JPS606702A - 糖脂質の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、新規な糖脂質に１列する。更に詳しくは、正
常細胞には表現されず、ヒト癌細胞に特異的に表現され
る抗原講造を有するノコガングリオシドの製造法に係る
。 本明細書において、糖質、脂質及びそれらの結合様式等
は、Ｉ　ＵＰＡＣ及びこの種の分野における通称名ある
いは慣用に従い示すっ 細胞の癌化に伴って細胞表層の複合糖質のパターンが変
化することが知られており、これらの糖鎖変化の原因と
して、糖脂質の糖鎖合成不全及び特異な糖鎖］）１造を
有する糖脂質の出現が示唆されている。この癌化に伴い
出現する特異な糖脂質として、ガングリオトリアオシル
セラミド（ｇａｎｇ目−ｏｔｒｉａｏｓｙｌｃｅｒａｍ
ｉｄｅ　；　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　３７．　１３３
３−１３３９　（１９７７）、５ｃｉｅｎｃｅ団、　、
１８７−４８９（１９８１））。 フォルスマン又はＡ様抗原（ｉｉ”ｏｒｓｓｍａｎ　ｏ
ｒ　Ａ−１ｉｋｅａｎｔｉｇｅｎ；　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒ
ｅｓ、　４１．４１８５−４１９０　（１９８１）、’
Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　ｓｃｉ、　ＵＳ
Ａ　７４．３０２３−３０２７（１９７７））、シアロ
シル−Ｌｅ　ガングリオシド（Ｓｉａｌｏｓｙｉ　−Ｌ
ｅａｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ　；　５ｃｉｅｎｃｅ　２
１２゜５３−５４　（１９８１）、同ちユ、５５−５６
　（１９８１）。 Ｆｅｄ、　１）ｒｏｅ、　４１　Ａ　４　、　Ａｂｓｔ
ｒａｃｔ　３６７２．　Ｐ８９８（１９８２））及びＧ
Ｄ、ガングリオシド〔ＧＤ３　ｇａｎｇｌ　１−ｏｓｉ
ｄｅ　；　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１５５．１１３
３−１１４７（１９８２）］が報告されている。 本発明者は、−上記各報告に１′、１連して、種々研究
を重ねた結果、ヒト癌π（０胞から、特定の糖鎖伯考造
全有する新）Ａ７よ糖脂質が分離されること、そしてそ
の糖鎖、１１ｑ造は正ｍ細胞には表現孕れず、ヒト癌細
胞に特異的に表現される抗原４Ｒｍであることを見い出
し、本発明を完成した。 すなわち、本発明はヒト癌細胞由来の次の一般式（１）
、 ＮｅｕＡｃα２−＋　５Ｑａ４β１　→４（ＪｃＮＡｃ
β１−＋　３Ｇａｅβ１（１） 〔式中、Ｇａ、６はガンクトース、Ｇ、ｇＣｊ弘ＣはＮ
−アセチルグルコザミン、Ｆｕｃｉ、ｊ：フコース、Ｇ
−ｅｃハクルコース、ＣＣｒはセラミド、ＮｅｕＡｃは
Ｎ−アセチルノイラミン酸を示す〕 で表わされるフコガングリオシドの製造法忙提供するも
のである。 本范明で得られる（１）式の糖脂質はヒト癌に特異的な
抗原であり、例えばヒトに癌特異的な抗）庄潟免疫を成
立きせる免疫療法剤としであるいはこれを通常の咄乳動
物に投馬してヒト癌に特異的な抗体をｊ’ｊ、’ｙ　（
ｆＤするだめの抗原と１７て有用である。 本発明の’ｌＸ’ｊ脂質（１）は、イ眞々の培養癌細胞
株、手術組織由来−１？１１！（ｎ胞等のヒト癌細１１
：ｕより、常法に従って脂タノｆ成分を分離１−１これ
より当該糖脂質の性質を利用する物理化学的又は生化学
的手段、例えばカラムクロマトグラフィー、薄層クロマ
トグラフィー、ル気泳１助法、透析法、抽出法、分配法
等を単独で又は適宜組合せることにより分離される。 すなわら、上記癌ｉ＜ＩＩＩ胞を］へ当な溶媒、例えば
石油エーテル、リグロイ７、ヘキサン、シクロヘキサン
、ベンゼン、トルエン、デトラヒドロフラン等の炭化水
素系溶媒；クロロホルム、四ｊ算化炭素、ジクロルエタ
ン等のハロゲン化炭化７１溶媒；水、メタ、ノール、エ
タノール、イソプロパツール、ブタ／−ル、エチレング
リコールｙｑ　ｔｖ　フルコ−ル系溶媒；エチルエーテ
ル、ジオキサン等のエーテル系溶媒；アセトン等のケト
ン系ｌ容媒；酢酸、ホルムアミド、酢酸エチル等のカル
ボン酸系溶媒；アセトニトリル、アニリン、ピリジン等
の窒素化合物系溶媒及びそれらの混合溶媒等の一般に脂
質生化学にて頻用される溶媒中にホモジネートシ、趙心
分離等を行って、脂ｔｔｔ成分を該溶媒中に移行させて
抽出する。 該抽出液から本発明の糖脂質を分離するには、モノシア
ロガングリオシドを分離する一般的方法が採用される。 例えばフオルク（ｌｉ’ｏｌｃｈ　）法及びそノスベン
ナーホＡ／　Ａ　（３ｖｅｎｎｃｒｈｏ１ｍ　）変法（
Ａｃｔａ　Ｃｈｅｍ、　５ｃａｎｄ、　１７．２３９−
２５０　（１９７１）。 Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　１９１．８１９−８３
１　（１９５１）参照〕等の溶媒間分配法、濾紙及びカ
ラムクロマトグラフィー〔生化学データブック）、１９
７９年１１月２６日発行、四東京化学同人発行、Ｐ８５
３〜８７３参照〕等により単１÷、（（される。 このようにして得られる糖脂質が前記（Ｉ）式の格造の
ものであることは、ＲＥ値及び後述の試験例から同定さ
れ′た。この糖ｆｌｉｔ質は必要により凍結乾燥して保
存される。 次に実施例を挙げて説明する。 実施例１ （Ｉ）　ヒト肝癌組織（アデノカルシノーマ）　約Ｉ　
Ｐヲイングロパノールーへキーｔｙ’７−水（５５：　
２５：２０）１（１／Ｉでホモジネートし、５０００回
転で３０分遠心する。残渣を再び同一溶媒でホモジネー
トシ、遠心する。遠心上清を合わせ、これに０．２倍散
の水を加え、上層を採取し、窒素雰囲気中で蒸発乾固す
るっ浅漬をメタノール−クロロホルム−水（６０：３（
１：８）３０ｍ６に溶かし、ＤｇＡＥセファデックスＡ
−２５（ファルマシア社）のカラムに注いで吸着させる
。カラムを同溶媒で洗浄後、０．０３Ｍ酢酸アンモニウ
ムで溶出し、溶出液を蒸留水に対して透析したのち、凍
結乾燥してガングリオシドを得る。 ＜２＋＋Ｍ＜して得られたガングリオシドを多孔性シリ
カゲルカラム（ヤトロビーズ６■ζ５−ｓｏｉｏ。 Ｉａｔｒｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｖｉｅｓ　）　を用い
た液体りＣｌマドグラフィー（ｆ（ＰＬＣ）　（Ｖａｖ
ｉａｎ、　ｆ（ＰＬＣ装置、モデル５０２）に付し、イ
ソプロパノールーヘキサン−水（５５：４０：５）／Ｊ
）ら同（５５；２０：２５）の濃度勾配溶出を２００ｍ
１行７

【い、２００分をかけて１００本に分取するつチ
ューブ番号４６〜５０のもの勿採増し−２れを再度篩速
液体クロマトグラフィー（１（ＰＩ、Ｃ）に付し、上記
と四−条件で誤雁勾１己溶出を行ない、１００本に分取
し、チューブ番号４６〜５０のものを採」４ソして、こ
れをフラクションＡ６とする。 次いで、このフジクンヨンＡ６をＨＰＴＩ、Ｃ（ｉ媒ｎ
ｎ−グロバノールー水−２８条アンモニア水溶液＝７：
３：ｌ）に付して４’Ｉ製し、１％ｆ値０．２８〜０．
３１を示すノコガングリオシドを得るっこれは、１３ａ
ｋｅｒ’ｑ　ＨＰＴＬＣプレート、溶媒クロロホルム−
メタノール−水＝６０：４０：９の条件において、Ｉｆ
値＝０．１１〜０．１４を示す。 上記のＨｌ）　Ｔ　Ｌ　Ｃパターンを第１図に示す。第
１図中、囚は展開溶媒としてｎ−ノロパノール−水−２
８チアンモニア水溶液（’７：３：１）を、（Ｃ３）ハ
クロロホルニーメタノールー水（６０：４０；９）を用
いた結果を示す。該図の囚において、各レーンは以下の
通りであるっ レーン１；　上記ＨＰＬＣにおけるチューブ番号３８〜
４５のフラクション。 （主要なバンドａ及び１）は、後記試験例】と同様にし
て解析した結果、ＮｅｕＡＣα１→６　Ｇａｇβｌ→４
　ＧｅｃＮＡ、ｃβ１　→３Ｇａ−６βｌ−＋４Ｇ６ｃ
β１−＋　１ｃｅｒ　［Ｊ。 Ｂｊｏｇ、　ＣＣ１１ｅ、　２５４．８２２３−８２２
９　（１９７９））であると確認した。） レーン６；　一般式（１）のフコガングリオシド。また
同図の（Ｂｌにおいて、各レーンは以下の通りである。 レーン１及び７；　上記）ｉ　１）Ｌ　Ｃにおけるフラ
クション６つ レーン６；　一般式（ＩＩのフコガンクリオシドっ尚、
各バンドは、オルシノール−硫酸法による染色により検
出したつ 実施例２ ヒト大腸癌組織（アデノカルシノーマ；及び培養ヒト癌
細胞（ＫＡ’ｒＯ−１１［；　前癌、　ＱＧ−５６Ｂ肺
癌より、実施例１と同様にして、同一のＲｆ値を有する
フコガングリオシドを得だ。 試験例１ 実施例１で得だフコガングリオシドについて、以上の操
作法により試験した。すなわち、薄層クロマドグ２フイ
ーはＢａｋｅｒ’ｓ　ＨＰＴＬＣプレートを使用して行
った。糖組成及びその結合様式はメチＶ　−−／　Ｅｌ
　７　マナリシス（Ｊ、　１３ｉｏｃｈｅｍ、　５５．
２０５−２０８　（１９６４））によった。シアル酸の
除去は、酵素処理（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐｅｒｆ
ｒｉｎｇｅｎｓｅ　５ｉａｌｉｄａｓｅＨシグマ社３７
℃、６０分）により行ったウシアル酸及びフコシル基の
除去は、０．ＩＮ）’Ｊジクロロ酸にて１００℃、１時
間の処理により行った。エキソ又はエンド−グリコシダ
ーゼによる酵素分解はＪａｃｋ　ｂｅａｎβ−ｇａｌａ
ｃｔｏｓｉｄａｓｅ又はβ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ１１ｅｘ
ｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ　（いずれもシグマ社）を使用
した（　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２４６．２２
７１−２２’１７（１９７１）］　、メチル化は、同線
のトリメチルシリル基を加え、室温で３０分間反応する
ことにより行った。質はスペクトロメトリーはＦｉｎｎ
ｉｇａｗ社の３３００／６１１０型を使用し、温度１４
０℃から２５０℃、エレクトロンエネルギー（ｇｌｅｃ
ｔｒｏｎ　ｅｎｅｒｇｙ）−３５Ｖ、イオンエネルギー
（ｌ０ＩＩ　ｅｎｅｒｇｙ　）　＋６．１ｖ１エミッシ
ョ：ｙ　（ｅｍｉｓｓｉｏｎ　）　０．５ｔｎＡ、感度
１０’Ａ／Ｖで行った。 結果： （１）脱シアル酸後の薄層クロマトグラフィーにより、
Ｙ２糖脂質（Ｖ３ＦｕｃｎＬｃＩＩＣｅｖ　）　［Ｊ、
　Ｂｉｏｌ。 ＣＣ１１ｅ、　２５７．１４８６５−１４８７４　（１
９８２）、Ｂｉｏｃｈｅｍ。 ＢｉｏｐＨｙｓ、　Ｒｅｓ、　（：：ｏｍｍｕｎ、　１
０９．３６−４４　（１９８２）］と近似のＴＬｅモビ
リティを示ずつ ｆ２）　脱シアルｌ′Ｉｉ２後の糖脂質は、Ｘ−ハプテ
ン（Ｇａ（３β１　→４［Ｆｕｃｃｔｌ　−ｈ　３）　
Ｇ、／？ＣＮＡＣβ１−）に対するモノクロナル抗体Ｃ
ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　ｓｃｉ。 ＵＳＡ　７５．５５６５−５５６９　（１９７８））と
は反応せｆ、Ｎ−アセテルラクトザミン、（Ｇａｅβ１
→４ＧＱｃＮＡｃ１１−＋　３ＧａＡβ１−）に対する
モノクロナル抗体ＣＪ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｒｎ、　
２５６．１０９６７−１０９７２（１９８１））と反応
（結合）する。 （３）脱シアル酸後の糖脂質のβ−ガラクトシダーゼ、
次いでβ−Ｎ−アセチルヘキソザミニダーゼ処理により
得らイ１．ろｅＴ脂質は、ラクトーフコペンクオシル（
１）セラミド［Ｇａ［β１→［、Ｆ’ｕｃα１→３）（
ＪｃＮＡｃβ１−＋　３Ｇａ、ｇβ１−＋４（Ｊｃβ３
−＋　ｌＣ６「；Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｃｍ、　２４
６．１１９２−１２００　（１９７１）、１１と同一の
ｒ　Ｌ　Ｃモビリティを示す。 （４）　メチル化後の（ｌτ量スペクトルにより、２．
３．４−　ト　リ　−〇　−メ　チ　／し　−Ｇａ０ｔ
ｔ）　、２．４．６−）　リ　−０−メチル−〇ａｐ　
（２）、２，３．４−）ジーＯ−メチル−Ｆｕｃ（３）
、２．３．６−トリー〇−メチル−〇８Ｃ（４）、３．
６−）−Ｏ−メチル−ＧｅＣＮＡＣメチル（５）及び６
−０−メアルーＧθｃＮＡｃ　メチル（６）がイｒｌＪ
詔きれ（し１２図）、脱フフシル化及び脱シアル酸化後
にメチル化した時の１４量スペクトルでは、２、３．４
．６−テトラ−０−メチルＧａＪｌ？ｆ力、２，３゜６
−トリー〇−メチル−〇−Ｑｃ　（８）、２．４．６−
トリー〇−メチル−ｃａ、ｇ　（９）及び３，６−ジー
０−メチル−Ｇ／ＩＣＮＡＣメチル（ｉｏ＋が確認され
る（第３図）。

【図面の簡単な説明】

第１図は一般式ｍで表わされる本発明フコガングリオシ
ドのＨＰ　Ｔ　Ｌ　Ｃパターンを、第２図は回ガングリ
オシドのメチル化後の質Ｍニスベクトルを、第３図は脱
ノフシル化及び脱シアル酸化の同ガングリオシドのメチ
ル化後の質庚スペクトルを示す。 以上 出に０人　犬塚製系株式会社 ′コ °・′い　−′１ 弁理士　高　町　登志雄、′ ；、・　ｊ １〜震、：・、胃

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　ヒト癌細胞から一般式（ＩＩ ＮｅｕＡｃａ２４６Ｇａ−ｅβ１　→４（ＪｃＮＡｃβ
   １→４ＧＡｃβ１　→ＩＣｅｒ　（１） 〔式中、Ｇａｐはガラクトース、０４）ｃＮＡ　ｃはＮ
   −アセチルグルコサミン、ｌｉ”ｕｃｉｊフフース、Ｇ
   −ｔ３ｃはグルコース、Ｃｅｒはセラミド、ＮｅｕＡＣ
   はＮ−アセチルノイラミン酸を示す〕 で表わされるノコガングリオシドを単離することを特徴
   とする糖脂質の製造法。