JPS61217765A - Method and apparatus for assaying immunizing protein - Google Patents

Method and apparatus for assaying immunizing protein

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JPS61217765A
JPS61217765A JP6166385A JP6166385A JPS61217765A JP S61217765 A JPS61217765 A JP S61217765A JP 6166385 A JP6166385 A JP 6166385A JP 6166385 A JP6166385 A JP 6166385A JP S61217765 A JPS61217765 A JP S61217765A
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JP
Japan
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protein
column
solution
measured
antibody
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Application number
JP6166385A
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Japanese (ja)
Inventor
Tadashi Hara
正 原
Motohiro Toriyama
鳥山 素弘
Masakatsu Imashiro
今城 正勝
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Horiba Ltd
Original Assignee
Horiba Ltd
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Publication date
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Abstract

PURPOSE:To enable efficient assay, by providing an immune affinity chromatograph column and a third passage for supplying an immune protein to be measured separated from the column and eluted and a labelled immune protein to a chemical luminescence reaction system. CONSTITUTION:First and second passages I and II are provided to supply a solution A containing chemically luminescent substance and a solution B containing oxidizing substance to a flowcell Fc at a chemically luminescent reaction section R. A third passage III is provided to supply a solution serving as catalyst for chemically luminescent reaction to the reaction section R through the passage II. With the passage III, respective specified amounts of a reference solution C containing antibody and a sampling solution D are sucked separately into sampling groups K1 and K2 or the solution D in the group K2 is introduced into an immune affinity chromatograph column (antibody immobilizing column) CU through a washing solution E by forcible extrusion while a dissociation solution F is introduced into the column CU - all done by switching valve mechanisms 6-8. Then, the antigen to be measured and a labelled antibody separated and eluted from the column CU are supplied to the reaction section R.

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、全く新規な手段に基く免疫性蛋白質の定量方
法および定量装置、詳しくは、サンプル溶液中に含有さ
れている特定の免疫性蛋白質(ただし、この免疫性蛋白
質とは、抗原−抗体関係にある免疫性蛋白質の一方のみ
を意味する)の量を定量する方法および装置に関するも
のである。
[Detailed Description of the Invention] [Industrial Application Field] The present invention relates to a method and apparatus for quantifying immune proteins based on completely new means, and more particularly, to a method and apparatus for quantifying immune proteins based on completely new means. (However, the term "immune protein" here refers to only one of the immune proteins in the antigen-antibody relationship).

なお、ここに言う免疫性蛋白質とは、上記のように、抗
原(蛋白質)または抗体(蛍白質)の何れをも意味し得
るが、以下、説明の便宜上、被測定免疫性蛋白質が抗原
の場合についてのみ述べることとする。その説明におい
て、r抗原」という用語と「抗体jという用語を入れ換
えることによって、被測定免疫性蛋白質が抗体の場合に
ついても容易に類推可能であろう。
As mentioned above, the immune protein referred to here can mean either an antigen (protein) or an antibody (fluorescent protein), but for convenience of explanation, in the following, when the immune protein to be measured is an antigen, I will only talk about this. In the explanation, by replacing the terms ``r antigen'' and ``antibody j'', it will be possible to easily infer the case where the immunological protein to be measured is an antibody.

〔従来の技術〕[Conventional technology]

一般に免疫測定法と呼ばれる免疫性蛋白質の定量方法(
およびそれを実施するための装置)としては、放射性同
位元素を標識剤として用いるRIA法、酵素を標識剤と
して用いるEIA法、螢光物質を標識剤として用いる螢
光標識法などの方法、即ち、被測定免疫性蛋白質(以下
、抗原とする)に対応する抗体に放射性同位元素や酵素
あるいは螢光物質を用いてI識を付した標識抗体を生成
し、その標識抗体にサンプル溶液中の被測定抗原を吸着
させてから、未吸着の標識抗体や他の物質を除去して標
識抗体−被測定抗原の結合体のみを残し、しかる後、そ
の標識抗体の量を、蛋白質の定量方法として公知のラジ
オアイソトープ法や吸光法あるいは螢光法によって測定
することにより、サンプル溶液中の被測定抗原を定量す
る、という方法が従来から知られている。
A method for quantifying immune proteins generally called immunoassay (
and equipment for carrying out the same) include methods such as the RIA method using a radioactive isotope as a labeling agent, the EIA method using an enzyme as a labeling agent, the fluorescent labeling method using a fluorescent substance as a labeling agent, etc. A labeled antibody corresponding to the immunological protein to be measured (hereinafter referred to as antigen) is labeled using a radioactive isotope, an enzyme, or a fluorescent substance, and the labeled antibody is added to the antibody to be measured in the sample solution. After adsorbing the antigen, unadsorbed labeled antibodies and other substances are removed to leave only the labeled antibody-analyte antigen complex, and then the amount of the labeled antibody is measured using a known method for quantifying protein. Conventionally, methods have been known in which the antigen to be measured in a sample solution is quantified by measurement using a radioisotope method, an absorption method, or a fluorescence method.

〔発明が解決しようとする問題点〕[Problem that the invention seeks to solve]

しかしながら、上記各種従来方法においては、非常に煩
雑で面倒な手順と長時間を要する抗体への標識操作を行
わねばならず、また、抗体および標識抗体は一回限りし
か使用できないためバッチ的な定量しか行えず、従って
、ひとつのサンプルについて数十時間もの長い定量時間
を要すると共に、抗体および標識抗体などの試薬の無駄
が多いという共通の欠点があり、また、RIA法では、
放射性同位元素を標識剤とするために危険性が大きく、
EIA法では、巨大な分子から成る酵素を標識剤とする
ために立体障害などによる免疫反応効率の悪さに起因し
て定量感度や精度の悪化を招き、螢光標識法では、螢光
物質をI識剤とするために標識操作時において有機溶媒
を用いざるを得ず、従って、被測定抗原の種類によって
は適用することはできない場合が多い、というように各
方法に固有の欠点もあった。
However, in the various conventional methods described above, it is necessary to carry out labeling operations for antibodies, which are extremely complicated and time-consuming procedures, and require a long time.Also, since antibodies and labeled antibodies can only be used once, batch quantification is required. Therefore, the RIA method has the common disadvantage that it requires a long quantification time of several tens of hours for one sample, and there is a lot of waste of reagents such as antibodies and labeled antibodies.
It is highly dangerous because it uses a radioactive isotope as a labeling agent.
In the EIA method, an enzyme consisting of a large molecule is used as a labeling agent, resulting in poor immune reaction efficiency due to steric hindrance, resulting in deterioration of quantitative sensitivity and accuracy.In the fluorescent labeling method, fluorescent substances are Each method has its own drawbacks, such as the need to use an organic solvent during the labeling operation in order to use it as a marker, and therefore it is often not applicable depending on the type of antigen to be measured.

本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであって、そ
の目的は、比較的簡素かつ安価に構成可能な装置で済み
、迅速に安全にかつ経済的に、しかも、多種類の免疫性
蛋白質に対して感度および精度の良い定量を行える免疫
性蛋白質の定量方法および定量装置を提供せんとするこ
とにある。
The present invention has been made in view of the above-mentioned circumstances, and its purpose is to provide a device that can be configured relatively simply and inexpensively, quickly, safely, and economically, and that can be used to produce a variety of immune proteins. It is an object of the present invention to provide a method and apparatus for quantifying immune proteins that can perform quantitative determinations with high sensitivity and precision.

C問題点を解決するための手段〕 本発明による免疫性蛋白質の定量方法および定量装置は
、基本的には化学ルミネセンス(化学発光反応)という
、当該技術分野においては従来は全(留意されていなか
った自然現象を存効利用するという新規なアイデアに端
を発して開発されたものであるので、先ず、その化学発
光反応に係る興味ある現象について説明しておく。
Means for Solving Problem C] The method and device for quantifying immune proteins according to the present invention basically uses chemiluminescence (chemiluminescence reaction), which has been conventionally known in the technical field (although it has not been noted). Since it was developed based on a novel idea of making effective use of a natural phenomenon that did not exist before, I will first explain the interesting phenomenon related to the chemiluminescent reaction.

即ち、第9図に示すように、ルミノール(cmH、N 
x Ot)溶液のような被酸化時において化学発光性を
示す物質を含有する溶液aと、過酸化水素水(HzOt
溶液)のような酸化性の物質を含有する溶液すと、フェ
リシアン化カリウム(Kn[F e (CN)61 )
溶液のような触媒溶液Cとを、反応部rを構成するフロ
ーセルfeへ導入供給して混合させると、前記化学発光
性物質は前記酸化性物質により酸化されてかなり強度の
大きい青色の化学発光1 (約450nm)を生じる反
応が起こることがよく知られている。なお、前記化学発
光性物質としては、前記ルミノールの他にルシゲニンや
ロフィンなどが、また、前記酸化性物質としては前記過
酸化水素の他に酸素、オゾン、次亜塩素酸などが知られ
ている。
That is, as shown in FIG. 9, luminol (cmH, N
x Ot) solution containing a substance that exhibits chemiluminescence when oxidized, and a hydrogen peroxide solution (HzOt
Potassium ferricyanide (Kn[F e (CN)61 )
When a catalyst solution C such as a solution is introduced and supplied to the flow cell fe constituting the reaction section r and mixed, the chemiluminescent substance is oxidized by the oxidizing substance and produces blue chemiluminescence 1 with considerably high intensity. (approximately 450 nm) is well known to occur. In addition, the chemiluminescent substances include lucigenin and lophine in addition to the luminol, and the oxidizing substances include oxygen, ozone, hypochlorous acid, and the like in addition to the hydrogen peroxide. .

而して、本発明者らは、かかる化学発光反応の系におい
て、同図中想像線矢印2で示すように、前記触媒溶液C
として、前記フェリシアン化カリウム溶液の代わりに、
本発明者らが独自に開発したところの+!識抗体(化学
発光反応に対して触媒活性を有すると共に蛋白質に対し
て共有結合可能な標識剤を被測定抗原に対して抗原−抗
体関係にある抗体に結合させて成るもの)を含有する溶
液fを用いた場合にも、前記化学発光lが発生すること
、ならびに、その化学発光lの強度は前記反応部「へ導
入供給される標識抗体含有溶液f中の標識抗体の量に広
い範囲(ごく少量の場合からかなり多量の場合まで)に
亘って比例的(直線性が良好)であり、また、その比例
定数は標識抗体の種類の違いによってもあまり左右され
ない、ということを発見ならびに実験的に確認したので
ある。
In this chemiluminescent reaction system, the present inventors discovered that the catalyst solution C
As, instead of the potassium ferricyanide solution,
+!, which was originally developed by the inventors! A solution containing a labeled antibody (a labeling agent that has catalytic activity for a chemiluminescent reaction and is capable of covalently bonding to a protein is bound to an antibody that has an antigen-antibody relationship with respect to the antigen to be measured) f Even in the case where the chemiluminescence 1 is used, the chemiluminescence 1 is generated, and the intensity of the chemiluminescence 1 varies over a wide range (very It was discovered and experimentally discovered that it is proportional (good linearity) from small amounts to considerably large amounts, and that the proportionality constant is not affected much by the type of labeled antibody. I confirmed it.

そこで、本発明者らは、上記した現象を有効に応用する
ことにより、下記のような免疫性蛋白質(抗原または抗
体)の定量法および定量装置を開発するに至ったのであ
る。
Therefore, by effectively applying the above-mentioned phenomenon, the present inventors have developed the following method and apparatus for quantifying immune proteins (antigens or antibodies).

即ち、本第−発明に係る免疫性蛋白質(例えば抗原)の
定量方法は、 被測定免疫性蛋白質(抗原)に対して抗原−抗体関係に
ある免疫性蛋白質(抗体)を固定化した免疫アフィニテ
ィークロマトカラム(抗体固定化カラム)内に被測定免
疫性蛋白質(抗原)を含有するサンプル溶液を導入して
、前記カラム内に固定化された免疫性蛋白質(抗体)に
対して前記被測定免疫性蛋白質(抗原)を抗原−抗体反
応により捕捉させてから、 前記カラム内を洗浄して不要な他物質を除去した後、 更に、被酸化時において化学発光性を示す物質を含有す
る溶液と酸化性を有する物質を含有する溶液との化学発
光反応に対して触媒活性を有すると共に蛋白質に対して
共有結合可能な標識剤を前記被測定免疫性蛋白質(抗原
)に対して抗原−抗体関係にある免疫性蛋白質(抗体)
に結合させて成る標識免疫性蛋白質(標識抗体)を含有
する溶液を前記カラム内に導入して、前記カラム内に捕
捉されている被測定免疫性蛋白質(抗原)に対して前記
標識免疫性蛋白質(標識抗体)を抗原−抗体反応により
捕捉させてから、 再び前記カラム内を洗浄して不要な他物質を除去した後
、 前記カラム内に解離溶液を導入して、前記カラム内に固
定化された免疫性蛋白′it(抗体)から前記被測定免
疫性蛋白質(抗原)と標識免疫性蛋白質(標識抗体)と
を分離させて前記カラム内から溶出させ、 しかる後、前記カラムから分離溶出された被測定免疫性
蛋白質(抗原)と標識免疫性蛋白質(標識抗体)とを前
記化学発光反応系へ導入供給して、その状態において、
前記標識免疫性蛋白質(標識抗体)の触媒作用により励
起される前記化学発光反応系からの化学発光強度を計測
することにより、前記サンプル溶液中の免疫性蛋白質(
抗原)の量を測定する、 という手順による手法を採用した点に特徴がある。
That is, the method for quantifying an immunological protein (for example, an antigen) according to the present invention uses an immunoaffinity chromatography system on which an immunological protein (antibody) that has an antigen-antibody relationship with respect to the immunological protein (antigen) to be measured is immobilized. A sample solution containing an immunogenic protein to be measured (antigen) is introduced into a column (antibody-immobilized column), and the immunogenic protein to be measured is applied to the immunogenic protein (antigen) immobilized in the column. (Antigen) is captured by an antigen-antibody reaction, and after washing the inside of the column to remove unnecessary substances, a solution containing a substance that exhibits chemiluminescence when oxidized and an oxidizing agent are added. A labeling agent that has catalytic activity for a chemiluminescent reaction with a solution containing a substance that has a substance and is capable of covalently bonding to a protein is attached to an immunological agent that has an antigen-antibody relationship with the immunogenic protein (antigen) to be measured. protein (antibody)
A solution containing a labeled immunological protein (labeled antibody) bound to is introduced into the column, and the labeled immunological protein is directed against the immunogenic protein to be measured (antigen) captured within the column. After the (labeled antibody) is captured by an antigen-antibody reaction, the inside of the column is washed again to remove unnecessary other substances, and then a dissociation solution is introduced into the column to immobilize it within the column. The immunological protein to be measured (antigen) and the labeled immunological protein (labeled antibody) are separated from the immunological protein (antibody) and eluted from the column, and then separated and eluted from the column. Introducing and supplying the immunogenic protein to be measured (antigen) and the labeled immunological protein (labeled antibody) to the chemiluminescent reaction system, and in that state,
By measuring the chemiluminescence intensity from the chemiluminescence reaction system excited by the catalytic action of the labeled immunological protein (labeled antibody), the immunological protein (labeled antibody) in the sample solution can be detected.
The method is unique in that it uses a procedure that measures the amount of antigen (antigen).

また、本第二発明に係る免疫性蛋白質の定量装置は、被
酸化時において化学発光性を示す物質を含有する溶液を
化学発光反応部へ所定量ずつ導入供給可能に構成された
第1流路と、酸化性を有する物質を含有する溶液を前記
化学発光反応部へ所定量ずつ導入供給可能に構成された
第2流路と、前記化学発光反応部から発せられる化学発
光の強度を計測する化学発光強度計測手段とを設けると
共に、被測定免疫性蛋白質(抗原)に対して抗原−抗体
関係にある免疫性蛋白質(抗体)を固定化した免疫アフ
ィニティークロマトカラム(抗体固定化カラム)、およ
び、そのカラム内に被測定免疫性蛋白質(抗原)を含有
するサンプル溶液を導入する状態と、そのカラム内に洗
浄溶液を導入する状態と、そのカラム内に化学発光反応
に対して触媒活性を有すると共に蛋白質に対して共有結
合可能な標識剤を前記被測定免疫性蛋白質(抗原)に対
して抗原−抗体関係にある免疫性蛋白質(抗体)に結合
させて成る標識免疫性蛋白′1t(標識抗体)を含有す
る溶液を導入する状態と、そのカラム内に解#溶液を導
入する状態とに切り替え可能な弁機構を備えていて、前
記カラム内にサンプル溶液を導入してそのカラム内に固
定化された免疫性蛋白質(抗体)に対して前記サンプル
溶液中の被測定免疫性蛋白質(抗原)を抗原−抗体反応
により捕捉させてから、前記カラム内を洗浄して不要な
他物質を除去した後、更に、前記標識免疫性蛋白質(標
識抗体)含有溶液を前記カラム内に導入して、前記カラ
ム内に捕捉されている被測定免疫性蛋白1t(抗原)に
対して前記標識免疫性蛋白質(標識抗体)を抗原−抗体
反応により捕捉させてから、再び前記カラム内を洗浄し
て不要な他物質を除去した後、前記カラム内に解離溶液
を導入して、前記カラム内に固定化された免疫性蛋白質
(抗体)から前記被測定免疫性蛋白!(抗原)と標識免
疫性蛋白質(標識抗体)とを分離させて前記カラム内か
ら溶出させ、しかる後、前記力ラムから分離溶出された
被測定免疫性蛋白質(抗原)と標識免疫性蛋白質(標識
抗体)とを前記化学発光反応系へ導入供給可能なように
構成された第3流路を設けである、という特徴を備えて
いる。
In addition, the immunological protein quantitative device according to the second invention has a first channel configured to be able to introduce and supply a predetermined amount of a solution containing a substance that exhibits chemiluminescence when oxidized to the chemiluminescence reaction section. a second channel configured to be able to introduce and supply a solution containing an oxidizing substance in a predetermined amount to the chemiluminescence reaction section; an immunoaffinity chromatography column (antibody-immobilized column) which is provided with a luminescence intensity measuring means and immobilized with an immunological protein (antibody) that has an antigen-antibody relationship with respect to the immunological protein (antigen) to be measured; A state in which a sample solution containing the immunological protein (antigen) to be measured is introduced into the column, a state in which a washing solution is introduced into the column, and a state in which a sample solution containing the immunological protein (antigen) to be measured is introduced into the column; A labeled immunological protein '1t (labeled antibody) is obtained by binding a labeling agent capable of covalently bonding to an immunological protein (antibody) that has an antigen-antibody relationship with respect to the immunological protein (antigen) to be measured. It is equipped with a valve mechanism that can be switched between a state in which a solution containing the sample solution is introduced and a state in which a solution solution is introduced into the column, and a sample solution is introduced into the column and immobilized in the column. After the immunological protein (antigen) to be measured in the sample solution is captured by the immunological protein (antibody) through an antigen-antibody reaction, the inside of the column is washed to remove unnecessary other substances, and then further , the solution containing the labeled immunological protein (labeled antibody) is introduced into the column, and the labeled immunological protein (labeled antibody) is directed against the immunological protein to be measured (antigen) captured in the column. is captured by an antigen-antibody reaction, the column is washed again to remove unnecessary substances, and a dissociation solution is introduced into the column to capture the immobilized immune protein within the column. (Antibody) to the immune protein to be measured! (antigen) and labeled immunological protein (labeled antibody) are separated and eluted from the column, and then the immunogenic protein to be measured (antigen) and the labeled immunological protein (labeled antibody) are separated and eluted from the column. The present invention is characterized in that it is provided with a third flow path configured to be able to introduce and supply an antibody (antibody) to the chemiluminescence reaction system.

〔作用〕[Effect]

本発明方法および装置において発揮される作用は次の通
りである。
The effects exhibited by the method and apparatus of the present invention are as follows.

即ち、上記第一発明方法によれば、被測定免疫性蛋白質
(例えば抗原)に対して抗原−抗体関係にある免疫性蛋
白質(抗体)を固定化した免疫アフィニティークロマト
カラム(抗体固定化カラム)を用いると共に、所謂サン
ドインチ法を利用して、サンプル溶液中の被測定免疫性
蛋白質(抗原)とそれに対応する量の標識免疫性蛋白質
(標識抗体)が効率良く分離溶出されるので、従来方法
におけるように非常に煩雑で面倒な手順と長時間を要す
る被測定免疫性蛋白質(抗原)自体に対するバッチ的な
標識操作を行なう必要が無く、また、前記カラムに固定
化された免疫性蛋白質(抗体)は反復使用が可能なため
連続的な定量が可能となり、従って、ひとつのサンプル
に対する定量時間を従来の数十時間に比べて約50分程
度という極めて短い時間で迅速に行えるようになると共
に、試薬の無駄を極めて少なくできるようになった。
That is, according to the first method of the invention, an immunoaffinity chromatography column (antibody-immobilized column) on which an immunological protein (antibody) that has an antigen-antibody relationship with an immunological protein to be measured (e.g., an antigen) is immobilized is used. At the same time, using the so-called sandwich method, the immunogenic protein to be measured (antigen) in the sample solution and the corresponding amount of labeled immunological protein (labeled antibody) can be efficiently separated and eluted, which is different from the conventional method. There is no need to perform a batch labeling operation for the immunological protein (antigen) to be measured, which requires extremely complicated and troublesome procedures and a long time. Since it can be used repeatedly, continuous quantification is possible. Therefore, the quantification time for one sample can be done quickly, approximately 50 minutes, compared to the conventional several tens of hours, and the reagent It has become possible to significantly reduce waste.

また、化学発光性物質含有溶液と酸化性物質含有溶液と
の化学発光反応系へ供給される標識免疫性蛋白質(標識
抗体)の量つまりは被測定免疫性蛋白質(抗原)の量に
対して、その量がごく少量の場合からかなり多量の場合
までの広い量範囲に亘って良好な直線性をもって比例的
に、しかも、標識免疫性蛋白質(標識抗体)の種類つま
りは被測定免疫性蛋白質(抗原)の種類如何に拘わらず
ほぼ一定の割合で、その化学発光反応系からの化学発光
の強度が変化するので、前記サンプル溶液中の被測定免
疫性蛋白質(抗原)の定量を、感度ならびに精度良く、
かつ、広い測定範囲で行うことができる。ちなみに、本
発明方法を採用して行った実験によれば、ヒト血清アル
ブミンの場合について、1309g (絶対量)という
優れた測定感度が得られた。これは、従来の一般的な測
定法に比べると2桁高い測定感度である。
In addition, the amount of labeled immunological protein (labeled antibody) supplied to the chemiluminescent reaction system of the chemiluminescent substance-containing solution and the oxidizing substance-containing solution, that is, the amount of the immunological protein (antigen) to be measured, The amount can be measured proportionally with good linearity over a wide range of amounts, from very small amounts to quite large amounts, and moreover, depending on the type of labeled immunological protein (labeled antibody) or the immunological protein to be measured (antigen). ) The intensity of chemiluminescence from the chemiluminescence reaction system changes at an almost constant rate regardless of the type of the chemiluminescence reaction system. ,
Moreover, it can be carried out over a wide measurement range. Incidentally, according to an experiment conducted using the method of the present invention, an excellent measurement sensitivity of 1309 g (absolute amount) was obtained for human serum albumin. This is two orders of magnitude higher measurement sensitivity than conventional general measurement methods.

更に、本発明方法においては、従来のRIA法のように
放射性同位元素の標識剤を用いることが無く、また、前
記化学発光反応系に対する触媒溶液として、通常用いら
れる毒性が強いフェリシアン化カリウム溶液の代わりに
、毒性が無い標識免疫性蛋白質(標識抗体)含有溶液を
用いているため、安全に定量操作を行うことができる。
Furthermore, the method of the present invention does not use a radioactive isotope labeling agent unlike the conventional RIA method, and can be used instead of the normally used highly toxic potassium ferricyanide solution as the catalyst solution for the chemiluminescent reaction system. Furthermore, since a solution containing a non-toxic labeled immunological protein (labeled antibody) is used, quantitative operations can be carried out safely.

更にまた、本発明方法は、比較的簡素で安価に構成でき
る装置と安価に入手できる試薬で実施できる上に、前述
のように被測定免疫性蛋白質(抗原)自体に対するバン
チ的な標識操作という試料の前処理が不要である°と共
に試薬の無駄も少ないので、イニシャルコストもランニ
ングコストも少なくて済み、極めて経済的である。
Furthermore, the method of the present invention can be carried out using a relatively simple and inexpensively configured apparatus and inexpensively available reagents, and as mentioned above, the method requires a bunch-like labeling operation for the immunological protein (antigen) itself to be measured. Since no pretreatment is required and there is little wastage of reagents, initial costs and running costs are low, making it extremely economical.

そして、上記第一発明方法を適用して構成された本第二
発明に係る免疫性蛋白質の定量装置によれば、その第一
発明方法における優れた基本的作用がそのまま発揮され
ることは勿論、免疫アフィニティークロマトカラム(抗
体固定化カラム)と、前述した遺り第一発明方法の手順
を効率的に実施可能に構成された切り替え弁機構を備え
ている第3流路を設けであるから、非常に能率的な免疫
性蛋白質の定量を行うことができる。
According to the immunological protein quantification apparatus according to the second invention, which is constructed by applying the above-mentioned method of the first invention, the excellent basic effects of the method of the first invention can of course be exhibited. The third flow path is equipped with an immunoaffinity chromatography column (antibody-immobilized column) and a switching valve mechanism configured to efficiently carry out the procedure of the first invention method described above. Quantification of immune proteins can be performed efficiently.

〔実施例〕〔Example〕

以下、本発明の実施例を図面(第1図ないし第8図)に
基いて説明する。
Embodiments of the present invention will be described below with reference to the drawings (FIGS. 1 to 8).

第1図(イ)、(ロ)、(ハ)、(ニ)、(ホ)。Figure 1 (a), (b), (c), (d), (e).

(へ)および第2図(イ)、(ロ)は本第−発明に係る
免疫性蛋白質としての抗原の定量方法の基本的手順を説
明するためのものである。
(f) and FIGS. 2(a) and (b) are for explaining the basic procedure of the method for quantifying an antigen as an immunogenic protein according to the present invention.

先ず、第1図(イ)に示すように、被測定抗原(例えば
ヒト血清アルブミン”)H3Aに対して抗原−抗体関係
にある抗体(抗ヒト血清アルブミン)Ab・・・を固定
化した免疫アフィニティークロマトカラムCU(以下、
抗体固定化カラムと称し、その具体的構成については後
述する)内に、同図中点線で示すように被測定抗原H5
A・・・等を含有するサンプル溶液りを導入する。
First, as shown in Figure 1 (a), an immunoaffinity antibody (anti-human serum albumin) Ab... which has an antigen-antibody relationship with the antigen to be measured (e.g., human serum albumin) H3A is immobilized. Chromato column CU (hereinafter referred to as
As shown by the dotted line in the figure, the antigen to be measured H5
A sample solution containing A... etc. is introduced.

すると、第1図(ロ)に示すように、前記サンプル溶液
り中の特定の抗原つまり被測定抗原ISA・・・のみが
、前記カラムC口内に固定化された抗体Ab・・・に対
して抗原−抗体反応により結合して補足され、それ以外
の不要な他物質XX・・・は前記抗体Ab・・・には結
合しないで遊離したままの状態となる。そこでその状態
において、同図中点線で示すように、前記カラムC口内
に洗浄溶液Eを流通させる。
Then, as shown in FIG. 1 (b), only the specific antigen, that is, the antigen to be measured, ISA, in the sample solution, reacts against the antibody Ab immobilized inside the column C. The other unnecessary substances XX, which are bound and captured by the antigen-antibody reaction, do not bind to the antibody Ab and remain free. In this state, the cleaning solution E is caused to flow into the column C inlet as shown by the dotted line in the figure.

すると、第1図(ハ)に示すように、前記カラムC口内
は洗浄されて前記他物質XX・・・は除去され、カラム
C口内には固定化抗体Ab・・・に捕捉された被測定抗
原H3A・・・のみが残ることとなる。
Then, as shown in FIG. 1(c), the inside of the column C is washed to remove the other substances XX, and the analyte captured by the immobilized antibody Ab is inside the column C. Only antigen H3A... will remain.

そこでその状態において、同図中点線で示すように、被
酸化時において化学発光性を示す物質を含有する溶液と
酸化性を有する物質を含有する溶液との化学発光反応に
対して触媒活性を存すると共に蛋白質に対して共有結合
可能な標識剤(TCPP−M)(これについては後で詳
述する)を前記抗体Abに結合させて成る標識抗体Ab
−(TCPP−M)・・・を含有する溶液Cを前記カラ
ムC口内に流通させる。
Therefore, in that state, as shown by the dotted line in the figure, the catalytic activity exists for the chemiluminescent reaction between the solution containing the chemiluminescent substance when oxidized and the solution containing the oxidizing substance. A labeled antibody Ab obtained by binding a labeling agent (TCPP-M) (described in detail later) that can be covalently bonded to a protein together with the antibody Ab.
-(TCPP-M)... is passed through the column C inlet.

すると、第1図(ニ)に示すように、前記標識抗体含有
溶液C中の標識抗体Ab−(TCPP−M〕・・・は、
前記カラムC口内に固定化された抗体Ab・・・に補足
されている被測定抗原H3A・・・に対して抗原−抗体
反応により結合して補足され、それ以外の不要な他物質
XXX・・・は前記抗体Ab・・・には結合しないで遊
離したままの状態となる。そこでその状態において、同
図中点線で示すように、再び前記カラムC口内に洗浄溶
液Eを流通させる。
Then, as shown in FIG. 1(d), the labeled antibody Ab-(TCPP-M) in the labeled antibody-containing solution C is
The target antigen H3A... captured by the antibody Ab... immobilized in the column C is bound to and captured by the antigen-antibody reaction, and other unnecessary substances XXX... * does not bind to the antibody Ab... and remains free. In this state, the cleaning solution E is again made to flow into the column C inlet as shown by the dotted line in the figure.

すると、第1図(ホ)に示すように、前記カラムC口内
は洗浄されて、前記他物質XXX・・・は除去され、カ
ラムC口内には固定化抗体Ab・・・に捕捉された被測
定抗原H3A・・・、および、その被測定抗原H3A・
・・に捕捉された標識抗体Ab−(TCPP−M)・・
・のみが残ることとなる。そこでその状態において、同
図中点線で示すように、前記カラムC口内に解離溶液F
を流通させる。
Then, as shown in FIG. 1 (e), the inside of the column C is washed to remove the other substances XXX..., and the inside of the column C is filled with the substances captured by the immobilized antibodies Ab... Measurement antigen H3A... and its to-be-measured antigen H3A...
Labeled antibody Ab-(TCPP-M) captured by...
・Only will remain. In this state, as shown by the dotted line in the figure, dissociation solution F is added to the column C port.
be distributed.

すると、第1図(へ)に示すように、前記カラムC口内
における固定化抗体Ab・・・から被測定抗原I S 
A・・・が、また、その被測定抗原H3A・・・から標
識抗体Ab−(TCPP−M)・・・が分離されて前記
解1ii1溶液G内に溶出する。そして、その分#溶出
された被測定抗原H3A・・・および標識抗体、a、b
−(TCPP−M)・・・は、同図中点線で示すように
、前記解#溶液Fと共に、次に述べる化学発光反応系Q
へ導入供給されることになる。
Then, as shown in FIG. 1 (f), the antigen to be measured I S
A..., and the labeled antibody Ab-(TCPP-M)... is separated from the antigen to be measured H3A... and eluted into the solution G. Then, #eluted antigen to be measured H3A... and labeled antibodies, a, b
-(TCPP-M)..., as shown by the dotted line in the figure, together with the solution # solution F, the chemiluminescence reaction system Q described below.
It will be introduced and supplied to

一方、第2図(イ)に示すように、被酸化時において化
学発光性を示す物質を含有する溶液Aとしてのルミノー
ル び酸化性を有する物質を含有する溶液Bとしての過酸化
水素(H.Ot )水を、化学発光反応部Rを構成する
フローセルFcへ夫々所定量ずつ混合導入供給するよう
に構成された化学発光反応系Qに対して、解離溶液Fの
みを所定量ずつ供給し、その状態で、前記フローセルF
cから発せられる化学発光りの強度(つまり触媒非作用
時における基準化学発光強度VO)を、フォトセンサー
l。
On the other hand, as shown in FIG. 2(a), solution A containing a substance that exhibits chemiluminescence when oxidized is luminol, hydrogen peroxide (H. Ot) A predetermined amount of only the dissociation solution F is supplied to the chemiluminescence reaction system Q, which is configured to mix and supply a predetermined amount of water to each of the flow cells Fc constituting the chemiluminescence reaction section R. state, the flow cell F
The intensity of chemiluminescence emitted from c (that is, the reference chemiluminescence intensity VO when the catalyst is not activated) is measured by the photo sensor l.

アンプ2,レコーダー3等から成る化学発光強度計測手
段Sにより計測する。
Measurement is performed by a chemiluminescence intensity measuring means S consisting of an amplifier 2, a recorder 3, etc.

次に、第2図(口)〔これは前述の第1図(ホ)および
第1図(へ)の段階に相当する〕に示すように、前記化
学発光反応部Rへの解離溶液Fの供給ライン5の途中に
、前述の第1図(ホ)の状態(非測定抗原および標識抗
体捕捉状態)にある抗体固定化カラムCUを介在させた
状態で、解離溶液Fを所定量ずつ流動させることによっ
て、前記カラムCUから非測定抗原HSA・・・および
標識抗体Ab− (TCPP−M)・・・を溶出させて
前記化学発光反応系Qに対して導入供給し、その状態に
おいて、前記と同様にしてフローセルFcから発せられ
る化学発光りの強度(つまり触媒作用時における化学発
光強度V)を、前記化学発光強度計測手段で計測する。
Next, as shown in FIG. 2 (portion) [this corresponds to the steps in FIG. 1 (e) and FIG. A predetermined amount of the dissociation solution F is caused to flow through the supply line 5 with the antibody-immobilized column CU in the state shown in FIG. By this, unmeasured antigen HSA... and labeled antibody Ab-(TCPP-M)... are eluted from the column CU and introduced and supplied to the chemiluminescence reaction system Q, and in this state, the above-mentioned Similarly, the intensity of chemiluminescence emitted from the flow cell Fc (that is, chemiluminescence intensity V during catalytic action) is measured by the chemiluminescence intensity measuring means.

そして、その化学発光反応に対する触媒としての標識抗
体,a.b− (TCPP−M)・・・を化学発光反応
系Qへ供給している触媒作用時に計測された化学発光強
度Vと前記基準化学発光強度Va(ゼロライン)とを比
較することにより、つまり具体的には、第3図において
ハツチングで示す部分Sの積分値を計算して、前記サン
プル溶液り中の被測定抗原H3A・・・に対応する量の
標識抗体Ab−(TCPP−M)・・・による触媒作用
に基く総発光量を求め、その総発光量から前記サンプル
溶液り中の被測定抗原)(SA・・・の量を定量するの
である。
and a labeled antibody as a catalyst for the chemiluminescent reaction, a. By comparing the chemiluminescence intensity V measured during the catalytic action of supplying b- (TCPP-M)... to the chemiluminescence reaction system Q with the reference chemiluminescence intensity Va (zero line), that is, Specifically, the integral value of the portion S indicated by hatching in FIG. 3 is calculated, and an amount of labeled antibody Ab-(TCPP-M). The total amount of luminescence based on the catalytic action of .

なお、前記第2図(イ)、(ロ)において、Pl+P 
t、 P :+は夫々各溶液を移送するための定流量圧
送ポンプを示しており、また、M 1. M !、は夫
々混合コネクターを示している。
In addition, in the above-mentioned FIGS. 2(a) and (b), Pl+P
t, P:+ indicates a constant flow pressure pump for transferring each solution, and M1. M! , respectively indicate mixed connectors.

ところで、前記免疫性蛋白1F(この場合は抗原H3A
であるが抗体Abの場合もある)に対する標識剤(TC
PP−M)としては、化学発光反応に対して強い触媒活
性を存すること、蛋白質との共有結合が可能なようにカ
ルボキシル基またはアミノ基を有すること、化学的安定
性が高いこと、あらゆる免疫性蛋白質に対して標識でき
ること、水溶性であること、操作上安全であること、と
いった必要条件を満たすものとして、中心金属とそれに
対して強い配位能を有する配位子とから成る合成金属錯
体、即ち、第4図に掲げたようなシッフ塩基型、フタロ
シアニン型、ポルフィリン型等のうちから選択された4
座配位子と、Fe、Co。
By the way, the immune protein 1F (in this case, antigen H3A)
However, in some cases it is an antibody Ab).
PP-M) has strong catalytic activity for chemiluminescent reactions, has a carboxyl group or amino group to enable covalent bonding with proteins, has high chemical stability, and has no immunogenicity. Synthetic metal complexes consisting of a central metal and a ligand with strong coordinating ability to the central metal meet the requirements of being able to label proteins, being water-soluble, and being operationally safe. That is, 4 selected from among the Schiff base type, phthalocyanine type, porphyrin type, etc. listed in Figure 4.
Locate ligands, Fe, Co.

Pt、Pd等の8族元素のうちからi!訳された中心金
属との合成金属錯体を開発している。そして、幾多の実
験的研究の結果、5,10,15.20−テトラキス(
4−カルボキシフェニル)ポルフィンの鉄(m)if体
が、今のところ最も好適な免疫性蛋白質に対する標識剤
であることが判っている。
i from Group 8 elements such as Pt and Pd! We are developing synthetic metal complexes with translated central metals. As a result of numerous experimental studies, 5,10,15.20-tetrakis (
The iron(m)if form of 4-carboxyphenyl)porphine has been found to be the most suitable labeling agent for immune proteins at present.

なお、上記5,10,15.20−テトラキス(4−カ
ルボキシフェニル)ポルフィンの鉄(I[[)錯体は、
次のようにして合成された。
The iron (I[[) complex of 5,10,15.20-tetrakis(4-carboxyphenyl)porphine above is
It was synthesized as follows.

即ち、先ず、ピロール23.3mlとテレフタルアルデ
ヒド酸50gとをプロピオン酸1.25zに加えて30
分間還流してから室温まで冷却した後濾過して得られた
沈澱を、熱湯、蒸溜水、メタノールで洗浄して、テトラ
カルボキシフェニルポルフィンを精製する。続いて、そ
のテトラカルボキシフェニルポルフィン4.94gと酢
酸ナトリウム3.00gとを1.51の酢酸中に分散さ
せ、それに無水塩化第二鉄3.00gを加え、5時間還
流してから室温まで冷却した後濾過し、更に、酢酸、蒸
溜水で洗浄する。そして、そのようにして得られた生成
物を、0.IN−水酸化ナトリウム水溶液に溶解させて
濾過してから、0.1N−塩酸を加えてpH2として沈
澱させた後濾過乾燥させる、という操作を3回繰り返す
ことにより、前記5,10゜15.20−テトラキス(
4−カルボキシフェニル)ポルフィンの鉄(Ill)錯
体を精製するのである。
That is, first, 23.3 ml of pyrrole and 50 g of terephthalaldehyde acid were added to 1.25 z of propionic acid.
The precipitate obtained by refluxing for a minute, cooling to room temperature, and filtration is washed with boiling water, distilled water, and methanol to purify tetracarboxyphenylporphine. Subsequently, 4.94 g of the tetracarboxyphenylporphine and 3.00 g of sodium acetate were dispersed in 1.51 g of acetic acid, 3.00 g of anhydrous ferric chloride was added thereto, refluxed for 5 hours, and then cooled to room temperature. After that, it is filtered and further washed with acetic acid and distilled water. Then, the product thus obtained was mixed with 0. By repeating the operation three times of dissolving in IN-sodium hydroxide aqueous solution and filtering it, adding 0.1N-hydrochloric acid to adjust the pH to 2, and filtering and drying it, the above-mentioned 5.10°15.20 −Tetrakis (
The iron (Ill) complex of 4-carboxyphenyl)porphine is purified.

第5図は、上記第一発明方法を適用して構成された本第
二発明に係る免疫性蛋白質としての抗原の定量装置の概
略構成を示している。
FIG. 5 shows a schematic configuration of an apparatus for quantifying an antigen as an immune protein according to the second invention, which is constructed by applying the method of the first invention.

図において、■は、前記化学発光性物質含有溶液Aとし
てのルミノール溶液を化学発光反応部Rにおけるフロー
セルFcへ所定量ずつ導入供給可能に構成された第1流
路、■は、前記酸化性物質含有溶液Bとしての過酸化水
素水を前記フローセルFcへ所定量ずつ導入供給可能に
構成された第2流路であり、前記各流路1.IIには解
放型溶液タンクT+、Tzおよび溶液移送用定流量圧送
式ポンプP+、Pzが夫々設けられている。また、前記
化学発光反応部RのフローセルFcに対しては、光電子
倍増管などのフォトセンサー1.アンプ2゜レコーダー
31インチグレーター4等から成る化学発光強度計測手
段Sが設けられている。そして、残りの部分■は、前記
第2tlL路■(第1流路Iでも可)を介して前記化学
発光反応部Rへ、化学発光反応に対する触媒となる溶液
を導入供給するように構成された第3流路である。
In the figure, ■ is a first channel configured to be able to introduce and supply a predetermined amount of a luminol solution as the chemiluminescent substance-containing solution A to the flow cell Fc in the chemiluminescent reaction section R, and ■ is the oxidizing substance-containing solution. The second flow path is configured to be able to introduce and supply a predetermined amount of hydrogen peroxide solution as the containing solution B to the flow cell Fc, and the second flow path is configured to be able to introduce and supply a predetermined amount of hydrogen peroxide solution as the containing solution B to the flow cell Fc. II is provided with open type solution tanks T+, Tz and constant flow rate pumps P+, Pz for transferring the solution. In addition, for the flow cell Fc of the chemiluminescence reaction section R, a photosensor 1. such as a photomultiplier tube. A chemiluminescence intensity measuring means S consisting of an amplifier, 2° recorder, 31-inch grater 4, etc. is provided. The remaining part (2) is configured to introduce and supply a solution serving as a catalyst for the chemiluminescence reaction to the chemiluminescence reaction section R via the second tlL path (2) (the first flow path I can also be used). This is the third flow path.

即ち、前記第3流路■は、洗浄溶液Eを収容するオープ
ン型タンクT、と、その洗浄溶液Eを所定量ずつ移送す
るための定流量圧送式第1ポンプPaと、その第1ポン
プPaの下流側に位置して定容量サンプリングループに
、と吸引/吐出用注射器W1とを備えている6方コツク
から成る第1弁機構6と、その第1弁機構6に接続され
た標識抗体含有溶液Cを収容するオープン型タンクT。
That is, the third flow path (2) includes an open tank T that accommodates the cleaning solution E, a first constant flow pump Pa for transferring the cleaning solution E in predetermined amounts, and the first pump Pa. A first valve mechanism 6 consisting of a six-way valve located downstream of the 6-way valve mechanism 6 and equipped with a constant volume sampling loop and an aspiration/discharge syringe W1, and a labeled antibody containing device connected to the first valve mechanism 6 Open type tank T containing solution C.

と、前記第1弁機構6の下流側に位置して定容量サンプ
リングループにアと吸引/吐出用注射器W。
and a suction/discharge syringe W located downstream of the first valve mechanism 6 and connected to the constant volume sampling loop.

とを備えている6方コツクから成る第2弁機構7と、そ
の第2弁機構7に接続された被測定抗原を含有するサン
プル溶液りを収容するオープン型タンクT4と、前記第
2弁機構7の流出部から前記第2流路■へ至る波路の途
中に介装された排出流路9を備えた6方コツクから成る
第3弁機構8と、その第3弁機構8に接続された免疫ア
フィニティークロマトカラム(抗体固定化カラム)CL
Iと、解離溶液Fを収容するオープン型タンクT、と、
その解離溶液Fを前記第3弁機構8へ所定量ずつ移送す
るための定流量圧送式第2ポンプpbとから成り、前記
各弁機構7.8.9を夫々適宜状態に切り換える(詳し
くは第7図を用いて後で説明する)ことによって、前記
各サンプリングループに+ 、Kz内に所定量の標識抗
体含有溶液Cおよびサンプル溶液りを夫々吸引する状態
、前記サンプリングループに2内のサンプル溶液りを洗
浄溶液Eによって前記抗体固定化カラムCUへ押し流し
て導入すると共にその洗浄溶液Eによって前記抗体固定
化カラムCU内を洗浄する状態、前記サンプリングルー
プに1内の標識抗体含有溶液Cを洗浄溶液已によって前
記抗体固定化カラムCUへ押し流して導入すると共にそ
の洗浄溶液已によって前記抗体固定化カラムCU内を洗
浄する状態。
a second valve mechanism 7 consisting of a six-way valve, which is connected to the second valve mechanism 7 and which accommodates a sample solution containing the antigen to be measured; and the second valve mechanism A third valve mechanism 8 is connected to the third valve mechanism 8, which consists of a six-way cock, and a third valve mechanism 8 is provided with a discharge passage 9 interposed in the middle of the wave path leading from the outflow portion of No. Immune affinity chromatography column (antibody immobilized column) CL
I, an open tank T containing a dissociation solution F,
It consists of a constant flow rate pressure-feeding second pump pb for transferring the dissociation solution F by a predetermined amount to the third valve mechanism 8, and switches each of the valve mechanisms 7, 8, 9 to an appropriate state (for details, refer to the third valve mechanism 8). (explained later using Figure 7), a state in which a predetermined amount of the labeled antibody-containing solution C and a sample solution are sucked into each sampling loop, a predetermined amount of labeled antibody-containing solution C and a sample solution into Kz, and a sample solution in 2 into the sampling loop. A state in which the labeled antibody-containing solution C in 1 is introduced into the antibody-immobilized column CU by washing solution E and the inside of the antibody-immobilized column CU is washed with the washing solution E, and the labeled antibody-containing solution C in 1 is introduced into the sampling loop as a washing solution. A state in which the washing solution is forced into the antibody-immobilized column CU by the water, and the inside of the antibody-immobilized column CU is washed by the washing solution.

前記抗体固定化カラムCU内に解離溶液Fを流通させて
前記第2流路■内へ導入する状態等に切り替え可能に、
つまり、前記カラムCU内にサンプル溶液りを導入して
そのカラムCU内に固定化された抗体に対して前記サン
プル溶液り中の被測定抗原を抗原−抗体反応により捕捉
させてから、前記カラムCU内を洗浄して不要な他物質
を除去した後、更に、前記標識抗体含有溶液Cを前記カ
ラムCU内に導入して、前記カラムCU内に捕捉されて
いる被測定抗原に対して前記標識抗体を抗原−抗体反応
により捕捉させてから、再び前記カラムCU内を洗浄し
て不要な他物質を除去した後、前記カラムCU内に解離
溶液Fを導入して、前記カラムCU内に固定化された抗
体から前記被測定抗原と標識抗体とを分離させて前記カ
ラムCU内から溶出させ、しかる後、そのカラムCUか
ら分離溶出された被測定抗原と標識抗体とを前記化学発
光反応部Rへ導入供給可能なように構成されている。
switchable to a state in which the dissociation solution F is passed through the antibody-immobilized column CU and introduced into the second flow path (2);
That is, a sample solution is introduced into the column CU, and the antigen to be measured in the sample solution is captured by the antibody immobilized in the column CU by an antigen-antibody reaction, and then the sample solution is introduced into the column CU. After washing the inside to remove unnecessary other substances, the labeled antibody-containing solution C is further introduced into the column CU, and the labeled antibody is applied to the antigen to be measured captured in the column CU. is captured by an antigen-antibody reaction, and after washing the inside of the column CU again to remove unnecessary other substances, a dissociation solution F is introduced into the column CU to immobilize it inside the column CU. The antigen to be measured and the labeled antibody are separated from the antibody and eluted from the column CU, and then the antigen to be measured and the labeled antibody separated and eluted from the column CU are introduced into the chemiluminescent reaction section R. It is configured so that it can be supplied.

なお、前記4個の定流量圧送式ポンプP I+ P t
In addition, the four constant flow pressure pumps P I + P t
.

Pa、Pbおよび3個の弁機構6.7.8は、操作盤1
0からの措令に従って制御されるように構成されている
。また、同第5図中、M、、M、は夫々混合コネクター
を示している。
Pa, Pb and the three valve mechanisms 6.7.8 are located on the operation panel 1.
It is configured to be controlled according to the measures from 0 onwards. In addition, in FIG. 5, M, , M each indicate a mixed connector.

また、前記化学発光反応部R9第1流路■、第2流路■
および第3流路■等における配管部分は全てテフロン(
ポリ四弗化エチレン:デュポン社の商標)で構成すると
共に、配管内での試料の拡散を防止するために、全ての
配管の内径をかなり小径のもの(例えば0.5mm以下
)に構成するのが望ましい。
In addition, the chemiluminescence reaction part R9 first flow path (■) and second flow path (■)
All piping parts in the third flow path ■ etc. are made of Teflon (
Polytetrafluoroethylene (Trademark of DuPont) and to prevent the sample from diffusing inside the pipes, the inner diameter of all pipes should be quite small (e.g. 0.5 mm or less). is desirable.

第5図は、前記免疫アフィニティークロマトカラム(抗
体固定化カラム)CUの具体的構成例を示すものであり
、例えば雌ネジ部から成る配管接続部分11A、11B
とフィルタ一部材11c。
FIG. 5 shows a specific example of the structure of the immunoaffinity chromatography column (antibody-immobilized column) CU, for example, piping connection parts 11A and 11B consisting of female threads.
and filter member 11c.

11Dとを両端部に備えた筒体11の内部に、被測定抗
原に対して抗原−抗体関係にある抗体を表面に固定化し
た多数のガラスピーズ12・・・が充填されている。こ
の抗体固定化ガラスピーズ12は次のようにして調製さ
れる。即ち、多孔質のガラスピーズを、HCl、HNO
2溶液等で洗浄してから、1%濃度のT−グリシドキシ
プロピルトリメトキシシランを作用させてグリシドキシ
型ガラスピーズとし、次に、pH3のHC1溶液を作用
させてジオール型ガラスピーズとし、更に、過ヨウ素酸
ナトリウムを作用させてアルデヒド型ガラスピーズとし
、そして、そのアルデヒド型ガラスピーズに所定の抗体
を結合させてイミン型結合抗体固定化ガラスピーズとし
、それに水素化ホウ素ナトリウムを作用させて抗体固定
化ガラスピーズを生成するのである。
A large number of glass beads 12, each having an antibody in an antigen-antibody relationship with respect to the antigen to be measured, immobilized on the surface thereof, are filled inside the cylinder 11, which has 11D at both ends. The antibody-immobilized glass beads 12 are prepared as follows. That is, porous glass beads are treated with HCl, HNO
After washing with 2 solution etc., 1% concentration T-glycidoxypropyltrimethoxysilane is applied to form glycidoxy type glass beads, next, a pH 3 HC1 solution is applied to form diol type glass beads, and further , react with sodium periodate to form aldehyde-type glass beads, bind a prescribed antibody to the aldehyde-type glass beads to form imine-type bound antibody-immobilized glass beads, and react with sodium borohydride to form the antibody. This produces immobilized glass beads.

第7図(イ)、(ロ)、(ハ)、(ニ)、(ホ)。Figure 7 (a), (b), (c), (d), (e).

(へ)は、上記のように構成された抗原定量装置による
定量操作手順を説明するためのものである。
(f) is for explaining the quantitative operation procedure using the antigen quantitative determination apparatus configured as described above.

即ち、先ず、前記第3流路■における第1弁機構6およ
び第2弁機構7を第7図(イ)に示す状態として、前記
吸引/吐出用注射器W、、W、に対する吸引(引き)操
作を行い、前記サンプリングループに、、に、内に所定
量の標識抗体含有溶液Cおよびサンプル溶液りを吸入す
る。
That is, first, the first valve mechanism 6 and the second valve mechanism 7 in the third flow path (2) are put into the state shown in FIG. The operation is performed to aspirate a predetermined amount of labeled antibody-containing solution C and sample solution into the sampling loop.

次に、前記第1流路IにおけるポンプPt、第2流路■
におけるポンプP□、第3流路■における第2ポンプp
bを作動させると共に第3弁機構8を第7図(ロ)に示
す状態として、前記カラムCUへ解離溶液Fのみを供給
し、その状態において、つまり、前記化学発光反応部R
のフローセルFcに対して解S溶液Fのみを供給してい
る状態において、前記フローセルFcから発せられる化
学発光しの強度(基準化学発光強度v、)即ちゼロ点を
、前記化学発光強度計測手段Sにより計測する。
Next, the pump Pt in the first flow path I, the second flow path
Pump P □ in , second pump p in third flow path ■
b is activated and the third valve mechanism 8 is brought into the state shown in FIG. 7(b), and only the dissociation solution F is supplied to the column CU.
In a state where only solution F is supplied to the flow cell Fc, the intensity of chemiluminescence emitted from the flow cell Fc (reference chemiluminescence intensity v,), that is, the zero point, is determined by the chemiluminescence intensity measuring means S. Measured by

なお、上記第7図(イ)および第7図(ロ)に示した操
作手順は前後してもよい。
Note that the operating procedures shown in FIGS. 7(a) and 7(b) may be performed before or after the above.

続いて、前記ポンプP+ 、p、、pbを停止させる一
方前記第3流路■における第1ポンプPaを作動させる
と共に、前記第1.第2.第3弁機構6,7.8を夫々
第7図(ハ)に示す状態に切り換えて、洗浄溶液Eを前
記サンプリングループKt内を通過するように流動させ
ることにより、そのサンプリングループに8内のサンプ
ル溶液りを前記抗体固定化カラムCU内へ供給し、その
サンプル溶液り中の特定の抗原つまり被測定抗原を前記
カラムCU内に固定化された抗体に抗原−抗体反応によ
り結合捕捉させ、その後更に洗浄溶液Eを前記カラムC
U内を通過するように流動させることにより、そのカラ
五〇〇内に残存している不要な他物質を除去排出する。
Subsequently, the pumps P+, p, . Second. By switching the third valve mechanism 6, 7.8 to the state shown in FIG. 7(c) and causing the cleaning solution E to flow through the sampling loop Kt, A sample solution is supplied into the antibody-immobilized column CU, and a specific antigen in the sample solution, that is, the antigen to be measured, is bound to and captured by the antibody immobilized in the column CU by an antigen-antibody reaction, and then Furthermore, washing solution E was added to the column C.
By causing the flow to pass through the U, unnecessary other substances remaining in the chamber 500 are removed and discharged.

更に続いて、前記第1弁機構6および第2弁機構7を夫
々第7図(ニ)に示す状態に切り換えて、洗浄溶液Eを
前記サンプリングループに、内を通過するように流動さ
せることにより、そのサンプリングループに、内の標識
抗体含有溶液Cを前記抗体固定化カラ五〇〇内へ供給し
、そのカラムCU内に固定化された抗体に捕捉されてい
る被測定抗原に前記標識抗体を抗原−抗体反応により結
合捕捉させ、その後更に洗浄溶液Eを前記カラムCU内
を通過するように流動させることにより、そのカラムC
U内に残存している不要な他物質を除去排出する。
Subsequently, the first valve mechanism 6 and the second valve mechanism 7 are respectively switched to the state shown in FIG. 7(d), and the cleaning solution E is caused to flow through the sampling loop. , the labeled antibody-containing solution C in the sampling loop is supplied into the antibody immobilization column 500, and the labeled antibody is applied to the antigen to be measured captured by the antibody immobilized in the column CU. The binding is captured by an antigen-antibody reaction, and then the washing solution E is caused to flow through the column CU, thereby forming the column C.
Remove and discharge unnecessary other substances remaining in the U.

次に、前記第3流路mにおける第1ポンプPaを停止さ
せる一方前記第1流路IにおけるポンプPI+第2流路
■におけるポンプPz+第3流路■における第2ポンプ
pbを再び作動させると共に、前記第3弁機構8を第7
図(ホ)に示す状態に切り横えて、解離溶液Fを前記抗
体固定化カラムCU内を通過するように流動させること
により、そのカラムCU内における固定化抗体から被測
定抗原およびl5lli抗体を前記解離溶液F内に分離
溶出させ、その分jlI溶出した被測定抗原および標識
抗体をその解離溶液Fと共に前記化学発光反応部Rへ供
給し、その状態において、つまり、前記化学発光反応部
RのフローセルFにおいて前記標識抗体が触媒作用を発
揮している状態において、前記フローセルFから発せら
れる化学発光りの強度Vを前記計測手段Sにより計測し
、前記触媒非作用時の基準化学発光強度V、をベースと
して前記インチグレーター4により算出された総発光量
から、前記所定量のサンプル溶液り中の抗原量を定量す
るのである。
Next, the first pump Pa in the third flow path m is stopped, while the pump PI in the first flow path I, the pump Pz in the second flow path ■, and the second pump pb in the third flow path ■ are activated again. , the third valve mechanism 8 is
By passing the dissociation solution F through the antibody-immobilized column CU in the state shown in Figure (E), the antigen to be measured and the l5lli antibody are removed from the immobilized antibody in the column CU. The antigen to be measured and the labeled antibody eluted into the dissociation solution F are then supplied to the chemiluminescence reaction section R together with the dissociation solution F, and in this state, that is, the flow cell of the chemiluminescence reaction section R. In the state in which the labeled antibody exerts a catalytic action in F, the intensity V of chemiluminescence emitted from the flow cell F is measured by the measuring means S, and the reference chemiluminescence intensity V when the catalyst is not active is determined. The amount of antigen in the predetermined amount of sample solution is quantified from the total luminescence amount calculated by the inch grater 4 as a base.

そして最後に、前記ポンプP、、P、、Pbを停止させ
ると共に、前記第1弁機構6および第2弁機構7を第7
図(へ)に示す状態に切り換えて、前記各吸引/吐出用
注射器W、、W、に対する吐出(押し)操作を行い、そ
の注射器W、、W、内の標識抗体含有溶液Cおよびサン
プル溶液りを排出して次の定量に備えるのである。
Finally, the pumps P, , P, , Pb are stopped, and the first valve mechanism 6 and the second valve mechanism 7 are
Switch to the state shown in the figure (f), perform the ejection (push) operation on each of the aspiration/discharge syringes W, , W, and remove the labeled antibody-containing solution C and sample solution in the syringes W, , W. is discharged and prepared for the next quantitative determination.

次に、上記のように構成された抗原定量装置を用いて行
った試験結果について記載しておく。
Next, the results of tests conducted using the antigen quantification device configured as described above will be described.

全ての試薬は市販の特級品が用いられた。All reagents were commercially available special grade products.

■化学発光性物質含有溶液A 0.1mol/ds+”のホウ酸と0.1sol/da
”の水酸化カリウムとを含むpH10,2の緩衝溶液(
Buff−4)で希釈して、1.OX 10”’+wo
l/ds+3のルミノール溶液を調製した。
■Chemiluminescent substance-containing solution A: 0.1 mol/ds+” of boric acid and 0.1 sol/da
” potassium hydroxide and a pH 10.2 buffer solution (
Buff-4) and 1. OX 10"'+wo
A luminol solution of l/ds+3 was prepared.

■酸化性物質含有溶液B 0.3重量%の過酸化水素水を純水で希釈して5、OX
 10−’mol/ds’の過酸化水素水を調製した。
■ Oxidizing substance-containing solution B Dilute 0.3% by weight hydrogen peroxide with pure water and
A 10-'mol/ds' hydrogen peroxide solution was prepared.

■洗浄溶液E カラムCUにおける試料溶出時においてそのカラムCU
によるイオン的な試料吸着を抑制するために若干の塩化
カリウムを添加して、PH7,2の洗浄用リン酸緩衝溶
液(Buff−IT)を調整した。
■Washing solution E During sample elution in column CU, the column CU
A washing phosphate buffer solution (Buff-IT) with a pH of 7.2 was prepared by adding a small amount of potassium chloride to suppress ionic sample adsorption caused by

■標識抗体含有溶液C 前記リン酸緩衝溶液(Buff41)に被測定抗原(ヒ
ト血清アルブミン)と抗原−抗体関係にある抗ヒト血清
アルブミンを溶解させた後、ジメチルスルホキサイドに
溶解したS、tO。
■ Labeled antibody-containing solution C After dissolving the antigen to be measured (human serum albumin) and anti-human serum albumin, which has an antigen-antibody relationship, in the phosphate buffer solution (Buff 41), S, tO dissolved in dimethyl sulfoxide, .

15.20−テトラキス(4−カルボキシフェニル)ポ
ルフィンの鉄(III)if体を加え、更に、水溶性の
カルボジイミド剤を加えて反応させ、それを塩析、i3
析、ゲルクロマトグラフィーによる精製等を経て調製し
た。
15. Add the iron (III) if form of 20-tetrakis(4-carboxyphenyl)porphine, further add a water-soluble carbodiimide agent to react, salt it out, i3
It was prepared through analysis, purification by gel chromatography, etc.

■サンプル溶液り 試料抗原(ヒト血清アルブミン)を前記リン酸緩衝溶液
(Buff−II)で希釈した。
(2) Sample solution A sample antigen (human serum albumin) was diluted with the phosphate buffer solution (Buff-II).

■解離溶液F pH3,1の(H(1−K(1)溶液を用いた。■Dissociation solution F A (H(1-K(1)) solution at pH 3.1 was used.

上記の試薬を用いて試験した結果、9.4 Xl0−”
〜9.4 Xl0−@mol/da’の標識抗体につい
て直線的な検量線が得られ、また、その最低検出限界(
つまり測定悪魔)は被測定抗原換算で130pgという
優れた値が得られた。
As a result of the test using the above reagent, 9.4 Xl0-"
A linear calibration curve was obtained for the labeled antibody of ~9.4 Xl0-@mol/da', and its lowest detection limit (
In other words, an excellent value of 130 pg was obtained in terms of the antigen to be measured.

また、ひとつのサンプルについて約50分という短時間
で定量可能であった。
Furthermore, it was possible to quantify one sample in a short time of about 50 minutes.

第8図は本第二発明に係る抗原定量装置の別実施例を示
している。
FIG. 8 shows another embodiment of the antigen quantification device according to the second invention.

これは、前記第5図ないし第7図に示した装置における
前記各流路1.  If、  +[[に対する溶液移送
エネルギー源として、流体フローに脈流が生しることが
無いように、通常用いられる定流量圧送式ポンプの代わ
りに、それら各流路■、■、■に共通の調圧器ll付き
の加圧不活性ガス(例えば窒素ガス)ボンベ12を用い
ると共に、前記第1弁機構6には標識抗体含有溶液C用
のオートサンプラー13を、そして、前記第2弁機構7
には複数のオープン型タンクT4.・・・・・・・・・
T4+tに収容された複数のサンプル溶液り、・・・・
・・・・・D、lを順次自動的に切り替え供給するため
のオートサンプラー14を設け、かつ、定量に必要なほ
ぼすべての操作を自動的に行えるようにオートコントロ
ーラー15を設け、更に、前記第1流路■および第2流
路Hの途中には、それら流路!、■内の各溶液を一定の
温度に保持して化学発光反応の安定化を図るための共通
の恒温化手段16.17(例えば約25℃程度の恒温水
バスなど)を介装したものである。
This corresponds to each flow path 1 in the apparatus shown in FIGS. 5 to 7. If, + [[As a solution transfer energy source for A pressurized inert gas (for example, nitrogen gas) cylinder 12 with a pressure regulator 11 is used, an autosampler 13 for the labeled antibody-containing solution C is installed in the first valve mechanism 6, and the second valve mechanism 7
has multiple open tanks T4.・・・・・・・・・
Multiple sample solutions accommodated in T4+t,...
. . . An autosampler 14 is provided to automatically switch and supply D and L in sequence, and an autocontroller 15 is provided to automatically perform almost all operations necessary for quantitative determination. In the middle of the first flow path ■ and the second flow path H, there are flow paths! A common constant temperature means 16 and 17 (for example, a constant temperature water bath at approximately 25°C) is installed to maintain each solution in , ① at a constant temperature to stabilize the chemiluminescence reaction. be.

なお、この場合には、前記加圧不活性ガスボン゛べ12
を用いている関係から、前記化学発光性物質含:Ir溶
液A、酸化性物質含有溶液B、洗浄溶液E、解離溶液F
用の溶液タンクT + 、 T z 、 T s 、 
T hは全て密封型とされ、また、それらの溶液タンク
T、、T、、T、、T、からの流出流路には流fi調節
用ニードルバルブ付きフローメータU +、U !+ 
U s、 U hが夫々介装されている。
In this case, the pressurized inert gas cylinder 12
Since the chemiluminescent substance-containing Ir solution A, the oxidizing substance-containing solution B, the cleaning solution E, and the dissociation solution F
Solution tanks for T + , T z , T s ,
All T h are sealed, and the outflow channels from the solution tanks T, , T, , T, , T are equipped with flow meters U +, U ! with needle valves for adjusting the flow fi. +
U s and U h are interposed respectively.

また、前記標識抗体含有溶液用オートサンプラー13に
おいて、13Aは開閉切り替え弁であり、13Bは逆止
弁18および吸引ポンプ19を備えた吸引/排出流路で
ある。また、前記サンプル溶液用オートサンプラー14
において、14Aは多段切り替え弁であり、14Bは逆
止弁20および吸引ポンプ21を備えた吸引/排出流路
である。
Further, in the labeled antibody-containing solution autosampler 13, 13A is an on/off switching valve, and 13B is a suction/discharge channel equipped with a check valve 18 and a suction pump 19. In addition, the sample solution autosampler 14
, 14A is a multi-stage switching valve, and 14B is a suction/discharge channel equipped with a check valve 20 and a suction pump 21.

そして、前記4個の流量調節用ニードルバルブ付きフロ
ーメータU+ 、U z、U 3+ U a と前記3
個の弁機構6.7.8と前記両オートサンプラー13゜
14における開閉切り替え弁13A9吸引ポンプ19、
多段切り替え弁14A、吸引ポンプ21等は、前記オー
トコントローラー13により、所定のシーケンスに従っ
て自動制御されるように構成されている。その他の構成
は前述の実施例のものと同様である。
Then, the four flowmeters U+, Uz, U3+Ua with needle valves for flow rate adjustment and the three
valve mechanism 6.7.8 and the on/off switching valve 13A9 in both autosamplers 13゜14, suction pump 19,
The multi-stage switching valve 14A, the suction pump 21, etc. are configured to be automatically controlled by the autocontroller 13 according to a predetermined sequence. Other configurations are similar to those of the previous embodiment.

ところで、前記各実施例においては、化学発光性物質含
有溶液Aとしてルミノール溶液を、酸化性物質含有溶液
Bとして過酸化水素水を、そして、標識剤として5,1
0,15..20−テトラキス(4−カルボキシフェニ
ル)ポルフィンの鉄(III)錯体を夫々用いたものを
示したが、前記化学発光性物質含有溶液Aとしては、前
記ルミノールの代わりにルシゲニンやロフィンなどを、
前記酸化性物質含有溶液Bとしては、前記過酸化水素の
代わりに次亜塩素酸などを、また、前記標識剤としては
、前記5,10.15.20−テトラキス(4−カルボ
キシフェニル)ポルフィンの鉄(Ill)錯体以外の合
成金属錯体を用いてもよい。
Incidentally, in each of the above Examples, a luminol solution was used as the chemiluminescent substance-containing solution A, a hydrogen peroxide solution was used as the oxidizing substance-containing solution B, and 5,1
0,15. .. Although those using iron (III) complexes of 20-tetrakis(4-carboxyphenyl)porphine are shown, the chemiluminescent substance-containing solution A may include lucigenin, lophine, etc. instead of the luminol,
The oxidizing substance-containing solution B includes hypochlorous acid instead of the hydrogen peroxide, and the labeling agent includes the 5,10.15.20-tetrakis(4-carboxyphenyl)porphine. Synthetic metal complexes other than iron (Ill) complexes may also be used.

また、本発明方法および装置により、未知量の免疫性蛋
白質の定量を行うに際しては、それに先立つキャリブレ
ーションとして、既知量の同種の免疫性蛋白質の定量を
行っておき、その結果を比較参照するようにすれば、よ
り一層精度のよい定量を行えることは言うまでもない。
In addition, when quantifying an unknown amount of immune protein using the method and device of the present invention, it is recommended to quantitate a known amount of the same type of immune protein as a prior calibration and compare and refer to the results. Needless to say, it is possible to perform quantitative determination with even higher accuracy.

〔発明の効果〕〔Effect of the invention〕

以上詳述したところから明らかなように、本第−発明方
法に係る免疫性蛋白質の定量方法によれば、免疫アフィ
ニティークロマトカラム(抗体固定化カラム)を用いる
と共に、所謂サンドインチ法を利用して、サンプル溶液
中の被測定免疫性蛋白質とそれに対応する量の標識免疫
性蛋白質が効率良く分離溶出されるので、従来方法にお
けるように非常に煩雑で面倒な手順と長時間を−する被
測定免疫性蛋白質自体に対するバッチ的な標識操作を行
なう必要が無く、また、前記カラムに固定化された免疫
性蛋白質は反復使用が可能なため連続的な定量が可能と
なり、従って、ひとつのサンプルに対する定量時間を従
来の数十時間に比べて約50分程度という極めて短い時
間で迅速に行えるようになると共に、試薬の無駄を極め
て少なくできると共に、被測定免疫性蛋白質の種類如何
に拘わらず、感度ならびに精度良く、かつ、広い測定範
囲で定量でき、更に、従来のR1A法のように放射性同
位元素の標識剤を用いることが無く、また、前記化学発
光反応系に対する触媒として毒性が無い標識標識免疫性
蛋白質を用いるようにしているため、安全に定量操作を
行うことができる、という種々の優れた効果が発揮され
る。更にまた、本発明方法は、比較的m素で安価に構成
できる装置と安価に入手できる試薬で実施可能であり、
しかも、前述のように被測定免疫性蛋白質自体に対する
バッチ的な環mff1作という試料の前処理が不要であ
ると共に試薬の無駄も少ないので、イニシャルコストも
ランニングコストも少なくて済み、極めて経済的である
、という効果も発揮される。
As is clear from the detailed description above, the method for quantifying immune proteins according to the method of the present invention uses an immunoaffinity chromatography column (antibody-immobilized column) and the so-called sandwich method. Since the immunogenic protein to be measured and the corresponding amount of labeled immunological protein in the sample solution are efficiently separated and eluted, it is possible to separate and elute the immunogenic protein to be measured and the corresponding amount of labeled immunological protein in the sample solution. There is no need to perform batch labeling operations on the immunogenic protein itself, and the immunological protein immobilized on the column can be used repeatedly, making continuous quantification possible. Therefore, the quantification time for one sample can be reduced. can be carried out quickly in about 50 minutes compared to the conventional several tens of hours, and the waste of reagents can be extremely reduced, and the sensitivity and accuracy can be improved regardless of the type of immunological protein to be measured. A labeled immunoprotein that can be quantified easily and over a wide measurement range, does not use a radioisotope labeling agent unlike the conventional R1A method, and is nontoxic as a catalyst for the chemiluminescent reaction system. Since this method is used, various excellent effects such as safe quantitative operation can be achieved. Furthermore, the method of the present invention can be carried out with relatively inexpensive equipment and inexpensively available reagents,
Moreover, as mentioned above, there is no need for pretreatment of the sample such as batch-like circular mff production for the immunological protein to be measured itself, and there is little waste of reagents, so the initial cost and running cost are low, making it extremely economical. There is also an effect that there is.

また、上記第一発明方法を適用して構成された本第二発
明に係る免疫性蛋白質の定量装置によれば、上記第一発
明方法における優れた基本的効果がそのまま発揮される
ことは勿論、免疫アフィニティークロマトカラムと、上
記第一発明方法の手順を効率的に実施可能に構成された
切り替え弁機構を備えている第3流路を設けであるから
、非常に能率的な免疫性蛋白質の定量を行うことができ
る、という効果が発揮される。
In addition, according to the immunological protein quantification device according to the second invention, which is constructed by applying the above-mentioned first invention method, the excellent basic effects of the above-mentioned first invention method can of course be exhibited as is. Since the third channel is equipped with an immunoaffinity chromatography column and a switching valve mechanism configured to efficiently carry out the steps of the first method of the invention, it is possible to quantify immune proteins very efficiently. The effect is that it is possible to do the following.

【図面の簡単な説明】[Brief explanation of drawings]

第1図ないし第8図は本発明の実施例を示し、第1図(
イ)、(ロ)、(ハ)、(ニ)、(ホ)。 (へ)および第2図(イ)、(ロ)は本第−発明に係る
免疫性蛋白質の定量方法の手順の説明図、第3図は計測
例のグラフ、第4図(イ)、(ロ)。 (ハ)、(ニ)、(ホ)は標識剤を構成する配位子の例
を示す化学構造式、第5図は本第二発明に係る免疫性蛋
白質の定量装置の全体概略構成図、第6図は要部の拡大
縦断側面図、第7図(イ)。 (ロ)、(ハ)、(ニ)、(ホ)、(へ)はその装置に
よる定量操作手順の説明図、そして、第8図は別実施例
の免疫性蛋白質の定量装置の全体概略構成図である。 また、第9図は本発明の背景技術の説明図を示している
。 A・・・・・・・・・・・・化学発光性物質含有溶液、
B・・・・・・・・・酸化性物質含有溶液、C・・・・
・・・・・標識抗体含有溶液、D・・・・・・・・・被
測定免疫性蛋白質を含有するサンプル溶液、E・・−・
・・・・・洗浄溶液、F・・・・・・・・・・・・解離
溶液、vo・・・・・・・・・基準化学発光強度、■・
・・・・・・・・化学発光強度、Q・・・・・・・・・
・・・化学発光反応系、R・・・・・・・・・化学発光
反応部、I・・・・・・・・・・・・第1流路、■・・
・・・・・・・第2流路、■・・・・・・・・・第3流
路、■・・・・・・・・・・・・第4流路、CU・・・
・・・・・・・・・免疫アフィニティークロマトカラム
(抗体固定化カラム)、S・・・・・・・・・・・・化
学発光強度計測手段、6,7.8・・・・・・・・・弁
機構、12・・・・・・・・・加圧不活性ガスボンベ、
16.IT・・・・・・・・・恒温化手段。 第1図(イ) 第1図(ロ) 第1図(ハ) (iJ (a、、4I−iff(1,]第7図(へ) m(13遼陶 第9図
1 to 8 show embodiments of the present invention, and FIG. 1 (
A), (B), (C), (D), (E). (f) and FIGS. 2(a) and (b) are explanatory diagrams of the procedure of the immunological protein quantification method according to the present invention, FIG. 3 is a graph of a measurement example, and FIGS. 4(a) and (b). B). (C), (D), and (E) are chemical structural formulas showing examples of ligands constituting the labeling agent; FIG. 5 is an overall schematic diagram of the immunological protein quantification device according to the second invention; Figure 6 is an enlarged vertical side view of the main part, and Figure 7 (a). (B), (C), (D), (E), and (F) are explanatory diagrams of the quantitative operation procedure using the device, and FIG. 8 is the overall schematic configuration of the immune protein quantification device of another example. It is a diagram. Further, FIG. 9 shows an explanatory diagram of the background art of the present invention. A: chemiluminescent substance-containing solution,
B......Oxidizing substance-containing solution, C...
... Labeled antibody-containing solution, D ... Sample solution containing the immunological protein to be measured, E ...
・・・・・・Washing solution, F・・・・・・・・・Dissociation solution, vo・・・・・・Reference chemiluminescence intensity, ■・
・・・・・・Chemiluminescence intensity, Q・・・・・・・・・
...Chemiluminescence reaction system, R...Chemiluminescence reaction section, I...First channel, ■...
......Second flow path, ■...Third flow path, ■...Fourth flow path, CU...
・・・・・・・・・Immune affinity chromatography column (antibody immobilized column), S・・・・・・・・・Chemiluminescence intensity measuring means, 6,7.8・・・・・・... Valve mechanism, 12... Pressurized inert gas cylinder,
16. IT・・・・・・・・・Method for constant temperature. Figure 1 (a) Figure 1 (b) Figure 1 (c) (iJ (a,, 4I-iff(1,) Figure 7 (f) m (13 Liao Tou Figure 9

Claims (7)

【特許請求の範囲】[Claims] (1)サンプル溶液中の免疫性蛋白質の量を測定する方
法であって、 被測定免疫性蛋白質に対して抗原−抗体関係にある免疫
性蛋白質を固定化した免疫アフィニティークロマトカラ
ム内に被測定免疫性蛋白質を含有するサンプル溶液を導
入して、前記カラム内に固定化された免疫性蛋白質に対
して前記被測定免疫性蛋白質を抗原−抗体反応により捕
捉させてから、前記カラム内を洗浄して不要な他物質を
除去した後、 更に、被酸化時において化学発光性を示す物質を含有す
る溶液と酸化性を有する物質を含有する溶液との化学発
光反応に対して触媒活性を有すると共に蛋白質に対して
共有結合可能な標識剤を前記被測定免疫性蛋白質に対し
て抗原−抗体関係にある免疫性蛋白質に結合させて成る
標識免疫性蛋白質を含有する溶液を前記カラム内に導入
して、前記カラム内に捕捉されている被測定免疫性蛋白
質に対して前記標識免疫性蛋白質を抗原−抗体反応によ
り捕捉させてから、 再び前記カラム内を洗浄して不要な他物質を除去した後
、 前記カラム内に解離溶液を導入して、前記カラム内に固
定化された免疫性蛋白質から前記被測定免疫性蛋白質と
標識免疫性蛋白質とを分離させて前記カラム内から溶出
させ、 しかる後、前記カラムから分離溶出された被測定免疫性
蛋白質と標識免疫性蛋白質とを前記化学発光反応系へ導
入供給して、その状態において、前記標識免疫性蛋白質
(標識抗体)の触媒作用により励起される前記化学発光
反応系からの化学発光強度を計測することにより、前記
サンプル溶液中の免疫性蛋白質の量を測定する、 という手順によることを特徴とする免疫性蛋白質の定量
方法。
(1) A method for measuring the amount of immune protein in a sample solution, in which the immune protein to be measured is placed in an immunoaffinity chromatography column on which an immunological protein that has an antigen-antibody relationship with the immune protein to be measured is immobilized. Introducing a sample solution containing a reactive protein and causing the immune protein to be measured to be captured by an antigen-antibody reaction against the immune protein immobilized within the column, and then washing the inside of the column. After removing unnecessary other substances, it is further added that it has catalytic activity for the chemiluminescent reaction between a solution containing a substance that shows chemiluminescence when oxidized and a solution that contains a substance that has oxidizing properties, and also has a catalytic activity on proteins. A solution containing a labeled immunological protein prepared by binding a labeling agent that can be covalently bonded to an immunological protein that has an antigen-antibody relationship with the immunological protein to be measured is introduced into the column. After the labeled immunological protein is captured by an antigen-antibody reaction against the immunogenic protein to be measured captured in the column, the inside of the column is washed again to remove unnecessary other substances, and then the column is removed. A dissociation solution is introduced into the column to separate the immunological protein to be measured and the labeled immunological protein from the immunological protein immobilized within the column and elute them from the column, and then from the column. The separated and eluted immune protein to be measured and the labeled immune protein are introduced and supplied to the chemiluminescence reaction system, and in this state, the chemiluminescence is excited by the catalytic action of the labeled immune protein (labeled antibody). A method for quantifying an immune protein, comprising: measuring the amount of the immune protein in the sample solution by measuring the chemiluminescence intensity from the reaction system.
(2)前記被測定免疫性蛋白質に対して抗原−抗体関係
にある免疫性蛋白質に対する標識剤として、シッフ塩基
型、フタロシアニン型、ポルフィリン型等のうちから選
択された4座配位子と、Fe、Co、Pt、Pd等の8
族元素のうちから選択された中心金属との合成金属錯体
を用いる特許請求の範囲第(1)項に記載の免疫性蛋白
質の定量方法。
(2) As a labeling agent for the immunological protein that has an antigen-antibody relationship with the immunological protein to be measured, a tetradentate ligand selected from Schiff base type, phthalocyanine type, porphyrin type, etc.; , Co, Pt, Pd, etc. 8
The method for quantifying an immune protein according to claim (1), which uses a synthetic metal complex with a central metal selected from group elements.
(3)前記被測定免疫性蛋白質に対して抗原−抗体関係
にある免疫性蛋白質に対する標識剤として、5,10,
15,20−テトラキス(4−カルボキシフェニル)ポ
ルフィンの鉄(III)錯体を用いる特許請求の範囲第(
1)項または第(2)項に記載の免疫性蛋白質の定量方
法。
(3) As a labeling agent for an immunological protein that has an antigen-antibody relationship with the immunological protein to be measured,
Claim No.
The method for quantifying an immune protein according to item 1) or item (2).
(4)サンプル溶液中の免疫性蛋白質の量を測定する装
置であって、 被酸化時において化学発光性を示す物質を含有する溶液
を化学発光反応部へ所定量ずつ導入供給可能に構成され
た第1流路と、酸化性を有する物質を含有する溶液を前
記化学発光反応部へ所定量ずつ導入供給可能に構成され
た第2流路と、前記化学発光反応部から発せられる化学
発光の強度を計測する化学発光強度計測手段とを設ける
と共に、被測定免疫性蛋白質に対して抗原−抗体関係に
ある免疫性蛋白質を固定化した免疫アフィニティークロ
マトカラム、および、そのカラム内に被測定免疫性蛋白
質を含有するサンプル溶液を導入する状態と、そのカラ
ム内に洗浄溶液を導入する状態と、そのカラム内に化学
発光反応に対して触媒活性を有すると共に蛋白質に対し
て共有結合可能な標識剤を前記被測定免疫性蛋白質に対
して抗原−抗体関係にある免疫性蛋白質に結合させて成
る標識免疫性蛋白質を含有する溶液を導入する状態と、
そのカラム内に解離溶液を導入する状態とに切り替え可
能な弁機構を備えていて、前記カラム内にサンプル溶液
を導入してそのカラム内に固定化された免疫性蛋白質に
対して前記サンプル溶液中の被測定免疫性蛋白質を抗原
−抗体反応により捕捉させてから、前記カラム内を洗浄
して不要な他物質を除去した後、更に、前記標識免疫性
蛋白質含有溶液を前記カラム内に導入して、前記カラム
内に捕捉されている被測定免疫性蛋白質に対して前記標
識免疫性蛋白質を抗原−抗体反応により捕捉させてから
、再び前記カラム内を洗浄して不要な他物質を除去した
後、前記カラム内に解離溶液を導入して、前記カラム内
に固定化された免疫性蛋白質から前記被測定免疫性蛋白
質と標識免疫性蛋白質とを分離させて前記カラム内から
溶出させ、しかる後、前記カラムから分離溶出された被
測定免疫性蛋白質と標識免疫性蛋白質とを前記化学発光
反応系へ導入供給可能なように構成された第3流路を設
けてあることを特徴とする免疫性蛋白質の定量装置。
(4) A device for measuring the amount of immune protein in a sample solution, which is configured to be able to introduce and supply a predetermined amount of a solution containing a substance that exhibits chemiluminescence when oxidized to a chemiluminescent reaction section. a first channel; a second channel configured to be able to introduce and supply a solution containing an oxidizing substance in a predetermined amount to the chemiluminescent reaction section; and an intensity of chemiluminescence emitted from the chemiluminescent reaction section. an immunoaffinity chromatography column on which an immunological protein having an antigen-antibody relationship with the immunological protein to be measured is immobilized; A state in which a sample solution containing a molecule is introduced, a washing solution is introduced into the column, and a labeling agent having catalytic activity for a chemiluminescent reaction and capable of covalently bonding to a protein is introduced into the column. introducing a solution containing a labeled immunological protein bound to an immunological protein in an antigen-antibody relationship with respect to the immunological protein to be measured;
It is equipped with a valve mechanism that can be switched between a state in which a dissociation solution is introduced into the column, and a state in which a sample solution is introduced into the column and the immune protein immobilized in the column is injected into the sample solution. After the immunogenic protein to be measured is captured by an antigen-antibody reaction, the inside of the column is washed to remove unnecessary substances, and then the labeled immunological protein-containing solution is introduced into the column. , after capturing the labeled immune protein to the immunogenic protein to be measured captured in the column through an antigen-antibody reaction, and after washing the inside of the column again to remove unnecessary other substances, A dissociation solution is introduced into the column to separate the immunological protein to be measured and the labeled immunological protein from the immunological protein immobilized within the column and elute them from the column; A third flow path configured to introduce and supply the immunological protein to be measured and the labeled immunological protein separated and eluted from the column to the chemiluminescent reaction system is provided. Quantitative device.
(5)前記第1流路および第2流路の途中に恒温化手段
を介装してある特許請求の範囲第(4)項に記載の免疫
性蛋白質の定量装置。
(5) The immunological protein quantification device according to claim (4), further comprising a constant temperature means interposed between the first flow path and the second flow path.
(6)前記第1流路および第2流路における溶液移送用
エネルギー源として加圧不活性ガスボンベを用いている
特許請求の範囲第(4)項または第(5)項に記載の免
疫性蛋白質の定量装置。
(6) The immune protein according to claim (4) or (5), wherein a pressurized inert gas cylinder is used as an energy source for transferring the solution in the first channel and the second channel. quantitative device.
(7)前記化学発光反応部、第1流路、第2流路、およ
び第3流路等における配管部分を全て ポリ四弗化エチレン製としてある特許請求 の範囲第(4)項ないし第(6)項の何れかに記載の免
疫性蛋白質の定量装置。
(7) All piping parts in the chemiluminescent reaction section, the first flow path, the second flow path, the third flow path, etc. are made of polytetrafluoroethylene. 6) The immunological protein quantification device according to any one of paragraphs 6) to 6).
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS63187157A (en) * 1987-01-30 1988-08-02 Mitsubishi Kasei Corp Measurement of antigen-antibody reaction
JPH01254868A (en) * 1988-04-05 1989-10-11 Eiji Ishikawa Method of measuring antigen material with extra-high sensitivity
JPH0273158A (en) * 1988-09-08 1990-03-13 Internatl Reagents Corp Measuring method for material in sample
JPH02198361A (en) * 1989-01-28 1990-08-06 Eiji Ishikawa Quick and highly sensitive measuring method
JP2007531862A (en) * 2003-12-31 2007-11-08 カウンシル オブ サイエンティフィク アンド インダストリアル リサーチ Methods and kits for pesticide analysis

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS63187157A (en) * 1987-01-30 1988-08-02 Mitsubishi Kasei Corp Measurement of antigen-antibody reaction
JPH01254868A (en) * 1988-04-05 1989-10-11 Eiji Ishikawa Method of measuring antigen material with extra-high sensitivity
JPH0273158A (en) * 1988-09-08 1990-03-13 Internatl Reagents Corp Measuring method for material in sample
JPH02198361A (en) * 1989-01-28 1990-08-06 Eiji Ishikawa Quick and highly sensitive measuring method
JP2007531862A (en) * 2003-12-31 2007-11-08 カウンシル オブ サイエンティフィク アンド インダストリアル リサーチ Methods and kits for pesticide analysis

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