JPS61177988A - α‐アミラーゼの熱安定化 - Google Patents
α‐アミラーゼの熱安定化Info
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- JPS61177988A JPS61177988A JP61016021A JP1602186A JPS61177988A JP S61177988 A JPS61177988 A JP S61177988A JP 61016021 A JP61016021 A JP 61016021A JP 1602186 A JP1602186 A JP 1602186A JP S61177988 A JPS61177988 A JP S61177988A
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- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
殿粉の液化中のうすめ剤（ｔｈｉｎｎｉｎｇ ａｇｅｎ
ｔ）として熱安定性α−アミラーゼの使用は砂糖甘味料
の製造において極めて重要である。殿粉物質の酵素的液
化は望ましくない副生成物の生成を減じ、そしてまた塩
の低レベルの使用を可能にし、このことは、最終グルコ
ースシロップ中の塩の高レベルにはイオン交換樹脂によ
るその除去に対する追加の製造コストが含まれるために
望ましい。昇温下で殿粉を液化するためのα−アミラー
ゼの如き酵素の有用性は、熱にさらすとその非可逆的変
性を起こすために、主に酵素の熱安定性に依存する。
ｔ）として熱安定性α−アミラーゼの使用は砂糖甘味料
の製造において極めて重要である。殿粉物質の酵素的液
化は望ましくない副生成物の生成を減じ、そしてまた塩
の低レベルの使用を可能にし、このことは、最終グルコ
ースシロップ中の塩の高レベルにはイオン交換樹脂によ
るその除去に対する追加の製造コストが含まれるために
望ましい。昇温下で殿粉を液化するためのα−アミラー
ゼの如き酵素の有用性は、熱にさらすとその非可逆的変
性を起こすために、主に酵素の熱安定性に依存する。
この変性は生物触媒活性の完全な損失をもたらす。
好熱性微生物から得られる熱安定性α−アミラーゼが殿
粉を含む物質を殿粉水解物に加水分解、液化及び／また
は転化するために用いられていた。
粉を含む物質を殿粉水解物に加水分解、液化及び／また
は転化するために用いられていた。
例えば米国特許Ｈ３，６５４，０８１号及び同第３．９
１２，５９０号にはバチルス・リケニホルミス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ） ｇのバ
クテリアによって産生された熱安定性α−アミラーゼを
用いて高温での殿粉の液化が記載されている。
１２，５９０号にはバチルス・リケニホルミス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ） ｇのバ
クテリアによって産生された熱安定性α−アミラーゼを
用いて高温での殿粉の液化が記載されている。
多くの市販のα−アミラーゼ製品はバクテリア源、例え
ば枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ）、バ
チルス・リケニホルミス、バチルス・ステアロセルモフ
イｈス（Ｂ、 ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ
）、バチルス・コアギユランス（Ｂ、 ｃｏａｇｕｌａ
ｎｓ）から得られる。菌・カビ類（ｆｕｎｇａｌ）のα
−アミラーゼは、このものが一般に熱安定性酵素とみな
されないために、高温での殿粉の液化において極めて限
定された適用範囲しか有していない。
ば枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ）、バ
チルス・リケニホルミス、バチルス・ステアロセルモフ
イｈス（Ｂ、 ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ
）、バチルス・コアギユランス（Ｂ、 ｃｏａｇｕｌａ
ｎｓ）から得られる。菌・カビ類（ｆｕｎｇａｌ）のα
−アミラーゼは、このものが一般に熱安定性酵素とみな
されないために、高温での殿粉の液化において極めて限
定された適用範囲しか有していない。
殿粉の酵素的液化は通常殿粉の酵素加水分解への容易さ
を増すために昇温下で行われる。上記の生物触媒活性の
損失は液化工程に好ましい昇温下で熱安定性α−アミラ
ーゼを用いても起こり得る。
を増すために昇温下で行われる。上記の生物触媒活性の
損失は液化工程に好ましい昇温下で熱安定性α−アミラ
ーゼを用いても起こり得る。
従って、その熱安定性を増加させるために、酵素に安定
剤を加える。かくして、ウォーラーシュタイン（Ｗａｌ
Ｉｅｒｓｔｅｉｎ）による米国特許第９０５゜０２９
号において、酵素法による殿粉の高温糖化は殿粉を含む
媒質に硫鍍カルシウムの添加によって高められることが
開示されている。α−アミラーゼを熱安定性にするため
にカルシウムイオンの使用が当該分野において一般に認
められているが、しかし、殿粉に塩を添加することに関
連した上記の問題の如き成る欠点を有する。
剤を加える。かくして、ウォーラーシュタイン（Ｗａｌ
Ｉｅｒｓｔｅｉｎ）による米国特許第９０５゜０２９
号において、酵素法による殿粉の高温糖化は殿粉を含む
媒質に硫鍍カルシウムの添加によって高められることが
開示されている。α−アミラーゼを熱安定性にするため
にカルシウムイオンの使用が当該分野において一般に認
められているが、しかし、殿粉に塩を添加することに関
連した上記の問題の如き成る欠点を有する。
極〈最近、米国特許第３，６５４，０８１号において、
好ましくは成るα−アミラーゼを含む水性殿粉スラリー
にカルシウム及び／またはナトリウム塩を添加すること
により、殿粉を容易に且つ完全に液化し得ることが開示
されている。
好ましくは成るα−アミラーゼを含む水性殿粉スラリー
にカルシウム及び／またはナトリウム塩を添加すること
により、殿粉を容易に且つ完全に液化し得ることが開示
されている。
米国特許第３，９１２．５９０号において、水性殿粉懸
濁液をバチルス・リケニホルミス杼から得られたα−ア
ミラーゼによって昇温下で処理することからなる殿粉の
組合わせた液化及びうすめに対する方法が開示されてい
る。
濁液をバチルス・リケニホルミス杼から得られたα−ア
ミラーゼによって昇温下で処理することからなる殿粉の
組合わせた液化及びうすめに対する方法が開示されてい
る。
米国特許第４．２８４．７２２号はバチルスｅステアロ
セルモフィルス種の細菌に由来する熱及び酸安定性α−
アミラーゼを特許請求している。
セルモフィルス種の細菌に由来する熱及び酸安定性α−
アミラーゼを特許請求している。
ベイズ（Ｐａｃｅ）等はジャーナル・オプ・パイオロジ
カに一ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏ
−１ｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）において、リ
ゾチームの熱及びグアニジン塩酸塩変性を、天然のリゾ
チームの活性部位に特異的に結合するトＩＪ−Ｎ−アセ
チルグルコースアミンの種々な濃度で研究し、そしてそ
の存在が熱及びグアニジン塩酸塩変性に対して蛋白質の
容易に認め得る安定性をもたらすことを報告している。
カに一ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏ
−１ｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）において、リ
ゾチームの熱及びグアニジン塩酸塩変性を、天然のリゾ
チームの活性部位に特異的に結合するトＩＪ−Ｎ−アセ
チルグルコースアミンの種々な濃度で研究し、そしてそ
の存在が熱及びグアニジン塩酸塩変性に対して蛋白質の
容易に認め得る安定性をもたらすことを報告している。
塩素イオンをα−アミラーゼの水溶液に加え、これによ
シ成る程度熱安定性を与えることが見出されたが、るる
る添加の主な目的はｐＨ値の調節である。
シ成る程度熱安定性を与えることが見出されたが、るる
る添加の主な目的はｐＨ値の調節である。
米国特許第４．４９７．８６７号において、カルシウム
イオン並びにホルメート、アセテート、グロピオネート
及びその混合物からなる群よシ選ばれる水溶性カルボキ
シレートを酵素の溶液に添加することからなるサブティ
リジン・カールスベルグ（Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ Ｃａ
ｒｌｓｂｅｒｇ）によるグロテアーゼの保存中の貯蔵寿
命を増す方法が開示されている。
イオン並びにホルメート、アセテート、グロピオネート
及びその混合物からなる群よシ選ばれる水溶性カルボキ
シレートを酵素の溶液に添加することからなるサブティ
リジン・カールスベルグ（Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ Ｃａ
ｒｌｓｂｅｒｇ）によるグロテアーゼの保存中の貯蔵寿
命を増す方法が開示されている。
米国特許＠４，３１８，８１８号には、ａ）洗浄表面活
性剤０〜約７５％： ｂ）純粋な酵素、好ましくは蛋白質分解性酵素的０．０
２５〜約１０％： Ｃ）低分子量の第一または第ニアルコール０％〜約６０
％； ｄ）短鎖長のカルボン酸塩、好ましくはギ酸塩約０．１
％〜約１０％： ｅ）カルシウムイオン０．１〜１０ｍＭ／ｌにするため
に十分な量の可溶性カルシウム塩；及び ｆ）残シは水 からなる安定化された水性酵素組成物を開示している。
性剤０〜約７５％： ｂ）純粋な酵素、好ましくは蛋白質分解性酵素的０．０
２５〜約１０％： Ｃ）低分子量の第一または第ニアルコール０％〜約６０
％； ｄ）短鎖長のカルボン酸塩、好ましくはギ酸塩約０．１
％〜約１０％： ｅ）カルシウムイオン０．１〜１０ｍＭ／ｌにするため
に十分な量の可溶性カルシウム塩；及び ｆ）残シは水 からなる安定化された水性酵素組成物を開示している。
典型的な市販用の操作においては、殿粉を熱安定性α−
アミラーゼを用いて、８０℃〜約１１０℃の温度範囲及
びｐＨ値６以上で液化する。一般に、昇温下で酵素を更
に安定化するために、カルシウム塩（５０−１５０ｐｐ
ｍ Ｃａ＋十）ｔ−加える。
アミラーゼを用いて、８０℃〜約１１０℃の温度範囲及
びｐＨ値６以上で液化する。一般に、昇温下で酵素を更
に安定化するために、カルシウム塩（５０−１５０ｐｐ
ｍ Ｃａ＋十）ｔ−加える。
殿粉の酵素的液化に対するこれらの条件には３つの欠点
がある。第一に、ｐＨ（ｌ ６．０以上及び８０℃また
はこれ以上の温度で殿粉の加水分解は続いての転化工程
の際にマルトースの生成において生ずる殿粉の還元基の
異性化を促進し、最終グルコース収率の減少を引き起こ
す。第二に１続いての果糖への転化に対してグルコース
を生成させるための液化した殿粉の糖化に用いる最適ｐ
Ｈ値は一般にアスペルギルス属（Ａｓｐｅｓｇｉ １ｌ
ｕｓ）タイプのグルコアミラーゼに対しては約４．５、
そしてクモノスカビ３％（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）タイプの
酵素に対しては約５．０である。かくして、殿粉をｐＨ
値６．０またはこれ以上で液化する場合、グルコアミラ
ーゼを用いて糖化を行う前にｐＨ値を降下させなけ゛れ
ばならない。このｐＨＩ’ｉ！調節は酸の添加のために
、生ずるグルコースシロップの塩含有量を増加させ、従
って過剰量の塩を除去するために必要なイオン交換樹脂
に対する経費を増加させる。ｐＨ値６．０またはこれ以
下で行う液化に対しては、更にカルシウムイオン（約ｓ
ｏ ｏ ｐｐｍまで）を加え危ければならない。この
ことは、グルコースイソメラーゼを用いる高果糖トウモ
ロコシシロップの製造に使用する場合、殿粉の糖化によ
って生成したグルコースシロップから加え九カルシウム
イオンの完全な除去を困難にする。
がある。第一に、ｐＨ（ｌ ６．０以上及び８０℃また
はこれ以上の温度で殿粉の加水分解は続いての転化工程
の際にマルトースの生成において生ずる殿粉の還元基の
異性化を促進し、最終グルコース収率の減少を引き起こ
す。第二に１続いての果糖への転化に対してグルコース
を生成させるための液化した殿粉の糖化に用いる最適ｐ
Ｈ値は一般にアスペルギルス属（Ａｓｐｅｓｇｉ １ｌ
ｕｓ）タイプのグルコアミラーゼに対しては約４．５、
そしてクモノスカビ３％（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）タイプの
酵素に対しては約５．０である。かくして、殿粉をｐＨ
値６．０またはこれ以上で液化する場合、グルコアミラ
ーゼを用いて糖化を行う前にｐＨ値を降下させなけ゛れ
ばならない。このｐＨＩ’ｉ！調節は酸の添加のために
、生ずるグルコースシロップの塩含有量を増加させ、従
って過剰量の塩を除去するために必要なイオン交換樹脂
に対する経費を増加させる。ｐＨ値６．０またはこれ以
下で行う液化に対しては、更にカルシウムイオン（約ｓ
ｏ ｏ ｐｐｍまで）を加え危ければならない。この
ことは、グルコースイソメラーゼを用いる高果糖トウモ
ロコシシロップの製造に使用する場合、殿粉の糖化によ
って生成したグルコースシロップから加え九カルシウム
イオンの完全な除去を困難にする。
水溶液中のα−アミラーゼの熱安定性を増す新規な方法
を提供することが望ましく、そして該方法を提供するこ
とが本発明の一目的である。更に本発明の目的はこの方
法によって製造した安定化されたα−アミラーゼ組成物
を提供することである０ 更に本発明の目的は、カルシウムイオンを加える必要が
なく、そしてカルシウムの低レベル（２５〜５０ｐｐｍ
）で殿粉を液化するために使用し得るかかる組成物を提
供することである。
を提供することが望ましく、そして該方法を提供するこ
とが本発明の一目的である。更に本発明の目的はこの方
法によって製造した安定化されたα−アミラーゼ組成物
を提供することである０ 更に本発明の目的は、カルシウムイオンを加える必要が
なく、そしてカルシウムの低レベル（２５〜５０ｐｐｍ
）で殿粉を液化するために使用し得るかかる組成物を提
供することである。
他の目的はｐＨ値５．０程度の低さで殿粉の高温液化に
使用し得るかかる組成物を提供することである。
使用し得るかかる組成物を提供することである。
本発明はバクテリア性α−アミラーゼの熱安定性を増す
方法である。本方法にはα−アミラーゼの水溶液に安定
化量の両親媒性物質（ａｍｐｈｉｐｈｉ−Ｉｅ）を加え
ることがら々る。また本発明にはこの方法によって安定
化されたα−アミラーゼ溶液及び殿粉の液化におけるそ
の用途が含まれる。
方法である。本方法にはα−アミラーゼの水溶液に安定
化量の両親媒性物質（ａｍｐｈｉｐｈｉ−Ｉｅ）を加え
ることがら々る。また本発明にはこの方法によって安定
化されたα−アミラーゼ溶液及び殿粉の液化におけるそ
の用途が含まれる。
本発明において有用なα−アミラーゼは、細胞外酵素を
晴生させるために適当な微生物を栄養増殖媒質中で培養
することによって製造される。両親媒性物寅安定化剤を
バイオマス（ｂｉｏｍａｓｓ）の除去または酵素溶液の
濃縮前または後に加えることができる。しかしながら、
典型的な実験においては、微生物細胞を普通の方法、例
えば遠心分離によって、デカンテーション及び／または
濾過によってα−アミラーゼを含む媒質から除去する。
晴生させるために適当な微生物を栄養増殖媒質中で培養
することによって製造される。両親媒性物寅安定化剤を
バイオマス（ｂｉｏｍａｓｓ）の除去または酵素溶液の
濃縮前または後に加えることができる。しかしながら、
典型的な実験においては、微生物細胞を普通の方法、例
えば遠心分離によって、デカンテーション及び／または
濾過によってα−アミラーゼを含む媒質から除去する。
次にＦ液を、所望の活性レベルを有する酵素の水溶液を
得るために、限外濾過及び真空蒸発を用いて濃縮する。
得るために、限外濾過及び真空蒸発を用いて濃縮する。
この溶液が好ましくは本発明の方法によって安定化され
た溶液である。
た溶液である。
α−アミラーゼ溶液の熱安定性の増加はこの溶液に両親
媒性物質の安定化する量を添加することによって達成さ
れる。両親媒性物質なる用語は有極性（水浴性）のヘッ
ド（ｈｅａｄ）及び非有極性（非水溶性）のテイル（ｔ
ａｉｌ）を有する分子またはイオンを意味する。加えて
、両親媒性物質はそれ自体溶解反応を示すために各末端
に対して十分に大きくなければならない。両親媒性物質
の一般的桝造式を次に示す： 蟲 式中、Ｘは有極性またはイオン性基、例えばＣＯＯ−１
ＮＨ，＋、０）ＩＸ８０．＝、５ｏ３＝またはＣ０ＮＨ
。
媒性物質の安定化する量を添加することによって達成さ
れる。両親媒性物質なる用語は有極性（水浴性）のヘッ
ド（ｈｅａｄ）及び非有極性（非水溶性）のテイル（ｔ
ａｉｌ）を有する分子またはイオンを意味する。加えて
、両親媒性物質はそれ自体溶解反応を示すために各末端
に対して十分に大きくなければならない。両親媒性物質
の一般的桝造式を次に示す： 蟲 式中、Ｘは有極性またはイオン性基、例えばＣＯＯ−１
ＮＨ，＋、０）ＩＸ８０．＝、５ｏ３＝またはＣ０ＮＨ
。
、を表わし、そして几は非有極性部分である。かくして
、異なる群の両親媒性物質がα−アミラーゼの熱安定性
に寄与する際に有用であるものとして考えられる。有用
な両親媒性物ケの例はアルコール類、例、ｔはエチルア
ルコール、フロビルアルコール、フチルアルコール、ベ
ンジルアルコール；アミン類、例えばベンジルアミン、
ブチルアミン、エチルアミン、ヘキシルアミン；及びア
ミド類、例えばブチルアミド、アセトアミド、フェニル
アセトアミド、ベンズアミドである。いかに本発明を操
作するかの特定の理論を見出す意図はないが、靜↑に気
的及び疎水性相互反応のために、両親媒性物質がα−ア
ミラーゼの熱安定性に寄与するものと思われる。好まし
い具体例においては、両親媒性物質のイオン性基はイオ
ン性部分が式％式％ 式中、ＲはＨまたは炭素原子２〜１４個を含む脂肪族も
しくは芳香族基である、 によって表わされるカルボキシレートである。更に詳細
には、Ｒはメチル、エチル、ｎ−もしくはイソプロピル
、ｎ−もしくはイソブチル、フェニルまたは置換された
フェニルであることができる。
、異なる群の両親媒性物質がα−アミラーゼの熱安定性
に寄与する際に有用であるものとして考えられる。有用
な両親媒性物ケの例はアルコール類、例、ｔはエチルア
ルコール、フロビルアルコール、フチルアルコール、ベ
ンジルアルコール；アミン類、例えばベンジルアミン、
ブチルアミン、エチルアミン、ヘキシルアミン；及びア
ミド類、例えばブチルアミド、アセトアミド、フェニル
アセトアミド、ベンズアミドである。いかに本発明を操
作するかの特定の理論を見出す意図はないが、靜↑に気
的及び疎水性相互反応のために、両親媒性物質がα−ア
ミラーゼの熱安定性に寄与するものと思われる。好まし
い具体例においては、両親媒性物質のイオン性基はイオ
ン性部分が式％式％ 式中、ＲはＨまたは炭素原子２〜１４個を含む脂肪族も
しくは芳香族基である、 によって表わされるカルボキシレートである。更に詳細
には、Ｒはメチル、エチル、ｎ−もしくはイソプロピル
、ｎ−もしくはイソブチル、フェニルまたは置換された
フェニルであることができる。
カルボキシレートを含む両親媒性物質を対応するカルボ
ン酸の形態でα−アミラーゼの水溶液に導入することが
できるが、しかし、酸塩の溶解性を増加させるために、
対応するカルボン酸の塩、例えばナトリウムまたはカル
シウム塩を用いることが好ましい。
ン酸の形態でα−アミラーゼの水溶液に導入することが
できるが、しかし、酸塩の溶解性を増加させるために、
対応するカルボン酸の塩、例えばナトリウムまたはカル
シウム塩を用いることが好ましい。
典型的にはそのすｌ−ＩＪウム塩型におけるカルボキシ
レートイオンをα−アミラーゼの水溶液に安定化せ、即
ち、顕著な程度に熱不活性化に対して酵素の耐性を増加
させる量として加える。市販のα−アミラーゼ調製物の
分析により、該調製物は実施例ＩＫ示した如く測定した
ＭＷＵで表現して酵素活性の１００万単位当りアセテー
トイオン０．０２ｆまでを含有し得ることが示された。
レートイオンをα−アミラーゼの水溶液に安定化せ、即
ち、顕著な程度に熱不活性化に対して酵素の耐性を増加
させる量として加える。市販のα−アミラーゼ調製物の
分析により、該調製物は実施例ＩＫ示した如く測定した
ＭＷＵで表現して酵素活性の１００万単位当りアセテー
トイオン０．０２ｆまでを含有し得ることが示された。
多分、アセテートイオンの存在はｐＨ値調節のための酢
酸の添加による結果であり、この低濃度における存在は
α−アミラーゼに意味のある熱安定性を与えるためには
不十分である。典型的には、アセテートの濃度は、計算
目的のためのα−アミラーゼに対して５８゜０００ダル
トンの分子量を用いて、α−アミラーゼｌモを当りアセ
テート少なくとも約Ｚ８９Ｘ１０”モルであるべきであ
る。この値は酵素活性１００万単位当シアセテー）０．
２４Ｆに対応する。酵素の有効な安定化に必要な他の両
親媒性物質の最少レベルは用いる特定の物質に応じて変
わるであろうが、しかし、実験せずに容易に決定するこ
とができる。
酸の添加による結果であり、この低濃度における存在は
α−アミラーゼに意味のある熱安定性を与えるためには
不十分である。典型的には、アセテートの濃度は、計算
目的のためのα−アミラーゼに対して５８゜０００ダル
トンの分子量を用いて、α−アミラーゼｌモを当りアセ
テート少なくとも約Ｚ８９Ｘ１０”モルであるべきであ
る。この値は酵素活性１００万単位当シアセテー）０．
２４Ｆに対応する。酵素の有効な安定化に必要な他の両
親媒性物質の最少レベルは用いる特定の物質に応じて変
わるであろうが、しかし、実験せずに容易に決定するこ
とができる。
安定化剤としてアセテートを用いる場合、安定化された
α−アミラーゼ調製物の製造はアセテートイオンのナト
リウム塩をα−アミラーゼの水性濃厚液に、１７０，０
００−１８０，０００ＭＷＵ／ｄ活性を有する酵素濃厚
液１００ｍ１に対して酢酸ナトリウム１（ｌの最終濃度
になるように加えることによって典型的に行われる。他
の具体例においては、両親媒性物質対α−アミラーゼの
当量比を与えるために十分な今において、α−アミラー
ゼの添加前または４Ｋ １両親媒性物質を殿粉に加える
。
α−アミラーゼ調製物の製造はアセテートイオンのナト
リウム塩をα−アミラーゼの水性濃厚液に、１７０，０
００−１８０，０００ＭＷＵ／ｄ活性を有する酵素濃厚
液１００ｍ１に対して酢酸ナトリウム１（ｌの最終濃度
になるように加えることによって典型的に行われる。他
の具体例においては、両親媒性物質対α−アミラーゼの
当量比を与えるために十分な今において、α−アミラー
ゼの添加前または４Ｋ １両親媒性物質を殿粉に加える
。
本発明を実行する方法を以下の実施例によって更に説明
する。
する。
実施例１
α−アミラーゼの試料を適当な栄養増殖媒質中でバチル
ス・リケニホルミスの突然変異種（ブダペスト条約に基
きＡＴＣＣ５３３７６として書記されている）を培養す
ることによって調製した。発酵後、微生物細胞を普通の
方法によって、溶液中で細廁外酵素を残して除去した。
ス・リケニホルミスの突然変異種（ブダペスト条約に基
きＡＴＣＣ５３３７６として書記されている）を培養す
ることによって調製した。発酵後、微生物細胞を普通の
方法によって、溶液中で細廁外酵素を残して除去した。
次１１Ｃ溶液を含む酵素を限外濾過及び真空蒸発を用い
て、３４０，００ｏ−３６０，ＯＯＯＭＷＵ／ｒ ［
：モデイファイド・ウォルゲムート単位（１％ｄｏｄｉ
ｆｉｅｄ ＷｏｈｌｇｅｍｕｔｈＵｎｉｔ）、／ｆ〕
の所望の活性レベルに濃縮した。
て、３４０，００ｏ−３６０，ＯＯＯＭＷＵ／ｒ ［
：モデイファイド・ウォルゲムート単位（１％ｄｏｄｉ
ｆｉｅｄ ＷｏｈｌｇｅｍｕｔｈＵｎｉｔ）、／ｆ〕
の所望の活性レベルに濃縮した。
α−アミラーゼ活性を、殿粉−ヨウ素錯体の實色相当還
元を用いて、可溶性殿粉の加水分奪を決定することによ
って測定した。典型的な実験においては、ｐＨ簀５．４
【緩衝した２％可溶性曖今５ｍｌ及び水４ｄを適当に希
釈ｔ７た酵素１ｍｌと共に、４０℃に保持された水浴中
で培養した。時間を定めた間隔で（酵素の添加から５〜
３０分間）、被検体１ｍを取り出し、希釈ヨウ素溶液５
＃ｌを含む管に注入し、転倒によって混合した。次に発
色した色をヘリッジ（Ｈｅ Ｉ Ｉ ｉｇｅ ’）社製
、ヘリッジ崖６００−ＤＡ昼光比色照明器で比較し、反
応終点の接近及びモディファイド・ウォルゲムート単位
として監視した酵素活性を監視した。１モデイフアイド
・ウォルゲムート単位（ＭＷＵ）は次の式を用いて、分
析条件下で３０分以内に可溶性殿粉ｌｄを定められた１
色値に糊槽化する活性である：式中、］００＝各培養混
合物中の殿粉のダ数３０＝定義された糊稍化時間、分 ′ｒ＝終点に到達するために必要な時 間、分 Ｗ＝希釈酵素被検体１ｍｌの培椿混合 物に加えた酵素゛の電通、？ 酢酸ナトリウム（ＣＨ８ＣＯＯＮａ）を、溶液のｐ。
元を用いて、可溶性殿粉の加水分奪を決定することによ
って測定した。典型的な実験においては、ｐＨ簀５．４
【緩衝した２％可溶性曖今５ｍｌ及び水４ｄを適当に希
釈ｔ７た酵素１ｍｌと共に、４０℃に保持された水浴中
で培養した。時間を定めた間隔で（酵素の添加から５〜
３０分間）、被検体１ｍを取り出し、希釈ヨウ素溶液５
＃ｌを含む管に注入し、転倒によって混合した。次に発
色した色をヘリッジ（Ｈｅ Ｉ Ｉ ｉｇｅ ’）社製
、ヘリッジ崖６００−ＤＡ昼光比色照明器で比較し、反
応終点の接近及びモディファイド・ウォルゲムート単位
として監視した酵素活性を監視した。１モデイフアイド
・ウォルゲムート単位（ＭＷＵ）は次の式を用いて、分
析条件下で３０分以内に可溶性殿粉ｌｄを定められた１
色値に糊槽化する活性である：式中、］００＝各培養混
合物中の殿粉のダ数３０＝定義された糊稍化時間、分 ′ｒ＝終点に到達するために必要な時 間、分 Ｗ＝希釈酵素被検体１ｍｌの培椿混合 物に加えた酵素゛の電通、？ 酢酸ナトリウム（ＣＨ８ＣＯＯＮａ）を、溶液のｐ。
値を５．８に保持しながら、適当に希釈した（３４０．
０００Ｍ’ｖ’／Ｕ／ｍ −−−１７００ＭＷＵ／ａｚ
または蛋白ＩＮＯ，２〜／ｌ’）酵素溶液に種々な槍で
加えた。各溶液の酵素活性をすでに述べた如くして測定
した。次に酵素溶液を９０℃に１０分間加熱した。加熱
後、酢酸ナトリウムの添加がα−アミラーゼの熱安定性
にいかなる効果がめったかを調べるために、活性を再び
測定した。酢酸ナトリウムの朴々なレベルに対するこの
実願結果を第１表に示した。
０００Ｍ’ｖ’／Ｕ／ｍ −−−１７００ＭＷＵ／ａｚ
または蛋白ＩＮＯ，２〜／ｌ’）酵素溶液に種々な槍で
加えた。各溶液の酵素活性をすでに述べた如くして測定
した。次に酵素溶液を９０℃に１０分間加熱した。加熱
後、酢酸ナトリウムの添加がα−アミラーゼの熱安定性
にいかなる効果がめったかを調べるために、活性を再び
測定した。酢酸ナトリウムの朴々なレベルに対するこの
実願結果を第１表に示した。
第１表
α−アミラーゼの熱安定性における
酢ａＮａ ｔ／酵素 活性（ＭｗＵ／ａｇ）活性１０
０万単位 室 温 加熱後 残存活性％対照 ０
１７１４ ０ ００．２３５
１５７ｇ ２３１ １２．７０．４７ １
７１４ ２８６ １５．７２．３５ １７１４
８３７ ４６．０４．７０ １８１８ ７３
５ ４０．４１１．７５ １８１８ ５２２
２８．７第１表から、酢酸ナトリウム型としてアセ
テートイオンの添加はα−アミラーゼの熱安定性を高め
ることを決定することができる。更に、認められた安定
化は酵素活性１００万単位当り酢酸Ｎａ最大２．．３５
ｆまでのアセテートａ度増加によって増加し、この濃度
レベルで、熱安定性は再び降下した。
０万単位 室 温 加熱後 残存活性％対照 ０
１７１４ ０ ００．２３５
１５７ｇ ２３１ １２．７０．４７ １
７１４ ２８６ １５．７２．３５ １７１４
８３７ ４６．０４．７０ １８１８ ７３
５ ４０．４１１．７５ １８１８ ５２２
２８．７第１表から、酢酸ナトリウム型としてアセ
テートイオンの添加はα−アミラーゼの熱安定性を高め
ることを決定することができる。更に、認められた安定
化は酵素活性１００万単位当り酢酸Ｎａ最大２．．３５
ｆまでのアセテートａ度増加によって増加し、この濃度
レベルで、熱安定性は再び降下した。
実施例２
モノカルボン酸のナトリウム塩、例えばギ酸ナトリウム
（ｌ（ＣＯＯＮａ）、酢酸ナトリウム（ＣＨ。
（ｌ（ＣＯＯＮａ）、酢酸ナトリウム（ＣＨ。
Ｃ００Ｎａ） 、プロピオン酸ナトリウＡ （ＣＨ３Ｃ
Ｈ。
Ｈ。
Ｃ００Ｎａ）及び酪酸ナトリウＡ （ＣＨ３ＣＨ，ＣＨ
，Ｃ００Ｎａ）を蛋白質４Ｑｍｐ／ｍを含む酵素溶液（
α−アミラーゼ活性３４０，０００ＭＷＵ／ａｚ ）に
最終濃度１．２２Ｍまで加えた。
，Ｃ００Ｎａ）を蛋白質４Ｑｍｐ／ｍを含む酵素溶液（
α−アミラーゼ活性３４０，０００ＭＷＵ／ａｚ ）に
最終濃度１．２２Ｍまで加えた。
適当な希釈後（ＩＸｌｏｏ）、酵素溶液、ｐ）１値５，
８、を９５℃に加熱し、酵素の熱安定性を加熱後Ｋｍ々
な間隔で、希釈した酵素の残存活性を決定することによ
って測定した。５０％不活性化を起こすために必要な時
間（半減期ｔに）を培養時間に対する百分率残存活性の
対数プロットから計算した。この計算結果を第１図に示
した。第１図から、α−アミラーゼの熱安定化において
、脂肪族鎖長の増加による効果を知ることができる。
８、を９５℃に加熱し、酵素の熱安定性を加熱後Ｋｍ々
な間隔で、希釈した酵素の残存活性を決定することによ
って測定した。５０％不活性化を起こすために必要な時
間（半減期ｔに）を培養時間に対する百分率残存活性の
対数プロットから計算した。この計算結果を第１図に示
した。第１図から、α−アミラーゼの熱安定化において
、脂肪族鎖長の増加による効果を知ることができる。
脂肪族鎖長の増加は、９５℃、ｐＨ値５．８での水溶液
中の酵素の熱安定性の増大において比列的増加をもたら
した。酵素の熱安定化は次の順序に従った： ホルメートくアセテートくプロピオネート〈ブチレート
。
中の酵素の熱安定性の増大において比列的増加をもたら
した。酵素の熱安定化は次の順序に従った： ホルメートくアセテートくプロピオネート〈ブチレート
。
９５℃、ｐＨ値５．８でホルメート処理した酵素の半減
期は、同一条件下での対照の１．８分と比較して、６．
３分であった。しかしながら、ホルメートにおける水素
に対して非有極性メチル基の導入により、酵素の熱安定
性に顕著な増加を起こした（半減期＝１０．５分）。更
にアルキル鎖の長さの搏加は試験条件下で酵素の半減期
において最少増加のみをもたらした（１．４分／ＣＨ２
基）。かぐして、非有極性脂肪族鎖（テイル）及び有極
性カルボキシレート基（ヘッド）を含む化合物は高温で
の変性から酵素を保護することを知ることができた。
期は、同一条件下での対照の１．８分と比較して、６．
３分であった。しかしながら、ホルメートにおける水素
に対して非有極性メチル基の導入により、酵素の熱安定
性に顕著な増加を起こした（半減期＝１０．５分）。更
にアルキル鎖の長さの搏加は試験条件下で酵素の半減期
において最少増加のみをもたらした（１．４分／ＣＨ２
基）。かぐして、非有極性脂肪族鎖（テイル）及び有極
性カルボキシレート基（ヘッド）を含む化合物は高温で
の変性から酵素を保護することを知ることができた。
実施例３
本実験においては、また非有極性芳香族基を含む有機酸
を試験した。安息香酸ナトリウム（ＣａＨｓＣＯＯＮａ
）、フェニル酢酸ナトリウム（Ｃ，Ｈ，ＣＨ２Ｃ００Ｎ
ａ）、ブエニルプロピオン酸ナトリウム（Ｃ，Ｈ，ＣＨ
，ＣＨ，Ｃ００Ｎａ）及びジフェニル酢酸すトリウム（
Ｃ，２Ｈ，。ＣＨＣＯＯＮａ）を酵素溶液（蛋白’ＩＩ
４０ ｍ９ ／ ａ／、α７ ミ、、−ゼ活性、３４
０，０００ＭＷＵ／−／’）に最終濃度１．２２Ｍまで
加えた。またこれらの芳香族酸は９５℃、ｐＨ値５．８
でα−アミラーゼの熱安定性に著し込増加をもたらした
。
を試験した。安息香酸ナトリウム（ＣａＨｓＣＯＯＮａ
）、フェニル酢酸ナトリウム（Ｃ，Ｈ，ＣＨ２Ｃ００Ｎ
ａ）、ブエニルプロピオン酸ナトリウム（Ｃ，Ｈ，ＣＨ
，ＣＨ，Ｃ００Ｎａ）及びジフェニル酢酸すトリウム（
Ｃ，２Ｈ，。ＣＨＣＯＯＮａ）を酵素溶液（蛋白’ＩＩ
４０ ｍ９ ／ ａ／、α７ ミ、、−ゼ活性、３４
０，０００ＭＷＵ／−／’）に最終濃度１．２２Ｍまで
加えた。またこれらの芳香族酸は９５℃、ｐＨ値５．８
でα−アミラーゼの熱安定性に著し込増加をもたらした
。
この実験結果を第２表に要約した；この表から、安息香
酸は試験した芳香族カルボン酸の中で安定化に対して最
小値を示し、一方ジフェニル酢酸アニオンは最大値を示
すことがわかった。
酸は試験した芳香族カルボン酸の中で安定化に対して最
小値を示し、一方ジフェニル酢酸アニオンは最大値を示
すことがわかった。
第２表
９５℃、ｐＨ値５．８でα−アミラーゼの熱安定化にお
ける非有極性芳香族基を含むカルボン酸塩の影響 半減期９５℃、 ナトリウム塩 構 造 式 ｐ）ｉ値５．８対
照 １．８分実施例４ 酢酸ナトリウム塩ム白質４０■／ｄを含むα−アミラー
ゼ濃厚液（α−アミラーゼ活性、３４０゜０００ ＭＷ
Ｕ／−ｚ）に最終濃度１．２２Ｍ（１０％ｗ ／ ｖ
）まで加えた。次に水酸化ナトリウムを用いて、酵素水
溶液のｐＨ値を５．０，５．６．６．０１７．０．８．
０及び９．０に調節した。３０分後、酵素を更に希釈し
く Ｉ ＸＩ ００倍）、種々な時間間隔で９５℃に加
熱し、残存酵素活性を測定した。
ける非有極性芳香族基を含むカルボン酸塩の影響 半減期９５℃、 ナトリウム塩 構 造 式 ｐ）ｉ値５．８対
照 １．８分実施例４ 酢酸ナトリウム塩ム白質４０■／ｄを含むα−アミラー
ゼ濃厚液（α−アミラーゼ活性、３４０゜０００ ＭＷ
Ｕ／−ｚ）に最終濃度１．２２Ｍ（１０％ｗ ／ ｖ
）まで加えた。次に水酸化ナトリウムを用いて、酵素水
溶液のｐＨ値を５．０，５．６．６．０１７．０．８．
０及び９．０に調節した。３０分後、酵素を更に希釈し
く Ｉ ＸＩ ００倍）、種々な時間間隔で９５℃に加
熱し、残存酵素活性を測定した。
ｐＨ値５．０及び５．５で、熱安定性を８５℃にて測定
した。比較するために、酢酸ナトリウムの不存在下にお
ける酵素の熱安定化に関するｐＨ値の影響を測定した。
した。比較するために、酢酸ナトリウムの不存在下にお
ける酵素の熱安定化に関するｐＨ値の影響を測定した。
実験結果を第３表に示した。
第３表
α−アミラーゼの熱安定化における
ｐＨ値の影響
８５℃ ｐＨ５，０１−１，５分 ３分ｐＨ５
，５６分 ２５分 ９５℃ ｐＨ６３分 １２分 ｐＨ７６分 １９分 ｐＨ８１１分 ３０分 ｐＨ９１５分 ２３分 上記の結果かられかるすぐれた特色は次のことを示す： １） カルボン酸基及び脂肪族または芳香族の非有極性
残基を含む両親媒性物質によるα−アミラーゼの処理は
酵素の熱安定性において著しい増加をもたらし； ２） 非有極性基の鎖長の増加は熱安定性を増加させ； ３） 芳香族残基は脂肪族残基よシもより大きな効果を
有する。
，５６分 ２５分 ９５℃ ｐＨ６３分 １２分 ｐＨ７６分 １９分 ｐＨ８１１分 ３０分 ｐＨ９１５分 ２３分 上記の結果かられかるすぐれた特色は次のことを示す： １） カルボン酸基及び脂肪族または芳香族の非有極性
残基を含む両親媒性物質によるα−アミラーゼの処理は
酵素の熱安定性において著しい増加をもたらし； ２） 非有極性基の鎖長の増加は熱安定性を増加させ； ３） 芳香族残基は脂肪族残基よシもより大きな効果を
有する。
本発明の特許権請求の可能性は特定の機構忙基づくもの
ではないが、認められる安定化効果忙必要な本質的な構
造は、酵素の有極性官能基によって不活性化する有極性
ヘッド及び非有極性炭化水素ティル（脂肪族または芳香
族）からなることによって示された実験的証拠から明白
である。また炭化水素テイルは周シの水分子から酵素分
子の成る範囲を保護する場合もあり得る０これは酵素分
子に熱変性に対する構造的耐性のために必要な堅さを与
える。ホルメートイオン（ＨＣＯＯ’″′″）は酢酸、
プロピオン酸または酪酸によって与えられるアニオンよ
シもかなり効果が少ないことが認められた。
ではないが、認められる安定化効果忙必要な本質的な構
造は、酵素の有極性官能基によって不活性化する有極性
ヘッド及び非有極性炭化水素ティル（脂肪族または芳香
族）からなることによって示された実験的証拠から明白
である。また炭化水素テイルは周シの水分子から酵素分
子の成る範囲を保護する場合もあり得る０これは酵素分
子に熱変性に対する構造的耐性のために必要な堅さを与
える。ホルメートイオン（ＨＣＯＯ’″′″）は酢酸、
プロピオン酸または酪酸によって与えられるアニオンよ
シもかなり効果が少ないことが認められた。
ホルメートアニオンにおける水素とバルク（ｂｕｌｋ）
中の水との相互作用は酵素及びアニオン間の相互作用を
弱める傾向にあシ、一方、アセテ−）Ｋおけるメチル基
は、熱安定化エネルギーにおける著しい増加を示して、
蛋白質の隣接疎水性側鎖と相互作用し得る。試験した芳
香族アニオンの中で安息香酸が最も有効性に乏しいＣカ
ルボキシル基及びベンゼン環間の結合の二重結合の性質
が、酵素分子の有極性残基との相互作用に対して、カル
ボ中シレートイオンの適応性を限定し得ることが可能で
ある。加えたカルボン酸塩によるα−アミラーゼの熱安
定性を増加させるための追加の安定化自由エネルギーを
計算し、第４表に示した。
中の水との相互作用は酵素及びアニオン間の相互作用を
弱める傾向にあシ、一方、アセテ−）Ｋおけるメチル基
は、熱安定化エネルギーにおける著しい増加を示して、
蛋白質の隣接疎水性側鎖と相互作用し得る。試験した芳
香族アニオンの中で安息香酸が最も有効性に乏しいＣカ
ルボキシル基及びベンゼン環間の結合の二重結合の性質
が、酵素分子の有極性残基との相互作用に対して、カル
ボ中シレートイオンの適応性を限定し得ることが可能で
ある。加えたカルボン酸塩によるα−アミラーゼの熱安
定性を増加させるための追加の安定化自由エネルギーを
計算し、第４表に示した。
９５℃、ｐＨ値５．８でα−アミラーゼの安定化におけ
る非極性脂肪族及び芳香族ｔ’Ａ ｔＸＩＩ２／ｖ２
° （−ΔＧ°）ｂｌ、８ １ ０ ）ＩＣＯＯＮａ ６−３ ａ５
０．９ＣＨ，ＣＯＯＮａ １０．５ ５．８
１．３ＣＨ，ＣＨ，ＣＯＯＮａ １１．９
６．６ １．４ＣＨ５ＣＨ，ＣＨ，ＣＯＯＮ
ａ １３．３ ７．４ １．５ａ＝加えた配位
子による相対安定化 ｂ＝安定化自由エネルギーは−ＲＴｌｎＦで示され、こ
こに Ｔ＝３６８Ｋ Ｆ＝相対安定化因子 Ｒ−気体定数、１．９８７力ロリー１モル／度ｔＷ０＝
配位子の不存在下における半減期第４表により、α−ア
ミラーゼにカルボン酸塩の添加はこの酵素の半減期を増
加させるものと決定づけることができる。加えた化合物
の存在下におけるｔＨ対その不存在下における（ｔ’＋
４’）比として示される相対安定化因子はカルボン酸の
鎖長増加に伴なって増加する。この相対安定化因子はΔ
Ｇ“＝−ＲＴｌｎＦ の関係を用いて、追加の安定化自
由エネルギーに変えることができる：ことに、Ｔは酵素
を加熱する温度（０Ｋ）であり、几は気体定数であり、
そしてＦは相対安定化因子である。
る非極性脂肪族及び芳香族ｔ’Ａ ｔＸＩＩ２／ｖ２
° （−ΔＧ°）ｂｌ、８ １ ０ ）ＩＣＯＯＮａ ６−３ ａ５
０．９ＣＨ，ＣＯＯＮａ １０．５ ５．８
１．３ＣＨ，ＣＨ，ＣＯＯＮａ １１．９
６．６ １．４ＣＨ５ＣＨ，ＣＨ，ＣＯＯＮ
ａ １３．３ ７．４ １．５ａ＝加えた配位
子による相対安定化 ｂ＝安定化自由エネルギーは−ＲＴｌｎＦで示され、こ
こに Ｔ＝３６８Ｋ Ｆ＝相対安定化因子 Ｒ−気体定数、１．９８７力ロリー１モル／度ｔＷ０＝
配位子の不存在下における半減期第４表により、α−ア
ミラーゼにカルボン酸塩の添加はこの酵素の半減期を増
加させるものと決定づけることができる。加えた化合物
の存在下におけるｔＨ対その不存在下における（ｔ’＋
４’）比として示される相対安定化因子はカルボン酸の
鎖長増加に伴なって増加する。この相対安定化因子はΔ
Ｇ“＝−ＲＴｌｎＦ の関係を用いて、追加の安定化自
由エネルギーに変えることができる：ことに、Ｔは酵素
を加熱する温度（０Ｋ）であり、几は気体定数であり、
そしてＦは相対安定化因子である。
ホルメートは“０．９ＫＣａｌ／ｍｏｌの安定化自由エ
ネルギーを与える。これは酵素の正に帯電した基との静
電的相互作用を介して主に生ずるものと考えられ、その
効果は主にエントロピーであり、帯電した基による水分
子の相互作用の解放に起因する。
ネルギーを与える。これは酵素の正に帯電した基との静
電的相互作用を介して主に生ずるものと考えられ、その
効果は主にエントロピーであり、帯電した基による水分
子の相互作用の解放に起因する。
ブチル基（ブチレートにおける）に起因する約０、６
Ｋ Ｃａ ｌ／ｉｎｏ Ｉによる追加の安定化は強化さ
れた疎水性相互作用から生じ、これはまた主として自由
エネルギーに対するエントロピー寄与を有する。鎖長の
影響が増加し、芳香族環は、これらが最適相互作用部位
に対して相互作用する分子を向は得る意味で、相互作用
における非常に静かな反応相手である。いずれの場合に
おいても、相互作用は（弱いが）静電的及び疎水性成分
によって特異的であると思われる。個々の相互作用によ
って与え得るよりも大きな安定化を与え得ることは協同
相互作用である。高温で長期間不活性を保持するため、
或いは高温露出に耐えるために、間隔領域において、必
ずしも活性部位に限らず、酵素配座の強制を助ける全て
の同様な領域において、有効な分子が酵素と相互作用す
ることが示された。
Ｋ Ｃａ ｌ／ｉｎｏ Ｉによる追加の安定化は強化さ
れた疎水性相互作用から生じ、これはまた主として自由
エネルギーに対するエントロピー寄与を有する。鎖長の
影響が増加し、芳香族環は、これらが最適相互作用部位
に対して相互作用する分子を向は得る意味で、相互作用
における非常に静かな反応相手である。いずれの場合に
おいても、相互作用は（弱いが）静電的及び疎水性成分
によって特異的であると思われる。個々の相互作用によ
って与え得るよりも大きな安定化を与え得ることは協同
相互作用である。高温で長期間不活性を保持するため、
或いは高温露出に耐えるために、間隔領域において、必
ずしも活性部位に限らず、酵素配座の強制を助ける全て
の同様な領域において、有効な分子が酵素と相互作用す
ることが示された。
表面の相互作用は決定されないが、ペンダント非極性基
の強化作用は相互作用の内部移行を示す。
の強化作用は相互作用の内部移行を示す。
実施例５
本発明の方法によって安定化されたα−アミラーゼは、
マルト−デキストリンの製造及びグルコアミラーゼを用
いる続いてのグルコースの製造において、殿粉の液化及
び転化に対して殊に適している。本実施例においては、
米国特許第八６５４゜０８１号に記載された熱安定性α
−アミラーゼを用いて、殿粉を液化するために高温ジェ
ット・クツキング法（ｊｅｔ ｃｏｏｋｉｎｇ ｐｒｏ
ｃｅｓｓ）を用いた。典型的な実験においては、トウモ
ロコシ殿粉６０ポンドを水３３ｔに懸濁させ、３５〜３
７％Ｄ８Ｂの殿粉濃度にし、酢酸を用いてｐＨ値を５．
０に調節した。１７０．０００ ＭＷＵ／ｙ （タカ
ーサーＡ （Ｔａｋａ−Ｔｈｅｒｍ） Ｌ−１７０）
活性を有する酢酸ナトリウム１０％で調製物化したタ
カーケーエ■（Ｔａｋａ−Ｔｈｅｒｍ”） ％’Ｅ定ユ
。−アＳ ？−ゼを０．０５％乾燥固体基準（ＤＳＢ）
で加えた。
マルト−デキストリンの製造及びグルコアミラーゼを用
いる続いてのグルコースの製造において、殿粉の液化及
び転化に対して殊に適している。本実施例においては、
米国特許第八６５４゜０８１号に記載された熱安定性α
−アミラーゼを用いて、殿粉を液化するために高温ジェ
ット・クツキング法（ｊｅｔ ｃｏｏｋｉｎｇ ｐｒｏ
ｃｅｓｓ）を用いた。典型的な実験においては、トウモ
ロコシ殿粉６０ポンドを水３３ｔに懸濁させ、３５〜３
７％Ｄ８Ｂの殿粉濃度にし、酢酸を用いてｐＨ値を５．
０に調節した。１７０．０００ ＭＷＵ／ｙ （タカ
ーサーＡ （Ｔａｋａ−Ｔｈｅｒｍ） Ｌ−１７０）
活性を有する酢酸ナトリウム１０％で調製物化したタ
カーケーエ■（Ｔａｋａ−Ｔｈｅｒｍ”） ％’Ｅ定ユ
。−アＳ ？−ゼを０．０５％乾燥固体基準（ＤＳＢ）
で加えた。
次に殿粉スラリーをパイロット・プラント・スチーム・
ジェット・クツカー（ｐｉｌｏｔ ｐｌａｎｔｓｔｅａ
ｍ ｊｅｔ ｃｏｏｋｅｒ）中にて１４０℃で１５秒間
ゼラチン化した。ゼラチン化した殿粉を９５℃に保持さ
れた温度調節した容器中に直接吹き込んだ−５殿粉１０
０ｆ当り２０，４００ＭＷＵの総濃度にするために０．
１０％ＤＳＢタカーサームＬ−１７０．０００（１０％
酢酸ナトリウムで調製物化したもの）を添加した後、液
化を２０分間続行し、次［８５℃に冷却した。次に殿粉
を平均１２０分間８５℃に保持した。液化期間中、標準
滴定法を用いてデキストロース当ｔ（ＤＥ）を追跡した
。
ジェット・クツカー（ｐｉｌｏｔ ｐｌａｎｔｓｔｅａ
ｍ ｊｅｔ ｃｏｏｋｅｒ）中にて１４０℃で１５秒間
ゼラチン化した。ゼラチン化した殿粉を９５℃に保持さ
れた温度調節した容器中に直接吹き込んだ−５殿粉１０
０ｆ当り２０，４００ＭＷＵの総濃度にするために０．
１０％ＤＳＢタカーサームＬ−１７０．０００（１０％
酢酸ナトリウムで調製物化したもの）を添加した後、液
化を２０分間続行し、次［８５℃に冷却した。次に殿粉
を平均１２０分間８５℃に保持した。液化期間中、標準
滴定法を用いてデキストロース当ｔ（ＤＥ）を追跡した
。
上記の実験をタカーサームＬ−１７０を用いて、加えた
カルシウム］ ５０ ｐＧｍ の存在下においてｐＨ値
６．５で、そしてｐＨ値５．０でカルシウム５ＱＱ ｐ
ｐｍ の存在下においてくり返し行った。
カルシウム］ ５０ ｐＧｍ の存在下においてｐＨ値
６．５で、そしてｐＨ値５．０でカルシウム５ＱＱ ｐ
ｐｍ の存在下においてくり返し行った。
いずれの場合にも殿粉の逆変化は認められなかった。そ
の結果を次のＷＪ５表に示した：表中、「スピン残渣」
なる用語は遠心分離後に回収した未加水分解殿粉を示す
。
の結果を次のＷＪ５表に示した：表中、「スピン残渣」
なる用語は遠心分離後に回収した未加水分解殿粉を示す
。
第５表に要約した結果は、アセテートを加えなかったα
−アミラーゼの使用と比較して、アセテート安定化した
α−アミラーゼは液化した殿粉においてより大きなりＢ
に達することを示している。
−アミラーゼの使用と比較して、アセテート安定化した
α−アミラーゼは液化した殿粉においてより大きなりＢ
に達することを示している。
アセテートの添加は殿粉構造の酵素的液化中にカルシウ
ムの代シをするのみならず、また低ｐＨ値で殿粉を液化
することを可能にする。
ムの代シをするのみならず、また低ｐＨ値で殿粉を液化
することを可能にする。
実施例６
ＦＩ仝粉を液化する際の高温ジェット・クツキング法（
１２０〜１４０℃で１５秒）に加えて、スコツト（Ｓｃ
ｏｔ）等による米国特許第３，９１２，５９０号に記載
された低温ジェット・クツキング法（１０５〜１０７℃
で３〜５分）に従って、殿粉を液化した。典型的な実験
においては、トウモロコシ殿粉７０ポンドを水５９／、
に懸濁させ、酢酸を用いてｐＨ！Ｗを５．ＯＫ調節した
。酢酸す） ＩＪウムＩＯＸで調製物化したタカーサー
ムＬ−１７０゜０００ ＭＷＵ／ｍ を加、ｔて最終
濃度０．１５％ＤＳＢ（２０，４００ＭＷＵ／１００ｆ
殿紛）にした。９素を含む殿粉スラリーを１０５〜１０
７℃に保持されたスチーム・ジェット・クツカーに通し
、この温度に３〜５分間保持した。ゼラチン化後、殿粉
を９５℃に保持された温度調節容器中に吹き込み、液化
を２時間続行した。他の実験においては、殿粉の液化を
加えたカルシウム５０ ｐｐｍの存在下においてｐＨ値
６．３〜６．５で（ｐＨ値を水酸化ナトリウムを用いて
調節した）行った。次１ｃＤＥ進行を比較し、第６表に
示した。
１２０〜１４０℃で１５秒）に加えて、スコツト（Ｓｃ
ｏｔ）等による米国特許第３，９１２，５９０号に記載
された低温ジェット・クツキング法（１０５〜１０７℃
で３〜５分）に従って、殿粉を液化した。典型的な実験
においては、トウモロコシ殿粉７０ポンドを水５９／、
に懸濁させ、酢酸を用いてｐＨ！Ｗを５．ＯＫ調節した
。酢酸す） ＩＪウムＩＯＸで調製物化したタカーサー
ムＬ−１７０゜０００ ＭＷＵ／ｍ を加、ｔて最終
濃度０．１５％ＤＳＢ（２０，４００ＭＷＵ／１００ｆ
殿紛）にした。９素を含む殿粉スラリーを１０５〜１０
７℃に保持されたスチーム・ジェット・クツカーに通し
、この温度に３〜５分間保持した。ゼラチン化後、殿粉
を９５℃に保持された温度調節容器中に吹き込み、液化
を２時間続行した。他の実験においては、殿粉の液化を
加えたカルシウム５０ ｐｐｍの存在下においてｐＨ値
６．３〜６．５で（ｐＨ値を水酸化ナトリウムを用いて
調節した）行った。次１ｃＤＥ進行を比較し、第６表に
示した。
第５及び６表に示したデータから、アセテート安定化し
たα−アミラーゼはカルシウムを添加せずにｐ）Ｉ値５
．０で殿粉を液化するために十分な熱安定性であること
を知ることができた。
たα−アミラーゼはカルシウムを添加せずにｐ）Ｉ値５
．０で殿粉を液化するために十分な熱安定性であること
を知ることができた。
実施例７
アセテートで安定化したα−アミラーゼの安定性を、市
販のα−アミラーゼ溶液に加えた公知のアニオンを含む
ものと比較する比較試験を行った。
販のα−アミラーゼ溶液に加えた公知のアニオンを含む
ものと比較する比較試験を行った。
種々なアニオンを含む酵素溶液の活性をすでに述べた如
くして測定し、百分率残存活性を９０℃で時間の関数と
してプロットした。この試験の結果を第２図に図式的に
表わした。酵素の熱不活性に対する異なるアニオンの安
定化効果は次の順序でアル：シトレート〈サルフェート
〈クロライド＜アセテート。
くして測定し、百分率残存活性を９０℃で時間の関数と
してプロットした。この試験の結果を第２図に図式的に
表わした。酵素の熱不活性に対する異なるアニオンの安
定化効果は次の順序でアル：シトレート〈サルフェート
〈クロライド＜アセテート。
実施例８
市販の液化した殿粉は約１０のＤＢを有し、従って、一
連の液化実験を、液化した殿粉においてｌＯの最終ＤＥ
を生ずるように酵素の最適濃度を測定するために行った
。この酵素濃度を用いて、いくつかの液化試験を行い、
前記の低温ジェット・クツキング条件下で低ｐＨ値にて
、殿粉を液化する際に市販品の適応性に対して、アセテ
ート安定化したタカーサームを評価した。その結果を次
の第７．８及び９表に要約した。
連の液化実験を、液化した殿粉においてｌＯの最終ＤＥ
を生ずるように酵素の最適濃度を測定するために行った
。この酵素濃度を用いて、いくつかの液化試験を行い、
前記の低温ジェット・クツキング条件下で低ｐＨ値にて
、殿粉を液化する際に市販品の適応性に対して、アセテ
ート安定化したタカーサームを評価した。その結果を次
の第７．８及び９表に要約した。
ｐ４５．７．８及び９表中のｒＣａ”＋無し」ノ項は、
殿粉スラリー及び加えた水が約２５〜５０ｐｐｍ のカ
ルシウムイオンを提供するために、Ｃａ＋１を加えなか
ったことを意味するものとする。
殿粉スラリー及び加えた水が約２５〜５０ｐｐｍ のカ
ルシウムイオンを提供するために、Ｃａ＋１を加えなか
ったことを意味するものとする。
実施例９
マルトースの生成における殿粉液化中のｐＨ値の影響
第７．８及び９表の試験１．７及び１１の下での殿粉の
液化を、還元基の化学的異性化においてｐＨ値及び高温
の影響を測定するために、長期間行った。次に液化した
殿粉を、グルコアミラーゼを用いて（ｌＯＯＤＵ／１ポ
／ド殿粉）、ｐＨ値４．２及び６０℃で４８時間糖化し
た。最終グルコース・シロップの炭水化物のプロフィー
ルを、ガス液クロマトダラフイー及び高速液体クロマト
グラフ法を用いて、試料を分析することによって測定し
た。ＨＰＸ−８７イオン交換樹脂を用いてＨＰＬＣＫよ
って他の二糖類（マルトース及びイソマルトース）から
マルツロースを分離した。かくシて得られたデータを次
の第１０表に要約した。
液化を、還元基の化学的異性化においてｐＨ値及び高温
の影響を測定するために、長期間行った。次に液化した
殿粉を、グルコアミラーゼを用いて（ｌＯＯＤＵ／１ポ
／ド殿粉）、ｐＨ値４．２及び６０℃で４８時間糖化し
た。最終グルコース・シロップの炭水化物のプロフィー
ルを、ガス液クロマトダラフイー及び高速液体クロマト
グラフ法を用いて、試料を分析することによって測定し
た。ＨＰＸ−８７イオン交換樹脂を用いてＨＰＬＣＫよ
って他の二糖類（マルトース及びイソマルトース）から
マルツロースを分離した。かくシて得られたデータを次
の第１０表に要約した。
上記の表から、多糖類の還元基の異性化がｐＨ値６．０
以上で起こることを決定することができる。
以上で起こることを決定することができる。
かくして、液化中（ｐＨ値６．０以下）にｐＨ値の調節
によって、殿粉液化のマルツロース生成の消去が、１％
よシ大きｂ最終グルコース収率において、全体的な増加
をもたらす。
によって、殿粉液化のマルツロース生成の消去が、１％
よシ大きｂ最終グルコース収率において、全体的な増加
をもたらす。
実施例１０
昇温及び低ｐＨ値で殿粉の液化中、α−アミラーゼ活性
の熱安定性に関して、殿粉スラリーに両親媒性物質を直
接加えた効果を測定するために次の実験を行った。無水
酢酸ナトＩＪウムを水性殿粉スラリー（３１％ＤＳＢ）
に加え、最終一度０．０１モルにした（６５１／殿粉７
ｏポンドを含む２１ガロン）。塩化カルシウムを２５
ｐｐｍ（Ｃａ 、！−して）のレベルに加え、１０
％水酸化ナトリ）ムを用いてｐＨ値を５．５に調節した
。α−アミラーゼ（Ｔａｋａ−Ｔｈｅｒｍ Ｌ−１７０
）を加え（２０，４００ＭＷＵ／１００ ｆ殿粉）、実
施例６に述べた低温ジェット・クツキング法に従って殿
粉を液化した。
の熱安定性に関して、殿粉スラリーに両親媒性物質を直
接加えた効果を測定するために次の実験を行った。無水
酢酸ナトＩＪウムを水性殿粉スラリー（３１％ＤＳＢ）
に加え、最終一度０．０１モルにした（６５１／殿粉７
ｏポンドを含む２１ガロン）。塩化カルシウムを２５
ｐｐｍ（Ｃａ 、！−して）のレベルに加え、１０
％水酸化ナトリ）ムを用いてｐＨ値を５．５に調節した
。α−アミラーゼ（Ｔａｋａ−Ｔｈｅｒｍ Ｌ−１７０
）を加え（２０，４００ＭＷＵ／１００ ｆ殿粉）、実
施例６に述べた低温ジェット・クツキング法に従って殿
粉を液化した。
１０％酢酸ナトリウムで調製物化したタカーサームＬ−
１７０を用いた場合に由来する当量、即ち、０．７ｍＭ
（４，６ｔ／殿粉７０ポンドを含む２１ガロン）にお
いて、酢酸ナトリウムを含む殿粉スラリーを用いてこの
実験をくり返し行った。比較のために、また通常のタカ
ーサームＬ−１７０及び１０％酢酸ナトリウムで調製物
化したタカーサーＡＬ−１７０を用いて、Ｃａ ２
５ ｐｐｍの存在下においてｐＨ値５．５で殿粉を液化
した。これらの実験結果を次の第１１表に要約した。
１７０を用いた場合に由来する当量、即ち、０．７ｍＭ
（４，６ｔ／殿粉７０ポンドを含む２１ガロン）にお
いて、酢酸ナトリウムを含む殿粉スラリーを用いてこの
実験をくり返し行った。比較のために、また通常のタカ
ーサームＬ−１７０及び１０％酢酸ナトリウムで調製物
化したタカーサーＡＬ−１７０を用いて、Ｃａ ２
５ ｐｐｍの存在下においてｐＨ値５．５で殿粉を液化
した。これらの実験結果を次の第１１表に要約した。
上記表中のデータは、殿粉スラリーまたは酵素に両親媒
性物質を添加することが殿粉の液化中、α−アミラーゼ
活性の安定化に同一効果を有することを明白に立証する
。
性物質を添加することが殿粉の液化中、α−アミラーゼ
活性の安定化に同一効果を有することを明白に立証する
。
第１図はα−アミラーゼの熱安定性における両親媒性物
質の影響を示すグラフである。 第２図はα−アミラーゼの熱安定性におけるアニオンの
影響を示すグラフである。 特許出願人 マイルス・ラボラドリース・インコーホレ
ーテッド 晴間（分） ＦＩＧ、 １
質の影響を示すグラフである。 第２図はα−アミラーゼの熱安定性におけるアニオンの
影響を示すグラフである。 特許出願人 マイルス・ラボラドリース・インコーホレ
ーテッド 晴間（分） ＦＩＧ、 １
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、α−アミラーゼの水溶液に安定化量の両親媒性物質
を加えることを特徴とするバクテリア性α−アミラーゼ
の熱安定性を増す方法。 ２、α−アミラーゼを枯草菌、バチルス・リケニホルミ
ス、バチルス・ステアロセルモフィルスまたはバチルス
・コアギュランス種の微生物から誘導する特許請求の範
囲第１項記載の方法。 ３、微生物がバチルス・リケニホルミス種である特許請
求の範囲第２項記載の方法。 ４、両親媒性物質が一般構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 式中、ＸはＣＯＯ＾−、ＮＨ＿４、ＯＨ、ＳＯ＿４＝、
ＳＯ＿３＝またはＣＯＮＨ＿２であり、そしてＲは非極
性部分である、 によって表わされる特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５、両親媒性物質が式 Ｒ−ＣＯＯ＾− 式中、Ｒは炭素原子２〜１４個を含む脂肪族または芳香
族基である、 によって表わされる特許請求の範囲第１項記載の方法。 ６、Ｒがメチル、エチル、ｎ−もしくはイソプロピル、
ｎ−もしくはイソブチル、フェニルまたは置換されたフ
ェニルである特許請求の範囲第５項記載の方法。 ７、両親媒性物質を含むカルボキシレートをその金属塩
の型におけるα−アミラーゼの水溶液に加える特許請求
の範囲第５項記載の方法。 ８、金属がナトリウムまたはカルシウムである特許請求
の範囲第７項記載の方法。 ９、α−アミラーゼを計算目的に用いるために、分子量
５８，０００ダルトンを有するα−アミラーゼ１モル当
りカルボキシレート少なくとも２．８９モルの濃度で両
親媒性物質をα−アミラーゼ水溶液に加える特許請求の
範囲第５項記載の方法。 １０、両親媒性物質がアセテートであり、該アセテート
をα−アミラーゼ水溶液に、改変したウォルゲムート単
位の項に表わされた酵素活性の１００万単位当り少なく
ともアセテートイオン０．２４ｇの濃度で加える特許請
求の範囲第１項記載の方法。 １１、安定化量の両親媒性物質を含有するα−アミラー
ゼの安定化された濃厚水溶液。 １２、モディファイド・ウォルゲムート単位で表現して
α−アミラーゼ活性の１００万単位当りアセテートイオ
ン少なくとも０．２４ｇのアセテートイオン濃度を与え
るのに十分な量においてアルカリ金属アセテート溶液を
加えることを特徴とするバチルス・リケニホルミス種か
らのバクテリアの適当な栄養媒質中での増殖中に産生し
たα−アミラーゼの水溶液の安定化方法。 １３、α−アミラーゼがモディファイド・ウォルゲムー
ト単位１７０，０００〜１８０，０００／ｍｌの活性を
与えるのに十分な量で溶液中に存在する特許請求の範囲
第１２項記載の方法。 １４、アルカリ金属がナトリウムである特許請求の範囲
第１２項記載の方法。 １５、モディファイド・ウォルゲムート単位で表現して
α−アミラーゼ活性の１００万単位当りアセテートイオ
ン少なくとも０．２４ｇの量でアセテートイオンを含有
するバチルス・リケニホルミス種からのバクテリアによ
って産生されたα−アミラーゼの安定化された水溶液。 １６、モディファイド・オルゲムート単位１７０，００
０〜１８０，０００／ｍｌの活性を与えるのに十分な量
のα−アミラーゼを含有する特許請求の範囲第１５項記
載の方法。 １７、殿粉の液化を達成するのに適当な条件下で、安定
化量の両親媒性物質の存在下において殿粉をα−アミラ
ーゼの水溶液と接触させることを特徴とする殿粉を殿粉
水解物に転化する方法。 １８、両親媒性物質がアセテートイオンであり、そして
モディファイド・ウォルゲムート単位で表現して酵素活
性の１００万単位当りアセテートイオン少なくとも０．
２４ｇの量でα−アミラーゼ溶液中に存在する特許請求
の範囲第１７項記載の方法。 １９、殿粉の転化をｐＨ値約５．０〜６．０で行う特許
請求の範囲第１７項記載の方法。 ２０、両親媒性物質をα−アミラーゼの水溶液に加える
特許請求の範囲第１７項記載の方法。 ２１、両親媒性物質をα−アミラーゼの添加前または後
に殿粉に加える特許請求の範囲第１７項記載の方法。 ２２、モディファイド・ウォルゲムート単位で表現して
酵素活性の１００万単位当りアセテート少なくとも０．
２４ｇの量のアセテートイオンの存在下において、ｐＨ
値を５．０〜６．０のレベルに保持しながら、バチルス
・リケニホルミス種のバクテリアによって産生されたα
−アミラーゼの水溶液と殿粉を接触させることを特徴と
する殿粉の液化方法。 ２３、アセテートイオンをα−アミラーゼの水溶液に加
える特許請求の範囲第２２項記載の方法。 ２４、両親媒性物質をα−アミラーゼの添加前または後
に殿粉に加える特許請求の範囲第２２項記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US69703685A | 1985-01-31 | 1985-01-31 | |
| US697036 | 1985-01-31 | ||
| US768370 | 1985-08-22 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61177988A true JPS61177988A (ja) | 1986-08-09 |
| JPH0569509B2 JPH0569509B2 (ja) | 1993-10-01 |
Family
ID=24799528
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61016021A Granted JPS61177988A (ja) | 1985-01-31 | 1986-01-29 | α‐アミラーゼの熱安定化 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61177988A (ja) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5729286A (en) * | 1980-07-30 | 1982-02-17 | Bristol Myers Co | Stabilized enzyme containing aqueous compositions |
-
1986
- 1986-01-29 JP JP61016021A patent/JPS61177988A/ja active Granted
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5729286A (en) * | 1980-07-30 | 1982-02-17 | Bristol Myers Co | Stabilized enzyme containing aqueous compositions |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0569509B2 (ja) | 1993-10-01 |
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