JPS611397A - Growth factor i-like 59valineinsulin and its preparation - Google Patents

Growth factor i-like 59valineinsulin and its preparation

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Publication number
JPS611397A
JPS611397A JP60069630A JP6963085A JPS611397A JP S611397 A JPS611397 A JP S611397A JP 60069630 A JP60069630 A JP 60069630A JP 6963085 A JP6963085 A JP 6963085A JP S611397 A JPS611397 A JP S611397A
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JP
Japan
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gene
igf
val
leu
sequence
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Pending
Application number
JP60069630A
Other languages
Japanese (ja)
Inventor
Ikuo Ueda
育男 植田
Mineo Niwa
丹羽　峰雄
Yoshimasa Saito
善正 斎藤
Susumu Sato
晋 佐藤
Hiroki Ono
裕樹 小野
Tadashi Kitaguchi
北口　忠司
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fujisawa Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Fujisawa Pharmaceutical Co Ltd
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Filing date
Publication date
Application filed by Fujisawa Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Fujisawa Pharmaceutical Co Ltd
Publication of JPS611397A publication Critical patent/JPS611397A/en
Pending legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/59—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g.hCG [human chorionic gonadotropin]; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/65—Insulin-like growth factors, i.e. somatomedins, e.g. IGF-1, IGF-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/036—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif targeting to the medium outside of the cell, e.g. type III secretion
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones

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Abstract

NEW MATERIAL:Growth factor I-like <59>valineinsulin comprising amino acis in a sequence shown by the figure. USE:For promoting growth and for clinical remedy of diabetes. PREPARATION:An organism having in itself a plasmid containing a synthetic growth factor I like <59>valineinsulin (<59>Val-IGF-I, for short) gene to code development of <59>Val-IGF-I consisting of amino acis in the sequence shown by the figure and a promoter gene that exists in the upper stream of the Val-IGF-I gene, adjoins it, has no structural gene, and controls development of Val-IGF-I gene is cultivated, and <59>Val-IGF-I is recovered from the culture solution.

Description

【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]

この発明は５９バリンインスリン様成長因子Ｉ（以下５
９Ｖａｌ−ＩＣＦ−１と略称する）、保護ペプチド融合
５９Ｖａｌ−ＩＣ；Ｆ−１（以下融合”Ｖａｌ−ＩＧＦ
−１と略称する）、”Ｖａｌ−ＩＧＦ−１をコードする
遺伝子、融合５９Ｖａｌ−ＩＧＦ−１をコードする遺伝
子、５９Ｖａｌ−ＩＧＦ−１遺伝子を含有するプラスミ
ド、融合５９ＶａｌｉＧＦ−１ｆｆｌ伝子を含有するプ
ラスミド、融合５９Ｖａ　ｌ　−Ｉ　ＧＦ　−１ｉｆｔ
伝子含有プラスミドを含有する宿主生物およびそれらの
製造法に関する。 ５９Ｖａｌ−ＩＣＦ−１は、インスリン様の活性および
軟・冑による硫酸塩取込みを刺激する活性を有するとと
もに細胞内での蛋白およびＤＮＡの合成を増強しうる。 従って、それは成長の促進にを用でありうる。 また糖尿病の七ｎ床治療においてもを用でありうる。 組換えＤＮＡ（遺伝子組換え）技術ならびに関連技術の
適用が、最も有効な５９Ｖａｌ−ＩＣＦ−■の大量製造
法となると考えられた。 ”Ｖａｌ−ＩＣＦ−１は新規であり、そのアミノ酸配列
は以下の如く表わすことができる。 Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ　−
Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａ　１−Ａｓｐ−
Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｖａ　ｌ−Ｃｙｓ−
Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｐ
ｈｅ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｔ、
ｙｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−６ｅｒ−Ｓｅｒ−人ｒｇ−Ａｒ
ｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−工１ｅ
−Ｖａ　１−Ａｓｐ−Ｇ１．ｕ−Ｃｙ　ｓ　−Ｃｙｓ−
Ｐｈｅ−Ａｒｇ−９ｅｒ−Ｃｙｓ　−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−
Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｃ
ｙｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ　−Ｐｒｏ−Ａ
ｌａ−Ｌｙｓ−８ｅｒ−Ａｌａこの発明の発明者らは、
以下の諸必須工程を用いて大量の５９Ｖａ　Ｉ　−ＩＣ
；Ｆ　−１を製造することに成功した。 工程１ ”Ｖａｌ−ＪＧＦ−１をコードする遺伝子を製造するプ
ロセス。所望により、このプロセスに続いて、保８１！
ペプヂドをコードする遺伝子を、ＳｑＶ、−ことがなる
ところの、融合５９ｙ ａｔ−ＩＣＦ−１ｉｆｌ伝子、すなわち保護ペプチドと
融合した５９Ｖａｌ−ＩＣＦ−１をコードする遺伝子を
製造するプロセスを設ける。 適当な「リンカ−」には、”Ｖａｌ−ＩＣＦ−ＩＪ伝転
子上流に保護ペプチドを連結するための適当な制限酵素
３．２識部位をもち、数個のアミノ酸をコードする遺伝
子が包含され得て、「リンカ−」自身が該保護ペプチド
を構成する。 とくに好ましい「リンカ−」は後記の実施例中で例示さ
れているごときものである。 さらに、該５９Ｖａｌ−ＩＣＦ−１遺伝子の下流に、こ
れに隣接して、ターミネークーを挿入しうる。 適当な「ターミネータ−」は、適当な制限酵素認識部位
をコードする遺伝子が含まれうる。 とくに好ましい「ターミネークー」は後記の実施例中で
例示されているごときものである。 適当な［融合”Ｖａ　Ｉ　　Ｉ　ＧＦ　　１％すなわち
保８便ヘブチトと融合した”Ｖａ　１−ＩＧＦ−ＩＪは
、後記の実施例において説明１例示されるごときもので
ある。 工程２ プロｔ−−りＪ転子および”Ｖａ　Ｉ　−ＩＧＦ　−１
をコードする遺伝子または融合Ｓ９’Ｖａｌ−ＩＣＦ−
■をコードする遺伝子をプラスミド中に挿入することか
らなる発現ベクター製造プロセス。 適当な「発現へククー」には、プラスミドｐｓｄＶ２ｔ
ｒｐ、ｐＳｄＶ２−３２２ｔｒｐ、ｐＬＨ３ｄＶｔｒｐ
、ｐＳｄＶ２−１ａｃ、ｐＳｄＶ２−ＮＴ４９などが含
まれうる。 とくに適当な「）゛ラスミドＪｌこは、ｐＢＲ３２２な
どが含まれうる。 工程３ 前記発現ベクターで宿主生物を形質転換することからな
る形質転換体製造プロセス。 適当な「宿主生物」には、＃キ毎エシェリキア・コリ　
（［１ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）　　（たと
えば、エシェリキア・コリＩＩＢＩＯＩ、エシェリキア
・コリ１１１２０１１、エシェリキア・コリＭＭ２９４
など）などが含まれうる。 工程４ 前記の形質転換体を適当な培地中で培養することからな
る５９Ｖａｌ−ＩＣＦ−１または副；合Ｓ″■ａｌ−Ｉ
ＣＦ−１製造プロセス。 合”Ｖａｌ−ＩＧＦ−１を単離するプロセス。 工Ｉ旦（任意） 前記融合５９Ｖａｌ−ＩＧＦ−１を保護ペプチド脱離反
応に付すことからなる”Ｖａｔ−ＩＣＦ　−■製造プロ
セス。 ［融合５９Ｖａ　ｌ　−ＩＣＦ−１すなわち保護ペプチ
ドと融合した”Ｖａｌ−ＩＧＦ−ＩＪなる表現における
「保護ペプチド」は、宿主生物細胞中でのプロテアーゼ
による分解に対して５９Ｖａｌ−ＩＧＦ−１を保護する
ために使用され、該融合５９Ｖａ　１−ＩＣＦ−１の脱
離反応によって除去される。 すなわち、該融合５９Ｖａｌ−ＩＣＦ−１は、脱離反応
によって５９Ｖａｌ−ＩＣＦ−１を調製するための中間
体であり、従って該保護ペプチドは、天然または合成の
蛋白、天然または合成のペプチド、あるいはそれらの断
片から誘導された任意の脱離可能な保護ペプチドであり
うる。 適当な［融合５９Ｖａ　１−ＩＧＦ−１ｊには、蛋白ペ
プチドのメチオニンを介してその蛋白ペプチドと融合し
た５９Ｖａｌ−ＩＧＦ−１が含まれうる。 この脱離反応に使用される適当な試薬には、臭化シアン
などが含まれる。 この工程では、蛋白ペプチドがそれのメチオニンを介し
て”Ｖａｌ−ＩＣＦ−１と融合している場合には、融合
５９Ｖａｔ−ＩＣＦ−１は、臭化シアンを用いる脱離反
応によって高収率で”Ｖａｌ−ＩＣＦ−１に転化できる
。 木ＤＱ離反応は、反応に悪影響を及はさない通常の溶媒
中で緩和な条件下に実施できる。 上記５″Ｖａｌ−ＩＣＦ−１のアミノ酸配列から、いく
つかの特定の非自明の基準に従って、対応するヌクレオ
チド配列を発明した。”Ｖａｌ−１ＧＦ−１遺伝子を、
クローニングヘククーとしての既知のプラスミドに挿入
することによって、クローン化した。組換えプラスミド
から５９Ｖａｌ−ＩＣＦ−１遺伝子を切出し、つぎに、
プロモーターによる制御下での”Ｖａ　１−ＩＣＦ−’
ｊｉｆｆ伝子の発転子極大ならしめるように特にデザイ
ンされたプラスミド中に５９Ｖａ　Ｉ　−ＩＣＦ　−１
ｉｆｌ伝子を挿入した。この場合、所望により、保護ペ
プチドをコードする構造遺伝子が前記”Ｖａｌ−ＩＣ；
Ｆ　−１遺伝子の上流にかつそれに隣接して挿入される
。 以下に、本発明をより詳しく説明するが、本発明はそれ
らに限定されるものではない。 （１）”Ｖａ　Ｉ−ＩＧＦ−１遺伝了の調製とクローニ
ング； ｆｌ）　　５９Ｖａｌ−ＩＧＦ−１遺伝子の調製：遺伝
暗号の多様性のため、上記アミノ酸配列から、”Ｖａｌ
−ＩＣＦ−１をコードする多数のヌクレオチド配列を予
言することが可能である。 多数の可能性のうちから最適の配列を本発明に従って決
定するに当って、いくつかの自明でない基準に従った。 まず、使用する予定の宿主生物に受容れられうるトリヌ
クレオチドコドンを使用すべきである。第二に、その配
列は、所望通りの配置でプラスミド中へ挿入できるよう
、分子の末端に種々の制限酵素認識部位をもつことが望
ましい。 さらに、周知のクローニングヘクターの使用が可能とな
るような部位を選択するようにすべきである。第三に、
合成が不必要に複雑であってはならず、また、遺伝子の
組立てを容易にすべく、誤まうた交差ハイブリッド化を
極少にして、不可逆的なオフダイアゴナル（ｏｆｆ−ｄ
ｉａｇｏｎａｌ）な相互反応をできるだけ避けるように
ずべきである。 ”Ｖａｌ−ＩＣＦ−１遺伝子部分をコードするために選
んだ好ましい配列を一例を以下に示ずことができる： Ｇｌｙ　Ｐｒ。 ３−ドする””　　　　　５’−ＧＧＴ−ＣＣＴ−コー
ドしないｔ貨：　　　　３シｃｃｂ−ａＧＡ−ＣＴＴ−
ＴＧＡ−ＧＡＣ−ＡＣＧ−ＣＣＧ−ＣＧＡ−ＣＴＴ　−
ＧＡＣ−ＣＡＡ−ＣＴＧ　−ＣＧＡ−ＧＡＣ−ＧＴＴ−
ＡＡＡ−ＣＡＴ−ＡＣＡ−ＣＣＡ−ＣＴＡ−ＧＣＡ−Ｃ
ＣＡ−ＡＡＧ−ＡＴＧ−Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｐｒ
ｏ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ
　ＳｅｒＴＴＣ−ＡＡＣ−ＡＡＡ−ＣＣＧ−ＡＣＣ−Ｇ
ＧＣ−ＴＡＴ−ＧＧＣ−ＴＣＣ−ＡＧＣ−ＴＣＴ−ＭＧ
−ＴＴＧ−ＴＴＴ−ＧＧＣ−ＴＧＧ−ＣＣＧ−ＡＴＡ−
ＣＣＧ−ＡＧＧ−ＴＣＧ−ＡＧＡ−Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａ
ｌａ　　Ｐｒｏ　　Ｇｌｎ　　Ｔｈｒ　　Ｇｌｙ　　工
１ｅ　　Ｖａｌ　　Ａｓｐ　　ＧｌｕＣＧＴ−ＣＧＣ−
ＧＣＡ−ＣＣＧ−ＣＡＧ−ＡＣＴ’−ＧＧＴ−ＡＴＣ−
ＧＴＡ−ＧＡＣ−ＧＭ−ＧＣＡ−ＧＣＧ−ＣＧＴ−ＧＧ
Ｃ−ＧＴＣ−ＴＧＡ−ＣＣＡ−ＴＡＧ−ＣＡＴ−ＣＴＧ
−ＣＴＴ−Ｃｙｓ　Ｃｙｓ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　
Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　ＬｅｕＴＧ
Ｃ−ＴＧＴ−ＴＴＴ−ＣＧＴ−ＴＣＴ−ＴＧＣ−ＧＡＴ
−ＣＴＣ−ＣＧＣ−ＣＧＴ−ＣＴＧ−ＡＣＧ−ＡＣＡ−
ＡＡＡ−ＧＣＡ−ＡＧＡ−ＡＣＧ−ＣＴＡ−ＧＡＧ−Ｇ
ＣＧ−ＧＣＡ−ＧＡＣ−Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｃｙ
ｓ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｌａ
　ＬｙｓＧＭ−ＧＴＴ−ＴＡＣ−ＴＧＴ−ＧＣＴ−ＣＣ
Ａ−ＣＴＧ−ＭＧ−ＣＣＡ−ＧＣＡ−ＡＡＡ　−ＣＴＴ
”ＣＡＡ−ＡＴＧ−ＡＣＡ−ＣＧＡ−ＧＧＴ−ＧＡＣ−
ＴＴＣ−ＧＧＴ−ＣＧＴ−ＴＴＴ−Ｓｅｒ　　Ａｌａ ＴＣＣ−ＧＣＧ’−３’ ＡＧＧ−ＣＧＣ−５’ この明細書におりる配列の表示において、Ａ。 Ｇ、ＣおよびＴは、それぞれ次の式を意味する：ｏ　−
ｐ　−ｏ−ｏ　−ｐ　−ｏ　− ＋１　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　）Ｉ
Ａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＧＣ
Ｔ また、５′−末端のＡ、Ｇ、ＣおよびＴは、それぞれ次
式を意味する： Ａ　　　　　　　　　　　　Ｇ Ｔ そして、３′−末端のＡ、Ｇ、ＣおよびＴは、それぞれ
次式を意味する： ｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＨＣ
Ｔ 上記の諸基準、とくに上記第二の基準を考慮に入れると
き、次の少しく長い配列を選択することができる。 実際、この発明の適当な実施態様として、ＥｃｏＲＩお
よびＢａｍＨ１部位を選択して、それぞれ５′末端およ
び３′末端に導入することができる。 さらに、ノチオニンコドン（ＡＴＧ）　を、ＩＧＦ−１
のＮ末端アミノ酸コドンの上流に、これに隣接して、挿
入し、２種の停止コドン（ＴＣ；ＡおよびＴＡＧ）を、
Ｃ末端コドンの下流に、これに隣接して、挿入した。 （ＡｖａＩＩ］ ｖ　−Ｆ　Ｌ、　ナイｌｉ　：　　　　　　３　’　−
Ｇ−ＴＡＣ−ＣＣＡ−ＧＧＡ−Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ
　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　
Ａｓｐ　ＡｌａＧＭ−ＡＣＴ−ＣＴＧ−ＴＧＣ−ＧＧＣ
−ＧＣＴ−ＧＭ−ＣＴＧ−ＧＴＴ−ＧＡＣ−ＧＣＴ−Ｃ
ＴＴ−ＴＧＡ−ＧＡＣ−ＡＣＧ−ＣＣＧ−ＣＧＡ−ＣＴ
Ｔ−ＧＡＣ−ＣＭ−ＣＴＧ−ＣＧＡ−Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　
Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｇ
ｌｙ　Ｐｈｅ　ＴｙｒＣＴＧ−ＣＭ−ＴＴＴ−ＧＴＡ−
ＴＧＴ−ＧＧＴ−ＧＡＴ−ＣＧＴ−ＧＧＴ−ＴＴＣ−Ｔ
ＡＣ−ＧＡＣ−ＧＴＴ−ＡＡＡ−ＣＡＴ−ＡＣＡ−ＣＣ
Ａ−ＣＴＡ−ＧＣＡ−ＣＣＡ−ＭＧ−ＡＴＧ−Ｐｈｅ　
Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｇ
ｌｙ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　ＳｅｒＴＴＣ−ＭＣ−ＡＡＡ−
ＣＣＧ−ＡＣＣ−ＧＧＣ−ＴＡＴ−ＧＧＣ−ＴＣＣ−Ａ
ＧＣ−ＴＣＴ−ＡＡＧ−ＴＴＧ−ＴＴＴ−ＧＧＣ−ＴＧ
Ｇ−ＣＣＧ−ＡＴＡ−ＣＣＧ−ＡＧＧ−ＴＣＧ−ＡＧＡ
−Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ｔｈｒ　
Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　ＧｌｕＣＧＴ−ＣＧ
Ｃ−ＧＣＡ−ＣＣＧ−ＣＡＧ−ＡＣＴ−ＧＧＴ−ＡＴＣ
−ＧＴＡ−ＧＡＣ−ＧＭ−ＧＣＡ−ＧＣＧ−ＣＧＴ−Ｇ
ＧＣ−ＧＴＣ−ＴＧＡ−ＣＣＡ−ＴＡＧ−ＣＡＴ−ＣＴ
Ｇ−ＣＴＴ−Ｃｙｓ　　Ｃｙｓ　　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｓ
ｅｒ　　Ｃｙｓ　　Ａｓｐ　　Ｌｅｕ　　Ａｒｇ　Ａｒ
ｇ　ＬｅｕＴＧＣ−ＴＧＴ−ＴＴＴ−ＣＧＴ−ＴＣＴ−
ＴＧＣ−ＧＡＴ−ＣＴＣ−ＣＧＣ−ＣＧＴ−ＣＴＧ−Ａ
ＣＧ−ＡＣＡ−ＡＡＡ−ＧＣＡ−ＡＧＡ−ＡＣＧ−ＣＴ
Ａ−ＧＡＧ−ＧＣＧ−ＧＣＡ−ＧＡＣ−Ｇｌｕ　Ｖａｌ
　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　
Ｐｒｏ　Ａｌａ　ＬｙｓＳｅｒ　Ａｌａ　５ｔｏｐ　５
ｔｏｐ　ＢａｍＨ工ＴＣＣ−ＧＣＧ−ＴＧＡ−ＴＡＧ−
３’八ＧＧ−ＣＧＣ−ＡＣＴ−ＡＴＣ−ＣＴＡＧ−５’
本発明は、相当する多数のオリゴヌクレオチドフ゛ロッ
クのハイフ゛りンド化およびライゲーションからなるこ
とを特徴とする、前記のこ゛とき遺（立子の製造方法に
も関するものである。 （ｉ）オリゴヌクレオチド類の合成： 実Ｗ、３０種の合成オリコヌクレオチドを作成すること
によって、上記の拡張された配列を有する分子を合成す
ることとした。それら合成メ゛リゴヌクレオチドを所定
の段階でノーイブリッド化し、ライゲートするとき、上
記の二ｆｆｉ鎖ヌクレメ′チド配列を与えるものである
。 この明細書におけるオリゴヌクレオチド類の合成に関す
る記載においては、次の略号を用いる。 Ａｐ、ｃｐ、Ｃｐおよび’ｒｐは、それぞれ次式を意味
する： ＨＨ Ａｐ　　　　　　　　　　　　Ｇｐ Ｃｐ　　　　　　　　　　、　　　Ｔｐまた、３′末端
のＡ、　Ｇ、　ＣおよびＴは、それぞれ次式を意味する
： 八〇 ＨＨ ＣＴ Ａ”ｐ　ｏ、　Ｇ”ｐ　ｏ、　ＣＩｌ″ｐ　ｏ、　’Ｉ
″ｐｏおよび＾ＣＵｐｏは、それぞれ次式を意味する。 ８□　　　　　　　　　　６ｉＢｐ。 Ａ　　ｐ。 ＣＢｚｐｏ　　　　　Ｔｐｏ　　　　　ＡｃＵｐ。 ＤＭＴｒはジメｊ−キシトリチルであり、Ｂはアデニニ
ル、グアニニル、シトシニルおよびチミニル（便宜上、
保８ＵＪは示さない）、Ｕはウラシルであり、 ＡＣはアセデルであり、 ｍは１または２なる整数であり、 ｎは１〜１２の整数である。 オリゴヌクレオチド類は次の通りである：（１１ＨＯＡ
ｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＧｐＧｐＧｐＴＯＨ（Ａｌ
ｌ（２１ＨＯＴｐＴｐＴｐＣｐＡｐＧｐＧｐＡｐＣｐＣ
ｐＣｐＡｐＴｐＧＯＨ（Ａ２１＋３１　　ＨＯＣｐＣｐ
ＴｐＧｐＡｐＡｐＡｐＣｐＴｐＣｐＴｐＧｐＴｐＧＯ）
Ｉ　　（Ｂｌ）＋４１　ＨＯＣｐＡｐＧｐＣｐＧｐＣｐ
ＣｐＧｐＣｐＡｐＣｐＡｐＧｐＡｐＧＯＨ（Ｂ２１（５
）　ＨＯＣｐＧｐＧβＣｐＧｐＣｐＴｐＧｐＡｐＡｐＣ
ｐＴｐＧｐＧｐＴＯＨ（Ｃ１ｌ＋６１　ＨＯＡｐＧｐＡ
ｐＧｐＣｐＧｐＴｐＣｐＡｐＡｐＣｐＣｐＡｐＧｐＴｐ
ＴＯＨ１ｃ２）（７１ＨＯＴｐＧｐＡｐＣｐＧｐＣｐＴ
ｐＣｐＴｐＧｐＣｐＡｐＡｐＴｐＴｐＴＯＨＩＤＩＩ＋
８１　　＋ｌ０ＣｐＣｐＡｐＣｐＡｐＴｐＡｐＣｐＡｐ
ＡｐＡｐＴｐＴｐＧｐＣＯＨ（Ｄ２１（９）　　ＨＯＧ
ｐＴｐＡｐＴｐＧｐＴｐＧｐＧｐＴｐＧｐＡｐＴｐＣｐ
ＧｐＴＯＨ（Ｅｌ）（１０１ＨＯＴｐＡｐＧｐＡｐＡｐ
ＡｐＣｐＣｐＡｐＣｐＧｐＡｐＴｐＣｐＡＯＨ（Ｅ２１
（１１１ＨＯＧｐＧｐＴｐＴｐＴｐＣｐＴｐＡｐＣｐＴ
ｐＴｐＣｐＡｐＡｐＣＯＨ（Ｆｌｌ（１２１ＨＯＧｐＧ
ｐＴｐＣｐＧｐＧｐＴｐＴｐＴｐＧｐＴｐＴｐＧｐＡｐ
ＡｐＧＯＨ（Ｆ２１＋１３１　　ＨＯＡｐＡｐＡｐＣｐ
ＣｐＧｐＡｐＣｐＣｐＧｐＧｐＣｐＴｐＡｐＴｐＧＯＨ
（Ｇｌ）（１４）　　１（ＯＧｐＣｐＴｐＧｐＧｐＡｐ
ＧｐＣｐＣｐＡｐＴｐＡｐＧｐＣｐＣＯＨ（Ｇ２＋（１
５１ｆｒＯＧｐＣｐＴｐＣｐＣｐＡｐＧｐＣｐＴｐＣｐ
ＴｐＣｐＧｐＴｐＣＯＩＩ　　ＴＨＩＩｆ１６）ＨＯＣ
ｐＧｐＧｐＴｐＧｐＣｐＧｐＣｐＧｐＡｐＣｐＧｐＡｐ
ＧｐＡＯＨ（Ｂ２）（１７１ＨＯＧｐＣｐＧｐＣｐＡｐ
ＣｐＣｐＧｐＣｐＡｐＧｐＡｐＣｐＴｐＧＯＨ（工１）
（１８）　ＨＯＣｐＴｐ’ＡｐＣｐＧｐＡｐＴｐＡｐＣ
ｐＣｐＡｐＧｐＴｐＣｐＴｐＧＯＨ（工２）（１９１Ｈ
ＯＧｐＴｐＡｐＴｐＣｐＧｐＴｐＡｐＧｐＡｐＣｐＧｐ
ＡｐＡｐＴｐＧＯＨ（Ｊｌ）（２０）、ＨＯＧｐＡｐＡ
ｐＡｐＡｐＣｐＡｐＧｐＣｐＡｐＴｐＴｐＣｐＧｐＴＯ
Ｈ（Ｊ２１［２１）ＨＯＣｐＴｐＧｐＴｐＴｐＴｐＴｐ
ＣｐＧｐＴｐＴｐＣｐＴｐＴｐＧＯＨ（Ｋｌｌｆ２２１
　　ＨＯＧｐＧｐＡｐＧｐＡｐＴｐＣｐＧｐＣｐＡｐＡ
ｐＧｐＡｐＡｐＣＯＨ（Ｋ２１（２３）　　Ｉ（ＯＣｐ
ＧｐＡｐＴｐＣｐＴｐＣｐＣｐＧｐＣｐＣｐＧｐＴｐＣ
ｐＴＯＨ（Ｌｌ）（２４）　　ＨＯＴｐＡｐＡｐＡｐＣ
ｐＴｐＴｐＣｐＣｐＡｐＧｐＡｐＣｐＧｐＧｐＣＯＨ（
Ｌ２’１（２５１ＨＯＧｐＧｐＡｐＡｐＧｐＴｐＴｐＴ
ｐＡｐＣｐＴｐＧｐＴｐＧｐＣｐＴＯＨｆＭ１’１（２
６）　　ＨＯＴｐＴｐＣｐＡｐＧｐＴｐＧｐＧｐΔｐＧ
ｐｃｐＡｐｃｐＡｐＧＯＨ（Ｍ２）（２７）　　ＨＯＣ
ｐＣｐＡｐＣｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧｐＣｐＣｐＡｐＧｐ
ＣｐＡＯＨｆＮｌｌ（２８１ＨＯＧｐＣｐＧｐＧｐＡｐ
ＴｐＴｐＴｐＴｐＧｐＣｐＴｐＧｐＧｐＣＯＨ（Ｎ２１
ｆ２９）ＨＯＡｐＡｐＡｐＴｐＣｐＣｐＧｐＣｐＧｐＴ
ｐＧｐＡｐＴｐＡｐＧＯＨ（ＯｌｌＤＯ）　　ＨＯＧｐ
ＡｐＴｐＣｐＣｐＴｐＡｐＴｐＣｐＡｐＣＯＨ（０２）
その逐次カンブリング反応を第１表に示す。 攬　　　　　　　社 ｔコ モノ　（またはジ、あるいはトリ）マー（１）は、広瀬
の方法（Ｔ、Ｈｉｒｏｓｅ、蛋白質・核酸、酵素１ｓｓ
Ｎ、１工、２２５　（１９８０）、日本で発行）によっ
て調製でき、カンプリングはリン酸トリエステル法（Ｒ
，Ｃｒｅａ　ら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　　Ｒｅ５
ｅａｒｃｈ、　　８．　２３３１　　（１９８０）″　
およびＭ、　　Ｌ、　　ＤｕｃｋｗｏｒＬｈら、Ｎ　ｕ
ｃｌｅｉｃ　　Ａ　ｃｉｄｓ＋Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　　
９．　１６９１　　（１９８１）　）により、セルロー
ス担体上で実施できる。 とくに、実施例１に記載したヘキサデカヌクレオチドＨ
ＯＡ　ｐ　Ａ　ｐ　Ａ　ｐ　Ｃｐ　Ｃｐ　Ｇ　ｐ　Ａ　
ｐ　Ｃｐ　ＣｐｃｐｃｐｃｐＴｐ八ｐＴｐＧＯＨへＧｌ
）の合成に関して、合成法を説明することとする。ヘキ
サデカヌクレオチドＧ１合成のフローチャートを第２表
に示す。 ７Ｑ７１〜 （ｉｉ　）化学合成オリゴヌクレオチドのハイブリッド
化とライゲーション を 極小にするために、一連の工程においてオリゴヌクレオ
チド類をハイブリッド化し、ライゲートする。第１図で
は、オリゴヌクレオチドを　ヒ（―は５′−ボスボリル
化末Ｏ：１；をπ味する）で表わし、ブロックされたオ
リゴヌクレオチド類ばたとえば←ムー（、、ｔ＋−はラ
イゲーションの位置を意味する）で表わしである。ライ
ゲーションはＴ４　　ＤＮＡリガーゼの存在下で行われ
る。 オリゴヌクレオチドＡ１．８１およびＡ２：Ｃ１、Ｂ２
およびＣ２；ＤＩ、ＥｌおよびＤ２ｉＦ１、Ｂ２および
Ｆ２；’Ｇｌ、Ｈ１およびＧ２１１び にＯｆ、Ｎ２およびｏ２をハイブリッド化し、−イゲー
トして、それぞれ相当するブロック１〜を得た。この場
合、オリゴヌクレオチド八１．　　Ｂ１およびＡ２なら
びに０１．Ｎ２および０２からそれぞれ得たブロック１
および１０を互いにハイブリッド化し、ライゲートして
、ダイマーを形成させた。ブロック２と３；４と５；６
と７および８と９をハイブリッド化し、ライゲートして
、それぞれブロック１１，１２．１３および１４を得た
。ブロック１，１５．１６およびｌＯをハイブリッド化
し、ライゲートし、かくして得たライゲーション生成物
を、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍ＋ｌｌで切断して、目的と
するポリヌクレオチド５９Ｖａｌ−ＩＧＦ−１を得た。 ｆ２１　　”Ｖａｌ−ＩＧＦ−１遺伝子のクローニング
＝５９Ｖａ　Ｉ　−ＩＣＦ−ＩＪ伝転子クローニングの
ため・、これを、５９Ｖａｌ−ＩＧＦ−１遺伝子を挿入
できる適当な酵素認識部位をもつ適切なプラスミド、す
なわちクローニングベクターに挿入する・。 この発明の適当な−・具体化例としζ、ニジエリラスミ
ド（たとえばｐ１３Ｒ３２２，ｐＢＲ２３５など）に挿
入し、クローニングを行った。 ま たとえば、第ち図に示された通りの、Ｅｃ　ｏＲ１およ
びＢａｍ１１１部位ををするプラスミＦｐＢＲ３２２（
商業的に入手可能）を使用した場合には、このブラース
ミドをＥＣ０ＲＩおよびＢ　ａ　ｍ　ｔｌ　Ｉで切断し
た。この場合には、そのプラスミドは、ＥＣ０ＲＩおよ
びＢａｍＨｌで切断したときの長い方の断片上に、アン
ピシリン抵抗性のコード（Ａｍ　ｐで示す）を有し、テ
トラサイクリン抵抗性のコード（Ｔｅｔで示す）は、Ｂ
　ａ　ｍ　Ｈ１部位切断の結果消失する。Ｅ　ｃ　ｏ　
ＲＩ　−Ｂ　ａ　ｍ　ｔｌ　Ｉで切断したプラスミドｐ
ＢＲ３２２の長い方の断片化し、ライゲートした。かく
して得た混合物を用いてＥ、ｃｏｌｉ　　ＨＢＩＯＩ　
　（ＡＴＣＣ３３６９４）を形質転換した。得られたい
くつかのアンピシリン抵抗性、テトラサイクリン感受性
の形質転ｐＳｄＶ２と名付しノる。 （３）　　プラスミドｐＳｄＶ２中の５９Ｖａｌ−ＩＧ
Ｆ−１ｉｌｌ伝子の配列 マキサム−ギルバー）　（Ｍａ　ｘ　ａ　ｍ−Ｇ１１ｂ
ｅｒｔ）法を使用できる。 ”Ｖａｌ−ＩＣ；Ｆ−１ｉ１１伝子の配列決定のため、
ブラスミｌ：’　ｐ　Ｓ　ｄ　Ｖ　２をＥＣｏ’１１で
ン肖化し、つぎに、α−”Ｐ−ＡＴＰの存在下にＡ　Ｍ
　Ｖ逆転写酵素で処理した。３２Ｐ標識線状プラスミ１
′をＢａｍＨＩで消化して、二つの断片（２２４ｂｐ、
４．。 ｋｂｐ　）を得た。小さい方の断片（２２４ｂｐ）をＳ
Ａ、７土、５６０　　（１９７７））により分析した。 他方、プラスミドｐＳｄ■２を先に３　ａ　ｍ　１１■
で消化し、次に上記の通りにして３２Ｐで標識した。線
状プラスミドをＥｃｏｌ’？！で消化して二つの断片（
２２４ｂ　ｐ、　４．ｏ　ｋｂｐ　）を得た。小さい方
の断片（２２４ｂｐ）をマキサムーギルノ＜−ト法で分
析した。”Ｖａｌ−ＩＧＦ−Ｉ遺伝子の両側力１ら配列
決定を行った結果は、設計したＳ９■ａｌ−Ｉ　Ｇ　Ｆ
　−１逍伝子と一敗した。 〔２〕プロモーター遺伝子の調製とクローニンク°：宿
主生物から融合５９Ｖａｌ−’ＩＧＦ−１を得るため、
プロモーター遺伝子を設計した。 かかる基準で得たプロモーター遺伝子を、それが５９Ｖ
ａｌ−ＩＣＦ−１または融合５９Ｖａｌ−ＩＣＦ−１を
コーｌ′する遺伝子の上流にかつそれＧこ隣接する位置
をとるよう、プラスミド中に挿入する。 この発明の適当な具体化例として、合成のｔｒρプロモ
ーターＩ遺伝子またはｔｒｐフ゛ロモーター■遺伝子を
調製した。 （１）合成ｔｒｐブロモークー■逍伝子転子製とクロー
ニング： 実際には、１４種の合成オリゴヌクレオチドフ゛口・ν
りを作成し、それぞれの−末鎖が少くとも７塩基ずつ重
なるように組立て、完全な二重鎖ヌクレオチド配列を得
ることによって、１０７ｂｐの分子を合成した。 ｃｏＲＩ ３　’　−ＡＣＧＧＣＴＧＴＡＧＴＡＴＴＧＣＣＭＧＡ
ＣＣＧＴＴＴＡＴＭＧＡＣＴＴ−ＥｃｏＲ工 （ｉ）オリゴヌクレオチド類の合成： オリゴヌクレオチドφ凸〒≠Ｉｆｆは次の通りである： （１）　　ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＴｐＧｐＣｐＣｐＧｐ
ＡｐＣｐＡＯＨ（八）（２）　　ＨＯＣｐＧｐＴｐＴｐ
ＡｐＴｐＧｐＡｐＴｐＧｐＴｐＣｐＧｐＧｐＣｐＡＯＨ
（Ｂｌ（３）　　ｌｌ０ＴｐＣｐＡｐＴｐＡｐＡｐＣｐ
ＧｐＧｐＴｐＴｐＣｐＴｐＧｐＧｐＣＯＨ（Ｃ）（４）
　　ＨＯＧｐＡｐＡｐＴｐＡｐＴｐＴｐＴｐＧｐＣｐＣ
ｐＡｐＧｐＡｐＡｐＣＯＨ（Ｄｌ（５１ＨＯＡｐＡｐＡ
ｐＴｐＡｐＴｐＴｐＣｐＴｐＧｐＡｐＡｐＡｐＴｐＧｐ
ＡＯＨ（Ｅ）（６）　　ＨＯＴｐＣｐＡｐＡｐＣｐＡｐ
ＧｐＣｐＴｐＣｐＡｐＴｐＴｐＴｐＣｐＡＯＨ（Ｆ＋（
７）　　ＨＯＧｐＣｐＴｐＧｐＴｐＴｐＧｐＡｐＣｐＡ
ｐＡｐＴｐＴｐＡｐＡｐＴ○ＩＩ　　（Ｇｌ（８）　　
ＨＯＧｐＴｐＴｐＣｐＧｐＡｐＴｐＧｐＡｐＴｐＴｐＡ
ｐＡｐＴｐＴｐＧＯＨ（Ｈｌ（９１ＨＯＣｐＡｐＴｐＣ
ｐＧｐＡｐＡｐＣｐＴｐＡｐＧｐＴｐＴｐＡｐＡｐＣＯ
Ｈ（Ｉｌｆｌｏｌ　　ＨＯＧｐＣｐＧｐＴｐＡｐＣｐＴ
ｐＡｐＧｐＴｐＴｐＡｐＡｐＣｐＴｐＡＯＨ（Ｊｌ（１
１）　　ＨＯＴｐＡｐＧｐＴｐＡｐＣｐＧｐＣｐＡｐＡ
ｐＧｐＴｐＴｐＣｐＡｐＣＯＨ（Ｋｌ（１２１ＨＯＣｐ
ＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＡｐＣｐＧｐＴｐＧｐＡｐＡｐＣ
ｐＴｐＴＯＨ（Ｌｌ（１３１ＨＯＧｐＴｐＡｐＡｐＡｐ
ＡｐＡｐＧｐＧｐＧｐＴｐＡｐＴｐＣｐＧＯＨ（Ｍｌ（
１４）　　ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＧｐＡｐＴｐＡｐ
ＣｐＣＯＨ（Ｎｌこれらの合成法は、上記へキザヌクレ
オチドＨｏ　Ａ　ｐ　Ａ　ｐ　Ａ　ｐ　Ｃｐ　Ｃｐ　Ｇ
　ｐ　Ａ　ｐ　Ｃｐ　Ｃｐ　Ｇ　ｐＧｐＣｐＴｐＡｐＴ
ｐＧＯＨ（Ｇｌ）の合成を参照すれば説明されよう。 （ｉｉ）化学合成オリゴヌクレオチドのライゲーション
： オリゴヌクレオチド類を、第り図に示したごと＜”Ｖａ
ｌ−ＩＣＦ−１遺伝子の場合と同様の方法に従って、ハ
イブリッド化し、ライゲートした。 （ｉｉｉ　）合成ｔｒｐプロモーターＩ遺伝子の分母ク
ローニング： 合成ｔｒｐプロモーターＩＪ伝子転子ローニングのため
、合成ＬｒｐプロモーターＩを挿入できる適当な酵素認
識部位をもつ適当なプラスミドに、合成ｔｒｐプロモー
ター酵素を挿入する。この発明の好ましい一実施ｃ、様
として、クローニングを、第４図に示した通り、プラス
ミ１°ｐ［３１？３２５（商業的に人手できる）を用い
て実施した。プラスミドｐＢ、Ｒ３２５をＥｃｏＲｌで
切断し、合成ｔｒｐプロモーターＩをそれに挿入した。 このようにして得たプラスミドｐ　ＳＴ−１を用いて旦
ｌＣｏ１ｔ　　ＩＩ　Ｂ　１０１を形質転換した。 （２）合成ｔｒｐプロモーター■遺伝子の調製二上記合
成Ｌｒｐプロモーター■をプラスミドに正しい方向で挿
入するため、合成ｔｒｐプロモーターＩのＥｃｏＲ１部
位の次にある長さの塩基封鎖をもち、３′末端にＢａｍ
Ｈ１部位をもつ、次のタイプの合成プロモーターずなわ
ち合成Ｌｒｐブロモーターロを８周製した。 実際には、２２種のオリゴヌクレオチド−〇〒毎を作成
し、それぞれの一本積が少くとも７塩基ずつ重なるよう
に組合せ、完全な二本鎖ヌクレオチド配列を得ることに
よって、１６３ｂｐの分子を合成することとした。 ＥｃｏＲｌ ５’−ＭＴＴＴＧＣＣＧＡＣＡＴＣＡＴＭＣＧＧＴＴＣ
ＴＧＧＣＡＡＡＴＡＴＴＣＴＧＭ−３嘗−ＡＣＧＧＣＴ
ＧＴＡＧＴＡＴＴＧＣＣＡＡＧＡＣＣＧＴＴＴＡＴＡＡ
ＧＡＣＴＴ−ＡＴＧＡＧＣＴＧＴＴＧＡＣＭＴＴＭＴＣ
ＡＴＣＧＭＣＴＡＧＴＴＡＡＣＴＡＧＴＡＣＧＣ−Ｅｃ
ｏＲよ りａｍＨ工 （１）オリゴヌクレオチドの合成： ８種のオリゴヌクレオチドをさらに合成した。 （１）　　ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＧｐＧｐ
ＣｐＴＯＨ（ＳＡＩ（２１ＨＯＧｐＧｐＴｐＴｐＧｐＴ
ｐＡｐＡｐＧｐＡｐＡｐＣｐＴｐＴｐＣｐＴＯＨ［５Ｂ
ｌ（３）　　ＨＯＴｐＴｐＴｐＧｐＧｐＡｐＡｐＧｐＡ
ｐＣｐＴｐＴｐＴＯＨ（ＳＣＩ＋４１　　ＨＯＣｐＡｐ
ＣｐＴｐＴｐＣｐＧｐＴｐＧｐＴｐＴｐＧｐＡｐＴｐＡ
ｐＧＯＨｆｓＤｌ＋５１　　ＨＯＴｐＴｐＡｐＣｐＡｐ
ＡｐＣｐＣｐＡｐＧｐＣｐＣｐＡｐＴｐＧＯＨ（ＳＥ１
１６１　１１０ＣｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＡｐＡｐ
ＧｐＴｐＴｐＣＯＩ（（ＳＦ１（７）　　ＨＯＣｐＧｐ
ＡｐＡｐＧｐＴｐＧｐＡｐＡｐＡｐＧｐＴｐＣｐＴｐＴ
ＯＨ（ＳＧ）＋８）　　ＨＯＧｐＡｐＴｐＣｐＣｐＴｐ
ＡｐＴｐＣｐＡｐＡｐＣｐＡＯＨ（ＳＨＩこれらの合成
法は、前記へキサデカヌクレオチドＨＯＡｐＡｐＡｐＣ
ｐＣｐＧｐＡｐＣｐＣｐＧ　ｐ　Ｇ　ｐ　Ｃｐ　Ｔ　ｐ
　Ａ　ｐ　Ｔ　ｐ　Ｇ　ＯＨ（Ｇ　１　）の合成を参照
すれば説明されよう。 （１１）化学合成オリゴヌクレオチド類のハイブリッド
化とライゲーション： 子の場合と同様のやり方に従ってハイブリッド化し、ラ
イゲートした。 （３）合成Ｌｒｐプロモーター■遺伝子の分子クローニ
ング： 合成Ｌｒｐプロモーター１１ｉＨ伝子をプラスミドに挿
入した。この発明の適当な一具体化例として、Ｌｒｐブ
ロモ−クー■遺伝子をプラスミドｐＢｌ”１びＢ　ａ　
ｍ　ＨＩによってその部位を開裂することによって、挿
入した。こうして得たプラスミドをプラスミドｐＴｒｐ
ＥＢ７と名付りる。 〔３〕量白ペプチドＬ　Ｈ遺伝子の調製とクローニング
： ５９Ｖａ　Ｉ　−ＩＧＦ−１と融合できる保護ペプチド
の適当な−・イ列として、蛋白ベプチーしＩＩが調製さ
れている。 （１１蛋白ペプチドＬ、ｔｌ遺伝子の調製：組合せ、完
全な二本鎖ヌクレオチド配列を得るごとによって、２３
３ｂｐの分子を合成することとした。 ヨードしない、、１７　、　　３’−Ｇ−ＴＡＣ−ＡＣ
Ａ−ＡＴＧ−ＡＣＧ−ＧＴＣ−八ｓｐ　　Ｐｒｏ　　Ｔ
ｙｒ　Ｖａｌ　　Ｌｙｓ　　Ｇｌｕ　Ａｌａ　　Ｇｌｕ
　Ａｓｎ　　Ｌｅｕ　　ＬｙｓＬｙｓ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ
　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　
Ｖａｌ　ＡｌａＡｓｐ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌｅ
ｕ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　ＧｌｙＬｙｓ　Ｌｅｕ　ＬｙＳＡ
ｓｎ　Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ａｓ
ｐ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　工１６　Ｍｅｔ５０　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｈｉｎｄ
エエエＧｉｎ　Ｓｅｒ　Ｇ１．ｎ　Ｉｃｅ　Ｖａｌ、Ｓ
ｅｒ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　ＬｅｕＰｈｅ
　　Ｌｙｓ　　Ａｓｎ　　Ｐｈｅ　　Ｌｙｓ　　Ａｓｐ
　Ａｓｐ　　Ｇｌｎ　　Ｓｅｒ　　工ｌｅ　　ＧｌｎＴ
ＴＣ−ＡＡＡ−ＡＡＣ−ＴＴＴ−ＡＡＣ−ＧＡ！ｒ−Ｇ
ＡＣ−ＣＡＧ−ＡＧＣ−ＡＴＣ−ＣＡＡ−ＡＡＧ−ＴＴ
Ｔ−ＴＴＧ−ＡＡＡ−ＴＴＣ−ＣＴＡ−ＣＴＧ−ＧＴＣ
−ＴＣＧ−ＴＡＧ−ＧＴＴ−ＬｙＳＳｅｒ　Ｖａｌ　５
ｔｏｐ　５ｔｏｐ　Ｂ：１ｍＸ１工（ｉ）オリゴヌクレ
オヂド類の合成； オリゴヌクレオチド婉＃テ学頚は次の通りである： （１）　ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＧｐＴｐＧ
ｐＴｐＴＯＨ（ａｌｌ（２）　ＨＯＡｐＣｐＴｐＧｐＣ
ｐＣｐＡｐＧｐＧｐＡｐＣｐＣｐＣｐＡｐＴＯＨｆａ２
］（３）　ＨＯＡｐＴｐＧｐＴｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐ
ＡｐＡｐＧｐＣｐＡｐＧＯＨ（ａ３１（４１ＨＯＴｐＧ
ｐＧｐＣｐＡｐＧｐＴｐＡｐＡｐＣｐＡｐＣｐＡｐＴｐ
ＧＯＨｆａ４）（５）　ＨＯＴｐＴｐＴｐＡｐＣｐＡｐ
ＴｐＡｐＴｐＧｐＧｐＧｐＴｐＣｐＣＯＨ（ａ５１（６
１ＨＯＡｐＡｐＧｐＧｐＴｐＴｐＴｐＴｐＣｐＴｐＧｐ
ＣｐＴｐＴｐＣｐＴＯＨｆａ６）（刀　ＨＯＡｐＡｐＡ
ｐＡｐＣｐＣｐＴｐＴｐＡｐＡｐＧｐＡｐＡｐＡｐＴｐ
ＡＯＨ（ｂｌｌ・＋８１　ＨＯＣｐＴｐＴｐＴｐＡｐＡ
ｐＴｐＧｐＣｐＡｐＧｐＧｐＴｐＣｐＡＯＨ（ｂ２）（
９）　ＨＯＴｐＴｐＣｐＡｐＧｐＡｐＴｐＧｐＴｐＡｐ
ＧｐＣｐＧｐＧｐＡＯＨ（ｂ３１（１０）　　ＨＯＡｐ
ＴｐＴｐＡｐＡｐＡｐＧｐＴｐＡｐＴｐＴｐＴｐＣｐＴ
ｐＴＯＨ（ｂ４）（１１１ＨＯ八へＴｐＣｐＴｐＧｐＡ
ｐＡｐＴｐＧｐＡｐＣｐＣｐＴｐＧｐＣＯＨ（ｂ５１（
１２）　　ＨＯＴｐＴｐＣｐＣｐＡｐＴｐＴｐＡｐＴｐ
ＣｐＣｐＧｐＣｐＴｐＡｐＣＯＨ（ｂ６）（１３）　Ｈ
ＯＴｐＡｐＡｐＴｐＧｐＧｐＡｐＡｐＣｐＴｐＣｐＴｐ
ＴｐＴｐＴｐＣＯＨ（ａｌｌ（１４１ＨＯＴｐＴｐＡｐ
ＧｐＧｐＣｐＡｐＴｐＴｐＴｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧＯＨ
（ｃ２）（１５１１１０ＡｐＡｐＴｐＴｐＧｐＧｐＡｐ
ＡｐＡｐＧｐＡｐＧｐＧｐＡｐＧＯＨｆｃ３１（１６）
　　ＨＯＴｐＧｐＣｐＣｐＴｐＡｐＡｐＧｐＡｐＡｐＡ
ｐＡｐＧｐＡｐＧＯｌｌ　　（ｃ４）（１７１ＨＯＴｐ
ＣｐＣｐＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＴｐＴｐＣｐＡｐＡｐＡ
ｐＡＯＨ（ｃ５１（１８１ＨＯＣｐＴｐＧｐＴｐＣｐＡ
ｐＣｐＴｐＣｐＴｐＣｐＣｐＴｐＣｐＴｐＴＯＨ（ｃ６
１（１９）　　ＨＯＡｐＧｐＴｐＧｐＡｐＣｐＡｐＧｐ
ＡｐＡｐＡｐＡｐＡｐＴｐＡＯＨｆａｌｌ（２０１＋（
ＯＡｐＴｐＧｐＣｐＡｐＧｐＡｐＧｐＣｐＣｐＡｐＡｐ
ＡｐＴｐＴＯＨｆｄ２）（２１）　　ＨＯＧｐＴｐＣｐ
ＴｐＣｐＣｐＴｐＴｐＴｐＴｐＡｐＣｐＴｐＴＯＨ＋６
３１（２２）ＩＩＯＣｐＴｐＣｐＴｐＧｐＣｐＡｐＴｐ
ＴｐＡｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴＯＨ（ｄ４１（２３）　Ｈ
ＯＡｐＧｐＧｐＡｐＧｐＡｐＣｐＡｐＡｐＴｐＴｐＴｐ
ＧｐＧＯＩｌ　（ｄ５］（２４）　ＨＯＡｐＡｐＡｐＧ
ｐＣｐＴｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧｐＴｐＡｐＡｐＡＯＨｆ
ｄ６）（２５１ＨＯＣｐＡｐＡｐＧｐＣｐＴｐＴｐＴｐ
ＴｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐ八ＯＨ（ｅｌｌ（２６１ＨＯ
ＣｐＴｐＴｐＴｐＡｐＡｐＧへＧｐＡｐＴｐＧｐＡｐＣ
ｐＣｐＡＯＨ（ｅ２１（２７）　ＨＯＧｐＡｐＧｐＣｐ
ＡｐＴｐＣｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＡｐＧＯＨ（ｅ
３）（２８）　　ＨＯＣｐＣｐＴｐＴｐＡｐＡｐＡｐＧ
ｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＧｐＡＯＨ（ｅ４１＋２９１　
ＨＯＧｐＧｐＡｐＴｐＧｐＣｐＴｐＣｐＴｐＧｐＧｐＴ
ｐＣｐＡｐＴＯＨｆｅ５）ｔ３０）　　ＨＯＴｐＧｐＴ
ｐＧｐＴｐＡｐＡｐＴｐＧｐＡｐＴｐＡｐＧＯＨ（１１
）＋３１１　　ＨＯＴｐＡｐＣｐＡｐＣｐＡｐＣｐＴｐ
ＣｐＴｐＴｐＴｐＴＯＨ（１２１（３２１ＨＯＧｐＡｐ
ＴｐＣｐＣｐＴｐＡｐＴｐＣｐＡｐＴＯＨ（１３１（ｉ
ｉ）化学合成オリゴヌクレオチド類のハイブリた通り、
”Ｖａ　Ｉ　−ＩＧＦ−１遺伝子の場合と同様の・やり
方で、ハイブリッド化しライゲートした。 （２）蛋白ペプチドＬＨｉｌｉ転子の分串クローニング
：蛋白ペプチドＬ　Ｈ遺伝子をプラスミドに挿入した。 この発明の適当な一興体化例として、蛋白ペプチＦＬｌ
ｌｉｆｉ転子をプラスミドｐ１３Ｒ３２２に、第弁イ図
に示した通り、ＥＣ０ＲＩおよびＢａｍＨＩによってそ
の部位を開裂することにより、挿入した。かくして得た
プラスミドをプラスミドｐＬ　ＩＩ　ｌ　０７と名付け
る。 （４）”Ｖａ　Ｉ　−ＩＧＦ−１発現ベクターの構築：
”Ｖａｔ−ＩＣＦ−１遺伝子を、プロモーター遺伝子を
含有するプラスミドに挿入し、”Ｖａｌ−ｌ　ＧＦ−１
遺伝子を用いて宿主生物を形質転換した。 この発明の適当な一具体化例として、次の組換えプラス
ミドを、Ｅ、　ｃｏｌｔ中で”Ｖａｌ−ＩＣＦ−Ｉ遺伝
子を発現させるべく確立した。 （１）　　組み換えプラスミドｐＳｄＶ２　ｔ　ｒｐの
構築：上で調製したグラスミ６ドｐ　５Ｔ−１をＥＣＯ
Ｒ■で消化し、生した大きい断片に５９Ｖａｌ−ＩＧＦ
−１遺伝子を挿入した。こうして得た組換えプラスミド
をプラスミドｐＳＶ２ｔｒｐと名付、旦。 ＋２＋　　＆ｆｌ換えプラスミドｐＳｄＶ２−３２２ｔ
ｒｐの構築ニ プラスミドｐ　Ｔ　ｒ　ｐ　ＩＥ　Ｂ　７をＥｃｏＲＩ
およびＢａ昆ＨＩで消化し、生じた大型断片（４，１ｋ
ｂｐ）をアガロースゲル電気泳動によって分離した。 一方、”Ｖａｌ−ＩＣＦ−１遺伝子をプラスミドｐｓｄ
Ｖ２から車離し、上記プロモータヘククー（４，１ｋｂ
ｐ）とライゲートした。得られたアンピシリン抵抗性、
テトラサイクリン感受性形質転換体の二つからプラスミ
ドを車離し、制限酵素による消化と電気泳動とによって
、５９Ｖａｌ−ＩＣｌ３−１遺伝子を含有していること
を確認した。こうして得たプラスミドをプラスミドｐＳ
ｄＶ２−３２２ｔｒｐと名付け、このプラスミドを含存
す（５）”Ｖａ　Ｉ　−ＩＧＦ−１遺伝子およびプロモ
ーター遺伝子の配列決定： マキサム−ギルハート（Ｍａｘａｍ−ＧｉｌｂｅｒＬ　
）法を使用できる。 （１）　　プラスミドｐＳｂＶＺｔｒｐ中の５９Ｖａｌ
−ＩＧＦ−１ｉｆｔ伝子および合成Ｌｒｐプロモーター
１遺伝子の配列ニ ブラス゛ミドｐＳｄＶ２ｔｒｐ中の”Ｖａｌ−ＩＣＦ−
１遺伝子および合成ｔｒｐプロモーター１遺伝子の配列
を、後記プラスミドｐ３ｄＶ２−３２２ｔｒｐの場合と
同様のやり方で決定した。 （２）　　プラスミドｐｓｄｖ２−３２２ｔｒｐ中の５
９Ｖａｌ−ＩＣＦ−１ｉ）１伝子および合成ｔｒｐプロ
モーターＩ遺伝子の配列； ”Ｖａ　Ｉ−ＩＧＦ−１遺伝子および合成Ｌｒｐプロモ
ータＩ遺伝子の配列決定のため、プラスミドｐｓｄＶ２
−３２２ｔｒｐをＥｃｏＲＩで消化し、ＢＡＰ　（バク
テリア　アルカリホスファターゼ）で処理し、つぎに、
ｒ−”Ｐ−ＡＴＰの存在下にＴ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼで処理した。 標識されたＤＮＡをＩＩ　ｉ　ｎ　ｒ　Ｉで消化して、
二つの断片（１１０ｂｐおよび４８０ｂｐ）を得た。 これらの断片をマキ→ノ・ムーギルバート法により分析
した。　（Ａ、　　ＭａｘａｍとＷ、　　Ｇ１１ｂｅｒ
Ｌ、　　Ｐｒｏｃ。 Ｎａ１１．　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　Ｕ　ＳΔ５
１土、５６０（１９７７、））、判明した配列は、”Ｖ
ａｌ−ＩＣＦ−１遺伝子および合成プロモーター遺伝子
の設計配列と一致した。 〔６〕融合５９Ｖａ　Ｉ　−ＩＧＦ−１発現ベクターの
構築： ”Ｖａ　Ｉ　−ＩＧＦ−１遺伝子の上流にリンカ−を介
在させまたはさせずに、保護ペプチドをコードする遺伝
子を”Ｖａｌ−ＩＧＦ−１逍伝子と連結することにより
、融合”Ｖａｌ−ＩＧＦ−１をコードする遺伝子を調製
した。 このプロセスにおいては、最後のアミノ酸としてメチオ
ニンをもつ蛋白ペプチドを５９Ｖａｌ−ＩＧＦ−１と融
合させる。 このようにして得た融合”Ｖａｌ−ＩＧＦ−１は、次の
通りである。 本発明は、かかる融合”Ｖａｌ−ＩＣＦ−１をコードす
る遺伝子の発現ベクターにも関するもの築： この発明の適当な一興体化例として、次のタイプの、蛋
白ペプチドＬ　ｌ−１と融合した５９Ｖａｌ−ＩＧＦＩ
をコードする遺伝子の発現ベクターを調製した。 本発明は、保護ペプチドをコードする遺伝子を、リンカ
−を介在させまたはさせずに、”Ｖａｌ−ＩＧＦ−１遺
伝子と該”Ｖａｌ−ＩＧＦ−Ｉｉｆｉ伝子の転子で連結
して構築されるかかる遺伝子の発明のためのプロセスに
も関するものである。 ｉ社通七ｉにより宿主生物を形質転換する。 こ、の発明の好適な一興体化例として、旦３匹旦中で蛋
白ペプチドＬｌ（ｉｆｆ伝子転子現させるべく、次の、
ｔ、１１ｔＡえプラスミドを確立した。 Ｔｒｐプロモーター■プラスミドｐＴｒｐＥＢ７をＥＣ
０ＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、生じた大断片（４，
１ｋｂｐ）を７ガロースゲル電気泳動により分離した。 他方、蛋白ペプチドＬ　ＩＩ遺伝子をプラスミドｐＬＨ
Ｉ０７から単離し、前記プロモーターベクター（４，１
ｋｂｐ）とライゲートした。この混合物を用いてＥ、ｃ
ｏｌｉ　　ＨＢＩＯＩを形質転換した。得られたアンピ
シリン低抗性、テトラサイクリン感受性形質転換体の一
つからプラスミドを単離し、それが蛋白ペプチドＬｌ１
ｍ転子を含有していることを、制限酵素による消化と電
気泳動とによって圃認した。このようにして得上記で調
製したプラスミドｐＬ　Ｈｔ　ｒ　ｐをｔｌ　１ｎｄｌ
ＵおよびＢａｍＨＩで消化し、生じた大きい断片を分取
アガロースゲル電気泳動によって分離した。一方、”Ｖ
ａ　ｌ　−Ｉ　ＧＦ　−ｊｉｆｆ伝子を転子記ＥｃｏＲ
ＩおよびＢ　ａ　ｍ　Ｈｆ消化により、上で調製したプ
ラスミドｐＳｄＶ２から単離し、その上流に、それに隣
接して、オリゴヌクレオチＩ’ｍ１およびｍ２をリンカ
−として連結した。こうして得たリンカ一つき５９Ｖａ
　［−ｒＧＦ−１遺伝子を上記プラスミドｐ　Ｌ　Ｈｔ
　ｒ　ｐの大型断片とライゲートした。混合物を用いて
且１匹旦　）＋１３１０１を形質転換した。得られたア
ンピシリン抵抗性、テトラサイクリン惑受性の形質転換
体の一つからプラスミドをｊ■離し、それが、蛋白ペプ
チドＬｌｌと融合した”Ｖａｌ−ＩＣＦ−１をコードす
る遺伝子を含有することを、制限酵素による消化と電気
泳動とによって確認した。かくして得たプラスかくして
１：また、蛋白ペプチドＬＳＩ融合”Ｖａｌ−ＩＣ；Ｆ
−１をコードする遺伝子は次の通りである。 ＥｃｏＲ工Ｍｅｔ　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎコ
ードする鎖：　　ｓ　１−ＡＡＴＴＣ−ＡＴＧ−ＴＧＴ
−ＴＡＣ−ＴＧＣ−ＣＡＧ−コードしない鎖、　　　３
Ｉ−ｃ−ＴＡｃ−ＡｃＡ−ｈＴａ−Ａｃａ−ａＴｃ−Ａ
ｓｐ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｌ
ａ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　ＬｙｓＧＡＣ−ＣＣＡ−
ＴＡＴ−ＣＴＡ−ＡＡＡ−ＣＡＡ−ＧＣＡ−ＣＡＡ−Ａ
ＡＣ−ＣＴＴ−八ＡＧ−ＣＴＧ−ＧＧＴ−ＡＴＡ−ＣＡ
Ｔ−ＴＴＴ−ＣＴＴ−ＣＧＴ−ＣＴＴ−ＴＴＧ−ＧＭ−
ＴＴＣ−Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｇ
ｌｙ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　ＡｌａＡＡＡ
−ＴＡＣ−ＴＴＴ−ＡＡＴ−ＧＣＡ−ＧＧＴ−ＣＡＴ−
ＴＣＡ−ＧＡＴ−ＧＴＡ−ＧＣＧ−ＴＴＴ−ＡＴＧ−八
人Ａ−ＴＴへ−ＣＧＴ−ＣＣＡ−ＧＴＡ−ＡＧＴ−ＣＴ
Ａ−ＣＡＴ−ＣＧＣ−八ｓｐ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ
　　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｙ　　工１ｅ　
　Ｌｅｕ　　ＬｙｓＧＡＴ−ＭＴ−ＧＧＡ−ＡＣＴ−Ｃ
ＴＴ−ＴＴＣ−ＴＴＡ−ＧＧＣ−ＡＴＴ−ＴＴＧ−ＭＧ
−ＣＴＡ−ＴＴＡ−ＣＣＴ−ＴＧＡ−ＧＭ−ＭＧ−ＡＡ
Ｔ−ＣＣＧ−ＴＭ−ＭＣ−ＴＴＣ−Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ｌ
ｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｌｙ
ｓ工１ｅ　Ｍｅｔ八Ａへ−ＴＧＧ−八ＡＡ−ＧＡＧ−Ｇ
ＡＧ−ＡＧＴ−ＧＡＣ−ＡＧＡ−ＡＡＡ−ＡＴＡ−ＡＴ
Ｇ−ＴＴＡ−ＡＣＣ−ＴＴＴ−ＣＴＣ−ＣＴＣ−ＴＣＡ
−ＣＴＧ−ＴＣＴ−ＴＴＴ−ＴＡＴ−ＴＡＣ−５０Ｈｉ
ｎｄエエＩ Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ工ｌｅ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｐｈ
ｅ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　ＬｅｕＧｌｕ　Ｖａｌ　
Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ｐ
ｒｏ　Ｇｌｕ　ＴｈｒＬｅｕ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｌａ
　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　
ＧｉｎＣＴＧ−ＴＧＣ−ＧＧＣ−ＧＣＴ　−ＧＭ−ＣＴ
Ｇ−ＧＴＴ　−ＧＡＣ−ＧＣＴ−ＣＴＧ−ＣＡＡ−ＧＡ
Ｃ−ＡＣＧ−ＣＣＧ−ＣＧＡ−ＣＴＴ　−ＧＡＣ−ＣＡ
Ａ−ＣＴＧ　−ＣＧＡ−ＧＡＣ−ＧＴＴ　−ＰｈｅＶａ
ｌ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ
　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　ＡｓｎＴＴＴ　−ＧＴＡ−ＴＧＴ−
ＧＧＴ−ＧＡＴ　−ＣＧＴ−ＧＧＴ−ＴＴＣ−ＴＡＣ−
ＴＴＣ−ＡＡＣ−ＡＡＡ−ＣＡＴ−ＡＣＡ−ＣＣＡ−Ｃ
ＴＡ−ＧＣＡ−ＣＣＡ−ＡＡＧ−ＡＴＧ−ＡＡＧ−ＴＴ
Ｇ−Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ
　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　ＡｒｇＡＡＡ−Ｃ
ＣＧ−ＡＣＣ−ＧＧＣ−ＴＡＴ−ＧＧＣ−ＴＣＣ−ＡＧ
Ｃ−ＴＣＴ−ＣＧＴ−ＣＧＣ−ＴＴＴ−ＧＧＣ−ＴＧＧ
−ＣＣＧ−ＡＴＡ−ＣＣＧ−ＡＧＧ、−ＴＣＧ−ＡＧＡ
−ＧＣＡ−ＧＣＧ−Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ｔｈｒ　
Ｇｌｙ　工１ｅ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｃ
ｙｓＰｈｅ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ
　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　ＶａＩＴＴＴ−Ｃ
ＧＴ−ＴＣＴ−ＴＧＣ−ＧＡＴ−ＣＴＣ−ＣＧＣ−ＣＧ
Ｔ−ＣＴＧ−ＧＭ−ＧＴＴ　−ＡＡＡ−ＧＣＡ−ＡＧＡ
−ＡＣＧ−ＣＴＡ−ＧＡＧ−ＧＣＧ−ＧＣＡ−ＧＡＣ−
ＣＴＴ−ＣへＡ−Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｌ
ｅｕ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ａｌ
ａＴＡＣ−ＴＧＴ−ＧＣＴ−ＣＣＡ−ＣＴＧ−ＭＧ−Ｃ
ＣＡ−ＧＣＡ−ＡＡＡ−ＴＣＣ−ＧＣＧ−八ＴＧ−ＡＣ
Ａ−ＣＧＡ−ＧＧＴ−ＧＡＣ−ＴＴＣ−ＧＧＴ−ＣＧＴ
−ＴＴＴ−ＡＧＧ−ＣＧＣ−５ｔｏｐ　５ｔｏｐ　Ｂａ
ｍＨＩ ＴＧＡ−ＴＡＧ−３’ 八ＣＴ−ＡＴＣ−ＣＴＡＧ−５’ そして、蛋白ペプチドＬ　Ｈ融合５９Ｖａｌ−ＩＧＩ”
−１をコードする遺伝子は次の通りである；Ａｓｐ　Ｐ
ｒｏ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｇｌ
ｕ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　ＬｙｓＧＡＣ−ＣＣＡ−ＴＡＴ−
ＧＴＡ−八Ｍ−ＧＭ−ＧＣＡ−ＧＡＡ−ＭＣ−ＣＴＴ−
ＭＧ−ＣＴＧ−ＧＧＴ−ＡＴＡ−ＣＡＴ−ＴＴＴ−ＣＴ
Ｔ−ＣＧＴ−ＣＴＴ−ＴＴＧ−ＧＭ−ＴＴＣ−Ｌｙｓ　
Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｓ
ｅｒ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　ＡｌａＡＡＡ−ＴＡＣ−ＴＴＴ
−ＡＡＴ−ＧＣＡ−ＧＧＴ−ＣＡＴ−ＴＣＡ−ＧＡＴ−
ＧＴＡ−ＧＣＧ−ＴＴＴ−ＡＴＧ−ＡＡＡ−ＴＴＡ−Ｃ
ＧＴ−ＣＣＡ−ＧＴＡ−ＡＧＴ−ＣＴＡ−ＣＡＴ−ＣＧ
Ｃ−Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ
　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ工１ｅ　Ｌｅｕ　ＬｙｓＧＡＴ−ＭＴ
−ＧＧＡ−ＡＣＴ−ＣＴＴ−ＴＴＣ−ＴＴＡ−ＧＧＣ−
ＡＴＴ−ＴＴＧ−へＡＧ−ＣＴＡ−ＴＴへ−ＣＣＴ−Ｔ
Ｇへ−ＧＡＡ−八ＡＧ−ＡＡＴ−ＣＣＧ−ＴＡＡ−７１
，ＡＣ−ＴＴＣ−Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇ
ｌｕ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　工１ｅ　Ｍｅ
ｔＡＡＴ−ＴＧＧ−ＡＡＡ−ＧＡＧ−ＧＡＧ−ＡＧＴ−
ＧＡＣ−ＡＧＡ−ＡＡＡ−ＡＴＡ−ＡＴＧ　−ＴＴＡ−
ＡＣＣ−ＴＴＴ−ＣＴＣ−ＣＴＣ−ＴＣＡ−ＣＴＧ−Ｔ
ＣＴ−ＴＴＴ−ＴＡＴ−ＴＡＣ−５０Ｈｉｎｄエエエ Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　工１ｅＶａｌ　Ｓｅｒ　Ｐｈ
ｅ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　ＬｅｕＣＡＧ−ＡＧＣ−
ＣＡＡ−ＡＴＴ−ＧＴＣ−ＴＣＣ−ＴＴＴ−ＴＡＣ−Ｔ
ＴＣ−ＭＧ−ＣＴＴ−ａＴｃ−Ｔｃｃ−ａｒＴ−ＴＡＡ
ＬｃＡＧ−Ａｃｃ−ｕ野−ＡＴＧ−ＡＡＧ−ＴＴＣ−Ｇ
ＡＡ−Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　Ｐ？
＋ｅＭｅｔ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　ＴｈｒＧＭ−Ｇ
ＴＡ−ＡＡＡ−ＣＡＴ−ＧＭ−ＴＴＣ−ＡＴＧ−ＧＧＴ
−ＣＣＴ−ＧＭ−ＡＣＴ−ＣＴＴ−ＣＡＴ−ＴＴＴ−Ｇ
ＴＡ−ＣＴＴ−ＭＧ−ＴＡＣ−ＣＣＡ−ＧＧＡ−ＣＴＴ
−ＴＧＡ−Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　
Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　ＧｉｎＣＴ
Ｇ−ＴＧＣ−ＧＧＣ−ＧＣＴ−ＧＡＡ−ＣＴＧ−ＧＴＴ
−ＧＡＣ−ＧＣＴ−ＣＴＧ−ＣＭ−ＧＡＣ−ＡＣＧ−Ｃ
ＣＧ−ＣＧＡ−ＣＴＴ−ＧＡＣ−ＣＡＡ−ＣＴＧ−ＣＧ
Ａ−ＧＡＣ−ＧＴＴ−Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ
　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　
ＡｓｎＴＴＴ−ＧＴＡ−ＴＧＴ−ＧＧＴ−ＧＡＴ−ＣＧ
Ｔ−ＧＧＴ−ＴＴＣ−ＴＡＣ−ＴＴＣ−ＡＡＣ−ＡＡＡ
−ＣＡＴ−八ＣＡ−ＣＣＡ−ＣＴＡ−ＧＣＡ−ＣＣＡ−
ＡＡＧ−ＡＴＧ−ＡＡＧ−ＴＴＧ−Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｔ
ｈｒ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅ
ｒ　Ａｒｇ　ＡｒｇＡＡＡ−ＣＣＧ−ＡＣＣ−ＧＧＣ−
ＴＡＴ−ＧＧＣ−ＴＣＣ−ＡＧＣ−ＴＣＴ−ＣＧＴ−Ｃ
ＧＣ−ＴＴＴ−ＧＧＣ−ＴＧＧ−ＣＣＧ−ＡＴＡ−ＣＣ
Ｇ−ＡＧＧ−ＴＣＧ−八ＧＡ−ＧＣＡ−ＧＣＧ−Ａｌａ
　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ工１ｅ　Ｖａｌ　Ａ
ｓｐ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　ＣｙｓＰｈｅ　Ａｒｇ　　Ｓｅ
ｒ　　Ｃｙｓ　　Ａｓｐ　　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　
Ｌｅｕ　　Ｇｌｕ　　ＶａｌＴＴＴ−ＣＧＴ−ＴＣＴ−
ＴＧＣ−ＧＡＴ−ＣＴＣ−ＣＧＣ−ＣＧＴ−ＣＴＧ−Ｇ
Ｍ−ＧＴＴ−Ｎ彷−ＧＣＡ−ＡＧＡ−ＡＣＧ−ＣＴＡ−
ＧＡＧ−ＧＣＧ−ＧＣＡ−ＧＡＣ−ＣＴＴ−ＣＭ−Ｔｙ
ｒ　ＣｙｓＡｌａ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　
Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　ＡｌａＴＡＣ−ＴＧＴ−ＧＣ
Ｔ−ＣＣＡ−ＣＴＧ−ＭＧ−ＣＣＡ−ＧＣＡ−ＡＪ彷−
ＴＣＣ−ＧＣＧ−３’ＡＴＧ−ＡＣＡ−ＣＧＡ−ＧＧＴ
−ＧＡＣ−ＴＴＣ−ＧＧＴ−ＣＧＴ−ＴＴＴ−ＡＧＧ−
ＣＧＣ−５’ｆ２１　　”Ｖａ　１−ＩＣＦ−１遺伝子
の下流にかつそれに隣接するターミネークーをイ１する
蛋白ペプチド遺伝子と融合した”Ｖａ　Ｉ　−ＩＧＦ−
１をコードする遺伝子の発現ヘククーの構築： クーミネークーが該Ｓ″’Ｖａｌ−ＩＣＦ−１遺伝子の
下流にかつそれに隣接する位置に挿入されうる。 適当な「クーミネーター」としては、適切な酵素認識部
位をコードする遺伝子が含まれうる。 ｆａ＋　　オリゴヌクレオチド１■の合成；１４種のオ
リゴヌクレオチドをさらに合成した。 ＋４１　　ＨＯＧｐＡｐＴｐＣｐＣｐＴｐＣｐＧｐＡｐ
ＧｐＡｐＴｐＣｐＡｐＡＯＨ（八１）（２）　ＨＯＧｐ
ＣｐＣｐＴｐＴｐＴｐＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＣ
ｐＴｐＣｐＧｐＡｐＧＯＨｆＢ’）（３）　　ＨＯＴｐ
ＴｐＡｐＡｐＡｐＧｐＧｐＣｐＴｐＣｐＣｐＴｐＴｐＴ
ｐＴｐＧｐＧｐＡＯＨｌｃ’１（４１ＨＯＡｐＡｐＡｐ
ＡｐＡｐＧｐＧｐＣｐＴｐＣｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧ
ｐＧｐＡＯＨ（Ｄ’１（５１ＨＯＧｐＣｐＣｐＴｐＴｐ
ＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＧＯＨ（Ｅ’）＋６
１　ＨＯＴｐＣｐＧｐＡｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＡＯＨ
（Ｆ’１１７）　ＨＯＧｐＡｐＴｐＣｐＣｐＴｐＣｐＧ
ｐＡｐＧｐＣｐＴＯ）ｌ　（Ｇ’）（８１ＨＯＧｐＴｐ
ＴｐＴｐＡｐＡｐＴｐＣｐＡｐＧｐＣｐＴｐＣｐＧｐＡ
ｐＧＯＨ（Ｈ’）＋９１　　＋１０ＧｐＡｐＴｐＴｐＡ
ｐＡｐＡｐＣｐＣｐＧｐＡｐＡｐＴｐＣｐＡｐＡＯＩＩ
　　（工１）（１０１ＨＯＧｐＣｐＣｐＴｐＴｐＴｐＡ
ｐＡｐＴｐＴｐＧｐＡｐＴｐＴｐＣｐＧＯ）（ｆ、ｆｆ
’１（１１）　ＨＯＧｐＣｐＣｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐ
ＴｐＴｐＴｐＴｐＴＯ）Ｉ　（Ｋ’１（１２）　　ＨＯ
ＴｐＣｐＴｐＣｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＡＯＨ＋Ｌ’１
ｆ１３）　　１ｌＯＧｐＧｐＡｐＧｐＡｐＣｐＡｐＡｐ
ＣｐＧＯＨｔＭ’）（１４１ＨＯＴｐＣｐＧｐＡｐＣｐ
ＧｐＴｐＴｐＧＯＨ（Ｎ’１ｆｂｌ　　化学合成オリゴ
ヌクレオチド類のライゲーション： 示した通り、”Ｖａｌ−ＩＣＦ−１の場合と同様のやり
方に従ってハイブリッド化、ライゲートしてクーミネー
ターＳを得た。 （ｉｉ）クーミネークーＬ（ｔｅｒｌ−）Ｉの場合と同
様のやり方に従ってハイブリッド化、ライゲートしてク
ーミネーターＬを得た。 ｔｅｌ　　ターミネークーＳおよびクーミネークーＬの
クローニング： クーミネークーＳおよびクーミネーターＬを、それぞれ
”Ｖａｌ−ＩＣ，Ｆ−１ｉｆｌ伝子の下流にか（３）　
　β−ガラクトシダーゼ融合”Ｖａｌ−ＩＣＦ−１発現
ヘクターの構築； （ａｌ　　組み換えプラスミドｐｓａｖ２−１ａｃの構
築ニ プラスミドｐＳｄＶ２−１ａｃを実施例２２に記載の方
法で構築した。 ｆｂｌ　　組み換えブー７スミドｐＳｄＶ２−ＮＴ４９
の構築ニ プラスミドｐＳｄＶ２−、、ＮＴイ９を実施例２４゜に
記載の方法で構築した。 （Ｃ１β−ガラクトシダーゼ融合”Ｖａｌ−１０Ｆ　−
，１をコードする遺伝子： β−ガラクトシダーゼ融合”Ｖａｌ　　ＩＣＦ−■をコ
ードする遺伝子は次の通りである：Ｔｈｒ　Ｍｅｔ工ｌ
ｅ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｖａｌ
　Ｖａｌ　ＬｅｕＡＣＣ−ＡＴＧ−ＡＴＴ−ＡＣＧ−Ｇ
ＡＴ−ＴＣＡ−ＣＴＧ−ＧＣＣ−ＧＴＣ−ＧＴＴ−ＴＴ
Ａ−ＴＧＧ−ＴＡＣ−ＴＭ−ＴＧＣ−ＣＴＡ−ＡＧＴ−
ＧＡＣ−ＣＧＧ−ＣＡＧ−ＣＭ−ＭＴ−Ｇｌｎ　　Ａｒ
ｇ　八ｒｇ　Ａｓｐ　　Ｔｒｐ　　Ｇｌｕ　　Ａｓｎ　
　Ｐｒｏ　　Ｇｌｙ　　Ｖａｌ　　ＴｈｒＣＭ−ＣＧＴ
−ＣＧＴ−ＧＡＣ−ＴＧＧ−ＧＡＡ−ＭＣ−ＣＣＴ−Ｇ
ＧＣ−ＧＴＴ−ＡＣＣ−ＧＴＴ−ＣＣＡ−ＧＣＡ−ＣＴ
Ｇ−ＡＣＣ−ＣＴＴ−ＴＴＧ−ＧＧＡ−ＣＣＧ−ＣＭ−
ＴＧＧ−Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ａ
ｌａ　Ａｌａ　Ｈｉｓ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　ＰｈｅＣＡＡ
−ＣＴＴ−ＭＴ−ＣＧＣ−ＣＴＴ−ＧＣＡ−ＧＣＡ−Ｃ
ＡＴ−ＣＣＣ−ＣＣＴ−ＴＴＣ−ＧＴＴ−ＧＡＡ−ＴＴ
Ａ−ｃｃｃ−ＧＡＡ−ＣＧＴ−ＣＧＴ−ＧＴＡ−ＧＧＧ
−ＧＧＡ−ＡＡＧ　−八ｌａ　　Ｓｅｒ　　Ｔｒｐ　　
Ａｒｇ　　Ａｓｎ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｕ　　Ｇｌｕ　　
Ａｌａ　　Ａｒｇ　　ＴｈｒＧＣＣ−ＡＧＣ−ＴＧＧ−
ＣＧＴ−八ＡＴ−ＡＧＣ−ＧＭ−ＧＡＧ−ＧＣＣ−ＣＧ
Ｃ−ＡＣＣ−ＣＧＧ−ＴＣＧ−ＡＣＣ−ＧＣＡ−ＴＴＡ
−ＴＣＧ−ＣＴＴ−ＣＴＣ−ＣＧＧ−ＧＣＧ−ＴＧＧ−
Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ｌ
ｅｕ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　ＡｓｎＧｌｙ　Ｇｌｕ
　Ｔｒｐ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｔｒｐ　　Ｐｈｅ
　　Ｐｒｏ　八ｌａ　　Ｐｒ。 ＧＧＣ−ＧＭ−ＴＧＧ−ＣＧＣ−ＴＴＴ−ＧＣＣ−ＴＧ
Ｇ−ＴＴＴ−ＣＣＧ　−ＧＣＡ−ＣＣＡ　−ＣＣＧ　−
ＣＴＴ−ＡＣＣ−ＧＣＧ−ＭＡ−ＣＧＧ−ＡＣＣ−ＡＭ
−ＧＧＣ−ＣＧＴ　−ＧＧＴ　−Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｖａ
ｌ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ
　Ｃｙｓ　ＡｓｐＧＭ−ＧＣＧ−ＧＴＧ−ＣＣＧ　−Ｇ
Ｍ−ＡＧＣ−ＴＧＧ−ＣＴＧ　−ＧＡＧ　−ＴＧＣ−Ｇ
ＡＴ　−ＣＴＴ−ＣＧＣ−ＣＡＣ−ＧＧＣ−ＣＴＴ−Ｔ
ＣＧ−ＡＣＣ−ＧＡＣ−ＣＴＣ−ＡＣＧ　−ＣＴＡ−Ｌ
ｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｖａ
ｌ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　５ｅｒＣＴＴ−ＣＣＴ−
ＧＡＧ−ＧＣＣ−ＧＡＴ−ＡＣＴ−ＧＴＣ−ＧＴＣ−Ｇ
ＴＣ−ＣＣＣ−ＴＣＡ−ＧＡＡ−ＧＧＡ−ＣＴＣ−ＣＧ
Ｇ−ＣＴＡ−ＴＧＡ−ＣＡＧ−ＣＡＧ−ＣＡＧ−ＧＧＧ
−ＡＧＴ−Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ｇｉｎ　Ｍｅｔ　Ｈｉｓ　
Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｐｒｏ工１ｅＭＣ−
ＴＧＧ−ＣＡＧ−ＡＴＧ−ＣＡＣ−ＧＧＴ−ＴＡＣ−Ｇ
ＡＴ−ＧＣＧ−ＣＣＣ−ＡＴＣ−ＴＴＧ−ＡＣＣ−ＧＴ
Ｃ−ＴＡＣ−ＧＴＧ−ＣＣＡ−ＡＴＧ−ＣＴＡ−ＣＧＣ
−ＧＧＧ−ＴＡＧ−Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　　Ｖａｌ
　　Ｔｈｒ　　Ｔｙｒ　　Ｐｒｏ　　工１−ｅ　　Ｔｈ
ｒ　Ｖａｌ　　八ｓｎＴＡＣ−ＡＣＣ−ＭＣ−ＧＴＡ−
ＡＣＣ−ＴＡＴ−ＣＣＣ−ＡＴＴ−ＡＣＧ−ＧＴＣ−Ｍ
Ｔ−ＡＴＧ−ＴＧＧ−ＴＴＧ−ＣＡＴ−ＴＧＧ−ＡＴＡ
−ＧＧＧ−ＴＭ−ＴＧＣ−ＣＡＧ−ＴＴＡ−Ｐｒｏ　Ｐ
ｒｏ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ａｓ
ｎ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　ＧｌｙＣＣＧ−ＣＣＧ−ＴＴＴ−
ＧＴＴ−ＣＣＣ−ＡＣＧ−ＧＡＧ−ＡＡＴ−ＣＣＧ−Ａ
ＣＧ−ＧＧＴ−ＧＧＣ−ＧＧＣ−ＡＡＡ−ＣＭ−ＧＧＧ
−ＴＧＣ−ＣＴＣ−ＴＴＡ−ＧＧＣ−ＴＧＣ−ＣＣＡ−
Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　ＰｈｅＡｓ
ｎ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　ＳｅｒＴＧＴ−ＴＡＣ−
ＴＣＧ−ＣＴＣ−ＡＣＡ−ＴＴＴ−ＭＴ−ＧＴＴ−ＧＡ
Ｔ−ＣＡＡ−ＡＧＣ−ＡＣＡ−ＡＴＧ−ＡＧＣ−ＧＡＧ
−ＴＧＴ−ＡＡＡ−ＴＴＡ−ＣＡＡ−ＣＴＡ−ＣＴＴ−
ＴＣＧ−Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｇ
ｌｎ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ工１ｅ　Ｉｌｅ　ＰｈｅＴＧＧ−
ＣＴＡ−ＣＡＧ−ＧＭ−ＧＧＣ−ＣＡＧ−ＡＣＧ−ＣＧ
Ａ−ＡＴＴ−ＡＴＴ−ＴＴＴ−ＡＣＣ−ＧＡＴ−ＧＴＣ
＝ＣＴＴ−ＣＣＧ−ＧＴＣ−ＴＧＣ−ＧＣＴ−ＴへＡ−
ＴＡＡ−ＡＡＡ−Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｓ
ｅｒ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｔ’ｒｐ　Ｃ
ｙｓＧＡＴ−ＧＧＣ−ＧＴＴ−八ＡＣ−ＴＣＧ−ＧＣＧ
−ＴＴＴ−ＣＡＴ−ＣＴＧ−ＴＧＧ−ＴＧＣ−ＣＴＡ−
ＣＣＧ−ＣＡＡ−ＴＴＧ−ＡＧＣ−ＣＧＣ−八ＡＡ−Ｇ
ＴＡ−ＧＡＣ−ＡＣＣ−ＡＣＧ−Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ａｒ
ｇ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ
　Ａｓｐ　ＳｅｒＭＣ−ＧＧＧ−ＣＧＣ−ＴＧＧ−ＧＴ
Ｃ−ＧＧＴ−ＴＡＣ−ＧＧＣ−ＣＡＧ−ＧＡＣ−ＡＧＴ
−ＴＴＧ−ＣＣＣ−ＧＣＧ−ＡＣＣ−ＣＡＧ−ＣＣＡ−
ＡＴＧ−ＣＣＧ−ＧＴＣ−ＣＴＧ−ＴＣＡ−Ａｒｇ　Ｌ
ｅｕ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｌｅ
ｕ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　ＰｈｅＣＧＴ−ＴＴＧ−ＣＣＧ−
ＴＣＴ−ＧＭ−ＴＴＴ−ＧＡＣ−ＣＴＧ−ＡＧＣ−ＧＣ
Ａ−ＴＴＴ−ＧＣＡ−ＡＡＣ−ＧＧＣ−ＡＧＡ−ＣＴＴ
−ＡＡＡ−ＣＴＧ−ＧＡＣ−ＴＣＧ−ＣＧＴ−ＡＡＡ−
Ｌｅｕ　　Ａｒｇ　　Ａｌａ　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｕ　　
Ａｓｎ　　Ａｒｇ　　Ｌｅｕ　　Ａｌａ　　Ｖａｌ　　
ＭｅｔＴＴＡ−ＣＧＣ−ＧＣＣ−ＧＧＡ−ＧＭ−ＭＣ−
ＣＧＣ−ＣＴＣ−ＧＣＧ−ＧＴＧ−ＡＴＧ−へへＴ−Ｇ
ＣＧ−ＣＧＧ−ＣＣＴ−ＣＴＴ−ＴＴＧ−ＧＣＧ−ＧＡ
Ｇ−ＣＧＣ−ＣＡＣ−ＴＡＣ−Ｖａｌ　Ｌａｕ　Ａｒｇ
　Ｔｒｐ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　
Ｌｅｕ　ＧｌｕＧＴＧ−ＣＴＧ−ＣＧＴ−ＴＧＧ−ＡＧ
Ｔ−ＧＡＣ−ＧＧＣ−ＡＧＴ−ＴＡＴ−ＣＴＧ−ＧＡＡ
−ＣＡＣ−ＧＡＣ−ＧＣＡ−ＡＣＣ−ＴＣＡ−ＣＴＧ−
ＣＣＧ−ＴＣＡ−ＡＴＡ−ＧＡＣ−ＣＴＴ　−Ａｓｐ　
Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｍｅｔ　Ｔｒｐ　Ａｒｇ　Ｍｅｔ　Ｓ
ｅｒ　Ｇｌｙ　工１ｅ　ＰｈｅＧＡＴ−ＣＡＧ−ＧＡＴ
−ＡＴＧ−ＴＧＧ−ＣＧＧ−ＡＴＧ−ＡＧＣ−ＧＧＣ−
ＡＴＴ−ＴＴＣ−ＣＴＡ−ＧＴＣ−ＣＴＡ−ＴＡＣ−Ａ
ＣＣ−ＧＣＣ−ＴＡＣ−ＴＣＧ−ＣＣＧ−ＴＡＡ−ＭＧ
−２１０２２’Ｏ Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｈ
ｉｓ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　ＴｈｒＧｌｎ　工１ｅ
　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｈｉｓ　Ｖａｌ　Ａｌａ　
Ｔｈｒ　Ａｒｇ　ＰｈｅＣ八Ａ−へＴＣ−ＡＧＣ−ＧＡ
Ｔ−ＴＴＣ−ＣＡＴ−ＧＴＴ−ＧＣＣ−ＡＣＴ−ＣＧＣ
−ＴＴＴ−ＧＴＴ−ＴＡＣ−ＴＣＧ−ＣＴＡ−ＡＡＧ−
ＧＴＡ−ＣＡＡ−ＣＧＧ−ＴＧＡ−ＧＣＧ−ＡＡＡ−Ａ
ｓｎ　　Ａｓｐ　　Ａｓｐ　　Ｐｈｅ　　Ｓｅｒ　　Ａ
ｒｇ　　Ａｌａ　　Ｖａｌ　　Ｌｅｕ　　Ｇ１＋ｊ　　
Ａｌ−ａＡＡＴ−ＧＡＴ−ＧＡＴ−ＴＴＣ−ＡＧＣ−Ｃ
ＧＣ−ＧＣＴ−ＧＴＡ−ＣＴＧ−ＧＡＧ−ＧＣＴ−ＴＴ
Ａ−ＣＴＡ−ＣＴＡ−ＭＧ−ＴＣＧ−ＧＣＧ−ＣＧＡ−
ＣＡＴ−ＧＡＣ−ＣＴＣ−ＣＧＡ−Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｇ
ｌｎ　Ｍｅｔ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｒ
ｇ　Ａｓｐ　ＴｙｒＧＭ−ＧＴＴ−ＣＡＧ−ＡＴＧ−Ｔ
ＧＣ−ＧＧＣ−ＧＡＧ−ＴＴＧ−ＣＧＴ−ＧＡＣ−ＴＡ
Ｃ−ＣＴＴ−ＣＭ−ＧＴＣ−ＴＡＣ−ＡＣＧ−ＣＣＧ−
ＣＴＣ−ＡＡＣ−ＧＣＡ−ＣＴＧ−ＡＴＧ−Ｌｅｕ　Ａ
ｒｇ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｔｒ
ｐ　Ｇｌ−ｎ　Ｇｌｙ　ＧｌｕＣＴＡ−ＣＧＧ−ＧＴＡ
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ＣＣＡ−ＧＧＡ−ＣＴＴ−ＴＧＡ−Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｇ
ｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ａｌ
ａ　Ｌｅｕ　ＧｉｎＣＴＧ−ＴＧＣ−ＧＧＣ−ＧＣＴ−
ＧＡＡ−ＣＴＧ−ＧＴＴ−ＧＡＣ−ＧＣＴ−ＣＴＧ−Ｃ
ＡＡ−ＧＡＣ−ＡＣＧ−ｃｃｉ：；−ＣＧＡ−ＣＴＴ−
ＧＡＣ−ＣＡＡ−ＣＴＧ−ＣＧＡ−ＧＡＣ−ＧＴＴ−Ｐ
ｈｅ　Ｖａｌ　ＣｙｓＧｌｙ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ
　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　ＡｓｎＴＴＴ−ＧＴＡ−Ｔ
ＧＴ−ＧＧＴ−ＧＡＴ−ＣＧＴ−ＧＧＴ−ＴＴＣ−ＴＡ
Ｃ−ＴＴＣ−ＭＣ−Ｎ倶−ＣＡＴ−ＡＣＡ−ＣＣＡ−Ｃ
ＴＡ−ＧＣＡ−ＣＣＡ−ＭＧ−ＡＴＧ−ＭＧ−ＴＴＧ−
Ｌｙｓ　　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　　Ｇｌｙ　　Ｔｙｒ　Ｇｌ
ｙ　　Ｓｅｒ　　Ｓｅｒ　　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　ＡｒｇＡ
ＡＡ−ＣＣＧ−ＡＣＣ−ＧＧＣ−ＴＡＴ−ＧＧＣ−ＴＣ
Ｃ−八ＧＣ−ＴＣＴ−ＣＧＴ−ＣＧＣ−ＴＴＴ−ＧＧＣ
−ＴＧＧ−ＣＣＧ−八ＴＡ−ＣＣＧ−ＡＧＧ−ＴＣＧ−
ＡＧＡ−ＣＣＡ−ＧＣＧ−Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ｔ
ｈｒ　Ｇｌｙ工１ｅ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ
　ＣｙｓＧＣＡ−ＣＣＧ−ＣＡＧ−ＡＣＴ−ＧＧＴ−Ａ
ＴＣ−ＧＴＡ−ＧＡＣ−ＧＡＡ−ＴＧＣ−ＴＧＴ−ＣＧ
Ｔ−ＧＧＣ−ＧＴＣ−ＴＧＡ−ＣＣＡ−ＴＡＧ−ＣＡＴ
−ＣＴＧ−ＣＴＴ−ＡＣＧ−ＡＣＡ−Ｐｈｅ　Ａｒｇ　
Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｌ
ｅｕ　Ｇｌｕ　ＶａｎＴＴＴ−ＣＧＴ−ＴＣＴ−ＴＧＣ
−ＧＡＴ−ＣＴＣ−ＣＧＣ−ＣＧＴ−ＣＴＧ−ＧＡＡ−
ＧＴＴ−ＭＡ−ＧＣＡ−ＡＧＡ−ＡＣＧ−ＣＴＡ−ＧＡ
Ｇ−ＧＣＧ−ＧＣＡ−ＧＡＣ−ＣＴＴ−ＣＡＡ−Ｔｙｒ
　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　
Ａｌａ　　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　ＡｌａＴＡＣ−ＴＧＴ−Ｇ
ＣＴ−ＣＣＡ−ＣＴＧ−ＡＡＧ−ＣＣＡ−ＧＣＡ−八人
Ａ−ＴＣＣ−ＧＣＧ−３’ＡＴＧ−ＡＣＡ−ＣＧＡ−Ｇ
ＧＴ−ＧＡＣ−ＴＴＣ−ＧＧＴ−ＣＧＴ−ＴＴＴ−ＡＧ
Ｇ−ＣＧＣ−５’〔７〕宿主生物での５″Ｖａ　ｌ　−
ＩＧＦ　−１遺伝子の発現： ５９Ｖａ　ｌ　−ＩＧＦ−１遺伝子を発現させるため、
こうして得たプロモーフ遺伝子と５９Ｖａｌ−ＩＧＦ−
１遺伝子とを有するプラスミドを用いて宿主生物を形質
転換し、つぎにそのプラスミドを存する宿主生物を、同
化可能な炭素源および窒素源を含有する栄養培地中で、
好気性条件下に（たとえば振とう培養、深部培養など）
培養する。 栄養培地中の好ましい炭素源は、グルコース。 フルクトース、スクロース、グリセリン、でん粉などの
ごとき炭水化物である。包含されうる他の炭素源は、キ
シロース、ガラクトース、マルトース、デキストリン、
ラクトースなどである。 好ましい窒素ｄｒＡは、酵母エキス、ペプトン、グルテ
ン粉、綿実粉、大豆粉、コーンスチープリカー、乾燥酵
母、小麦の麦芽など、ならびに、硝酸アンモニウム、硫
酸アンモニウム、燐酸アンモニウム、尿素、アミノ酸な
どのごとき無機および有機の窒素化合物である。 の量の無機栄養源を含有する相対的に低純度の材料も使
用に適しているので、それらは必ずしも純粋な形で使用
することを要しない。所望の時には、炭酸カルシウム、
燐酸ナトリウムまたはカリウム。 塩化ナトリウムまたはカリウム、マグネシウム塩類、銅
塩類などの無機塩類を培地に添加してもよい。 培養混合物の攪拌および通気は種々の方法で達成できる
。攪拌は、プロペラまたは類似の機械的攪拌装置により
、醗酵槽の回転または振とうにより、種々のポンプ装置
により、または無菌の空気を培地に通すことにより、も
たらされる。攪拌は、醗酵混合物に無菌空気を通過させ
ることにより遂行しうる。 醗酵は、通常約２０℃と４２°Ｃとの間の温度で、好ま
しくは３５〜３８℃の間の温度で、数時間ないし５０時
間にわたって行う。 こうして産出された５９Ｖａｌ−ＩＧＦ−１または融合
”Ｖａ　Ｉ　−ＩＧＦ−１は、他の既知の生物学的活性
物質の回収に一般的に用いられる慣用の手段によって培
養培地から回収できる。一般的には、産出された５９Ｖ
ａｌ−ＩＧＦ−１または融合”Ｖａｌ−ＩＧＦ−１は宿
主生物の細胞中に見出され、従って、”Ｖａｌ−ＩＧＦ
−Ｉまたは融合５９Ｖａ、１−ＩＧＦ−’　Ｉは、培養
液を濾過または遠心分離して得られる細胞から、減圧下
の濃縮、超音波処理などの細胞破砕、ＨＰＬＣ，凍結乾
燥。 ｐＨ１１節、樹脂（たとえばアニオンまたはカチオン交
換樹脂、非イオン性吸着樹脂）を用いての処理、慣用の
吸着剤（たとえば活性炭、珪酸、シリカゲル、セルロー
ス、アルミナ）での処理、ゲル濾過、晶出などの常法に
よって、分離できる。 （１）　　プラスミドｐ３ｄＶ２ｔｒｌ’を用いての基
６ｃｏｌｉ中での”Ｖａｌ−ＩＧＦ−１遺伝子の発現ｐ
ｓｄＶ２ｔｒｐ含有旦９匹旦　ＨＢＩＯＩをＬブロス中
で一夜培養したものをトップ１〜フ不含不含Ｍ９培地で
希釈し、細胞を、β−インドールアクリル酸誘導の条件
下に、３７℃で３時間インキユヘートした。”Ｖａｌ−
ＩＧＦ−１産生の検出は、矢内原の方法〔矢内原ら、Ｐ
ｅｐｔｉｄｅ　　Ｈｏｒ−ｍｏｎｅｓ　ｉｎ　　Ｐａｎ
ｃｒｅａｓ、　　３．　２８　　（１９８３）　）に従
って、”Ｖａｌ−ＩＧＦ　　Ｉ断片（２６−４６）の抗
体を用いて、放射免疫測定法（以下ＲＩＡという）によ
り行った。 （２）　　プラスミドｐＳｄＶ２−３２２　ｔ　ｒｌｌ
）を用いての旦６匹旦　　中での５９Ｖａ　ｌ　−ＩＧ
Ｆ−１遺伝子の発現 プラスミドｐｓｄＶ２−３２２ｔｒｐを含有する旦９匹
旦　ＨＢ　１０１をＬブロス中で一夜培養したものを、
トリプトファン不含Ｍ９培地で稀釈し、β−インドール
アクリル酸誘導条件下に細胞を３７℃で３時間インキユ
ヘートした。”Ｖａｌ−ＩＧＦ−Ｉ産生の検知は、矢内
原の方法に従って、５９Ｖａｌ−ＩＧＦ−１断片（２６
−４６）の抗体を用いＲＩＡによって行った。 〔８〕融合５９Ｖａ　］　−１ＣＦ−Ｉをコードする遺
伝子の宿主生物中での発現： （１）蛋白ペプチドＬ　Ｈ融合”Ｖａｌ−ＩＧＦ−１を
コードする遺伝子の宿主生物中での発現：蛋白ペプチド
ＬＨ融合５９Ｖａｌ−ＩＧＦ−１をコードする遺伝子を
発現させるため、プロモーター遺伝子と、蛋白ペプチド
ＬＨ融合”Ｖａｌ−ＩＧＦ−Ｉとを有するプラスミドを
用いて宿主生物を形質転換し、つぎに、そのプラスミド
を有する宿主生物を適当な培地中で培養する。得られた
培養液から蛋白ペプチドＬＨ融合５９Ｖａｌ−ＩＧＦい
ての、旦、延中での発現： ｐＬＨ３ｄ、Ｖｔｒｐ、ｐＬＨ３ｄＶｔｒｐＳまたはｐ
Ｌ、Ｈ３ｄＶｔｒｐＬを含有する旦９匹旦ＨＢ　１０１
をＬブロス中で一夜培養したものを、トリプトファ不含
含Ｍ９培地で稀釈し、β−インドールアクリル酸誘導の
条件下に細胞を３７°Ｃで３時間インキユヘートした。 融合５９Ｖａｌ−ＩＧＦ−Ｉ産出の検知は、矢内原の方
法〔矢内原ら、Ｐｅｐｔｉｄｅ　　Ｈｏｒｍｏｎｅｓ　
１ｎＰａｎｃｒｅａｓ、　　３．　２８（１９８３））
に従って、”Ｖａ　ｌ　−ＩＣＦ　−１断片（２６−４
６）の抗体を用いる放射免疫測定法（以下ＲＩＡという
）によって実施した。 （ｉｔ）蛋白ペプチドＬＨ融合５９Ｖａｌ−ＩＣＦ　−
１の単離： 培養液を遠心分離して、湿潤細胞ペーストを得て、細胞
を超音波処理によって破壊した。遠心分離によってベレ
ットを集め、つぎに、０．１Ｍのジチオスレイトール（
以下、ＤＴＴと略称する）を含有する８Ｍ尿素溶液に溶
解した。遠心分離後、溶液を３３００カラムクロマトグ
ラフイにより精製した。ＲＩＡによって検知された活性
画分を集め、透析して、所望の成分を含をする蛋白を得
た。 ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ったところ、正規
の位ｉＴＥ、（１５５００）に融合５９Ｖａｌ−ＩＧＦ
ｉが検出された。 こうして得た蛋白ペプチドＬ　Ｈ融合”Ｖａｌ−ＩＧＦ
−Ｉは次の通りである。 Ｃｙｓ　−Ｔｙｒ　−Ｃｙ　ｓ　−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐ
　ｒｏ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｌｙ　５−Ｇｌｕ−Ａｌａ−
Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ　−Ｌｙ　５−Ｔｙｒ
−Ｐｈｅ　−Ａｓ　ｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｈｉ　ｓ　−
Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａ　１−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｓ　ｎ
−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ、−Ｇｌｙ
−工１ｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−
Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−５ｅｒ−Ａｓｐ−へｒｇ−Ｌｙｓ−工
１ｅ−Ｍｅｔ−Ｇｌｎ−６ｅｒ−Ｇｌｎ−工１ｅ−Ｖａ
ｌ−９ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ　−Ｌｅ
ｕ−Ｇ　１ｕ−Ｖａｌ−Ｌｙ　ｓ−Ｈｉ　ｓ　−Ｇｌｕ
−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ｇ　１ｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ
−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ　−Ｇ　１ｙ−Ａｌａ−Ｇ　１ｕ−Ｌ
ｅｕ−Ｖａ　１−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇ　１ｎ−
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｃｙ　ｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ　
−Ｇ　１ｙ−Ｐｈ　ｅ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｓ　ｎ−Ｌ
ｙ　５−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−５
ｅｒ−Ｓｅｒ−６ｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒ
ｏｌ１０５ｅｒ−６ｅｒ−Ａｒ工：Ｌｅ−Ｖａｎ−Ａｓ
ｐ−Ｇｌｕ−Ｃｙ　ｓ　−（Ｊｓ−ＰｈｅＪ、ｒｇ−５
ｅ　ｒ−Ｃｙｓ　−Ａｓｐ−Ｌｅｕ　−Ａｒｇ　−Ａｒ
ｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａ　１−Ｔｙ　ｒ　−Ｃｙ　ｓ
　−Ａｌａ−Ｐ　ｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙ　ｓ−Ｐ　ｒｏ−
Ａｌａ−Ｌ＋ｙｓ−５ｅｒ−Ａｌａ （２）　　β−ガラクトシダーゼ融合５９Ｖａｌ−ＩＣ
Ｆ−■をコードする遺伝子の宿主生物中での発現＝ｐｓ
ｄＶ２−１ａＣを含有する宿主生物またはｐＳｄＶ２−
ＮＴ４９およびｐＮＴ２０４を含有する宿主生物を用い
、蛋白ペプチドＬ　ｔｌ融合５９Ｖａｌ−ＩＣＦ＝社母
＝＃の場合と同様のやり方に従って、β−ガラクトシダ
ーゼ融合５９Ｖａｌ−ＩＣＦ＝十≠＝４を得た。 こうして得た融合５″Ｖａｌ−１’ＧＦ＝転曇＝→は次
の通りである。 Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−工１ｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−９ｅｒ−Ｌ
ｅｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇ　ｉｎ−Ａ
ｒｑ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｐ　
ｒｏ−Ｇ　ｌｙ　−Ｖａ　１−Ｔｈｒ　−Ｇｌｎ−Ｌｅ
ｕ−Ａｓ　ｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−１１
ｉ　５−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ　−八１ａ−５ｅｒ−
Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−９ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａ
ｌａ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｓｅ
ｒ−Ｇｉｎ−Ｇｉｎ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−５ｅｒ−Ｌｅｕ
−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｐｈ　ａ
−Ａｌ　ａ−Ｔｒｐ−Ｐ　ｈｅ−Ｐ　ｒｏ−Ａｌａ　−
Ｐ　ｒｏ−Ｇ　１ｕ−Ａ　１　ａ−Ｖａ　１−Ｐ　ｒｏ
−Ｇｌｕ−５ｅｒ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙ　５
−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−八ｌａ−Ａｓｐ−
Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ７Ｓｅｒ−Ａ
ｓｎ−Ｔｒｐ−Ｇｉｎ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｔｙ
ｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−工１ｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ
−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−工１ｅ−
Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ　−
Ｖａ”ｈ　−Ｐ　ｒｏ−Ｔｈ　ｒ　−Ｇ　１ｕ−Ａｓｎ
　−Ｐ　ｒ　ｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｃｙ　５−Ｔｙｒ−
９ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈ　ｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ　−Ｖａ　
１−Ａｓ　ｐ−Ｇ　ｌｕ　−Ｓｅ　ｒ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ
−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−
１１ｅ−工１ｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａ
ｓｎ−９ｅｒ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｔｒ
ｐ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ　−Ｇ　Ｌｙ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｖ
ａ　１−Ｇ　１ｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−
Ｓ　ｅ　ｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｇｌｕ
−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ａｌａ−Ｐｈｅ　
−Ｌｅｕ−Δｒｑ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−
Ａｒｇ−Ｌａｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｖａ　１−
Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−９ｅｒ−Ａｓｐ−Ｇ　１ｙ−
６ｅｒ−Ｔｙ　ｒ−Ｌｅｕ−Ｇ　ｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ
−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−
Ｇｌｙ−工１ｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｖａ　ｌ−
５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｈｉ　ｓ　−Ｌｙｓ　−Ｐ　
ｒｏ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−工１ｅ−５ｅｒ−Ａｓ
ｐ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ
−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−５ｅｒ−
Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇ
ｌｕ−Ｖａ　１−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇ
　ｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｅ、ｕ−
八ｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔ
ｒｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｖａ
ｌ　−Ａｌａ−９ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒ
ｏ−Ｐｈｅ　−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−工１ｅ−工１
ｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ
−Ａｌａ−Ａｓ　ｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ
−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ　−Ｖａ　１−Ｇ　ｌｕ　−
Ａ　ｓ　ｎ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ
−Ａｌａ−Ｇｌｕ−工ｌｅ　−Ｐ　ｒ　Ｏ−Ａ　Ｓ　ｎ
　−Ｌｅ　ｕ　−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｖ
ａｌ−Ｇｌｕ　−Ｌｅｕ−Ｈｉ　５−Ｔｈｒ−Ａｌａ　
−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−工１ｅ−Ｇｌｕ−
Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇ
ｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−工１
ｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ
−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−
Ｌｅｕ−工１ｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａ
ｒｇ−Ｈｉ　５−Ｇｌｕ−Ｈｉ　ｓ　−Ｈｉ　５−Ｐｒ
ｏ−Ｌｅｕ−Ｈｉ　ｓ　−Ｇｌｙ−Ｇｌ　ｎ　−Ｖａ　
１−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｇ　１ｕ−Ｇｌ　ｎ　−Ｔｈｒ　
−Ｍｅ　ｔ−Ｖａ　１−Ｇ　ｉｎ　−Ａｓｐ−工１ｅ−
Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ａ
ｓｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｖａ　１−Ａｒｇ−Ｃ
ｙ　５−５ｅ　ｒ−Ｈｉ　５−Ｔｙｒ−Ｐ　ｒｏ−Ａｓ
ｎ−Ｈｉ　ｓ　−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｔ
ｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｇｌ
ｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓ、ｐ−Ｇｌ
ｕ−Ａｌａ−Ａｓｎ−工１ｅ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ
−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−
Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｐ　ｒｏ　
−Ａｒｇ−’Ｉ’ｒｐ−Ｌｅｕ−Ｐ　ｒｏ−Ａｌａ−Ｍ
ｅｔ−Ｓ　ｅｒ　−Ｇ　ｌｕ−Ａｒｇ　−Ｖａ　１−Ｔ
ｈ　ｒ−Ａｒｇ　−＋４ｅ　ｔ−Ｖａ　１−Ｇｌ　ｎ−
Ａｒｇ−Ａｓ　ｐ−Ａｒｇ−Ａｓｎ　−Ｈｉ　ｓ　−Ｐ
　ｒｏ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−工１ｅ−工１ｅ−Ｔｒｐ−Ｓ
ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌ
ｙ−Ｈｉ　ｓ　−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｎ　−Ｈｉ　５
−Ａｓｐ−Ａｌ　ａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ
−工１ｅ−Ｌｙｓ−５ｅｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−
５ｅｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇ　１ｎ−Ｔｙｒ−
Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｔ
ｈｒ−Ｔｈｒ−Ａ：Ｌａ　−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−工１ｅ−
工１ｅ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａ
ｒｇ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｐ　
ｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐ　ｒｏ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐ　ｒｏ−
Ｌｙ　ｓ　−Ｔｒｐ−５ｅｒ−工１ｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ
−Ｔｒｐ−Ｌａｕ−６ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−
Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−工１ｅ−Ｌ
ｅｕ−ＣｙＳ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ａｌ
ａ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ
−Ｇｌｙ−Ｐｈａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−
Ｇｌｎ−Δｌａ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇｉｎ−Ｔｙｒ−Ｐ
ｒｏ−Ａｒｇ　−Ｌｅｕ−Ｇｉｎ−Ｇｌｙ−Ｇ　ｌｙ　
７Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ　−Ｖａ　
１−Ａｓｐ　−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−工１ｅ−Ｌｙ
ｓ　−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓ
ｎ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−３ｅｒ−Ａ１ａ７Ｔｙｒ−Ｇｌｙ
−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−
Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｃ
ｙｓ−）ｉｅｔ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐ
ｈｅ−Ａｌａ−Ａｓｐ　−Ａｒｇ−Ｔｈ　ｒ−Ｐｒｏ−
Ｈｉ　５−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇ　１ｕ
−Ａｌ　ａ−Ｌｙ　ｓ　−Ｈｌｓ　−Ｇ　ｌ　ｎ−Ｇ　
１ｎ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｒ
ｇ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−工１ｅ
−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｔｈ　ｒ　−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｔｙ
ｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｈｉ　ｓ　−Ｓ　ｅｒ−
Ａｓ　ｐ−Ａｓ　ｎ　−Ｇ　１ｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−）
１　ｉｓ−Ｔｒｐ−Ｍｅ　ｔ−Ｖａ　１−Ａｌ　ａ−Ｌ
ｅｕ−ＡＳｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ　−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａ
ｌａ　−Ｓｅ　ｒ−Ｇｌｙ−Ｇ　１ｕ−Ｖａｌ　−Ｐｒ
ｏ７Ｌｅｕ　−Ａ　ｓｐ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇ
ｌｎ−ＧＬｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−工１ｅ−Ｇｌ
ｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｉｎ
−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−
Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｔｈ　ｒ−Ｖ、ａｌ　−Ａｒ
ｇ−Ｖａ　１−Ｖａｌ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｐｒｏ−Ａｓ　
ｎ　−Ａｌ、ａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｇ
ｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−１１ｅ−５ｅｒ−Ａｌ
　ａ−Ｔｒｐ−Ｇｉｎ　−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｌ
ｅｕ　＝Ａ１ａ−Ｇ　１ｕ−Ａｓ　ｎ−Ｌｅｕ　−Ｓｅ
ｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ
−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−工１ｅ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−
Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ａ
ｓｐ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−工１ｅ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇ　
１ｙ−Ａｓｎ−Ｌｙ　ｓ　−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｉｎ　
−Ｐ　ｈｅ−Ａｓ　ｎ　−Ａｒｇ−Ｇｉｎ−Ｓｅｒ−Ｇ
ｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｔｒ
ｐ−工１ｅ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｌｙ　ｓ　−Ｌｙ　ｓ　
−Ｇ　１　ｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ　−Ｔｈ　ｒ−Ｐｒｏ−
Ｌｅｕ−Ａｒｇ　−Ａｓｐ−Ｇｉｎ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−
Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−ＡＳｎ−Ａ
ｓｐ−工ｌｅ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｌ
ａ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−工１ｅ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｓ　
ｎ−Ａｌａ−Ｔｒｐ　−Ｖａ　１−Ｇ　ｌｕ−Ａｒｇ−
Ｔｒｐ−Ｌｙ　５−Ａｌ　ａ　−Ａｌ　ａ−Ｇ　ｌｙ−
Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａ
ｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｉｎ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｌ
ａ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ
−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−工１ｅ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−
Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｇｉｎ−Ｈｉｓ−Ｇｉｎ−Ｇ
ｌｙ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈａ−工１ｅ−Ｓｅ
ｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−工１ｅ
−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−
Ａｌａ−工１ｅ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−８７０８Ｅ
］０ Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｌａ−５ｅｒ−Ａｓｐ−Ｔ
ｈｒ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ　−Ａｒｇ−工
１ｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅ
ｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ
−Ｖａ　１−Ａｓ　ｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅ
ｕ−Ｇ　１ｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙ
ｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｌａ
−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−
Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ａｓｐ−Ｍ
ｅｔ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−１１ａ１−Ｐ
ｈｅ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅ
ｕ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ
−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｇ　ｌｙ−Ｐ　ｒｏ−Ｈｉ
　ｓ　−Ｇ　ｉｎ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−
Ｐｈｅ−Ｇ　ｉｎ　−Ｐｈｅ　−Ａｓｎ−工１ｅ−３ｅ
ｒ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−９ｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ
−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−９ｅｒ−Ｈｉｓ−
Ａｒｇ−Ｈｉ　５−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｈｉ　ｓ　−Ａｌ
ａ−Ｇｌｕ−Ｇ　１ｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈ　ｒ−Ｔｒｐ−Ｌ
ｅｕ−Ａｓｎ　−工１ｅ−Ａｓｐ　−Ｇ　１ｙ−Ｐｈｅ
−Ｈｉ　ｓ　−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−工１ｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｙ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−５ｅｒ−Ｔｒｐ−９ｅｒ７Ｐｒｏ
　−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ
−Ｍｅ七−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ＝Ｌｅｕ−
Ｃｙ　ｓ　−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ　−Ｖａ
　１−Ａｓｐ−Ａｌａ　−Ｌｅｕ−Ｇｉｎ　−Ｐｈｅ−
Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐ
ｈｅ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−八ｓｎ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｈ
ｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｓｓ　ｒ−５ｅｒ−Ｓｅ
ｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−７１１ａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｔｈ
ｒ−Ｇｌｙ−工１ｅ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ
−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−３ｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−
Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇ　１ｕ−Ｖａ　Ｌ
−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙ　ｓ
　−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙ　５−５ｅｒ−ＡｌａThis invention relates to 59 valine insulin-like growth factor I (hereinafter 5
9Val-ICF-1), protected peptide fusion
59Val-IC; F-1 (hereinafter referred to as fusion “Val-IGF”
-1), code “Val-IGF-1”
Gene, gene encoding fusion 59Val-IGF-1
offspring, plasmid containing the 59Val-IGF-1 gene
protein containing the fused 59ValiGF-1ffl gene.
Lasmid, fusion 59Val-I GF-1ift
Host organisms containing gene-containing plasmids and their
Regarding manufacturing methods. 59Val-ICF-1 has insulin-like activity and
It is said to have the activity of stimulating sulfate uptake by
Both can enhance protein and DNA synthesis within cells. Therefore, it can be used to promote growth. It can also be used in the treatment of diabetes. Recombinant DNA (genetic recombination) technology and related technologies
The most effective application is mass production of 59Val-ICF-■
It was thought that it would become law. “Val-ICF-1 is novel and its amino acid sequence
can be expressed as follows. Gly-Pro-Glu-Thr-Leu-Cys-
Gly-Ala-Glu-Leu-Va 1-Asp-
Ala-Leu-Gln-Phe-Val-Cys-
Gly-Asp-Arg-Gly-Phe-Tyr-P
he-Asn-Lys-Pro-Thr-Gly-T,
yr-Gly-Ser-6er-Ser-personrg-Ar
g-Ala-Pro-Gln-Thr-Gly-Engineering 1e
-Va 1-Asp-G1. u-Cys-Cys-
Phe-Arg-9er-Cys-Asp-Leu-
Arg-Arg-Leu-Glu-Val-Tyr-C
ys-Ala-Pro-Leu-Lys-Pro-A
la-Lys-8er-Ala The inventors of this invention
Large quantities of 59Va I-IC using the following essential steps
; Succeeded in producing F-1. Step 1 ``Plug-in for producing the gene encoding Val-JGF-1''
Roces. If desired, this process is followed by a 81!
The gene encoding the peptide, SqV, will be
However, the fusion 59y at-ICF-1ifl gene, that is, the protected peptide and
The gene encoding the fused 59Val-ICF-1
Establish a manufacturing process. A suitable "linker" includes "Val-ICF-IJ transfer"
Appropriate restriction enzymes to link the protected peptide upstream of the child
3.2 A gene that has a recognition site and codes for several amino acids
the "linker" itself can be included in the protected peptide.
Configure. Particularly preferable "linkers" are exemplified in the examples below.
It looks like it is being used. Furthermore, downstream of the 59Val-ICF-1 gene, this
A terminator may be inserted adjacent to this. A suitable "terminator" is a suitable restriction enzyme recognition site.
may include a gene encoding. Particularly preferable "Termineku" is shown in the examples below.
This is what is shown in the example. Appropriate [fusion” Va I I GF 1% ie
"Va 1-IGF-IJ" fused with Hou 8 Hebutito is
, as illustrated in the example below.
be. Step 2 Prot-J trochanter and “Va I-IGF-1”
A gene encoding or fusion S9'Val-ICF-
■Is it possible to insert a gene encoding into a plasmid?
Expression vector manufacturing process. For suitable “expression”, plasmid psdV2t
rp, pSdV2-322trp, pLH3dVtrp
, pSdV2-1ac, pSdV2-NT49, etc.
It can happen. A particularly suitable ``)゛rasmid Jl is pBR322.
may be included. Step 3: Avoid transforming the host organism with the expression vector.
Transformant production process. Suitable “host organisms” include Escherichia coli
([1scherichia coli)
For example, Escherichia coli IIIBIOI, Escherichia coli
・Escherichia coli 1112011, Escherichia coli MM294
etc.) may be included. Step 4 From culturing the above transformant in an appropriate medium.
59Val-ICF-1 or sub; combined S″■al-I
CF-1 manufacturing process. Process of isolating the fused Val-IGF-1. (optional) The fusion 59Val-IGF-1 is isolated by a protected peptide desorption reaction.
“Vat-ICF-■Manufacturing process consisting of
Seth. [Fusion 59Val-ICF-1 or protected peptide
In the expression “Val-IGF-IJ” fused with
"Protective peptides" protect against proteases in host organism cells.
protects 59Val-IGF-1 against degradation by
used for desorption of the fusion 59Va 1-ICF-1.
It is removed by a dissociation reaction. That is, the fusion 59Val-ICF-1 undergoes an elimination reaction.
Intermediate for preparing 59Val-ICF-1 by
therefore, the protected peptide is a natural or synthetic
proteins, natural or synthetic peptides, or fragments thereof;
Any removable protected peptide derived from the fragment
sell. The appropriate [fusion 59Va 1-IGF-1j includes protein
fused with the protein peptide through the methionine of the peptide.
and 59Val-IGF-1. Suitable reagents used in this elimination reaction include cyanogen bromide.
etc. are included. In this process, the protein peptide is transferred via its methionine.
"If it is fused with Val-ICF-1, the fusion
59Vat-ICF-1 is a desorption reaction using cyanogen bromide.
It can be converted to “Val-ICF-1” in high yield by reaction.
. The wood DQ separation reaction can be carried out using ordinary solvents that do not have a negative effect on the reaction.
It can be carried out under mild conditions. From the above amino acid sequence of 5″Val-ICF-1,
According to some non-trivial criteria, the corresponding nucleo
Invented the sequence. ``Val-1GF-1 gene,
Inserting into a known plasmid as a cloning heccle
It was cloned by doing this. recombinant plasmid
The 59Val-ICF-1 gene was excised from
"Va 1-ICF-' under the control of the promoter
Specifically designed to maximize the initiator of the jiff gene.
59Va I-ICF-1 in the inserted plasmid
Ifl gene was inserted. In this case, if desired, a protective
The structural gene encoding the peptide is the above-mentioned “Val-IC;
inserted upstream of and adjacent to the F-1 gene
. The present invention will be explained in more detail below.
It is not limited to these. (1) Preparation and cloning of “Va I-IGF-1 gene”
ng; fl) Preparation of 59Val-IGF-1 gene: Genetics
Due to the diversity of codes, from the above amino acid sequence, “Val
- Numerous nucleotide sequences encoding ICF-1 have been predicted.
It is possible to say. The optimal arrangement is determined according to the present invention from a large number of possibilities.
In determining this, several non-trivial criteria were followed. First, the trinus that is acceptable to the host organism you plan to use.
The cleotide codon should be used. Second, the arrangement
The columns can be inserted into the plasmid in the desired position.
, it is desirable to have various restriction enzyme recognition sites at the ends of the molecule.
Delicious. Furthermore, it is now possible to use the well-known cloning hector.
The site should be selected in such a way that the Third,
Synthesis must not be unnecessarily complex and genetic
In order to make assembly easier, cross-hybridization by mistake
Minimize and irreversible off-diagonal (off-d)
iagonal) interactions as much as possible
It should be done. ``Selected to encode Val-ICF-1 gene portion.''
An example of a preferred sequence can be shown below: Gly Pr. 3-code ""5'-GGT-CCT-code
T coins that do not include: 3 ccb-aGA-CTT-
TGA-GAC-ACG-CCG-CGA-CTT-
GAC-CAA-CTG -CGA-GAC-GTT-
AAA-CAT-ACA-CCA-CTA-GCA-C
CA-AAG-ATG-Phe Asn Lys Pr
o Thr Gly Tyr Gly Ser Ser
SerTTC-AAC-AAA-CCG-ACC-G
GC-TAT-GGC-TCC-AGC-TCT-MG
-TTG-TTT-GGC-TGG-CCG-ATA-
CCG-AGG-TCG-AGA-Arg Arg A
la Pro Gln Thr Gly Engineering
1e Val Asp GluCGT-CGC-
GCA-CCG-CAG-ACT'-GGT-ATC-
GTA-GAC-GM-GCA-GCG-CGT-GG
C-GTC-TGA-CCA-TAG-CAT-CTG
-CTT-Cys Cys Phe Arg Ser
Cys Asp Leu Arg Arg LeuTG
C-TGT-TTT-CGT-TCT-TGC-GAT
-CTC-CGC-CGT-CTG-ACG-ACA-
AAA-GCA-AGA-ACG-CTA-GAG-G
CG-GCA-GAC-Glu Val Tyr Cy
s Ala Pro Leu Lys Pro Ala
LysGM-GTT-TAC-TGT-GCT-CC
A-CTG-MG-CCA-GCA-AAA-CTT
“CAA-ATG-ACA-CGA-GGT-GAC-
TTC-GGT-CGT-TTT-Ser Ala TCC-GCG'-3'AGG-CGC-5' In the sequence representations herein, A. G, C and T each mean the following formula: o −
p -o-o -p -o - +1)I
AGC
T In addition, A, G, C and T at the 5'-end are as follows.
means the formula: A G T and A, G, C and T at the 3'-end are each
means: o HC
T Taking into account the above criteria, especially the second criterion above,
and then select the next slightly longer sequence. In fact, as a suitable embodiment of this invention, EcoRI and
and BamH1 sites were selected to represent the 5′ end and BamH1 site, respectively.
It can be introduced at both the 3' and 3' ends. Furthermore, the notionine codon (ATG) is
upstream of and adjacent to the N-terminal amino acid codon of
and two stop codons (TC; A and TAG),
It was inserted downstream of and adjacent to the C-terminal codon. (AvaII) v -F L, nai: 3' -
G-TAC-CCA-GGA-Glu Thr Leu
Cys Gly Ala Glu Leu Val
Asp AlaGM-ACT-CTG-TGC-GGC
-GCT-GM-CTG-GTT-GAC-GCT-C
TT-TGA-GAC-ACG-CCG-CGA-CT
T-GAC-CM-CTG-CGA-Leu Gin
Phe Val Cys Gly Asp Arg G
ly Phe TyrCTG-CM-TTT-GTA-
TGT-GGT-GAT-CGT-GGT-TTC-T
AC-GAC-GTT-AAA-CAT-ACA-CC
A-CTA-GCA-CCA-MG-ATG-Phe
Asn Lys Pro Thr Gly Tyr G
ly Ser Ser Ser SerTTC-MC-AAA-
CCG-ACC-GGC-TAT-GGC-TCC-A
GC-TCT-AAG-TTG-TTT-GGC-TG
G-CCG-ATA-CCG-AGG-TCG-AGA
-Arg Arg Ala Pro Gln Thr
Gly Ile Val Asp GluCGT-CG
C-GCA-CCG-CAG-ACT-GGT-ATC
-GTA-GAC-GM-GCA-GCG-CGT-G
GC-GTC-TGA-CCA-TAG-CAT-CT
G-CTT-Cys Cys Phe Arg S
er Cys Asp Leu Arg Ar
g LeuTGC-TGT-TTT-CGT-TCT-
TGC-GAT-CTC-CGC-CGT-CTG-A
CG-ACA-AAA-GCA-AGA-ACG-CT
A-GAG-GCG-GCA-GAC-Glu Val
Tyr Cys Ala Pro Leu Lys
Pro Ala LysSer Ala 5top 5
top BamH Engineering TCC-GCG-TGA-TAG-
3'8GG-CGC-ACT-ATC-CTAG-5'
The present invention provides a corresponding large number of oligonucleotide fibrils.
This process consists of high-linking and ligation.
The above-mentioned results (in the method of manufacturing Tachiko) are characterized by
It also relates to (i) Synthesis of oligonucleotides: Production of 30 types of synthetic oligonucleotides
To synthesize a molecule with the above extended sequence,
I decided to do so. Specify those synthetic oligonucleotides
When converting to a no-brid stage and ligating, the upper
This gives the two-ffi chain nucleotide sequence of
. Regarding the synthesis of oligonucleotides in this specification
The following abbreviations will be used in the description. Ap, cp, Cp and 'rp each mean the following formula
: HH Ap Gp Cp , Tp Also, 3' end
A, G, C and T each mean the following formula
: 80HH CT A"po, G"po, CIl"po, 'I
"po and ^CUpo respectively mean the following formulas: 8□ 6iBp. A p. CBzpo Tpo AcUp. DMTr is di-j-oxytrityl, B is adeninyl
guaninyl, cytosinyl, and thyminyl (for convenience,
U is uracil, AC is acedel, m is an integer of 1 or 2, and n is an integer of 1 to 12. The oligonucleotides are as follows: (11HOA
pApTpTpCpApTpGpGpGpTOH (Al
l(21HOTpTpTpCpApGpGpApCpC
pCpApTpGOH (A21+31 HOCpCp
TpGpApApApCpTpCpTpGpTpGO)
I (Bl)+41 HOCpApGpCpGpCp
CpGpCpApCpApGpApGOH (B21(5
) HOCpGpGβCpGpCpTpGpApApC
pTpGpGpTOH(C1l+61 HOApGpA
pGpCpGpTpCpApApCpCpApGpTp
TOH1c2) (71HOTpGpApCpGpCpT
pCpTpGpCpApApTpTpTOHIDII+
81 +l0CpCpApCpApTpApCpAp
ApApTpTpGpCOH (D21(9) HOG
pTpApTpGpTpGpGpTpGpApTpCp
GpTOH(El)(101HOTpApGpApAp
ApCpCpApCpGpApTpCpAOH (E21
(111HOGpGpTpTpTpCpTpApCpT
pTpCpApApCOH(Fll(121HOGpG
pTpCpGpGpTpTpTpGpTpTpGpAp
ApGOH(F21+131 HOApApApCp
CpGpApCpCpGpGpCpTpApTpGOH
(Gl) (14) 1 (OGpCpTpGpGpAp
GpCpCpApTpApGpCpCOH (G2+(1
51frOGpCpTpCpCpApGpCpTpCp
TpCpGpTpCOII THIIf16)HOC
pGpGpTpGpCpGpCpGpApCpGpAp
GpAOH(B2)(171HOGpCpGpCpAp
CpCpGpCpApGpApCpTpGOH (Engineering 1)
(18) HOCpTp'ApCpGpApTpApC
pCpApGpTpCpTpGOH (Engineering 2) (191H
OGpTpApTpCpGpTpApGpApCpGp
ApApTpGOH (Jl) (20), HOGpApA
pApApCpApGpCpApTpTpCpGpTO
H(J21[21)HOCpTpGpTpTpTpTp
CpGpTpTpCpTpTpGOH (Kllf221
HOGpGpApGpApTpCpGpCpApA
pGpApApCOH(K21(23)I(OCp
GpApTpCpTpCpCpGpCpCpGpTpC
pTOH (Ll) (24) HOTpApApApC
pTpTpCpCpApGpApCpGpGpCOH (
L2'1(251HOGpGpApApGpTpTpT
pApCpTpGpTpGpCpTOHfM1'1(2
6) HOTpTpCpApGpTpGpGpΔpG
pcpApcpApGOH (M2) (27) HOC
pCpApCpTpGpApApGpCpCpApGp
CpAOHfNll(281HOGpCpGpGpAp
TpTpTpTpGpCpTpGpGpCOH (N21
f29) HOApApApTpCpCpGpCpGpT
pGpApTpApGOH (OllDO) HOGp
ApTpCpCpTpApTpCpApCOH (02)
The sequential cambling reaction is shown in Table 1.攬 Company tcommono (or di, or trim)mer (1) is Hirose
method (T, Hirose, protein/nucleic acid, enzyme 1ss
N., 1st, 225 (1980), published in Japan).
Campling can be prepared using the phosphoric triester method (R
, Crea et al., Nucleic Acids Re5
8. 2331 (1980)''
and M, L, DuckworLh et al., N u
cleic A cids+Re5earch,
9. 1691 (1981)), cellulose
It can be carried out on a support. In particular, the hexadecanucleotide H described in Example 1
OA p A p A p Cp Cp G p A
p Cp CpcpcpcpTp8pTpGOH to Gl
), the synthesis method will be explained. Heki
Table 2 shows the flow chart of Sadeca nucleotide G1 synthesis.
Shown below. 7Q71~ (ii) Hybrid of chemically synthesized oligonucleotides
Oligonucleotides are used in a series of steps to minimize conjugation and ligation.
Hybridize and ligate tides. In figure 1
represents the oligonucleotide as H(- means 5'-bosboryl
The blocked O: 1;
For example, ← Mu (,, t+- is La
igation position). Rai
The ligation was performed in the presence of T4 DNA ligase.
Ru. Oligonucleotides A1.81 and A2: C1, B2
and C2; DI, El and D2iF1, B2 and
F2; 'Gl, H1 and G211 and Of, N2 and o2 are hybridized;
Then, corresponding blocks 1 to 1 were obtained. this place
81. For B1 and A2
and 01. Block 1 obtained from N2 and 02 respectively
and 10 to each other and ligate
, a dimer was formed. Blocks 2 and 3; 4 and 5; 6
Hybridize and 7 and 8 and 9 and ligate
, obtained blocks 11, 12.13 and 14 respectively
. Hybridize blocks 1, 15, 16 and lO
and ligate, and the ligation product thus obtained
was cut with EcoRI and Bam+ll to obtain the desired
A polynucleotide 59Val-IGF-1 was obtained. Cloning of f21” Val-IGF-1 gene
=59Va I-ICF-IJ trochanter cloning
Therefore, insert the 59Val-IGF-1 gene into this
A suitable plasmid with a suitable enzyme recognition site that can
i.e. inserted into a cloning vector. A suitable embodiment of this invention is
(e.g. p13R322, pBR235, etc.)
and performed cloning. For example, EcoR1 and
Plasmi FpBR322 containing the Bam111 and Bam111 sites (
(commercially available), this brass
Cut the mido with EC0RI and B a m tl I.
Ta. In this case, the plasmid contains EC0RI and
On the longer fragment cut with BamHl and
It has a code for picillin resistance (denoted as Amp) and
The code for tracycline resistance (indicated by Tet) is B
a m Disappears as a result of H1 site cleavage. Eco
Plasmid p cut with RI-B a m tl I
The longer BR322 fragment was fragmented and ligated. write
Using the mixture obtained in E. coli HBOI
(ATCC33694) was transformed. I want to get it
Some ampicillin resistant, tetracycline sensitive
The transformation was named pSdV2. (3) 59Val-IG in plasmid pSdV2
F-1ill gene sequence Maxam-Gilver) (Maxam-G11b)
ert) method can be used. “Val-IC; For sequencing the F-1i11 gene,
Brasmil:' p S d V 2 in ECo'11
Then, in the presence of α-”P-ATP, A M
treated with V reverse transcriptase. 32P labeled linear plasmid 1
' was digested with BamHI to obtain two fragments (224 bp,
4. . kbp) was obtained. The smaller fragment (224bp) is
A, 7th edition, 560 (1977)). On the other hand, plasmid pSd■2 was first added at 3 am 11■
and then labeled with 32P as described above. line
Ecol'? ! Digested into two fragments (
224b p, 4. o kbp) was obtained. smaller one
A fragment (224 bp) of
analyzed. “Bilateral sequence of Val-IGF-I gene
The result of the decision is the designed S9■al-I G F
-1 loss with Shodenko. [2] Preparation and cloning of promoter gene: host
To obtain fused 59Val-'IGF-1 from the main organism,
A promoter gene was designed. The promoter gene obtained based on these criteria is
al-ICF-1 or fusion 59Val-ICF-1
A position upstream of the calling gene and adjacent to it
Insert into the plasmid so that it takes As a suitable embodiment of this invention, the synthetic trρ promoter
The trp promoter I gene or the trp promoter gene
Prepared. (1) Synthetic trp bromocou ■Shoden trochanter and claw
Nuning: Actually, 14 types of synthetic oligonucleotides
strands, each with at least 7 bases at the -end.
Assemble to obtain the complete double-stranded nucleotide sequence.
A 107 bp molecule was synthesized by coRI 3'-ACGGCTGTAG TATTGCCMGA
CCGTTTATMGACTT-EcoR Engineering (i) Synthesis of oligonucleotides: Oligonucleotide φ convex〒≠Iff is as follows: (1) HOApApTpTpTpGpCpCpGp
ApCpAOH (8) (2) HOCpGpTpTp
ApTpGpApTpGpTpCpGpGpCpAOH
(Bl(3) ll0TpCpApTpApApCp
GpGpTpTpCpTpGpGpCOH (C) (4)
HOGpApApTpApTpTpTpGpCpC
pApGpApApCOH(Dl(51HOApApA
pTpApTpTpCpTpGpApApApTpGp
AOH(E)(6) HOTpCpApApCpAp
GpCpTpCpApTpTpTpCpAOH(F+(
7) HOGpCpTpGpTpTpGpApCpA
pApTpTpApApT○II (Gl(8)
HOGpTpTpCpGpApTpGpApTpTpA
pApTpTpGOH(Hl(91HOCpApTpC
pGpApApCpTpApGpTpTpApApCO
H(Ilflor HOGpCpGpTpApCpT
pApGpTpTpApApCpTpAOH(Jl(1
1) HOTpApGpTpApCpGpCpApA
pGpTpTpCpApCOH(Kl(121HOCp
TpTpTpTpTpApCpGpTpGpApApC
pTpTOH(Ll(131HOGpTpApApAp
ApApGpGpGpTpApTpCpGOH (Ml(
14) HOApApTpTpCpGpApTpAp
CpCOH(Nl) These synthetic methods are similar to those described above.
Hot Ho A p A p A p Cp Cp G
p A p Cp Cp G pGpCpTpApT
This will be explained with reference to the synthesis of pGOH(Gl). (ii) Ligation of chemically synthesized oligonucleotides
: The oligonucleotides are as shown in the figure.
Following the same method as for the l-ICF-1 gene,
Hybridized and ligated. (iii) Synthetic trp promoter I gene denominator
Rowning: Synthetic trp promoter for IJ gene trochanter rowing
, a suitable enzyme recognizer into which the synthetic Lrp promoter I can be inserted.
The synthetic trp promoter is inserted into a suitable plasmid containing the recognition site.
Insert the tar enzyme. A preferred embodiment of this invention c.
As shown in Figure 4, cloning is performed as a plus
Using Mi1°p[31~325 (which can be done manually commercially)
It was carried out. Plasmid pB, R325 with EcoRl
was cut and the synthetic trp promoter I was inserted into it. Using the plasmid pST-1 obtained in this way,
lColt II B 101 was transformed. (2) Synthetic trp promoter ■ Preparation of gene The above two combinations
Insert the adult Lrp promoter■ into the plasmid in the correct orientation.
To enter the EcoR1 region of the synthetic trp promoter I
It has a base blockade of a certain length after the position, and Bam at the 3' end.
The following types of synthetic promoters with H1 site
Eight cycles of synthetic Lrp bromotar was produced. Actually, 22 types of oligonucleotides were created for each
and make sure that each single product overlaps by at least 7 bases.
to obtain a complete double-stranded nucleotide sequence.
Therefore, we decided to synthesize a 163 bp molecule. EcoRl 5'-MTTTGCCGACATMCGGTTC
TGGCAAATATTCTGM-3嘗-ACGGCT
GTAGTATTGCCAAGACCGTTTATAA
GACTT-ATGAGCTGTTGACMTTMTC
ATCGMCTAGTTAACTAGTACGC-Ec
Synthesis of amH engineering (1) oligonucleotides from oR: Eight types of oligonucleotides were further synthesized. (1) HOApApTpTpCpApTpGpGp
CpTOH(SAI(21HOGpGpTpTpGpT
pApApGpApApCpTpTpCpTOH[5B
l(3) HOTpTpTpGpGpApApGpA
pCpTpTpTOH (SCI+41 HOCpAp
CpTpTpCpGpTpGpTpTpGpApTpA
pGOHfsDl+51 HOTpTpApCpAp
ApCpCpApGpCpCpApTpGOH (SE1
161 110CpCpApApApApGpApAp
GpTpTpCOI((SF1(7) HOCpGp
ApApGpTpGpApApApGpTpCpTpT
OH(SG)+8) HOGpApTpCpCpTp
ApTpCpApApCpAOH (SHI these synthesis
The method uses the hexadecanucleotide HOApApApC
pCpGpApCpCpG p G p Cp T p
See synthesis of A p T p G OH (G 1 )
Then it will be explained. (11) Hybrid of chemically synthesized oligonucleotides
Hybridization and ligation: Hybridize and ligate in the same manner as for the children.
I gated. (3) Synthetic Lrp promoter ■ Molecular cloning of the gene
Inserting the synthetic Lrp promoter 11iH gene into the plasmid.
I entered. As one suitable embodiment of this invention, the Lrp block
Plasmid pBl”1 and Ba
m HI by cleaving the site.
I entered. The thus obtained plasmid is called plasmid pTrp.
It is named EB7. [3] Preparation and cloning of the white peptide LH gene
: Protected peptide that can be fused with 59Va I-IGF-1
Protein peptide II is prepared as an appropriate sequence of
It is. (Preparation of 11 protein peptide L, tl genes: combination, complete
By obtaining the complete double-stranded nucleotide sequence, 23
We decided to synthesize a 3 bp molecule. Not iodine, 17, 3'-G-TAC-AC
A-ATG-ACG-GTC-8sp Pro T
yr Val Lys Glu Ala Glu
Asn Leu LysLys Tyr Phe
Asn Ala Gly His Ser Asp
Val AlaAsp Asn Gly Thr Le
u Phe Leu GlyLys Leu LySA
sn Trp Lys Glu Glu Ser As
p Arg Lys Eng16 Met50
Hind
Eeee Gin Ser G1. n Ice Val, S
er Phe Tyr Phe Lys LeuPhe
Lys Asn Phe Lys Asp
Asp Gln Ser ENGLE GlnT
TC-AAA-AAC-TTT-AAC-GA! r-G
AC-CAG-AGC-ATC-CAA-AAG-TT
T-TTG-AAA-TTC-CTA-CTG-GTC
-TCG-TAG-GTT-LySSer Val 5
top 5top B: 1mX1 engineering (i) Oligonucle
Synthesis of oligonucleotides; oligonucleotides are as follows: (1) HOApApTpTpCpApTpGpTpG
pTpTOH(all(2) HOApCpTpGpC
pCpApGpGpApCpCpCpApTOHfa2
] (3) HOApTpGpTpApApApApGp
ApApGpCpApGOH(a31(41HOTpG
pGpCpApGpTpApApCpApCpApTp
GOHfa4) (5) HOTpTpTpApCpAp
TpApTpGpGpGpTpCpCOH(a51(6
1HOApApGpGpTpTpTpTpCpTpGp
CpTpTpCpTOHfa6) (Sword HOApApA
pApCpCpTpTpApApGpApApApTp
AOH(bll・+81 HOCpTpTpTpApA
pTpGpCpApGpGpTpCpAOH (b2) (
9) HOTpTpCpApGpApTpGpTpAp
GpCpGpGpAOH(b31(10) HOAp
TpTpApApApGpTpApTpTpTpCpT
pTOH (b4) (111HO8TpCpTpGpA
pApTpGpApCpCpTpGpCOH(b51(
12) HOTpTpCpCpApTpTpApTp
CpCpGpCpTpApCOH (b6) (13) H
OTpApApTpGpGpApApCpTpCpTp
TpTpTpCOH(all(141HOTpTpAp
GpGpCpApTpTpTpTpGpApApGOH
(c2) (151110ApApTpTpGpGpAp
ApApGpApGpGpApGOHfc31 (16)
HOTpGpCpCpTpApApGpApApA
pApGpApGOll (c4) (171HOTp
CpCpApApTpTpCpTpTpCpApApA
pAOH(c51(181HOCpTpGpTpCpA
pCpTpCpTpCpCpTpCpTpTOH (c6
1 (19) HOApGpTpGpApCpApGp
ApApApApApTpAOHfall(201+(
OApTpGpCpApGpApGpCpCpApAp
ApTpTOHfd2) (21) HOGpTpCp
TpCpCpTpTpTpTpApCpTpTOH+6
31 (22) IIOCpTpCpTpGpCpApTp
TpApTpTpTpTpTOH(d41(23) H
OApGpGpApGpApCpApApTpTpTp
GpGOIl (d5] (24) HOApApApG
pCpTpTpGpApApGpTpApApAOHf
d6) (251HOCpApApGpCpTpTpTp
TpCpApApApAp8OH(ell(261HO
CpTpTpTpApApG to GpApTpGpApC
pCpAOH(e21(27) HOGpApGpCp
ApTpCpCpApApApApGpApGOH (e
3) (28) HOCpCpTpTpApApApG
pTpTpTpTpTpGpAOH(e41+291
HOGpGpApTpGpCpTpCpTpGpGpT
pCpApTOHfe5)t30) HOTpGpT
pGpTpApApTpGpApTpApGOH (11
)+311 HOTpApCpApCpApCpTp
CpTpTpTpTOH(121(321HOGpAp
TpCpCpTpApTpCpApTOH (131(i
i) hybridization of chemically synthesized oligonucleotides;
``The same method as in the case of the VaI-IGF-1 gene''
On the other hand, I hybridized it and ligated it. (2) Branch cloning of the protein peptide LHili trochanter
: The protein peptide LH gene was inserted into a plasmid. As a suitable monomerization example of this invention, the protein peptide FLl
lifi trochanter to plasmid p13R322, Fig.
As shown in EC0RI and BamHI,
It was inserted by cleaving the site. thus obtained
The plasmid was named plasmid pL II l 07.
Ru. (4) “Construction of VaI-IGF-1 expression vector:
``Vat-ICF-1 gene, promoter gene
into the plasmid containing “Val-l GF-1
The gene was used to transform the host organism. As a suitable embodiment of this invention, the following recombinant plus
Mid, E, colt with “Val-ICF-I gene”
Established to express offspring. (1) Recombinant plasmid pSdV2 trp
Construction: ECO the Grasmi6dop5T-1 prepared above.
59Val-IGF to the large fragments digested with R■
-1 gene was inserted. The recombinant plasmid thus obtained
The plasmid was named pSV2trp. +2+ &fl recombinant plasmid pSdV2-322t
Construction of rp Two plasmids p T r p IE B 7 with EcoRI
and Bakon HI, resulting in a large fragment (4,1k
bp) were separated by agarose gel electrophoresis. On the other hand, “Val-ICF-1 gene is transferred to plasmid psd”
Remove the car from V2, and check the above promoter (4.1kb)
p). Ampicillin resistance obtained,
Plasmids from two of the tetracycline-sensitive transformants
The cells were separated and digested with restriction enzymes and electrophoresed.
, containing the 59Val-ICl3-1 gene
It was confirmed. The thus obtained plasmid is plasmid pS.
named dV2-322trp and contains this plasmid.
(5) “Va I-IGF-1 gene and promoter
Sequencing of the protein gene: Maxam-GilberL
) method can be used. (1) 59Val in plasmid pSbVZtrp
-IGF-1ift gene and synthetic Lrp promoter
1 gene sequence “Val-ICF-” in Nibrasmid pSdV2trp
1 gene and synthetic trp promoter 1 gene sequence
In the case of plasmid p3dV2-322trp described below,
It was decided in the same way. (2) 5 in plasmid psdv2-322trp
9Val-ICF-1i) 1 gene and synthetic trp protein
Sequence of motor I gene; “Va I-IGF-1 gene and synthetic Lrp promoter
For sequencing the data I gene, plasmid psdV2
-322trp was digested with EcoRI and BAP
alkaline phosphatase), and then
T4 polynucleotide cina in the presence of r-”P-ATP
treated with The labeled DNA was digested with II in r I,
Two fragments (110 bp and 480 bp) were obtained. These fragments were analyzed using the Maki → No Mu Gilbert method.
did. (A, Maxam and W, G11ber
L, Proc. Na11. Acad, Sci, U SΔ5
1 Sat., 560 (1977, )), the sequence revealed was “V
al-ICF-1 gene and synthetic promoter gene
matched the design sequence. [6] Fusion 59Va I-IGF-1 expression vector
Construction: ``Insert a linker upstream of the VaI-IGF-1 gene''
Genes encoding protective peptides with or without
By connecting the child with the Val-IGF-1 gene
, prepared a gene encoding the fusion “Val-IGF-1”
did. In this process, methion is used as the last amino acid.
Fusion of protein peptide with 59Val-IGF-1
Match. The thus obtained fusion “Val-IGF-1” is as follows.
That's right. The present invention encodes such a fusion "Val-ICF-1".
Construction of expression vectors for genes of the following types: As a suitable embodiment of the present invention,
59Val-IGFI fused with white peptide L l-1
An expression vector for the gene encoding was prepared. The present invention combines genes encoding protected peptides into linkers.
- with or without the intervention of “Val-IGF-1
The gene is connected at the trochanter of the Val-IGF-Iifi gene.
The process for the invention of such genes constructed by
It also relates to The host organism is transformed by Ishatsu7i. As a preferred embodiment of this invention, three animals were
In order to express the white peptide Ll (if gene trochanter), the following:
The 11tA plasmid was established. Trp promoter■EC plasmid pTrpEB7
Digested with 0RI and BamHI, resulting in a large fragment (4,
1 kbp) were separated by 7 galose gel electrophoresis. On the other hand, the protein peptide L II gene was transferred to the plasmid pLH.
I07 and the promoter vector (4,1
kbp). Using this mixture, E, c
oli HBIOI was transformed. Obtained amplicon
One of the transformants with low syrin resistance and tetracycline sensitivity
A plasmid was isolated from the protein peptide Ll1.
The presence of the m trochanter was confirmed by restriction enzyme digestion and electrolysis.
It was confirmed by aerophoresis. Obtained in this way
The prepared plasmid pL Ht r p is tl 1ndl
Digest with U and BamHI and separate the resulting large fragments.
Separated by agarose gel electrophoresis. On the other hand, “V
a l -I GF -jiff gene as trochanter EcoR
I and B a m Hf digestion produced the protein prepared above.
isolated from the lasmid pSdV2, upstream of it, and adjacent to it.
The oligonucleotides I'm1 and m2 are connected to the linker.
Concatenated as -. 59Va with one linker obtained in this way
[- rGF-1 gene was added to the above plasmid p L Ht
ligated with a large fragment of rp. using a mixture
In addition, 1 mouse was transformed into +13101. Obtained a
Transformation of ampicillin resistance and tetracycline susceptibility
The plasmid is released from one of the bodies, and it becomes a protein peptide.
The code for “Val-ICF-1” fused with ChidoLll
Digestion with restriction enzymes and electrolysis
Confirmed by electrophoresis. Thus obtained plus, thus
1: Also, protein-peptide LSI fusion “Val-IC;F
The genes encoding -1 are as follows. EcoR Engineering Met Cys Tyr Cys Ginko
Chain coded: s 1-AATTC-ATG-TGT
-TAC-TGC-CAG-non-coding chain, 3
I-c-TAc-AcA-hTa-Aca-aTc-A
sp Pro Tyr Val Lys Glu Al
a Glu Asn Leu LysGAC-CCA-
TAT-CTA-AAA-CAA-GCA-CAA-A
AC-CTT-8AG-CTG-GGT-ATA-CA
T-TTT-CTT-CGT-CTT-TTG-GM-
TTC-Lys Tyr Phe Asn Ala G
ly His Ser Asp Val AlaAAA
-TAC-TTT-AAT-GCA-GGT-CAT-
TCA-GAT-GTA-GCG-TTT-ATG-8
Person A-TT-CGT-CCA-GTA-AGT-CT
A-CAT-CGC-8sp Asn Gly Thr
Leu Phe Leu Gly 工1e
Leu LysGAT-MT-GGA-ACT-C
TT-TTC-TTA-GGC-ATT-TTG-MG
-CTA-TTA-CCT-TGA-GM-MG-AA
T-CCG-TM-MC-TTC-Asn Trp L
ys Glu Glu Ser Asp Arg Ly
s engineering 1e Met8A-TGG-8AA-GAG-G
AG-AGT-GAC-AGA-AAA-ATA-AT
G-TTA-ACC-TTT-CTC-CTC-TCA
-CTG-TCT-TTT-TAT-TAC-50Hi
Val Ser Ph
e Tyr Phe Lys LeuGlu Val
Lys His Glu Phe Met Gly P
ro Glu ThrLeu Cys Gly Ala
Glu Leu Val Asp Ala Leu
GinCTG-TGC-GGC-GCT-GM-CT
G-GTT-GAC-GCT-CTG-CAA-GA
C-ACG-CCG-CGA-CTT-GAC-CA
A-CTG-CGA-GAC-GTT-PheVa
l Cys Gly Asp Arg Gly Phe
Tyr Phe AsnTTT -GTA-TGT-
GGT-GAT -CGT-GGT-TTC-TAC-
TTC-AAC-AAA-CAT-ACA-CCA-C
TA-GCA-CCA-AAG-ATG-AAG-TT
G-Lys Pro Thr Gly Tyr Gly
Ser Ser Ser Ser Arg ArgAAA-C
CG-ACC-GGC-TAT-GGC-TCC-AG
C-TCT-CGT-CGC-TTT-GGC-TGG
-CCG-ATA-CCG-AGG, -TCG-AGA
-GCA-GCG-Ala Pro Gln Thr
Gly Engineering 1e Val Asp Glu Cys C
ysPhe Arg Ser Cys Asp Leu
Arg Arg Leu Glu VaITTT-C
GT-TCT-TGC-GAT-CTC-CGC-CG
T-CTG-GM-GTT-AAA-GCA-AGA
-ACG-CTA-GAG-GCG-GCA-GAC-
A-Tyr Cys Ala Pro L to CTT-C
eu Lys Pro Ala Lys Ser Al
aTAC-TGT-GCT-CCA-CTG-MG-C
CA-GCA-AAA-TCC-GCG-8TG-AC
A-CGA-GGT-GAC-TTC-GGT-CGT
-TTT-AGG-CGC-5top 5top Ba
mHI TGA-TAG-3'8CT-ATC-CTAG-5' and protein peptide LH fusion 59Val-IGI"
The genes encoding -1 are as follows; Asp P
ro Tyr Val Lys Glu Ala Gl
u Asn Leu LysGAC-CCA-TAT-
GTA-8M-GM-GCA-GAA-MC-CTT-
MG-CTG-GGT-ATA-CAT-TTT-CT
T-CGT-CTT-TTG-GM-TTC-Lys
Tyr Phe Asn Ala Gly His S
er Asp Val AlaAAA-TAC-TTT
-AAT-GCA-GGT-CAT-TCA-GAT-
GTA-GCG-TTT-ATG-AAA-TTA-C
GT-CCA-GTA-AGT-CTA-CAT-CG
C-Asp Asn Gly Thr Leu Phe
Leu Gly 1e Leu LysGAT-MT
-GGA-ACT-CTT-TTC-TTA-GGC-
ATT-TTG-to AG-CTA-TT-CCT-T
To G-GAA-8AG-AAT-CCG-TAA-71
, AC-TTC-Asn Trp Lys Glu G
lu Ser Asp Arg Lys 工1e Me
tAAT-TGG-AAA-GAG-GAG-AGT-
GAC-AGA-AAA-ATA-ATG -TTA-
ACC-TTT-CTC-CTC-TCA-CTG-T
CT-TTT-TAT-TAC-50HindEEEEGln Ser Gln ENG 1eVal Ser Ph
e Tyr Phe Lys LeuCAG-AGC-
CAA-ATT-GTC-TCC-TTT-TAC-T
TC-MG-CTT-aTc-Tcc-arT-TAA
LcAG-Acc-u area-ATG-AAG-TTC-G
AA-Glu Val Lys His Glu P?
+eMet Gly Pro Glu ThrGM-G
TA-AAA-CAT-GM-TTC-ATG-GGT
-CCT-GM-ACT-CTT-CAT-TTT-G
TA-CTT-MG-TAC-CCA-GGA-CTT
-TGA-Leu Cys Gly Ala Glu
Leu Val Asp Ala Leu GinCT
G-TGC-GGC-GCT-GAA-CTG-GTT
-GAC-GCT-CTG-CM-GAC-ACG-C
CG-CGA-CTT-GAC-CAA-CTG-CG
A-GAC-GTT-Phe Val Cys Gly
Asp Arg Gly Phe Tyr Phe
AsnTTT-GTA-TGT-GGT-GAT-CG
T-GGT-TTC-TAC-TTC-AAC-AAA
-CAT-8CA-CCA-CTA-GCA-CCA-
AAG-ATG-AAG-TTG-Lys Pro T
hr Gly Tyr Gly Ser Ser Se
r Arg ArgAAA-CCG-ACC-GGC-
TAT-GGC-TCC-AGC-TCT-CGT-C
GC-TTT-GGC-TGG-CCG-ATA-CC
G-AGG-TCG-8GA-GCA-GCG-Ala
Pro Gin Thr Gly 1e Val A
sp Glu Cys Cys Phe Arg Se
r Cys Asp Leu Arg Arg
Leu Glu ValTTT-CGT-TCT-
TGC-GAT-CTC-CGC-CGT-CTG-G
M-GTT-N-GCA-AGA-ACG-CTA-
GAG-GCG-GCA-GAC-CTT-CM-Ty
r CysAla Pro Leu Lys Pro
Ala Lys Ser AlaTAC-TGT-GC
T-CCA-CTG-MG-CCA-GCA-AJ-
TCC-GCG-3'ATG-ACA-CGA-GGT
-GAC-TTC-GGT-CGT-TTT-AGG-
CGC-5'f21 "Va 1-ICF-1 gene
Terminate downstream of and adjacent to
“Va I-IGF-” fused with protein peptide gene
Construction of the gene encoding S''' Val-ICF-1:
It can be inserted at a downstream and adjacent position. A suitable “couminator” is an appropriate enzyme recognition part.
A gene encoding a position can be included. Synthesis of fa+ oligonucleotide 1; 14 types of oligonucleotides
Further oligonucleotides were synthesized. +41 HOGpApTpCpCpTpCpGpAp
GpApTpCpApAOH (81) (2) HOGp
CpCpTpTpTpApApTpTpCpApTpC
pTpCpGpApGOHfB') (3) HOTp
TpApApApGpGpCpTpCpCpTpTpT
pTpGpGpAOHlc'1 (41HOApApAp
ApApGpGpCpTpCpCpApApApApG
pGpAOH(D'1(51HOGpCpCpTpTp
TpTpTpTpTpTpTpTpGOH(E')+6
1 HOTpCpGpApCpApApApApAOH
(F'117) HOGpApTpCpCpTpCpG
pApGpCpTO)l (G')(81HOGpTp
TpTpApApTpCpApGpCpTpCpGpA
pGOH(H')+91 +10GpApTpTpA
pApApCpCpGpApApTpCpApAOII
(Engineering 1) (101HOGpCpCpTpTpTpA
pApTpTpGpApTpTpCpGO) (f, ff
'1 (11) HOGpCpCpTpTpTpTpTp
TpTpTpTpTO)I (K'1(12) HO
TpCpTpCpCpApApApApAOH+L'1
f13) 1lOGpGpApGpApCpApAp
CpGOHtM') (141HOTpCpGpApCp
GpTpTpGOH (N'1fbl chemically synthesized oligo
Ligation of nucleotides: As shown, follow the same procedure as for Val-ICF-1.
hybridize, ligate and coumine according to the
I got Tar S. (ii) Same as in the case of Koumineku L(terl-)I
Hybridize, ligate and click according to your method.
- Obtained the Minator L. tel Terminéku S and Cuminéku L
Cloning: Kouminakoo S and Kouminator L, respectively
``Val-IC, downstream of F-1ifl gene (3)
β-galactosidase fusion “Val-ICF-1 expression”
Construction of hector; (al Construction of recombinant plasmid psav2-1ac)
Constructed plasmid pSdV2-1ac described in Example 22
Constructed by law. fbl recombinant boo7 smid pSdV2-NT49
Construction of two plasmids pSdV2-, NT-9 in Example 24.
Constructed as described. (C1β-galactosidase fusion “Val-10F −
, 1: Gene encoding β-galactosidase fusion “Val ICF-■
The coded genes are as follows: Thr Met engineering
e Thr Asp Ser Leu Ala Val
Val LeuACC-ATG-ATT-ACG-G
AT-TCA-CTG-GCC-GTC-GTT-TT
A-TGG-TAC-TM-TGC-CTA-AGT-
GAC-CGG-CAG-CM-MT-Gln Ar
g 8rg Asp Trp Glu Asn
Pro Gly Val ThrCM-CGT
-CGT-GAC-TGG-GAA-MC-CCT-G
GC-GTT-ACC-GTT-CCA-GCA-CT
G-ACC-CTT-TTG-GGA-CCG-CM-
TGG-Gln Leu Asn Arg Leu A
la Ala His Pro Pro PheCAA
-CTT-MT-CGC-CTT-GCA-GCA-C
AT-CCC-CCT-TTC-GTT-GAA-TT
A-ccc-GAA-CGT-CGT-GTA-GGG
-GGA-AAG -8la Ser Trp
Arg Asn Ser Glu Glu
Ala Arg ThrGCC-AGC-TGG-
CGT-8AT-AGC-GM-GAG-GCC-CG
C-ACC-CGG-TCG-ACC-GCA-TTA
-TCG-CTT-CTC-CGG-GCG-TGG-
Asp Arg Pro Ser Gin Gin L
eu Arg Ser Leu AsnGly Glu
Trp Arg Phe Ala Trp Phe
Pro 8 la Pr. GGC-GM-TGG-CGC-TTT-GCC-TG
G-TTT-CCG -GCA-CCA-CCG-
CTT-ACC-GCG-MA-CGG-ACC-AM
-GGC-CGT -GGT -Glu Ala Va
l Pro Glu Ser Trp Leu Glu
Cys AspGM-GCG-GTG-CCG-G
M-AGC-TGG-CTG-GAG-TGC-G
AT-CTT-CGC-CAC-GGC-CTT-T
CG-ACC-GAC-CTC-ACG-CTA-L
eu Pro Glu Ala Asp Thr Va
l Val Val Pro 5erCTT-CCT-
GAG-GCC-GAT-ACT-GTC-GTC-G
TC-CCC-TCA-GAA-GGA-CTC-CG
G-CTA-TGA-CAG-CAG-CAG-GGG
-AGT-Asn Trp Gin Met His
Gly Tyr Asp Ala Pro 1eMC-
TGG-CAG-ATG-CAC-GGT-TAC-G
AT-GCG-CCC-ATC-TTG-ACC-GT
C-TAC-GTG-CCA-ATG-CTA-CGC
-GGG-TAG-Tyr Thr Asn Val
Thr Tyr Pro Engineering 1-e Th
r Val 8snTAC-ACC-MC-GTA-
ACC-TAT-CCC-ATT-ACG-GTC-M
T-ATG-TGG-TTG-CAT-TGG-ATA
-GGG-TM-TGC-CAG-TTA-Pro P
ro Phe Val Pro Thr Glu As
n Pro Thr GlyCCG-CCG-TTT-
GTT-CCC-ACG-GAG-AAT-CCG-A
CG-GGT-GGC-GGC-AAA-CM-GGG
-TGC-CTC-TTA-GGC-TGC-CCA-
Cys Tyr Ser Leu Thr PheAs
n Val Asp Glu SerTGT-TAC-
TCG-CTC-ACA-TTT-MT-GTT-GA
T-CAA-AGC-ACA-ATG-AGC-GAG
-TGT-AAA-TTA-CAA-CTA-CTT-
TCG-Trp Leu Gln Glu Gly G
ln Thr Arg 1e Ile PheTGG-
CTA-CAG-GM-GGC-CAG-ACG-CG
A-ATT-ATT-TTT-ACC-GAT-GTC
=CTT-CCG-GTC-TGC-GCT-T to A-
TAA-AAA-Asp Gly Val Asn S
er Ala Phe His Leu T'rp C
ysGAT-GGC-GTT-8AC-TCG-GCG
-TTT-CAT-CTG-TGG-TGC-CTA-
CCG-CAA-TTG-AGC-CGC-8AA-G
TA-GAC-ACC-ACG-Asn Gly Ar
g Trp Val Gly Tyr Gly Gin
Asp SerMC-GGG-CGC-TGG-GT
C-GGT-TAC-GGC-CAG-GAC-AGT
-TTG-CCC-GCG-ACC-CAG-CCA-
ATG-CCG-GTC-CTG-TCA-Arg L
eu Pro Ser Glu Phe Asp Le
u Ser Ala PheCGT-TTG-CCG-
TCT-GM-TTT-GAC-CTG-AGC-GC
A-TTT-GCA-AAC-GGC-AGA-CTT
-AAA-CTG-GAC-TCG-CGT-AAA-
Leu Arg Ala Gly Glu
Asn Arg Leu Ala Val
MetTTA-CGC-GCC-GGA-GM-MC-
CGC-CTC-GCG-GTG-ATG-HeheT-G
CG-CGG-CCT-CTT-TTG-GCG-GA
G-CGC-CAC-TAC-Val Lau Arg
Trp Ser Asp Gly Ser Tyr
Leu GluGTG-CTG-CGT-TGG-AG
T-GAC-GGC-AGT-TAT-CTG-GAA
-CAC-GAC-GCA-ACC-TCA-CTG-
CCG-TCA-ATA-GAC-CTT-Asp
Gin Asp Met Trp Arg Met S
er Gly 工１e PheGAT-CAG-GAT
-ATG-TGG-CGG-ATG-AGC-GGC-
ATT-TTC-CTA-GTC-CTA-TAC-A
CC-GCC-TAC-TCG-CCG-TAA-MG
-21022'O Arg Asp Val Ser Leu Leu H
is Lys Pro Thr Thr Gln 工1e
Ser Asp Phe His Val Ala
Thr Arg PheC8A- to TC-AGC-GA
T-TTC-CAT-GTT-GCC-ACT-CGC
-TTT-GTT-TAC-TCG-CTA-AAG-
GTA-CAA-CGG-TGA-GCG-AAA-A
sn Asp Asp Phe Ser A
rg Ala Val Leu G1+j
Al-aAAT-GAT-GAT-TTC-AGC-C
GC-GCT-GTA-CTG-GAG-GCT-TT
A-CTA-CTA-MG-TCG-GCG-CGA-
CAT-GAC-CTC-CGA-Glu Val G
ln Met Cys Gly Glu Leu Ar
g Asp TyrGM-GTT-CAG-ATG-T
GC-GGC-GAG-TTG-CGT-GAC-TA
C-CTT-CM-GTC-TAC-ACG-CCG-
CTC-AAC-GCA-CTG-ATG-Leu A
rg Val Thr Val Ser Leu Tr
p Gl-n Gly GluCTA-CGG-GTA
-ACA-GTT-TCT-TTA-TGG-CAG-
GGT-GAA-GAT-GCC-CAT-TGT -
CM-AGA-MT-ACC-GTC-CCA-CT
T -Thr Gln Val 8 la Se
r Gly Thr Ala Pro Phe
GlyACG-CAG-GTC-GCC-AGC-
GGC-ACC-GCG-CCT-TTC-GGC-T
GC-GTC-CAG-CGG-TCG-CCG-TG
G-CGC-GGA-AAG-CCG-Gly Glu
Engineering 1e Engineering 3-e Asp Glu Arg Gly
Gly Tyr AlaGGT-CAA-ATT-AT
C-GAT-GAG-CGT-GGT-GGT-TAT
-A-TAG-CTA- to GCC-CCA-CTT-T
CTC-GCA-CCA-CCA-ATA-CGG-8
sp Arg Val Thr Leu Arg L
eu Asn Val Glu AsnGAT-CG
C-GTC-ACA-CTA-CGT-CTG-MC-
GTC-CAA-AAC-CTA-GCG-CAG-T
GT-GAT-GCA-GAC-TTG-CAG-CT
T-TTG-Pro Lys Leu Trp Ser
Ala Glu Ile Pro Asn LeuC
CG-AAA-CTG-TGG-AGC-GCC-GA
A-ATC-CCG-MT-CTC-GGC-TTT-
GAC”-ACC-TCG-CGG-CTT-TAG-
GGC-TTA-GAG-Tyr Arg Ala V
al Val Glu Leu HiSThr Ala
AspTAT-CGT-GCG-GTG-GTT-G
AA-CTG-CAC-ACC-GCC-GAC-AT
A-GCA-CGC-CAC-CAA-CTT-GAC
-GTG-TGG-CGG-CTG-Gly Thr
Leu Ile Glu Ala Glu Ala C
ys Asp ValGly Phe Arg G11
z Val Arg Engineering Glu Asn Gly
LeuGGT-TTC-CGC-GAG-GTG-CG
G-ATT -GM-AAT-GGT-CTG -CC
A-AAG-GCG-CTC-CAC-GCC-TM-
CTT-TTA-CCA-GAC-LeuLeuL
eu Asn Gly Lys Pro Leu Le
u engineering 1e ArgCTG-CTG-CTG-AAC-G
GC-MG-CCG-TTG-CTG-ATT-CGA
-GAC-GAC-GAC-TTG-CCG-TTC-
GGC-MC-GAC-TM-GCT-Gly Va
l Asn Arg His Glu Hi
s His Pro Leu l1 is GGC
-GTT-AAC-CGT-CAC-GAG-CAT-
cAT-CCT-CTG-CAT-ccc-cAA-T
Ta-GCA-GTG-CTC-GTA-GTA-GG
A-GAC-GTA-Gly Gln Val Met
Asp Glu Gin Thr Met Val
GlnGGT-CAG-GTC-ATG-GAT-GA
G-CAG-ACG-ATG-GTG-CAG-CCA
-GTC-CAG-TAC-CTA-CTC-GTC-
TGC-TAC-CAC-GTC-Asp Engineering Le
u Leu Met Lys Gln Asn Asn
Phe AsnGAT-8TC-CTG-CTG-A
TG-MG-CAG-MC-MC-TTT-MC-CT
A-TAG-GAC-GAC-TAC-TTC-GTC
-TTG-TTG-AAA-TTG-Ala Val
Arg Cys Ser His Tyr Pro A
sn His Pr. GCC-GTG-CGC-TGT-TCG-CAT-T
AT-CCG-MC-CAT-CCG-CGG-CAC
-GCG-ACA-AGC-GTA-ATA-GGC-
TTG-GTA-GGC-Leu Trp Tyr T
hr Leu Cys Asp Arg Tyr Gl
y LeuCTG-TGG-TAC-ACG-CTG-
TGC-GAC-CGC-TAC-GGC-CTG-G
AC-ACC-ATG-TGC-GAC-ACG-CT
G-GCG-ATG-CCG-GAC-Tyr Val
Val Asp Glu Ala Asn Engineering 1e
Glu Thr )IisTAT-GTG-GTG-G
AT-GAA-GCC-MT-ATT-GM-ACC-
CAC-ATA-CAC-CAC-CTA-CTT-C
A-CTT-TGG-GTG-Gl to GG-TTA-T
y Met Val Pro Met Asn Arg
Leu Thr Asp AspGGC-ATG-G
TG-CCA-ATG-MT-CGT-CTG-ACC
-GAT-GAT-CCG-TAC-CAC-GGT-
TAC-TTA-GCA-GAC-TGG-CTA-C
TA-Pro Arg Trp Leu Pro Al
a Met Ser 'Glu Arg ValThr
Arg Met Val Gin Arg Asp
Arg Asn His Pr. ACG-CGA-ATG-GTG-CAG-CGC-G
AT-CGT-MT-CAC-CCG-TGC-GC
T-TAC-CAC-GTC-GCG-CTA-GCA
-TTA-GTG-GGC-Ser Val Engineering 1e
Engineering 1e Trp Ser Leu Gly Asn G
lu 5erAGT-GTG-ΔTC-ATC-TGG
-TCG-CTG-GGG-MT-GM-TCA-TC
A-CAC-TAG-TAG-ACC-AGC-GAC
-CCC-TTA-CTT-AGT-Gly His
Gly Ala Asn His Asp Ala L
eu Tyr ArgGGC-CAC-GGC-GCT
-AAT-CAC-GAC-GCG-CTG-TAT-
CGC-CCG-GTG-CCG-CGA-TTA-G
TG-CTG-CGC-GAC-ATA-GCG-T
rp ENGLE Lys Ser Val Asp Pr
o Ser Arg Pro ValTGG- to TC-
to AA-TCT-GTC-GAT-CCT-TCC-C
GC-CCG-GTG-ACC-TAG-TTT-AG
A-CAG-CTA-GGA-AGG-GCG-GGC
-CAC-Gin Tyr Glu Gly Gay
Gly Ala Asp Thr Thr AlaTh
r Asp Engineering 1e Engineering le Cys Pro Met T
yr Ala Arg ValACC-GAT-ATT
-ATT-TGC-CCG-ATG-TAC-GCG-
CGC-GTG-TGG-CTA-TM-TM-ACG
-GGC-TAC-ATG-CGC-GCG-CAC-
Asp Glu Asp Gin Pro Phe P
ro Ala Val Pro LysGAT-GM-
GAC-CAG-CCC-TTC-CCG-GCT-G
TG-CCG-AAA-CTA-CTT-CTG-GT
C-GGG-MG-GGC-CGA-CAC-GGC-
TTT-Trp Ser Engineering Lys Lys T
rp Leu Ser Leu Pro GlyTGG
-TCC-ATC-AAA-AAA-TGG-CTT-
TCG-CTA-CCT-GGA-ACC-AGG-T
AG-TTT-TTT-ACC-GAA-AGC-GA
T-GGA-CCT-Glu Thr Arg Pro
Leu 工 le Leu （：ys Glu Tyr
AlaGAG-ACG-CGC-CCG-CTG-A
TC-CTT-TGC-GAA-TAC-GCC-CT
C-TGC-GCG-GGC-GAC-TAG-GM-
ACG-CTT-ATG-CGG-His Ala M
et Gly Asn Ser Leu Gly-Gl
y-Phe-Ala-Lys-Tyr-Trp-
G 1n-Al a-Phe -Arq-G In-T
yr-Pro-ArgAAA-TAC-TGG-CA
G-GCG-TTT-CGT-CAG-TAT-CCC
-CGT-TTT-ATG-ACC-GTC-CGC-
A7-GCA-GTC-ATA-GGG-GCA-L
eu Gln Gly Gly Phe Val Tr
p Asp Trp Val AspTTA-CAG-
GGC-GGC-TTC-GTC-TGG-GAC-T
GG-GTG-GAT-MT-GTC-CCG-CCG
-A7■-CAG-ACC-CTG-ACC-CAC-
CTA-Gln Ser Leu 工１e Lys Ty
r Asp Glu Asn Gly AsnCAG-
TCG-CTG-ATT-A75-TAT-GAT-G
AA-AAC-GGC-AAC-GTC-AGC-GA
C-TM-TTT-ATA-CTA-CTT-TTG-
CCG-TTG-Pro Trp Ser Ala T
yr Gly Gly Asp Phe Gly As
pCCG-TGG-TCG-GCT-TAC-GGC-
GGT-GAT-TTT-GGC-GAT-GGC-A
CC-AGC-CGA-ATG-CCG-CCA-CT
A-AJ5-CCG-CTA-Thr Pro Asn
Asp Arg Gln Phe Cys Met
Asn GlyLeu Val Phe Ala As
p Arg Thr Pro His Pro Ala
Leu Thr Glu Hala Lys His
Gin Gln Gln Phe PheGln Ph
e Arg Leu Ser Gly Gln Thr
Engineering Glu ValThr Ser Glu Ty
r Leu Phe Ar:q His Ser As
pAsnACC-8GC-GAA-TAC-CTG-
TTC-CGT-CAT-AGC-GAT-8AC-T
GG-TCG-CTT-ATG-GAC-A7-GC
A-GTA-TCG-CTA-TTG-Glu Leu
Leu His Trp Met Val Ala
Leu Asp GlyLys Pro Leu Al
a Ser Gly Glu Val Pro Leu
AspVal Ala Pro Gln Gly L
ys Gin LeuPro
Glu Leu Pro Gln Pro Glu S
er Ala Gly GlnCCT-GM-CTA-
CCG-CAG-CCG-GAG-AGC-GCC-G
GG-CAA-GGA-CTT-GAT-GGC-GT
C-GGC-CTC-TCG-CGG-CCC-GTT
-Leu Trp Leu Thr Van Arg
Van Van Gin Pro AsnCTC-TG
G-CTC-ACA-GTA-CGC-GTA-GTG
-CM-CCG-MC-GAG-ACC-GAG-TG
T-CAT-GCG-CAT-CAC-GTT-GGC
-TTG-Ala Thr Ala Trp Ser
Glu Ala Gly His Ile SerAl
a Trp Gln Gin Trp Arg Leu
Ala Glu Asn LeuSer Val T
hr Leu Pro Ala Ala Ser H
is Ala 工１eAGT-GTG-ACG-CT
C-CCC-GCC-GCG-TCC-CAC-GCC
-ATC-TCA-CAC-TGC-GAG-GGG-
(:GG-CGC-AGG-GTG-CGG-TAG-
Pro His Leu Thr Thr Ser G
lu Met Asp Phe CySCCG-CAT
-CTG-ACC-Acc-AGC=cAA-ATG-
GAT-TTT-TGC-GGC-GTA-GAC-T
GG-TGG-TCG-CTT-TAC-CTA-8A
A-ACG-Engineering 1e Glu Leu Gl-y As
n Lys Arg Trp Gln Phe Asn
ATC-GAG-CTG-GGT-AAT-AAG-C
GT-TGG-CM-TTT-8AC-TAG-CTC
-GAC-CCA-TTA-TTC-GCA-ACC-
GTT-AAA-TTG-Arg, Gln Ser
Gly Phe Leu Ser Gln Met T
rp engineering 1eGly Asp Lys Lys Gln
Leu Leu Thr Pro Leu ArgAs
p Gin Phe Thr Arg Ala Pro
Leu Asp Asn AspGAT-CAG-T
TC-ACC-CGT-GCA-CCG-CTG-GA
T-MC-GAC-CTA-GTC-MG-TGG-G
CA-CGT-GGC-GAC-CTA-TTG-CT
G-Engineering 1e Gly VaISer Glu Ala
Thr Arg Engineer Asp Pr. Asn Ala Trp Val Glu Arg T
rp Lys Ala Ala GlyMC-GCC-
TGG-GTC-GM-CGC-TGG-MG-GCG
-GCG-GGC-TTG-CGG-ACC-CAG-
CTT-GCG-ACC-TTC-CGC-CGC-C
CG-His Tyr Gin Ala qlu
Eight la Ala Leu 'Lreu Gln
CysThr Ala Asp Thr Leu A
la Asp Ala Val Leu 工１eACG-
GCA-GAT-ACA-CTT-GCT-GAT-G
CG-GTG-CTG-ATT-TGC-CGT-CT
A-TGT-GM-CGA-C'rA-CGC-CAC
-GAC-TAA-Thr Thr Ala His
Ala Trp Gln His Gin Gly L
ysACG-ACC-GCT-CAC-GCG-TGG
-CAG-CAT-CAG-GGG-AAA-TGC-
TGG-CGA-GTG-CGC-ACC-GTC-G
TA-GTC-CCC-TTT-Thr Leu Ph
e Engineering Ser Arg Lys Thr Tyr
Arg Engineering 1eACC-TTA-TTT-ATC-A
GC-CGG-AAA-ACC-TAC-CGG-AT
T-TGG-AAT-AAA-TAG-TCG-GCC
-TTT-TGG-ATG-GCC-TAA-Asp
Gly Ser Gly Gln Met Ala 工
1e Thr Val AspGAT-GGT-AGT
-GGT-CM-ATG-GCG-ATT-ACC-G
TT-GAT-CTA-CCA-TCA-CCA-GT
T-TAC-CGC-TM-TGG-CAA-CTA-
Val Glu Val Ala Ser Asp T
hr Pro His Pro AlaArg Engineering 1e
Gly Leu Asn Cys Gln Leu A
la Gln VanCGG-ATT-GGC-CTG
-AAC-TGC-CAG-CTG-GCG-CAG-
GTA-GCC-TAA-CCG-GAC-TTG-A
CG-GTC-GAC-CGC-GTC-CAT-Al
a Glu Arg Van Asn Trp Leu
Gly Leu Gly Pr. GCA-GAG-CGG-GTA-AAC-TGG-C
TC-GGA-TTA-GGG-CCGLCGT-CT
C-GCC-CAT-TTG-ACC-GAG-CCT
-MT-CCC-GGC-Gln Glu Asn T
yr Pro Asp Arg Leu Thr Al
a AlaCAA-GAA-MC-TAT -CCC-
GAC-CGC-CTT-ACT-G CC-GC
C-GTT-CTT-TTG-ATA-GGG-C
TG-GCG-GM-TGA-CGG-CGG-Cy
s Phe Asp Arg Trp Asp Leu
Pro Leu Ser AspTGT-TTT
-GAC-CGC-TGG-GAT-CTG-CCA-
TTG-TCA-GAC-ACA-AJ愼-CTG-G
CG-ACC-CTA-GAC-GGT-A7-AG
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Val Phe Pro Ser Glu AsnA
TG-TAT-ACC-CCG-TAC-GTC-TT
C-CCG-AGC-GM-MC-TAC-ATA-T
GG-GGC-ATG-CAG-MG-GGC-TCG
-CTT-TTG-Gly Leu Arg Cys
Gly Thr Arg Glu Leu Asn T
yrGGT-CTG-CGC-TGC-GGG-ACG
-CGC-GM-TTG-MT-TAT-CCA-GA
C-GCG-ACG-CCC-TGC-GCG-CTT
-MC-TTA-ATA-Gly Pro HiSGl
n Trp Arg Gly Asp Phe Gln
PheGGC-CCA-CAC-CAG-TGG-C
GC-GGC-GAC-TTC-CAG-TTC-CC
G-GGT-GTG-GTC-ACC-GCG-CCG
-CTG-AAG-GTC-AAG-Asn Engineering
Ser Arg Tyr Ser Gin Gin G
ln Leu +/+etMC-ATC-AGC-CG
C-TAC-AGT-CM-CAG-CAA-CTG-
ATG-TTG-TAG-TCG-GCG-ATG-T
CA-GTT-GTC-GTT-GAC-TAC-GL
u Thr Ser His Arg His Leu
Leu HiSAla GluGAA-ACC-AG
C-CAT-CGC-CAT-CTG-CTG-CAC
-C; CG-G A-CTT-TGG-TCG-GTA
-GCG-GTA-GAC-GAC-GTG-CGC-
CTT-Glu Gly Thr Trp Leu A
Sn Engineering Asp Gly Phe HisGM-G
GC-ACA-TGG-CTG-AAT-ATC-GA
C-GGT-TTC-CAT-CTT-CCG-TGT
-8CC-GAC-TTA-TAG-CTG-CCA-
AAG-CTA-Met Gly Engineering 1e Gly Gl
y Asp Asp Ser Trp Ser Pr. ATG-GGG-ATT-GGT-GGC-GAC-G
AC-TCC-TGG-AGC-CCG-TAC-CC
C-TM-CCA-CCG-CTG-CTG-AGG-
ΔCC-TCG-GGC-Ser Val Ser
8 la Glu Phe Met Gly Pro G
lu ThrTCA-GTA-TCG-GCG-GM-
TTC-ATG-GGT-CCT-GM-ACT-AG
T-CAT-AGC-CGC-CTT-MG-GAC-
CCA-GGA-CTT-TGA-Leu Cys G
ly Ala Glu Leu Val Asp Al
a Leu GinCTG-TGC-GGC-GCT-
GAA-CTG-GTT-GAC-GCT-CTG-C
AA-GAC-ACG-cci:;-CGA-CTT-
GAC-CAA-CTG-CGA-GAC-GTT-P
he Val CysGly Asp Arg Gly
Phe Tyr Phe AsnTTT-GTA-T
GT-GGT-GAT-CGT-GGT-TTC-TA
C-TTC-MC-N-CAT-ACA-CCA-C
TA-GCA-CCA-MG-ATG-MG-TTG-
Lys Pro Thr Gly Tyr Gl
y Ser Ser Ser Ser Arg ArgA
AA-CCG-ACC-GGC-TAT-GGC-TC
C-8GC-TCT-CGT-CGC-TTT-GGC
-TGG-CCG-8TA-CCG-AGG-TCG-
AGA-CCA-GCG-Ala Pro Gln T
hr Gly Engineering 1e Val Asp Glu Cys
CysGCA-CCG-CAG-ACT-GGT-A
TC-GTA-GAC-GAA-TGC-TGT-CG
T-GGC-GTC-TGA-CCA-TAG-CAT
-CTG-CTT-ACG-ACA-Phe Arg
Ser Cys Asp Leu Arg Arg L
eu Glu VanTTT-CGT-TCT-TGC
-GAT-CTC-CGC-CGT-CTG-GAA-
GTT-MA-GCA-AGA-ACG-CTA-GA
G-GCG-GCA-GAC-CTT-CAA-Tyr
Cys Ala Pro Leu Lys Pro
Ala Lys Ser AlaTAC-TGT-G
CT-CCA-CTG-AAG-CCA-GCA-8 people
A-TCC-GCG-3'ATG-ACA-CGA-G
GT-GAC-TTC-GGT-CGT-TTT-AG
G-CGC-5′ [7] 5″Val − in host organism
Expression of IGF-1 gene: In order to express the 59Val-IGF-1 gene,
The promorph gene thus obtained and 59Val-IGF-
A plasmid containing one gene is used to transform a host organism.
the host organism harboring the plasmid.
in a nutrient medium containing a carbon and nitrogen source that can be converted into
under aerobic conditions (e.g. shaking culture, deep culture, etc.)
Cultivate. The preferred carbon source in the nutrient medium is glucose. Fructose, sucrose, glycerin, starch, etc.
It is a type of carbohydrate. Other carbon sources that may be included include
Silose, galactose, maltose, dextrin,
such as lactose. Preferred nitrogen drAs are yeast extract, peptone, gluten
corn flour, cottonseed flour, soybean flour, corn steep liquor, dry fermentation
Mother, wheat malt, etc., as well as ammonium nitrate, sulfur
ammonium acid, ammonium phosphate, urea, amino acids, etc.
All inorganic and organic nitrogen compounds. Relatively low purity materials containing amounts of inorganic nutrients can also be used.
They are not necessarily used in their pure form because they are suitable for
It is not necessary to do so. When desired, calcium carbonate,
Sodium or potassium phosphate. Sodium or potassium chloride, magnesium salts, copper
Inorganic salts such as salts may be added to the medium. Agitation and aeration of the culture mixture can be achieved in a variety of ways.
. Agitation is by a propeller or similar mechanical agitation device.
, various pump devices by rotating or shaking the fermenter
or by passing sterile air through the medium.
It is caused by Stirring passes sterile air through the fermentation mixture
This can be accomplished by Fermentation is usually carried out at temperatures between about 20°C and 42°C, preferably
or at a temperature between 35 and 38℃ for several hours to 50 hours.
Do it over a period of time. 59Val-IGF-1 or fusion thus produced
“Va I-IGF-1 has other known biological activities.
Cultivate by conventional means commonly used for material recovery.
It can be recovered from the culture medium. Generally, the produced 59V
al-IGF-1 or fusion “Val-IGF-1”
Found in the cells of the host organism, and therefore “Val-IGF
-I or fusion 59Va, 1-IGF-' I is cultured
Cells obtained by filtration or centrifugation of the solution are collected under reduced pressure.
concentration, cell disruption such as sonication, HPLC, freeze-drying
Dry. pH 11, resin (e.g. anionic or cationic
treatment with conventional adsorption resins, nonionic adsorption resins), and conventional
Adsorbents (e.g. activated carbon, silicic acid, silica gel, cellulose)
For conventional methods such as treatment with alumina, gel filtration, and crystallization.
Therefore, it can be separated. (1) Group using plasmid p3dV2trl'
Expression of Val-IGF-1 gene in 6 coli
9 animals containing sdV2trp HBIOI in L broth
Cultured overnight in Top 1~F-free M9 medium
Dilute cells and β-indole acrylic acid induction conditions
The bottom of the ink was incubated at 37°C for 3 hours. “Val-
Detection of IGF-1 production was performed using Yanaihara's method [Yanaihara et al., P.
eptide Hor-mones in Pan
creas, 3. 28 (1983))
Therefore, “antibody of Val-IGF I fragment (26-46)”
Using the body, radioimmunoassay (hereinafter referred to as RIA)
I went there. (2) Plasmid pSdV2-322 trll
) using 59Val-IG in 6 animals.
9 mice containing the F-1 gene expression plasmid psdV2-322trp
After culturing HB 101 in L broth overnight,
Diluted with tryptophan-free M9 medium, β-indole
Incubate cells at 37°C for 3 hours under acrylic acid induction conditions.
I hated it. ”Detection of Val-IGF-I production is
The 59Val-IGF-1 fragment (26
-46) by RIA. [8] Fusion 59Va] Remains encoding -1CF-I
Expression of gene in host organism: (1) Protein-peptide LH fusion “Val-IGF-1”
Expression of the encoding gene in the host organism: protein peptide
The gene encoding LH fusion 59Val-IGF-1
For expression, promoter gene and protein peptide
Plasmid with LH fusion “Val-IGF-I”
The plasmid is then used to transform a host organism, and then the plasmid
A host organism having the following conditions is cultured in a suitable medium. obtained
Protein peptide LH fusion 59Val-IGF was extracted from the culture medium.
Expression in the middle of the day: pLH3d, Vtrp, pLH3dVtrpS or p
9 Dan HB 101 containing L, H3dVtrpL
cultured overnight in L broth, tryptopha-free
Diluted with M9 medium containing β-indole acrylic acid.
Cells were incubated for 3 hours at 37°C. Detection of fusion 59Val-IGF-I production was performed by Yanaihara.
[Yanaihara et al., Peptide Hormones]
1nPancreas, 3. 28 (1983))
According to “Val-ICF-1 fragment (26-4
6) Radioimmunoassay (hereinafter referred to as RIA) using the antibody
). (it) Protein-peptide LH fusion 59Val-ICF-
Isolation of 1: Centrifuge the culture medium to obtain a wet cell paste and remove the cells.
were destroyed by ultrasonication. Bere by centrifugation
Then, add 0.1M dithiothreitol (
Dissolved in an 8M urea solution containing DTT (hereinafter abbreviated as DTT)
I understand. After centrifugation, the solution was transferred to a 3300 column chromatograph.
Purified by Raffy. Activity detected by RIA
Fractions are collected and dialyzed to obtain proteins containing the desired components.
Ta. When polyacrylamide gel electrophoresis was performed, it was found that
iTE, (15500) fused 59Val-IGF
i was detected. The thus obtained protein peptide LH fusion “Val-IGF”
-I is as follows. Cys-Tyr-Cys-Gln-Asp-P
ro-Tyr-Val-Ly 5-Glu-Ala-
Glu-Asn-Leu-Lys-Ly 5-Tyr
-Phe-As n-Ala-Gly-His-
Ser-Asp-Va 1-Ala-Asp-As n
-Gly-Thr-Leu-Phe-Leu, -Gly
-Eng.1e-Leu-Lys-Asn-Trp-Lys-
Glu-Glu-5er-Asp-to rg-Lys-Engineering
1e-Met-Gln-6er-Gln-Engineering 1e-Va
l-9er-Phe-Tyr-Phe-Lys-Le
u-G 1u-Val-Ly s-His-Glu
-Phe-Met-G 1y-Pro-Glu-Thr
-Leu-Cys -G 1y-Ala-G 1u-L
eu-Va 1-Asp-Ala-Leu-G 1n-
Phe-Val-Cys-Gly-Asp-Arg
-G 1y-Ph e-Tyr-Phe-As n-L
y5-Pro-Thr-Gly-Tyr-Gly-5
er-Ser-6er-Arg-Arg-Ala-Pr
ol105er-6er-Ar engineering: Le-Van-As
p-Glu-Cys-(Js-PheJ, rg-5
e r-Cys -Asp-Leu -Arg -Ar
g-Leu-Glu-Va 1-Tyr-Cys
-Ala-Pro-Leu-Lys-Pro-
Ala-L+ys-5er-Ala (2) β-galactosidase fusion 59Val-IC
Expression of the gene encoding F-■ in the host organism = ps
A host organism containing dV2-1aC or pSdV2-
Using a host organism containing NT49 and pNT204
, protein peptide L tl fusion 59Val-ICF = company mother
= β-galactocida following the same method as for #
The enzyme fusion 59Val-ICF=1≠=4 was obtained. The fusion obtained in this way 5″Val-1’GF=Tangumo=→ is as follows
It is as follows. Thr-Met-Eng 1e-Thr-Asp-9er-L
eu-Ala-Val-Val-Leu-G in-A
rq-Arg-Asp-Trp-Glu-Asn-P
ro-G ly -Va 1-Thr -Gln-Le
u-As n-Arg-Leu-Ala-Ala-11
i 5-Pro-Pro-Phe -81a-5er-
Trp-Arg-Asn-9er-Glu-Glu-A
la-Arg-Thr-Asp-Arg-Pro-Se
r-Gin-Gin-Leu-Arg-5er-Leu
-Asn-Gly-Glu-Trp-Arg-Ph a
-Ala-Trp-Phe-Pro-Ala-
Pro-G 1u-A 1 a-Va 1-Pro
-Glu-5er-Trp-Leu-Glu-Cy 5
-Asp-Leu-Pro-Glu-8la-Asp-
Thr-Val-Val-Val-Pro7Ser-A
sn-Trp-Gin-Met-His-Gly-Ty
r-Asp-Ala-Pro-Eng.1e-Tyr-Thr
-Asn-Val-Thr-Tyr-Pro-Engineering 1e-
Thr-Val-Asn-Pro-Pro-Phe-
Va”h -P ro-Th r -G 1u-Asn
-P r o-Thr-Gly-Cy 5-Tyr-
9er-Leu-Thr-Phe-Asn-Va
1-As p-G lu -Ser-Trp-Leu
-Gln-Glu-Gly-Gln-Thr-Arg-
11e-Engineering 1e-Phe-Asp-Gly-Val-A
sn-9er-Ala-Phe-His-Leu-Tr
p-Cys-Asn-G Ly-Arg-Trp-V
a 1-G 1y-Tyr-Gly-Gln-Asp-
Ser-Arg-Leu-Pro-5er-Glu
-Phe-Asp-Leu-3er-Ala-Phe
-Leu-Δrq-Ala-Gly-Glu-Asn-
Arg-Lau-Ala-Val-Met-Va 1-
Leu-Arg-Trp-9er-Asp-G 1y-
6er-Tyr-Leu-Glu-Asp-Gln
-Asp-Met-Trp-Arg-Met-Ser-
Gly-Engineering1e-Phe-Arg-Asp-Val-
5er-Leu-Leu-His-Lys-P
ro-Thr-Thr-Gln-Engineering1e-5er-As
p-Phe-His-Val-Ala-Thr-Arg
-Phe-Asn-Asp-Asp-Phe-5er-
Arg-Ala-Val-Leu-Glu-Ala-G
lu-Va 1-Gln-Met-Cys-Gly-G
lu-Leu-Arg-Asp-Tyr-Le, u-
8rg-Val-Thr-Val-Ser-Leu-T
rp-Gln-Gly-Glu-Thr-Gln-Va
l -Ala-9er-Gly-Thr-Ala-Pr
o-Phe -Gly-Gly-Glu-technique 1e-technique 1
e-Asp-Glu-Arg-Gly-Gly-Tyr
-Ala-As p-Arg-Val-Thr-Leu
-Arg-Leu-Asn -Va 1-G lu -
As n-Pro-Lys-Leu-Trp-Ser
-Ala-Glu-E -Pr O-A Sn
-Le u -Tyr-Arg-Ala-Val-V
al-Glu-Leu-Hi 5-Thr-Ala
-Asp-Gly-Thr-Leu-Eng.1e-Glu-
Ala-Glu-Ala-Cys-Asp-Val-G
ly-Phe-Arg-Glu-Val-Arg-Engineering 1
e-Glu-Asn-Gly-Leu-Leu-Leu
-Leu-Asn-Gly-Lys-Pro-Leu-
Leu-Engineering1e-Arg-Gly-Val-Asn-A
rg-Hi5-Glu-His-Hi5-Pr
o-Leu-His-Gly-Gln-Va
1-Met-Asp-G 1u-Gl n -Thr
-Me t-Va 1-G in -Asp-Engineering 1e-
Leu-Leu-Met-Lys-Gln-Asn-A
sn-Phe-Asn-Ala-Va 1-Arg-C
y 5-5e r-Hi 5-Tyr-P ro-As
n-His-Pro-Leu-Trp-Tyr-T
hr-Leu-Cys-Asp-Arg-Tyr-Gl
y-Leu-Tyr-Val-Val-As, p-Gl
u-Ala-Asn-E-Glu-Thr-His
-Gly-Met-Val-Pro-Met-Asn-
Arg-Leu-Thr-Asp-Asp-Pro
-Arg-'I'rp-Leu-Pro-Ala-M
et-S er -G lu-Arg -Va 1-T
h r-Arg −+4e t-Va 1-Gl n-
Arg-As p-Arg-Asn-His-P
ro-Ser-Val-Engineering 1e-Engineering 1e-Trp-S
er-Leu-Gly-Asn-Glu-Ser-Gl
y-His-Gly-Ala-Asn-Hi5
-Asp-Al a-Leu-Tyr-Arg-Trp
-Engineering 1e-Lys-5er-Val-Asp-Pro-
5er-Arg-Pro-Val-G 1n-Tyr-
Glu-Gly-Gly-Gly-Ala-Asp-T
hr-Thr-A:La-Thr-Asp-Eng.1e-
Engineering 1e-Cys-Pro-Met-Tyr-Ala-A
rg-Val-Asp-Glu-Asp-Gln-P
ro-Phe-P ro-Ala-Val-P ro-
Lys -Trp-5er-Eng.1e-Lys-Lys
-Trp-Lau-6er-Leu-Pro-Gly-
Glu-Thr-Arg-Pro-Leu-Eng.1e-L
eu-CyS-Glu-Tyr-Ala-His-Al
a-Met-Gly-Asn-Ser-Leu-Gly
-Gly-Pha-Ala-Lys-Tyr-Trp-
Gln-Δla-Phe-Arg-Gin-Tyr-P
ro-Arg-Leu-Gin-Gly-Gly
7Phe-Val-Trp-Asp-Trp-Va
1-Asp-Gln-Ser-Leu-Eng.1e-Ly
s-Tyr-Asp-Glu-Asn-Gly-As
n-Pro-Trp-3er-A1a7Tyr-Gly
-Gly-Asp-Phe-Gly-Asp-Thr-
Pro-Asn-Asp-Arg-Gln-Phe-C
ys-)iet-Asn-Gly-Leu-Val-P
he-Ala-Asp-Arg-Thr-Pro-
Hi 5-Pro-Ala-Leu-Thr-G 1u
-Ala-Lys-Hls-Gln-G
1n-Gln-Phe-Phe-Gln-Phe-Ar
g-Leu-5er-Gly-Gln-Thr-Engineering 1e
-Glu-Val-Th r -Ser-Glu-Ty
r-Leu-Phe-Arg-His-Ser-
As p-As n -G 1u-Leu-Leu-)
1 is-Trp-Me t-Va 1-Ala-L
eu-ASp-Gly-Lys-Pro-Leu-A
la -Se r-Gly-G 1u-Val -Pr
o7Leu-A sp-Val-Ala-Pro-G
ln-GLy-Lys-Gln-Leu-ENG1e-Gl
u-Leu-Pro-Glu-Leu-Pro-Gin
-Pro-Glu-Ser-Ala-Gly-Gln-
Leu-Trp-Leu-Thr-V,al-Ar
g-Va 1-Val -G In -Pro-As
n-Al, a-Thr-Ala-Trp-Ser-G
lu-Ala-Gly-His-11e-5er-Al
a-Trp-Gin-Gln-Trp-Arg-L
eu = A1a-G 1u-As n-Leu -Se
r-Val-Thr-Leu-Pro-Ala-Ala
-Ser-His-Ala-Engineering 1e-Pro-His-
Leu-Thr-Thr-5er-Glu-Met-A
sp-Phe-Cys-Engineering1e-Glu-Leu-G
1y-Asn-Lys-Arg-Trp-Gin
-P he-As n -Arg-Gin-Ser-G
ly-Phe-Leu-5er-Gln-Met-Tr
p-tech1e-Gly-Asp-Ly s -Ly s
-G 1 n-Leu-Leu -Th r-Pro-
Leu-Arg-Asp-Gin-Phe-Thr-
Arg-Ala-Pro-Leu-Asp-ASn-A
sp-Engineering-Gly-Val-Ser-Glu-Al
a-Thr-Arg-E-Asp-Pro-As
n-Ala-Trp -Va 1-G lu-Arg-
Trp-Ly 5-Ala-Ala-Gly-
His-Tyr-Gln-Ala-Glu-Ala-A
la-Leu-Leu-Gin-Cys-Thr-Al
a-Asp-Thr-Leu-Ala-Asp-Ala
-Val-Leu-E-Thr-Thr-Ala-
His-Ala-Trp-Gin-His-Gin-G
ly-Lys-Thr-Leu-Pha-Engineering1e-Se
r-Arg-Lys-Thr-Tyr-Arg-Engineering 1e
-Asp-Gly-Ser-Gly-Gln-Met-
Ala-Engineering 1e-Thr-Val-Asp-8708E
]0 Val-Glu-Val-Ala-5er-Asp-T
hr-Pro-His-Pro-Ala-Arg-Engineering
1e-Gly-Leu-Asn-Cys-Gln-Le
u-Ala-Gln-Val-Ala-Glu-Arg
-Va 1-As n-Trp-Leu-Gly-Le
u-G 1y-Pro-Gln-Glu-Asn-Ty
r-Pro-Asp-Arg-Leu-Thr-Ala
-Ala-Cys-Phe-Asp-Arg-Trp-
Asp-Leu-Pro-Leu-5er-Asp-M
et-Tyr-Thr-Pro-Tyr-11a1-P
he-Pro-3er-Glu-Asn-Gly-Le
u-Arg-Cys-Gly-Thr-Arg-Glu
-Leu-Asn-Tyr-Gly-Pro-Hi
s-Gin-Trp-Arg-Gly-Asp-
Phe-G in -Phe -Asn-eng 1e-3e
r-Arg-Tyr-9er-Gln-Gln-Gln
-Leu-Met-Glu-Thr-9er-His-
Arg-Hi5-Leu-Leu-His-Al
a-Glu-G 1u-Gly-Th r-Trp-L
eu-Asn - 工1e-Asp -G 1y-Phe
-His -Met-Gly-Engineering1e-Gly-Gl
y-Asp-Asp-5er-Trp-9er7Pro
-Ser-Val-Ser-Ala-Glu-Phe
-Me7-Gly-Pro-Glu-Thr=Leu-
Cys-Gly-Ala-Glu-Leu-Va
1-Asp-Ala -Leu-Gin -Phe-
Val-Cys-Gly-Asp-Arg-Gly-P
he-Tyr-Phe-8sn-Lys-Pro-Th
r-Gly-Tyr-Gly-Ss r-5er-Se
r-Arg-Arg-711a-Pro-Gln-Th
r-Gly-Engineering1e-Val-Asp-Glu-Cys
-Cys-Phe-Arg-3er-Cys-Asp-
Leu-Arg-Arg-Leu-G 1u-Va L
-Tyr-Cys-Ala-Pro-Leu-Lys
-Pro-Ala-Ly 5-5er-Ala

〔９〕
融合５９Ｖａ　］　−１０Ｆ−１の”Ｖａｌ−ＩＧＦ−
１への変換および５９Ｖａｌ−ＩＣＦ−１の単離： こうして得た融合５９Ｖａｌ−ＩＣＦ　　＋は、保護ペ
プチドの脱離反応によって５９Ｖａｌ−ＩＧＦ−Ｉに変
換できる。 この脱離反応は、ペプチド化学の領域で用いられる常法
に従って実施できる。融合”Ｖａｌ−ＩＧＦ−１のタイ
プに応じて適当な脱離反応を選択することができる。 この脱離反応で使用される適当な反応剤には、臭化シア
ンが包含されうる。 蛋白ペプチドのメチオニンを介して蛋白ペプチドと融合
し７た”Ｖａｌ−ＩＧＦ−１からの蛋白ペプチドの脱ｉ
Ｊ： 蛋白ペプチドのメチオニンを介して蛋白ペプチドと融合
した”Ｖａｌ−ＩＣＦ−１は、臭化シアンを用いた脱離
反応によって、”Ｖａｌ−ＩＣ＋Ｆ−■に変換できる。 この反応は、通常、反応に悪影響を及ぼさない恨用の溶
媒中、緩和な条件下で行われる。 反応温度はとくに限定されず、通常は、冷却ないし加温
のもとて反応を行う。 融合”Ｖａｌ−ＩＯＦ−］を、６６０％蟻酸中２５°で
３時間臭化シアンで処理した。凍結乾燥後、残渣ヲ、５
０ｍＭの２−メルカプトエタノールを含存する８Ｍ尿素
溶液に溶解させ、透析して、還元型５９Ｖａｌ−ＩＣＦ
−１の粗混合物を得た。この混合物をカチオン交換クロ
マトグラフィ　（ＣＭ５２）によって精製し、ＲＩＡで
検知された活性画分を集めて、透析した。透析後の両分
を高速液体クロマトグラフィにかけて、純粋な還元型″
′■ａｔ−ＩＣＦ−１を得た。この還元”Ｖａｌ−ＩＣ
Ｆ−１を、通嘱の再生法（ｒｅ４ｏ１ｄｉｎｇ）によっ
て酸化型”Ｖａ’１−ＩＧＦ−１に変換した。精製され
た５９Ｖａｌ−ＩＣＦ−１は、ポリアクリルアミドゲル
電気法ｖＪ（ＰＡＧＥ）に際して単一のバンドを示し、
またその”Ｖａｌ−ＩＧＦ−１は、ＩＩＰＬＯにおいて
、Ｈｕｍｂｅｌ博士から贈られた紐キキ年コＩＧＦ−１
の標品と重なった。”Ｖａｌ−ＩＧＦ−１のアミノ酸配
列を、エドマン法とカルボキシペプチダーゼ法とを組合
“Ｖて、決定した・その”Ｖａｌ−ＩＣＦ−１はＢＡＬ
Ｂ／ｃ　　３Ｔ３マウス細胞によるＭｌｌ）−チミジン
取込みアッセイにおいて生物活性を示した。 （１０）”Ｖａ　Ｉ　−ＩＧＦ−１の放射免疫測定：矢
内原〔矢内原ら、Ｐｅｐｔｉｄｅ　　Ｈｏｒｍｏｎｅｓ
　１ｎＰａｎｃｒｅａｓ、　　３．　２８　　（１９８
３）　）が確立した方法に従って、”Ｖａｌ−ＩＧＦ−
１のＲＩＡを行った。上記の試料または標準試料（ＩＧ
Ｆ−１断片（２６−４６））の０．１ｍβを、試料用緩
衝液（０，ＯＩＭ　　ＰＢＳ、０．０２５Ｍ　　ＥＤＴ
Ａ中、０．５％ＢＳＡ　（ｐＨ７，４）　　（０，４ｍ
ｊり　〕、”Ｖａ　１−ＩＧＦ−１（２６−４６）に対
するウサギの抗血清（０，１ｍ＃）および”’ＩＩＧＩ
”−１（２６−４６）（０，１ｍ１）と混合した。混合
物を４　’Ｃに４８時間放置し、つぎに、ウサギ血ｉ’
）ｆ（０，１ｍβ）、ウサギγ−グロブリン抗血清（０
，１ｍｌ）および５％ＰＥ０６０００　（０，９ｍｌを
加えた。４°Ｃでさらに２時間放置したのち、遠心分離
（３ｋｒｐｍ、４°Ｃ１３０分間）によってペレットを
集め、γ−カウシターで放射活性を測定した。この放射
活性から”Ｖａｌ−ＩＧＦ−１の含量を算出した。 （１１）　５９Ｖａ　Ｉ　−ＩＧＦ−１の生物学的アッ
セイ； ＢΔＬＢ／ｃ　　３Ｔ３マウスの胚線維芽細胞（クロー
ンＡ３１）をトリプシン処理し、５％のウシ胎児血清と
２５ｍＭのＮ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−
Ｎ′−２−エタンスルホン￥Ｊ、（Ｈｌ、ＰＥ５）を含
有するダルベツコーフォークトの改変イーグル培地中に
、１０５細胞／ｍｊ２の濃度に再Ｑ、　ｆ５した。１０
０μβづつをＱ、３ｃｎ！のウェル（９６ウエルのマイ
クロタイクープレート、コスタ−社製）に入れた。均一
な単層細胞が形成されてから（最初のプレーＦ　ｉ１Ｍ
製から５〜７日後）３〜４日後に、培地を除去し、培養
物を３回洗い、つぎに、０．２μＣｉ／ウエルの（”Ｈ
）チミジン（０，６７Ｃｉ／ｍｍｏ　＋）および被検試
料を加えた。２４時間のインキュベーションののち、培
地を除去し、細胞をＰＢＳで洗い、放射能測定のためト
リプシン処理した。細胞を半自動のマルチプルセルハー
ヘスタ（ＬＡＶＯ，ＭＡＳＨ。 ラボ・サイエンス）を使用して、ガラスフィルターに捕
捉した。取込まれたＣ　Ｈ）チミジンを、アクタゾール
２　にュー・イングランド・ニュクリアー）８ｍｊ！中
で、パソカード・トライ−カーフ’ｆａ体シンチレーシ
ョンカウンタを用いて、カラ△ ントした。 以下、実施例を示し、この発明を説明する。 去隻±上 ＨＯＡ　ｐ　Ａ　ｐ　Ａ　ｐ　Ｃｐ　Ｃｐ　Ｇ　ｐ　Ａ
　ｐ　Ｃｐ　ＣｐＧｐＧｐＣｐＴｐＡｐＴｐＧＯＨ（Ｇ
ｌ）の合成（１１ＤＭＴｒＯＴｐ　ｏＡ”ｐ　ｏＴｐ　
ｏＧ”ｐ　ｏＡｅＵｐｏ−セルロースの合成： ｉ　）　ＨＯＧ′８ｐ　ｏ　ＡｃＵ　ｐ　ｏ−セ／（／
ロース（Ｄ調製：ＤＭＴｒＯＧ”ｐ　ｏＡｃＵｐ　ｏ−
セルロース（１３０，４ｍｇ、　４．５９　μｍｏｌｅ
”）　（Ｒ，Ｃｒｅａの方法１１により製造）のメタノ
ール／クロロホルム（１：９Ｖ／Ｖ、　５ＪＯｍＩｌ）
　懸？ｉ液にＴＣＡ／りａｏボルム（２：８　Ｗ／Ｖ、
　５．Ｏｍｊりを冷却下に加え、０°Ｃで１０分間攪拌
する。クロロホルム（２ｍ／）およびメタノール（６，
０ｍ１）で洗浄後、濾紙上のセルロース付加物（ＨＯＧ
”ｐ　ｏ”Ｕｐ　ｏ　−セルｅ＋−ス）を乾燥させた。 この際、水はピリジン（２ｍｌ）との共沸混合物として
分離した。 ＊この値は、クロロホルム洗液の吸光度を５０７ｎｍで
測定して算出した。 １）　　Ｒ，Ｃｒｅａ　ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１
ｄｓ　　Ｒｅｓ、。 ■、２３３１　　（１９８０） ｉｉ）ＤＭＴｒＯＴｐ　ｏＡＩｌｚｐ　ｏＴｐ　ｏ−の
調Ｍ　：ＤＭＴ　ｒ　ＯＴｐ　ｏ　Ａ”ｐ　ｏ　Ｔ　ｐ
　ｏ−ＣＥ　（３９，９ｍｇ、　２３．０μｍｏｌｅ）
をトリエヂルアミンーアセトニトリＪＬｉ　（ＩＩＩ　
Ｖ／Ｖ、　５ｍ　ｌ）を室温で１時間処理して得られた
ホスホジエステルトリマー（ＤＭＴｒＯＴｐ　ｏＡ”ｐ
　ｏＴｐ　ｏ−）を乾燥させた。水はピリジンとの共沸
混合物（０，５ｍｊ！　、　　２　Ｘｌｍｊｌりとして
分離した。 ｉｉｉ　）カップリング トリマー（ＤＭＴｒＯＴｐｏＡ”ｐｏＴｐｏ−）セルロ
ース付加物（ＨＯＧ”ｐ　ｏＡｃＴＪ　ｐ　ｏ　−（！
ルコースンと１０ｍ１容丸底フラスコ中で混合した。 混合物を乾燥させ（水はピリジンとの共沸混合物（２Ｘ
１ｍ４）として分離ン、無水ピリジン（１ｍｌ）に再懸
澗させた。 メンチレンスルボニルニトコトリアヅリド（ＭＳＮＴ）
　　（６８，０ｍｇ、　２３０．ｌｊｍｏｌｅ）をこの
：Ｖ、　ンＢ　？（ｌに加え、室温で１時間撹拌した。 次いでピリジンを反応容器に加え、セルロース付加物を
遠心分離（３０００ｒｐｍ、　２分間）により回収した
。 ｉｖ）未反応５′ヒドロキシル基のアセチル化：前記セ
ルロース付加物をピリジン−無水酢酸溶液（１０：１ν
／Ｖ、　５．５＋ｎＡ）にセ、濁し、室温で３０分間攪
拌した。ピリジン（５ｔｔ＃！ン中で反復遠心分離（３
０００ｒｐｍ、　２分間）し、メタノール（１５ｍ　ｌ
　）で洗浄、室温で３０分間真空乾燥することにより、
セルロース生成物（１１３，９ｍｇ）を得た。このセル
ロース付加物（ＤＭＴ　ｒ　ＯＴ　ｐ　ｏ　ＡＩＩＩｐ
　ｏ　Ｔ　ｐ　ｏ　Ｇ”ｐ　ｏ　Ａ　ＣＵ　ｐ　ｏ−セ
ルロース）は次のカンプリング工程に使用できる。 （２）　　ＤＭＴｒＯＧ”ｐｏＱ”ｐｏＣ”ｐｏＴｐ。 ＡＢｚｐ　ｏ　Ｔ　ｐ　ｏ　Ｇ”ｐ　ｏＡｃＵ　ｐ　ｏ
　−セ／Ｌ／Ｃ１−ス（７）合成： ＤＭＴｒＯＧＩＢｐ　ｏＧ”ｐ　ｏＣ”ｐ　ｏＴｐ　ｏ
Ａ”ｐｏＴｐｏＧ”ｐｏ”Ｕｐｏ−セルロースは、ＤＭ
ＴｒＯＴｐ　ｏＡ”ｐ　ｏＴｐ　ｏＧ”ｐ　ｏＡｃＵｐ
Ｏ−セルロース（１１３，９ｍｇ）とＤＭＴ　ｒ　０Ｇ
ｌｌＩｐ　。 Ｑ”ｐ　ｏ　Ｃ”ｐ　ｏ　−ＣＥ　（４３，７ｍｇ）か
ら前記と同様の条件により合成した。 （３１ＤＭＴｒＯＡｌ１２ｐｏＣＢ２ｐｏｃ”ｐｏＧ”
ｐｏＧ”ｐ　ｏＣＩｌｌｌｐ　ｏＴｐ　ｏＡ”ｐ　ｏＴ
ｐ　ｏＧ”ｐｏ　Ａ　ＣＵ　Ｉ）　Ｏ−セルロースの合
成：ＤＭＴ　ｒ　ＯＡ”ｐ　ｏ　Ｃ”ｐ　ｏ　Ｃｇ＋ｐ
　ｏ　Ｇ”ｐ　。 Ｇ”ｐ　ｏ　Ｃ”ｐ　ｏＴｐ　ｏＡ”ｐ　ｏＴ　ｐ　ｏ
Ｇ”ｐ　。 ＾Ｃ［Ｊ　ｐ　ｏ−セルロース（１０５，８ｍｇ）はＤ
ＭＴ　ｒ　ＯＧ”ｐ　ｏＧＩＢｐ　ｏＣ”ｐ　ｏＴｐ　
ｏＡ”ｐ　ｏＴｐ　ｏＱｌ　＋＋　ｐ　ｏ　Ａｃ　Ｕｐ
　ｏ−セルロース（１０９，５ｍｇ）とＤＭＴｒ　０Ａ
Ｉｌｌｌｐ　ｏ　Ｃ”ｐ　ｏ　Ｃ”ｐ　ｏ　−ＣＥ　　
（４４，０ｍｇ）から同様の条件により合成した。 ｔ４１　　ＤＭＴｒＯＣＩｌｔｐｏＣ”ｐｏＧＩＢｐｏ
Ａ”ｐｏ　Ｃｌ１１ｐ　ｏ　ＣＢｆｆｉｐ　ｏ　Ｇ”ｐ
　ｏ　Ｇ”ｐ　ｏ　Ｃ口ｐｏＴｐ　ｏＡｌ１２ｐ　ｏＴ
ｐ　ｏＧ”ｐ　ｏＡｃＩＪｐ　ｏ−セルロースの合成： ＤＭＴ　ｒ　ＯＣｌｚｐ　ｏ　Ｃ”ｐ　ｏ　Ｇ”ｐ　ｏ
　ＡＵｐ。 Ｃ”ｐ　ｏＣＲ＋ｐ　ｏＧ”ｐ　ｏＧＩＢｐ　ｏＣＢｚ
ｐ　ｏＴｐＯＡ口ｐｏＴｐ　ｏＧＩＢｐ　ｏＡｅＵｐ　
ｏ−セルロース（９４，５ｍｇ）はＤＭＴ　ｒ　ＯＡ”
ｐ　ｏ　Ｃ”ｐ　ｏ　ＣＵｐ。 ＧＩｌｌｐ　ｏＧＩＩＩｐ　ｏＣ”ｐ　ｏＴｐ　ｏＡ”
ｐ　ｏＴｐ　。 Ｇ′ＢｐＯＡｃＵｐＱ−セルロース（１０５，８ｍｇ）
とＤＭＴ　ｒ　Ｏ’Ｃ”ｐ　ｏ　Ｃ”ｐ　ｏ　Ｇ”ｐ　
ｏ　−ＣＥ　（４３，５ｍｇ）から同様の条件により合
成した。 ｆ５１　　ＤＭＴｒＯＡＢ！ｐｏＡ”ｐｏ八へ２ｐｏｃ
ｉｚｐｏＣ”ｐ　ｏＧＩＩｌｐ　ｏＡ”ｐ　ｏＣ”ｐ　
ｏＣ”ｐ　ｏＧＩＲｐ　ｏ　ＧＩＩＩｐ　ｏ　ＣＩＩｚ
ｐ　ｏＴｐ　ｏ　Ａ”ｐ　ｏＴｐ　ｏ　Ｇ′Ｂｐ　ｏＡ
ｃＵｐ　ｏ−セルロースの合成：ＤＭＴ　ｒ　ＯＡ”ｐ
　ｏ　Ａ”ｐ　ｏ　Ａ”ｐ　ｏ　Ｃ”ｐ　。 Ｃ”ｐ　　ｏ　　Ｇ”ｐ　　ｏ　　ＡＢｚｐ　　ｏ　　
Ｃ”ｐ　　ｏ　　Ｃ”ｐ　　ｏ　　Ｇ”ｐ　ｏＧ”ｐ　
ｏＣＩＩｚｐ　ｏＴｐ　ｏＡ”ｐ　ｏＴｐ　ｏＧ”ｐｏ
　Ａｃ　Ｕ　ｐ　ｏ−セルロース（９０，４ｍｇ）は、
ＤＭＴｒＱＣ”ｐ　ｏ　Ｃ”ｐ　ｏ　Ｇ”ｐ　ｏ　Ａ”
ｐ　ｏ　Ｃ”ｐ　ｏ　Ｃ”ｐ　ｏＧ”ｐ　ｏＧ”ｐ　ｏ
　Ｃ”ｐ　ｏＴｐ　ｏＡ”ｐ　。 Ｔ　ｐ　ｏ　Ｇ″′ｐ　ｏＡｃＵ　ｐ　ｏ−セルロース
（９４、５ｍｇ）とＤＭＴ　ｒ　０ＡＢｔｐ　ｏ　ＡＩ
ＩＩｐ　ｏ　ＡＢｚｐ　ｏ−ＣＥ（４５，１ｍｇ）から
同様の条件下で合成した。この１８％段階では未反応５
′−ヒドロキシ基はアセチル基で保護する必要はなかっ
た。 （６１ＨＯＡ　ｐ　Ａ　ｐ　Ａ　ｐ　Ｃｐ　Ｃｐ　Ｇ　
ｐ　Ａ　ｐ　Ｃｐ　ＣｐＧｐＧｐＣｐＴｐＡｐＴｐＧＯ
Ｈの合成：ＤＭＴ　ｒ　０Ａｌｌ！ｐ’　ｏ　Ａ”ｐ　
ｏ　Ａ３ｆｆ１ｐ　ｏ　Ｇ”ｐ　。 Ｃ５ｚｐ　ｏ　Ｇ”ｐ　ｏ　ＡＩＩＩｐ　ｏ　Ｃｌ１１
ｐ　ｏ　Ｃ”ｐ　ｏ　Ｇ”ｐ　ｏＧ”ｐ　ｏ　Ｃ１ｌ″
ｐ　ｏＴｐ　ｏＡｌｌ″ｐ　ｏＴｐ　ｏＧ”ｐｏ”Ｕｐ
ｏ−セルロース（９０，４ｍｇ）を０．５Ｍ　　Ｎ。 Ｎ、Ｎ゛、Ｎ’−テトラメチルグアニジニウムピリジン
２−アルドキシマート〔ジオキサン−水（１：１　ｖ／
ｖ、　１ｍ　り中〕と封管中、２０℃で２０時間処理し
た。 反応混合物に２８％（會ハ）アンモニア水（１２ｍ　ｊ
！　）を加え、６０℃で２時間加熱した。固形セルロー
スを濾別し、水（１０ｍ　ｌ！　）で洗浄した。濾液と
洗液を蒸発乾固させ、残渣を８０％酢酸水溶液（２５ｍ
ｌ）で室温で１５分間処理した。溶媒留去後、残渣を０
．１Ｍ炭酸トリエチル　アンモニウム緩衝液（ｐｌ！？
、５．２５ｍ　ｊ！　）に溶かし、ジエチルエーテル（
３×２５ｍ　ｊ！　）で洗浄した。水層を蒸　発乾固し
、残渣を０．１Ｍ炭酸トリエチルアンモニウム緩衝液（
ｐｉ（７，５，２ｍｊりに溶解し、）８液中に粗ＨＯＡ
　ｐ　Ａ　ｐＡｐｃｐｃｐｃｐＡｐｃｐｃｐｃｐｃｐｃ
ｐＴｐＡｐＴｐＧＯＨを得た。 ＋７１　１（ＯＡ　ｐ　Ａ　ｐ　Ａ　ｐ　Ｃｐ　Ｃｐ　
Ｇ　ｐ　Ａ　ｐ　Ｃｐ　ＣｐＧｐＧｐＣｐＴｐＡｐＴｐ
ＧＯＨの精製：ｉ）粗生成物の最初の精製はカラムクロ
マトグラフィー（バイオゲルＰ　２２４　Ｘ　２．６ｃ
ｍ　　ｌ　Ｄ）により行った。最初の溶出ピークに相当
する画分（５０ｍＭ　　Ｎｌ１４０Ａ　ｃ、　０．１ｍ
Ｍ　　ＥＤＴ八、１ｍｊ！／分）を取り、凍結乾燥し最
初の精製物を得た。 ｉｉ　）最初の精製物の２回目の精製はＨＰ　Ｌ　Ｃ（
ＣＤ　Ｒ１０，２５ｃｍＸ４．６ｍｍ　Ｉ　Ｄ）になり
１Ｍ酢酸アンモニウム−１Ｂ％（Ｖ／Ｖ）水性エタノー
ルから４．５Ｍ酢酸アンモニウム−１０％（Ｖ／Ｖ）水
性エタノールまでの直線勾配（８０分間、（ｍ１７分。 １ｉｉ）２回目の精製物の第３回目の精製は逆相ＨＰＬ
Ｃ（Ｒｐ　　１Ｂ　　５μ（Ｘ７７）、１５ｃｍＸ４ｍ
ｍｌＤ）により、０．１Ｍ酢酸アンモニウムから０．１
Ｍ酢酸アンモニウム−１５％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリル
水溶液までの直線勾配（４０分間、　１．５ｍｌ／分、
室温）を用いて行い、最終精製物（ＩＩ　ＯＡ（１）オ
リゴヌクレオチドの分析 （Ｈ○ＡｐＡｐＡｐＣｐＣｐＧｐＡｐＣｐＣｐＧｐＧｐ
ＣｐＴｐＡｐＴｐＣＯＨ） ｉ）ホスホジェステラーゼによる消化 ＨＯＡｐＡｐＡｐＣｐＣｐＧｐＡｐＣｐＣｐＧｐＧｐｃ
ｐＴｐＡｐＴｐＧＯｌ（（５μｇ、　　６１．７μｋ）
０．２　　Ｍ　　ＭＨＣｊ！ｚ（１０μＩり、０．２Ｍ
　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐ　Ｈ８，５）（１０μｌ）お
よび　０．１ｍＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ水溶液（１３，３μ
ｍ）の混合物をホスホジェステラーゼ（５車位、５μｌ
）で室温にて２０分間処理し、続いて１００“Ｃで２分
間加熱した。 １ｉ）ｉ（ＰＬＯ分析 反応混合物中のオリゴヌクレオチドは１１　Ｐ　Ｌ　Ｃ
（ＣＤＲ１０，２５ｃｍｘ　４．５ｍｍ　Ｉ　Ｄ）によ
り水〜２．ＯＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ３，４）の直線
勾配（４０分間、　１．５ｍρ／分、６０°Ｃ）を用い
て行った。標準品の面積を比較することにより、各ピー
ク面積からそのヌクレオチド組成を決定した。 計算値：　ｐ　Ｃｏ１１５．０００．ｐＡＯＨ４，００
０゜ｐＴｏｏ　２，０００．　　ｐＧｏｌ＋４，０００
実測値：　ｐＣｏｏ　４．７６７、　　ｐ　Ａｏｕ　４
，１２７゜ｐＴｏｎ　２，０５４．ｐＧｏｏ　４，０５
２入■凱ｌ オリゴヌクレオチド（ＡＩ、Ａ２．Ｂ１．Ｂ２゜ＣＬ、
Ｃ２，Ｄｌ、Ｄ２．　　Ｅｌ、Ｂ２．Ｆｌ、Ｆ２゜Ｇ２
．Ｈｌ、Ｎ２．　　ＩＩ、　　１２．　　Ｊｌ、　　Ｊ
２．Ｋｌ。 Ｋ２．Ｌｌ、Ｌ２．ＭＩ　　Ｎ２．Ｎｌ、Ｎ２，０１お
よび０２）の合成： 下記オリゴヌクレオチドを実施例１に記載の０１と同様
の方法で製造した。 （１）　ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＧｐＧｐＧ
ｐＴＯＨ（Ａｌｌ（２）　ＨＯＴｐＴｐＴｐＣｐＡｐＧ
ｐＧｐＡｐＣｐＣｐＣｐＡｐＴｐＧＯＨ（Ａ２１（３１
ＨＯＣｐＣｐＴｐＧｐＡｐＡｐＡｐＣｐＴｐＣｐＴｐＧ
ｐＴｐＧＯＨ（Ｂｌｌ（４１ＨＯＣｐＡｐＧｐＣｐＧｐ
ＣｐＣｐＧｐＣｐＡｐＣｐＡｐＧｐＡｐＧＯＴ（（Ｂ２
）（５１ＨＯＣｐＧｐＧｐＣｐＧｐＣｐＴｐＧｐＡｐＡ
ｐＣｐＴｐＧｐＧｐＴＯＨ（Ｃ１）＋６）　ＨＯＡｐＧ
ｐＡｐＧｐＣｐＧｐＴｐＣｐＡｐＡｐＣｐＣｐＡｐＧｐ
ＴｐＴＯＨ（Ｃ２１（７）　ＨＯＴｐＧｐＡｐＣｐＧｐ
ＣｐＴｐＣｐＴｐＧｐＣｐＡｐＡｐＴｐＴｐＴＯＨ（Ｄ
Ｉ）（８１ＨＯＣｐＣｐＡｐＣｐＡｐＴｐＡｐＣｐＡｐ
ＡｐＡｐＴｐＴｐＧｐＣＯＨ（Ｃ２１（９）　ＨＯＧｐ
ＴｐＡｐＴｐＧｐＴｐＧｐＧｐＴｐＧｐＡｐＴｐＣｐＧ
ｐＴＯＨ（Ｅｌｌ（１０）　ＨＯＴＰＡＰＧＰＡＰＡＰ
ＡＰＣＰＣＩ）ＡＰＣＰＧＰＡＰＴＰＣＰＡＯＨｆＥ２
）（１１）　　ＨＯＧｐＧｐＴｐＴｐＴｐＣｐＴｐＡｐ
ＣｐＴｐＴｐＣｐＡｐＡｐＣＯＨ（Ｆｌｌ（１２１ＨＯ
ＧｐＧｐＴｐＣｐＧｐＧｐＴｐＴｐＴｐＧｐＴｐＴｐＧ
ｐＡｐＡｐＧＯ＋Ｉ　（Ｆ２１（１３１ＨＯＧｐＣｐＴ
ｐＧｐＧｐＡｐＧｐＣｐＣｐＡｐＴｐＡｐＧｐＣｐＣＯ
Ｈ（Ｇ２）（１４１ＨＯＧｐＣｐＴｐＣｐＣｐＡｐＧｐ
ＣｐＴｐＣｐＴｐＣｐＧｐＴｐＣＯＨ（Ｈｌ）（１５１
ＨＯＣｐＧｐＧｐＴｐＧｐＣｐＧｐＣｐＧｐＡｐＣｐＧ
ｐＡｐＧｐＡＯＨ（Ｎ２１ｆ１６１　　ＨＯＧｐＣｐＧ
ｐＣｐＡｐＣｐＣｐＧｐＣｐＡｐＧｐＡｐＣｐＴｐＧＯ
Ｈ（ＩＩ）（１７１ＨＯＣｐＴｐＡｐＣｐＧｐＡｐＴｐ
ＡｐＣｐＣｐＡｐＧｐＴｐＣｐ、ＴｐＧＯＨＩＩ２）（
１８１ＨＯＧｐＴｐＡｐＴｐＣｐＧｐＴｐＡｐＧｐＡｐ
ＣｐＧｐＡｐＡｐＴｐＧＯＨ（Ｊｌｌ（１９１ＨＯＧｐ
ＡｐＡｐＡｐＡｐＣｐＡｐＧｐＣｐＡｐＴｐＴｐＣｐＧ
ｐＴＯＨ（Ｊ２１（２０１ＨＯＣｐＴｐＧｐＴｐＴｐＴ
ｐＴｐＣｐＧｐＴｐＴｐＣｐＴｐＴｐＧＯＨ（Ｋｌ）（
２１１ＨＯＧｐＧｐＡｐＧｐＡｐＴｐＣｐＧｐＣｐＡｐ
ＡｐＧｐＡｐＡｐＣＯＨ（Ｘ２１（２２１ＨＯＣｐＧｐ
ＡｐＴｐＣｐＴｐＣｐＣｐＧｐＣｐＣｐＧｐＴｐＣｐＴ
ＯＨ（Ｌｌｌ（２３１ＨＯＴｐＡｐＡｐＡｐＣｐＴｐＴ
ｐＣｐＣｐＡｐＧｐＡｐＣｐＧｐＧｐＣＯＨ＜Ｌ２’１
（２４）　　ＨＯＧｐＧｐＡｐＡｐＧｐＴｐＴｐＴｐＡ
ｐＣｐＴｐＧｐＴｐＧｐＣｐＴＯ）Ｉ　　ｔＭ１’）（
２５）　　ＨＯＴｐＴｐＣｐＡｐＧｐＴｐＧｐＧｐＡｐ
ＧｐＣｐＡｐＣｐＡｐＧＯＨ（）１２）（２７）　　Ｈ
ＯＣｐＣｐＡｐＣｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧｐＣｐＣｐＡｐ
ＧｐＣｐＡＯＨ（Ｎｌｌ（２８）　　ＨＯＧｐＣｐＧｐ
ＧｐＡｐＴｐＴｐＴｐＴｐＧｐＣｐＴｐＧｐＧｐＣＯＨ
（Ｎ２）（２９１ＨＯ八へＡｐＡｐＴｐＣｐＣｐＧｐＣ
ｐＧｐＴｐＧｐＡｐＴｐＡｐＧＯＨ（０１１（３０）　
　ＨＯＧｐＡｐＴｐＣｐＣｐＴｐＡｐＴｐＣｐＡｐＣＯ
Ｈ（０２）五１１州ｌ オリゴヌクレオチド（ａ　ｌ　　ａ　２．　　ａ　３．
　　ａ　４゜Ｇ５．Ｇ６．ｂｌ、ｂ２．ｂ３．ｂ４．ｂ
５．ｂ６゜ｃｌ；　　Ｇ２．Ｇ３．Ｇ４．Ｇ５．Ｇ６．
ｄｉ、’ｄ２゜ｄ３．ｄ４．ｄ５．ｄ６．ｅｌ、Ｇ２．
Ｇ３．Ｇ４゜Ｇ５，１１．１２および１３）の合成：下
記オリゴヌクレオチドを実施例１記載のＧ１と同様の方
法で製造した。 （１１ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＧｐＴｐＧｐ
ＴｐＴＯＨ＜ａｌｌ（２）　ＨＯＡｐＣｐＴｐＧｐＣｐ
ＣｐＡｐＧｐＧｐＡｐＣｐＣｐＣｐＡｐＴＯＨ＋ａ２）
（３１ＨＯＡｐＴｐＧｐＴｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＡｐ
ＡｐＧｐＣｐＡｐＧＯＨ（Ｇ３１（４１ＨＯＴｐＧｐＧ
ｐＣｐＡｐＧｐＴｐＡｐＡｐＣｐＡｐＣｐＡｐＴｐＧＯ
Ｈ（Ｇ４１（５）　ＨＯＴｐＴｐＴｐＡｐＣｐＡｐＴｐ
ＡｐＴｐＧｐＧｐＧｐＴｐＣｐＣＯＨ＋ａ５１（６１Ｈ
ＯＡｐＡｐＧｐＧｐＴｐＴｐＴｐＴｐＣｐＴｐＧｐＣｐ
ＴｐＴｐＣｐＴＯＨ（Ｇ６１（７１ＨＯＡｐＡｐＡｐＡ
ｐＣｐＣｐＴｐＴｐＡｐＡｐＧｐＡｐＡｐＡｐＴｐＡＯ
Ｈ（ｂｌ）（８）　ＨＯＣｐＴｐＴｐＴｐＡｐＡｐＴｐ
ＧｐＣｐＡｐＧｐＧｐＴｐＣｐＡＯＨ（ｂ２１（９１Ｈ
ＯＴｐＴｐＣｐＡｐＧｐＡｐＴｐＧｐＴｐＡｐＧｐＣｐ
ＧｐＧｐＡＯＨ（ｂ３１（Ｌｏ）　ＨＯ八へＴｐＴｐＡ
ｐＡｐＡｐＧｐＴｐＡｐＴｐＴｐＴｐＣｐＴｐＴＯＨ（
’ｏ４）＋１１３１（ＯＡｐＴｐＣｐＴｐＧｐＡｐＡｐ
ＴｐＧｐＡｐＣｐＣｐＴｐＧｐＣＯＨ（ｂ５）（１２）
　ＨＯＴｐＴｐＣｐＣｐＡｐＴｐＴｐＡｐＴｐＣｐＣｐ
ＧｐＣｐＴｐＡｐＣＯＨ（ｂ６）（１３１ＨＯＴｐＡｐ
ＡｐＴｐＧｐＧｐＡｐＡｐＣｐＴｐＣｐＴｐＴｐＴｐＴ
ｐＣＯ＋Ｉ　（ｃ　１１（１４１ＨＯＴｐＴｐＡｐＧｐ
ＧｐＣｐＡｐＴｐＴｐＴｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧＯＨ（Ｇ
２）（１５）　　ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＧｐＧｐＡｐＡ
ｐＡｐＧｐＡｐ’ＧｐＧｐＡｐＧＯＨ（Ｇ３）（１６１
ＨＯＴｐＧｐＣｐＣｐＴｐＡｐＡｐＧｐＡｐＡｐＡｐＡ
ｐＧｐＡｐＧＯＨ（Ｇ４１！１７１　　ＨＯＴｐＣｐＣ
ｐＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＴｐＴｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡＯ
Ｈ（Ｇ５）（１８１ＨＯＣｐＴｐＧｐＴｐＣｐＡｐＣｐ
ＴｐＣｐＴｐＣｐＣｐＴｐＣｐＴｐＴＯＨ（Ｇ６１（１
９）　　ＨＯＡｐＧｐＴｐＧｐＡｐＣｐＡｐＧｐＡｐＡ
ｐＡｐＡｐＡｐＴｐＡＯＨ（ｄｌｌ（２０）　ＨＯＡｐ
ＴｐＧｐＣｐＡｐＧｐＡｐＧｐＣｐＣｐＡｐＡｐＡｐＴ
ｐＴＯＨ（ｄ２１（２１１ＨＯＧｐＴｐＣｐＴｐＣｐＣ
ｐＴｐＴｐＴｐＴｐＡｐＣｐＴｐＴＯＨ（ｄ３）（２２
／）　　ＨＯＣｐＴｐＣｐＴｐＧｐＣｐＡｐＴｐＴｐＡ
ｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴＯＨ（ｄ４）＋２３１　　ＨＯＡ
ＰＧＰＧＰＡＰＧＰＡＰＣＩ）ＡＰＡＰＴＰＴＰＴＰＧ
ＰＧＯＨｆｄ５１（２４）　ＨＯＡｐＡｐＡｐＧｐＣｐ
ＴｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧｐＴｐＡｐＡｐＡＯＨ（ｄ６１
（２５）　ＨＯＣｐＡｐＡｐＧｐＣｐＴｐＴｐＴｐＴｐ
ＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＡＯＨ（ａｌｌ（２６１ＨＯＣｐ
ＴｐＴｐＴｐＡｐＡｐＧｐＧｐＡｐＴｐＧｐＡｐＣｐＣ
ｐＡＯＨ（Ｇ２１＋２７）　　ＨＯＧｐＡｐＧｐＣｐＡ
ｐＴｐＣｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＡｐＧＯＨ（Ｇ３
１（２８）　　ＨＯＣｐＣｐＴｐＴｐＡｐＡｐＡｐＧｐ
ＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＧｐＡＯＨ（Ｇ４）＋２９１　Ｈ
ＯＧｐＧｐＡｐＴｐＧｐＣｐＴｐＣｐＴｐＧｐＧｐＴｐ
ＣｐＡｐＴＯＨ（Ｇ５１（３０）　　ＨＯＴｐＧｐＴｐ
ＧｐＴｐＡｐＡｐＴｐＧｐＡｐＴｐＡｐＧＯＨ（１１１
（３１）　ＨＯＴｐＡｐＣｐＡｐＣｐＡｐＣｐＴｐＣｐ
ＴｐＴｐＴｐＴＯＨ（１２）（３２１１１０ＧｐＡｐＴ
ｐＣｐＣｐＴｐＡｐＴｐＣｐＡｐＴＯＨ（１３１去Ｊｌ
羨を 下記オリゴヌクレオチド（ｍｌおよびｍ２）を実施例１
と同様の方法で製造した。 （１）　　ＨＯＡｐＧｐＣｐＴｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧｐ
ＴｐＡｐＡｐＡｐＡｐＣｐＡｐＴｐＧＯＨ（ｍｌ）（２
１ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＧｐＴｐＴｐＴｐ
ＴｐＡｐＣｐＴｐＴｐＣｐＡＯＨ（ｍ２）去旌貞盈 オリゴヌクレオチド（Ａ、Ｂ、Ｃ，Ｄ、Ｅ、Ｆ。 Ｇ、Ｈ，Ｈ，Ｊ、に、Ｌ、ＭおよびＮ）の合成：下記オ
リゴヌクレオチドを実施例１と同様の方法で製造した。 ＋１）　ｌｌ０ＡｐＡｐＴｐＴｐＴｐＧｐＣｐＣｐＧｐ
ＡｐＣｐＡＯＨ（Ａ）（１１）　　ＨＯＴｐＡｐＧｐＴ
ｐＡｐＣｐＧｐＣｐＡｐＡｐＧｐＴｐＴｐＣｐＡｐＣＯ
Ｈ＋Ｋ）（１２１ＨＯＣｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＡｐＣ
ｐＧｐＴｐＧｐＡｐＡｐＣｐＴｐＴＯＨ（Ｌｌ（１４）
　ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＧｐＡｐＴｐＡｐＣｐＣＯ
Ｈ（Ｎ）ＳＥ、ＳＦ、ＳＧおよびＳＨ）の合成：＋１１
　ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＧｐＧｐＣｐＴＯ
Ｈ（ＳＡ）（２）　ＨＯＧｐＧｐＴｐＴｐＧｐＴｐＡｐ
ＡｐＧｐＡｐＡｐＣｐＴｐＴｐＣｐＴＯＨ（ＳＢ）（３
１ＨＯＴｐＴｐＴｐＧｐＧｐＡｐＡｐＧｐＡｐＣｐＴｐ
ＴｐＴＯＨ（Ｓ（ｊ＋４１　ＨＣＩＣｐＡｐＣｐＴｐＴ
ｐＣｐＧｐＴｐＧｐＴｐＴｐＧｐＡｐＴｐＡｐＧＯＨｆ
ｓＤｌ＋５１　ＨＯＴｐＴｐＡｐＣｐＡｐＡｐＣｐＣｐ
ＡｐＧｐＣｐＣｐＡｐＴｐＧＯ）Ｉ　（ＳＥＩ（６１Ｈ
ＯＣｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＡｐＡｐＧｐＴｐＴｐ
ＣＯ！（（ＳＦＩ＋７）　　ＨＯＣｐＧｐＡｐＡｐＧｐ
ＴｐＧｐＡｐＡｐＡｐＧｐＴｐＣｐＴｐＴＯＨ（ＳＧＩ
（８１ＨＯＧｐＡｐＴｐＣｐＣｐＴｐＡｐＴｐＣｐＡｐ
ＡｐＣｐＡＯＨ（ＳＨ）天」ｕ」Ｌ 下記オリゴヌクレオチド（Ａ’−Ｎ’）を実施例１と同
様の方法で製造した。 （４）　ＨＯＡｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＧｐＣｐＴｐＣ
ｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＧｐＡＯＨ（Ｄ’１（５１
ＨＯＧｐＣｐＣｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴ
ｐＴｐＧＯＨ（Ｅ’）＋６１　ＨＯＴｐＣｐＧｐＡｐＣ
ｐＡｐＡｐＡｐＡｐＡＯＨ（Ｆ’１（７）　ＨＯＧｐＡ
ｐＴｐＣｐＣｐＴｐＣｐＧｐＡｐＧｐＣｐＴＯＨ（Ｇ’
）（Ｅｌ）　ＨＯＧｐＴｐＴｐＴｐＡｐＡｐＴｐＣｐＡ
ｐＧｐＣｐＴｐＣｐＧｐＡｐＧＯ）！　＋１１’）（９
１ＨＯＧｐＡｐＴｐＴｐＡｐＡｐＡｐＣｐＣｐＧｐＡｐ
ＡｐＴｐＣｐＡｐＡＯＨ（工１）（１０）　ＨＯＧＰＣ
ＰＣＰＴＰＴＰＴＰＡＰＡＩ）ＴＰＴＰＧＰＡＰＴＰＴ
ｐＣＰＧＯＨ（Ｊ’）＋ｉｌｌ　　ＨＯＧｐＣｐＣｐＴ
ｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴＯＨ（Ｋ’１（
１２１ＨＯＴｐＣｐＴｐＣｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＡＯ
Ｈ（Ｌ’１（１３７ＨＯＧｐＧｐＡｐＧｐＡｐＣｐＡｐ
ＡｐＣｐＧＯＨ（Ｍ’１（１４１ＨＯＴｐＣｐＧｐＡｐ
ＣｐＧｐＴｐＴｐＧＯＨ（Ｎ’１ス］ｌ壓Ｊ ”Ｖａｌ−ＩＧＦ−ｌ遺伝子の製造： 化学合成オリゴヌクレオチドのライゲーション各オリゴ
ヌクレオチド（Ａ　Ｉ　−０１）　（０，４ｎＭ）の一
部を、７４　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ　−ＨＣ（１（ｐ　Ｈ７
，６）。 Ｌ　ＯｍＭ　　ＤＴＴ、　　１．６ｍＭメルカプトエタ
ノール＋’　１０ｍＭ　　ＭｇＣｆｚおよび０．５ｍＭ
ＡＴＰを含存する溶液１００μ！中でＴ４ポリヌクレオ
チドキナーゼＣＢＲＬ製）を用い３７゛Ｃで２０分間リ
ン酸化した。反応終了後、反応混合物中の酵素を１００
℃で５分間インキュベートし不活性化した。 りを得、最終的にはクローニング用の５９Ｖａｌ−ＩＧ
Ｆ−Ｉ遺伝子を得る。ライゲーションはＴ４ＤＮＡリガ
ーゼ（７単位）を用い、１００ｍＭＡＴＰ（０，５μｌ
）含有溶液中にて４°Ｃで２３時間（標準条件）行った
。各段階におけるオリゴヌクレオチドのライゲーション
生成物は、トリス−ＥＤＴＡ緩衝溶液中２−１６％グラ
ジェントＰＡＧＥで臭化エチジウム染色により同定した
。 実施狙工 ”Ｖａｌ−ＩＣＦ−１遺伝子のクローニング：プラスミ
ドｐＢＲ３２２をＢａｍＨＩおよびＥｃ　ｏＲＩ制限エ
ンドヌクレアーゼで消化した。 反応を、６５゛Ｃで５分間加熱して終了させ、断片を０
．５％アガロースゲル電気泳動により分離した。 ｐＢＲ３２２由来の大きな断片３９８５ｂｐを回収し、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼと工２°Ｃで１８時間ライゲートさ
せ、２２４ｂｐ”Ｖａ　ｌ−ＩＣ；Ｆ−■遺伝子を得た
。ライゲーション混合物を用いてクソシュナー法により
、Ｅ、　ｃｏｌｉ　　Ｉ［Ｂ　１０１を形質転換し、ア
ンピシリン耐性形質転換体をテトラサイクリン（２５ｐ
ｇ／ｍｌを含有するプレート上で選択した。アンピシリ
ンに耐性でテトラサイクリンに感受性を示す５クローン
の１つから分離したプラスミドＤＮＡをＥＣ０ＲＩおよ
びＢａた。このプラスミドは”Ｖａｌ−ＩＧＦ−１遺伝
子の完全ヌクレオチド配列によって特徴づけられ、ｐＳ
ｄＶ２と命名し、発現ベクターの構築に使用した。 叉星凱土亙 プラスミドｐｓｄＶ２中”Ｖａｌ−ＩＧＦ−１遺伝子の
配列決定： ”Ｖａ　Ｉ　−Ｉ　ＣＦ　−１遺伝子の配列を調べるた
め、プラスミドｐｓｄｖ２をＥｃｏＲＩで消化し、次い
でα−”Ｐ−ＡＴＰの存在下にＡＭＶ逆転写酵素（生化
学工業ｈａより購入）を用い３７°Ｃで３０分間処理し
た。３２ｐで標識された線状プラスミドをＢ　ａ　ｍ　
ＨＩで消化し、２つの断片（２２４ｂｌ）、　４．Ｏｂ
ｐ）を得た。小さい断片（２２４ｂｐ）は分取用ポリア
クリルアミドゲル電気泳動により回収し、マキ与ムーギ
ルバート法の手順に従フて配列決定した。 一方、プラスミドｐＳｄＶ２はまずＢａｍＨＩで消化し
、次に前述のように３１ｐで標識した。線状プラスミド
をＥＣ０ＲＩで消化し、２つの断片（２２４ｂｐ、４．
０　ｋｂｐ）を得た。小さい断片（２２４ｂｐ）は前述
のようにマキサム−ギルバート法により分析した。”Ｖ
ａｌ−ＩＣＦ−１遺伝子の両側からの配列決定の結果は
、設計した”Ｖａ　Ｉ　−ＩＣＦ−１遺伝子と一致した
。 大流思上上 蛋白ペプチドＬ　Ｈ遺伝子の調製： （０，４ｎＭ）を５０　ｍＭ　　Ｔｒｉｓｉｌ　ＣＲ（
ｐ　１１７．６）。 ２０ｍＭ　　ＤＴＴ、５０．Ｌ１ｇ／ｍｊ！　　ＢＳＡ
、ｌｒｎＭスペルミジン、１０ｍＭ　ＭｇＣｊ！ｚおよ
び２ｍＭＡＴＰを含有する溶液４０μβ中で２．５単位
のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用い３７℃で３時間
リン酸化した。反応終了後、反応混合物中の酵素を１０
０℃で５分間インキユヘートして不活性化しンは第７図
に示すようにして行い、まず６フラグメントブロソクを
得、最終的にクローニング用の蛋白ペプチドＬＨｉｌｌ
転子（２３６ｂｐ）を得た。 ライゲーションはＴ４ＤＮＡリガーゼ（５単位）を用い
、５０ｍＭＡ、ＴＰ含有溶液（１μｎ）中１６°Ｃで５
時間行った。各段階のオリゴヌクレオチドのライゲーシ
ョン生成物はＴｒｉｓ　−Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ緩衝液中２−
１６％グラジェントＰＡＧＥで臭化エヂジウム染色によ
り同定した。 実施史上叉 蛋白ペプチドＬ’Ｈ遺伝子のクローニング：前述のよう
にして合成した蛋白ペプチドＬ　Ｈ遺伝子（２３６ｂｐ
）を実施例日と同様の方法でｐＢＲ３２２４：挿入した
。Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＨＢＩＯＩ形質転換体から得たプラ
スミド（ｐＬＨＩ０７）は、制限酵素分析により蛋白ペ
プチドＬＨ（２３６ｂｐ）を有していることが明らかに
なった。 入■炎上主 合成ｔｒｐプロモーター遺伝子ｌの構築ニブロックＩ、
ＩＩおよび■のそれぞれのオリゴヌクレオチド（Ｂ−Ｍ
）をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、前述
のように７４ＤＮＡリガーゼでライゲートした。次いで
このブロック（１−１）と未リン酸化オリゴヌクレオチ
ド（Ａ。 Ｎ）を縮合させた。最後のライゲーション住成物を分取
用１．５％ＰＡ、ＧＥによりｑｆｆ製し、１０７ｂｐの
合成ｔｒｐプロモーターＩ遺伝子を得た。 去１１引り土 合成ｔｒｐプロモーターＩ遺伝子のクローニング： プラスミドｐＢＲ３２５をＥＣ０ＲＩで消化し、綿状ｐ
ＢＲ３２５を前記合成ｔｒｐプロモーターＩ遺伝子とラ
イゲートし°た。このライゲーション混合物による一旦
−１匹旦　ＨＢ　１０１の形質転換体を抗生物質含有プ
レート上でスクリーニングし、ＲＡｍｐ’Ｃｍコロニー
４つを得た。この４コロニーから得たプラスミドをそれ
ぞれＨｐａＩで消化した。＋１　ｉ　ｎ　ｄ　ｍおよび
Ｅｃ　ｏＲＩ消化によりこれらプラスミドから得た断片
をＩＩ　ｉ　ｎ　ｄ　ｌ１１およびＥＣ０ＲＩ消化によ
るｐＢＲ３’２５の断片と比較した。４つのプラスミド
のうちの１つは正しい方向のプロモーター遺伝子（合成
ｔｒｐプロモーターＩｎ伝子転子有し、他のものは逆方
向に挿入されていた。 人妻■［Ｌ晃 ｔｒｐプロモーター■遺伝子の構築； ブロックＩ′、Ｉｔ’、Ｉ［Ｉ’およびＩＶ　′の各オ
リゴヌクレオチド（Ｂ−３Ｏ）をＴ４ポリヌクレオチド
キナーゼでリン酸化し、次いで前述のようにＴ４ＤＮＡ
リガー・ゼでライゲートした。これらのブロック　（Ｉ
　′〜■”）と未リン酸化オリゴヌクレオチド（Ａおよ
びＳＨ）を続いて縮合した。最終ライゲーション生成物
は分取用７．５％ＰＡＧＥで精製し、１６３ｂｐの合成
ｔｒｐプロモーター■遺伝子を得た。 大旌班上１ 合成ｔ　ｒ　ｐ　フロモータ■遺伝子のクローニングニ
実施例１５で構築した合成ｔｒｐプロモークＨ遺伝子を
ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片とライゲー
トし、次いでＥ、　ｃｏｌｉ　　ＩＩＢ　１０１をライ
ゲーション生成物を用い形質転換させた。 ＲＡｍｐ、　　５Ｔｅｔ形質転換体から得たプラスミド
をｌ１ｐａ＋で消化してバンド（４，１ｋｂｐ）を確認
。 し、次いでＢａ　ｍ　ＨＩで消化しＰＡＧＥにて９０ｂ
ｐのバンドを確認した。さらに、ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨ
Ｉ消化による５６ｂｐの断片をＰＡＧＥにてサイズマー
カーと比較することにより、確認した。 このプラスミドをｐＴｒｐＥＢ７と命名し、発現ベクタ
ーの構築に用いた。 爽施炎上１ ”Ｖａｌ−ＩＣＦ−１発現ベクター（ｐＳｄＶ２−’３
２２Ｌｒｐ）の構築： 合成Ｌｒｐプロモーク■ヘクター（ｐＴｒｐＥＢ△ ７）をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ＰＡＧＥ
により大きな断片（４，１ｋｂｐ）を得た。 この断片をプラスミドｐＳｄＶ２から製造した”Ｖａｌ
−ＩＧＦ−１遺伝子とライゲートした。 このライゲーション混合物で旦、並置　ＨＢ　１０１を
形質転換し、アンピシリン耐性でテトラサイクリン怒受
性の形質転換体を選択した。得られたプラスミドｐＳｄ
Ｖ２−３２２　Ｌ　ｒｐをＥｃｏＲプラスミドｐＳｄＶ
２−３２２　ｔ　ｒｐ中％　９　ｙ　ａｌ−ＩＧＦ−１
遺伝子および合成ｔｒｐプロモーク遺伝子の配列決定： △ マキサム−ギルバート法にょる５９Ｖａｌ−ＩＧＦ−１
ｉｆｆ伝子およびｔｒｐプロモーへ遺伝子の配列決定の
ため、プラスミドｐＳｄＶ２−３２２ｔｒｐをＥｃｏＲ
Ｉで消化し、大腸菌アルカリホスポターゼを用い３７゛
ｃで１時間処理した。 フェノール抽出およびエタノール沈澱後、プラスミドを
ｒ−”Ｐ−ＡＴＰの存在下にＴ４ボリヌクレオクドキナ
ーゼを用い３７℃で１時間リン酸化し、最後にＨｉｎｆ
　Ｉで消化し、２つの断片（Ｉｌｏｏｂ　ｐ、　　４８
０ｂ　ｐ）を得た。各断片はマクサム−ギルハート法に
従って配列決定した。得られた５９Ｖａｌ−ＩＣＦ−１
および合成Ｌｒｐプロモーへ遺伝子の配列は設計したも
のと一致した。 情夫ｉ（？！１１９ 蛋白ペプチドＬＨ発現ヘクター（ｐＬＨｔｒｐ）の構築
： 実施例１６で製造した合成ｔｒｐプロモーター■ヘクタ
ー（ｐＴｒｐＥＢ？）をＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化
し、分取用アガロースゲル電気法ｖＪにより大きな断片
（４，１ｋｂｐ）を得た。この断片をＥｃｏＲＩ−Ｂａ
ｍＨＩ消化によりプラスミドｐ　Ｌ　Ｈ１０７から調製
した蛋白ペプチドＬＨ遺伝子とライゲートした。ライゲ
ーション混合物を用い旦０匹旦　ＨＢＩＯＩを形質転換
させ、アンピシリンに耐性でテトラサイクリン怒受性を
示す形質転換体を得た。 形質転換体から得たプラスミド （ｐＬＨｔｒｐ）をＥＣ０ＲＩとＢ　ａ　ｍ　ＨＩで消
化し、７．５％ＰＡＧＥにて蛋白ペプチドＬＨｉＪｌ転
子（２３６ｂｐ）を確認した。 実施例２０ ”Ｖａｌ−ＩＣＦ−１発現ベクターの構築：実施例４　
（１）で調製したオリゴヌクレオチド（ｍｌ）を実施例
８に記載したようにＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリ
ン酸化した。このリン酸化オリゴヌクレオチド、実施例
４　（２）で鋼製したオリゴヌクレオチド（ｍ２）およ
び実施例１０で調製したプラスミドｐＳｄＶ２から調製
した５９Ｖａ　Ｉ　−ＩＧＦ−１遺伝子（２２４ｂ　ｐ
）を混合し、１００ｍＭＡＴＰを含有する溶液中でＴ４
リガーゼを用い４°Ｃで２３時間処理した。ライゲーシ
ョン混合物を分取用ＰＡＣ，Ｅで精製してリンカ−付き
５９Ｖａ　Ｉ　−ＩＣＦ−１遺伝子（２４２ｂｐ）を得
た。この遺伝子を、Ｈ４ｎｄｌＵ−ＢａｍＨＩ消死によ
りｐＬ）（ｔｒｐから得た断片をライゲートし、ライゲ
ーション混合物を用いて基０皿ＨＢＩＯＩを形質転換さ
せた。プラスミドｐＬＨ３ｄＶｔｒｐ含有旦９匹旦　Ｈ
ＢＩＯＩを且、並置Ｆ−５と命名し、１９８４年５月２
８日に寄託番号ＦＥＲＭＡ−７６４４の下に、工業技術
院微生物工業技術研究所（日本国茨城県筑波郡谷田部町
東１丁目、郵便番号３０５）に寄託した。該寄託−はそ
の後１９８５年２月２８日に同所のブタペスト条約に基
づく国際寄託に変更されたく寄託番号ＦＥＲＭ、ｌ’Ｂ
Ｐ−７２８）。形質転換体から得たプラスミド（ｐＬＨ
３ｄＶｔｒｐ）をＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ　　（１９８
，２２４ｂｐ）、ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ　　（１９Ｂ、
８５９ｂｐ）、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨｌ　　（２４
２ｂｐ）およびＨｐａｌ−ＢａｍＨＩ　　（４５６ｂｐ
）で消化し、７．５％ＰＡＧＥにてｔｒｐプロモーター
、蛋白ペプチドＬ　Ｈお”Ｖａ　Ｉ　−ＩＣＦ−１遺伝
子の発現ニブラスミドｐＳｄＶ２−３２２ｔｒｐ含を互
。 ｃｏｌｉをアンピシリン２０μｇ　／　ｍ　ｊ！金含有
Ｌブロス中で一晩培養し、０．２％グルコース、０．５
％カザミノ酸（酸加水分解カゼイン）およびビタミンＢ
＋５０．ｃ＋ｇ／ｍｆｆを含有するＭ９培地で、１：２
５の割合で希釈した。β−インドールアクリル酸を加え
、最終濃度１０μｇ／ｍβとした。この時のＡ６゜。は
０．４であった。次に３時間培養し１、遠心分離（６ｋ
ｒｐｍ、、　　４℃、５分間）により菌体を集めた。菌
体は超音波処理により破壊し遠心分離により残層を取り
除いた。上清を３Ｍ酢酸と混合し、沈澱を遠心分離（２
０ｋｒｐｍ、　　４°Ｃ１１０分間）ＤＴＡおよび０．
５％ＢＳＡ）４ｍＪ！にＨｐ、　ｆ５し、０．ＩＮ　Ｎ
ａＯＨ″？：ｐＨ７−８に調製した。不溶性物質を遠心
分離により除去した後、上清を定量を行うまで一２０℃
で保存した。 去鳳皿叢ユ ”Ｖａ　Ｉ−ＩＣＦ−１のＲＩＡ ”Ｖａｌ−ＩＧＦ−１のＲＩＡは矢内原の方法に従って
行った。前記サンプルまたは標準サンプル（ＩＣＦ−１
７ラグメント（２６−４６））０．１ｍｌを、サンプル
緩衝液（０，ＯＩＭ　　ＰＢＳ、　０．０２５Ｍ　　Ｅ
　Ｄ　Ｔ　Ａ　（ｐ　）１７．４）中０，５％Ｂ　Ｓ　
Ａ（０，４ｍ１））　。 １’ＣＦ−１（２，６−４６）のウサギ抗血清（０，ｊ
ｍｐ）および”’Ｉ　−Ｉ　ＣＦ−１（２６−４６）（
０，１ｍＪ）と混合し、４°Ｃで４８時間放置した後、
ウサギ血清（０，１ｍｊり　、ウザギＴ−グロブリン抗
血？ｆｆ（０，１ｍ７りおよび５％Ｐ　Ｅ　Ｇ６０００
　（０，９ｍ　ｌ！　）を加えた。さらに２時間４７Ｃ
で放置した後、ペレットを遠心分離（３ｋｒｐｍ、　　
４°Ｃ２３０分間）により集め、γ−カウシターにより
放射活性を測定した。 ５９Ｖａｌ−ＩＧＦ−Ｉの含量はこの放射活性から算出
した。 失腹桝１土 Ｅ、ｃｏｌｉＦ−５における蛋白ペプチドＬ）ｉ融合”
Ｖａ　Ｉ　−ＩＧＦ−１をコードする遺伝子の発現： Ｅ、　ｃｏｌｉ　　Ｆ−５（プラスミド　ｐＬＨ３ｄＶ
Ｌブロス中で一晩培養し、０．２％グルコース、０．５
％カザミノ酸（酸加水分解カゼイン）、５０μｇ／ｍ７
！ビタミンＢ１および２５．ｃ＋ｇ／ｍ１アンピシリン
含有Ｍ−９培地に１＝２０の割合で希釈した。β−イン
ドールアクリル酸を加え最終濃度１０μｇ　／　ｍ　ｊ
！とじた。この時のＡ６゜。は０．５であった。次に、
菌体を２時間培養し、遠心分離（５ｋｒｐｍ、４℃、５
分間）により収集した。 尖舅炭１１ ターミネークーＳ遺伝子のクローニング：各オリゴヌク
レオチド（Ｂ’、Ｃ’、Ｄ’およびＥ’）をＴ４ポリヌ
クレオチドキナーゼでリン酸化し、実施例８に記載した
ようにＴ４ＤＮＡリガーゼで処理した。ライゲーション
混合物と二種のオリゴヌクレオチド（Ａ’およびＦ’）
とを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで処理した。ライゲー
ション生成物を分取用ＰＡＧＥにより精製し、ＢａｍＨ
Ｉ−３ａｌｌ消化によるｐＢＲ３２２の大きな断片と混
合した。混合物のライゲーションは、標準条件下におい
て７４ＤＮＡリガーゼを用い行った。ライゲーション混
合物を用いてクノシュナー法により、旦、ｃｏｌｉ　　
ＨＢＩＯＩを形質転換し、アンピシリン耐性形質転換体
をテトラサイクリンを含量するプレート上で選択した。 アンピシリンに耐性でテトラサイクリンに感受性を示す
クローンから分離したプラスミドＤＮＡをＡｖａ　ｌで
消化させると断片８１７ｂｐが得られ、Ｂ　ａ　ｍ　Ｈ
１−３ａ　Ｉ　Ｉで消化させるとターミネータ−遺伝子
（４７ｂｐ）が確認された。このプラスミドをｐ’ｌ”
ｅｒｓ２１と命名し、発現ベクターの構築に使用した。 爽旌斑叉ｉ クーミネーターＬｉｆｉ転子のクローニング：各オリゴ
ヌクレオチド（Ｃ’、Ｄ’、Ｈ’、Ｉ’Ｊ’、に’、Ｌ
’およびＭ’）をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン
酸化し、実施例８に記載したようにＴ４ＤＮＡリガーゼ
で処理した。ライゲーション混合物と二種のオリゴヌク
レオチド（Ｇ’およびＮ’）とをン昆合し、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼで処理した。ライゲーション生成物を分取用Ｐ
ＡＧＥにより精製し、ＢａｍＨＩ−３ａｌｌ消化による
ｐＢＲ３２２の大きな断片（４０８７ｂｐ）とを混合し
た。混合物のライゲーションは、標準条件下においてＴ
４ＤＮＡリガーゼを用いてクノシュナー法により、Ｅ、
　ｃｏｌｔ　　ＨＢ　１０１を形質転換し、アンピシリ
ン耐性形質転換体をテトラサイクリンを含有するプレー
ト上で選択した。アンピシリンに耐性でテトラサイクリ
ンに感受性を示すクローンから分離したプラスミドＤＮ
ＡをＡＶａ■で消化すると０．８％アガロースゲル電気
泳動および７．５％ＰＡＧＥにて断片３．３２ｋｂｐお
よび８３９ｂｐを示ず。このターミネータ−し遺伝子を
含有するプラスミドをｐＴｅｒＬど命名し、発現ベクタ
ーの構築に使用した。 爽施班１１ ターミネータ−３遺伝子含有”Ｖａｌ−ＩＣＦ−１発現
ベクターの構築： ターミネータ−３遺伝子を含有するｐＴｅｒＳ２１をＰ
ｓｔｌとＢａｍＨＩで消化し、分取用アガロースゲル電
気泳動により大きな断片（３００５ｂｐ）を得た。遺伝
子（３，０５ｂｐ）をＢａｍＨｌ−Ｐｓｔｌ消化により
ｐＬＨ３ｄＶｔｒｐから得た小さい断片（１２８１ｂｐ
）で標準条件下においてライゲートし、次いでライゲー
ション混合物を用いてＥ、ｃｏｌｉ　　ＨＢＩＯＩを形
質転換させた。形質転換で得たアンピシリンに耐性のプ
ラスミド（りＬＨ３ｄＶｔｒｐＳ）をＰｓむｌ−５ａｌ
ｌ　　（１３３１，２９５８’ｂｐ）およびＨｉｎｄｌ
［［−３ａ　Ｉ　Ｉ　　（２８９ｂｐ）で消化し、７．
５％ＰＡＧＥにてターミネータ−３ｉｆｔ伝子を確認し
た。 入施玉１盈 ターミネータ−し遺伝子含有”９Ｖａｌ−ＩＯＦ−１発
現ベクターの構築： クーミネーターＬｉｄ転子を含有するプラスミドｐＴｅ
ｒｌ、をＰｓｔｌとＢａｍＨＩで消化し、分取用アガロ
ースゲル電気泳動により大きな断片（３０２７ｂｐ）を
得た。遺伝子（３０２７ｂｐ）をＥ３ａｍＨＩ−Ｐｓｔ
ｌ消化によりｐＬＨ３ｄＶｔｒｐから得た小さい断片（
１２１３１ｂｐ）で標準条件においてライゲートし、次
いでライゲーション混合物を用いてＥ、　ｃｏｌｉ　　
ＨＢ　１０１を形質転換させた。形質転換で得たアンピ
シリンに耐性のプラスミド（ｐＬＨ３ｄＶｔｒｐ）をＰ
ｓｔｌ−３ａｌｌ　（１３５３，２９５８ｂｐ）および
１（ｉｎｄｌｌ＋−５ａ１１　　（３１１ｂｐ）で消化
し、７．５％ＰＡＧＥにてターミネータ−し遺伝子を確
認した。 叉並■又工 β−ガラクトシダーゼ遺伝子融合”Ｖａｌ−ＩＣＦ−１
発現ベクター（ｐＳｄＶ２−１ａｃ）の構築： シャロン２５フアージＤＮＡ　（今井博士供与）をＥｃ
ｏＲＩで消化し４個の断片（１９，９，１０゜７．６．
６および５．７　ｋ　ｂ　り　）を得た。ラクトースプ
ロモーター、オペレーターおよびＺ遺伝子の大半を含有
する断片（６，６ｋｂｐ）を分取用アガロースゲル電気
泳動により回収した。一方、ｐＳｄＶ２をＥｃｏＲＩで
消化し、次いで大腸菌アルカリホスホターゼ（Ｂ　Ａ　
Ｐ）で処理した。線状プラスミドを、Ｔ４リガーゼの存
在下に４℃で、前記プロモーター遺伝子（６，６ｋｂｐ
）と等モルでライゲートした。このライゲーション混合
物による旦０匹旦　ＨＢ　１０１の形質転換体を、アン
ピシリン耐性菌として、５−プロモー４−クロローイン
ドリルガクトシド（Ｘｇａｌ）培地上で選択した。この
インジケータープレート上では、リプレッサーを滴定す
るｌａｃオペレーターの数の増加によるβ−ガラクトシ
ダーゼが合成されたコロニーがその青い色で識別される
。約１３％のコロニーが青く、テトラサイクリン惑受性
を示した。４コロニーから得たプラスミドをそれぞれＢ
ａｍＨｌおよびＩＩ　ｉ　ｎ　ｄ　ｉｌｌで消化した。 ４プラスミド中１プラスミドが目的とした正しいプロモ
ーター遺伝子を存しているが、他のプラスミドは逆方向
に挿入されていた。得られたプラスミドｐｓｄＶ２−１
ａｃｆｃＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩでン肖化し、７，５％
ＰＡＧＥにて５９Ｖａ、Ｉ−ＩＣＦ−１遺伝子（２２４
ｂｐ）をｌｉｖｔｇした。プラスミドを含有する旦。 β−ガラクトシダーゼ遺伝子融合”Ｖａｌ−ＩＣＦ−Ｅ
　　（ｐＳｄＶ２−１ａｃ）の発現ニブラスミドｐＳｄ
Ｖ２−１ａｃ含有Ｅ、　ｃｏｌｉＨ’Ｂ　１０１をアン
ピシリン２０μｇ／ｍｊ！含有Ｉ７ブロース中で一晩培
養し、Ｌブロース中（３００ｍ　ｊ！　）で希釈し、次
いで３７°Ｃで培養した。Ａ６゜。 が０．８の時、イソプロピルチオガラクトシド（■ＰＴ
Ｇ）を加え最終濃度０．１ｍＭとした。さらに２時間培
養し、遠心分離（５ｋｒｐｍ、４°Ｃ１５分間）により
菌体を集め、菌体をＢｒＣＮ（１０ｍｇ’／ｍｅ）含有
の７０％ギ酸に懸濁した。混合物を室温で２時間放置し
５、溶媒を真空中で蒸発した。不溶性物質を遠心分離に
より除去した後、上清を定量を行うまで一２０°Ｃで保
存した。 叉盗±主上 β−ガラクトシダーゼ融合５９Ｖａｌ−ＩＧＦ−れたｐ
ＮＴ４９は、ｐｔ、プロモーター、トリプトファン（ｔ
ｒｐＡ）およびラクトース構造遺伝子を含有するプラス
ミドである。このプラスミドｐＮＴ４９を１３　ａ　ｍ
ｌ（１で消化し、次いでＥｃｏＲＩで部分的に消化し、
分収用アガロースゲル電気泳動により約１１ｋｂｐの断
片を回収した。この断片を前記で得た５９Ｖａｌ−ＩＧ
Ｆ−１遺伝子（２２４ｂｐ）でライゲートし、ライゲー
ション混合物を用いＥ、　ｃｏｌｉ　　ＭＭ　２９４を
形質転換しアンピシリン耐性形質転換体を得た。この形
質転換体の一つから得られるプラスミドをＥｃｏＲＩと
Ｂａ　ｍ　ＨＩで消化し５９Ｖａｌ−ＩＧＦ−１遺伝子
（２２４ｂｐ）の存在を確認した。 一方、レシピアント菌体旦、　ｃｏｌｔ　　ＨＩ　２０
１゛−実鳩、コールド・スプリング・ ハーバ−・ラボラトリ−（１９７２）参照）をｐｓｃｌ
ｏｌに０１８５７遺伝子を含有するプラスミドｐＮＴ２
０４　（このプラスミド（ｐ　ＮＴ　２０４）は今井博
士により提供）により形質転換し、テトラサイクリン耐
性形質転換体を得た。レシピエンドＥ、　ｃｏｌｉ　　
ＩＩ　１２０１９／Ｉ）ＮＴ２０４を上記プラスミドｐ
ＳｄＶ２−ＮＴ４９で形質転換し、アンピシリンおよび
テトラサイクリンに耐性％ＰＡＧＥにより”Ｖａｌ−Ｉ
ＣＦ−１遺伝子（２２４ｂｐ）の存在を確認した。ｐＳ
ｄＶ２−ＮＴ４９含有旦、　ｃｏｌｉ　　ＨＩ　２０１
９／ｐＮＴ２β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｐｓｄＶ２
−ＪＩＴ４９）融合５９Ｖａ　Ｉ　−Ｉ　ＧＦ　−Ｉの
発現：（アンピシリン（２５μｇ／ｍｊりおよびテトラ
サイクリン（２５μｇ／ｍｊりを３０°ＣでＬＰブロー
ス〔Ｌブロース＋０．２Ｍリン酸カリウム緩衝液＋１％
グルコース）　　（１００ｍｊりに希釈した〕（５ｍｌ
）中で一晩培養した。培養物は３０℃でＡも。。＝　０
．５−０．６となるまで発育させ、次いで４２°Ｃに移
した。更に４２°Ｃで３時間培養した後、菌体を集め、
ＢｒＣＮ　（１０ｍｇ／ｍＡ）含有７０％ギ酸で懸濁し
、室温で２４時間放置した。 溶媒を減圧下に留去し、残渣を３Ｍ酢酸（３ｍｊ２）に
懸濁した。混合物を一晩室温で放置し、滅菌水で３倍に
希釈した。不溶性物質を遠心分離により除去し、上清を
凍結乾燥して分析するまで一２０℃で保存した。 実施■ユニ ５９Ｖａｌ　−ＩＧＦ−１の分離および精製＋１１　　
融合”Ｖａｌ−ＩＧＦ−１の分離および精製温潤細胞ペ
ースト（６０ｇ）を１０ｍＭＰＢＳ−Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　
（ｐ　Ｈ８，０）　１５０ｍ　ＩｌにｒＵ、ｆ５し、菌
体を超音波処理により破壊した。菌体残層を１８０００
ｒｐｍで３０分間遠心分離してペレット化した。得られ
たペレットを０．１Ｍ　　Ｔｒｉｓ　−ＨＣ１（ｐ　Ｈ
８，０）／８Ｍ尿素−０，１Ｍジチオスレイトール（５
０ｍ６）に溶かし、３５．００Ｏｒｐｍ、　２５°Ｃで
３０分間遠心分離した。上清を取り、０．１Ｍ　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣＩ！（ｐＨ８，０）／８Ｍ尿素および１０．ｍ
Ｍ２−メルカプトエタノールで平衡化したセファクリル
３３００ス−バーファインカラム（５，，０Ｘ８６．６
ｃｍ、　１７００ｍｊ！樹脂）にかけた。溶出は４℃で
平衡緩衝液を用い、流速０．６ｍ　ｊ！　／分で行った
。画分１１ｍｊ！を集めた。セファクリル５３００クロ
マトグラフイを行った。定量は全クロマトグラフィ段階
について両分後直ちに行った。活性画分を集め、合わせ
た画分２０４ｍｊｌ！を１Ｍ酢酸水溶液８７！を用い室
温で３時間透析し、次いで新たに１Ｍ酢酸水溶液８７！
を用い一晩透析した。透析画分は凍結乾燥し、所望の成
分を含有する融合”Ｖａｌ−ＩＣＦ−１２４ｏｍｇを得
た。 （２ン　臭化シアンによる融合”Ｖａｌ−ＩＣＦ−１か
らの蛋白ペプチドＬＨの脱離 操作（１２により得た融合”Ｖａｌ−ＩＣＦ−１（２４
０ｍｇ）を８０％ギ酸１２ｍｊ＋に溶解した。 臭化シアン（２４０ｍｇ）を加え、２５℃以下で一晩攪
拌下に反応させた。蒸留水１０８ｍｆを加えた後、ギ酸
および臭化シアンを凍結乾燥により除去した。残渣をＩ
　Ｍ　Ｔｒｉｓ　−Ｉ　ＣＩｌ　（ｐ１１８．０）／８
Ｍ尿素−５０ｍＭ２−メルカプトエタノール６ｍｌに溶
かした。この溶液を２５°Ｃで４時間攪拌し、０．０１
Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ４，６）／８Ｍ尿素−５０ｍ
Ｍ２−メルカプトエタノール（パンファーＡ）１５０ｒ
ｒ＋ｊ！を用い室温で２時間、２回透析した。 透析溶液はバッファ−Ａで午後ｉ化したカチオン交換樹
脂ＣＭ５２カラム（１，６Ｘ１５．ｏｃ＋ｎ３０ｍ　Ｒ
樹脂）にかけた。カラムはバッファーＡ　（６０ｍ　１
２　）　ヲ用い、室温にて流速０．５ｍ　１２／分で洗
浄し、バッファ　　Ａ（２５０ｍｆ）から０，２Ｍ酢酸
アンモニウム／８Ｍ尿素−５０ｍＭ２−メルカプトエタ
ノール（２５０ｍＡ）までの直線勾配で溶出した６両分
２．７５ｍｊ！を集めた。陽イオン交換クロマトグラフ
ィーを行った。活性画分を集め、プールした両分を１Ｍ
酢酸水溶液−１０ｍＭ２−メルカプトエタノール４１を
用い室温で４時間、２回透析した。 （３）　　高速液体クロマトグラフィ：操作（２）によ
り得たラジオイムノ活性含有透析画分を用いた。 カラム二へツクマンウルトラポアＲＰＳＣ（４，６Ｘ７
５鶴） 流速：１ｍＩ！、／分 溶　出：　Ｏ，ＯＩＭ　Ｉ−リフルオロ酢酸中１０％か
ら６０邪までのアセトニトリルの直 線勾配；５０分間 操作は３０回繰返して還元型”Ｖａｌ−ＩＣＦ−■含有
画分を集めた。保持時間２１３．１１８分の主ピークは
還元型５９Ｖａｌ−ＩＣＦ−１に相当する。 前述の操作により還元型”Ｖａ　Ｉ　−Ｉ　ＧＦ　−１
が収率８０％（約７　ｍ　ｇ”）で得られた。 この還元型”Ｖａ　Ｉ　−ＩＧＦ−Ｅは通常の再生（ｒ
ｅｆｏｌｄｉｎｇ）法により酸化型５９Ｖａｌ−ＩＧＦ
−■に変えた。 大狙班１↓ プラスミドｐＬＨ３ｄＶｔｒｐＳによる蛋白ペプチドＬ
Ｈ融合”Ｖ、１ｌ−ＩＧＦ−１をコードする遺伝子の発
現ニ プラスミドｐＬＨ３ｄＶｔｒｐｓ含有旦１匹旦ＨＢＩＯ
Ｉをβ−インドールアクリル酸誘導の条件下で実施例２
４と同様の方法により培養した。 集めた菌体を融解し、融合”Ｖａｌ−ＩＧＦ−１を実施
例３３　（１）に記載のように分離した。融合５９Ｖｉ
ｌ−ＩＧＦ−１を臭化シアンで処理し、粗”Ｖａｌ−Ｉ
ＣＦ−１を実施例３３（２）に記載のように精製し、純
粋な”Ｖａ　Ｉ　−Ｉ　ＧＦ　−１を得た。 去旌■ユ盈 プラスミドｐＬＨ３ｄＶｔｒｐＬによる蛋白ペプチｌ−
″ＬＨ融合５９Ｖａ　Ｉ　−ＩＣＦ−１をコードする遺
伝子の発現ニ プラスミドｐＬ　ＨＳ　ｄ　Ｖ　ｔ　ｒ　ｐ　Ｌを用イ
ル５９ｖａｌ−ＩＣＦ−１の発現は実施例２４と同様の
方法で行った。 尖施狙ユニ 還元型”Ｖａｌ−ＩＧＦ−１の分析： （１）アミノ酸組成 実施例に３３により調製した物質はウォーターズ社製ア
ミノ酸分析システムを用い分析した。物質のＳ　Ｈ基は
文献記載の方法によりカルボキシメデル（ＣＩｔ　ｚ　
ＣＯＯＨ）　Ｍ　（ｆｕｎｃＬｉｏｎ）で保護した。 アミノ酸残基の計算は本明細書に示したＤＮＡ配列デー
タに基づき７０と標準に合わせた。 （２１”Ｖａ　１−ＩＣＦ−１のアミノ酸配列分析：こ
のペプチドのＮｌｈ末端のアミノ酸配列はエドマン法Ｃ
ＤＩＢＩＴＣ法）（Ｊ、Ｙ、Ｃｈａｎｇら：Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、　　Ｊ、、１５３．　６０７　　（１９７６）　
、　　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｔｏｐｈｙｓ、　ＡｃＬａ
、＋　　５１８．　１８８（１９７９））によりベック
マン配列モデル８９ブチダーゼ消化法により決定した。 Ｑ”ｙ＋ｌ’Ｖ、＄＝’ｆＣ，Ｑ　”’Ａ　Ｉ−Ｘ（（
Ｆ−１，ｆ）　Ｔ　、”　／　１１憧ψ艮 還元型５９Ｖａｌ−ＩＧＦ−１のアミノ酸組成（値はモ
ル％） アミノ酸　残基数／分子　近似整数　予測値ＣＭ−Ｃｙ
ｓ　　　　５．６　　　　　６　　　　６Ａｓｐ　　　
　　　５．２　　　　　５　　　　５Ｔｈｒ　　　　　
　２．６　　　　　３　　　　３Ｓｅｒ　　　　　　４
　、９　　　　　５　　　　５Ｇｌｕ　　　　　　５　
、９　　　　　６　　　　６ＰｆＯ５，４５５ Ｇｌｙ　　　　　　７　、４　　　　　７　　　　７Ａ
ｌａ　　　　　　５　、６　　　　　６　　　　６Ｖａ
ｌ　　　　　　３．７　　　　　４　　　　４Ｍｅヒ　
　　　　Ｑ　　　　　　　Ｑ　　　　　Ｏ工ｌｅ　　　
　　　ｏ、ｓ　　　　　　１　　　　１Ｌｅｕ　　　　
　　５　、１　　　　　５　　　　６ＴＹｒ　　　　　
　２．５　　　　　３　　　　３Ｐｈｅ　　　　　　３
　、６　　　　　４　　　　４Ｌｙｓ　　　　　　３．
２　　　　　３　　　　３Ａｒｇ　　　　　　８．４　
　　　　　Ｂ　　　　　６（３）ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動：ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｐ　Ａ
　Ｇ　Ｅ）はスワンクおよびムンクレスの方法に従って
行った。 ”Ｖａｌ−ＩＣＦ−１はＰＡＣ；Ｅで約５０００ダルト
ンの位置に単一バンドを示した。〔天然ＩＣＦ−１は文
献（Ｒ，Ｅ、　　Ｈｕｍｂｅｌ　　ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、＋　Ｕ　Ｓ　Ａ、工３，
２３６５−２３６９　（１９７６））＆ではＰ　Ａ　Ｇ
　Ｅ、テ約５０００ダルトンの位置にバンドを示す。〕 貞晦　２　図　５９Ｖａｔ−ＩＧＦ−Ｉ潰イ訃のり０−
二）グ↓　シ吾善ヒ単鮪 ρ５ｄＶ２ 第３　図　合戊廿Ｐアロ針外　■遣イ立子の構築合成１
１７６口モーター　１潰イ云＋ 納４図　合成ｔｒｐ ＥｃｏＲＩ　　　　　　　ＥｃｏＲ１ 合成ｔヒＰアロモーターエ遣４ム÷ アＯモーター　ｘ４イ云＋のクローニ）り゛。 ＰＳＴ−１、 ＳＴ−１ ！８　　図　蛋白ペア子ドＬＨｉｉイ云＋のりＯ−二ン
ク°。 １１ヒ卑潰准 ρＬＭ　１０７ ｉ自公プ子ドＬＨ遣イ云千 ＠９　図　絹娘アラス汁ｐｓｄＶ２廿ρの＄葺堵ｐＳｄ
Ｖ２ｔ　ｒρ 肖−１２図　Ｓｌａ換′ｚＶ°ラスミＦ　　ｐＬＨ５ｄ
Ｖｔｒｐ　　Ｏ＠９ｐＬＨ９ＪＶｔｒｐ’Ｌ’Ｊ有’Ｉ
’＋　Ｌ　α市）−ＩＢ１０１１焙普ヒ草劃伽 ｐＬＨ５ｄＶｔｒＰ ？　　１３１Ｄ　　　　ター三ネイターＳ潰イ立子の構
繁ター三ネイターＳ遣イ２４＋ 第１４図　　ツーミネイターＬｉｌ私÷の構替−Σ＝　
　　　　　　　　　ニピー　エ　Ｊ二　Ｊ吐！ターミネ
イターＬ　　１１六子 図　組換え７゛ラスミドρＬＨ５ｄＶｔｒρＳのＩｌ絆
に づ Ｐｓｔｌ　Ｅ’ ！　　１６　　図　糸且廃えプラスミド予ＬＨｄｓＶｔ
ｒρＬのゎ１験５ｊ　　１７　　［ｉ８　　組をトえ）
“ラスミド　ρ５ｄＶ２−１ａｃの末島）誼ＰＳｄＶ２
−１ａ（ｔｉ：ｌＡｑる旦９λし、ＨＢ　１０１Ｊ　ｔ
ｐ４ビ単鮪 ｐｓｄＶ２−ｔａｃ[9]
Fusion 59Va] -10F-1's "Val-IGF-"
Conversion to 1 and isolation of 59Val-ICF-1: The thus obtained fusion 59Val-ICF + can be converted to 59Val-IGF-I by an elimination reaction of the protected peptide. This elimination reaction can be carried out according to conventional methods used in the field of peptide chemistry. An appropriate elimination reaction can be selected depending on the type of fusion Val-IGF-1. Suitable reagents used in this elimination reaction can include cyanogen bromide. Desorption of protein peptide from Val-IGF-1 fused with protein peptide via methionine
J: "Val-ICF-1" fused to a protein peptide via the methionine of the protein peptide can be converted to "Val-IC+F-■" by an elimination reaction using cyanogen bromide. This reaction is usually carried out under mild conditions in a suitable solvent that does not adversely affect the reaction. The reaction temperature is not particularly limited, and the reaction is usually carried out under cooling or heating. The fusion "Val-IOF-" was treated with cyanogen bromide for 3 hours at 25° in 660% formic acid. After lyophilization, the residue was
Reduced 59Val-ICF was dissolved in 8M urea solution containing 0mM 2-mercaptoethanol and dialyzed.
A crude mixture of -1 was obtained. This mixture was purified by cation exchange chromatography (CM52), and the active fractions detected by RIA were collected and dialyzed. After dialysis, both fractions are subjected to high-performance liquid chromatography to obtain the pure reduced form.
'■at-ICF-1 was obtained. This reduction “Val-IC
F-1 was converted to the oxidized form "Va'1-IGF-1" by a conventional regeneration method (re4olding). shows the band of
In addition, the "Val-IGF-1" was a gift from Dr. Humbel at IIPLO.
It overlapped with the standard item. The amino acid sequence of Val-IGF-1 was determined by a combination of the Edman method and the carboxypeptidase method.
It showed biological activity in Mll)-thymidine incorporation assay with B/c 3T3 mouse cells. (10) “Radioimmunoassay of VaI-IGF-1: Yanaihara [Yanaihara et al., Peptide Hormones
1nPancreas, 3. 28 (198
3) According to the method established by ), “Val-IGF-
1 RIA was performed. The above sample or standard sample (IG
0.1 mβ of F-1 fragment (26-46)) was added to sample buffer (0, OIM PBS, 0.025M EDT).
In A, 0.5% BSA (pH 7.4) (0.4m
rabbit antiserum against Va 1-IGF-1 (26-46) (0,1m#) and IIGI
'-1 (26-46) (0,1 ml). The mixture was left at 4'C for 48 hours and then rabbit blood i'
) f(0,1mβ), rabbit γ-globulin antiserum (0
, 1 ml) and 5% PE06000 (0.9 ml) were added. After standing at 4°C for an additional 2 hours, the pellet was collected by centrifugation (3 krpm, 4°C for 130 minutes), and the radioactivity was measured using γ-causciter. From this radioactivity, the content of Val-IGF-1 was calculated. (11) Biological assay of 59Va I-IGF-1; BΔLB/c 3T3 mouse embryonic fibroblasts (clone A31) were treated with trypsin. , 5% fetal bovine serum and 25mM N-(2-hydroxyethyl)piperazine-
Re-Q, f5 to a concentration of 105 cells/mj2 in Dulbecco Voigt's modified Eagle's medium containing N'-2-ethanesulfone, (Hl, PE5). 10
0μβ each Q, 3cn! wells (96-well microtiter plate, manufactured by Costar). After the formation of a uniform monolayer of cells (first play Fi1M
After 3-4 days (5-7 days after production), remove the medium, wash the cultures three times, and then add 0.2 μCi/well of
) Thymidine (0,67 Ci/mmo +) and the test sample were added. After 24 hours of incubation, the medium was removed, cells were washed with PBS, and trypsinized for radioactivity measurements. Cells were captured onto glass filters using a semi-automatic multiple cell harvester (LAVO, MASH. Lab Science). Incorporated CH) Thymidine to Actazol 2 New England Nuclear) 8 mj! Coloring was carried out using a Pasocard tri-calf'fa body scintillation counter. The present invention will be explained below with reference to Examples. Abandoned ship ± upper HOA p A p A p Cp Cp G p A
p Cp CpGpGpCpTpApTpGOH(G
l) Synthesis (11DMTrOTp oA”p oTp
oG"poAeUpo-Synthesis of Cellulose: i) HOG'8poAcUpo-Se/(/
Loin (D preparation: DMTrOG”poAcUp o-
Cellulose (130.4 mg, 4.59 μmole
”) (prepared by method 11 of R, Crea) in methanol/chloroform (1:9 V/V, 5 JOml)
Hang on? I-liquid contains TCA/riaovolum (2:8 W/V,
5. Add Omjri under cooling and stir at 0°C for 10 minutes. Chloroform (2m/) and methanol (6,
After washing with 0ml), remove the cellulose adduct (HOG) on the filter paper.
"po"Up o-cell e+-su) was dried. At this time, water was separated as an azeotrope with pyridine (2 ml). *This value was calculated by measuring the absorbance of the chloroform washing solution at 507 nm. 1) R, Crea et al., Nucleic Ac1
ds Res,. ■, 2331 (1980) ii) Key of DMTrOTp oAIlzp oTp o-: DMT r OTp o A”p o T p
o-CE (39.9mg, 23.0μmole)
Triedylamine-acetonitrile JLi (III
Phosphodiester trimer (DMTrOTpoA”p) obtained by treating V/V, 5ml) for 1 hour at room temperature.
oTp o-) was dried. Water was separated as an azeotrope with pyridine (0,5 mj!, 2
Mixed with Lucosone in a 10ml round bottom flask. Dry the mixture (water is an azeotrope with pyridine (2X
The solution was separated as 1 m4) and resuspended in anhydrous pyridine (1 ml). Menthylene sulfonyl nitokotriazuride (MSNT)
(68,0mg, 230.ljmole) in this:V, nB? Pyridine was then added to the reaction vessel and the cellulose adduct was collected by centrifugation (3000 rpm, 2 minutes). iv) Acetylation of unreacted 5' hydroxyl groups: The adduct was dissolved in a pyridine-acetic anhydride solution (10:1ν
/V, 5.5+nA), turbid, and stirred at room temperature for 30 minutes. Repeated centrifugation (3 times) in pyridine (5tt#!)
000 rpm for 2 minutes) and methanol (15ml
) and vacuum drying at room temperature for 30 minutes.
A cellulose product (113.9 mg) was obtained. This cellulose adduct (DMT r OT p o AIIIp
(2) DMTrOG"poQ"poC"poTp. ABzp o T p o G”p oAcU p o
-S/L/C1-Synthesis (7): DMTrOGIBpoG”poC”poTpo
A"poTpoG"po"Upo-Cellulose is DM
TrOTp oA”p oTp oG”p oAcUp
O-cellulose (113.9 mg) and DMT r 0G
llIp. It was synthesized from Q"poC"po-CE (43.7mg) under the same conditions as above. (31DMTrOAl12poCB2poc"poG"
poG”poCIllp oTp oA”poT
p oG"po A CU I) Synthesis of O-cellulose: DMT r OA"po C"po Cg+p
o G"p. G"po C"po Tp oA"p oT p o
G"p.^C[J p o-cellulose (105.8 mg) is D
MT r OG”p oGIBp oC”p oTp
oA"p oTp oQl ++ p o Ac Up
o-Cellulose (109,5 mg) and DMTr 0A
Illp o C"p o C"p o -CE
(44.0 mg) under the same conditions. t41 DMTrOCIltpoC”poGIBpo
A”po Cl11p o CBffip o G”p
o G”p o CmouthpoTp oAl12p oT
p oG”p oAcIJp o-Synthesis of cellulose: DMT r OClzp o C”p o G”p o
AUp. C"p oCR+p oG"p oGIBp oCBz
poTpOAmouthpoTp oGIBp oAeUp
o-Cellulose (94.5 mg) is DMT r OA”
p o C"p o CUp. GIllp oGIIIp oC"p oTp oA"
poTp. G'BpOAcUpQ-cellulose (105,8 mg)
and DMT r O'C"p o C"p o G"p
Synthesized from o-CE (43.5 mg) under similar conditions. f51 DMTrOAB! poA"po eight 2poc
izpoC"p oGIIlp oA"p oC"p
oC”p oGIRp o GIIIp o CIIz
p oTp o A"p oTp o G'Bp oA
Synthesis of cUp o-cellulose: DMT r OA”p
o A”p o A”p o C”p. C”p o G”po o ABzp o
C”p o C”p o G”p oG”p
oCIIzp oTp oA”po oTp oG”po
Ac U p o-cellulose (90.4 mg) is
DMTrQC”p o C”p o G”p o A”
p o C"p o C"p oG"p oG"po
C”poTp oA”p. TpoG'''poAcUpo-Cellulose (94, 5mg) and DMTr0ABtpoAI
It was synthesized from IIp o ABzp o-CE (45.1 mg) under similar conditions. At this 18% stage, unreacted 5
The '-hydroxy group did not need to be protected with an acetyl group. (61HOA p A p A p Cp Cp G
p A p Cp CpGpGpCpTpApTpGO
Synthesis of H: DMT r 0All! p' o A”p
o A3ff1p o G”p. C5zp o G”p o AIIIp o Cl11
p o C"p o G"p oG"p o C1l"
p oTp oAll"poTp oG"po"Up
o-cellulose (90.4 mg) at 0.5M N. N,N゛,N'-tetramethylguanidiniumpyridine 2-aldoximate [dioxane-water (1:1 v/
20°C for 20 hours in a sealed tube. Add 28% aqueous ammonia (12mj) to the reaction mixture.
! ) and heated at 60°C for 2 hours. The solid cellulose was filtered off and washed with water (10 ml!). The filtrate and washings were evaporated to dryness, and the residue was dissolved in an 80% aqueous acetic acid solution (25 m
l) for 15 minutes at room temperature. After solvent distillation, the residue is reduced to 0.
．． 1M triethyl ammonium carbonate buffer (pl!?
, 5.25m j! ) and diethyl ether (
3×25m j! ). The aqueous layer was evaporated to dryness, and the residue was dissolved in 0.1 M triethylammonium carbonate buffer (
Crude HOA in 8 liquids (dissolved in 7, 5, 2 mj)
pA pApcpcpcpApcpcpcpcpc
pTpApTpGOH was obtained. +71 1(OA p A p A p Cp Cp
G p A p Cp CpGpGpCpTpApTp
Purification of GOH: i) Initial purification of the crude product by column chromatography (Biogel P 224
m l D). The fraction corresponding to the first elution peak (50mM Nl140A c, 0.1m
M EDT 8, 1mj! /min) and lyophilized to obtain the first purified product. ii) Second purification of the first purified product by HPLC (
CD R10, 25cm 1ii) The third purification of the second purification was performed by reverse phase HPL.
C (Rp 1B 5μ (X77), 15cmX4m
mlD) from 0.1 M ammonium acetate to 0.1
M ammonium acetate - linear gradient to 15% (V/V) acetonitrile in water (40 min, 1.5 ml/min,
analysis of the final purified product (II OA(1) oligonucleotide (H○ApApApCpCpGpApCpCpGpGp
CpTpApTpCOH) i) Phosphogesterase digestion HOApApApCpCpGpApCpCpGpGpc
pTpApTpGOl ((5μg, 61.7μk)
0.2 MHCj! z (10μI, 0.2M
Tris-HCI (pH 8.5) (10 μl) and 0.1 mM EDTA aqueous solution (13.3 μl)
m) mixture with phosphogesterase (5 μl, 5 μl)
) for 20 minutes at room temperature, followed by heating at 100"C for 2 minutes. 1i)i (PLO analysis The oligonucleotides in the reaction mixture were
(CDR10,25cm x 4.5mm ID) by water~2. It was performed using a linear gradient of OM ammonium acetate (pH 3,4) (40 min, 1.5 mρ/min, 60°C). The nucleotide composition of each peak was determined from the area of each peak by comparing the area of the standard. Calculated value: pCo115.000. pAOH4,00
0゜pToo 2,000. pGol+4,000
Actual value: pCoo 4.767, pAou 4
, 127°pTon 2,054. pGoo 4,05
2-pack ■ Kail oligonucleotide (AI, A2.B1.B2゜CL,
C2, Dl, D2. El, B2. Fl, F2゜G2
．． Hl, N2. II, 12. Jl, J
2. Kl. K2. Ll, L2. MI N2. Synthesis of Nl, N2, 01 and 02): The following oligonucleotides were prepared in the same manner as 01 described in Example 1. (1) HOApApTpTpCpApTpGpGpG
pTOH(All(2) HOTpTpTpCpApG
pGpApCpCpCpApTpGOH(A21(31
HOCpCpTpGpApApApCpTpCpTpG
pTpGOH(Bll(41HOCpApGpCpGp
CpCpGpCpApCpApGpApGOT ((B2
) (51HOCpGpGpCpGpCpTpGpApA
pCpTpGpGpTOH(C1)+6) HOApG
pApGpCpGpTpCpApApCpCpApGp
TpTOH(C21(7) HOTpGpApCpGp
CpTpCpTpGpCpApApTpTpTOH (D
I) (81HOCpCpApCpApTpApCpAp
ApApTpTpGpCOH (C21(9) HOGp
TpApTpGpTpGpGpTpGpApTpCpG
pTOH(Ell(10) HOTPAPGPAPAP
APCPCI)APCPGPAPTPCPAOHfE2
) (11) HOGpGpTpTpTpCpTpAp
CpTpTpCpApApCOH(Fll(121HO
GpGpTpCpGpGpTpTpTpGpTpTpG
pApApGO+I (F21(131HOGpCpT
pGpGpApGpCpCpApTpApGpCpCO
H(G2)(141HOGpCpTpCpCpApGp
CpTpCpTpCpGpTpCOH (Hl) (151
HOCpGpGpTpGpCpGpCpGpApCpG
pApGpAOH(N21f161 HOGpCpG
pCpApCpCpGpCpApGpApCpTpGO
H(II) (171HOCpTpApCpGpApTp
ApCpCpApGpTpCp, TpGOHII2) (
181HOGpTpApTpCpGpTpApGpAp
CpGpApApTpGOH(Jll(191HOGp
ApApApApCpApGpCpApTpTpCpG
pTOH(J21(201HOCpTpGpTpTpT
pTpCpGpTpTpCpTpTpGOH (Kl) (
211HOGpGpApGpApTpCpGpCpAp
ApGpApApCOH(X21(221HOCpGp
ApTpCpTpCpCpGpCpCpGpTpCpT
OH(Lll(231HOTpApApApCpTpT
pCpCpApGpApCpGpGpCOH<L2'1
(24) HOGpGpApApGpTpTpTpA
pCpTpGpTpGpCpTO)I tM1') (
25) HOTpTpCpApGpTpGpGpAp
GpCpApCpApGOH ()12) (27) H
OCpCpApCpTpGpApApGpCpCpAp
GpCpAOH(Nll(28) HOGpCpGp
GpApTpTpTpTpGpCpTpGpGpCOH
(N2) (291HO 8ApApTpCpCpGpC
pGpTpGpApTpApGOH (011(30)
HOGpApTpCpCpTpApTpCpApCO
H(02) 511 state l oligonucleotide (al a 2. a 3.
a 4°G5. G6. bl, b2. b3. b4. b
5. b6°cl; G2. G3. G4. G5. G6.
di,'d2゜d3. d4. d5. d6. el, G2.
G3. Synthesis of G4°G5, 11, 12 and 13): The following oligonucleotides were produced in the same manner as G1 described in Example 1. (11HOApApTpTpCpApTpGpTpGp
TpTOH<all(2) HOApCpTpGpCp
CpApGpGpApCpCpCpApTOH+a2)
(31HOApTpGpTpApApApApGpAp
ApGpCpApGOH(G31(41HOTpGpG
pCpApGpTpApApCpApCpApTpGO
H(G41(5) HOTpTpTpApCpApTp
ApTpGpGpGpTpCpCOH+a51(61H
OApApGpGpTpTpTpTpCpTpGpCp
TpTpCpTOH(G61(71HOApApApA
pCpCpTpTpApApGpApApApTpAO
H(bl)(8) HOCpTpTpTpApApTp
GpCpApGpGpTpCpAOH(b21(91H
OTpTpCpApGpApTpGpTpApGpCp
GpGpAOH (b31 (Lo) HO 8 TpTpA
pApApGpTpApTpTpTpCpTpTOH (
'o4)+1131(OApTpCpTpGpApAp
TpGpApCpCpTpGpCOH (b5) (12)
HOTpTpCpCpApTpTpApTpCpCp
GpCpTpApCOH (b6) (131HOTpAp
ApTpGpGpApApCpTpCpTpTpTpT
pCO+I (c 11(141HOTpTpApGp
GpCpApTpTpTpTpGpApApGOH (G
2) (15) HOApApTpTpGpGpApA
pApGpAp'GpGpApGOH (G3) (161
HOTpGpCpCpTpApApGpApApApA
pGpApGOH (G41!171 HOTpCpC
pApApTpTpCpTpTpCpApApApAO
H(G5)(181HOCpTpGpTpCpApCp
TpCpTpCpCpTpCpTpTOH (G61(1
9) HOApGpTpGpApCpApGpApA
pApApApTpAOH(dll(20) HOAp
TpGpCpApGpApGpCpCpApApApT
pTOH(d21(211HOGpTpCpTpCpC
pTpTpTpTpApCpTpTOH (d3) (22
/) HOCpTpCpTpGpCpApTpTpA
pTpTpTpTpTOH(d4)+231 HOA
PGPGPAPGPAPCI)APAPTPTPTPPG
PGOHfd51(24) HOApApApGpCp
TpTpGpApApGpTpApApAOH (d61
(25) HOCpApApGpCpTpTpTpTp
CpApApApApAOH(all(261HOCp
TpTpTpApApGpGpApTpGpApCpC
pAOH(G21+27) HOGpApGpCpA
pTpCpCpApApApApGpApGOH (G3
1 (28) HOCpCpTpTpApApApGp
TpTpTpTpTpGpAOH(G4)+291H
OGpGpApTpGpCpTpCpTpGpGpTp
CpApTOH(G51(30) HOTpGpTp
GpTpApApTpGpApTpApGOH (111
(31) HOTpApCpApCpApCpTpCp
TpTpTpTOH (12) (321110GpApT
pCpCpTpApTpCpApTOH (131 left Jl
The following oligonucleotides (ml and m2) were prepared in Example 1.
Manufactured in the same manner as. (1) HOApGpCpTpTpGpApApGp
TpApApApApCpApTpGOH (ml) (2
1HOApApTpTpCpApTpGpTpTpTp
Synthesis of TpApCpTpTpCpAOH (m2) oligonucleotides (A, B, C, D, E, F. G, H, H, J, L, M and N): The following oligonucleotides were synthesized as in Example 1. Manufactured in a similar manner. +1) ll0ApApTpTpTpGpCpCpGp
ApCpAOH(A)(11) HOTpApGpT
pApCpGpCpApApGpTpTpCpApCO
H+K) (121HOCpTpTpTpTpTpApC
pGpTpGpApApCpTpTOH(Ll(14)
HOApApTpTpCpGpApTpApCpCO
Synthesis of H(N)SE, SF, SG and SH): +11
HOApApTpTpCpApTpGpGpCpTO
H(SA)(2) HOGpGpTpTpGpTpAp
ApGpApApCpTpTpCpTOH (SB) (3
1HOTpTpTpGpGpApApGpApCpTp
TpTOH(S(j+41 HCICpApCpTpT
pCpGpTpGpTpTpGpApTpApGOHf
sDl+51 HOTpTpApCpApApCpCp
ApGpCpCpApTpGO)I (SEI(61H
OCpCpApApApApGpApApGpTpTp
CO! ((SFI+7) HOCpGpApApGp
TpGpApApApGpTpCpTpTOH (SGI
(81HOGpApTpCpCpTpApTpCpAp
ApCpAOH(SH) 天"u"L The following oligonucleotides (A'-N') were produced in the same manner as in Example 1. (4) HOApApApApApGpGpCpTpC
pCpApApApApGpGpAOH(D'1(51
HOGpCpCpTpTpTpTpTpTpTpTpT
pTpGOH(E')+61 HOTpCpGpApC
pApApApApAOH(F'1(7) HOGpA
pTpCpCpTpCpGpApGpCpTOH(G'
) (El) HOGpTpTpTpApApTpCpA
pGpCpTpCpGpApGO)! +11')(9
1HOGpApTpTpApApApCpCpGpAp
ApTpCpApAOH (Engineering 1) (10) HOGPC
PCPTPTPTPAPTPT
pCPGOH(J')+ill HOGpCpCpT
pTpTpTpTpTpTpTpTpTOH(K'1(
121HOTpCpTpCpCpApApApApAO
H(L'1(137HOGpGpApGpApCpAp
ApCpGOH(M'1(141HOTpCpGpAp
Production of CpGpTpTpGOH(N'1su]lJ"Val-IGF-l gene: Ligation of chemically synthesized oligonucleotides A portion of each oligonucleotide (AI-01) (0.4nM) was dissolved in 74mM Tris-HC. (1 (pH7
, 6). L OmM DTT, 1.6mM mercaptoethanol +'10mM MgCfz and 0.5mM
100 μ of solution containing ATP! The cells were phosphorylated using T4 polynucleotide kinase (manufactured by CBRL) at 37°C for 20 minutes. After the reaction is complete, the enzyme in the reaction mixture is
It was inactivated by incubating at ℃ for 5 minutes. 59Val-IG for cloning.
Obtain the F-I gene. Ligation was performed using T4 DNA ligase (7 units) and 100mM ATP (0.5μl).
) at 4°C for 23 hours (standard conditions). Ligation products of oligonucleotides at each step were identified by ethidium bromide staining on 2-16% gradient PAGE in Tris-EDTA buffer. Implementation Plan: Cloning of the Val-ICF-1 gene: Plasmid pBR322 was digested with BamHI and EcoRI restriction endonucleases. The reaction was terminated by heating at 65°C for 5 min, and the fragment was
．． Separation was performed by 5% agarose gel electrophoresis. A large fragment of 3985 bp derived from pBR322 was recovered,
It was ligated with T4 DNA ligase at 2°C for 18 hours to obtain a 224 bp "Val-IC; Resistant transformants were treated with tetracycline (25p
Selected on plates containing g/ml. Plasmid DNA isolated from one of the five clones that was resistant to ampicillin and sensitive to tetracycline was isolated from EC0RI and Ba. This plasmid is characterized by the complete nucleotide sequence of the Val-IGF-1 gene and pS
It was named dV2 and used to construct an expression vector. Sequencing of the Val-IGF-1 gene in the plasmid psdV2: To determine the sequence of the Va I-I CF-1 gene, plasmid psdv2 was digested with EcoRI, and then α-P-ATP was sequenced. The linear plasmid labeled with 32p was treated with AMV reverse transcriptase (purchased from Seikagaku Ha) for 30 minutes at 37°C.
Digested with HI, resulting in 2 fragments (224bl), 4. Ob
p) was obtained. A small fragment (224 bp) was recovered by preparative polyacrylamide gel electrophoresis and sequenced according to the Maki-Moo-Gilbert procedure. On the other hand, plasmid pSdV2 was first digested with BamHI and then labeled with 31p as described above. The linear plasmid was digested with EC0RI and two fragments (224 bp, 4.
0 kbp) was obtained. The small fragment (224 bp) was analyzed by the Maxam-Gilbert method as previously described. ”V
The results of sequencing from both sides of the al-ICF-1 gene were consistent with the designed "Va I-ICF-1 gene." Preparation of the large current hypothetical protein peptide LH gene: (0.4 nM) was mM Trisil CR (
p 117.6). 20mM DTT, 50. L1g/mj! B.S.A.
, lrnM spermidine, 10mM MgCj! Phosphorylation was carried out using 2.5 units of T4 polynucleotide kinase in a solution containing z and 2mM ATP for 3 hours at 37°C. After the reaction is complete, the enzyme in the reaction mixture is
Inactivation by incubation at 0°C for 5 minutes was carried out as shown in Figure 7. First, 6 fragments were obtained, and finally the protein peptide LHill for cloning was obtained.
A trochanter (236 bp) was obtained. Ligation was performed using T4 DNA ligase (5 units) in 50 mM, TP-containing solution (1 μn) at 16°C.
Time went. The ligation products of the oligonucleotides at each step were prepared in Tris-EDTA buffer.
Identification was performed by 16% gradient PAGE and edidium bromide staining. Cloning of protein peptide L'H gene: Cloning of protein peptide L'H gene (236 bp) synthesized as described above.
) was inserted into pBR3224 in the same manner as on the day of the example. Restriction enzyme analysis revealed that the plasmid (pLHI07) obtained from the E. coli HBIOI transformant contained the protein peptide LH (236 bp). Input ■Construction of main synthetic trp promoter gene I block I,
Oligonucleotides II and ■ (B-M
) was phosphorylated with T4 polynucleotide kinase and ligated with 74 DNA ligase as described above. This block (1-1) was then condensed with unphosphorylated oligonucleotide (AN). The final ligation product was qff-produced using preparative 1.5% PA and GE to obtain a 107 bp synthetic trp promoter I gene. Cloning of soil synthesis trp promoter I gene: Plasmid pBR325 was digested with EC0RI and flocculent pBR325 was digested with EC0RI.
BR325 was ligated with the synthetic trp promoter I gene. Transformants of 1-1 HB 101 with this ligation mixture were screened on antibiotic-containing plates and four RAmp'Cm colonies were obtained. The plasmids obtained from these four colonies were each digested with HpaI. The fragments obtained from these plasmids by +1 in d m and EcoRI digestion were compared with the fragments of pBR3'25 by II in d l11 and ECORI digestion. One of the four plasmids had the promoter gene (synthetic trp promoter In gene trochanter) in the correct orientation, and the others had been inserted in the opposite orientation. Construction of the Married Woman ■ [L Akira trp promoter ■ gene; Each oligonucleotide (B-3O) of blocks I', It', I[I' and IV' was phosphorylated with T4 polynucleotide kinase and then purified with T4 DNA as described above.
Reigate with Riger Ze. These blocks (I
'~■'') and unphosphorylated oligonucleotides (A and SH) were subsequently condensed. The final ligation product was purified by preparative 7.5% PAGE to yield a 163 bp synthetic trp promoter ■ gene. Otsuki Group 1 Cloning of the synthetic trp fromomota gene 2. The synthetic trp promoter H gene constructed in Example 15 was ligated with the EcoRI-BamHI fragment of pBR322, and then E. coli IIB 101 was transformed using the ligation product. The plasmid obtained from the RAmp, 5Tet transformant was digested with l1pa+ and a band (4.1 kbp) was confirmed. Then, it was digested with Bam HI and 90b was extracted with PAGE.
The p band was confirmed. Furthermore, EcoRI-BamH
This was confirmed by comparing the 56 bp fragment obtained by I digestion with a size marker on PAGE. This plasmid was named pTrpEB7 and was used to construct an expression vector. Sousei Flame 1 ” Val-ICF-1 expression vector (pSdV2-'3
22Lrp) Construction: Synthetic Lrp promoter ■hector (pTrpEB△7) was digested with EcoRI and BamHI, and PAGE
A larger fragment (4.1 kbp) was obtained. This fragment was prepared from plasmid pSdV2.
- Ligated with the IGF-1 gene. This ligation mixture was first transformed into juxtaposed HB 101, and transformants resistant to ampicillin and sensitive to tetracycline were selected. The resulting plasmid pSd
V2-322 L rp to EcoR plasmid pSdV
2-322% 9y al-IGF-1 in trp
Sequencing of genes and synthetic trp promoter genes: △ 59Val-IGF-1 by Maxam-Gilbert method
For gene sequencing of iff gene and trp promoter, plasmid pSdV2-322trp was transformed into EcoR
The mixture was digested with E. coli alkaline phospotase at 37°C for 1 hour. After phenol extraction and ethanol precipitation, the plasmid was phosphorylated with T4 vorinucleucdokinase in the presence of r-”P-ATP for 1 h at 37°C and finally with Hinf
Digested with I, resulting in two fragments (Iloob p, 48
0b p) was obtained. Each fragment was sequenced according to the Maxam-Gilhart method. Obtained 59Val-ICF-1
The sequence of the gene and the synthetic Lrp promoter matched the designed one. Construction of the protein peptide LH expression hector (pLHtrp): The synthetic trp promoter ■ hector (pTrpEB?) produced in Example 16 was digested with EcoRI and BamHI, and a large A fragment (4.1 kbp) was obtained. This fragment was
It was ligated with the protein peptide LH gene prepared from plasmid pLH107 by mHI digestion. The ligation mixture was used to transform HBIOI from 0 mice to obtain transformants that were resistant to ampicillin and sensitive to tetracycline. The plasmid (pLHtrp) obtained from the transformant was digested with EC0RI and BamHI, and the protein peptide LHiJl trochanter (236 bp) was confirmed by 7.5% PAGE. Example 20 “Construction of Val-ICF-1 expression vector: Example 4
The oligonucleotide (ml) prepared in (1) was phosphorylated with T4 polynucleotide kinase as described in Example 8. This phosphorylated oligonucleotide, the oligonucleotide (m2) prepared in Example 4 (2), and the 59Va I-IGF-1 gene (224 b p
) and T4 in a solution containing 100mM ATP.
It was treated with ligase at 4°C for 23 hours. The ligation mixture was purified by preparative PAC,E to obtain the linker-attached 59Va I-ICF-1 gene (242 bp). This gene was ligated with the fragment obtained from pL (trp) by H4ndlU-BamHI extinction, and the ligation mixture was used to transform HBIOI in 0 groups.
BIOI was named juxtaposition F-5, and was released on May 2, 1984.
On the 8th, it was deposited at the Institute of Microbial Technology, Agency of Industrial Science and Technology (1-chome, Higashi, Yatabe-cho, Tsukuba-gun, Ibaraki Prefecture, Japan, postal code 305) under deposit number FERMA-7644. The deposit was subsequently changed to an international deposit under the Budapest Treaty at the same location on February 28, 1985, with deposit number FERM, l'B.
P-728). Plasmid (pLH) obtained from the transformant
3dVtrp) to EcoRI-BamHI (198
, 224 bp), EcoRI-PstI (19B,
859 bp), HindIII-BamHl (24
2bp) and Hpal-BamHI (456bp)
) and digested with 7.5% PAGE to digest the trp promoter, protein peptide LH, VaI-ICF-1 gene expression Niblasmid pSdV2-322trp. Cultured overnight in 0.2% glucose, 0.5
% Casamino Acids (Acid Hydrolyzed Casein) and Vitamin B
+50. 1:2 in M9 medium containing c+g/mff
It was diluted at a rate of 5. β-indole acrylic acid was added to give a final concentration of 10 μg/mβ. A6° at this time. was 0.4. Next, culture for 3 hours, centrifuge (6k
The bacterial cells were collected at 4° C. for 5 minutes. The bacterial cells were destroyed by ultrasonication, and the remaining layer was removed by centrifugation. The supernatant was mixed with 3M acetic acid, and the precipitate was centrifuged (2
0 krpm, 4°C for 110 minutes) DTA and 0.
5%BSA) 4mJ! Hp, f5, 0. IN N
aOH''?: Adjusted to pH 7-8. After removing insoluble substances by centrifugation, the supernatant was kept at -20°C until quantification.
Saved with. RIA of Va I-ICF-1 RIA of Val-IGF-1 was performed according to Yanaihara's method. The sample or standard sample (ICF-1
7 fragment (26-46)) in sample buffer (0, OIM PBS, 0.025M E
0.5% B S in D T A (p) 17.4)
A(0,4m1)). Rabbit antiserum of 1'CF-1 (2,6-46) (0,j
mp) and “'I-I CF-1(26-46)(
0.1mJ) and left at 4°C for 48 hours.
Rabbit serum (0.1 mj), rabbit T-globulin anti-blood serum (0.1 mj) and 5% PE G6000
(0.9 ml!) was added. 47C for another 2 hours
After the pellet was left to stand, the pellet was centrifuged (3 krpm,
The samples were collected at 4°C for 230 minutes, and the radioactivity was measured using γ-causciter. The content of 59Val-IGF-I was calculated from this radioactivity. "Protein peptide L)i fusion in coli F-5"
Expression of the gene encoding Va I-IGF-1: E. coli F-5 (plasmid pLH3dV
Cultured overnight in L broth, 0.2% glucose, 0.5
%casamino acids (acid-hydrolyzed casein), 50μg/m7
! Vitamin B1 and 25. Diluted at a ratio of 1=20 in M-9 medium containing c+g/ml ampicillin. Add β-indole acrylic acid to a final concentration of 10 μg/m j
! Closed. A6° at this time. was 0.5. next,
The bacterial cells were cultured for 2 hours and centrifuged (5 krpm, 4°C, 5°C).
minutes). Cloning of the Terminaceu S gene: Each oligonucleotide (B', C', D' and E') was phosphorylated with T4 polynucleotide kinase and treated with T4 DNA ligase as described in Example 8. . Ligation mixture and two oligonucleotides (A' and F')
and treated with T4 DNA ligase. The ligation product was purified by preparative PAGE and BamH
It was mixed with the large fragment of pBR322 from I-3all digestion. Ligation of the mixture was performed using 74 DNA ligase under standard conditions. coli by Knoschner method using the ligation mixture.
HBIOI was transformed and ampicillin resistant transformants were selected on plates containing tetracycline. When plasmid DNA isolated from a clone resistant to ampicillin and sensitive to tetracycline was digested with Aval, a fragment of 817 bp was obtained, and BamH
When digested with 1-3a II, the terminator gene (47 bp) was confirmed. p'l'' this plasmid
It was named ers21 and used to construct an expression vector. Cloning of Sokei Makarikai Couminator Lifi trochanter: Each oligonucleotide (C', D', H', I'J', Ni', L
' and M') were phosphorylated with T4 polynucleotide kinase and treated with T4 DNA ligase as described in Example 8. The ligation mixture and two types of oligonucleotides (G' and N') were combined to form T4 DNA.
treated with ligase. Preparative P for ligation product
It was purified by AGE and mixed with a large fragment (4087 bp) of pBR322 digested with BamHI-3all. Ligation of the mixture is carried out under standard conditions at T
E, by the Knoschner method using 4 DNA ligase.
colt HB 101 was transformed and ampicillin resistant transformants were selected on plates containing tetracycline. Plasmid DNA isolated from a clone resistant to ampicillin and sensitive to tetracycline
When A was digested with AVa■, 0.8% agarose gel electrophoresis and 7.5% PAGE showed no fragments of 3.32 kbp and 839 bp. The plasmid containing this terminator gene was named pTerL and used to construct an expression vector. Souse Group 11 Construction of Val-ICF-1 expression vector containing terminator-3 gene: PTerS21 containing terminator-3 gene
A large fragment (3005 bp) was obtained by digestion with stl and BamHI and preparative agarose gel electrophoresis. A small fragment (1281 bp) of the gene (3,05 bp) was obtained from pLH3dVtrp by BamHl-Pstl digestion.
) under standard conditions and the ligation mixture was then used to transform E. coli HBIOI. The ampicillin-resistant plasmid (LH3dVtrpS) obtained by transformation was transformed into Psml-5al.
l (1331,2958'bp) and Hindl
Digested with [[-3a I I (289 bp), 7.
Terminator-3ift gene was confirmed on 5% PAGE. Construction of "9Val-IOF-1 expression vector containing terminator gene: Plasmid pTe containing couminator Lid trochanter"
rl was digested with Pstl and BamHI, and a large fragment (3027 bp) was obtained by preparative agarose gel electrophoresis. Gene (3027bp) to E3amHI-Pst
A small fragment obtained from pLH3dVtrp by l digestion (
12131 bp) under standard conditions and then using the ligation mixture to transform E. coli
HB 101 was transformed. The ampicillin-resistant plasmid (pLH3dVtrp) obtained by transformation was transformed into P
Digested with stl-3all (1353,2958bp) and 1(indll+-5a11 (311bp)), terminated with 7.5% PAGE, and confirmed the gene. -1
Construction of expression vector (pSdV2-1ac): Sharon 25 phage DNA (donated by Dr. Imai) was
Digested with oRI to generate 4 fragments (19,9,10°7.6.
6 and 5.7 kb) were obtained. A fragment (6.6 kbp) containing the lactose promoter, operator and most of the Z gene was recovered by preparative agarose gel electrophoresis. Meanwhile, pSdV2 was digested with EcoRI and then treated with E. coli alkaline phosphotase (BA
P). The linear plasmid was incubated with the promoter gene (6,6 kbp) at 4°C in the presence of T4 ligase.
) was ligated in equimolar amounts. Transformants of HB 101 produced by this ligation mixture were selected as ampicillin-resistant bacteria on 5-promo-4-chloroindolylgactoside (Xgal) medium. On this indicator plate, colonies in which β-galactosidase has been synthesized due to the increasing number of lac operators titrating the repressor are identified by their blue color. Approximately 13% of the colonies were blue, indicating tetracycline-susceptibility. Plasmids obtained from 4 colonies were labeled B.
Digested with amHl and II in dill. One of the four plasmids contained the correct promoter gene of interest, but the other plasmids had been inserted in the opposite direction. The resulting plasmid psdV2-1
acfcEcoRI and BamHI, 7.5%
59Va, I-ICF-1 gene (224
bp) was ivtg. Containing plasmids. β-galactosidase gene fusion “Val-ICF-E”
(pSdV2-1ac) Expression Niblasmid pSd
V2-1ac containing E, coli H'B 101 with ampicillin 20μg/mj! cultured overnight in containing I7 broth, diluted in L broth (300 m j!), and then incubated at 37 °C. A6°. is 0.8, isopropylthiogalactoside (■PT
G) was added to give a final concentration of 0.1 mM. After culturing for an additional 2 hours, the bacterial cells were collected by centrifugation (5 krpm, 4°C for 15 minutes) and suspended in 70% formic acid containing BrCN (10 mg'/me). The mixture was left at room temperature for 2 hours, and the solvent was evaporated in vacuo. After removing insoluble material by centrifugation, the supernatant was stored at -20°C until quantification. Strain ± main β-galactosidase fusion 59Val-IGF-rep
NT49 contains pt, promoter, tryptophan (t
rpA) and a lactose structural gene. This plasmid pNT49 was transferred to 13 am
l (digested with 1, then partially digested with EcoRI,
A fragment of about 11 kbp was recovered by preparative agarose gel electrophoresis. This fragment was 59Val-IG obtained above.
The resultant was ligated with the F-1 gene (224 bp), and the ligation mixture was used to transform E. coli MM 294 to obtain ampicillin-resistant transformants. A plasmid obtained from one of the transformants was digested with EcoRI and BamHI to confirm the presence of the 59Val-IGF-1 gene (224 bp). On the other hand, recipient bacterial cells, colt HI 20
1 - Real pigeon, Cold Spring Harbor Laboratory (1972)) pscl
Plasmid pNT2 containing the 01857 gene in ol
04 (this plasmid (pNT 204) was provided by Dr. Imai) to obtain a tetracycline-resistant transformant. Recipe End E, coli
II 12019/I) NT204 as above plasmid p
Transformed with SdV2-NT49 and resistant to ampicillin and tetracycline.
The presence of the CF-1 gene (224 bp) was confirmed. pS
coli HI 201 containing dV2-NT49
9/pNT2β-galactosidase gene (psdV2
-JIT49) Expression of fusion 59Va I -I GF-I: (Ampicillin (25 μg/mj) and tetracycline (25 μg/mj) at 30°C in LP broth [L broth + 0.2M potassium phosphate buffer + 1%
glucose) (diluted to 100ml) (5ml
) and cultured overnight. The culture was also A at 30°C. . = 0
．． 5-0.6 and then transferred to 42°C. After further culturing at 42°C for 3 hours, the bacterial cells were collected,
It was suspended in 70% formic acid containing BrCN (10 mg/mA) and left at room temperature for 24 hours. The solvent was distilled off under reduced pressure, and the residue was suspended in 3M acetic acid (3mj2). The mixture was left overnight at room temperature and diluted three times with sterile water. Insoluble material was removed by centrifugation and the supernatant was lyophilized and stored at -20°C until analysis. Implementation ■ Separation and purification of Uni-59Val-IGF-1 +11
Isolation and purification of fusion Val-IGF-1 Wet cell paste (60 g) was added to 10 mM PBS-EDTA.
(pH 8,0) 150 mI was treated with rU and f5, and the bacterial cells were destroyed by ultrasonication. 18,000 bacteria remaining layer
Pellet by centrifugation at rpm for 30 minutes. The obtained pellet was dissolved in 0.1M Tris-HC1 (pH
8,0)/8M urea-0,1M dithiothreitol (5
0 m6) and centrifuged at 35.00 rpm and 25°C for 30 minutes. Remove the supernatant and add 0.1M Tri
s-HCI! (pH 8,0)/8M urea and 10. m
A Sephacryl 3300 Suberfine column (5,0x86.6
cm, 1700mj! resin). Elution was performed at 4°C using equilibration buffer at a flow rate of 0.6 m j! / minute. Fraction 11mj! Collected. Sephacryl 5300 chromatography was performed. Quantitation was performed immediately after both minutes for all chromatographic steps. The active fractions were collected and the combined fraction was 204 mjl! 1M acetic acid aqueous solution 87! Dialysis was carried out for 3 hours at room temperature using 1M acetic acid aqueous solution (87%).
was dialyzed overnight using The dialyzed fraction was lyophilized to obtain fused "Val-ICF-124omg" containing the desired components. The fusion “Val-ICF-1 (24
0mg) was dissolved in 80% formic acid 12mj+. Cyanogen bromide (240 mg) was added, and the mixture was reacted with stirring at 25° C. or below overnight. After adding 108 mf of distilled water, formic acid and cyanogen bromide were removed by freeze drying. I the residue
M Tris-I CIl (p118.0)/8
M urea-50mM was dissolved in 6ml of 2-mercaptoethanol. The solution was stirred at 25°C for 4 hours and 0.01
M ammonium acetate (pH 4,6)/8M urea-50m
M2-Mercaptoethanol (Panfer A) 150r
r+j! The mixture was dialyzed twice at room temperature for 2 hours. The dialysis solution was prepared using a cation exchange resin CM52 column (1,6×15.oc+n30m R
resin). The column was buffer A (60 m 1
2) Washed at room temperature with a flow rate of 0.5m/min, and eluted with a linear gradient from buffer A (250mf) to 0.2M ammonium acetate/8M urea-50mM 2-mercaptoethanol (250mA). 2.75mj per minute! Collected. Cation exchange chromatography was performed. Collect the active fractions and make both pooled fractions 1M
Dialysis was performed twice for 4 hours at room temperature using an acetic acid aqueous solution-10mM 2-mercaptoethanol 41. (3) High performance liquid chromatography: The radioimmunoactivity-containing dialyzed fraction obtained in step (2) was used. Column 2: Tsukuman Ultrapore RPSC (4,6X7
5) Flow rate: 1 mI! ,/min Elution: O,OIM I-Linear gradient of acetonitrile from 10% to 60% in lifluoroacetic acid; 50 min operation was repeated 30 times to collect fractions containing reduced form Val-ICF-■.Retained. The main peak at time 213.118 minutes corresponds to reduced form 59Val-ICF-1.
was obtained with a yield of 80% (approximately 7 mg"). This reduced form "Va I-IGF-E" was subjected to normal regeneration (r
Oxidized 59Val-IGF was obtained by
- Changed to ■. Daiaiban 1↓ Protein peptide L by plasmid pLH3dVtrpS
Expression of the gene encoding H fusion "V, 1l-IGF-1" 2 plasmids containing pLH3dVtrps
Example 2 under conditions of β-indole acrylic acid induction
The cells were cultured in the same manner as in 4. The collected bacterial cells were thawed and fusion "Val-IGF-1" was isolated as described in Example 33 (1). Fusion 59Vi
l-IGF-1 was treated with cyanogen bromide to give crude “Val-I”
CF-1 was purified as described in Example 33(2) to obtain pure "Va I-I GF-1".
Expression of gene encoding LH fusion 59Va I-ICF-1 Expression of ICF-1 was carried out in the same manner as in Example 24 using two plasmids pL HS d V t r p L. Analysis of uni-reduced Val-IGF-1: (1) Amino acid composition The substance prepared in Example 33 was analyzed using an amino acid analysis system manufactured by Waters. The S H group of the substance was converted to carboxymedel (CIt z
COOH) M (funcLion). Amino acid residue calculations were adjusted to a standard of 70 based on the DNA sequence data presented herein. (Amino acid sequence analysis of 21” Va 1-ICF-1: The amino acid sequence of the Nlh terminus of this peptide was determined using the Edman method C
DIBITC method) (J, Y, Chang et al.: Bioch
em, J., 153. 607 (1976)
, Biochem, Btophys, AcLa
,+518. 188 (1979)) using the Beckman sequence model 89 butidase digestion method. Q"y+l'V, $='fC, Q"'A I-X((
Amino acid composition of reduced form 59Val-IGF-1 (value is mol%) Amino acid Number of residues/molecule Approximate integer Predicted value CM-Cy
s 5.6 6 6Asp
5.2 5 5Thr
2.6 3 3Ser 4
,9 5 5Glu 5
,9 6 6PfO5,455 Gly 7 ,4 7 7A
la 5, 6 6 6Va
l 3.7 4 4Mehi
Q Q O engineering
o,s 1 1Leu
5, 1 5 6TYr
2.5 3 3Phe 3
, 6 4 4Lys 3.
2 3 3Arg 8.4
B 6 (3) Polyacrylamide gel electrophoresis: Polyacrylamide gel electrophoresis (PA
GE) was carried out according to the method of Swank and Munkles. "Val-ICF-1 showed a single band at approximately 5000 daltons in PAC;E.
tl, Acad, Sci, + USA, Engineering 3,
2365-2369 (1976)) & P A G
E, showing a band at approximately 5000 daltons. ] Sadao 2 Figure 59 Vat-IGF-I collapse 0-
2) Gu↓ Shigozenhi single tuna ρ5dV2 Figure 3.
176-mouth motor 1 block + storage 4 figure Synthetic trp EcoRI EcoR1 Synthetic trp Aroma motor 4 m ÷ A O motor x 4 engine + crony). PST-1, ST-1! Figure 8 Protein pair child LHiii + glue O-2 link °. 11 hi base crushing Jun ρLM 107 i LH puzi de LH transfer i Yusen @ 9 Figure Silk Girl Aras Juice psdV2 廿ρ＄葺ato pSd
V2t rρ Portrait-12 Figure Sla exchange'zV° Lasmi F pLH5d
Vtrp O@9pLH9JVtrp'L'J have'I
'+ L α City) - IB1011 roasted grass pLH5dVtrP ? 131D Structure of Tsuminator S crushing Tatsuko Tatsunator S using 24+ Figure 14 Tsuminator Lil I ÷ structure change - Σ=
Nippy e J2 J vomit! Terminator L 11 Rokuko Diagram Recombinant 7゛ Lasmid ρLH5dVtrρS Il Bond Pstl E'! Figure 16 Thread and waste plasmid preparation LHdsVt
rρL's ゎ1experience5j 17 [Teach group i8]
“Lasmid ρ5dV2-1ac no Sueshima) 誼PSdV2
-1a (ti:lAq 9λ, HB 101J t
p4 single tuna psdV2-tac

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １、次の配列の７０個のアミノ酸からなる＾５＾９バリ
ンインスリン様成長因子Ｉ（以下＾５＾９Ｖａｌ−ＩＧ
Ｆ−Ｉと略称する）： 【アミノ酸配列があります】 ２、次の配列の７０個のアミノ酸からなる＾５＾９Ｖａ
ｌ−インスリン様成長因子Ｉ（以下＾５＾９Ｖａｌ−Ｉ
ＧＦ−Ｉと略称する）の製造法であって、 【アミノ酸配列があります】 （ａ）＾５＾９Ｖａｌ−ＩＧＦ−Ｉの発現をコードする
合成の＾５＾９Ｖａｌ−ＩＧＦ−Ｉ遺伝子と該＾５＾９
Ｖａｌ−ＩＧＦ−Ｉ遺伝子の上流に、それに隣接して存
在し、構造遺伝子を有さず、＾５＾９Ｖａｌ−ＩＧＦ−
Ｉ遺伝子の発現をコントロールするプロモーター遺伝子
とを包含するプラスミドを自身の中に含有する生物を培
養すること、および、 （ｂ）培養液から＾５＾９Ｖａ ｌ−ＩＧＦ−Ｉを回収すること を包含することを特徴とする該方法。 ３、（ａ）宿主生物がエシェリキア・コリ（￥Ｅｓｃｈ
ｅ￥−￥ｒｉｃｈｉａ￥　￥ｃｏｌｉ￥）であり、（ｂ
）＾５＾９Ｖａｌ−ＩＧＦ−Ｉ遺伝子が次の配列を包含
し、 コードする鎖：【遺伝子配列があります】 コードしない鎖：【遺伝子配列があります】そして、 （ｃ）プロモーター遺伝子が次の配列を包含する 【遺伝子配列があります】 ものである特許請求の範囲第２項記載の方 法。 ４、次の配列の７０個のアミノ酸からなる＾５＾９Ｖａ
ｌ−ＩＧＦ−Ｉをコードする合成遺 伝子またはそのサブユニット： 【遺伝子配列があります】 ５、遺伝子が次の配列またはそのサブユニットを包含す
るところの特許請求の範囲第４項記載の合成遺伝子： コードする鎖：【遺伝子配列があります】 コードしない鎖：【遺伝子配列があります】６、遺伝子
が次の配列またはそのサブユニットを包含するところの
特許請求の範囲第４〜５項記載の合成遺伝子： コードする鎖：【遺伝子配列があります】 コードしない鎖：【遺伝子配列があります】７、いくつ
かの数のオリゴヌクレオチドブロックのハイブリッド化
とライゲーションを包含することを特徴とする特許請求
の範囲第４〜６項のいずれかに記載の合成遺伝子の製造
法。 ８、次の配列の７０個のアミノ酸からなる＾５＾９Ｖａ
ｌ−ＩＧＦ−Ｉの発現をコードする合成の＾５＾９Ｖａ
ｌ−ＩＧＦ−Ｉ遺伝子を含有するプラスミド： 【アミノ酸配列があります】 ９、次の配列の７０個のアミノ酸からなる＾５＾９Ｖａ
ｌ−ＩＧＦ−Ｉの発現をコードする合成の＾５＾９Ｖａ
ｌ−ＩＧＦ−Ｉ遺伝子を包含するプラスミドを自身の中
に含有することを特徴とする生物： 【アミノ酸配列があります】 １０、次の配列の７０個のアミノ酸からなる＾５＾９Ｖ
ａｌ−ＩＧＦ−Ｉをコードする合成の ＾５＾９Ｖａｌ−ＩＧＦ−Ｉ遺伝子と、該＾５＾９Ｖａ
ｌ−ＩＧＦ−Ｉの上流にそれに隣接して存在し、構造遺
伝子を有さず＾５＾９Ｖａｌ−ＩＧＦ−Ｉ遺伝子の発現
をコントロールするプロモーター遺伝子とを包含してい
ることを特徴とする ＾５＾９ＶａＩ−ＩＣＦ−Ｉ発現プラスミド：【遺伝子
配列があります】 １１、次の配列の７０個のアミノ酸からなる＾５＾９Ｖ
ａｌ−ＩＧＦ−Ｉをコードする合成の ＾５＾９Ｖａｌ−ＩＧＦ−Ｉ遺伝子と、該＾５＾９Ｖａ
ｌ−ＩＧＦ−Ｉ遺伝子の上流にそれに隣接して存在し、
構造遺伝子を有さず、＾５＾９Ｖａｌ−ＩＧＦ−Ｉ遺伝
子の発現をコントロールするプロモーター遺伝子とを包
含しているプラスミドを自身の中に含有することを特徴
とする生物： 【遺伝子配列があります】 １２、次の配列を含むところの、＾５＾９Ｖａｌ−ＩＧ
Ｆ−Ｉ遺伝子の発現をコントロールする合成のプロモー
ター遺伝子： 【遺伝子配列があります】 １３、いくつかの数のオリゴヌクレオチドブロックのハ
イブリッド化およびライゲーションを包含することを特
徴とする特許請求の範囲第１２項記載の合成遺伝子の製
造法。 １４、次の配列を包含する合成のプロモーター遺伝子を
含有するプラスミド： 【遺伝子配列があります】 １５、次の配列を包含する合成のプロモーター遺伝子を
含有するプラスミドを自身の中に含有することを特徴と
する生物： 【遺伝子配列があります】 １６、特許請求の範囲第４〜６項記載の＾５＾９Ｖａｌ
−ＩＧＦ−Ｉ遺伝子と特許請求の範囲第１２項記載のプ
ロモーター遺伝子とを適当なプラスミド中へ挿入するこ
とを含むことを特徴とする、特許請求の範囲第１０項記
載の＾５＾９Ｖａｌ−ＩＧＦ−Ｉ発現プラスミドの製造
法。 １７、適当な生物を特許請求の範囲第１０項記載の＾５
＾９Ｖａｌ−ＩＧＦ−Ｉ発現プラスミドで形質転換する
ことを含むことを特徴とする＾５＾９Ｖａｌ−ＩＧＦ−
Ｉ生産性生物の製造法。 １８、保護ペプチドと融合した＾５＾９Ｖａｌ−ＩＧＦ
−Ｉを脱離反応に付すことを特徴とする＾５＾９Ｖａｌ
−ＩＧＦ−Ｉの製造法。 １９、ｉ）保護ペプチドが最終のアミノ酸としてメチオ
ニンを有する蛋白ペプチドであって、その蛋白ペプチド
の該メチオニンを介して ＾５＾９Ｖａｌ−ＩＧＦ−Ｉと融合しており、ｉｉ）脱
離反応は臭化シアンを用いて行われるところの、特許請
求の範囲第１８項記載の方法。 ２０、保護ペプチドと融合した＾５＾９Ｖａｌ−ＩＧＦ
−Ｉ。 ２１、保護ペプチドが最終のアミノ酸としてメチオニン
を有する蛋白ペプチドであって、その蛋白ペプチドの該
メチオニンを介して＾５＾９Ｖａｌ−ＩＧＦ−Ｉと融合
しているところの、特許請求の範囲第２０項記載の保護
ペプチド融合＾５＾９Ｖａｌ−ＩＧＦ−Ｉ。 ２２、次のアミノ酸配列をもつ蛋白ペプチドＬＨ融合Ｉ
ＧＦ−Ｉであるところの、特許請求の範囲第２１項記載
の保護ペプチド融合＾５＾９Ｖａｌ−ＩＧＦ−Ｉ： 【遺伝子配列があります】 ２３、次のアミノ酸配列をもつβ−ガラクトシダーゼ融
合＾５＾９Ｖａｌ−ＩＧＦ−Ｉであるところの、特許請
求の範囲第２１項記載の保護ペプチド融合＾５＾９Ｖａ
ｌ−ＩＧＦ−Ｉ： 【アミノ酸配列があります】 【アミノ酸配列があります】 【アミノ酸配列があります】 ２４、保護ペプチドと融合した＾５＾９Ｖａｌ−ＩＧＦ
−Ｉをコードする遺伝子。 ２５、保護ペプチドをコードする遺伝子を＾５＾９Ｖａ
ｌ−ＩＧＦ−Ｉをコードする遺伝子に、該 ＾５＾９Ｖａｌ−ＩＧＦ−Ｉ遺伝子がその下流にターミ
ネーターを有していてももしくは有していなくても該＾
５＾９Ｖａｌ−ＩＧＦ−Ｉ遺伝子の上流に、リンカーを
用いて連結することを特徴とする保護ペプチド融合＾５
＾９Ｖａｌ−ＩＧＦ−Ｉをコードする遺伝子の製造法。 ２６、プロモーター遺伝子と保護ペプチド融合＾５＾９
Ｖａｌ−ＩＧＦ−Ｉをコードする遺伝子とを含有する発
現ベクター。 ２７、プロモーター遺伝子と保護ペプチド融合＾５＾９
Ｖａｌ−ＩＧＦ−Ｉをコードする遺伝子とをプラスミド
に挿入することを特徴とする発現ベクターの製造法。 ２８、特許請求の範囲第２６項で定義した通りの発現ベ
クターを含有する形質転換体。 ２９、特許請求の範囲第２８項で定義した通りの発現ベ
クターで宿主生物を形質転換することを特徴とする形質
転換体の製造法。 ３０、特許請求の範囲第２８項で定義した通りの形質転
換体を培養することを特徴とする保護ペプチド融合＾５
＾９Ｖａｌ−ＩＧＦ−Ｉの製造法。[Claims] 1. ^5^9 Valine-insulin-like growth factor I (hereinafter referred to as ^5^9Val-IG) consisting of 70 amino acids having the following sequence:
(abbreviated as F-I): [There is an amino acid sequence] 2. ^5^9Va consisting of 70 amino acids in the following sequence
l-Insulin-like growth factor I (hereinafter referred to as ^5^9Val-I
(a) A synthetic ^5^9Val-IGF-I gene encoding the expression of ^5^9Val-IGF-I and its amino acid sequence. 5＾9
It exists upstream of and adjacent to the Val-IGF-I gene, does not have a structural gene, and is ^5^9Val-IGF-
(b) collecting ^5^9 Va IGF-I from the culture solution; The method is characterized in that: 3. (a) The host organism is Escherichia coli (￥Esch
e￥−￥richia￥ ￥coli￥), and (b
)^5^9 The Val-IGF-I gene contains the following sequence, the coding strand: [there is a gene sequence] the non-coding strand: [there is a gene sequence], and (c) the promoter gene contains the following sequence. The method according to claim 2, which comprises [there is a gene sequence]. 4. Consisting of 70 amino acids with the following sequence ^5^9Va
A synthetic gene encoding l-IGF-I or a subunit thereof: [There is a gene sequence] 5. A synthetic gene according to claim 4, wherein the gene includes the following sequence or a subunit thereof: Code Chain that encodes: [There is a gene sequence] Non-coding chain: [There is a gene sequence] 6. Synthetic gene according to claims 4 to 5, where the gene includes the following sequence or a subunit thereof: code Non-coding strand: [There is a gene sequence] 7. Claims 4 to 6, characterized in that they include hybridization and ligation of several numbers of oligonucleotide blocks. A method for producing a synthetic gene according to any of paragraphs. 8. Consisting of 70 amino acids with the following sequence ^5^9Va
Synthetic ^5^9Va encoding expression of l-IGF-I
Plasmid containing the l-IGF-I gene: [There is an amino acid sequence] 9. ^5^9Va consisting of 70 amino acids with the following sequence
Synthetic ^5^9Va encoding expression of l-IGF-I
An organism characterized by containing a plasmid containing the l-IGF-I gene: [There is an amino acid sequence] 10. Consisting of 70 amino acids with the following sequence ^5^9V
The synthetic^5^9Val-IGF-I gene encoding al-IGF-I and the^5^9Va
It is characterized by being present upstream and adjacent to l-IGF-I, having no structural gene, and containing a promoter gene that controls the expression of the Val-IGF-I gene. ^9VaI-ICF-I expression plasmid: [Gene sequence is available] 11. Consists of 70 amino acids with the following sequence ^5^9V
The synthetic^5^9Val-IGF-I gene encoding al-IGF-I and the^5^9Va
is present upstream and adjacent to the l-IGF-I gene,
An organism characterized by containing within itself a plasmid that does not have a structural gene and includes a promoter gene that controls the expression of the ^5^9Val-IGF-I gene: [There is a gene sequence] 12. ^5^9Val-IG containing the following sequence
Synthetic promoter gene controlling the expression of the F-I gene: [There is a gene sequence] 13. Claim 12, characterized in that it encompasses hybridization and ligation of several numbers of oligonucleotide blocks. Methods for producing the described synthetic genes. 14. A plasmid containing a synthetic promoter gene containing the following sequence: [There is a gene sequence] 15. A plasmid containing a synthetic promoter gene containing the following sequence: Organism: [There is a gene sequence] 16. ^5^9Val described in claims 4 to 6
^5^9Val-IGF according to claim 10, which comprises inserting the IGF-I gene and the promoter gene according to claim 12 into an appropriate plasmid. -Method for producing I expression plasmid. 17. Appropriate living organisms as described in claim 10^5
^5^9Val-IGF- characterized by comprising transformation with a ^9Val-IGF-I expression plasmid.
I. Method for producing productive organisms. 18.^5^9Val-IGF fused with a protective peptide
^5^9Val characterized by subjecting -I to an elimination reaction
-Production method of IGF-I. 19, i) The protected peptide is a protein peptide having methionine as the final amino acid, and is fused to ^5^9Val-IGF-I via the methionine of the protein peptide, and ii) The elimination reaction 19. A method according to claim 18, which is carried out using cyanogen oxide. 20.^5^9Val-IGF fused with protective peptide
-I. 21. Claim 20, wherein the protected peptide is a protein peptide having methionine as the final amino acid, and is fused to ^5^9Val-IGF-I via the methionine of the protein peptide. Protected peptide fusion ^5^9Val-IGF-I as described. 22. Protein peptide LH fusion I with the following amino acid sequence
Protected peptide fusion according to claim 21, which is GF-I^5^9 Val-IGF-I: [There is a gene sequence] 23. β-galactosidase fusion having the following amino acid sequence^5^ Protected peptide fusion^5^9Va according to claim 21, which is 9Val-IGF-I
l-IGF-I: [There is an amino acid sequence] [There is an amino acid sequence] [There is an amino acid sequence] 24.^5^9Val-IGF fused with a protective peptide
-The gene encoding I. 25. Gene encoding the protective peptide ^5^9Va
The gene encoding l-IGF-I may or may not have a terminator downstream of the ^5^9 Val-IGF-I gene.
5^9 Protective peptide fusion characterized by being linked upstream of the Val-IGF-I gene using a linker^5
^9 Method for producing a gene encoding Val-IGF-I. 26. Promoter gene and protective peptide fusion^5^9
An expression vector containing a gene encoding Val-IGF-I. 27. Promoter gene and protective peptide fusion^5^9
1. A method for producing an expression vector, which comprises inserting a gene encoding Val-IGF-I into a plasmid. 28. A transformant containing an expression vector as defined in claim 26. 29. A method for producing a transformant, which comprises transforming a host organism with an expression vector as defined in claim 28. 30. Protected peptide fusion characterized by culturing a transformant as defined in claim 28^5
^9Method for producing Val-IGF-I.
JP60069630A 1984-04-02 1985-04-01 Growth factor i-like 59valineinsulin and its preparation Pending JPS611397A (en)

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GB8408473 1984-04-02
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012533622A (en) * 2009-07-22 2012-12-27 イプセン ファルマ ソシエテ パール アクシオン サンプリフィエ An analog of insulin-like growth factor-1 (IGF-1) having an amino acid substitution at position 59

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012533622A (en) * 2009-07-22 2012-12-27 イプセン ファルマ ソシエテ パール アクシオン サンプリフィエ An analog of insulin-like growth factor-1 (IGF-1) having an amino acid substitution at position 59
JP2014169309A (en) * 2009-07-22 2014-09-18 Ipsen Pharma Sas Analogues of insulin-like growth factor-1 (igf-1) having amino acid substitution at position 59

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