JPS6097250A - 特定の酵素／イオン発生団対を使用する診断用電極膜 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は体液またはその他の液体テスト試料中の特定の
成分（アナライト）の濃度測定に有用な電極膜に関する
。本発明はまたこの膜を利用した電極半電池ならびにこ
れら半電池手段による液体テスト試料中のアナライト濃
度の測定法に関する。

Ｊ、　Ａｍｅｒ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、９１．２１６４
（１９６９）はその中に物理的に不動化させたウレアー
ゼを有する６０〜３５０μｍ厚さのアクリルアミド層で
被覆したベックマン陽イオンガラス電極を包含する尿素
電極を記載している。ウレアーゼは尿素のアンモニウム
イオン（ＮＨ，１”）と二酸化炭素（ＣＯ２）への変換
を接触させる。その様にして生成されたアンモニウムイ
オンはガラス電極と反応して測定可能な電圧変化を生成
させる。

Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　、２．２８３
　（１９６９）は酵素重合体層に対する支持体としてナ
イロンメツシュを使用すること、そして酸素重合体層に
対するカバーとしてセロファンを使用することを記載し
ている。セロファン被筒された電極は被われていない電
極に比べて上昇した安定性を有することが示されている
。

前記文献の研究者等により記載されている電極はそれら
をある種の臨床的適用に対して不利なものとさせるよう
な重大な限定を受ける。

［Ｊ、　Ａｍｅｒ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、９２，２５３
（１９７０）兎特に、電極反応はＮＨ４＋以外のイオン
、特にナトリウム（Ｎａ”）およびカリウム（Ｋ＋）イ
オンにより悪影響を受る。これら同一の研究者は、これ
らイオンから実質的に独立した電極反応を得るためには
Ｎａ＋イオン濃度は尿素濃度の半分以下でなくてはなら
ずそしてに＋イオン濃度は尿素濃度のＡ以下でなくては
ならないということを見出した。

これら研究者は、Ｎａ＋イオンおよびに＋イオンに関す
る限定は、伝統的燐酸塩バッファーを使用した場合充分
なバッファー能力を得ることができないものでありそし
て例えばトリスのようなバッファーを要求するものであ
ると考えている。

トリスバッファーもまた分析目的に対するそのような電
極の使用に重大な限定を課す可能性がある。

更に、これら電極の安定性および反応時間（典型的には
静常状態値の９８％に達するには２５〜６０秒）は酵素
−重合体膜の厚さの函数であることが見出されている。

高度の均一性を以ってそのような電極を製造することに
固有の困難さおよび費用の故に、臨床的に重要な測定を
実施する前に各電極を個々に基準化することが必要であ
る。これら電極は重合体膜からの酵素のもれを遅延させ
るセロファンコーティングを使用した場合でさえも、こ
れら電極が３週間後には活性を失い始めるというその他
の不利な点を有している。

Ｃ，Ｒ，Ａｃａｄ、、Ｓｃ、　Ｐａｒｉｓ、　Ｓｅｒ、
　Ｃ，２７５，３０９゜（１９７２）は牛血清アルブミ
ン（ＢＳＡ）グルタルアルデヒドおよびウレアーゼより
なる膜でディップコーティングしたベックマン陽イオン
感受性ガラス電極を包含する尿素感受性電極を記載して
いる。ウレアーゼをテスト溶液中で尿素に接触させると
、ＮＨ４＋が生成する。このＮＨ４＋ｌｔ＊陽イオン感
受性ガラス電極と作用して電位変化を生成させる。電極
はＮＴ（４＋に対して感受性ではあるけれども、それは
ＮＨ４＋以外の一価陽イオン特にに＋の存在によって影
響される。酵素により生成されたもの以外の陽イオンに
よる阻害の故に、これら研究者はＮａ＋またはに＋ベー
スのバッファー以外のトリスバッファーを使用した溶液
中で電極をテスト１７た。

最後に、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｃ’ｈｅｍｉｓｔｒｙ
、　４５　、４１７　。

（１９７３）はその中に抗生物質ノナクチンを分散させ
たシリコンゴムを包含するアンモニウムイオン感受性膜
を使用した改善された尿素電極を記載している。これら
の膜を０．１　Ｎ　ＮＨ４Ｃｌで満したそして銀テープ
を内部基準電極として使用したガラスチューブの端に置
いた。アンモニウムイオン感受性電極の活性表面を、そ
の中に物理的に不動化させたウレア−七を有する重合体
膜で被った。この二層電極はに＋イオンによる阻害に対
して改善された免疫性を示した。しかしなおこれら電極
は１、尿素濃度および酵素的活性重合層の厚さによって
典型的には６０〜１８０秒の長い反応時間の問題を有し
ている。これら電極は高度の均一性を以って製造するこ
とが困難である。従って臨床的に重要な測定の実施の前
に、個々の基準化が要求されよう。更に酵素の溶解は時
間の経過と共に電極の活性を失わせる。

そのような電極は製造に費用がかかるのであるから、−
回使用後にそれを捨てるのは無駄である。周期的測定に
対して一つの電極を使用する場合には、この溶解の問題
の故に各使用の前に再基準化が必要であろう。最後に、
これら電極は、前記のすべての電極のように、有効な操
作のためには実質的量のテスト試料を要求する。

小量の体液またはその他の液体テスト試料中の非イオン
性アナライトを選択的に検出しうる均一で安価な、使い
捨て可能な、安定な反応性電極半電池の構成のための適
当な膜が要求されている。

本発明の電極膜はその中にイオン発生口を分散させた。

そしてその表面に酵素を結合させた疎水性で化学的に不
活性な、誘電性重合体を包含しておりそしてその酵素は
関心ある基質と反応してイオン発生口が特異的親和性を
有しているようなイオンを生成させうるものである。好
ましい具体例においては、酵素は電極膜に共有結合的に
結合している。

図面は２つの図よりなっている。第１図は水性溶液中で
のＬｏｇ　（尿素〕に対する測定電位を示すグラフであ
る。そして第２図は血清溶液中のＬｏｇ　（尿素窒素〕
に対する測定電位を示すグラフである。

本発明の膜は２つの高度に選択的な化学反応を一緒に連
結させそしてこれら化学反応を単一界面である膜／テス
ト溶液界面に局在化させることによって関心あるアナラ
イトに対するその特異性を達成するものである。酵素は
界面のテスト溶液側に局在化されておりそこでそれは特
異的にアナライトの分解を接触させて、イオンの生成を
導く。そのようにして生成されたイオンは選択的に膜内
に局在しているイオン発生口と結合する。従って２つの
高度に選択的な反応が界面のどちらかの側で生ずるが、
その一つはイオンの酵素的生成でありそして他方は、そ
のイオンに対する親和性の故に前取って選択されている
イオン発生口とのイオンの特異的錯体（ｃｏｍｐｌｅｘ
）化である。

この錯体化反応はイオン、遊離イオン発生口および錯体
の間の化学的平衡を生成させる。この錯体化反応は膜の
内側に約５０Ｘのびている帯域内に局在化されている。

その理由はイオン発生口は水性溶液に不溶でありそして
イオンはそれがこのイオン発生口と錯体化されない限り
膜中に有意には溶性ではないからであり、そしてその膜
内部への移動は膜の高い粘度および比較的大なるイオン
／イオン発生口錯体のサイズの故に限定されているから
である。測定の時間範囲（即ち数分間）においては、有
意のイオン除去は生じない。

全酵素反応はテスト溶液中の、界面から約１ａｏｏＸに
のびた帯域中で生ずる。

本発明の膜を使用した半電池の全体的反応性は膜表面上
の酵素層への基質（アナライト）の質量輸送速度、酵素
触媒速度および界面からのイオン拡散速度によって制御
されている。意図されるところによりこの質量輸送は速
度制限段階であり、その結果半電池は酵素活性変動には
非感受性となる。

膜表面からのイオン拡散速度に等しいイオン生成速度を
反映する靜常状態シグナルを測定することができる。或
はまた電位変化速度を測定することができる。

荷電勾配は界面の各側に確立される。界面の腹側に確立
される荷電勾配はコンパクトである。

界面の溶液側の非結合対応イオンは低粘度の水性テスト
溶液中に容易に拡散して、溶液側に荷電の拡散した勾配
を生せしめる。荷電的中性は電位生成に有意の役割を演
じない対応のイオンにより保持される。

電極膜を製造しうる重合体は疎水性で化学的に不活性な
、そして誘発性の、典型的には約４．５５の誘電定数を
有するものでなくてはならない。種々の重合体が適当で
あるが、それらとしては少（とも以下のものがあげられ
る。

ポリ（塩化ビニル）　（ｐｖｃ） セルロースアセテート ポリ（ビスフェノール−Ａカルボネート）ポリシロキサ
ン／ポリ（ビスフェノール−へカーボネート）ブロック
共重合体 ポリ（メチルメタアクリレート） ポリ（ビニリデンクロリド） ポリスチレン 低級アルキルアクリレートおよびメタアクリレート重合
体および共重合体 ポリウレタン シリコンゴム 前記に列記されている重合体の中でカルボキシル化ＰＶ
Ｃが好ましい。

一般に重合体を可塑剤と合していくらかの量の重合体膨
潤を与える。これは膜中でのイオン発生団の移動性を可
能ならしめるために必要である。

適当な可塑剤としてはジオクチルアジハート、トリス（
２−エチル−ヘキシル〕ホスフェート、ジブチルセパセ
ード、０−ニトロフェニルオクチルエーテル、ジフェニ
ルエーテル、ジノニルフタレート、ジはンチルフタレー
ト、ジー２−二トロフェニルエーテル、グリセロールト
リアセテート、トリブチルホスフェートおよびジオクチ
ルフェニルホスフェート＃”−，１，ケラレル。

本発明の膜は通常はイオン発生団、重合体および可塑剤
（使用される場合には）の揮発性有機溶媒中の溶液を生
成させ、所望の表面上にまたは所望の形にこの溶液をス
クリーン印刷または成形させ、そして次いで蒸発によっ
てこの溶媒を除去することによって製造される。次いで
以下に記載のようにして重合体表面に酵素を結合させる
。

膜中に分散させるべきイオン発生団および、物理的にま
たは化学的に膜に結合させるべき酵素は、化学的補合的
組合せを形成するように選ばれな（てはならない。即ち
酵素は基質（関心あるアナライト）と反応してイオン発
生団が特異的に親和性を有しているようなイオン性生成
物を生成させｔｒ　＜てはならない。例えばアナライト
が尿素である場合には、酵素は尿素と反応してＮＨ４”
を生成させるウレアーゼである。このイオン発生団はそ
のＮＨ４＋に対する親和性の故にノナクチンである。ア
ナライト、不動化酵素のモニターされるイオン種、およ
びイオン発生団は以下の表１に示されている。

表　１ ＢＵＮ　ウレアーゼ　ＮＨ４十　ノナクチン＋ クレアチニン　クレアチニ　ＮＨ４ノナクチンダーゼ トリグリセラ　リバー七　Ｈ＋）リオクチルアミンイド フェニルアラ　デカルホキ　Ｈｃｏ５−　ｐ−オクトデ
クロキニン　シラーゼ　シーｍ−クロロフェ ニルヒドラゾン−メ ゾキサロニトリル チロシン　デカルホキ　ＨＣＯ３−ｐ−オクトデクロキ
シラーゼ　シーｍ−クロロフェ ニルヒドラゾン−メ ゾキサロニトリル アスパラギン　アスパラギ　ＮＨ４＋　ノナクチンダー
ゼ ＋ グルタミン　グルタミナ　ＮＨ４ノナクチンーゼ ペニシリン　β−ラクタマ　肋　トリオクチルアミンー
ゼ 膜中のイオン発生団の濃度は臨界的ではない。

典型的濃度は約０，５〜約３．０１　（膜全重量に対す
るイオン発生口重ｆｉ）である。

好ましい酵素不動化法は、膜のグルタルアルデヒド修正
表面に酵素を共有結合的に結合させることである。得ら
れた構造物は前記の望ましい特性を有している。一般に
重合体の膜表面は共有結合のために適当な反応性基に欠
けている。

従って表面は誘導体化されなくてはならない。

即ち反応性基を結合または露出させそして次いで膜表面
を酵素に結合させるように働くカップリング剤と反応さ
せなくてはならない。以下の表２は適当な反応性基、カ
ップリング剤、酵素上の反応性基、およびカップリング
後に生じた結合を列記している。本発明の膜の製造用に
好ましい重合体はＰＶＣである。好ましい反応性基はＣ
０ＯＨである。カルボキシル化ＰＶＣは市場的に入手可
能であるかまたはＰＶＣと無水マレイン酸の共重合法を
使用することによってｐｖｃから製造することができる
。Ｊ、　Ｐｏ１ｙｅｃｉ、　、　５　、２５３（１９５
０）。好ましｒカップリング剤はグルタルアルデヒドで
あり、そしてグルタルアルデヒドと酵素の間のカップリ
ング後に得られる結合はアミドである。

本発明の膜は診断適用用の固体状態半電池の製造に使用
することができる。この半電池は出願中の米国特許出願
第４６１，４７９号明細書中に詳しく記載されている。

本発明の膜を使用した半電池は多層ディバイスであって
、これは（ａ３　その上に被覆させた寸法が安定で化学
的に不活性な電気絶縁性基質層、 （ｂ）　その上に被覆させた少くとも１ｘ１０２（オー
ム−備）　の伝導度の電気伝４性物質の端子層、（Ｃ）
　その上に被覆させた有機重合体結合剤のマトリクス中
に均一に分散させた微細分割炭素粒子の層、 （ｄ）　本発明の膜 を包含しており、そしてこの膜は炭素層のインピーダン
スよりも少くとも２桁大きいインピーダンスを有してお
り、炭素分散層と本発明の膜の間の界面は層が一部相互
拡散している帯域を包含しておｐｌそして１吏用に当っ
ては層（ｂ）と（Ｃ）は存在しうるすべてのアナライト
の化学的ならびに電気伝導性両接触から隠蔽されている
。

本明細書に使用されている場合、「半電池」の表現はイ
゛オン運動が電子運動に変換される界面の集成体を意味
している。完全な感知器は電極としても参照されうる２
つのその様な半電池より構成されているが、その一方は
指示半電池であり、他方は基準半電池である。

分散炭素層は本質的には訪電体有機疎水性重合体のマト
リクス中の微細分割炭素粒子の分散液よりなっている。

炭素粒子の正確な構造は臨界的ではない。例えばカーボ
ンブラックならびに微細分割はレットおよび木炭粒子を
使用しうる。しかし炭素重合体分散層がイオン選択は膜
のインピーダンスの約１チ以下の電気インピーダンスし
か有していないようにするに充分な量の炭素を存在させ
ることが重要である。

しかし、分散させた炭素層はイオン選択膜中に一部拡散
していなくてはならないという事実の故に、炭素粒子は
微細分割されていなくてはならないということは明白で
ある。即ちそれらは膜層および炭素層のどちらの厚さよ
りも実質的により小さいものでなくてはならない。層の
厚さはそれ自体は臨界的ではないが、その厚さによって
１〜２０μｍの粒子サイズが好ましく、１１０μｍが特
に好ましい。

炭素粒子用マ）　ＩＪクスとして使用される特定の有機
重合体は同様に、その重合体が誘電性であってかつ炭素
およびイオン選択性膜層の両方に対して非反応性である
限りは、特に臨界的ではない。例えば膜層のマトリクス
に対して適当なすべての重合体は分散炭素層のマトリク
スに対してもまた適当である。それに加えてより高度に
結晶性の重合体例えばポリエチレンおよびポリプロピレ
ンもまた使用しうる。

分散炭素層に対して適当なマトリクス重合体としてはま
たフィルム形成性親油性重合体例えばポリ（カプロラク
トン）、ポリアクリレートおよびα−アルキルポリアク
リレートエステル例えばポリメタアクリレート、ポリメ
チルメタアクリレートおよびポリエチルメタアクリレー
ト、ビニリデンクロリド共重合体例えばビニリデンクロ
リド／アクリロニトリル、ビニリデンクロリド／メタア
クリレートおよびビニリデンクロリド／ビニルアセテー
ト共重合・体、エチレン／ビニルアセテート共重合体、
ポリエチレン、ポリビニルエステル例えばポリビニルア
セテート／アクリレート、ポリビニルアセテート／メタ
アクリレートおよびポリビニルアセテート、共ポリエス
テル例えば式ＨＯ（ＣＨ２）ｎ−ＯＨＣ式中ｎは２〜１
０の全数である〕のポリメチレングリコールド（１）へ
キサヒドロテレフタル酸、セバシン酸、およびテレフタ
ル酸、（２）テレフタル酸、イソフタル酸およびセパ−
シン酸、（３）テレフタル酸およびセバシン酸、（４）
テレフタル酸およびイソフタル酸との反応生成物から製
造されたものおよび、（５）前記グリコールとテレフタ
ル酸、イソフタル酸セバシン酸およびアジピン酸から製
造された共ポリエステル混合物、ナイロンまたはポリア
ミド例えばＮ−メトキシメチルポリヘキサメチレンアジ
パミド、合成ゴム例えばブタジェン／アクリロニトリル
共重合体、およびクロロ−２−ブタジェン−１，３−共
重合体、ブロック共重合体例えばポリスチレンーボリブ
タジェンーボリスチレンおよびポリスチレン−ポリイソ
プレン、ポリ（塩化ビニル）および共重合体例えばポリ
（塩化ビニル／ビニルアセテート）、ポリビニルアセタ
ール、例えばポリ（ビニルブチラール）、ポリ（ビニル
ホルマル）、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリス
チレン、フェノール樹脂およびメラミン−ホルムアルデ
ヒド樹脂があげられる。

ある場合には、分散炭素層用のマトリクス重合体の可塑
化は不要かもしれない。しかし、イオン選択性膜と分散
炭素層の間の望ましくない濃度勾配の形成を最小とする
ためには、この二層中に同一のまたは少くとも類似の重
合体を使用することが好ましい。即ち、ジオクチル７タ
レートで可塑化されたｐｖｃが膜層用マトリクスとして
使用される場合には、層間の物質種の移動を最小化させ
る最も便利なそして経済的な方法は分散炭素層に対する
マトリクスとして同一の可塑化ＰＶＣ組成物を使用する
ことである。更に層の相互拡散はマトリクスの相互可溶
化性により容易化される。

本発明の電極半電池の製造の以下の議論において、明白
となるように、分散炭素層マトリクス重合体をある程度
可塑化させて膜と炭素層の相互拡散を容易ならしめるこ
とが好ましい。

一般にこの半電池中には、分散炭素層との界面が安定な
伝導体接触電位差を有しかつ酸化がない限りは広範な種
々の伝導性物質を使用しうる。伝導性物質としては、そ
れらの化学的不活性性の故に貴金属例えば銀および金が
往々にして好まれるけれども卑金属例えば銅、ニッケル
、鉄、錫、カドミウムおよびアルミニウムもまた使用し
うる。その理由はそれらは本発明のディバイス中におい
ては、きびしい酸化的条件にかけられることはないから
である。

すべての場合、この半電池の伝導体層には端子が与えら
れていなくてはならない。そしてこれによって電極を電
位計−増巾器に接続させて、半電池の間のすべての電位
差を測定することができる。これらの端子は単に伝導性
層の延長でありうるしまたはそれらは別個に同一のまた
は異った伝導体金属の隣接伝導性層を特別に印刷するこ
とによって製造することができる。正確な端子形成法は
臨界的ではなくそしてそれらは主としていずれかの与え
られた性能水準に対する製造経済性により決定される。

分散炭素層に接していない伝導体バタンか電気的に絶縁
性でありかつテスト試料に関して化学的に不活性である
層によってテスト試料から隠蔽されていることが勿論必
要である。これは通常は伝導体パタンの非化学的機能部
分を化学的に不活性な絶縁物質例えば重合体またはガラ
スの層で被覆させることにより実施される。膜および炭
素層のマトリクスに対して適当な重合体はまた隠蔽され
な（てはならない伝導体層部分に対する絶縁体としても
また一般に適当である。

それから製造された電極半電池および感知器はそれらを
非常に小さいサイズのそして非常に薄い層として成形さ
せうるというその他の利点を有している。この半電池は
本質的には単純な多層積層体である。即ちそれは薄い層
またはフィルムの積み重ね物である。特に便利な層の形
成法は使用されるいずれかの基材上にそれらをスクリー
ン印刷させることである。例えば伝導性物質の場合には
、不活性有機媒体中の伝導性物質の微細分割粒子の分散
液を生成させ、絶縁基材上に所望のパタンでスクリーン
印刷サセ、そして焼成させて伝導性物質を焼結させそし
て連続的伝導体層を生成させる。

他方伝導性物質の微細分割粒子を光感受性媒体中に分散
させ、絶縁基質上に被覆させ、適当な光用具（ｐｈｏｔ
ｏｔｏｏｌ）を通して露光させて所望のパタンで分散液
を硬化させ、そして現像させて、未露光分散液を除去さ
せることかできる。

同様に連続的炭素およびイオン発生口／酵素層を同一の
、または当業者には周知のその他の技術により適用させ
ることができる。

しかし第一義的に重要なことは炭素とイオン発生口／酵
素層の間の相互拡散帯域の形成である。この相互拡散帯
域はイオン発生間／酵素膜または炭素層のどちらかを完
全に貫き抜けていてはいけない。しかしこの帯域は測定
に使用される電位計−増巾器により要求される電流通過
により生成されたすべての荷電勾配を拡散させるに充分
なだけ犬なるものでなくてはならない。

この理由は、半電池電位を変化させることなしに電流支
持において電子流れをイオン流れに変換させるためには
実質的に純粋なイオン発生口／酵素層および実質的に純
粋な伝導体層の帯域が存在していなくてはならない。濃
度勾配は試料溶液／イオン発生間／酵素層界面で発現し
そして内側にそして相互拡散帯域に向ってのびており、
そして帯域の炭素層側において実質的にゼロの濃度勾配
が存在しているべきである。他方相互拡散帯域の炭素層
側から、炭素層は電子に対して伝導性通路を与えそして
また界面で電位計−増巾器による電流支持のためのイオ
ン輸送を可能ならしめる。

理論的にはこれら基準はそれぞれイオン発生団および炭
素粒子の濃度の適当な変化を有する多数の別個の積み重
ね層によって満足されうるけれども、これは非常に厄介
でありかつ非常に費用がかかる。これを達成するための
はるかに容易な方法は、両マトリクス重合体を可塑化さ
せ、それによって積層させた層が相互可溶化により自動
的に相互拡散するようにすることである。それに加えて
、可塑化させた、またはそれなしの層の相互拡散は正当
な程度の相互拡散を行わせるに充分な時間の間の圧の適
用および／または熱の適用によって行わせることができ
る。

しかしどの方法によって相互拡散帯域が形成されるにし
ても、相互拡散帯域が膜から炭素層に向って高→低誘電
勾配を有していることが本質的である。それに加えて、
相互拡散帯域が安定であることが本質的である。この最
後の理由の故に、重合体マトリクスのどちらかまたは両
方の結合剤成分中に交叉結合剤を包含させて、膜および
炭素層両方ならびにそう人されてる相互拡散層の物理的
ならびに化学的側安定化を行わせることが非常に望まし
い。

次の方法は本発明の電極半電池およびそれから作られた
検知器をスクリーン印刷技術を使用して層に成形させる
方法の典型的なものである。

種々の層を扁平基材上に構成させるがこれらは典型的に
は１“×２“ｘ　Ｏ，０２５”（２，５ｘ　５．Ｏｘ　
Ｏ，０６ｃｍ）の寸法を有している。得られる構造は一
般にチップとして参照される。基材はアナライトおよび
その上に置かれた層に関して、化学的に不活性でなくて
はならない。それはまた寸法的に安定でなくてはならず
かつアナライトおよび／またはそれに重層させた層に関
して非混合性でなくてはならない。しかし寸法は臨界的
ではなくそしてこれは変化させることができる。基材の
組成はコスト、製造の容易さおよび耐久性に基いて選ば
れる。本発明の議論の目的に対してはセラミックが基材
として選ばれているがその他の基材例えばマイラー［Ｆ
］ポリエステルフィルムを使用することができる。

このディバイスの第一の、または最も底の機能層は伝導
体通常は銀である。２５０メツシユスクリーンを使用し
て銀ば一ストをセラミック基村上にスクリーン印刷させ
、そして室温で５〜１０分乾燥させる。次いでそれを更
に１０分間１５０℃で乾燥させ、そして最後に３０分間
８５０℃で焼成させる。

ディバイスの第２機能層は絶縁体通常はガラスでありこ
れは伝導体バタン上に１６５メツシユスクリーンを使用
して伝導体通路は保護されるがしかし電極の接触部分は
露出されているように印刷させる。それを室温で約５分
間乾燥させ、そして更に１５０℃で１０分間乾燥させる
。

最後にそれを８５００で３０分間焼成させる。重合体基
材が使用される場合には、適当な保護バタン生成のため
の誘電体保護重合体系（例えば乾燥フィルムホトレジス
ト）の使用によって同一機能を生成させることができる
。

ディバイスの第５の機能層の炭素層は伝、導体バタン上
に印刷される。１６５メツシユスクリーンが使用される
。炭素層を室温で約５分間乾燥させそして１６０℃で更
に２０分硬化させる。

ディバイスの第４の層の重合体／イオン発生回層は１６
５メツシユスクリーンを使用してこの炭素バタン上に印
刷される。この層の組成物は検出させるべき物質種によ
って変化させることが可能である。

最後にこの酵素／イオン発生凹表面に酵素を結合させる
。好ましい結合法は、表面にグルタルアルデヒド水性溶
液を重層させ、室温で約１０分インキュベートしそして
次いで余剰のものを吸引除′去１す・る゛ことよりなる
。次いで酵素をこのグルタルアルデヒド処理表面に重層
させる。

この表面上には、アナライトの重合体／イオン発生凹表
面への質量輸送速度よりはるかにより早い基質独立酵素
触媒反応速度を確実ならしめるに充分な酵素を不動化さ
せなくてはならない。即ち拡散は全体的イオン発生速度
の速度制限または暖化段階である。ミカエリスメンテン
方程式において、この条件は０次元反応の゛極限値とし
て記載されるが、ここにｘＴｒｌ＜＜ｆ：８１　（Ｋｍ
は（（ＫＳ）／（Ｅ）　＋　Ｃ８〕）として、そして（
Ｋ）−酵素濃度、〔Ｓ〕−基質濃度、［ＦｉＳ］＝活性
化錯体濃度として定義される）である。そのような条件
下には、イオン形成は以下の式により説明される。

Ｋ２（Ｅ）（Ｖ”〕 〔イオン〕＝ φ ここにに２はＦＭＳの解離速度であり ■１は最大基質独立反応速度でありそしてφは試料およ
び障壁層を通しての基質の透過度である。

φよりも１００倍速い速度で基質を完全に変換させるこ
とを確実ならしめるためには、表面上に１０単位（Ｍ／
分〕の酵素活性を不動化させることが必要である。これ
らの計算は、親水性媒体（例えば蛋白質）を通してのＨ
２Ｏの典型的透過性および人血液の臨床範囲の基質濃度
を仮定している。実際には重合体／イオン発生団に典型
的に沈着させる酵素活性は約１００単位（または１０μ
ｔの１０，０００　Ｕ／ｄの調整液）であり、これは要
求されるものよりも１０００倍活性であり、かつ質量輸
送限界速度の値よりも充分大である。

前記物質を使用した場合、イオン発生量と炭素層の界面
に相互拡散帯域を形成させるために特別の方法を実施す
る必要はない。この理由は、両相中には同一の可塑剤お
よび同一の重合体が使用されておりこれが層に実質的程
度の相互溶解性を与え、そしてこれがそれ以上の処理な
しに、成形後非常に短時間内でその帯域の形成および安
定化の結果を与えるからである。相互拡散帯域はこの方
法によって非常に容易に形成されるのであるから、これ
が本発明の電極半電池のこのセグメントの製造の好まし
い方法である。

相互拡散の程度および速度は層の相互溶解性を上昇また
は減少させることによって、例えば層のどちらかまたは
両方の組成および／または可塑剤の濃度を変化させるこ
とによって調整することができる。

はとんどの場合、層形電極半電池は検知半電池と同様の
但し非酵素蛋白質一般にアルブミン例えばＢＳＡを酵素
に置換させた基準半電池と同一基材上に置かれているこ
とが好ましい。検知半電池と基準半電池はある距離だけ
離れた関係にある。得られる全電池は小分子（〈５００
Ｘ）が酵素まで浸透することを可能ならしめる疎水性重
合体の連続障壁層で被覆されている。そのような重合体
の例はセルロース、ポリアクリルアミドおよびカルボセ
ット（デュポンより入手可能）である。この具体例にお
いては、全電池はアナライトの酵素触媒に帰せられない
イオン効果即ちテスト試料中のバラフグ２ウントイオン
濃度を自己補正する。好ましい具体例においては、酵素
含有半電池および基準半電池の両方が同一セラミック基
材層に構成されており、そして随意の障壁層が両生電池
を被覆しており、それによってそれらを大形分子から分
離させ、かつ酵素活性半電池から、酵素的に生成された
イオンが基準半電池の方に拡散することを制限している
。酵素反応はイオン検出が実施される重合体／イオン発
生凹表面に局在しているが故に酵素反応により生成され
るイオンは典型的な測定の時間わく内では基準半電池電
位を阻害させない。

これは、２０半電池が約１ｍｍＬか離れていない場合で
さえも、イオンは基準半電池電位に影響する程充分に速
やかには拡散しないからである。

従って電位差滴定（検知および基準半電池に同一試料を
適用する）を実施して生物試料中に出会うすべての阻害
源を除去することができる。

好ましい全電池を電位計−増巾器に接続させてテスト試
料中のアナライト濃度の函数としての電圧変化を測定す
る。両生電池含有のセラミックチップを関心あるテスト
溶液に含浸させることができるし、或はテスト試料の一
区分量を全電池の表面に適用することかできる。

例 第１部 ＮＨ４＋検知エレメントの製造 アンモニウムイオン（ＮＨ４）　−検知エレメントは本
質的にはここに基準として包含されている米国特許出願
第４６１，４７９号明細書記載のようにして製造した。

詳細には、この検知器はその上に２つの端子銀伝導体パ
タンを印刷した１“×２“ｘｏ、０２５”（２，５ｘ５
ｘＯ，０６ｃｒｎ）のアルミナチップよりなっていた。

この基材チップの被われていない全部分をガラス層で被
って、伝導体バタン側をアナライトから保護した。それ
に応じて分散された炭素層側をイオン発生団層で重層さ
せることによって保護した。全エレメントを、イオン選
択性膜のアナライトとの限定されたイオン接触を与える
ために露出させて残しておく一〇側以外をシラスティッ
ク［Ｆ］重合体フィルムの層で被った。

この検知エレメントの第一のまたは最も底の機能層であ
る調伏導体を銀イーストおよび２５０メツシユスクリー
ンを使用して基材上にスクリーン印刷させた。それを５
〜１０分風乾させ、次いで更に１０分間１５０℃で乾燥
させ、そして最後に８５０℃で３０分焼成させた。

このディバイスの第２の機能層のガラス絶縁体を１６５
メツシユスクリーンを使用して伝導体通路は保護される
がしかし電極接触部分は露出されるようにして伝導体・
ξタン上に印刷させた。この層を５分間風乾させ次いで
更に１５０℃で１０分間乾燥させ、そして最後に′５０
分間８５０℃で焼成させた。

第３の機能層の炭素層は本質的に、ブチルセルロースア
セテート含有の塩化ビニル／ビニルアセテート共重合体
マ）　ＩＪクス中の微細分割炭素よりなっていた。これ
は１６５メツシユスクリーンを使用して伝導体バタン上
にスクリーン印刷された。この層を５分間風乾させ、そ
して次いで１６０℃で２０分間硬化させた。

コノディバイスの第４の層のイオン発生団層はシクロヘ
キサノン中の３０％カルボキシル化ポリ（塩化ビニル〕
と７０チジオクチルアジは−トよりなる溶液１００部当
り５部のノナクチンよりなっていた。この層を１６５メ
ツシユスクリーンを使用して炭素ノソタン上に印刷させ
た。

それを１０分間風乾させ、そして次いで３５℃で３０分
硬化させた。

ｐＴ（７，５の２５　ｍＭ燐酸ナトリウムバッファー中
の１２．５１グルタルアルデヒド溶液を次いで表面を完
全に被覆させるに充分な量でイオン発生口層上に滴下重
層させた。室温で１０分インキュベートさせた後、吸引
によって過剰の溶液を除去しそして表面を窒素を使用し
て吹きつけ乾燥させた。次いでウレアーゼ（７，０００
〜１０，０００Ｔ３／−１５０ｍＭ５０ｍＭ燐酸バッフ
アール、　５中、１００■／１ｎｌ）をイオン発生口層
上にそれを完全に被覆するに充分な量で滴下重層させた
。室温で１０分間インキュベートさせた後、吸引によっ
て過剰の酵素溶液を除去しそして表面を１時間風乾させ
た。

前記と全く同様にして、但しウレアーゼで番家なくアル
ブミンをイオン発生団層にカップリングさせて基準半電
池を製造した。

基準半電池および検知半電池の両方を次いで１６５メツ
シコースクリーンを使用して印刷させたシラスチック［
Ｆ］で重層させた。それらを１０分間風乾させ、そして
５０℃で湿ったｃｏ２１Ｊ境中で１時間硬化させた。

第２部 尿素の測定 前記第１部で製造された電極を使用して５０ｍＭ燐酸ナ
トリウムバッファー］）Ｈ６，Ｂ中に所望の濃度に尿素
を溶解させることによって製造された水性標準液を使用
して、標準尿素曲線を生成させた。第１図は２分測定期
間を使用した場合の、対数モル尿素濃度の函数としての
ｍＶの電極応答を示す。反応は濃度の２つの次元の大き
さに亘って直線状であり、そしてそれは尿素濃度におけ
る１０の変化に対して３５．４ｍＶの傾斜感度を有して
いた。

第６部 血中尿素窒素（ＢＩＩＮ）の測定 前記実施例１で形成させた電極を使用して人血清試料中
のＢＵＮを測定した。使用前に各電極を２０ｍＭ尿素標
準溶液を使用してカリブレーションにかけた。第２図は
３の異った時間に対するｔｎｇ７ｄｔの対数ＢＯＮ濃度
の函数としてのｍＶ電極反応を示す。以下の表は３の異
ったＢＵＮ濃度における正確さおよび精度に関する電極
の性能を示す。参照される方法は、ａｃａＴＭ独立臨床
アナライザーＢＵＮ法である。

ＢＵＮ検知電極の性能特性 １５．７　１ｏｏ　７．６ ３７、１　９９．７　９．２ ５ａ５　１００．５　１０．０

【図面の簡単な説明】

第１図は水性溶液中でのＬｏｇ　［尿素〕に対する測定
電位を示すグラフである。 第２図は血清溶液中のＬｏｇ　（尿素窒素〕に対する測
定電位を示すグラフである。 特許出願人　イー・アイ・デュポン・ド・ネモアース９
アンド・コンパニー 代　理　人　弁理士　山　下 ＦＩＧ、Ｉ ＢＵＮ応答 −３−２−Ｉ ＬＯＧ　［尿素］（Ｍ） （水溶液） ＦＩＧ、２ 尿素窒素勾配応答 、８．９１．０１．＋　１．２１．３１．４　＋、５１
．６　＋、７１．８　＋、９２．０２．ＩＬＯＧ　［床
累窒素］（ＭＧ／ＤＬ） （血清溶液）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）その表面にアナライトと反応してイオンを生成させ
   うる酵素を結合させ、そしてその中にそのイオンと錯体
   を形成しうるイオン発生量を分散させた疎水性で化学的
   に不活性な、誘電体重合体を包含する液体テスト試料中
   のアナライトの測定のための電極膜。 ２）重合体が、ポリ（塩化ビニル）、セルロースアセテ
   ート、ポリ（ビスフェノール−Ａカーボネート）、ポリ
   シロキサン／ポリ（ビスフェノール−Ａカーボネート）
   ブロック共重合体、ポリ（メチルメタアクリレート）、
   ポリ（ビニリデンクロリド）、ポリスチレン、低級アル
   キルアクリレートおよびメタアクリレート重合体および
   共重合体およびポリウレタンよりなる群から選ばれる前
   記特許請求の範囲第１項記載の膜。 ３）重合体がポリ（塩化ビニル）である前記特許請求の
   範囲第２項記載の膜。 ４〕　ポリ（塩化ビニル）がカルボキシル化されている
   前記特許請求の範囲第２項記載の膜。 ５）酵素がウレアーゼであり、そしてイオン発生量がノ
   ナクチンである前記特許請求の範囲第１項記載の膜。 ６）更に可塑剤を包含している前記特許請求の範囲第１
   項記載の膜。 ７）可塑剤がジオクチルアジハートである前記特許請求
   の範囲第５項記載の膜。 ８）カップリング剤を使用してウレアーゼを膜表面に結
   合させた前記特許請求の範囲第５項記載の膜。 ９）カップリング剤がグルグルアルデヒドである前記特
   許請求の範囲第８項記載の膜。 １０）（ａ）　その上に被覆させた寸法が安定で化学的
   に不活性な電気絶縁性基材層 （ｂ）　その上に被懐させた少くとも１Ｘ１０２（オー
   ム−ｃｒｎ）　の伝導度を有する電気伝導性物質の端子
   層 （Ｃ）　その上に被覆させた有機重合体結合剤のマトリ
   クス中に均一に分散させた炭素の微細分割粒子層 （ｄ）　炭素層のインピーダンスよりも少くとも２等級
   大きいインピーダンスを有し、炭素分散層と膜との間の
   界面は該層が一部相互拡散した帯感を構成しておりそし
   てその外側表面に膜が結合している、その中にイオン発
   生団を分散させた疎水性で化学的に不活性の誘電体重合
   体膜 （θ）　非イオン性アナライトと反応してイオン発生団
   とコンプレックスを形成しうるイオンを生成しうる酵素 を包含する、電極半電池。 １１）検知半電池と基準半電池を包含し、そして検知半
   電池が前記特許請求の範囲第１０項定義の半電池であり
   、そして基準半電池が（ａ）その上に被覆させた寸法が
   安定で化学的に不活性な電気絶縁性基材層、 （ｂ）　その上に被覆させた少くともｌＸ１０２（オー
   ム−ｃｍ）−１，の伝導度の電気伝導性物質の端子層、 （ｃ）　その上に被覆させた有機重合体結合剤のマ）　
   ＩＪクス中に均一に分散させた微細分割炭素粒子の層、 （ｄ）　それの外側表面に膜が結合しており、その中に
   イオン発生団を分散させた疎水性で化学的に不活性な誘
   電体重合体膜 （θ）非酵素性蛋白質 を包含しているテスト試料中の非イオン性アナライトを
   電位差測定するための電極全電池。 １２）非酵素蛋白がアルブミンである前記特許請求の範
   囲第１１項記載の全電池。 １３）検知半電池および基準半電池がある距離だけ離れ
   ている関係で同一基材層上に置かれている、前記特許請
   求の範囲第１１項記載の全電池。