JPS6042400A - Monoclonal antibody to human igm - Google Patents

Monoclonal antibody to human igm

Info

Publication number
JPS6042400A
JPS6042400A JP15215683A JP15215683A JPS6042400A JP S6042400 A JPS6042400 A JP S6042400A JP 15215683 A JP15215683 A JP 15215683A JP 15215683 A JP15215683 A JP 15215683A JP S6042400 A JPS6042400 A JP S6042400A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
antibody
cell
cells
strain
igm
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP15215683A
Other languages
Japanese (ja)
Inventor
Masato Sugi
正人 杉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yamasa Shoyu KK
Original Assignee
Yamasa Shoyu KK
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yamasa Shoyu KK filed Critical Yamasa Shoyu KK
Priority to JP15215683A priority Critical patent/JPS6042400A/en
Publication of JPS6042400A publication Critical patent/JPS6042400A/en
Pending legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

NEW MATERIAL:A monoclonal antibody having specificity to human IgM, and specifically linking ability to chain on the surface of B cell. USE:Capable of dyeing specifically B cell clearly without dyeing background by making it with a fluorescent substance or an enzyme, dyeing tissue. Useful for classification and diagnosis of leukemia such as B cell chronic lymphocytic leukemia of cancerated B cell, differential diagnosis for glomerulonepheritis. PREPARATION:A different animal is immunized against IgM purified from human serum, an antibody-producing cell having the immunization is collected, it is fused with a myeloma cell (preferably cell strain of 8-azaguanine resistance) of different animal. An antibody-producing hybridoma having human IgM resistance (e.g., 2C12 strain, or 3F1 strain) is selected from the prepared hydridoma by enzyme linked immuno sorbent assay, and it is cultivated to give the desired antibody.

Description

【発明の詳細な説明】 m化対する単一クローン抗体シこ関するものである。[Detailed description of the invention] The present invention relates to a monoclonal antibody against m.m.

近年、特異性の高い抗体を大型に得る方法として、抗体
産生細胞と骨髄肝細胞を融合し、ハイブリドーマ(融合
細胞)を作製し、これを培養することにより単一クロー
ン抗体を生産する方法が知うレ(ミルシュタインら、N
attire、Vol、 256 +p495(197
5〕)、多数の単一クローン抗体が取得されている。
In recent years, a method to produce a single clone antibody by fusing antibody-producing cells with bone marrow hepatocytes to create hybridomas (fused cells) and culturing them has become known as a method for obtaining large-scale highly specific antibodies. Ure (Milstein et al., N.
attire, Vol, 256 +p495 (197
5]), a large number of monoclonal antibodies have been obtained.

抗体産生細胞は、幹細胞→プレB細胞→B細胞−艷活性
化B細胞−艷抗体産生細胞(形質細胞)と分化する。こ
の過程で、プレB細胞ではIgMのII 1M(μ鎖)
が細胞質内て合成され、B細胞にな、ると細胞表面に1
gM分子を保有するようになる。抗原刺激を受けたB細
胞は、活性化B細胞になり、さらに抗体産生細胞へ分化
し、IgM 、IgG 、 IgA 。
Antibody-producing cells differentiate into stem cells, pre-B cells, B cells, activated B cells, and antibody-producing cells (plasma cells). During this process, in pre-B cells, IgM II 1M (μ chain)
is synthesized in the cytoplasm, and when it becomes a B cell, 1 is deposited on the cell surface.
Comes to possess gM molecules. B cells that receive antigen stimulation become activated B cells, which further differentiate into antibody-producing cells, such as IgM, IgG, and IgA.

■g星などの抗体を分泌する・ようになる。したがって
、蛍光物質もしくは酵素などで標識した抗IgMことが
できる。さらに、糸球体腎炎の患者では、腎臓に免疫グ
ロブリンが免疫複合体として沈着1することが認められ
、”IgAが沈着するIgA腎症や、門 IgG 、 Igilが沈着する場合も知られている。
■ Secretes antibodies such as g-star. Therefore, anti-IgM labeled with a fluorescent substance or an enzyme can be used. Furthermore, in patients with glomerulonephritis, immunoglobulins are deposited as immune complexes in the kidneys, and cases of IgA nephropathy in which IgA is deposited, as well as cases in which phylum IgG and Igil are deposited, are also known.

このような糸球体腎炎の鑑別診断にも抗1gM抗体は使
用することができる。
Anti-1gM antibodies can also be used in the differential diagnosis of such glomerulonephritis.

しかしながら、ヒトIgMを異種動物に免疫して得られ
た抗血清では、IgMに対する特異性に問題があり、B
細胞を特異的に染色することは困難てあった。
However, antiserum obtained by immunizing a foreign animal with human IgM has a problem with its specificity for IgM, and
It has been difficult to specifically stain cells.

ヒトIgMに対する単一クローン抗体につ0てit、T
Kuri’tani らなとに報告され(ユEXp、 
Mjd、、 VO1155、p839(1982))、
数社から市販されている。しかしながら、これらの単一
クローン抗体はIgMに対する特異性に関しては優れて
Ilするが、B細胞の組織染色において′は、非特異的
な結合を生してバックグランドまで染色するなどの欠点
を有し、満足できるものではなかった。
0it, T for monoclonal antibodies against human IgM
Kuri'tani was reported to Nana (YuEXp,
Mjd,, VO1155, p839 (1982)),
It is commercially available from several companies. However, although these monoclonal antibodies have excellent IgM specificity, they have drawbacks in tissue staining of B cells, such as nonspecific binding and background staining. , was not satisfactory.

本発明は、このような技術背景のもとに完成されたもの
であり、IgMに対して特異性を有し、B細胞表面上の
μ鎖と特異的な結合能を有する単一クローン抗体を提供
するものである。
The present invention was completed based on this technical background, and is a single clone antibody that has specificity for IgM and has the ability to specifically bind to the μ chain on the surface of B cells. This is what we provide.

本発明抗体は、IgMに対して特異性を有・し、かつB
細胞表面上においてμ鎖に特異的な結合能を有するとい
う特性を兼備するものである。したがって、本発明抗体
を蛍光物質もしくは酵素などで標識して組織染色に用い
れば、B細胞表面にお0て非特異的な結合を生ぜず、ノ
くツクグランドが染色しないので、明瞭なり細胞の特異
的染色が可能である。このように、本発明抗体はB細胞
のμ鎖と特異的に結合を有することから、リンパ節等の
組織においてB細胞領域を特異的か゛つ明瞭に染め分け
ることができるなど、前述した抗1gN抗体の有用性に
おいてずくれた効果を達成するものである。
The antibody of the present invention has specificity for IgM and
It has the property of having specific binding ability to μ chain on the cell surface. Therefore, if the antibody of the present invention is labeled with a fluorescent substance or an enzyme and used for tissue staining, it will not cause non-specific binding on the surface of B cells and will not stain the cells. Specific staining is possible. As described above, since the antibody of the present invention specifically binds to the μ chain of B cells, it is possible to specifically and clearly stain B cell regions in tissues such as lymph nodes. This achieves an extraordinary effect on the utility of antibodies.

本発i抗体の調製法、調製形態については特に限定され
ず、目的に応して適宜に選択されるべきである。本発明
抗体を産生ずるハイブリドーマは一般の細胞融合法を応
用して得る2ことがてき−る。
The preparation method and preparation form of the i-antibody of the present invention are not particularly limited, and should be appropriately selected depending on the purpose. Hybridomas producing the antibodies of the present invention can be obtained by applying general cell fusion methods.

このような細胞融合法について説明すれば次のとおりで
ある。
This cell fusion method will be explained as follows.

■ 抗体産生細胞の調製 抗体産生細胞の調製は、ヒト血清より精製したヒトIg
−をマウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ウシ、な
どの異種動物に免疫し、その免疫を獲得した肺細胞、胸
腺細胞゛、リンパ節細胞および/または末梢血細胞の抗
体産生細胞を取得することにより行う。
■ Preparation of antibody-producing cells Antibody-producing cells are prepared using human Ig purified from human serum.
- immunizing xenobiotic animals such as mice, rats, rabbits, sheep, horses, and cows, and obtaining antibody-producing cells such as lung cells, thymocytes, lymph node cells, and/or peripheral blood cells that have acquired the immunity. This is done by

■ ミエローマ細胞の調製 ミエローマ細胞としては、マウス、ラット、ウサギ、ヒ
トなとの種々の動物の細胞株を適用できる。使用する細
胞株は、好ましくは薬剤紙 〈抗性のものであり、未融
合の状態では選択培地で生存できず、融合した状態て生
存てきる性質を自するものであることが好ましい。最も
普通に用いられるのは、8−アザグアニン抵抗性の細胞
株であり、これはヒボキサンチン・ホスホリボメルト5
 ンス7 x 5− セ(hypoxanthi、ne
phospboribosyl transferas
e )を欠損し、ヒボキサンチン アミノプテリン チ
ミン゛ン(HAT )培地に生育てきない性質を有する
。また、いゎ (ゆる1非分泌型」の細胞株であること
が好ましい。このような細胞株の具体例としては、マウ
スミエローマ・M OP C−2,1ライン由来のPB
/X 68−Ag’8 Ul (PBUI)、Pg/ 
X 68. Ag8 6 5 ・ 3 (X 68 6
 ・ 5 8 )、P8/NSI−1−Ag4−NSl
−1−A、S、 210−Ag14 (SF3)、ラッ
トミエローマ21゜RCY8 Ag1・2・8 (Y8
・Ag 1.23 ) 、 ヒ ト ミ エ ロ −マ
 [1−266,−API 。
■ Preparation of myeloma cells As myeloma cells, cell lines of various animals such as mouse, rat, rabbit, and human can be used. The cell line used is preferably one that is resistant to drug paper, and has the property that it cannot survive in the selective medium in an unfused state, but can survive in a fused state. The most commonly used are 8-azaguanine-resistant cell lines, which are treated with hyboxanthin phosphoribomel 5.
hypoxanthi, ne
phospboribosyl transferas
e), and has the property of not being able to grow on hypoxanthine aminopterin thymine (HAT) medium. In addition, it is preferable that the cell line be a ``Yuru-1 non-secreting type'' cell line.A specific example of such a cell line is PB derived from the mouse myeloma MOP C-2,1 line.
/X 68-Ag'8 Ul (PBUI), Pg/
X 68. Ag8 6 5 ・ 3 (X 68 6
・58), P8/NSI-1-Ag4-NSl
-1-A, S, 210-Ag14 (SF3), rat myeloma 21°RCY8 Ag1・2・8 (Y8
・Ag 1.23), human myeloma [1-266,-API.

GM1500などを挙げることかできる。GM1500 can be mentioned.

D 細胞融合 細胞融合は、イーグル最少基本培地(MEM )、RP
MI 1640なとの動物細胞培養用培地中で107−
108のミエローマ細胞と抗体産生細胞を混合比1:4
〜10て混合して行う。融合促進剤としては平均分子m
 1000〜6000のポリエチレングリコロール(P
EG)をはしめ、ポリビニルアルコール、ウィルスなと
か使用される。
D Cell fusion Cell fusion is carried out in Eagle's minimal essential medium (MEM), RP
107- in animal cell culture medium such as MI 1640.
108 myeloma cells and antibody-producing cells at a mixing ratio of 1:4
Mix for ~10 minutes. As a fusion promoter, the average molecule m
1000-6000 polyethylene glycol (P
EG), polyvinyl alcohol, and viruses are used.

リ 選択培地におけるハイフリト−マの選別細胞融合処
理後の細胞からハイブリドーマを選別するには選択培地
における選択的増殖により行う。たとえば、細胞を15
%ウノ胎児血清含イT RP M I’ 164047
:地なとて適当に希釈し、マイクロタイタープレー 1
・上に105〜106/ウエル程度にまき、各ウェルに
選択培地(たとえば、HAT培地なと)を加え、以後適
当に選択培地を交換して培養する。たとえばミエロ−マ
細胞として8−アザグアニン抵抗性株、選択培地として
HAT培地を用いれば、未融合のミエローマ細胞は培養
10日1くらいまでに死滅し、また正常細胞である抗体
産生細胞も 1nvitroでは長期間生育てきない。
Selection of hybridomas in a selective medium Hybridomas are selected from cells after cell fusion treatment by selective growth in a selective medium. For example, 15 cells
% Uno Fetal Serum Contains TRP MI' 164047
: Properly dilute and use microtiter plate 1
- Sprinkle the cells at a density of about 10 5 to 10 6 per well, add a selective medium (for example, HAT medium) to each well, and then culture by replacing the selective medium appropriately. For example, if an 8-azaguanine-resistant strain is used as myeloma cells and HAT medium is used as the selective medium, unfused myeloma cells will die within about 10 days of culture, and antibody-producing cells, which are normal cells, will also die for a long time in vitro. It cannot grow for a period of time.

したがって1、培養10〜14日目から生育してくる細
胞はすべてハイブリドーマとなる。
Therefore, 1. All cells that grow from day 10 to 14 of culture become hybridomas.

6)抗ヒトIgM抗体産生ハイブリドーマの検索抗ヒト
IgM抗体産生ハイブリドーマの検索は、酵素免疫測定
法(Enzyme Linked 1nnnun。
6) Search for anti-human IgM antibody-producing hybridomas Search for anti-human IgM antibody-producing hybridomas by enzyme immunoassay (Enzyme Linked 1nnnn).

3prbe’nt As5ay 、E L I S A
 )によって行った。
3prbe'nt As5ay, E L I S A
).

′ ヒ ずなわち、陣ト血liVより精製したIgM、または・
N髄肺患者血inより精製したIgMを予め10〜10
0μ9 / mlにりん酸緩衝生理食塩水(PBS)、
炭酸水素ナトリウム(pll 8.0 )なとの緩衝液
Iζ溶解させ、E L I S A /Lノポリ塩化ビ
ニル(PVC)なとのソフトプレート(96穴) ニ5
0 IJずつ添加し、4°Cて〜晩装置する。次に上記
抗原を捨て、PBSて洗浄後、196ウシ血清アルブミ
ン(BSA)含有PBSを加えて室温て1時間静置し、
抗原の結合していない部位をBSAでブロックする。ハ
イブリドーマの上l青を50μγ ずつ加え、室温で1
時間放置し、PBSて8回洗浄する。次に抗マウスイム
ノグロブリン抗血清(第2抗体)をビオチン化したもの
を加え、室温で1時間放置する。PBSで8回洗浄後、
アビジンD−酵素結合体を加え、室温で15分間静置す
る。PE3Sで4回洗浄後、酵素の基質を°加えて発色
させる。
'IgM purified from human blood liV, or
IgM purified from N-pulmonary lung patient blood in advance was 10 to 10
0μ9/ml phosphate buffered saline (PBS),
Dissolve sodium bicarbonate (pll 8.0) in buffer solution Iζ and place on a soft plate (96 wells) with polyvinyl chloride (PVC).
Add 0 IJ in increments and incubate at 4°C for ~night. Next, the above antigen was discarded, and after washing with PBS, PBS containing 196 bovine serum albumin (BSA) was added and left at room temperature for 1 hour.
Block the non-antigen binding sites with BSA. Add 50μγ of the upper half of the hybridoma and let it cool at room temperature.
Leave for an hour and wash 8 times with PBS. Next, biotinylated anti-mouse immunoglobulin antiserum (second antibody) is added and left at room temperature for 1 hour. After washing 8 times with PBS,
Add avidin D-enzyme conjugate and let stand at room temperature for 15 minutes. After washing four times with PE3S, an enzyme substrate is added to develop color.

抗原と結合力のある抗体を産生じている培養上清を加え
たウェルは、以」二の操作で容易に判別でき、ハイブリ
ドーマの検索を行うことかできる。
Wells to which culture supernatant producing antibodies with antigen-binding ability have been added can be easily identified by the following two operations, and hybridomas can be searched for.

■ クローニング 各ウェル中には2種以上のハイブリドーマがlイ′ 生育している可能性があるので、限界希釈法なとにより
クローニングを行い、単一クローン抗体産生ハイブリド
ーマを取得する。
(2) Cloning Since there is a possibility that two or more types of hybridomas are growing in each well, cloning is performed by a limiting dilution method or the like to obtain a single clone antibody-producing hybridoma.

■ 抗体の生産 最も純粋な単一クローン抗体は、その産生ハイブリドー
マを10〜15%ウシ胎児血清含自RP tvl I 
1640培地なとの動物細胞培養用培地で培養し、その
培養上清液から得゛ることかてきるー。その細胞培養法
および条件は、通隼の動物細胞培養法のものを適宜に応
用すればよい。
■ Production of antibodies The purest single-clonal antibodies are produced by hybridomas containing 10-15% fetal bovine serum.
It can be obtained from the culture supernatant by culturing it in an animal cell culture medium such as 1640 medium. The cell culture method and conditions may be appropriately adapted from the animal cell culture method of Tsuyoshi Hayabusa.

一方、さらに大量に抗体を生産する方法として、ハイブ
リドーマの親ミエローマ細胞の由来動物と同系動物にブ
リスタン(2,6,10,l 4−テトラメチルベンタ
テカン)なとの鉱物浦を腹腔内に投!りした後、ハイブ
リドーマを腹腔内投!j、 して大量に増殖させる方法
を採用することかできる。ハイフリトーマは10〜18
ト1はとて腹水肺癌を形成し、血清および腹水中に高濃
度(約1〜20 mg / rn()の抗体が生産され
る。精製を必すとする場合には、腹水を硫安分画後、D
EAE セルロτスイオン交換クロマトグラフィー、ヒ
I・IgMを結合させたセファロース4Bなとを用いた
アフイニテイ力ラムクロマトグラフイ−1分子ふるいカ
ラムクロマトグラフィーなどによって精製することによ
り目的を達することができる。
On the other hand, as a method for producing antibodies in even larger amounts, a mineral containing bristan (2,6,10,l 4-tetramethylbentatecan) was intraperitoneally administered to an animal syngeneic with the animal from which the parent myeloma cells of the hybridoma were derived. ! After that, the hybridoma was injected intraperitoneally! j. It is possible to adopt a method of multiplying them in large quantities. High fritoma is 10-18
1 forms ascites lung cancer, and high concentrations of antibodies (approximately 1 to 20 mg/rn) are produced in serum and ascites. When purification is necessary, ascites is fractionated with ammonium sulfate. After, D
The purpose can be achieved by purification by EAE cellulose ion exchange chromatography, affinity column chromatography using Sepharose 4B bound with human I/IgM, single molecule sieve column chromatography, and the like.

本発明抗体を生産するに好適なハイブリドーマの例とし
て、2012株、8F1株、4!(7株などが取得され
ている。
Examples of hybridomas suitable for producing the antibody of the present invention include the 2012 strain, the 8F1 strain, and the 4! (7 shares etc. have been acquired.

以下、これらのハイブリドーマの調製法と、それらから
生産される本発明抗体の性質についてより具体的な説明
を加える。
More specific explanations will be given below regarding the preparation method of these hybridomas and the properties of the antibodies of the present invention produced therefrom.

!、 ハイブリドーマの取得 ヒトIgM (11+1g/*/)を生理食塩水に溶解
させ、完全フロインドアジュバント、と1:1で混合し
てエマルジョンとしたものを、BALB/Cマウス(雌
、6週令)に2週問おきに数回50μ9/bead 腹
腔内投勾し、最後に80μgを静注しノこ。
! , Obtaining hybridomas Human IgM (11+1 g/*/) was dissolved in physiological saline and mixed 1:1 with complete Freund's adjuvant to form an emulsion, which was given to BALB/C mice (female, 6 weeks old). Inject 50μ9/bead intraperitoneally several times every two weeks, and finally inject 80μg intravenously.

最終免疫から3日後にマウスの牌細胞を取り出し、ME
Mて洗浄した。マウスミエローマP3tJlをMEMで
洗浄し、牌細胞とpBulを10:1て混合して遠心後
、ペレットに50%PEG1000MEM溶液IIII
tを徐々に加えて細胞融合を?jわせた。さらにMEM
溶液を徐々に加え、最終的に10m1とした。再び遠心
し、ペレットを15%ウシ胎児血清含有RPM I 1
640培地にp8u、として1 x 105cel11
0.1m/とナルヨウニ懸濁させ、96ウエルマイクロ
プレートに0.1肩lずつまいた。
Three days after the final immunization, mouse tile cells were removed and ME
Washed with M. Wash mouse myeloma P3tJl with MEM, mix tile cells and pBul at 10:1, centrifuge, and add 50% PEG1000 MEM solution III to the pellet.
Cell fusion by gradually adding t? I made it. More MEM
The solution was added gradually to a final volume of 10 ml. Centrifuge again and transform the pellet into RPM I1 containing 15% fetal bovine serum.
640 medium as p8u, 1 x 105cell11
The suspension was suspended at a concentration of 0.1 m/l and spread onto a 96-well microplate in 0.1 l portions.

1日後、HA T培地を0.1 mtずつ添加し、その
後3〜4日ごとに培地の半分量を新しいHATのウェル
で1ハイブリドーマの生育が認められた。
One day later, 0.1 mt of HAT medium was added, and then half the amount of the medium was added every 3 to 4 days to a new HAT well, and growth of one hybridoma was observed.

ハイブリドーマが生育してきたウェルの上lnsewm
gssg+a’ssg+sasigsggs*awsa
m■1111WIWIIIIIWII5oμlずっをそ
れぞれ予めヒト夏gMでコートした・96穴ソフトブレ
ーゝトに添加した。アビジンD〜酵素結合体としてアビ
ンンD−ペルオキシダーゼ(バクターン1製)、基質お
よび発色剤として過酸化水素、4−アミノアンチピリン
、フエノー−レを用いて前記したEL I SA法ζこ
より、ヒトIgMとは反応するが。
Above the well where hybridomas have grown
gssg+a'ssg+sasigsggs*awsa
Five microliters of m1111WIWIIIWII were each added to a 96-well soft plate previously coated with Human Summer gM. From the ELISA method ζ described above using avidin D-peroxidase (manufactured by Bactane 1) as the avidin D-enzyme conjugate and hydrogen peroxide, 4-aminoantipyrine, and phenol as the substrate and coloring agent, what is human IgM? I will react though.

ヒトIgGとは反応しないものを選び、限界希釈法によ
りクローニングを行った。
One that did not react with human IgG was selected and cloned using the limiting dilution method.

その結果、ヒ)IgMに特異性を有する抗体を産生ずる
ハイブリドーマ2 C1lid、8 F la。
As a result, hybridomas 2 C1lid and 8 Fla produced antibodies with specificity for human IgM.

4H7株を取得した。4H7 strain was obtained.

■、 単一クローン抗体の生産 バイブリド−゛72012株、8F1株、4H7株をそ
れぞれ15%ウシ胎児血清含有RPM11640培地て
96ウエルプレート、25cmフラスコ、75c4フラ
スコとスケールアップしなから゛培養し、培養上清を集
めて単一クローン抗体を調製した。
③ Production of single clone antibodies Hybrid strains 72012 strain, 8F1 strain, and 4H7 strain were each cultured in RPM11640 medium containing 15% fetal bovine serum in a 96-well plate, 25 cm flask, and 75c4 flask without being scaled up. Supernatants were collected and monoclonal antibodies were prepared.

m 抗体のサブクラスの決定 96穴ソフトマイクロプレートに各単一クローン抗体を
コードン、1%BS、A含有PBSでブロッキングした
後、MONOAB I D EIAKIT(ZYMED
社製)により抗1gA抗体、抗1gG1抗体、抗1gG
2a抗体、抗IgG2b抗体、抗IgG3抗体、抗Ig
M抗体との反応をみて、各単一クローン抗体のサブクラ
スを決定した。
m Determination of antibody subclass After blocking each single clone antibody in a 96-well soft microplate with PBS containing codon, 1% BS, and A, MONOAB ID EIAKIT (ZYMED
anti-1gA antibody, anti-1gG1 antibody, anti-1gG
2a antibody, anti-IgG2b antibody, anti-IgG3 antibody, anti-Ig
The subclass of each single clone antibody was determined by observing the reaction with M antibody.

またし鎖の抗帆抗体、抗λ抗体との反応性を調へてタイ
プを決定した。
The type was determined by examining the reactivity of the chain with anti-sail and anti-λ antibodies.

この結果、2C12株の産生ずる抗体はG21)′/′
代、3F1株および4 H7株の産生ずる抗体はIgG
1/にであることが判明した。
As a result, the antibody produced by the 2C12 strain was G21)'/'
The antibodies produced by the 3F1 strain and 4H7 strain are IgG.
It turned out to be 1/.

1■、抗体の特異性 ヒト゛j1髄腫蛋白質を精製し、それぞれ100メ llり/weにして50111ずつマイクロタイターブ
ーレートにコ〜 トシた。次に本発明抗体(1/1g/
It) 501t(lを加え、洗浄後、それぞれの抗原
への結合性をEL I SA法により検討した。
1. Specificity of Antibody Human J1 myeloma protein was purified and coated in 50111 microtiter plates at 100 ml/we each. Next, the antibody of the present invention (1/1g/
It) 501t (l) was added, and after washing, the binding to each antigen was examined by ELISA method.

その結果、第1表に示したように、本発明抗体は、Ig
Mとのみ結合し、他のクラスの免疫クロプリンおよび免
疫グロブリント−鎖とは全く反応しないことか確かめら
れた。
As a result, as shown in Table 1, the antibody of the present invention
It was confirmed that it binds only to M and does not react at all with other classes of immunocropurins and immunoglobulin complex chains.

第1表 V 抗体の力価 2012株の培養土清中の抗体の力価をELISA法に
より測定した結果、8000てあった。
Table 1 V Antibody titer The antibody titer in the culture soil of strain 2012 was measured by ELISA and was found to be 8,000.

なお、力価は、固定化された抗原に対して十分蹴の抗体
が存在する試料についてEL I SA法により得られ
た吸光度を100%とし、その値の50%をりえる抗体
試料の原液からの希釈倍率で表わした。
In addition, the titer is calculated from the stock solution of the antibody sample that exceeds 50% of the absorbance obtained by ELISA method for a sample in which there is a sufficient amount of antibody against the immobilized antigen as 100%. It is expressed as a dilution ratio.

この際のノジ価測定曲線は第1図のとおりてあった。対
照として市販のヒトIgMに対する単一クローン抗体と
比較した。第1図から明らかなように本発明抗体は、市
販品に比べ抗体過剰領域での吸光度の値が高かったー。
The nozzle value measurement curve at this time was as shown in FIG. As a control, a commercially available single clone antibody against human IgM was compared. As is clear from FIG. 1, the antibody of the present invention had a higher absorbance value in the antibody-excess region than the commercially available product.

このことは1gM1分子あたりに結合する単一クローン
抗体の量が多いことを示している。
This indicates that the amount of monoclonal antibody bound per 1 gM molecule is large.

■0本発明抗体による組゛織染色 ヒト肺臓をTi5sue−T E K I lこより固
定した後、クリオスタットにより切片標本を作製した。
(2) Tissue staining with the antibody of the present invention Human lungs were fixed using Ti5sue-TEK Il, and sections were prepared using a cryostat.

これらの切片標本を本発明抗体を用いてビオチン−アビ
ジノ系により染色した。
These section specimens were stained with the biotin-avidino system using the antibody of the present invention.

すなわち、切片標本をPBS (0,OIM、pH7,
2yにて、−次抗体として本発明抗体(2C12株由来
)と40分間、87°Cでインキュベーションした。そ
の後、再度洗浄した後、二次抗体として抗マウスIgG
ビオチン標識抗体(TAGO社)を同様に反応させた。
That is, section specimens were soaked in PBS (0, OIM, pH 7,
At 2y, the cells were incubated with the antibody of the present invention (derived from 2C12 strain) as a secondary antibody for 40 minutes at 87°C. After that, after washing again, anti-mouse IgG was used as a secondary antibody.
A biotin-labeled antibody (TAGO) was reacted in the same manner.

さらに再度、洗浄後、−一5iiaii−フルオレイセ
イン標識アビジン(E、Yラボラトリーズ社、以下1−
F、 I ’I’ CJという)と゛同様に反応させ、
これを洗浄したものをグリセリンにて封入し、染色標本
を作製した。
Furthermore, after washing again, -15iiiaii-fluorescein-labeled avidin (E, Y Laboratories, hereinafter 1-
F, I 'I' CJ).
The washed specimen was sealed in glycerin to prepare a stained specimen.

これらの標本を蛍光顕微鏡により検鏡した。These specimens were examined using a fluorescence microscope.

次に同様の方法により糸球体腎炎患者の腎臓の組織染色
を行った。結果は、写IX2に示したとおり、IgM抗
体が沈着してい4部分が染色された。
Next, tissue staining of the kidney of a patient with glomerulonephritis was performed using the same method. As a result, as shown in Photo IX2, IgM antibodies were deposited and 4 areas were stained.

さらに、蛍光標識したB細胞をサイトフローメトリーに
より、分別定■することも可能である。すなわち、ヒト
末梢血液よりフィコール法によりリンパ球画分を調製し
、本発明抗体(2C12株Iこより産生されたもの)と
45分インキュベーションした後、3同洗浄し、抗マウ
ス免疫グロブリンFITCと45分インキュヘンヨンL
、FAC3IV (ベクi・ン・デッキンソン社製)で
解析した。
Furthermore, it is also possible to separate and identify fluorescently labeled B cells by cytoflowmetry. Specifically, a lymphocyte fraction was prepared from human peripheral blood by the Ficoll method, incubated with the antibody of the present invention (produced from 2C12 strain I) for 45 minutes, washed 3 times, and incubated with anti-mouse immunoglobulin FITC for 45 minutes. Inkyuhenyon L
, FAC3IV (manufactured by Baekhyun Dickinson).

その結果、ll]−細胞は5〜20%の値を小し、゛ 
2 13細胞マーツノ−9LEU ll1l(ベクトン・デ
ツキンソンネj製)で測定したB細胞の、割合と良い相
関かみられた。
As a result, ll]-cells decrease the value by 5-20%,
A good correlation was observed with the proportion of B cells measured with 213 cells Martuno-9LEU 111 (manufactured by Becton Detskinsonnej).

【図面の簡単な説明】[Brief explanation of the drawing]

゛第1図は、本発明抗体の力価測定曲線である。 写真lは、本発明抗体を用いて組織染色したヒi・肺臓
標本の顕微鏡写真図である。写真2は、同しく糸球体腎
炎患者の腎臓標本の顕微鏡写真図である。 特許出願人 (677)ヤマサ醤浦t1、式会月¥Wt
図 徂優獣野牛家借午 手続補正書(方式) 昭和59年 8月23日 1、 事件の表示 昭和58年特許願第152156号 2、 発明の名称 ヒl−1gM に対する単一クローン抗体8、 補正を
する者 事件との関係 特許出願人 住所 千葉県銚子市新生町2丁目10番地の14、補正
命令の日イ=1 昭和59年7月11日 (昭和59年7月81日発送) 5、 補正の対象 明細書の図面の簡単な説明の欄、および図面6、 補正
の内容 l)明細書第17頁第16〜19行目の図面の簡単な説
明の欄における「写真lは、・・・・(中略)・・・・
顕微鏡写真・図である。」の記載を削除する。 −2)図面から写真1および2を削除する。 8)“別紙のとおり参考写真を提出する。
゛Figure 1 is a titration curve of the antibody of the present invention. Photo 1 is a micrograph of a human lung specimen tissue-stained using the antibody of the present invention. Photo 2 is a microscopic photograph of a kidney specimen from a patient with glomerulonephritis. Patent applicant (677) Yamasa Shoura t1, ceremony month ¥ Wt
Amended Procedures for the Lease of the Wild Ox House (Method) August 23, 19801, Case Description 1982 Patent Application No. 1521562, Name of the Invention Single Clone Antibody against Hili-1gM 8, Relationship with the case of the person making the amendment Patent applicant address: 14-2-10 Shinseicho, Choshi City, Chiba Prefecture Date of amendment order: 1 July 11, 1980 (Shipped on July 81, 1980) 5 , the column for a brief explanation of the drawings of the specification to be amended, and Drawing 6, Contents of the amendment l) In the column for the brief explanation of the drawings on page 17, lines 16 to 19 of the specification, ``Photo 1 is... ...(omitted)...
This is a microscopic photograph/diagram. ” will be deleted. -2) Delete photos 1 and 2 from the drawing. 8) “Submit a reference photo as shown in the attached sheet.

Claims (1)

【特許請求の範囲】 ヒトIgMに対して特異性を有し、B細胞表面上におい
てμ鎖に特異的な結合能を有する単一クロー ン抗体。 。
[Scope of Claims] A single clone antibody that has specificity for human IgM and has the ability to specifically bind to μ chain on the surface of B cells. .
JP15215683A 1983-08-19 1983-08-19 Monoclonal antibody to human igm Pending JPS6042400A (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP15215683A JPS6042400A (en) 1983-08-19 1983-08-19 Monoclonal antibody to human igm

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP15215683A JPS6042400A (en) 1983-08-19 1983-08-19 Monoclonal antibody to human igm

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPS6042400A true JPS6042400A (en) 1985-03-06

Family

ID=15534243

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP15215683A Pending JPS6042400A (en) 1983-08-19 1983-08-19 Monoclonal antibody to human igm

Country Status (1)

Country Link
JP (1) JPS6042400A (en)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0161596U (en) * 1987-10-09 1989-04-19
US6335175B1 (en) 1997-07-29 2002-01-01 Sumitomo Electric Industries, Ltd. Anti-human pre-B cell receptor antibody
WO2010026758A1 (en) 2008-09-05 2010-03-11 積水メディカル株式会社 Monoclonal antibody, and immunoassay using same

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS=1982 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0161596U (en) * 1987-10-09 1989-04-19
US6335175B1 (en) 1997-07-29 2002-01-01 Sumitomo Electric Industries, Ltd. Anti-human pre-B cell receptor antibody
WO2010026758A1 (en) 2008-09-05 2010-03-11 積水メディカル株式会社 Monoclonal antibody, and immunoassay using same
EP3056517A1 (en) 2008-09-05 2016-08-17 Sekisui Medical Co., Ltd. Monoclonal antibody and immunoassay using the same

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4350683A (en) Antibody production from hybrid cell line
JPS59157569A (en) Two section immunity test method using single clone antibodyof different section or lower section and test kit thereof
JPH09294584A (en) Monoclonal antibody against human tumor necrosis factor
JPS6317688A (en) Human-human hybridoma, production thereof and monoclonal antibody produced by said hybridoma
JPS6229972A (en) Production of rabbit monocronal antibody, cell system used therein and antibody produced thereby
JP5903381B2 (en) Anti-FDP monoclonal antibody, reagent and reagent kit for FDP measurement using the same, and FDP measurement method
CA1225608A (en) Monoclonal antibody to cardiac myosin heavy chain
JPS60228421A (en) Monoclonal anti-human-igg antibody and its preparation
JPS6042400A (en) Monoclonal antibody to human igm
CA1231067A (en) Monoclonal antibody to peroxidase and hybridoma producing it
JP2006105633A (en) D-dimer measuring reagent, and monoclonal antibody used in same
EP0205352A2 (en) Monoclonal anti-human IgG4 antibodies, their production and use
EP0428485A1 (en) Novel antiidiotypic monoclonal antibodies
JPH05176790A (en) Monoclonal antibody to brain myosin
FI93469B (en) Method for producing a hybridoma cell line and monoclonal antibody produced by it
Cucina et al. Hybridoma monoclonal antibodies to human fetal haemoglobin
JPH0320240B2 (en)
JPS61126100A (en) Anti-tdt-monoclonal antibody and preparation thereof
JPS6051121A (en) Monoclonal antibody, its preparation and its use
CN112094345A (en) Monoclonal antibody of mouse anti-immunoglobulin associated beta CD79b capable of being applied to tumor cell capture
JPH0458960B2 (en)
JPS60188327A (en) Monoclonal antibody against swine insulin and human insulin and its preparation
JPS60115530A (en) Monoclonal anti-g3m(21) antibody, and hybridoma capable of producing the same
JPS60204726A (en) Anti-human prolyl hydroxylase antibody
JPS61254529A (en) Production of helper t cell factor having antigenic specificity