ
１−１ｍ ＭＥＤＴＡ ） Ｋ通し、蛋白部をプールす
る。
このものについて、２８０ｎｍの吸収よりＢＳＡの濃度
を求め、さらＫ、過剰のジチオスレイトールを加えるこ
とにより遊離し７’ｃ５−フルカプト−２−二トロ安息
香酸に由来する４１２ｎｍＫおける吸収を測定すること
Ｋよって、ＭＭＣ結合ＢＳＡＫ含有されるチオール基の
濃度を定量できた。これらの比を求めると、 ［？ｔ−趨ｌ）／（ＢＳＡ１＝（１，４７）／（２，１
０）＝０．７０以上の定量値より、得られたＭＭＣ結合
アルブミンは、 １−２式で表わされる。
を求め、さらＫ、過剰のジチオスレイトールを加えるこ
とにより遊離し７’ｃ５−フルカプト−２−二トロ安息
香酸に由来する４１２ｎｍＫおける吸収を測定すること
Ｋよって、ＭＭＣ結合ＢＳＡＫ含有されるチオール基の
濃度を定量できた。これらの比を求めると、 ［？ｔ−趨ｌ）／（ＢＳＡ１＝（１，４７）／（２，１
０）＝０．７０以上の定量値より、得られたＭＭＣ結合
アルブミンは、 １−２式で表わされる。
ｌ−に）ＳＭＢ化１ｇＧとＭＭＣ結合ＢＳＡの反応によ
る複合体（１−３）の調製 上記１−ビ）で得られたマレイミド基を平均３．３３個
含肩するＩｇＧの溶液（０，１Ｍリン酸緩衝液−０，１
Ｍ ＮａＣｌ、ＰＩＩ６．５） １．５ｍ／と、上記１
−（ハ）で得られた、ＭＭＣを平均７．０個結合したＢ
ＳＡの溶液（０，０１Ｍ酢酸緩衝液０．１４ Ｍ Ｎａ
Ｃｌ −０，０１ｍ ＭＥＤＴＡ 、 ｐｌ＋ ５．２
５ ） １．５ ｍｌ を混合し、４℃で一夜反応せし
めた。反応液なナトリウムドデンルサルフエート（以下
ＳＤＳと省略する）電気泳動で調べることにより、生成
物は、ＩｇＧＫＭＭＣ結合ＢＳＡが１〜３個結合した複
合体（１−３）を主成分とすることが判明した。セファ
デックスＧ−１５０スーパーフアインのカラム（１，８
Ｘ ８０ ｆｉ ）を用いることＫより、複合体を精製
した。
る複合体（１−３）の調製 上記１−ビ）で得られたマレイミド基を平均３．３３個
含肩するＩｇＧの溶液（０，１Ｍリン酸緩衝液−０，１
Ｍ ＮａＣｌ、ＰＩＩ６．５） １．５ｍ／と、上記１
−（ハ）で得られた、ＭＭＣを平均７．０個結合したＢ
ＳＡの溶液（０，０１Ｍ酢酸緩衝液０．１４ Ｍ Ｎａ
Ｃｌ −０，０１ｍ ＭＥＤＴＡ 、 ｐｌ＋ ５．２
５ ） １．５ ｍｌ を混合し、４℃で一夜反応せし
めた。反応液なナトリウムドデンルサルフエート（以下
ＳＤＳと省略する）電気泳動で調べることにより、生成
物は、ＩｇＧＫＭＭＣ結合ＢＳＡが１〜３個結合した複
合体（１−３）を主成分とすることが判明した。セファ
デックスＧ−１５０スーパーフアインのカラム（１，８
Ｘ ８０ ｆｉ ）を用いることＫより、複合体を精製
した。
ｌ−（ホ）Ｌ１２１０ Ｊａｌ胞に対する複合体（１−
え）の細胞毒性 上記１−に）の如くして得られた複合体（１−３）の標
的細胞Ｌ１２３０に対する細胞毒性を検討した。
え）の細胞毒性 上記１−に）の如くして得られた複合体（１−３）の標
的細胞Ｌ１２３０に対する細胞毒性を検討した。
２４大の培養プレートに、５Ｘ］Ｏ’個のＬ１２１０細
胞を含むロズウエルバークメモリアルインステチュート
１６４０ （以下ＲＰＭＩ １６４０と省略する）培地
（１０％牛脂児血清、２０μＭの２−メルカプトエタノ
ールと０．１■／ｍｌのカナマイシンを含む）０．９ｍ
ｊを分注し、更に種々の濃度の被検サンプル０．１ｍｌ
を加え、５％ＣＯ１雰囲気下で３７℃で４８時間培養後
、トリバンブルー染色法により生細胞数を測定した。
胞を含むロズウエルバークメモリアルインステチュート
１６４０ （以下ＲＰＭＩ １６４０と省略する）培地
（１０％牛脂児血清、２０μＭの２−メルカプトエタノ
ールと０．１■／ｍｌのカナマイシンを含む）０．９ｍ
ｊを分注し、更に種々の濃度の被検サンプル０．１ｍｌ
を加え、５％ＣＯ１雰囲気下で３７℃で４８時間培養後
、トリバンブルー染色法により生細胞数を測定した。
その結果、第１表に示す如り、交合体（１−３）は、標
的細胞Ｌ］、２１Ｑに対し濃度依存的に著しい細胞増膚
抑制効果を示した。尚、培養は２系列行ない、値はその
平均で示した。
的細胞Ｌ］、２１Ｑに対し濃度依存的に著しい細胞増膚
抑制効果を示した。尚、培養は２系列行ない、値はその
平均で示した。
第１表
実施例２
免疫グロブリン（ＩｇＧ”ｌ蛋白質に導入されたヨード
アセチル基の定量 実施例１−（イ）の反応における、チオール基反応性基
導入剤Ｎ−サクシンイミジ１１． （ｍ−マレイミド）
ベンゾエートのかわりに、Ｎ−サクシクイ５ジルヨード
アセテートを用いて同様の反応を行なった。生成物九つ
いて実施例１−（イ）と同様な操作をほどこし、導入さ
れたヨードアセチル基の量を定量したところ、ＩｇＧ１
分子に４．３個導入されたことが判明した。
アセチル基の定量 実施例１−（イ）の反応における、チオール基反応性基
導入剤Ｎ−サクシンイミジ１１． （ｍ−マレイミド）
ベンゾエートのかわりに、Ｎ−サクシクイ５ジルヨード
アセテートを用いて同様の反応を行なった。生成物九つ
いて実施例１−（イ）と同様な操作をほどこし、導入さ
れたヨードアセチル基の量を定量したところ、ＩｇＧ１
分子に４．３個導入されたことが判明した。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、チオール基反応性基を含有する物質に、Ｎ−（２，
４−ジニトロフェニル）システインを反応せしめ、得ら
れる反応生成物中のＮ−２，４−ジニトロフェニル基に
由来する吸光度を測定することを特徴とする該物質に含
有されるチオール基反応性基の定量法。 ２、チオール基反応性基が、マレイミド基 （▲数式、化学式、表等があります▼）、２，５−ジオ
キソ−３−シクロヘキセニル基（▲数式、化学式、表等
があります▼）、ヨードアセチル基 （ＩＣＨ＿２ＣＯ−）、ブロモアセチル基（ＢｒＣＨ＿
２ＣＯ−）、クロロアセチル基（ＣｌＣＨ＿２ＣＯ−）
、のいずれかである、特許請求の範囲第１項記載のチオ
ール基反応性基の定量法。 ３、チオール基反応性基を含有する物質が、チオール基
反応性基を導入した水溶性蛋白質である、特許請求の範
囲第１項又は第２項記載のチオール基反応性基の定量法
。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12383484A JPS613066A (ja) | 1984-06-18 | 1984-06-18 | チオ−ル基反応性基の定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12383484A JPS613066A (ja) | 1984-06-18 | 1984-06-18 | チオ−ル基反応性基の定量法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS613066A true JPS613066A (ja) | 1986-01-09 |
Family
ID=14870526
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12383484A Pending JPS613066A (ja) | 1984-06-18 | 1984-06-18 | チオ−ル基反応性基の定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS613066A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0374620A2 (de) * | 1988-12-19 | 1990-06-27 | MERCK PATENT GmbH | Verfahren und Mittel zur Bestimmung von Maleimidgruppen |
| US5576216A (en) * | 1992-07-14 | 1996-11-19 | Zipora Patchornik | Universal standard reagents, method of preparing same and use thereof |
| US9475768B2 (en) | 2011-03-17 | 2016-10-25 | The Hong Kong University Of Science And Technology | Luminogen compounds and the use of the same for biosensing and cellular imaging |
| US9518921B2 (en) | 2011-12-28 | 2016-12-13 | The Hong Kong University Of Science And Technology | Silica nanoparticles with aggregation induced emission characteristics as fluorescent bioprobe for intracellular imaging and protein carrier |
-
1984
- 1984-06-18 JP JP12383484A patent/JPS613066A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0374620A2 (de) * | 1988-12-19 | 1990-06-27 | MERCK PATENT GmbH | Verfahren und Mittel zur Bestimmung von Maleimidgruppen |
| US5576216A (en) * | 1992-07-14 | 1996-11-19 | Zipora Patchornik | Universal standard reagents, method of preparing same and use thereof |
| US9475768B2 (en) | 2011-03-17 | 2016-10-25 | The Hong Kong University Of Science And Technology | Luminogen compounds and the use of the same for biosensing and cellular imaging |
| US9518921B2 (en) | 2011-12-28 | 2016-12-13 | The Hong Kong University Of Science And Technology | Silica nanoparticles with aggregation induced emission characteristics as fluorescent bioprobe for intracellular imaging and protein carrier |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Bayley | Photogenerated reagents in biochemistry and molecular biology | |
| Allen | Sequencing of proteins and peptides | |
| Plapp et al. | Activity of bovine pancreatic deoxyribonuclease A with modified amino groups | |
| Chang et al. | Artificial hybrid protein containing a toxic protein fragment and a cell membrane receptor-binding moiety in a disulfide conjugate. I. Synthesis of diphtheria toxin fragment ASS-human placental lactogen with methyl-5-bromovalerimidate. | |
| Clark et al. | Exofacial photolabelling of the human erythrocyte glucose transporter with an azitrifluoroethylbenzoyl-substituted bismannose | |
| KR0148619B1 (ko) | Pivka-x의 측정방법 및 측정시약 | |
| EP0304628A2 (en) | Immunoassay for CK-MM isoenzymes | |
| US4259233A (en) | β-Galactosyl-umbelliferone-labeled protein and polypeptide conjugates | |
| Workman et al. | Pepsin inhibition by a high specific activity radioiodinated derivative of pepstatin | |
| Neumann et al. | On the Non‐Essentiality of Two Specific Disulphide Bonds in Ribonuclease for its Biological Activity | |
| Line et al. | The effect of chemical modification on the iron binding properties of human transferrin | |
| Dunn et al. | The synthesis, purification, and evaluation of a chromophoric substrate for pepsin and other aspartyl proteases: design of a substrate based on subsite preferences | |
| US4259232A (en) | Flavin adenine dinucleotide-labeled protein and polypeptide conjugates | |
| JPS613066A (ja) | チオ−ル基反応性基の定量法 | |
| Bergdoll et al. | Staphylococcal Enterotoxin B: III. The physicochemical properties and the N-and C-terminal amino acid sequences | |
| JPH02227098A (ja) | マレイミド基を測定する方法および測定剤 | |
| Burstein et al. | Selective chemical cleavage of tryptophanyl peptide bonds in peptides and proteins | |
| JPS6291197A (ja) | 抗ヒトインタ−ロイキン１抗体，その製法及びその使用法 | |
| SCHEINER‐BOBIS et al. | Demonstration of an Mg2+‐induced conformational change by photoaffinity labelling of the high‐affinity ATP‐binding site of (Na++ K+)‐ATPase with 8‐azido‐ATP | |
| Huang et al. | Calcium-binding protein of bovine intestine. The complete amino acid sequence. | |
| Habeeb | A new reagent for nitroguanidination of proteins | |
| Kurup et al. | Photoaffinity labeling of uncoupler binding sites on mitochondrial membrane | |
| Taira et al. | Effects of physical and chemical treatments on the biological activity of ricin D | |
| EP0132292A2 (en) | Method of measuring biological ligands | |
| Levy | The selective chloromercuration of insulin |