JPS61280283A - 酵母エノラ−ゼプロモ−タ− - Google Patents
酵母エノラ−ゼプロモ−タ−Info
- Publication number
- JPS61280283A JPS61280283A JP60120900A JP12090085A JPS61280283A JP S61280283 A JPS61280283 A JP S61280283A JP 60120900 A JP60120900 A JP 60120900A JP 12090085 A JP12090085 A JP 12090085A JP S61280283 A JPS61280283 A JP S61280283A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- yeast
- promoter
- dna
- region
- enolase
- Prior art date
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- Granted
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
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- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
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- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、酵母エノラーゼを支配している遺伝子の発現
活性を有するプロモーターを含有するＤＮＡに関する。
活性を有するプロモーターを含有するＤＮＡに関する。
近年、遺伝子工学的手法を用いて、有用タンパク質を微
生物に産生させる技術が急速に一般化している。宿主と
して用いられる微生物は、大腸菌が最も汎用されている
が、新しい宿主の１つとして有核細胞生物である酵母が
注目されている。酵母は、培養条件が容易であり、その
安全性が歴史的にも証明されていること、また特にサツ
カロミセス酵母では、遺伝生化学的解析が、より多くな
されていることなどの理由による。
生物に産生させる技術が急速に一般化している。宿主と
して用いられる微生物は、大腸菌が最も汎用されている
が、新しい宿主の１つとして有核細胞生物である酵母が
注目されている。酵母は、培養条件が容易であり、その
安全性が歴史的にも証明されていること、また特にサツ
カロミセス酵母では、遺伝生化学的解析が、より多くな
されていることなどの理由による。
一方、遺伝子工学的手法において、有用タンパク質を宿
主細胞に産生させる場合には、宿主に合ったプロモータ
ー領域（遺伝子発現調節部位）が必須であり、また発現
の効率は、使用するプロモーターの強さに依存している
ものと考えられている。特に酵母用プロモーターについ
ては、酸性ホスファターゼプロモーター、α−ファクタ
ープロモーター、グリセルアルデヒド−３−ホスフェー
トデヒドロゲナーゼプロモーター、ピルベートキナーゼ
プロモーター、３−ホスホグリセロキナーゼプロモータ
ーなどが報告されている。
主細胞に産生させる場合には、宿主に合ったプロモータ
ー領域（遺伝子発現調節部位）が必須であり、また発現
の効率は、使用するプロモーターの強さに依存している
ものと考えられている。特に酵母用プロモーターについ
ては、酸性ホスファターゼプロモーター、α−ファクタ
ープロモーター、グリセルアルデヒド−３−ホスフェー
トデヒドロゲナーゼプロモーター、ピルベートキナーゼ
プロモーター、３−ホスホグリセロキナーゼプロモータ
ーなどが報告されている。
酵母の解糖系の各酵素は一般に酵母内金タンパク質の数
パーセントを占めることから、それらの遺伝子プロモー
ターは、発現効率が高いものと考えられている。また、
解糖系酵素には、しばしば数種のアイソザイムが存在し
、炭素源の種類や培養条件の相違により異なる発現制御
を受けている。
パーセントを占めることから、それらの遺伝子プロモー
ターは、発現効率が高いものと考えられている。また、
解糖系酵素には、しばしば数種のアイソザイムが存在し
、炭素源の種類や培養条件の相違により異なる発現制御
を受けている。
エノラーゼは、解糖系の代謝サップ上、比較的下位に位
置し、２−ホスホグリセレートとホスホエノールビルベ
ートとの相互交換を触媒する酵素である。その遺伝子は
２種類存在するが、いずれも既に遺伝子が単離され、プ
ロモーター領域を含むＤＮＡ塩基配列が報告されている
（Ｍ、Ｊ、Ｈｏ１ｌａｎｄ。
置し、２−ホスホグリセレートとホスホエノールビルベ
ートとの相互交換を触媒する酵素である。その遺伝子は
２種類存在するが、いずれも既に遺伝子が単離され、プ
ロモーター領域を含むＤＮＡ塩基配列が報告されている
（Ｍ、Ｊ、Ｈｏ１ｌａｎｄ。
ｅｔ ａｌ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｔａ、＋ ２５６
．１３８５ （１９８１） ）。
．１３８５ （１９８１） ）。
ＥＮＯ１遺伝子はパン酵母を実用生産させる際に合成が
誘導される酵素（ｅｎｏｌａｓｅ−１）をコードする遺
伝子であり、ＥＮＯ２遺伝子はグルコースを炭素源とし
て通常のバッチ培養で生育させたときに合成が誘導され
る酵素（ｅｎｏｌａｓｅ−２）をコードする遺伝子であ
る（Ｌ、Ｍｃａｌｔｓｔｅｒ ａｎｄ Ｍ、Ｊ、Ｈｏ１
ｌａｎｄ、Ｊ、Ｂｉｏｌ。
誘導される酵素（ｅｎｏｌａｓｅ−１）をコードする遺
伝子であり、ＥＮＯ２遺伝子はグルコースを炭素源とし
て通常のバッチ培養で生育させたときに合成が誘導され
る酵素（ｅｎｏｌａｓｅ−２）をコードする遺伝子であ
る（Ｌ、Ｍｃａｌｔｓｔｅｒ ａｎｄ Ｍ、Ｊ、Ｈｏ１
ｌａｎｄ、Ｊ、Ｂｉｏｌ。
Ｃｈｅｗ、、 ２５７ ．７１８Ｎ１９Ｂ２）。）この
うち、ＥＮＯ１は、糖密等の炭素源の供給を制限しなか
ら好気的に連続培養することにより発現が誘導される遺
伝子と考えられることから、有用タンパク質を実用生産
する場合には有利であろうと推察される。
うち、ＥＮＯ１は、糖密等の炭素源の供給を制限しなか
ら好気的に連続培養することにより発現が誘導される遺
伝子と考えられることから、有用タンパク質を実用生産
する場合には有利であろうと推察される。
この様に宿主として酵母が注目されている一方、タンパ
ク賞をコードする遺伝子の発現をコントロールする酵母
に適合したプロモーターの開発は、いまだ充分とはいい
がたい。
ク賞をコードする遺伝子の発現をコントロールする酵母
に適合したプロモーターの開発は、いまだ充分とはいい
がたい。
また、解糖系酵素の１つであるエノラーゼ遺伝子プロモ
ニターにおいても、そのプロモーター領域を含むＤＮＡ
塩基配列が明らかにされてはいるが、遺伝子組換え技術
による酵母中での異種遺伝子発現系を構成するためには
使用されておらず、また、完全なプロモーター領域につ
いての検討も全くなされていない。
ニターにおいても、そのプロモーター領域を含むＤＮＡ
塩基配列が明らかにされてはいるが、遺伝子組換え技術
による酵母中での異種遺伝子発現系を構成するためには
使用されておらず、また、完全なプロモーター領域につ
いての検討も全くなされていない。
（問題を解決するための手段）
本発明者らは、上記の点に鑑み鋭意検討した結果、酵母
エノラーゼプロモーターの既知塩基配列領域に加えて、
さらにＤＮＡ塩基配列（＋）−以下余白一 ＧＡＡＴＴＣＧＧＴＣＡＴＴＧＡＴＧＣＡＴＧＣＡＴＧ
ＴＧＣＣＧＴＧＡＡＧＣＧＧＧＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＡ
（：ＴＴＡＡＧＣＣＡＧＴＡＡＣＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡ
ＣＡＣＧＧＣＡＣＴＴＣＧＣＣＣＴＧＴＴＧＧＴＣＴＴ
ＴＡＧＴＣＧＴＣＴＡＴＡＡＡＴＧＣＣＧＧＣＡＣＧＴ
ＧＣＧＡＴＣＡＴＣＧＴＧＧＣＧＧＧＧＴＴＴＴＡＡＧ
ＡＴＣＡＧＣＡＧＡＴＡＴＴＴＡＣＧＧＣＣＧＴＧＣＡ
ＣＧＣＴＡＧＴＡＧＣＡＣＣＧＣＣＣＣＡＡＡＡＴＴＣ
ＴＧＴＧＣＡＴＡＴＣＡＣへへＡＴＴＧＴＣＧＣＡＴＴ
ＡＣＣＧＣＧＧＡＡＣＣＧＣＣＡＧＡＴＡＴＴＣＡＴＴ
へＣＡＣＧＴＡＴＡＧＴＧＴＴＴＡＡＣＡＧＣＧＴＡＡ
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ＴＣＴＴＧＡＣＧＣＡＡＡＡＧＣＧＴＴＴＧＡＡＡＴＡ
ＡＴＧＡＣＧＡＡＡＡＡＧＡＡＧＧＡＡＧＡへへＡ＾へ
＾ＧＡＡＣＴＧＣＧＴＴＴＴＣＧＣＡＡＡＣＴＴＴＡＴ
ＴＡＣＴＧＣＴＴＴＴＴＣＴＴＣＣＴＴＣＴＴＴＴＴＴ
ＴＡＡＧＡＡＡ＾へＴＡＣＣＧＣＴＴＣＴＡＧＧＣＧＧ
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ＧＧＡＴＴＡＣＣＴＧＡＧＣＧＧＴＣＣＴＣＴＴＴＣＴ
ＡＡＴＧＧＡＣＴＣＧＣＣＡＧＧＡＧＡＡＡで表わされ
る領域を５′末端側の上流に結合させることによって、
酵母を宿主とする系で、異種遺伝子の発現に利用可能な
プロモーターを構築するに至り、本発明を完成するに至
った。
エノラーゼプロモーターの既知塩基配列領域に加えて、
さらにＤＮＡ塩基配列（＋）−以下余白一 ＧＡＡＴＴＣＧＧＴＣＡＴＴＧＡＴＧＣＡＴＧＣＡＴＧ
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＾ＧＡＡＣＴＧＣＧＴＴＴＴＣＧＣＡＡＡＣＴＴＴＡＴ
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る領域を５′末端側の上流に結合させることによって、
酵母を宿主とする系で、異種遺伝子の発現に利用可能な
プロモーターを構築するに至り、本発明を完成するに至
った。
すなわち、本発明は酵母エノラーゼを支配している遺伝
子の発現活性を有するプロモーターであって、発現活性
を有する酵母エノラーゼプロモーターが、エノラーゼ翻
訳開始コドンより上流の約７２０塩基対に対応する領域
を含むものであって、その５°末端側よりＤＮＡ塩基配
列（１）で示される塩基配列を含有している発現活性を
有する酵母エノラーゼプロモーターに関する。
子の発現活性を有するプロモーターであって、発現活性
を有する酵母エノラーゼプロモーターが、エノラーゼ翻
訳開始コドンより上流の約７２０塩基対に対応する領域
を含むものであって、その５°末端側よりＤＮＡ塩基配
列（１）で示される塩基配列を含有している発現活性を
有する酵母エノラーゼプロモーターに関する。
本発明の酵母エノラーゼプロモーター（ＥＮＯ１プロモ
ーターと略することもある。）の塩基配列は、翻訳開始
コドンＡＴＧより上流３５２塩基対までが報告されてい
るが、ＲＮＡポリメラーゼの認識部位と考えられるＴＡ
ＴＡＡＡＴ配列がＡＴＧの上流１４６塩基対（−１４６
ｂｐ）に、また類似の配列（ＴＡＴＴＡＡＴ）が−１２
１ｂｐに存在する。
ーターと略することもある。）の塩基配列は、翻訳開始
コドンＡＴＧより上流３５２塩基対までが報告されてい
るが、ＲＮＡポリメラーゼの認識部位と考えられるＴＡ
ＴＡＡＡＴ配列がＡＴＧの上流１４６塩基対（−１４６
ｂｐ）に、また類似の配列（ＴＡＴＴＡＡＴ）が−１２
１ｂｐに存在する。
またこの直下（−１１，０〜−６０）には、その意義に
ついてはいまだ明らかにされていないが、解糖系遺伝子
によく見られるＣＴ ｒｉｃｈな領域が存在する。さら
に転写開始部位は（−４０＞または（−４１）のアデニ
ン（Ａ）であることが明らかにされている。以上の知見
から、既知プロモーター領域をさらにプロモーター活性
に最小限必要な領域として、ＡＴＧの上流１７２塩基対
までをＤＳ領域とし、さらにその上流領域−１７３〜−
３５２ｂｐまでをＵ Ｐ Ｓ 領域として２つの単位に
分けて合成した。
ついてはいまだ明らかにされていないが、解糖系遺伝子
によく見られるＣＴ ｒｉｃｈな領域が存在する。さら
に転写開始部位は（−４０＞または（−４１）のアデニ
ン（Ａ）であることが明らかにされている。以上の知見
から、既知プロモーター領域をさらにプロモーター活性
に最小限必要な領域として、ＡＴＧの上流１７２塩基対
までをＤＳ領域とし、さらにその上流領域−１７３〜−
３５２ｂｐまでをＵ Ｐ Ｓ 領域として２つの単位に
分けて合成した。
ａ）ＤＳおよびＵＰＳ領域の化学合成
本発明はまず、酵母エノラーゼプロモーターの既知塩基
配列領域のプロモーター活性の意義を評価することから
始まる。
配列領域のプロモーター活性の意義を評価することから
始まる。
ＥＮＯ１プロモーターの既知塩基配列領域（ＤＳおよび
ＵＰＳ）は、天然の酵母より分離し、適当な制限酵素に
て各領域を断片化してクローニングし、それぞれのプロ
モーター活性の測定に供することができる。また、最近
の遺伝子工学技術の進歩に伴って、既知塩基配列に従っ
て化学合成したＤＮＡを用いることもできる。本発明の
場合、ＥＮＯ１プロモーターの既知塩基配列領域のプロ
モーター活性の意義評価も含まれるので、この様な場合
、とりわけ化学合成による方法が好ましい。
ＵＰＳ）は、天然の酵母より分離し、適当な制限酵素に
て各領域を断片化してクローニングし、それぞれのプロ
モーター活性の測定に供することができる。また、最近
の遺伝子工学技術の進歩に伴って、既知塩基配列に従っ
て化学合成したＤＮＡを用いることもできる。本発明の
場合、ＥＮＯ１プロモーターの既知塩基配列領域のプロ
モーター活性の意義評価も含まれるので、この様な場合
、とりわけ化学合成による方法が好ましい。
たとえば、ｉ）従来のクローニング法では、天然型のＤ
ＮＡＬか得られないのに対して、化学合成ＤＮＡ法では
、天然型はもちろんの事、目的に応じ、構造改変したＤ
ＮＡを設計することも容易であり、ｉｉ ）制限酵素認
識部位が存在しないような狭い領域の機能を解析したい
場合、人為的に、その領域の末端に制限酵素認識塩基配
列を付加して化学合成することより、その領域だけを容
易にクローニングしたり、または各領域を任意に結合さ
せたりすることが可能である。
ＮＡＬか得られないのに対して、化学合成ＤＮＡ法では
、天然型はもちろんの事、目的に応じ、構造改変したＤ
ＮＡを設計することも容易であり、ｉｉ ）制限酵素認
識部位が存在しないような狭い領域の機能を解析したい
場合、人為的に、その領域の末端に制限酵素認識塩基配
列を付加して化学合成することより、その領域だけを容
易にクローニングしたり、または各領域を任意に結合さ
せたりすることが可能である。
ＤＮＡの化学合成を行なうには、目的とする二本鎖ＤＮ
Ａ０両鎖において、これをいくつかのフラグメントに分
けて化学的に合成し、各々のフラグメントを結合させる
方法が用いられる。各フラグメントは、通常１０〜２０
塩基対から成り、向い合う各々が７〜１０塩基づつ重な
るように設計される。各フラグメントの合成法としては
、ジエステル法（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０３．６１４（１
９７９）） 、）ジエステル法（Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９
８．１０５６（１９７７）） 、固相法（Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、 ８ ＋５４９
１（１９８０））、液相法あるいは酵素法（Ｊ、Ｂｉｏ
ｌ、Ｃｈｅｍ、、」旦、 ２０１４（］ ９６６） ）
などを用いることができる。しかし、合成時間、収率、
精製などの点から同相トリエステル法が好適である。
Ａ０両鎖において、これをいくつかのフラグメントに分
けて化学的に合成し、各々のフラグメントを結合させる
方法が用いられる。各フラグメントは、通常１０〜２０
塩基対から成り、向い合う各々が７〜１０塩基づつ重な
るように設計される。各フラグメントの合成法としては
、ジエステル法（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０３．６１４（１
９７９）） 、）ジエステル法（Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９
８．１０５６（１９７７）） 、固相法（Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、 ８ ＋５４９
１（１９８０））、液相法あるいは酵素法（Ｊ、Ｂｉｏ
ｌ、Ｃｈｅｍ、、」旦、 ２０１４（］ ９６６） ）
などを用いることができる。しかし、合成時間、収率、
精製などの点から同相トリエステル法が好適である。
こうして合成されたオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡリガ
・−ゼにて順次、結合してゆくが、その際、合成フラグ
メントの５゛ −水酸基をリン酸化しておく必要がある
。このためには、ポリヌクレチオドキナーゼを用いるの
が、一般的であるが、化学的なリン酸化も可能である（
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ。
・−ゼにて順次、結合してゆくが、その際、合成フラグ
メントの５゛ −水酸基をリン酸化しておく必要がある
。このためには、ポリヌクレチオドキナーゼを用いるの
が、一般的であるが、化学的なリン酸化も可能である（
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ。
８．５７５３（１９８０））。
ｂ）ベクターへの連結およびクローニング上述のような
方法にて化学合成され、任意に組み合わせて連結された
ＤＳお・よびＵ Ｐ Ｓ 領域の合成ＤＮＡは、通常の
方法によって、適当なプラスミドに挿入し、一般に入手
可能な宿主細胞を形質転換して得られた形質転換株を選
別し、クローニングを確認する。
方法にて化学合成され、任意に組み合わせて連結された
ＤＳお・よびＵ Ｐ Ｓ 領域の合成ＤＮＡは、通常の
方法によって、適当なプラスミドに挿入し、一般に入手
可能な宿主細胞を形質転換して得られた形質転換株を選
別し、クローニングを確認する。
Ｃ）化学合成ＤＮＡを用いたより広範囲のプロモーター
領域の分離 酵母エノラーゼプロモーターの既知領域のみならず、よ
り広範囲のプロモーター領域から、プロモーター活性を
評価する目的で、既知塩基配列の一部または全部のＤＮ
Ａ断片をプローブとして酵母染色体ＤＮＡより、新たに
既知塩基配列を含み、さらに広範囲の領域を含むＤＮＡ
断片を得る。
領域の分離 酵母エノラーゼプロモーターの既知領域のみならず、よ
り広範囲のプロモーター領域から、プロモーター活性を
評価する目的で、既知塩基配列の一部または全部のＤＮ
Ａ断片をプローブとして酵母染色体ＤＮＡより、新たに
既知塩基配列を含み、さらに広範囲の領域を含むＤＮＡ
断片を得る。
クローニングの方法としては、酵母染色体ＤＮＡを適当
な制限酵素にて消化し、プラスミドベクターにショット
ガン・クローニングする。次に上記プローブを用いてコ
ロニー・ハイブリダイゼーション法（Ｇｒｕｎｓｔｅｉ
ｎ Ｍ、ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、ｓｃｉ、
ＵｓＡ。
な制限酵素にて消化し、プラスミドベクターにショット
ガン・クローニングする。次に上記プローブを用いてコ
ロニー・ハイブリダイゼーション法（Ｇｒｕｎｓｔｅｉ
ｎ Ｍ、ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、ｓｃｉ、
ＵｓＡ。
双、３９６Ｈ１９７５） ）により、目的とするＤＮＡ
断片を含むクローンを選別する。
断片を含むクローンを選別する。
ｄ）未知塩基配列の決定
方法Ｃ）によって得られた酵母エノラーゼプロモーター
の未知領域については、公知の方法であるマキサム−ギ
ルバート法（Ｍａｘａｍ、Ａ、Ｍ、＆ Ｇ１１ｂｅｒｔ
。
の未知領域については、公知の方法であるマキサム−ギ
ルバート法（Ｍａｘａｍ、Ａ、Ｍ、＆ Ｇ１１ｂｅｒｔ
。
Ｈ，、Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ
、 ７４．５６０（１９７７））あるいはＭ−１３グイ
デオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ、 Ｆ、 ら。
、 ７４．５６０（１９７７））あるいはＭ−１３グイ
デオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ、 Ｆ、 ら。
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＬＩＳＡ、
７４５４６３（１９７７）にて決定することができる。
７４５４６３（１９７７）にて決定することができる。
また、上述の方法ａ）、ｂ）中における合成あるいはク
ローニングＤＮＡ断片も同方法にて塩基配列を測定する
ことによって合成あるいはクローニングの６Ｉ ｉＨを
行うことができる。
ローニングＤＮＡ断片も同方法にて塩基配列を測定する
ことによって合成あるいはクローニングの６Ｉ ｉＨを
行うことができる。
ｅ）プロモーター活性の検索
作製された各種のＥＮＯ１プロモーターは、公知のプラ
スミドベクターｐＭＣ１４０３（Ｃａｓａｄａｂａｎ、
Ｍ、 らＪ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 １４３ 、９７１
（１９８０））およびｐＭＣ１５８７（Ｃａｓａｄａｂ
ａｎ＋Ｍ、 らＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ、ユ並。
スミドベクターｐＭＣ１４０３（Ｃａｓａｄａｂａｎ、
Ｍ、 らＪ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 １４３ 、９７１
（１９８０））およびｐＭＣ１５８７（Ｃａｓａｄａｂ
ａｎ＋Ｍ、 らＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ、ユ並。
２９３ （１９８３） ）にクローニングし、その挿入
部位の下流にコードされたβ−ガラクトシダーゼの酵素
活性を測定することにより、間接的にプロモーター活性
を知ることができる。これらのプラスミドベクターは、
プロモーター活性検索用ベクターとして知られており、
ｐＭＣ１５８７は、ｐＭＣ１４０３ニ２ μｍＤＮＡと
Ｌｅｕ ２遺伝子を組み入れたシャトルベクターである
。大腸菌にはｐＭＣ１４０３を、酵母にはｐＭＣ１５８
７をそれぞれ用いる。
部位の下流にコードされたβ−ガラクトシダーゼの酵素
活性を測定することにより、間接的にプロモーター活性
を知ることができる。これらのプラスミドベクターは、
プロモーター活性検索用ベクターとして知られており、
ｐＭＣ１５８７は、ｐＭＣ１４０３ニ２ μｍＤＮＡと
Ｌｅｕ ２遺伝子を組み入れたシャトルベクターである
。大腸菌にはｐＭＣ１４０３を、酵母にはｐＭＣ１５８
７をそれぞれ用いる。
ＥＮＯ１プロモーターをｐＭＣ１５８７にクローニング
する方法としては、ＥＮＯ１プロモーターを先にｐＭｃ
１４０３にクローニングし、２．ｌｊｍＤＮＡおよびＬ
ｅｕ ２遺伝子を含む領域をその後挿入する方法を用い
る。
する方法としては、ＥＮＯ１プロモーターを先にｐＭｃ
１４０３にクローニングし、２．ｌｊｍＤＮＡおよびＬ
ｅｕ ２遺伝子を含む領域をその後挿入する方法を用い
る。
β−ガラクトシダーゼの酵素活性を測定する方法として
、定性的には、この酵素の合成基質の１つであるＸ−ｇ
ａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−
Ｄ−ガラクトシド）を培地中に混合して、菌が産生ずる
β−ガラクトシダーゼにより分解されて生ずる５−ブロ
モ−４−クロロ−３−インディゴの青色呈色にて知る方
法（Ｍｉｌｌｅｒ。
、定性的には、この酵素の合成基質の１つであるＸ−ｇ
ａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−
Ｄ−ガラクトシド）を培地中に混合して、菌が産生ずる
β−ガラクトシダーゼにより分解されて生ずる５−ブロ
モ−４−クロロ−３−インディゴの青色呈色にて知る方
法（Ｍｉｌｌｅｒ。
Ｊ、 ” Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ″ Ｃｏｌ
ｄＳｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
、Ｃ，Ｓ、Ｈ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ 。
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ″ Ｃｏｌ
ｄＳｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
、Ｃ，Ｓ、Ｈ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ 。
１１９７２１）が用いられる。
また、定量的測定法としては、菌体を凍結融解し、ガラ
スピーズなどで破壊し、その細胞抽出液中に含まれるβ
−ガラクトシダーゼ活性を、Ｘ−ｇａ１同様、合成基質
の１つである０ＮＰＧ （オルト−ニトロフェニル−β
−Ｄ−ガラクトピラノシド）が分解されて生ずる黄色発
色度を吸光度４２０ｎｍとして測定する方法が用いられ
る。活性単位は、単位タンパク質（曙）が、単位時間（
分）当りに分解する０ＮＰＧのモル数で表わずこととす
る。（Ｒｏｓｅ、Ｍら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ
、ｓｃｉ、ＵｓＡ、 ７８ ．２４６０（１９８１））
。
スピーズなどで破壊し、その細胞抽出液中に含まれるβ
−ガラクトシダーゼ活性を、Ｘ−ｇａ１同様、合成基質
の１つである０ＮＰＧ （オルト−ニトロフェニル−β
−Ｄ−ガラクトピラノシド）が分解されて生ずる黄色発
色度を吸光度４２０ｎｍとして測定する方法が用いられ
る。活性単位は、単位タンパク質（曙）が、単位時間（
分）当りに分解する０ＮＰＧのモル数で表わずこととす
る。（Ｒｏｓｅ、Ｍら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ
、ｓｃｉ、ＵｓＡ、 ７８ ．２４６０（１９８１））
。
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、
本発明は、これらにより限定されるもではない。
本発明は、これらにより限定されるもではない。
ｌＪｕ 酵母エノラーゼプロモーターの化学合成
（１−１）ＤＳ領域の化学合成
ＥＮＯ１プロモーターのＤ Ｓ ｗｉ域は、第２図に示
したようにそれぞれ１１〜１９塩基の長さをもつ２２本
のＤＮＡオリゴマーとして分割し、それぞれのオリゴマ
ーは公知の固相トリエステル法によって合成した。
したようにそれぞれ１１〜１９塩基の長さをもつ２２本
のＤＮＡオリゴマーとして分割し、それぞれのオリゴマ
ーは公知の固相トリエステル法によって合成した。
合成したＤＮＡオリゴマーは、第５図に示した連結過程
に伴って結合した。まず、各ブロックを構成するオリゴ
マーを２ｐｇ （約４００ｐｍｏｌｅ ）相当量づつ混
合し、Ｔ４−ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液、総５°
−ＯＨのモル数の１゜５％相当量の（ｒ −”Ｐ ）
ＡＴＰ 、総５° −ＯＨの５０倍量のＡＴＰ。
に伴って結合した。まず、各ブロックを構成するオリゴ
マーを２ｐｇ （約４００ｐｍｏｌｅ ）相当量づつ混
合し、Ｔ４−ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液、総５°
−ＯＨのモル数の１゜５％相当量の（ｒ −”Ｐ ）
ＡＴＰ 、総５° −ＯＨの５０倍量のＡＴＰ。
総５ ’ −ＯＨ１０００１０００ｐに対し、１ユニ
ツトのＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造）を加
え、反応容量を５０μｌとして３７℃、６０分間反応さ
せた。フェノール抽出、エーテル抽出の後、２．５容量
のエタノールでＤＮＡを沈澱させた。ＤＮＡを再度、Ｔ
４− ＤＮＡリガーゼ緩衝液に溶解し、５’−０Ｈ１ｐ
ｍｏｌｅに対し、０．２１ユニツトの７４− ＤＮＡリ
ガーゼにフボンジーン）を加え、反応容量１００μｌと
して、１］’Ｃ１１５時間反応させた。フェノール抽出
、エーテル抽出の後、２゜５容量のエタノールでＤＮＡ
を沈澱させた。各連結反応物は、８．３Ｍ尿素を含む１
５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、ｆ
ｆ２ｐによるオートラジオグラフィーで、その反応成績
を確認し、最終目的鎖長のＤＮＡの生成も同様にして確
認した（ここで生成されたものをＤＳ−１−１と略す）
。
ツトのＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造）を加
え、反応容量を５０μｌとして３７℃、６０分間反応さ
せた。フェノール抽出、エーテル抽出の後、２．５容量
のエタノールでＤＮＡを沈澱させた。ＤＮＡを再度、Ｔ
４− ＤＮＡリガーゼ緩衝液に溶解し、５’−０Ｈ１ｐ
ｍｏｌｅに対し、０．２１ユニツトの７４− ＤＮＡリ
ガーゼにフボンジーン）を加え、反応容量１００μｌと
して、１］’Ｃ１１５時間反応させた。フェノール抽出
、エーテル抽出の後、２゜５容量のエタノールでＤＮＡ
を沈澱させた。各連結反応物は、８．３Ｍ尿素を含む１
５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、ｆ
ｆ２ｐによるオートラジオグラフィーで、その反応成績
を確認し、最終目的鎖長のＤＮＡの生成も同様にして確
認した（ここで生成されたものをＤＳ−１−１と略す）
。
上述と同様な方法にて、Ｄ Ｓ ｔ＋Ｉ域については、
１）翻訳開始コドンＡＴＧのすぐ上流に制限酵素Ｃ１ａ
Ｉの認識配列を設け、この部位を介して、構造遺伝
子の直接発現を可能にしたもの（第３図、以下ＤＳ−ｎ
と略す）。
１）翻訳開始コドンＡＴＧのすぐ上流に制限酵素Ｃ１ａ
Ｉの認識配列を設け、この部位を介して、構造遺伝
子の直接発現を可能にしたもの（第３図、以下ＤＳ−ｎ
と略す）。
２）１）と同様の目的で設計され制限酵素Ｃ１ａ ｒ
の認識配列部位のすぐ上流の２塩基を欠失させたもの（
第４図、以下ＤＳ−１［Ｉと略す）。
の認識配列部位のすぐ上流の２塩基を欠失させたもの（
第４図、以下ＤＳ−１［Ｉと略す）。
３ ） ＣＴ ｒｉｃｈな領域が天然よりも３４塩基長
くなったもの（第７図、以下ＤＳ−Ｉ−２と略す）４
） ＣＴ ｒｉｃｈな領域が天然よりも３２塩基長くな
り、長くなったＣＴ ｒｉｃｈ領域の３ケ所にＣ−Ｔ変
異が起こり、さらにＣＴ ｒｉｃｈな領域の５″末端（
オリゴマ一番号９の５゛末端）のＴＡが欠失したもの（
第８図、以下Ｄ５−Ｉ−３と略す）。
くなったもの（第７図、以下ＤＳ−Ｉ−２と略す）４
） ＣＴ ｒｉｃｈな領域が天然よりも３２塩基長くな
り、長くなったＣＴ ｒｉｃｈ領域の３ケ所にＣ−Ｔ変
異が起こり、さらにＣＴ ｒｉｃｈな領域の５″末端（
オリゴマ一番号９の５゛末端）のＴＡが欠失したもの（
第８図、以下Ｄ５−Ｉ−３と略す）。
の計５種類のＤ Ｓ Ｎ域が合成された。ただし、３）
、４）のＣＴ ｒｉｃｈな領域の長くなったＯ５−１−
２．Ｏ３−■−３は、化学合成したＤＮＡオリゴマーを
第６図に示された連結過程により行ない、さらに用いる
オリゴマーのモル比を変えることで合成された。
、４）のＣＴ ｒｉｃｈな領域の長くなったＯ５−１−
２．Ｏ３−■−３は、化学合成したＤＮＡオリゴマーを
第６図に示された連結過程により行ない、さらに用いる
オリゴマーのモル比を変えることで合成された。
（１−２）ＵＰＳ領域の化学合成
ＥＮＯ１７”Ｏモー９−ノＵＰＳ’ｉｉｌ域は、第９図
に示したようにそれぞれ１１〜１９塩基の長さをもつ２
２本のＤＮＡオリゴマーとして分割し、それぞれのオリ
ゴマー合成、さらに連結反応はＤｓｌ￥域と同様第５図
の方法に従って合成した。
に示したようにそれぞれ１１〜１９塩基の長さをもつ２
２本のＤＮＡオリゴマーとして分割し、それぞれのオリ
ゴマー合成、さらに連結反応はＤｓｌ￥域と同様第５図
の方法に従って合成した。
！ＪＬＩＩ ベクターへの連結およびクローニング（
２−１）実施例１で得た連結反応生成物（ＤＳ−１−１
）をプラスミドベクターｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩおよ
びＢａｍＨＩ部位に挿入連結して、Ｅ、ｃｏｌｉ Ｃ−
６００株を形質転換した。
２−１）実施例１で得た連結反応生成物（ＤＳ−１−１
）をプラスミドベクターｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩおよ
びＢａｍＨＩ部位に挿入連結して、Ｅ、ｃｏｌｉ Ｃ−
６００株を形質転換した。
連結反応は、０．２μｇ担当の制限酵素で処理したｐＢ
Ｒ３２２と実施例１に示した連結反応生成物に、４ユニ
ツトの７４−ＤＮＡリガーゼを加え、反応容量が５０μ
βになるように、Ｔａ ＤＮＡリガーゼ緩衝液を加え
、１１℃で１５時間反応させた。
Ｒ３２２と実施例１に示した連結反応生成物に、４ユニ
ツトの７４−ＤＮＡリガーゼを加え、反応容量が５０μ
βになるように、Ｔａ ＤＮＡリガーゼ緩衝液を加え
、１１℃で１５時間反応させた。
形質転換は常法に従い、すなわち、塩化カルシウム処理
して得られた菌液０．２ｍｌに連結反応液０．１ｍ１を
混合して行なった。アンピシリン耐性でテトラサイタリ
ン怒受性の形質転換株について、常法に従いプラスミド
ＤＮＡを調製し、制限酵素切断により、挿入ＤＮＡ断片
の大きさを８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で確認
した。さらに、この挿入ＤＮＡ断片についてＭａｘａｍ
−Ｇｉｌｂｅｒｔ法あるいはＭ−１３ダイデオキシ法で
塩基配列を決定した。
して得られた菌液０．２ｍｌに連結反応液０．１ｍ１を
混合して行なった。アンピシリン耐性でテトラサイタリ
ン怒受性の形質転換株について、常法に従いプラスミド
ＤＮＡを調製し、制限酵素切断により、挿入ＤＮＡ断片
の大きさを８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で確認
した。さらに、この挿入ＤＮＡ断片についてＭａｘａｍ
−Ｇｉｌｂｅｒｔ法あるいはＭ−１３ダイデオキシ法で
塩基配列を決定した。
上記方法にて実施例Ｉで得たＥＮＯ１プロモーターの各
領域をｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨ１部位
に挿入することによって各プロモーター領域を含んだｐ
ＢＲ３２２〜ＥＮＯ１０Ｓ−Ｔ ７．ｌ、 ｐＢＲ３２
２−ＥＮＯｌｏＳ−Ｔ −２。
領域をｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨ１部位
に挿入することによって各プロモーター領域を含んだｐ
ＢＲ３２２〜ＥＮＯ１０Ｓ−Ｔ ７．ｌ、 ｐＢＲ３２
２−ＥＮＯｌｏＳ−Ｔ −２。
ｐＢＲ３２２−ＥＮＯｌｏＳ−Ｔ−３，ρＢＲ３２２−
ＥＮＯ／ＤＳ−Ｕ 、 ｐＢＲ３２２−ＥＮＯｌｏＳ−
ＩＩ［およびｐＢＲ３２２−ＥＮＯ／ＵＰＳの計６種類
のプラスミドを得た。
ＥＮＯ／ＤＳ−Ｕ 、 ｐＢＲ３２２−ＥＮＯｌｏＳ−
ＩＩ［およびｐＢＲ３２２−ＥＮＯ／ＵＰＳの計６種類
のプラスミドを得た。
（２−２）次にクローニングされたＤＳ領域をｐＢＲ３
２２−ＥＮＯ１０５−Ｉ−１よりＥｃｏＲＩおよびＢａ
ｍＨＩで消化して、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で
分離し、ゲルから抽出しで、回収した。そして、プロモ
ーター活性検索用ベクターｐＭｃ１４０３へのＤＳ−Ｌ
ｌｆＩＩ域の挿入は第１０図に従ってＥｏＲＩおよびＢ
ａｍ１ｌ［部位に挿入連結した。すなわち、０．２μｇ
のｐＭＣ１４０３制限酵素処理液、０，５μｇ相当のＤ
Ｓ、ＤＮＡ断片、さらにＴ４−ＤＮＡリガーゼ２ユニツ
トを２０μｌ中に含むようにＴ、−ＤＮＡリガーゼ緩衝
液を加え、１１℃で１５時間反応させた。
２２−ＥＮＯ１０５−Ｉ−１よりＥｃｏＲＩおよびＢａ
ｍＨＩで消化して、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で
分離し、ゲルから抽出しで、回収した。そして、プロモ
ーター活性検索用ベクターｐＭｃ１４０３へのＤＳ−Ｌ
ｌｆＩＩ域の挿入は第１０図に従ってＥｏＲＩおよびＢ
ａｍ１ｌ［部位に挿入連結した。すなわち、０．２μｇ
のｐＭＣ１４０３制限酵素処理液、０，５μｇ相当のＤ
Ｓ、ＤＮＡ断片、さらにＴ４−ＤＮＡリガーゼ２ユニツ
トを２０μｌ中に含むようにＴ、−ＤＮＡリガーゼ緩衝
液を加え、１１℃で１５時間反応させた。
形質転換には、Ｉａｃオペロン欠損株として知られてい
るＭＣ１０６１株〔△１ａｃ（ＩＰＯ２ＹＡ） Ｘ７４
．ｇａｌ Ｕ。
るＭＣ１０６１株〔△１ａｃ（ＩＰＯ２ＹＡ） Ｘ７４
．ｇａｌ Ｕ。
ｇａｌ Ｋ＋５ｔｒＡ’ 、 ｈｓｄＲ−、△（ａｖａ
、１ｅｕ） ） （Ｍ。
、１ｅｕ） ） （Ｍ。
Ｃａ５ａｄａｂａｎ ら、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、 １
３８ 、１７９ （１９８０） ）を宿主として用い
、常法に従って、塩化カルシウム処理したＭＣ］０６１
０．２ｍｌに０．１ｍｌの連結反応液を加え、Ｘ−ｇ
ａｌ（２％ジメチルホルムアミド溶液）をトップ・アガ
ーに混ぜて播いた。アンピシリン耐性でＸ−ｇａｌを分
解して青色を呈するコロニーについて、常法に従って、
プラスミドＤＮＡを調製し制限酵素処理によりクローニ
ングを確認した。
３８ 、１７９ （１９８０） ）を宿主として用い
、常法に従って、塩化カルシウム処理したＭＣ］０６１
０．２ｍｌに０．１ｍｌの連結反応液を加え、Ｘ−ｇ
ａｌ（２％ジメチルホルムアミド溶液）をトップ・アガ
ーに混ぜて播いた。アンピシリン耐性でＸ−ｇａｌを分
解して青色を呈するコロニーについて、常法に従って、
プラスミドＤＮＡを調製し制限酵素処理によりクローニ
ングを確認した。
上記方法にてＥＮｏ １プロモーターのＤ Ｓ ？＋Ｉ
域を有したプロモーター活性検索用ベクター ｐＭｃ１
４０３− ＥＮＯｌｏＳ −ｒ −１，ｐＭｃ１４０３
−ＥＮＯｌｏＳ −Ｉ −２，ｐＭｃ１４０３−１ｉＮ
ｏ１０５−１−３． ｐＭｃ１４０３−ＥＮＯｌｏＳ
、、 ＩＩおよびｐＭｃ１４０３− ＥＮＯｌｏＳ −
ｍが得られた。
域を有したプロモーター活性検索用ベクター ｐＭｃ１
４０３− ＥＮＯｌｏＳ −ｒ −１，ｐＭｃ１４０３
−ＥＮＯｌｏＳ −Ｉ −２，ｐＭｃ１４０３−１ｉＮ
ｏ１０５−１−３． ｐＭｃ１４０３−ＥＮＯｌｏＳ
、、 ＩＩおよびｐＭｃ１４０３− ＥＮＯｌｏＳ −
ｍが得られた。
天産±３ ＵＰＳとＤＳの連結とクローニングＵＰＳ
とＤＳの連結は第１１図の手順に従って行なった。まず
、実施例２ （２−１）にて得られた１ｅｕｇの ｐＢ
Ｒ３２２−ＥＮＯ／ＵＰＳを２５ユニツトのＥｃｏＲＩ
および２５ユ−ットの５ａｎ３八で３７℃、２時間２重
消化した。一方、１ｅｕｇのｐＢＲ３２２−ＥＮＯｌｏ
Ｓ−１−１を２５ユ−−−／トの５ａｎ３＾で３７℃、
２時間消化した。それぞれ５％ポリアクリルアミドゲル
電気泳動で挿入ＤＮＡ断片を分離し、抽出回収した。２
０μｌのＴ、−ＤＮＡリーゼ緩衝液に、得られたＤＮＡ
断片を溶解し、２ユニツトのＴ、 −ＤＮＡ リガーゼ
を加えて、１１℃、１５時間反応させた。連結反応物を
０．２μｇのｐＭｃ１４０３ ＥｃｏＲＩおよびＲａｍ
旧消化ＤＮＡと連結させ、Ｅ、ｃｏｌｉ、ＭＣ１０６１
株を形質転換した。アンピシリン耐性でＸ−ｇａｌを分
解して青色を呈する形質転換株からＵＰＳとＤＳ−１−
１の連結したＤＮＡをクローン化した９ＭＣ１４０３の
存在を確認し、このプラスミドを９ＭＣ１４０３−ＥＮ
Ｏ／１ｌＰＳ −＋−Ｄｓ−ｒ−１と命名した。
とＤＳの連結は第１１図の手順に従って行なった。まず
、実施例２ （２−１）にて得られた１ｅｕｇの ｐＢ
Ｒ３２２−ＥＮＯ／ＵＰＳを２５ユニツトのＥｃｏＲＩ
および２５ユ−ットの５ａｎ３八で３７℃、２時間２重
消化した。一方、１ｅｕｇのｐＢＲ３２２−ＥＮＯｌｏ
Ｓ−１−１を２５ユ−−−／トの５ａｎ３＾で３７℃、
２時間消化した。それぞれ５％ポリアクリルアミドゲル
電気泳動で挿入ＤＮＡ断片を分離し、抽出回収した。２
０μｌのＴ、−ＤＮＡリーゼ緩衝液に、得られたＤＮＡ
断片を溶解し、２ユニツトのＴ、 −ＤＮＡ リガーゼ
を加えて、１１℃、１５時間反応させた。連結反応物を
０．２μｇのｐＭｃ１４０３ ＥｃｏＲＩおよびＲａｍ
旧消化ＤＮＡと連結させ、Ｅ、ｃｏｌｉ、ＭＣ１０６１
株を形質転換した。アンピシリン耐性でＸ−ｇａｌを分
解して青色を呈する形質転換株からＵＰＳとＤＳ−１−
１の連結したＤＮＡをクローン化した９ＭＣ１４０３の
存在を確認し、このプラスミドを９ＭＣ１４０３−ＥＮ
Ｏ／１ｌＰＳ −＋−Ｄｓ−ｒ−１と命名した。
上記方法により、それぞれのＤＳｊｌ域とＵＰＳを連結
させｐＭ（：１４０３−ＥＮＯ／ｌｌＰ、ｓ ＋ Ｏ３
−１−２，９ＭＣ１４０３−ＥＮＯ／ＩＪＰＳ ＋Ｏ５
−１−３． ｐＭｃ１４０３−ＥＮＯ／ＵＰＳ ＋Ｏ５
−Ｈの計４種類のプラスミドを得た。
させｐＭ（：１４０３−ＥＮＯ／ｌｌＰ、ｓ ＋ Ｏ３
−１−２，９ＭＣ１４０３−ＥＮＯ／ＩＪＰＳ ＋Ｏ５
−１−３． ｐＭｃ１４０３−ＥＮＯ／ＵＰＳ ＋Ｏ５
−Ｈの計４種類のプラスミドを得た。
尖旅■↓ 酵母用プラスミドへのクローニング酵母用プ
ラスミドへの酵母エノラーゼプロモーターのクローニン
グは第１２図に従って行なった。
ラスミドへの酵母エノラーゼプロモーターのクローニン
グは第１２図に従って行なった。
すなわち、反応容量５０μｌでｐｌ’１ｃ１５８７３μ
ｇを７．５ユニツトのＥｃｏＲＩで３７℃、１５分間反
応させることにより部分分解し、２μｒｎ ＤＮＡおよ
びＬｅｕ２遺伝子を含む領域（約６Ｋｂ）のＤＮＡを得
ることができた。これらの部分分解物は、０．８％アガ
ロースゲル電気泳動により分離し、約６Ｋｂに相当する
ＤＮＡを切り出し、公知の方法（Ｄｃｄｏｎｅｌｌ＋Ｍ
、Ｗ。
ｇを７．５ユニツトのＥｃｏＲＩで３７℃、１５分間反
応させることにより部分分解し、２μｒｎ ＤＮＡおよ
びＬｅｕ２遺伝子を含む領域（約６Ｋｂ）のＤＮＡを得
ることができた。これらの部分分解物は、０．８％アガ
ロースゲル電気泳動により分離し、約６Ｋｂに相当する
ＤＮＡを切り出し、公知の方法（Ｄｃｄｏｎｅｌｌ＋Ｍ
、Ｗ。
らＪ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ＋旦し、 １１９（１，９７７
））により透析チューブ内に電気泳動的に溶出、回収し
た。
））により透析チューブ内に電気泳動的に溶出、回収し
た。
ＥＮＯ１プロモーターを種々組み入れたｐＭｃ１４０３
０．０５μｇに対し、０．５μｇ相当の６にｂ断片を加
え２ユニツトのＴ、−ＤＮＡリガーゼで２ｅｕ１反応液
中で１１℃、１５時間反応させた。
０．０５μｇに対し、０．５μｇ相当の６にｂ断片を加
え２ユニツトのＴ、−ＤＮＡリガーゼで２ｅｕ１反応液
中で１１℃、１５時間反応させた。
Ｅ、ｃｏｌｉ Ｃ６００株を常法で形質転換し、アンピ
シリン耐性菌をスレオニン（５０μｇ／ｍｌ＞、チアミ
ン（１μｇ／ｌ１１１）、グルコース（０，１％）を補
ったＭ−９培地（旧１１ｅｒ＋Ｊ、＋ ” Ｅｘｐｅｒ
ｉｍｅｎｔｓ ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ ” ＋４３１．−４３３ Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ（１９７２） ）に滅菌した“つまようじ”で植え
換えて、ロイシン産生株を得た。
シリン耐性菌をスレオニン（５０μｇ／ｍｌ＞、チアミ
ン（１μｇ／ｌ１１１）、グルコース（０，１％）を補
ったＭ−９培地（旧１１ｅｒ＋Ｊ、＋ ” Ｅｘｐｅｒ
ｉｍｅｎｔｓ ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ ” ＋４３１．−４３３ Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ（１９７２） ）に滅菌した“つまようじ”で植え
換えて、ロイシン産生株を得た。
アンピシリン耐性ロイシン産生株について常法に従って
、プラスミドＤＮＡを調製し、制限酵素処理により、ク
ローニングを確認した。
、プラスミドＤＮＡを調製し、制限酵素処理により、ク
ローニングを確認した。
その結果、ｐＭｃ１５８７−ＢＮＯｌｏＳ−１−１，ｐ
Ｍｃ１５８７−ＢＮＯｌｏＳ−１−２，ｐＭｃ１５８７
−ＢＮＯｌｏＳ−Ｉ−３，ｐＭｃ１５８７−ｔ！Ｎｏ１
０ＳＩＩ 、 ｐＭｃ１５８７−ＢＮＯｌｏＳ ■
、 ｐＭｃ１５８７−ＥＮＯ／ＵＰＳ ＋ＤＳ、Ｉ
−１およびｐＭｃ１５８７−ＥＮＯ／ＵＰＳ ＋ＤＳ
−ＩＩＩを得た。
Ｍｃ１５８７−ＢＮＯｌｏＳ−１−２，ｐＭｃ１５８７
−ＢＮＯｌｏＳ−Ｉ−３，ｐＭｃ１５８７−ｔ！Ｎｏ１
０ＳＩＩ 、 ｐＭｃ１５８７−ＢＮＯｌｏＳ ■
、 ｐＭｃ１５８７−ＥＮＯ／ＵＰＳ ＋ＤＳ、Ｉ
−１およびｐＭｃ１５８７−ＥＮＯ／ＵＰＳ ＋ＤＳ
−ＩＩＩを得た。
（以上のプロモーターを総称してｐＭｃ１５８７／ＥＮ
Ｏと呼ぶ。） 男」Ｅ四擾−ｐＭｃ１５８７／ＥＮＯの酵母への導入Ｅ
、ｃｏｌｉ Ｃ６００株に導入し、クローン化された各
ｐＭｃ１５８７／ＥＮＯを酵母Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ ＡＨ２２Ｃａ１ｅｕ ２−３．Ｉｅｕ ２−１１２
．ｈｉｓ４．ｃａｎｌ ）に公知の方法（たとえば、旧
ｎｎｅｎ＋へ、ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ
ｃｉ、ＵＳＡ７５．１９２９（１９７８））で導入した
。培地としては、ロイシン以外のアミノ酸（２０ｍｌ／
ｌ ： Ｌ−Ｔｒｐ＋Ｌ−Ｈｉｓ＋Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−
Ｍｅｔ、 ３０ ■／ Ｉｔ ： Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−１
１ｅ、Ｌ−Ｌｙｓ。
Ｏと呼ぶ。） 男」Ｅ四擾−ｐＭｃ１５８７／ＥＮＯの酵母への導入Ｅ
、ｃｏｌｉ Ｃ６００株に導入し、クローン化された各
ｐＭｃ１５８７／ＥＮＯを酵母Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ ＡＨ２２Ｃａ１ｅｕ ２−３．Ｉｅｕ ２−１１２
．ｈｉｓ４．ｃａｎｌ ）に公知の方法（たとえば、旧
ｎｎｅｎ＋へ、ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ
ｃｉ、ＵＳＡ７５．１９２９（１９７８））で導入した
。培地としては、ロイシン以外のアミノ酸（２０ｍｌ／
ｌ ： Ｌ−Ｔｒｐ＋Ｌ−Ｈｉｓ＋Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−
Ｍｅｔ、 ３０ ■／ Ｉｔ ： Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−１
１ｅ、Ｌ−Ｌｙｓ。
５０ ［／ ｊ！ ： Ｌ−Ｐｈｅ、 １ｏｏｆＩｆ
／ ｌ ：Ｌ−Ｇｌｕ、Ｌ−＾ｐｓ。
／ ｌ ：Ｌ−Ｇｌｕ、Ｌ−＾ｐｓ。
１５０ａＮ／ １ ： ＬＪａｌ、 ２００ｗ／ ｅ
： Ｌ−Ｔｈｒ、 ３７５Ｎ／ｌｌ： Ｌ−３ｅｒ）お
よび２０ｅｇ／ ｇのＡｄｅｎｉｎｅ ５ｕｌｆａｔｅ
およびＵｒａｃｉｌを含むＳＤ培地を用いた。
： Ｌ−Ｔｈｒ、 ３７５Ｎ／ｌｌ： Ｌ−３ｅｒ）お
よび２０ｅｇ／ ｇのＡｄｅｎｉｎｅ ５ｕｌｆａｔｅ
およびＵｒａｃｉｌを含むＳＤ培地を用いた。
、！Ｊｕｌｉ Ｘ−ｇａｌによる定性的評価既知塩基配
列をもとに再構築したｆ！Ｎｏ １プロモーターにより
産生されるβ−ガラクトシダーゼの活性を定性的に評価
するためにＸ−ｇａｌを含むｐＨ７，０のＳＤプレート
に、ｐＭｃ１５８７／ＥＮＯを導入したＡＨ２２株を移
しかえて、青色への呈色度を評価したがいずれのプロモ
ーターを保有した株も、はとんど呈色しなかった。そこ
で、菌体をニトロセルロース・フィルター上に移し、凍
結融解して細胞を壊した後、同様の系で測定すると、わ
ずかに青色を呈した。そして、その呈色度は、ＵＰＳを
連結したプロモーターの方がやや高かった。すなわち既
知塩基配列をもとに再構築した数種のＥＮＯ１プロモー
ターは、酵母内でプロモーターとして機能するが、その
活性は弱いものであった。
列をもとに再構築したｆ！Ｎｏ １プロモーターにより
産生されるβ−ガラクトシダーゼの活性を定性的に評価
するためにＸ−ｇａｌを含むｐＨ７，０のＳＤプレート
に、ｐＭｃ１５８７／ＥＮＯを導入したＡＨ２２株を移
しかえて、青色への呈色度を評価したがいずれのプロモ
ーターを保有した株も、はとんど呈色しなかった。そこ
で、菌体をニトロセルロース・フィルター上に移し、凍
結融解して細胞を壊した後、同様の系で測定すると、わ
ずかに青色を呈した。そして、その呈色度は、ＵＰＳを
連結したプロモーターの方がやや高かった。すなわち既
知塩基配列をもとに再構築した数種のＥＮＯ１プロモー
ターは、酵母内でプロモーターとして機能するが、その
活性は弱いものであった。
去隻斑１ 未知塩基配列領域を含むＥＮＯ１プロモータ
ーのクローニング Ｈｏ１ｌａｎｄらの報告（Ｈｏｌｌａｎｄ、 Ｍ、Ｊ、
ら、Ｊ、Ｂｔｏｌ。
ーのクローニング Ｈｏ１ｌａｎｄらの報告（Ｈｏｌｌａｎｄ、 Ｍ、Ｊ、
ら、Ｊ、Ｂｔｏｌ。
Ｃｈｅｗ、、 ２５６ 、１３８５（１９８１） ）
によれば、酵母染色体を制限酵素ＥｃｏＲＩで処理して
得られる約１．６ｋｂＤＮＡ断片が、ＥＮＯ１遺伝子の
構造遺伝子の一部と、その上流にある５″ 非翻訳領域
の約７２０ｂｐをカバーすることが知られている。そこ
で、先にクローニングされている既知塩基配列をもとに
合成されたＥＮＯ／ＵＰＳ ＋Ｏ５−１−］をプローブ
として、公知のコロニー・ハイブリダイゼーション法（
Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ、Ｍ、ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ
ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ＾、Ｈ＋３９６１ （１９７５）
）により約１．６ ＫｂのＥｃｏＲＩ断片をクローニ
ングした。
によれば、酵母染色体を制限酵素ＥｃｏＲＩで処理して
得られる約１．６ｋｂＤＮＡ断片が、ＥＮＯ１遺伝子の
構造遺伝子の一部と、その上流にある５″ 非翻訳領域
の約７２０ｂｐをカバーすることが知られている。そこ
で、先にクローニングされている既知塩基配列をもとに
合成されたＥＮＯ／ＵＰＳ ＋Ｏ５−１−］をプローブ
として、公知のコロニー・ハイブリダイゼーション法（
Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ、Ｍ、ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ
ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ＾、Ｈ＋３９６１ （１９７５）
）により約１．６ ＫｂのＥｃｏＲＩ断片をクローニ
ングした。
すなわち、Ｓ、ｃｅｒｅｖｔｓｉａｅ ＡＨ２２株を５
００ ｍｌのＹＰＤ培地（１％イーストエキス、２％ポ
リペプトン、２％グルコース）で３０℃で一晩振とう培
養し、得られた菌株をＣｒｅｙらの方法（Ｍｅｔｈｏｄ
ｉｎ Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ。
００ ｍｌのＹＰＤ培地（１％イーストエキス、２％ポ
リペプトン、２％グルコース）で３０℃で一晩振とう培
養し、得られた菌株をＣｒｅｙらの方法（Ｍｅｔｈｏｄ
ｉｎ Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ。
川、３９（１９７５））によって、総ＤＮＡを分離した
。
。
このＤＮＡ１５０ 、ｕｇを４５０ユニツトのＥｃｏＲ
Ｉで３７℃、２時間処理することにより切断した。反応
後、１．５％アガロースゲル電気泳動により分離し、１
．６Ｋｂに相当するバンドの周辺を切り出す。公知の方
法（Ｄｃｄｏｎｅｌｌ、Ｍ、Ｗ、 ら、Ｊ、Ｍｏ１．
Ｂｉｏｌ、 １１０．１１９（１９７７） ）により、
透析チューブ内にＤＮＡを溶出、回収した。回収した１
、６Ｋｂ前後の［！ｃｏｌｌＩ断片を、公知のプラスミ
ド・ベクターｐＡＣＹＣ１８４のＥｃｏＲ１部位に挿入
連結し、Ｅ、ｃｏｌｉ、Ｃ−６００株を形質転換した。
Ｉで３７℃、２時間処理することにより切断した。反応
後、１．５％アガロースゲル電気泳動により分離し、１
．６Ｋｂに相当するバンドの周辺を切り出す。公知の方
法（Ｄｃｄｏｎｅｌｌ、Ｍ、Ｗ、 ら、Ｊ、Ｍｏ１．
Ｂｉｏｌ、 １１０．１１９（１９７７） ）により、
透析チューブ内にＤＮＡを溶出、回収した。回収した１
、６Ｋｂ前後の［！ｃｏｌｌＩ断片を、公知のプラスミ
ド・ベクターｐＡＣＹＣ１８４のＥｃｏＲ１部位に挿入
連結し、Ｅ、ｃｏｌｉ、Ｃ−６００株を形質転換した。
テトラサイクリン耐性でカナマイシン惑受性の形質転換
株３６００株について、ｆｆＺｐで放射性標識した３６
６ｂρのＵＰＳ ＋ｏＳ −■−１でコロニーハイブリ
ダイゼーションを行ない、２株の陽性クローンを得た。
株３６００株について、ｆｆＺｐで放射性標識した３６
６ｂρのＵＰＳ ＋ｏＳ −■−１でコロニーハイブリ
ダイゼーションを行ない、２株の陽性クローンを得た。
この２株について、常法に従いプラスミドＤＮＡを調製
し、制限酵素地図を作製し、既報のパターンと比較し、
目的のＤＮＡをクローニングしてｐＡＣＹＣ１８４−Ｅ
ＮＯ６２を得た。
し、制限酵素地図を作製し、既報のパターンと比較し、
目的のＤＮＡをクローニングしてｐＡＣＹＣ１８４−Ｅ
ＮＯ６２を得た。
叉ＩＬＬ長鎖合成プロモーターの作製
長鎖合成プロモーターの作製は第１３図に示した方法に
よって行なった。すなわち、実施例７で得たｐＡＣＹＣ
１，８４−ＥＮＯ６２は、ＥＮＯ１構造遺伝子の一部と
、その上流に約７２０ ｂｐの非翻訳領域をカバーする
ＤＮＡを組み入れられたもである。
よって行なった。すなわち、実施例７で得たｐＡＣＹＣ
１，８４−ＥＮＯ６２は、ＥＮＯ１構造遺伝子の一部と
、その上流に約７２０ ｂｐの非翻訳領域をカバーする
ＤＮＡを組み入れられたもである。
そして、この約７２０ ｂｐの５°非翻訳領域は、３５
２ｂｐの既知塩基配列領域の５°末端の上流に約３７０
ｂｐの未知塩基配列を保有している。そこで、この未
知塩基配列領域を、既知塩基配列領域の上流に連結する
ため、クローニングした約１．６ ＫｂのＥｃｏＲＩＤ
ＮＡ断片を制限酵素旧ｎｆ Ｉにて消化し、ＵＰＳ領域
に１ケ所存在する制限酵素旧ｎｆ １部位を介して連結
し、長鎖合成プロモーターを作成した。
２ｂｐの既知塩基配列領域の５°末端の上流に約３７０
ｂｐの未知塩基配列を保有している。そこで、この未
知塩基配列領域を、既知塩基配列領域の上流に連結する
ため、クローニングした約１．６ ＫｂのＥｃｏＲＩＤ
ＮＡ断片を制限酵素旧ｎｆ Ｉにて消化し、ＵＰＳ領域
に１ケ所存在する制限酵素旧ｎｆ １部位を介して連結
し、長鎖合成プロモーターを作成した。
以下、天然由来のＥＮＯ１プロモーターのＨｉｎｆ Ｉ
より５′上流側のＤＮＡ断片をＵＡＳと略す。
より５′上流側のＤＮＡ断片をＵＡＳと略す。
ｐＡＣＹＣ１８４−ＥＮＯ６２１０μｇを、２５ユニツ
トのＥｃｏＲＩで３７℃、２時間消化し、１％アガロー
スゲル電気泳動で、約１．６ ＫｂのＤＮＡ断片を分離
精製した。得られた１、６ＫｂのＤＮＡ断片２μｇを、
４ユニツトのＨｉｎｆ Ｉで３７℃、２時間消化し、５
％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、３本生ず
るＤＮＡ断片のうち、約０．５ Ｋｂの大きさをもつＵ
ＡＳ断片を切り出し、ＤＮＡを回収した。
トのＥｃｏＲＩで３７℃、２時間消化し、１％アガロー
スゲル電気泳動で、約１．６ ＫｂのＤＮＡ断片を分離
精製した。得られた１、６ＫｂのＤＮＡ断片２μｇを、
４ユニツトのＨｉｎｆ Ｉで３７℃、２時間消化し、５
％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、３本生ず
るＤＮＡ断片のうち、約０．５ Ｋｂの大きさをもつＵ
ＡＳ断片を切り出し、ＤＮＡを回収した。
一方、ｐＭｃ１４０３−ＥＮＯ／ＵＰＳ ＋ Ｏ３−Ｉ
−１２０μｇを、２５ユニツトのＥｃｏＲＩおよび３０
ユニツトのＢａｍＨＩで３７℃、２時間、２重消化し、
５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、２本生
ずるＤＮＡ断片のうち、大きい方の断片を回収した。
−１２０μｇを、２５ユニツトのＥｃｏＲＩおよび３０
ユニツトのＢａｍＨＩで３７℃、２時間、２重消化し、
５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、２本生
ずるＤＮＡ断片のうち、大きい方の断片を回収した。
このようにして得られた２種のＤＮＡ断片を反応容量２
０μｌでＴ、−ＤＮＡリガーゼにより連結反応を行ない
、約７２０ｂｐを含む長鎖合成プロモーターを得た。こ
の長鎖合成プロモーターは、第１１図と同様の方法にて
プラスミドｐＭｃ１４０３のＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩ部
位に挿入し、前述のＥ、ｃｏｌｉ ＭＣ１０６１株を形
質転換した。
０μｌでＴ、−ＤＮＡリガーゼにより連結反応を行ない
、約７２０ｂｐを含む長鎖合成プロモーターを得た。こ
の長鎖合成プロモーターは、第１１図と同様の方法にて
プラスミドｐＭｃ１４０３のＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩ部
位に挿入し、前述のＥ、ｃｏｌｉ ＭＣ１０６１株を形
質転換した。
アンピシリン耐性でＸ−ｇａｌを分解して青色を呈する
形質転換株の中から、常法に従い、制限酵素による切断
パターンにより、目的ＤＮＡを組み入れたｐＭｃ１４０
３−ＥＮＯ／ＵＡＳ ＋ＵＰＳ ＋０５−Ｌｌを得た。
形質転換株の中から、常法に従い、制限酵素による切断
パターンにより、目的ＤＮＡを組み入れたｐＭｃ１４０
３−ＥＮＯ／ＵＡＳ ＋ＵＰＳ ＋０５−Ｌｌを得た。
上記の方法にて、それぞれのＵＰＳ ＋Ｄ！ＪＮ域をＬ
ＩＡＳ ｅＩ域と結合させて、ｐＭｃ１４０３４ＮＯ／
ＵＡＳ ＋ＵＰＳ＋０５−Ｉ−２． ｐＭｃ１４０３−
ＥＮＯ／ＵＡＳ ＋ＵＰＳ ＋ＤＳ−１−３およびｐＭ
ｃ１４０３−ＥＮＯ／ＬＩＡＳ ＋ＵＰＳ ＋ＤＳ−Ｉ
１１（７）計４種類のプラスミドを得た。
ＩＡＳ ｅＩ域と結合させて、ｐＭｃ１４０３４ＮＯ／
ＵＡＳ ＋ＵＰＳ＋０５−Ｉ−２． ｐＭｃ１４０３−
ＥＮＯ／ＵＡＳ ＋ＵＰＳ ＋ＤＳ−１−３およびｐＭ
ｃ１４０３−ＥＮＯ／ＬＩＡＳ ＋ＵＰＳ ＋ＤＳ−Ｉ
１１（７）計４種類のプラスミドを得た。
これらのプラスミドは、実施例４（第１２図の方法）に
従い、酵母用プラスミドへのクローニングを行ない、ｐ
Ｍｃ１５８７−ＥＮＯ／［ＩＡＳ ＋ｕｐｓ ＋ｏｓ
−１−１，ｐＭｃ１５８７− ［！Ｎｏ／ＵＡｓ
＋Ｕｐｓ ＋ｏｓ −１−２、ｐＭｃ１５８７−ＥＮ
Ｏ／ＵＡＳ ＋ｕｐｓ ＋ＤＳ ４−３を得た。さら
に、実施例５に従って１酵母Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
ＡＨ２２株を形質転換した。
従い、酵母用プラスミドへのクローニングを行ない、ｐ
Ｍｃ１５８７−ＥＮＯ／［ＩＡＳ ＋ｕｐｓ ＋ｏｓ
−１−１，ｐＭｃ１５８７− ［！Ｎｏ／ＵＡｓ
＋Ｕｐｓ ＋ｏｓ −１−２、ｐＭｃ１５８７−ＥＮ
Ｏ／ＵＡＳ ＋ｕｐｓ ＋ＤＳ ４−３を得た。さら
に、実施例５に従って１酵母Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
ＡＨ２２株を形質転換した。
ａ 長鎖合成プロモーター活性の測定ＵＡＳをもつＥ
ＮＯ１の長鎖合成プロモーターの酵母における発現活性
を実施例６に従って、Ｘ−ｇａｌにより定性的に評価し
た。その結果、菌体の周辺は、鮮明な青色を呈し、その
プロモーター活性の強さを示唆した。
ＮＯ１の長鎖合成プロモーターの酵母における発現活性
を実施例６に従って、Ｘ−ｇａｌにより定性的に評価し
た。その結果、菌体の周辺は、鮮明な青色を呈し、その
プロモーター活性の強さを示唆した。
そこでさらに、プロモーターの発現活性を０ＮＰＧアツ
セイ法（Ｍａｒｋ Ｒｏｓｅ ら＋Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ１
．八ｃａｄ、ｓｃｉ。
セイ法（Ｍａｒｋ Ｒｏｓｅ ら＋Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ１
．八ｃａｄ、ｓｃｉ。
ＵＳＡ、ユ、２４６０（１９８１） ）に従って定量的
に測定した。
に測定した。
その結果を第１表に示した。
−以下余白一
第 １ 表
ＵＡＳを連結していないＥＮＯＬプロモーターは、Ｘ−
ｇａｌによる定性的活性評価法で、すべてわずかな活性
しか示さなかった。そして、その活性値は０ＮＣＰアツ
セイ法による定量値より、２．２〜５．３ユニット程度
であった。これらに、ＵＡＳを連結した結果、その活性
は、Ｘ−ｇａｌによる定性的評価でもまた０ＮＰＧアツ
セイ法による結果でも、驚異的な上昇を示した。この活
性値は、酵母プロモーターとしてすでに異種遺伝子の発
現に利用されているＧＡＬ １プロモーター（Ｐｉｏｔ
ｒ Ｐ、５ｔｅｐｉｅｎらＧｅｎｅ、 ２４．２８９（
１９８３） ）を同じ系で測定して得た値（Ｒ，Ｗｅｓ
ｔら、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、 ４ 、２４
６７（１９８４））に匹敵するものであった。
ｇａｌによる定性的活性評価法で、すべてわずかな活性
しか示さなかった。そして、その活性値は０ＮＣＰアツ
セイ法による定量値より、２．２〜５．３ユニット程度
であった。これらに、ＵＡＳを連結した結果、その活性
は、Ｘ−ｇａｌによる定性的評価でもまた０ＮＰＧアツ
セイ法による結果でも、驚異的な上昇を示した。この活
性値は、酵母プロモーターとしてすでに異種遺伝子の発
現に利用されているＧＡＬ １プロモーター（Ｐｉｏｔ
ｒ Ｐ、５ｔｅｐｉｅｎらＧｅｎｅ、 ２４．２８９（
１９８３） ）を同じ系で測定して得た値（Ｒ，Ｗｅｓ
ｔら、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、 ４ 、２４
６７（１９８４））に匹敵するものであった。
大血斑則 ＵＡＳの塩基配列の決定
ＵＡＳの連結により、ＥＮｏ １合成プロモーターの活
性が著しく上昇し、その領域がプロモーター活性に大き
く、関与することが示唆されたため、この領域の塩基配
列を、Ｍ−１３グイデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ、 Ｆ。
性が著しく上昇し、その領域がプロモーター活性に大き
く、関与することが示唆されたため、この領域の塩基配
列を、Ｍ−１３グイデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ、 Ｆ。
ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、
７４．５４６３（１９７７） ）により決定した。
７４．５４６３（１９７７） ）により決定した。
その結果を第１図に示した。５′末端のＥｃｏＲＩ認識
部位から３゛末端の旧ｎｆ Ｉ 認識部位までをカバ
ーしており、５゛末端より３７３番目のＴより下流側が
既知塩基配列領域であるが、その右頁域の塩基配列が２
ケ所（５”末端より４４４番目と４５８番目のＴがＣに
変異）報告と異なっていた。これは、ＤＮＡを取得した
菌株の差であると考えられる。
部位から３゛末端の旧ｎｆ Ｉ 認識部位までをカバ
ーしており、５゛末端より３７３番目のＴより下流側が
既知塩基配列領域であるが、その右頁域の塩基配列が２
ケ所（５”末端より４４４番目と４５８番目のＴがＣに
変異）報告と異なっていた。これは、ＤＮＡを取得した
菌株の差であると考えられる。
第１図は、酵母エノラーゼプロモーター領域の新規部分
の塩基配列を含む旧ｎｆ Ｔ 切断部位までの塩基配
列を示す。 第２図は、ＥＮＯ１プロモーターのＤＳＳｉ域の化学合
成の際のＤＮＡオリゴマー分割断片を示す。 第３図は、ＤＳ領域の翻訳開始コドンＡＴＧのすぐ上流
に制限酵素Ｃ１ａ Ｉの認識塩基配列を、第４図は、さ
らにＣ１ａ Ｉの認識塩基配列のすぐ上流の２塩基を欠
失させた異変部分のＤＮＡオリゴマー分割断片を示す。 第５図は、ＤＳ領域の連結反応手順を、また第６図は、
０３−Ｉ−２またはＯ５−１−３の連結反応手順を示す
。 第７図は、ＤＳ４−２変異部分を、第８図は、ＤＳ−ｒ
−３の変異部分を示す。 第９図は、ＥＮＯ１プロモーターのＵＰＳ領域の化学合
成の際のＤＮＡオリゴマー分割断片を示す。 第１０図は、組換えＤ Ｎ ＡｐＭＣ１４０３−ＥＮＯ
／ＤＳ４−１を、第１１図は、組換えＤ Ｎ Ａ ｐＭ
ｃ１４０３−ＥＮＯ／ＩＩＰＳ＋ＤＳ４−１を、第１２
図は、組換えＤ Ｎ ＡｐＭＣ１５８７−ＥＮＯ／ＵＰ
Ｓ ＋Ｏ３，ｒ−１を、さらに第１３図は、発現活性を
有する長鎖合成プロモーターを製造する過程をそれぞれ
示す。 劣 １図 ＣＴＴＡＡＧＣＣＡＧＴＭＣＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＡ
ＣＧＧＣＡＣＴＴＣＧＣＣＣＴＧＴＴＧＧＴＣＴＴＴＴ
ＣＡＧＣＡＧＡＴＡＴＴＴＡＣＧＧＣＣＧＴＧＣＡＣＧ
ＣＴＡＧＴＡＧＣＡＣＣＧＣＣＣＣＭＡＡＴＴＣＴＣＡ
ＣＧＴＡＴＡＧＴＧＴＴＴＭＣＡＧＣＧＴＡＡＴＧＧＣ
ＧＣＣｎＧＧＣＧＧＴＣＴＡＴＡＡＧＴＡＡＴＧＭＣＴ
ＧＣＧＴｍＣＧＣＭＡＣＴｎＡＴＴＡＣＴＧＣｍＴＴＣ
ＴＴＣＣＴｒＣｍＴＴＴＴＴＴＣＴＴｎＴＡＴＧＧＣＧ
ＡＡＧＡＴＣＣＧＣＣＣＡＡＴＡＧＡＴＧＡＣＴＡＧＧ
ＣＴＣＧＡＡＧＧＴＧＡＴＣＣＴＡＴＣＧＴＯＧＧＴＴ
ＴＧＴＧＧＡＣＧＴＡＴＭＡＣＣＴＧＣＴＧＧＭＡＴＧ
ＡＡＴＧＴＧＧＴＧＧＴｎＴＴＧＧＴＧＡＭＧＣＧＧＡ
ＧＡＧＧＧＣＧＧＧＧＡＣＴＡＴＴＧＣＡＧＧＴＧＡＴ
ＴＡＡＣＴＣＧＣＴＭＴＧＧＡＣＴＣＧＣＣＡＧＧＡＧ
ＭＡＡＣＡＡＡＣＧＴＣＧＴＡＣＴＣＴＧＡＡＣＧＴＡ
ＴＧＡＣＧＴＴＣ ＡＡＧ 篤２１刀 ■９昌呵Ｃ３）ＴＡＧＣＴＡ／門い輩げ呼ＣＣ／Ｇ’１
ＧＴＱＴＡ品Ｇ ｐＭに＋４ＬＪＪ−ヒＮ（ＪｌｏＳ−１−１第１１１目 ｐＭｃ１４０３−ＥＮＯ／ＵＰＳ＋ＤＳＪ−１Ｌ ｐＭｃ１５８７−ＥＮＯ／ＵＰＳ＋ＤＳ−Ｉ−１第１３
１］ ＵＡＳ （ｃａ、５００ｂｐ）
の塩基配列を含む旧ｎｆ Ｔ 切断部位までの塩基配
列を示す。 第２図は、ＥＮＯ１プロモーターのＤＳＳｉ域の化学合
成の際のＤＮＡオリゴマー分割断片を示す。 第３図は、ＤＳ領域の翻訳開始コドンＡＴＧのすぐ上流
に制限酵素Ｃ１ａ Ｉの認識塩基配列を、第４図は、さ
らにＣ１ａ Ｉの認識塩基配列のすぐ上流の２塩基を欠
失させた異変部分のＤＮＡオリゴマー分割断片を示す。 第５図は、ＤＳ領域の連結反応手順を、また第６図は、
０３−Ｉ−２またはＯ５−１−３の連結反応手順を示す
。 第７図は、ＤＳ４−２変異部分を、第８図は、ＤＳ−ｒ
−３の変異部分を示す。 第９図は、ＥＮＯ１プロモーターのＵＰＳ領域の化学合
成の際のＤＮＡオリゴマー分割断片を示す。 第１０図は、組換えＤ Ｎ ＡｐＭＣ１４０３−ＥＮＯ
／ＤＳ４−１を、第１１図は、組換えＤ Ｎ Ａ ｐＭ
ｃ１４０３−ＥＮＯ／ＩＩＰＳ＋ＤＳ４−１を、第１２
図は、組換えＤ Ｎ ＡｐＭＣ１５８７−ＥＮＯ／ＵＰ
Ｓ ＋Ｏ３，ｒ−１を、さらに第１３図は、発現活性を
有する長鎖合成プロモーターを製造する過程をそれぞれ
示す。 劣 １図 ＣＴＴＡＡＧＣＣＡＧＴＭＣＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＡ
ＣＧＧＣＡＣＴＴＣＧＣＣＣＴＧＴＴＧＧＴＣＴＴＴＴ
ＣＡＧＣＡＧＡＴＡＴＴＴＡＣＧＧＣＣＧＴＧＣＡＣＧ
ＣＴＡＧＴＡＧＣＡＣＣＧＣＣＣＣＭＡＡＴＴＣＴＣＡ
ＣＧＴＡＴＡＧＴＧＴＴＴＭＣＡＧＣＧＴＡＡＴＧＧＣ
ＧＣＣｎＧＧＣＧＧＴＣＴＡＴＡＡＧＴＡＡＴＧＭＣＴ
ＧＣＧＴｍＣＧＣＭＡＣＴｎＡＴＴＡＣＴＧＣｍＴＴＣ
ＴＴＣＣＴｒＣｍＴＴＴＴＴＴＣＴＴｎＴＡＴＧＧＣＧ
ＡＡＧＡＴＣＣＧＣＣＣＡＡＴＡＧＡＴＧＡＣＴＡＧＧ
ＣＴＣＧＡＡＧＧＴＧＡＴＣＣＴＡＴＣＧＴＯＧＧＴＴ
ＴＧＴＧＧＡＣＧＴＡＴＭＡＣＣＴＧＣＴＧＧＭＡＴＧ
ＡＡＴＧＴＧＧＴＧＧＴｎＴＴＧＧＴＧＡＭＧＣＧＧＡ
ＧＡＧＧＧＣＧＧＧＧＡＣＴＡＴＴＧＣＡＧＧＴＧＡＴ
ＴＡＡＣＴＣＧＣＴＭＴＧＧＡＣＴＣＧＣＣＡＧＧＡＧ
ＭＡＡＣＡＡＡＣＧＴＣＧＴＡＣＴＣＴＧＡＡＣＧＴＡ
ＴＧＡＣＧＴＴＣ ＡＡＧ 篤２１刀 ■９昌呵Ｃ３）ＴＡＧＣＴＡ／門い輩げ呼ＣＣ／Ｇ’１
ＧＴＱＴＡ品Ｇ ｐＭに＋４ＬＪＪ−ヒＮ（ＪｌｏＳ−１−１第１１１目 ｐＭｃ１４０３−ＥＮＯ／ＵＰＳ＋ＤＳＪ−１Ｌ ｐＭｃ１５８７−ＥＮＯ／ＵＰＳ＋ＤＳ−Ｉ−１第１３
１］ ＵＡＳ （ｃａ、５００ｂｐ）
Claims (7)
- （１）エノラーゼ翻訳開始コドンより上流の約７２０塩
基対に対応する領域を含むものであって、その５’末端
側より 【ＤＮＡ配列があります】 で示される塩基配列を含有している発現活性を有する酵
母エノラーゼプロモーターＤＮＡ。 - （２）発現活性を有する酵母エノラーゼプロモーターが
、酵母染色体より分離されたもの、化学合成されたもの
または、分離および化学合成の雑種によって作られたも
のである特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ。 - （３）酵母エノラーゼプロモーターの塩基配列を有した
天然あるいは化学合成したＤＮＡ断片をプローブとして
、酵母染色体より、発現活性を有する酵母エノラーゼプ
ロモーターを分離することを特徴とする発現活性を有す
る酵母エノラーゼプロモーターの製造方法。 - （４）酵母染色体より分離された発現活性を有する酵母
エノラーゼプロモーターを適当な制限酵素により切断し
、その欠失部分を任意の化学合成ＤＮＡ切断と再結合す
ることにより再構成する発現活性を有する酵母エノラー
ゼプロモーターの製造方法。 - （５）特許請求の範囲第１〜３項記載の酵母エノラーゼ
プロモーターを有しているプラスミド。 - （６）酵母エノラーゼプロモーターを有し、大腸菌にお
いて遺伝子発現が可能な特許請求の範囲第５項記載のプ
ラスミド。 - （７）酵母エノラーゼプロモーターを有し、酵母におい
て遺伝子発現が可能な特許請求の範囲第５項記載のプラ
スミド。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60120900A JPH066059B2 (ja) | 1985-06-04 | 1985-06-04 | 酵母エノラ−ゼプロモ−タ− |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60120900A JPH066059B2 (ja) | 1985-06-04 | 1985-06-04 | 酵母エノラ−ゼプロモ−タ− |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61280283A true JPS61280283A (ja) | 1986-12-10 |
| JPH066059B2 JPH066059B2 (ja) | 1994-01-26 |
Family
ID=14797774
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60120900A Expired - Lifetime JPH066059B2 (ja) | 1985-06-04 | 1985-06-04 | 酵母エノラ−ゼプロモ−タ− |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH066059B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000020571A3 (en) * | 1998-10-06 | 2000-09-21 | Pioneer Hi Bred Int | Maize promoters |
| CN113881677A (zh) * | 2021-10-28 | 2022-01-04 | 华中科技大学 | 一种解脂耶氏酵母杂合启动子及其应用 |
-
1985
- 1985-06-04 JP JP60120900A patent/JPH066059B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| J.BIOL.CHEM=1981 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000020571A3 (en) * | 1998-10-06 | 2000-09-21 | Pioneer Hi Bred Int | Maize promoters |
| US6504083B1 (en) | 1998-10-06 | 2003-01-07 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Maize Gos-2 promoters |
| AU772908B2 (en) * | 1998-10-06 | 2004-05-13 | Agricultural Genetic Engineering Research Institute (Ageri) | Maize promoters |
| CN113881677A (zh) * | 2021-10-28 | 2022-01-04 | 华中科技大学 | 一种解脂耶氏酵母杂合启动子及其应用 |
| CN113881677B (zh) * | 2021-10-28 | 2024-03-19 | 华中科技大学 | 一种解脂耶氏酵母杂合启动子及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH066059B2 (ja) | 1994-01-26 |
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