JPS6030518B2 - グルコ−ス濃度の測定方法及び試験具 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 糖の摂取を規制するために食事をコントロールしなけれ
ばならず、またこの点に関して尿中のグルコースを規則
的にチェックして指導を受けなければならない糖尿病患
者にとって、体液中のグルコースの検出並びにその濃度
の測定は極めて重要である。

尿中のグルコースのの測定は、多数の人々を検査して糖
尿病の発生を知る上にも重要である。早期診断及び継続
コントロールは糖尿病において極めて重要であるので、
大変有意義なグルコ−ス試験は、好都合に速やかに行な
われなければならず、技術者または患者が容易に覚える
ことができる程簡単でなければならず、臨床医または患
者に役立つことができる程精密でなければならず、患者
の症状の変動を反映するのに充分鋭敏でなければならず
、さらにグルコースに対して特異的でなければならない
。

現在では有用な精巧生化学系が存在しており、この生化
学系は乾式浸債−議取り試薬ストリップ試験臭に混入可
能なものである。

また前記生化学系は溶液法あるいは懸濁液法において、
または分光法及び他の論取り系との組合わせにおいて使
用される。これらストリップは、酵素試験組成物が含浸
された担体部分を一端に有するプラスチックストリップ
から成り、前記酵素試験組成物は主要活性成分として酵
素のグルコースオキシダーゼ及びベルオキシダーゼ並び
に１つあるいはそれ以上の指示薬化合物を含むものであ
る、反応が起こる位置には、反応体のｐＨを所定ｐＨ範
囲に保持するため、緩衝剤を含ませることもできる。

ストリップには酵素系を利用して、この酵素系の場合、
グルコースがグルコースオキシダーゼの基質となってい
る。グルコースはグルコン酸に酸化され、同時に過酸化
水素を生成する。存在する指示薬化合物は、過酸化水素
及びベルオキシダーゼの存在で変色する。「ベンジジン
型一色原体、例えばペンジジン、ｏ−トリジン及びテト
ラメチルベンジジン及び置換ァニリン色原体を含め、種
々の指示薬を使用することができる。また複合指示薬を
利用することもできる。前記グルコース酵素試験ストリ
ップによれば、指示薬が受ける変色の速度、即ち反応速
度を測定することによって、グルコースレベルを分析す
ることができる、グルコース分析用試料は、担体部分を
試料中に一時的に浸潰するか、または一定量の試料を担
体部分に付着することによって試薬混入挺体部分と接触
され、次に、担体部分に生成した色を種々のグルコース
濃度に対して目盛られた標準カラーチャートと比較する
ことによって、設定反応時間後の応答を測定する。

化学反応速度論の一般原理は酵素触媒反応に該当するが
、酵素触媒反応はまた、非酵素反応に通常観察されない
明らかな特徴、即ち基質による飽和状態を示す。

単一の基質、例えばグルコースに対する酵素による触媒
反応速度式は、ミカヱリスーメンテン（Ｍｉｃｈａｅｌ
ｉｓ−Ｍｅｎにｎ）式として知られている式で表わされ
る。一定反応条件下で、ミカェリスーメンテン式を使用
してミカェリスーメンテン定数（ＫＭ）として知られて
いる値を誘導することができる〔バイオケミストリイ（
Ｂｉｏｃｈｅｍぶり）、レーニンガー（Ｌｅｈｎｉｎｇ
ｅｒ）、第２版、１８９〜１９２頁参照〕。

この式は酵素触媒反応の初速度と基質の濃度との間の数
字的関係を表わす。高い基質濃度では、グルコースオキ
シダーゼのＫＭは限度を越え、反応速度は濃度にはほと
んど依存しなくなる。即ち、このような濃度では、反応
による変色速度に基づいてグルコースの濃度を測定する
ことは困難になる。グルコースーグルコースオキシダー
ゼ系において、存在するグルコースの濃度が２％に接近
するに従って、グルコースオキシダーゼのＫＭは限度を
越え、試験試料のグルコース濃度を測定することは困難
になる。糖尿病患者は５０の９／ｄ‘（０．０５％）〜
１０，０００ｍ９／の（１０％）のグルコース濃度を有
する。グルコース濃度がこのように広範囲であるため、
検出及び治療の目的に、約１′２〜１０％の範囲のグル
コース濃度を定量的に測定しうろことは重要である。現
在、浸債−読み取り試薬ストリップでは、約２％を越え
るグルコース濃度を測定することはできない。本発明は
、浸漬−読み取り試薬ストリップのこの制限を克服し、
約１／２％〜約８％のグルコース濃度を測定する方法を
提供するものである。

本発明は約１／２〜８％のグルコースを含む試験試料中
のグルコース濃度の酵素による測定方法に関する。この
方法はグルコースオキシダーゼ、ベルオキシダーゼ及び
色原体を含む酵素試験組成物で担体を含浸し、合浸した
担体を乾燥することから成る。この場合、担体は０．５
〜１．５重量％のポリスチレンを含浸する。試験試料を
試験臭と接触させ、検出可能の応答を観察し、グルコー
ス濃度を測定する。本発明の試験具はグルコースオキシ
ダーゼ、ベルオキシダーゼ及び色原体を含む酵素試験組
成物で含浸され、その後０．５〜１．５重量％のポリス
チレンで合浸した担体マトリックスから成る。本発明に
使用する担体は多様な形をとることができる。

坦体は１相でも多相でもよく、１種以上の適切な材料か
ら成り、または同様の、あるいは異なる吸収特性または
他の物理的特性を有する媒体から成る。担体は疎水性ま
たは親水性、吸水性または非吸水性でもよい。坦体は溶
液分析のため酵素試薬ストリップに利用されるような多
くの公知の形をしていてもよい。例えば、米国特許第３
，８４６，２４７号明細書はフェルト、多孔性セラミッ
クストリツプ、及び製織またはマット化したガラス繊維
の使用を教示している。紙用代替物として、米国特許第
３，５５２，９２８号明細書は木片、布、スポンジ材料
及び粘土質物質を使用することを教示している。英国特
許第１，３６９，１３叫号明細書には、紙の代りに合成
樹脂フリース及びガラス繊維フェルトを使用することが
示唆されている。更に英国特許第１，３４９，６２３号
明細書には、紙担体ベース用のカバーとして細いフィラ
メントの光透過性メッシュ材料を使用することが示唆さ
れている。フランス特許第２，１７０，３９７号明細書
はポリアミド繊維を５０％より多量に含む担体の使用を
教示している。担体に関する他の態様は、米国特許第４
，０４６，５１３号明細書に開示され、この特許では適
当な担体上に試薬をプリントするという概念を採用して
いる。米国特許第４，０４０ ５１４号明細書は、反応
体系に試薬を保有するフィラメントの編成物またはニッ
トを開示している。このような担体はすべて、他のもの
と同様に本発明に使用することができる。担体は吸水性
材料、例えば炉紙から成るのが好ましく、この担体に含
浸するためにグルコースオキシダーゼの溶液または懸濁
液を使用する。試薬の多工程付着法を利用するのが望ま
しい。

このような場合には、試薬の２種以上の溶液または懸濁
液を製造し、担体を順次、浸造毎に乾燥工程を入れて浸
薄する。このような場合、紙のような多孔性材料が最も
有利であろう。また、多孔性材料の２層以上を相互に上
下に固着させた多相担体を利用するのが望ましい。さら
に他の担体混入方法は、ィムノアツセィ系の種々の試薬
を含む被膜で連続ポリマーを順次被覆することである。
潜在的干渉剤が分析系に達するのを妨害し、他方試料中
に存在する被分析物に接近させるために、担体中に炉過
層を設けてもよい。前記のように、損体部分はグルコー
スオキシダーゼ、ベルオキシダーゼ及び指示薬、例えば
「ベンジジン型一色原体若しくは置換アニリン色原体ま
たはこれらの組合わせを混入している。

場合によっては、１種またはそれ以上の水溶性ポリマー
、例えばポリピニルピロリドン及び非イオン性表面活性
剤、例えばポリェトキシ化脂肪アルコ−ルを混入して、
グルコースの試験中、より均一な色を生じるようにする
ことができる。商品名工マルフオー（Ｅｍｕｌｐｈｏｒ
）ＯＮ８７０として市販されている好適な脂肪アルコー
ルは、ニューヨーク州ニューヨークのＧＡＦ社から入手
できる。

当業者にとって公知のいくつかの方法により酵素試験組
成物を担体マトリックスに含浸させることができる。

その１つの方法として、試験組成物の成分を含む含浸格
に担体マトリックス材料のゥェブを通して、マトリック
スを含浸溶液で充分に飽和する方法がある。飽和された
マトリックスを例えば空気炉中で５０ｑｏで乾燥し、マ
トリックス内に混入した試験組成物を残存させる。担体
マトリックスを酵素試験組成物で含浸した後、マトリッ
クスにポリスチレンの溶液を含浸し、乾燥する。

グルコース濃度の測定を改良するポリスチレンの範囲は
約０．５〜１．５％（重量／容量）である。ポリスチレ
ンの好ましい量は約１％である。次に実施例に基づいて
本発明によるグルコース濃度の測定方法を説明する。

実施例 １ 下記組成を有する酵素試験溶液中に市販のィートン・ア
ンド・ダイクマン（Ｅａｔｏｎ ａｎｄＤｉｋｅｍａｎ
）２０４戸紙を浸潰し、その後６０ｑｏで１５分間乾燥
した：クエン酸ナトリウム緩衝液 （１．ｍＭ、ＰＨ５．５） ４．０の‘
西洋わさびベルオキシダーゼ（３の９／泌）
４．０の【グルコースオキシダーゼ（５０００
Ｕ／の‘） 〇．〇６のＺｐーアニシ
ジン・ＨＣ１ ３２０．０の９蒸
留 水 １２．０炉紙にポ
リスチレン（分子量約２０，０００）の１．０％（重量
／容量）溶液を含浸し、再び乾燥した。

処理済み炉紙から試験ストリップを作り、０．０〜５％
の濃度範囲のグルコースを含む尿中にそのストリップを
浸潰した。未処理のィートン・アンド・ダィクマン２０
亀戸紙に前記の酵素試験組成物を含浸し対照試験ストリ
ップを製造した。ただしポリスチレンは含浸せず。「ラ
ピツド・スキヤナ（ＲａｐｉｄＳｃａｎ船ｒ）」として
知られている装置を使用して、前記のように製造した試
験ストリップの性能を機器手段により分析した。

この装置はジギタール・イクイップメント・コーポレー
ション（ＤｉｇｔａＩＥｑｕｉｐｍｅｎｔＣｏｒｐｏｒ
ａｔｉｏｎ）のＰＤＰ−１２コンピュータと一体状の走
査反射分光光度計である。この計器は可視領域における
反射スペクトルを迅速に測定するために使用される。コ
ンピュータはスペクトルデータの記憶及び計算のために
利用する。ラビット・スキャナにおける試験ストリップ
の性能の測定は、肉眼による観察法と比較して下記の利
点を有する。１ 光源及び試料の周囲条件が安定してい
る。

肉眼による読みでは、光源は波長成分のみならず、観察
される各ストリップの位置関係も変動することがある。
２ 検出器特性はラビット・スキャナにおいて安定して
いる。

肉眼観察では、検出器（即ち観察者の目‘こ相当する）
は人によって異なり、また同じ人でも印こよって異なる
。３ ラビット・スキャナは、人の観察より一層精確に
数量化することができ、これにより結果を比較する場合
、肉眼観察より一層客観的に行なうことが可能になる。

ラビット・スキャナはアメリカ合衆国ィンディアナ州ェ
ルクハートのマイルス・ラポラトリーズ・インコーポレ
ーテツドのエームス・デ、イビジョンによって作成され
たもので、これにより構造及び性能特性に関する完全な
情報を得ることができる。

５４０ｎｍの波長で６町秒間隔で得た反射率は、図面に
おいてグラフで示されている。

この図面にはＫ／Ｓがグルコース濃度に対してプロット
されている。Ｋ／Ｓは下記の式：Ｋ（ＩＲ〆 Ｓ一 ２Ｒ 〔式中Ｋは定数であり、Ｓは特定の反射媒体の散乱係数
であり、Ｒは試験ストリップからの反射率である〕で定
義される。

この関係は周知のクベルカームンクの式〔グスタフ・コ
ルチュム（Ｇ瓜ｔａｖｋｏｒｔｄｍ）著「リフレクタン
ス・スベクトロスコピイ（ＲｅｆｌｅｃｔａｎｃｅＳｐ
ｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）」１０６〜１１１頁、ニューヨ
ークのスプリンガーヴェルラズ（Ｓｐｈｎ袋ｒ−Ｖｅｒ
ｌａｚ）１９６ｇ手発行〕の簡略形である。

損体中のグルコースパーセントに対するＫ／Ｓの曲線（
セグメント）の勾配は、該曲線（セグメント）を直線と
仮定して、計算した。

得られた勾配を第１表に示す。第１表 図面に見られ、第１表に計算したように、約１／２％〜
約５％の範囲のグルコース濃度において、ポリスチレン
で処理した試験ストリップは、未処理の試験ストリップ
より大きな勾配を有する。

この大きな勾配は、前記グルコース濃度範囲内において
ポリスチレン処理担体上で起る変色の反応速度が、グル
コース濃度に左右されていることを示す。禾処理の試験
ストリップは小さな勾配を有する。

即ち約１／２％〜約５％のグルコース濃度の範囲で急速
に一層漸近線状となる。このことは禾処理の坦体上に起
る変色の反応速度がグルコース濃度から一層無関係にな
り、グルコース濃度を測定することが困難になることを
示している。前記の実施例は、本発明方法により約１′
２〜５％のグルコース範囲内で試験試料中のグルコース
濃度の定量法が改良されることを示している。下記のよ
うに、本発明方法により測定しうるグルコース濃度の上
限範囲を測定するために、他の一連の試験ストリップを
試験した。

実施例 ２ 下記の組成を有する酵素試験溶液中に実施例１に記載し
た市販の炉紙を浸潰し、６０ｏｏで１８分間乾燥した：
クエン酸ナトリウム緩衝液（１．０Ｍ、ＰＨ５．５）
２．０の‘西洋わさびベルオキシダーゼ
（３の９／私） ２．０の‘グルコ
ースオキシダーゼ（５０００Ｕ／の‘）
〇．〇仇‘ｐーアニシジン・ＨＣ１
４００．０の９ポリビニルピロリドン（１５％）
２．０の‘エマルフオー。

Ｎ８７０（５％） １．０の‘蒸 留 水
３．０の【炉紙にポリスチレン
の１．０％溶液（重量／容量）を含浸し、試験ストリッ
プの性能を実施例１に記載したように分析した。対照試
験ストリップを例１に記載したように製造した。Ｋ／Ｓ
値をグルコース濃度に対してプロットし、得られた曲線
（セグメント）の勾配を計算し、次の第２表にまとめる
。第２表 第２表の結果によれば、ポリスチレンで処理した試験ス
トリップは約５〜１０％の範囲のグルコース濃度で未処
理試験ストリップより大きな勾配を有する。

前記試験結果は、実施例１に示した試験結果と共に、本
発明方法が約１′２〜１０％の範囲のグルコース濃度の
定量を改良しうろことを示す。比較例本発明に用いるポ
リスチレンと、他の半透過性薄膜又は疎水化剤とのグル
コース濃度の定量に対する効果を比較するため以下の試
験を行なった。

酵素試験溶液中に炉紙を浸潰し、乾燥後、ポリスチレン
、エチルセルロース、酢酸セルロース、又はパラフィン
２％（重量／容量）溶液を含浸し、再び乾燥した後、炉
紙から試験ストリップを作成した。また、いずれの皮膜
処理も施さない試験ストリップを対照として用いた。こ
れらの試験ストリップを、１〜１０％のグルコースを含
む尿中に浸潰し、Ｋ／Ｓ値をグルコース濃度に対してプ
ロットし、得られた曲線の勾配を計算し、次の第３表に
まとめた。第３表 Ｋ／Ｓ対クルコースの勾配値 第３表から、ポリスチレンで処理した試験ストリップは
、未処理試験ストリップに比し、約４倍もの勾配値を示
した。

一方、他のエチルセルロース、酢酸セルロース又はパラ
フィンで処理した試験ストリップは、未処理試験ストリ
ップに比し、低い勾配値を示した。従って、１〜１０％
の範囲のグルコース濃度の定量を改良するには、ポリス
チレンを用いることが必要であり、他のエチルセルロー
ス、酢酸セルロース、パラフィンンでは、却って、この
範囲のグルコース濃度の定量に悪影響を及ぼすことがわ
かる。

【図面の簡単な説明】

第１図はＫ／Ｓーグルコース濃度曲線を表わす線図であ
る。 ＦＩＧ．ｌ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、及び
   色原体を含有する酵素試験組成物が混入された担体マト
   リツクスを含む試験具と、約１／２〜１０％のグルコー
   スを含む試験試料とを接触させる工程、及びこの試験具
   によつて生じる検出可能な応答を観察する工程を含む試
   験試料中のグルコース濃度の測定方法において、前記試
   験組成物の混入後に、担体マトリツクス中に約０．５〜
   １．５重量％のポリスチレンを混入することを特徴とす
   る試験試料中のグルコース濃度の測定方法。 ２ 担体が紙である特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ ポリスチレンが約１．０重量％の量で存在する特許
   請求の範囲第１項記載の方法。４ 色原体がベンジジン
   型指示薬または置換アニリン指示薬である特許請求の範
   囲第１項記載の方法。 ５ グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及び色
   原体が混入された担体マトリツクスから成る、試験試料
   中のグルコースの存在を検出する試験具において、担体
   マトリツクスが引き続き０．５〜１．５重量％のポリス
   チレンで処理されることを特徴とする試験具。 ６ 前記担体が紙である特許請求の範囲第５項記載の試
   験具。 ７ ポリスチレンが約１．０重量％の量で存在する特許
   請求の範囲第５項記載の試験具。 ８ 色原体がベンジジン型指示薬または置換アニリン指
   示薬である特許請求の範囲第５項記載の試験具。