JPS60218071A - Solid-phase support composite body having chromogen responding function for detecting antibody, antigen, receptor or ligand - Google Patents
Solid-phase support composite body having chromogen responding function for detecting antibody, antigen, receptor or ligandInfo
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- JPS60218071A JPS60218071A JP5214985A JP5214985A JPS60218071A JP S60218071 A JPS60218071 A JP S60218071A JP 5214985 A JP5214985 A JP 5214985A JP 5214985 A JP5214985 A JP 5214985A JP S60218071 A JPS60218071 A JP S60218071A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。(57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は抗体、抗原、リセプターおよびリガンドの検定
技術に関し、より詳しくは抗体、抗原またはりセンター
の測定および検出力ための色原体応答性マーカーを含有
する改良された同相支持侍合体に関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to assay techniques for antibodies, antigens, receptors and ligands, and more particularly to improved assay techniques containing chromogen-responsive markers for the measurement and detection of antibodies, antigens or receptors. Concerning the same phase support samurai union.
診断技師に提供しうる感度及び特異性のため。Because of the sensitivity and specificity it can provide to diagnostic technicians.
ラジオイムノアッセイ及びラジオリセプターアッセイは
臨床診断における重要な手段である。しかしながら、放
射検定法はラジオアイソトープ標識を行うに必要な材料
を要すばかりでなく、放射能検出の複雑な装置を要する
。従って、この方法は検出技術が要求する適当な設備の
ために必要な余裕を有する社会および国の、十分に設備
の整った研究室に限定される。その結果、多くの治療情
況において、放射分析が提供する感度を有する検定の実
施が不可能である。そのような情況としては。Radioimmunoassay and radioreceptor assay are important tools in clinical diagnosis. However, radioassays not only require the materials necessary to perform radioisotope labeling, but also require complex equipment for radioactivity detection. Therefore, this method is limited to well-equipped laboratories in societies and countries that have the necessary space for the appropriate equipment required by the detection technique. As a result, in many therapeutic situations it is not possible to perform assays with the sensitivity that radiometry provides. In such a situation.
開業医院、急救診療所、地方の病院及び治療センターお
よび類似の情況があげられる。さらに、家庭での迅速簡
易な検定もまた不可能である。These include private practice offices, urgent care clinics, local hospitals and treatment centers, and similar situations. Furthermore, a quick and simple test at home is also not possible.
ラジオアイソトープの取扱いを必要とせず、従っ又、放
射能検出装量を必要としないで、薬剤。drug without the need for radioisotope handling and therefore without the need for radioactivity detection equipment.
ステロイド、ペプチド等の測定および検出を可能ならし
めるために採用された試みとして、酵素イムノアッセイ
のような、非アイソトープ性イムノアッセイの開発があ
る。Attempts that have been made to enable the measurement and detection of steroids, peptides, etc. include the development of non-isotopic immunoassays, such as enzyme immunoassays.
そのよっな酵素イムノアッセイ技術の成果の一例は、婦
人が比較的簡単な検出法により、自己の妊娠を判定でき
る家庭用妊娠判定試験の出現である。妊娠判定試験の開
発に関する先行技術とし1次のものが挙げられる:米国
特許A4,376,110号、4,008,749号、
4,016,250号、4.。One example of such achievements in enzyme immunoassay technology is the emergence of home pregnancy tests that allow women to determine their own pregnancy using a relatively simple detection method. Prior art related to the development of pregnancy testing tests includes the following: U.S. Pat.
No. 4,016,250, 4. .
94.963号、3,862,302号、3,655,
838号および3,654,090号; Van We
eman等「抗原−酵素檜合体を使用したイムノアッセ
イ」。94.963, 3,862,302, 3,655,
838 and 3,654,090; Van We
"Immunoassay using antigen-enzyme combination" by Eman et al.
FEBS 1etters、15,232(1971’
) :5axena等「牛の黄体からの黄体形成ホルモ
ン−絨毛性ゴナドトロピンリセフリーの高収率単離」。FEBS 1etters, 15, 232 (1971'
): 5axena et al. "High-yield isolation of luteinizing hormone-chorionic gonadotropin Lycefree from bovine corpus luteum".
The Journal of Biological
Chemistry、VoL258、准5. 341
0−3158(3月10日、1983年) ; 5ax
ena等[尿中黄体形成ホルモン−ヒト絨毛性ゴナドト
ロピンのラジオリセプターアッセイ:黄体形成ホルモン
の検出Surge & PregnancyJ。The Journal of Biological
Chemistry, VoL258, Associate 5. 341
0-3158 (March 10, 1983); 5ax
[Urinary Luteinizing Hormone - Radioreceptor Assay for Human Chorionic Gonadotropin: Detection of Luteinizing Hormone Surge & Pregnancy J.
Fertility & 5terility、 Vo
l、28.A2(2月。Fertility & 5terility, Vo
l, 28. A2 (February.
1977年) ; 5axena等[ヒト絨毛性ゴナド
トロピンのラジオリセプターアッセイによる妊娠の診断
と管理J 、 American Journal o
f Obstet−rics and Gynecol
ogy、Vol、 131. 97−109(1978
年5月1日)。上記検定を実施する特、別の診断装置は
2例えば米国特許/I63.57’9゜306号及び米
国章匠特許A215744号に記載されている。これら
の先行技術に開示されている試験方法は、一般に八〇G
と抗体との結合反応(イムノアッセイ)、リセプターと
の結合反応(リセプターアッセイ)等の方法による。妊
娠試験用に開発された技術(ラジオアッセイおよび酵素
アッセイ)は9例えば限定的例ではないがステロイド分
子、蛋白質分子、ホルモン等を含め℃他の分子の測定に
も同様に応用可能である。当業者も認める如く、そのよ
うな酵素イムノアッセイ技術の広範な応用性は当技術分
野で認識されている。1977); 5axena et al. [Diagnosis and Management of Pregnancy by Radioreceptor Assay for Human Chorionic Gonadotropin J, American Journal o
f Obstet-rics and Gynecol
ogy, Vol. 131. 97-109 (1978
(May 1, 2017). Particularly different diagnostic devices for carrying out the above assays are described in two examples, for example US Pat. No. 63.57'9.306 and US Pat. The test methods disclosed in these prior art generally
By a method such as a binding reaction between and an antibody (immunoassay) or a binding reaction with a receptor (receptor assay). Techniques developed for pregnancy testing (radioassays and enzymatic assays) are equally applicable to the measurement of other molecules, including, for example, but not limited to, steroid molecules, protein molecules, hormones, etc. As those skilled in the art will appreciate, the broad applicability of such enzyme immunoassay techniques is recognized in the art.
この分野での近年における発展にもかかわらず。Despite developments in this field in recent years.
先行技術の試験は、酵素イムノアッセイ技術をラジオイ
ムノアッセイ技術と一層匹敵させるに必要な9%に低レ
ベルの抗体、抗原又はリセプターを検出しうる程度の感
度には未だ及んでいない。また、ラジオアッセイの感度
にせまる上記先行技術の試験には、設備及び装置が必要
である。本発明の主題は、上記のようなアッセイ技術の
ための。Prior art tests have not yet been sensitive enough to detect levels of antibodies, antigens, or receptors as low as 9%, which is necessary to make enzyme immunoassay techniques more comparable to radioimmunoassay techniques. Additionally, the prior art tests that approach the sensitivity of radioassays require equipment and equipment. The subject of the invention is for assay techniques as described above.
より高感度の色原体応答性複合体に関するものである。It concerns a more sensitive chromogen-responsive complex.
本発明の一観Aは、抗体−抗原反応の一成分の測定及び
検出のための試薬にある。本発明の範囲にはそのような
試薬の二種の形態が含まれる。その形態の一つは、抗体
を化学結合で不溶性同相マトリックスもしくは支持体に
結合させたもの誉。Aspect A of the present invention resides in reagents for the measurement and detection of a component of an antibody-antigen reaction. Two forms of such reagents are within the scope of this invention. One form is that the antibody is chemically bound to an insoluble homogeneous matrix or support.
複数の色原体応答性標識分子を担持した担体と抗原との
接合体と結合させたものである。試薬のもう一つの形態
は、抗原を化学結合で不溶性同相マトリックスもしくは
支持体に結合させたものを。This is a combination of a carrier carrying multiple chromogen-responsive label molecules and an antigen. Another form of reagent is one in which the antigen is attached to an insoluble homologous matrix or support through chemical bonds.
複数の色原体応答性標識分子を担持した担体と抗体との
接合体と結合させたものである。好ましい色原体応答性
標識は酵素である。妊娠判定の場合は抗原はんCGであ
り抗体は抗−β−hCGf−グロブリンである。This is a combination of a carrier carrying multiple chromogen-responsive label molecules and an antibody conjugate. A preferred chromogen-responsive label is an enzyme. In the case of pregnancy determination, the antigen is CG and the antibody is anti-β-hCGf-globulin.
本発明の別の観点は、抗体−抗原反応また+117セプ
タ一−リセプター結合性分子(リガンド)反応の一方の
成分の測定法である。この測定法は上記の新規試薬を使
用する免疫化学検定法である。Another aspect of the invention is a method for measuring one component of an antibody-antigen reaction or a +117 receptor-receptor binding molecule (ligand) reaction. This measurement method is an immunochemical assay using the above-mentioned novel reagent.
この方法は、測定すべき成分を含むサンプルを免疫化学
反応が生ずるに十分な時間、予め定めた量の前記試薬と
接触させ、該試薬の不溶性基質をテスト溶液から分離し
、そし℃残りのテスト溶液を前記マーカーと応答性の色
原体で処理することからなる。例えば妊娠試験におい又
は、試験される体液中のACGホルモンの存在が、用い
られる特定色原体の各システムに応じた適当な色または
変色により示される。本発明の更に別の観点は、リセプ
ターまたはそのリセプターに結合しうる分子の測定のた
めの試薬及び方法である。抗原と抗体。This method involves contacting a sample containing the component to be measured with a predetermined amount of the reagent for a time sufficient for an immunochemical reaction to occur, separating the insoluble substrate of the reagent from the test solution, and discharging the remaining test sample at °C. It consists of treating the solution with a chromogen responsive to said marker. For example, in a pregnancy test or in the body fluid being tested, the presence of the ACG hormone is indicated by an appropriate color or color change depending on the particular chromogen system used. Yet another aspect of the invention is reagents and methods for the determination of a receptor or a molecule capable of binding to that receptor. antigens and antibodies.
およびリセプターと該リセプターに結合性の分子は9本
発明により測定される立体構造的および生物学的に特異
性ある反応体の例であるが2本発明はこれらとは別の特
異的反応体間の検出用にも応用可能である。Although receptors and molecules that bind to these receptors are examples of conformationally and biologically specific reactants that can be measured by the present invention, the present invention also deals with the use of specific reactants other than these. It can also be applied to the detection of
本発明の利点は従来可能であったよりも多量のマーカー
な各試薬分子に結合した試薬が開発されたことをも包含
する。マーカー貴の増加をも検出および/または測定さ
れる低レベルの物質の測定感度を大巾に向上させる。例
えば、妊娠テストにおいては、他の利点とし℃従来の酵
素イムノアッセイで可能であったよりもはるかに早期に
妊娠の判定を可能にすることである。さらに別の利点は
。Advantages of the present invention also include the development of reagents that bind larger amounts of each marker reagent molecule than previously possible. An increase in marker abundance also greatly improves the sensitivity of measuring low levels of substances being detected and/or measured. For example, in pregnancy tests, another advantage is that it allows determination of pregnancy much earlier than was possible with traditional enzyme immunoassays. Yet another advantage.
抗原、抗体またはりセプターの測定において9本発明の
方法および試薬は、高い信頼性を有することである。さ
らに別の利点は、安定であるため予め調製して良好に長
期間保存可能及び良好な取扱い性を有する試薬が開発さ
れたことである。さらに別の利点は、新規試薬による検
定の実施が簡単であり、非熟練使用者2例身ば家庭での
個人による利用可能性を高めたことである。以下の記載
により当業者には更に別の種々の利点が明らかになるで
あろう。The methods and reagents of the present invention are highly reliable in measuring antigens, antibodies, or receptors. Yet another advantage is that reagents have been developed that are stable and thus can be pre-prepared and stored well over long periods of time and have good handling properties. Yet another advantage is that the assay with the new reagents is simple to perform, increasing its usability by unskilled users and individuals at home. Further advantages will become apparent to those skilled in the art from the following description.
次に本発明を図面に基づいて更に詳述する。Next, the present invention will be explained in more detail based on the drawings.
本発明は、従来の実験室装置2例えはスペクトロメータ
ーやスペクトロフォトメーター等を使用せず、肉眼観察
可能な指標を用いて行なう診断試験の試薬及び方法を提
供する。本発明で開発された診断試験は、非熟練者の家
庭的使用を可能とする。さらに2本発明の診断試薬は、
非実験室的医療環境9例えば医者の診察室、外来診療所
または救急治療室での使用に理想的である。上記環境に
おいて特に精確で感度の高い信頼性ある検定法が。The present invention provides reagents and methods for diagnostic tests that do not use conventional laboratory equipment, such as spectrometers or spectrophotometers, but instead use indicators that can be observed with the naked eye. The diagnostic test developed in this invention allows for home use by unskilled personnel. Furthermore, two diagnostic reagents of the present invention include:
Ideal for use in non-laboratory medical environments 9 such as a doctor's office, outpatient clinic or emergency room. A particularly accurate, sensitive and reliable assay method in the above environment.
迅速かつ比較的安価に実施可能となった、肉眼的指標2
例えば色相変化2発色またげパターン形成を使用するた
め、もはや必ずしも訓練を受けた実験技術者が診断試験
の結果を実施および評価する必要はなくなった。診断試
薬のそのような定性的性格にもかかわらず、結果の定量
化も、下記により詳しく記載する如く容易に確認できる
。本発明の新規試薬は、抗体−抗原反応又はリセプター
ーリセプター結合性分子反応の一方の成分の測定を可能
とするものであるが、5種の基本成分から構成される。Macroscopic indicators 2 that can be implemented quickly and relatively cheaply
For example, due to the use of hue-changing two-color straddle patterning, it is no longer necessary that trained laboratory technicians perform and evaluate the results of diagnostic tests. Despite such qualitative nature of the diagnostic reagents, quantification of the results is also easily ascertained, as described in more detail below. The novel reagent of the present invention enables the measurement of one component of an antibody-antigen reaction or a receptor-receptor binding molecule reaction, and is composed of five basic components.
これらの成分とは、固相の支持体マトリックス、抗体(
又はリセプター)、抗原(又はリセプター結合性分子)
、担体分子、および色原体応答性マーカーもしくはトレ
ーサー分子である。These components include solid support matrices, antibodies (
or receptor), antigen (or receptor-binding molecule)
, carrier molecules, and chromogen-responsive marker or tracer molecules.
特に重要なことは、単一体もしくは複合試薬の形成であ
り、この点従来技術と直ちに区別される。Of particular importance is the formation of single or complex reagents, which immediately distinguishes it from the prior art.
本発明の試薬の形成には広範な反応技術を使用できるが
2次に新規な好ましい特定の反応方法な示す。特に、こ
の方法においてヒト絨毛性ゴナドトロピン(ACG)の
使用およびその妊娠診断への用途を例にする。しかしな
がら、この特宇例は説明のための例示であり発明をこの
範囲に限定するものではない。Although a wide variety of reaction techniques can be used to form the reagents of the present invention, certain novel and preferred reaction methods are now described. In particular, the use of human chorionic gonadotropin (ACG) in this method and its application in pregnancy diagnosis is exemplified. However, this special example is an illustration for explanation and does not limit the invention to this scope.
先ず、固相もしくは固体の支持体マトリックスに関し、
好ましくはマトリックスは抗体、リセプターまたは抗原
をその上に共有結合させるための処理が可能な固体より
なる。好ましいマトリックスはナイロン−6である。し
かし、他の適当な慣用の同相とし壬9例えば他の棹のナ
イロン、ポリブタジェン、ポリスチレン、ラテックス、
フリジエンースチレンコホリマー、カラス、 7 i
o −ス。First, regarding the solid phase or solid support matrix,
Preferably, the matrix comprises a solid that can be treated to covalently attach antibodies, receptors or antigens thereon. A preferred matrix is nylon-6. However, other suitable conventional materials such as nylon, polybutadiene, polystyrene, latex, etc.
frisien-styrene coholimer, crow, 7i
o-su.
架橋デキストラン、セルロース、リポソーム(リン脂質
二層膜)、F紙等があ木、支持体マトリックスは9種々
の形状に製造可wトで9例えば棒状。Support matrices such as cross-linked dextran, cellulose, liposomes (phospholipid bilayer membranes), F paper, etc. can be manufactured in various shapes, for example, rod-shaped.
プレート状、リング状、ディスク状2片状、チューブ状
、ビーズ状2円錐状1粒状等であってよい。It may be in the shape of a plate, a ring, two discs, a tube, a bead, two cones, one grain, etc.
支持体の表面積を出来る限り大きくすることは。To make the surface area of the support as large as possible.
試薬の最大濃度を提供するために好ましい。この固体支
持体への抗体又は他の試薬の結合のため物堺的吸着技術
もある種の用途においては可能であろうが、#も好まし
くは、固体支持体をその上に抗体、リセプター又は抗原
を共有結合させるために処理する。倒えばナイロン−6
固体支持体はアミン基を結合させてアミン化するために
9例えばHcl又は1.6−ジアミツヘキサンで処理し
2例えばN−アセチルホモシスティン・チオラクトン(
AHTL)でチオール化し、アミン基をチオール基に変
換する。固体マトリックスと抗体との間のスペーサー分
子としてAHTLを使用することは1例えば、チオール
反応性基と抗体結合サイトの立体障害を減少させる。こ
のチオール化担体な次で例えばマレイミド化抗体(例え
ば抗ACG)と結合させるへとができる。7以下め、H
においてはアミノ基はチ万−ル基と非反応性であり、そ
のためこの方法で架橋は防止される。抗体又は抗原の固
相に対する共有結合を行なわせる他の方法はKawo
i等の[ペルオキシダーゼと蛋白佃との改良接合法J
、Fed Proc、 、 32 Abstract
840(1973) ; 5axcria等[排卵検査
のためのLHの遠心分離不要同相酵素アッセイの開発j
+ Psy−choneuroendocrinol
ogy ’in Reproduction。Preferred to provide maximum concentration of reagents. Although physical adsorption techniques for attachment of antibodies or other reagents to the solid support may also be possible in some applications, it is also preferred to attach the solid support onto which the antibody, receptor or antigen is attached. processed to form a covalent bond. If you fall down, nylon-6
The solid support is treated with 9 e.g.
AHTL) to convert the amine group into a thiol group. The use of AHTL as a spacer molecule between a solid matrix and an antibody reduces the steric hindrance of the thiol-reactive groups and the antibody binding site, for example. This thiolated carrier can then be coupled, for example, to a maleimidized antibody (eg, anti-ACG). 7 or less, H
The amino group is non-reactive with the thiol group, so crosslinking is prevented in this way. Other methods for covalent attachment of antibodies or antigens to solid phases are described by Kawo.
[Improved conjugation method of peroxidase and protein Tsukuda J]
, Fed Proc, , 32 Abstract
840 (1973);
+ Psy-choneuroendocrinol
ogy'in Reproduction.
Zichella等編、Elsevier/Nbrth
Ho1land(1979);Po5t等[同相にガ
ラスピーズな使用したヒト絨毛性ゴナドトロピンに特異
的な遠心分離不要の迅速ラジオイムノアッセイJ、J、
CIjnEndocrino1. Metab、、 5
0.169 (1980)に記載されている。これらに
より、アルデヒド、々ルボキシ基および他の化学反応性
基または共゛有結合を適宜使用し、抗体、リセプター、
抗原を、必要、所望、都合に応じて慣用手段で固相に共
有結合させうる。Edited by Zichella et al., Elsevier/Nbrth
Holand (1979); Po5t et al.
CIjnEndocrino1. Metab,, 5
0.169 (1980). These allow antibodies, receptors,
The antigen may be covalently attached to the solid phase by conventional means as necessary, desired or convenient.
上記のとおり2本発明の試薬の第二成分は、抗体、リセ
フリーまたは抗原であり、これらは同相への反応のため
処理(変性)される。本発明の目的において、抗体とは
広く単一モツクローナル抗体、単−多クローナル抗体、
各々同一の抗原に対する異なる結合ならびに交差反応性
を有する予め窒めた比率の二種またはそれ以上の°モノ
クロナール抗体の混合物、又は各々同一の抗原に対する
異tcった結合ヤよび/または交差反応性を有する一種
または一種以上のモノクローナル抗体と一種または一種
以上の多クローナル抗体の混合物を包含する広い意味を
有する。このような抗体混合物は同一抗原(例えばAC
G)に対して協力して作用するが、しかし恐らく同一抗
原の異なる抗原決定部位(エピトープ)に作用する。も
ちろん、この協力作用の十分な理解は、モノクローナル
抗体の出現以前は十分でなかった。本発明の免疫診断テ
ストに使用するために適するリセプターは、前記記載に
基づいて広い範囲のものと解すべきである。As mentioned above, the second component of the reagent of the invention is an antibody, lysefree or antigen, which is treated (denatured) for reaction to the same phase. For the purposes of the present invention, antibodies broadly refer to monoclonal antibodies, monoclonal antibodies, monoclonal antibodies,
A mixture of two or more monoclonal antibodies in predetermined ratios, each having different binding and/or cross-reactivity to the same antigen, or each having different binding and/or cross-reactivity to the same antigen. It has a broad meaning that includes a mixture of one or more monoclonal antibodies and one or more polyclonal antibodies having the following. Such antibody mixtures may contain antibodies against the same antigen (e.g. AC
G) but probably act on different antigenic determining sites (epitopes) of the same antigen. Of course, this synergy was not fully understood before the advent of monoclonal antibodies. A wide range of receptors suitable for use in the immunodiagnostic tests of the invention should be understood based on the foregoing description.
Mo y l e等「ホルモンのオリエンテーションお
よびそのリセプターとの複合体の試験のためのヒト絨毛
性ゴナドトロピンのサブユニットに対するモノクローナ
ル抗体の使用J 、 Proc、 Nat 1. Ac
ad、 Sci。Moyle et al. ``Use of monoclonal antibodies against subunits of human chorionic gonadotropin for testing hormone orientation and complexes with its receptors J, Proc, Nat 1. Ac.
ad, Sci.
USA、Vol、79,2245−2249 (198
2年4月);Ehrlich等[二つのモノクローナル
抗体の混合による抗原に対する向上した親和性の達成J
、theJournal of Itrmunolog
y、 Vol、 128.46(1982年6月) ;
Ehrlich等「掩、同イムノアッセイ:混合モノ
クローナル抗体による趨感度検定J、5ci−ence
、Vo1.221,279−281 (1983年7月
15日)も参照。この点に関し「抗原」の語は抗原−抗
体の対になる抗原だけでなく、第二の抗体が第一抗体に
対して生じる抗体−抗体の対における第二の抗体をも含
むと解すべきである。即ち、第一抗体(例えば抗r−グ
ロブリン)も本発明で対象とする抗原である。このよう
な抗体−抗体の対は。USA, Vol. 79, 2245-2249 (198
April 2016); Ehrlich et al. [Achieving improved affinity for antigen by mixing two monoclonal antibodies J
, the Journal of Itrmunolog
y, Vol, 128.46 (June 1982);
Ehrlich et al., “Immunoassay: Trend Sensitivity Test with Mixed Monoclonal Antibodies J, 5ci-ence”
, Vol. 1.221, 279-281 (July 15, 1983). In this regard, the term "antigen" should be understood to include not only the antigen in an antigen-antibody pair, but also the second antibody in an antibody-antibody pair in which the second antibody is raised against the first antibody. be. That is, the first antibody (eg, anti-r-globulin) is also an antigen targeted by the present invention. Such antibody-antibody pairs.
例えば抗原の入手困難な場合9例えは供給が困畔および
または高価な場合に使用されている。本発明の教えによ
す、上記抗体−抗体対に基づいて試薬を調整することは
本発明の範囲に含まれる。For example, they are used when antigens are difficult to obtain and/or when supplies are difficult and/or expensive. It is within the scope of the present invention to prepare reagents based on the antibody-antibody pairs described above in accordance with the teachings of the present invention.
妊娠テストのためには、現在抗体をナイロンまたは他の
固体マトリックスに結合させることが好ましいが、もち
ろん抗原またはりセプターを固相に結合させることも適
当である。抗原−抗原反応また&’t IJセプター−
サセプター結合性分子反応のどの成分を同相に結合させ
るかにかかわらず9本発明の試薬調製のためには、これ
らを標識接合体と結合させる。抗体−抗体結合(もしく
はカップリング)は共有結合ではなく、測定すべき成分
により置換可能なパンデルバールスカ的なものである。For pregnancy tests it is currently preferred to couple the antibody to a nylon or other solid matrix, although it is of course also suitable to couple the antigen or receptor to a solid phase. Antigen-antigen reaction and IJ receptor
Regardless of which components of the susceptor-binding molecule reaction are bound in the same phase, 9 they are bound to the labeled conjugate for the preparation of the reagents of the present invention. The antibody-antibody bond (or coupling) is not a covalent bond, but a Panderbarska type that can be replaced by the component to be measured.
従って、残りの三成分は好ましくは接合体(コンジュゲ
ート)となし、この接合体を前記処理された固体マ)
IJラックス添加する。接合とは蛋白質物質または非蛋
白物質を、他の蛋白質物質または非蛋白質物質に検出可
能に結合させることである。本発明の試薬において、理
想的接合体は、抗原、リセフリーまたは抗体の一または
二つの分子(同相に結合した成分により定まる)および
多数の色原体応答性マーカーもしクハトレーサー分子よ
りなる。例えば、従来の試薬は抗体または抗原ケ酵素に
直接共有結合したもので、抗原または抗原1分子当り最
大で3または4個の酵素しか与えなかった。酵素の存在
量は、低レベルで存在する目的成分を検出しうる検定の
感度を定めるものであることは明らかである。このこと
は2本発明の試薬が予測生理開始時期に遅れることなく
妊娠の判断(肉眼判定)を可能とする性能があることを
示すものである。本発明の接合体を使用すれば。Therefore, the remaining three components are preferably formed into a conjugate, and the conjugate is combined with the treated solid matrix.
Add IJ Lux. Conjugation is the detectable binding of protein or non-protein substances to other protein or non-protein substances. In the reagents of the invention, the ideal conjugate consists of one or two molecules of antigen, lysefree or antibody (as determined by the components bound in phase) and a number of chromogen-responsive markers or Kuhatracer molecules. For example, conventional reagents have been covalently linked directly to antibodies or antigens and enzymes, providing a maximum of only 3 or 4 enzymes per antigen or antigen molecule. It is clear that the amount of enzyme present determines the sensitivity of the assay to be able to detect components of interest that are present at low levels. This shows that the reagent of the present invention has the ability to determine pregnancy (with the naked eye) without delaying the expected start of menstruation. If the zygote of the present invention is used.
接合体中のACG抗原1分子当り例えば広い意味では約
1ないし15分子の酵素、典型的には約抗原の分子当り
5ないし10個の酵素分子が、接合体に担持される。ト
レーサーもしくはマーカーとし℃有用な酵素の神々のも
ののうちには、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ
ホスファターゼ、カタラーゼ等も含まれる。酵素がマー
カーとして好ましい。何故なら、酵素は非常に少量でも
容易に検出できるからである。しかしながら、その他の
マーカー、例えばフェノール、酵素コファクター。Broadly, for example, about 1 to 15 molecules of enzyme are carried in the conjugate per molecule of ACG antigen in the conjugate, typically about 5 to 10 molecules of enzyme per molecule of antigen. The pantheon of enzymes useful as tracers or markers also include horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, catalase, and the like. Enzymes are preferred as markers. This is because enzymes can be easily detected even in very small amounts. However, other markers such as phenols, enzyme cofactors.
染料(例えばアゾ色素)、化学螢光物質前躯体。Dyes (e.g. azo dyes), chemical fluorophore precursors.
酵素基質、螢光色素、螢光原、螢光消光体、およびヘム
等も接合体の形成のマーカーとし℃使用できる。例えば
5cha l lおよびTenoso [ラジオイムノ
アッセイに代る方法二標識剤および方法」。Enzyme substrates, fluorescent dyes, fluorogens, fluorescent quenchers, heme, and the like can also be used as markers of conjugate formation. For example, 5chall and Tenoso [Alternatives to Radioimmunoassay 2 Labeling Agents and Methods].
Cl1n、 Chem、 Vol、 27. A 7
(1981)を参照。Cl1n, Chem, Vol, 27. A 7
(1981).
接合体に使用する適当なマーカーに要求されることは9
色原体と反応してその存在を肉眼で判別しうろことのみ
である。The requirements for a suitable marker for use in zygotes are 9.
It reacts with chromogens and its presence can only be detected with the naked eye.
接合体の担体分子は反応溶媒(典型的には水性溶媒)中
に可溶でなければならず、この要件が担体の分子量を実
際上制限する。さらに2分子量の太きすぎる相体は遅延
された反応速度を示し、その使用を非実用的なものとす
る。好ましい担体は実質的に約70,000の分子量を
越えないことが多くr 例’tばシー−クロースポリマ
ー(例えばフィコール’lt&>、ウシ血清アルブミン
(以下BSA)という)およびこれらに類似の公知担体
分子である。反応特異性を有する種々の接合技法がこの
分野で提唱されており9例えば下記の文献にみられる:
Engvall等「酵素結合イムノアトソルベントア
ッセイ(ELISA):イムノグロブリンGの定を検定
J 、Irrmunochemistry、 8.87
1 (1971)s Kawo i 等rペルオキシダ
ーゼと蛋白質との改良接合法」(前述) ; 5axe
na等「排卵検査のためのLHの遠心分離不要固相酵素
アッセイの開発」(前述) ; Carlsson等「
蛋白質のチオール化及び可逆的蛋白質−帯白質の接合[
Bi ochem J、 。The carrier molecule of the conjugate must be soluble in the reaction solvent (typically an aqueous solvent), and this requirement practically limits the molecular weight of the carrier. Furthermore, phases that are too thick, with two molecular weights, exhibit retarded reaction rates, making their use impractical. Preferred carriers often do not substantially exceed a molecular weight of about 70,000, such as sea-close polymers (e.g., Ficoll®, bovine serum albumin (BSA)) and similar known carriers. It is a molecule. A variety of conjugation techniques with reaction specificity have been proposed in the field9 and can be found, for example, in the following literature:
Engvall et al., “Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): Assaying the determination of immunoglobulin G, J, Irrmunochemistry, 8.87
1 (1971) s Kawo et al. ``Improved conjugation method between peroxidase and protein'' (mentioned above); 5axe
na et al. “Development of a centrifugation-free solid-phase enzyme assay for LH for ovulation testing” (mentioned above); Carlsson et al. “
Protein thiolation and reversible protein-white matter junction [
Biochem J, .
173.723(1978);Khan等[黄体形成ホ
ルモンおよび゛ヒト絨毛性ゴナドトロピンのための酵素
リセプターアッセイ(EA)の開発における純化ゴナド
トロピンリセプターの使用J 、 Enzy−me L
abelled Immunoassay of Hp
rmpnesand Drugs 、 S、 B、 P
a1編de Gruyler & Co。173.723 (1978); Khan et al. [Use of purified gonadotropin receptors in the development of enzyme receptor assays (EA) for luteinizing hormone and human chorionic gonadotropin J, Enzyme L.
abelled immunoassay of HP
Rmpnesand Drugs, S, B, P
a1 edition de Gruyler & Co.
(1978);Lee等[検出可能な組成のβ−ACG
COOHペプチドー担体接合物の調製法J、 Mo1e
−cular Irrmunplogy、 17.74
9−756(1980)。(1978); Lee et al.
Preparation of COOH peptide-carrier conjugates J, Mole
-cular Irrmunplogy, 17.74
9-756 (1980).
第1図は妊娠婦人の尿のhCGの測定例について本発明
の試薬を模式的に説明するものである。FIG. 1 schematically explains the reagent of the present invention for an example of measuring hCG in the urine of a pregnant woman.
この図は単に説明のためのもので9本発明の詳細な説明
を視覚的に理解しやすくするためのものである。第1図
において、固体マトリックスは担体分子に結合したAC
G分子に結合した抗体よりなる。やや複雑な分子構造物
を支持している。担体分子は抗体と結合していない40
0分子並びに第1図では西洋ワサビペルオキシダーゼで
ある数分子のマーカーをも有する。この試薬の第1図に
よる説明は本発明の種々の1要な点を示している。This figure is for illustrative purposes only and is provided to facilitate visual understanding of the detailed description of the present invention. In FIG. 1, the solid matrix is composed of AC attached to carrier molecules.
It consists of an antibody coupled to a G molecule. It supports somewhat complex molecular structures. The carrier molecule is not bound to the antibody40
It also has 0 molecules as well as several molecules of marker, which in FIG. 1 is horseradish peroxidase. The illustration of this reagent according to FIG. 1 illustrates various aspects of the invention.
第一に、担体分子は典型的には1分子当り1または2分
子の抗原例えばACGを担持している。担体1分子当り
1分子より多くの八〇〇を有することは2反応率を高め
、マ) +7ツクスに結合した抗体に対する相体分子の
結合反応を促進する。第二に。First, the carrier molecules typically carry one or two molecules of antigen such as ACG per molecule. Having more than one molecule of 800 per carrier molecule increases the 2 reaction rate and promotes the binding reaction of the phase molecule to the antibody bound to the +7x. Secondly.
AC01分子当りのHRPマーカー分子の割り合は6:
1として示されている。この割合は上記4−15:1の
広い範囲内のものである。重要な点は。The ratio of HRP marker molecules per AC0 molecule is 6:
1. This ratio is within the wide range of 4-15:1 mentioned above. The important point is.
第1図に示した特定構造の試薬によれば、接合体1分子
が本試薬から構成される装置換された各/2
、ACG分子当9I分子のHRPV提供することである
。試薬の感度は測定すべき抗原1分子当りの上記高率の
マーカーによって向上する。もちろん。According to the specific structure of the reagent shown in FIG. 1, each conjugate molecule composed of the present reagent provides an HRPV of 91 molecules per 2/2 ACG molecule. The sensitivity of the reagent is increased by the high ratio of markers per molecule of antigen to be measured. of course.
マトリックスは図示した分子を無数に支持するが。The matrix supports an infinite number of the molecules shown.
第1図にはその一つのみv謂明のため示している。Only one of them is shown in FIG. 1 for clarity.
さらにもう一つ重要なことは、抗体とマトリックスとの
結合は試薬が用いられる典型的反応条件では切断され難
い共有結合であることである。例六ば始端の尿の中の測
定すべきACGは三角形記号のACGで示され2点m&
!マトリックスが妊婦の尿に接触したとき生じる#換反
応を示すものである。測定すべきACG分子は、液体尿
中に存在し。Another important point is that the bond between the antibody and the matrix is a covalent bond that is difficult to cleave under the typical reaction conditions in which the reagent is used. For example, the ACG to be measured in urine at the starting point is indicated by the triangular symbol ACG, and the two points m&
! This shows the # exchange reaction that occurs when the matrix comes into contact with the urine of a pregnant woman. The ACG molecule to be measured is present in liquid urine.
これに対して試薬は固体形状である。Reagents, on the other hand, are in solid form.
第2図におい”ct換反応の結果後の状態が示される。In FIG. 2, the state after the result of the ct conversion reaction is shown.
共有結合し7た抗体を有する固体マトリックスは妊婦尿
からの測定すべf!hCG分子を抗体に結合し℃有する
。残部液体反応物からこの固体マトリックスを取り去る
。マトリックスを取り除いた後にはHRPマーカー分子
を含む担体分子が残液中に存在する。HRP分子の存在
を検出するための適当な化学物質を添加して肉眼的に検
定されるのは、この測定すべきACG分子で置換された
担体分子である。生じた担体分子は、マトリックスから
置換されたACG1分子当分子数のHRPマーカー分子
を有している。このため本発明の者しい感度が得られる
。A solid matrix with covalently bound antibodies can be used for measurement from pregnant women's urine! The hCG molecule is conjugated to the antibody and held at °C. This solid matrix is removed from the remaining liquid reactants. After removing the matrix, carrier molecules containing HRP marker molecules are present in the residual liquid. It is this carrier molecule substituted with the ACG molecule to be measured that is visually assayed by adding appropriate chemicals to detect the presence of the HRP molecule. The resulting carrier molecule has an equivalent number of HRP marker molecules per molecule of ACG displaced from the matrix. Therefore, the sensitivity of the present invention can be obtained.
接合体形成のための二種の代表的一般反応方式を次に簡
単に説明し、その詳細については後記実施例に記載する
。どの方式によるかにかかわらず。Two representative general reaction schemes for conjugate formation are briefly described below and detailed in the Examples below. Regardless of which method.
抗体、抗原、またはりセプターおよび色原体応答性マー
カーは、担体分子と反応または結合させるために変性さ
せる。これらは変性された状態において、マーカーと抗
体、抗原またはりセプターとの間に結合またはカッ°プ
リングは起らない。ここで再度注意すれば、このような
反応方式は説明のための好ましいものであるが2発明の
限定のためのものではない。第一の反応方式は、「サン
ドイッチ」の形成と呼ぶことのできるもので、酵素また
は他のマーカーが連続し1層となって積重なり。Antibodies, antigens, or receptor and chromogen-responsive markers are denatured to react with or bind to carrier molecules. In their denatured state, no binding or coupling occurs between the marker and the antibody, antigen or receptor. It should be noted here again that such a reaction scheme is preferred for illustrative purposes, but is not intended to limit the invention. The first type of reaction is what can be called the formation of a "sandwich", in which enzymes or other markers are stacked in one continuous layer.
担体1分子当りのマーカーの量を増加させる。多くの担
体上への酵素またはマーカーのモル数な増加させる能力
は2反応サイトの数によるよりは立体障害によって一層
制限を受ける点に注意すべきである。層状化またはサン
ドイッチ技術はその制、限を克服する一方法である。基
本的には、この反応方式!容易に実行するために二つの
方法が考えられる。一つの方法は担体分子をマレイミド
化し。Increase the amount of marker per molecule of carrier. It should be noted that the ability to increase the number of moles of enzyme or marker on many carriers is more limited by steric hindrance than by the number of two reaction sites. Layering or sandwich technology is one way to overcome these limitations. Basically, this reaction method! Two methods can be considered to facilitate implementation. One method is to maleimide the carrier molecule.
およびマーカーおよび抗原をチオール化し、これと同時
又はひきつづいてこれら成分を所望比率で反応させるこ
とである。この方法は架橋なしに精製する点に困難を生
ずる傾向がある。and thiolation of the marker and antigen, and simultaneous or subsequent reaction of these components in the desired ratio. This method tends to create difficulties in purification without crosslinking.
別の方法は、担体なチオール化し、抗原およびマーカー
をマレイミド化し、これらを次いで反応させることであ
る。この方法では架橋なく容易に精製できる。好ましく
は9例えば次のように実施ア
できる。BSAまたは他の担体をN−〆セチルホモフッ
フィンチオラクトン(以下A、HTL)略す)を用いて
チオール化する。西洋ワサビペルオキシダーゼ(以下H
RPと略す)または他の2紫を6−マレイミドカプロン
ffN−ヒドロキシスクシンイミドエステル(以下MC
8と略す)でマレイミド化する。チオール化したBSA
&j4ないし5モルまでのマレイミド化HRPと反応さ
せてよい。Another method is to thiolate the carrier, maleimidize the antigen and marker, and then react them. This method allows easy purification without crosslinking. Preferably, for example, it can be implemented as follows. BSA or other carrier is thiolated using N-cetylhomofuffhinethiolactone (hereinafter A, HTL). Horseradish peroxidase (H
(hereinafter referred to as RP) or the other two purple 6-maleimidocaprone ffN-hydroxysuccinimide ester (hereinafter referred to as MC
(abbreviated as 8)) to maleimide. Thiolated BSA
&jIt may be reacted with up to 4 to 5 moles of maleimidized HRP.
この反応生成物を次いで例えば1,6−ジチオヘキサン
またはジチオスレイトールのようなジチオールと反応さ
せ、さらにマレイミド化HRPを添加することができる
。この添加はBSA担体1モル当りの酵素マーカーの追
加分のモル量を得るに必要な回数繰返してよい。つづい
てマレイミド化ACG(MC8によるもの)を、HR8
でサンドイッチされた担体分子と、チオール化BSA
1モル当りマレイミド化ACG約1ないし2モルの割合
で反応させる。得られた接合体を本発明の新規試薬の形
成のために抗体で処理されたナイロン又は他の同相に結
合させることができる。This reaction product can then be reacted with a dithiol, such as 1,6-dithiohexane or dithiothreitol, and further maleimidized HRP can be added. This addition may be repeated as many times as necessary to obtain additional molar amounts of enzyme marker per mole of BSA carrier. Next, maleimide ACG (by MC8) was added to HR8
carrier molecules sandwiched with and thiolated BSA
The reaction is carried out at a ratio of about 1 to 2 moles of maleimidated ACG per mole. The resulting conjugate can be coupled to antibody-treated nylon or other homologous phase to form the novel reagents of the invention.
コントロールされた反応を用いる上記「サンドイッチ」
方式の変法とじ℃、酢素(又は他のマーカー)の1合体
の形成も含まれる。そのような重合化は架橋反応を用い
た非特異的反応であるが。The above “sandwich” using a controlled reaction
Variations on the method also include the formation of a compound of acetic acid (or other marker). Although such polymerization is a non-specific reaction using a cross-linking reaction.
この架橋反応法は本明細書に列挙した先行技術におい又
は排斥されている。酵素の架橋形成はカルボジイミド、
ゲルタールアルデヒド、多−イソシアネー) (mul
ti−ispcyanates ) 、および同様の二
価ならびに多価の試薬であって、酵素富化重合体を形成
しうるものケ使用できる。次いでこの重合体を使用し又
接合体を形成するには9本明細書に記載された。酵素又
は他のマーカーに富む抗原、抗体またはりセプターの形
成のための種々の特異的反応によることができる。This crosslinking reaction method is excluded in the prior art listed herein. Enzyme crosslink formation is carried out by carbodiimide,
geltaraldehyde, polyisocyanate) (mul
ti-ispcyanates), and similar divalent and multivalent reagents that can form enzyme-enriched polymers. This polymer was then used to form conjugates as described herein. A variety of specific reactions for the formation of antigens, antibodies or receptors enriched with enzymes or other markers can be used.
前記第二の一般反応方式は、二種の方法で実行できる。The second general reaction scheme can be carried out in two ways.
この方式は、 Carlsson等「蛋白質のチオール
化及び可逆的蛋白質−蛋白質の接合」(前記)に報告さ
れたN−スクシンイジジル−3−(2−ピリジルチオ)
−プロピオネート(以下5PDPと略す)を使用する。This method is based on N-succiniidyl-3-(2-pyridylthio) reported in Carlsson et al., “Protein thiolation and reversible protein-protein conjugation” (cited above).
- Using propionate (hereinafter abbreviated as 5PDP).
この反応方式昏も例えば、フィコール7oを担体分子と
し1使用し、これをフィコール701モル当り約5ない
し20モルの5PDSと反応させることにより実行でき
る。This reaction mode can also be carried out, for example, by using Ficoll 7O as a carrier molecule and reacting it with about 5 to 20 moles of 5PDS per mole of Ficoll 70.
hCGまたは他の抗原もまた5PDPと反応させて。hCG or other antigens may also be reacted with 5PDP.
AC01モル当り1または2個のチオール基を与六るこ
とができる。次いで5PDP−変性フィコール7oおよ
び5PDP−変性hCGを、フィコール分子が担体1分
子当り1または2個のACG分子を有するような割合で
反応させることができる。One or two thiol groups can be present per mole of AC0. 5PDP-modified Ficoll 7o and 5PDP-modified hCG can then be reacted in a ratio such that the Ficoll molecules have 1 or 2 ACG molecules per carrier molecule.
次いで、HRPまたは他のマーカーを5PDPまたはA
、HTL’&使用し℃チオール化できる。次いでチオー
ル化HRPVACG−フィコール謁反応物と反応させて
、フィコール1分子当り1または2分子のACGおよび
フィコール1分子当り約4ないし15個のHRP分子を
有する接合体を得る。HRP or other markers are then added to 5PDP or A
, HTL'& can be thiolated at °C. It is then reacted with a thiolated HRPVACG-Ficoll reactant to yield a conjugate having 1 or 2 molecules of ACG per molecule of Ficoll and about 4 to 15 molecules of HRP per molecule of Ficoll.
第二の反応方式を行なう第二の方法をも ACG、HR
Pおよびフイコールラθの別々のチオール化およびこれ
ら三種反応成分のひきつづく同時反応による。この場合
も三成分のモル比は上記第1方法の場合と同様である。ACG, HR
By separate thiolation of P and Ficolla θ and subsequent simultaneous reaction of these three reactants. In this case as well, the molar ratios of the three components are the same as in the first method.
採用する方法にかかわらず。Regardless of the method adopted.
得られた接合体を次いで抗体処理ナイロン又は他の固体
支持体と結合させて本発明の試薬を形成する。こうして
得られた試薬は安定であり、取扱い容易の目的で予め形
成しておき、長期間安定し又保存できる。また9本発明
の試薬は遊離アミンと結合しない。The resulting conjugate is then coupled to antibody-treated nylon or other solid support to form the reagent of the invention. The reagents thus obtained are stable, can be preformed for ease of handling, are stable and can be stored for long periods of time. Also, 9 the reagents of the present invention do not bind to free amines.
接合体を抗体処理プレートに結合させるには。To bind the conjugate to antibody-treated plates.
これらの反応成分を、温度によっても異なるか典型的に
61約2時間ないし5日間、よりひんばんには約12時
間接触させればよい。固世に結合した得られた複合体を
次いで簡単に洗浄して2表面張力で付着した接合体な除
去する。しかしながら、接合体の散逸を防ぐためには、
固相を水に浸漬しな′いは5が良い。水性の調製接合体
は水により容易に溶解するため、固相に支持された接合
体と水との接触時間はできるだけ短かい方がよい点に注
意を要する。最後に9面相の表面の複合体の脱水を抑制
するため、保護コーティングとしてプロピレングリコー
ル−エチレングリ、コール、マニトールまたは同様な物
質を、浸漬または他の慣用法により固相に被覆させる。The reactants may be contacted for typically about 2 hours to 5 days, more frequently about 12 hours, depending on the temperature. The resulting rigidly bound complex is then briefly washed to remove the conjugate that is attached by surface tension. However, in order to prevent dissipation of the bonded material,
It is better not to immerse the solid phase in water. Since the aqueous prepared conjugate is easily dissolved in water, it should be noted that the contact time of the solid-supported conjugate with water should be as short as possible. Finally, to inhibit dehydration of the complex on the surface of the nine-sided phase, a protective coating of propylene glycol-ethylene glycol, mannitol or similar substances is applied to the solid phase by dipping or other conventional methods.
試薬を支持する得られた固相は9次いで空気乾燥し使用
に供される。The resulting solid phase supporting the reagents is then air dried and ready for use.
上記説明において特定の試薬を例としたが、これは説明
のためであり、上記試薬成分の多くのものが他のものと
交換可能であり、従って他の試薬成分の使用も可能であ
る。また9反応に関する説明の多くは妊娠判定によった
が9本発明の試薬は他の特定の用途も有しうる。例えば
子宮の触診ま “たは鯵音波ソノグラフィー(sono
graphy )によっ℃、胎児の着床が認められない
とぎ、ACGの定量は子宮外妊娠の存在を確認するため
にmWである。定量は既知濃度希釈について予めめたデ
ータを用いて行なう。子宮外妊娠に伴なう非常に低レベ
ルのACG生産も本発明の試薬によれば、試薬1分子当
り多量の酵素又は他のマーカーを用するため非常に高感
度であるから、容易に検出できる。本発明の試薬の他の
用途には9例えばステロイド類の分子、蛋白質分子およ
びホルモンの測定が含まれる。この点に関し1本発明の
試薬は2女性のニストロジエン、プロシュステロンおよ
び黄体形成、ホルモンを、尿および血液等の体液を用(
・で測定することにより、排卵および不妊の検査に利用
できる。この場合も本発明の試薬の感度&丁。Although specific reagents have been used as examples in the above description, this is for illustrative purposes only; many of the reagent components described above are interchangeable with others, and thus other reagent components may also be used. Additionally, although much of the description of the 9 reaction has been based on pregnancy testing, 9 the reagents of the present invention may have other specific uses as well. For example, palpation of the uterus or sonography (sonography).
If no fetal implantation is observed by graphy (graph), quantification of ACG is performed in mW to confirm the presence of an ectopic pregnancy. Quantification is performed using pre-existing data for dilutions of known concentrations. The very low level of ACG production associated with ectopic pregnancy can be easily detected using the reagent of the present invention, as it is highly sensitive due to the use of a large amount of enzyme or other marker per molecule of the reagent. . Other uses of the reagents of the invention include the determination of molecules such as steroids, protein molecules and hormones. In this regard, 1 the reagents of the present invention can be used to detect female nistrogiens, proshosterone and luteinizing hormones, using body fluids such as urine and blood.
・By measuring, it can be used for ovulation and infertility tests. Again, the sensitivity of the reagents of the invention.
例L&f−プロジエステロンやエストロザエン検出に用
いられた報告のある唾液の使用さえも可能とする。他の
用途には本試薬を流産の経験のある妊婦に用いることも
含まれる。担当医また一工妊婦自身がニス) l)オー
ルの比率を容易にモニターでき。Example L&F - even allows the use of saliva, which has been reported to be used to detect prodiesterone and estrozaene. Other uses include the use of this reagent in pregnant women who have experienced miscarriage. The attending physician or the pregnant woman herself can easily monitor the ratio of l) oar.
エストリオールレベルの低下は9例えば胎盤が正常に機
能し又いない等の妊娠障害を示唆する。Decreased estriol levels9 indicate a pregnancy disorder, such as a malfunctioning or not functioning placenta.
本発明の試薬の他の特定用途の説明を敷桁するため、従
来は前記のとおりLH検出により行われていた排卵試験
について述べる。本発明の試薬の感度および適応性は、
排卵の予知および検査(精密検定)のための夫々ニス)
pジエンおよびLH双方の測定を可能とする。例えば本
発明の試薬は。In order to explain other specific uses of the reagent of the present invention, an ovulation test conventionally performed by LH detection as described above will be described. The sensitivity and adaptability of the reagents of the invention are
Varnishes for predicting and testing ovulation (precise testing)
Allows measurement of both p-diene and LH. For example, the reagent of the present invention.
ニストロジエンの酵素マーカーとしてアルカリホスファ
ターゼを、そし”1(LHの酵素マーカーとしてHRP
V使用してよい。もちろん、その際本発明の試薬の製
造にニストロジエンとLHの混合物およびそれらの相当
する抗体を使用できる。その際検定反応は2例えばニス
トロジエンの色原体としてインドキンルホスフエートを
使用しく青色の発色は陽性結果を示す)9次いでLHの
色原体としてアミンアンチピリン(赤色の発色は陽性結
果を示す)を連続的に使用することができる。結果とし
1紫色の発色があったときは、ニストロジエンおよびL
H両者の存在を示唆する。このような二重検出方法の利
点には、特徴的色彩(および/またはバクーン)の発生
並びに一種または二種以上の色原体応答性マーカーを用
いることにより。Alkaline phosphatase was used as an enzyme marker for nistrodiene, and HRP was used as an enzyme marker for LH.
V may be used. Of course, mixtures of nistrogienes and LH and their corresponding antibodies can then be used for the preparation of the reagents according to the invention. In this case, the assay reaction is 2.For example, indoquine phosphate is used as a chromogen for nistrodiene (blue coloration indicates a positive result) 9. Then amine antipyrine is used as a chromogen for LH (red coloration indicates a positive result) can be used continuously. As a result, if there is a purple color, Nistrodiene and L
H suggests the existence of both. Advantages of such dual detection methods include the generation of characteristic colors (and/or bacoons) and the use of one or more chromogen-responsive markers.
単独では弱いか又は検出困難な色を生ずる色原体を用い
うる点である。さらに、二種またはそれ以上のホルモン
(または他の分子)を測定すべきことによる誤った判定
の危険が減少する。したがって9本発明の試薬におい1
種々の成分の混合物及び組合せの使用(ち本発明の範囲
に含まれる。The advantage is that chromogens can be used that alone produce colors that are weak or difficult to detect. Furthermore, the risk of false positives due to having to measure two or more hormones (or other molecules) is reduced. Therefore, in the reagent of the present invention 1
The use of mixtures and combinations of the various components is within the scope of the invention.
以下の実施例に基づいて本発明の実施について述べるが
、この例のみに限定されるものではない。The implementation of the present invention will be described based on the following examples, but is not limited to these examples only.
この明細書生金ての単位はメートル法により2本明細書
に配賦した全ての文献は参照により本明細書に含まれる
。All references herein are incorporated by reference.
実施例 1
抗ACG−標識ナイロン6マトリツクスの製造ナイロン
−6プレー) (0,317xl−27x10.16(
1m )を3 N Hcl溶液に37″Cで1時間浸漬
した。次いでプレートを流水で充分洗浄し9次いで蒸溜
水で3回ゆすいだ。このアミン化プレーを9素で飽和し
たイミダゾールの1モル溶液中の0.05モルAHTL
で一晩チオール化した。チオール化プレー)’/fi返
し0.2モル酢酸で洗浄し。Example 1 Preparation of anti-ACG-labeled nylon 6 matrix
1 m) was immersed in a 3 N HCl solution for 1 hour at 37"C. The plate was then thoroughly washed with running water and then rinsed three times with distilled water. The aminated plate was soaked in a 1 molar solution of imidazole saturated with element 9. 0.05 mol AHTL in
The mixture was thiolated overnight. Wash with 0.2M acetic acid.
洗液中にエルメンス反応(Elmens reacti
on )でチオール化合物が検出されなくなるまで洗浄
した。Elmens reaction (Elmens reaction) is carried out in the washing solution.
on) until no thiol compounds were detected.
慣用法で調製ならびに純化した抗β−ACGをMC8で
軽くマレイミド化しくr−グロブリン1モル当り約1な
いし2個のマレイミド基)、ゲル濾過で精製して凍結乾
燥した。Anti-β-ACG prepared and purified by conventional methods was lightly maleimidized with MC8 (about 1 to 2 maleimide groups per mole of r-globulin), purified by gel filtration, and lyophilized.
チオール化ナイロン6プレートを004%EDTA及び
0.2■/mlのマレイミドr−グロブリンを含有し、
9素で飽和した01モルコハク酸バッファー(pH6,
0)中に浸漬した。浸漬プレートをこの溶液中で室温に
て一夜撮とうした。次いでプレートをその表面に残存す
る遊離SH基をブロックするためN−エチルマレイミド
を含有する15%食塩水に浸漬した。30分浸漬後、プ
レートを取り出し、8度15%食塩水で洗浄し8次いで
洗液が280nmの吸収を示さなくなる点に到達するま
で必要な回数だけ十分に水洗した。Thiolated nylon 6 plates containing 0.04% EDTA and 0.2 μ/ml maleimide r-globulin;
01 molar succinate buffer saturated with element 9 (pH 6,
0). Dip plates were photographed in this solution overnight at room temperature. The plate was then immersed in 15% saline containing N-ethylmaleimide to block free SH groups remaining on its surface. After immersing for 30 minutes, the plate was taken out and washed eight times with 15% saline, and then thoroughly washed with water as many times as necessary until the point at which the washing solution no longer showed absorption at 280 nm was reached.
プレートの抗原結合能は、既知の特定、活性を有する1
21)IACGを用いてラジオイムノアッセイで測定し
た。The antigen binding capacity of the plate is 1 with known specificity and activity.
21) Measured by radioimmunoassay using IACG.
実施例 2
ACG分子表面のアミン基をMC8で十分にマレイミド
化し、ゲル透過クロマトグラフィーで精製した。HRP
酵素をAHTI、で軽くチオール化し。Example 2 The amine groups on the surface of the ACG molecule were sufficiently maleimidized with MC8, and purified by gel permeation chromatography. HRP
Lightly thiolate the enzyme with AHTI.
’HRP1分子当り約1ないし2個のチオール基を含む
ようにした〔チオール化反応の進行の追跡は。'The HRP contained about 1 to 2 thiol groups per molecule [to monitor the progress of the thiolation reaction].
フルオロスカミンーフルオロメトリック法(Fl−uo
roscamin−Fluorometric met
hod )を用いて行なった〕。このチオール化酵素生
成物を0.2モル酢酸に対して透析して凍結乾燥した。Fluoroscamine-fluorometric method (Fl-uo
roscamin-Fluorometric met
hod)]. The thiolating enzyme product was dialyzed against 0.2 molar acetic acid and lyophilized.
チオール化hCG生成物およびチオール化HRP酵素の
双方を、0.04%EDTAv含有し、9素で飽和しり
0.1モルコノ・りψバッファー(pH6,0)K溶解
した。得られた接合体をセファクリルS −200のカ
ラムで精製した。Both the thiolated hCG product and the thiolated HRP enzyme were dissolved in 0.1 molar ψ buffer (pH 6,0) containing 0.04% EDTA and saturated with 9. The obtained conjugate was purified using a Sephacryl S-200 column.
HRP−BSAコポリマーの調製 BSAのアミノ基の約にをAHTLでチオール化した。Preparation of HRP-BSA copolymer About half of the amino groups of BSA were thiolated with AHTL.
チオール化BSAを0.2M酢酸に対して透析し、凍結
乾燥した。次いでHRPIMC8によって各HRP酵素
分子が約3個のマレイミド基を有するようにマレイミド
化した。これらの変性蛋白質を次いでN飽和0.1Mス
クシネートバッファー、pH6,0,O14%EDTA
、中で反応させ壬BSA分子1個当り約4−5個のHR
P分子を有するBSAを製造した。重合生成物は分子量
が増加し又いるため9通常のゲル濾過クロマトグラフィ
ーによってモノマー反応体から分離された。The thiolated BSA was dialyzed against 0.2M acetic acid and lyophilized. Each HRP enzyme molecule was then maleimidized by HRPIMC8 so that it had about 3 maleimide groups. These denatured proteins were then washed with N-saturated 0.1 M succinate buffer, pH 6.0, O 14% EDTA.
, about 4-5 HR per BSA molecule.
BSA with P molecules was produced. The polymerized product was separated from the monomeric reactants by conventional gel filtration chromatography due to its increased molecular weight.
分離したBSA−HRP コポリマーを1,6−ジチオ
ヘキサン(またはジチオトリトール)と反応させて、B
SA分子に結合している各)(R,P中に1〜2個のチ
オール基を導入した。このチオール化生成物を前記調製
したマレイミド化HRPの追加分と反応させた。得られ
た生成物をゲル濾過によっ1モノマーHRPと分離して
凍結乾燥した。The separated BSA-HRP copolymer was reacted with 1,6-dithiohexane (or dithiothritol) to
One to two thiol groups were introduced into each (R, P) attached to the SA molecule. This thiolated product was reacted with an additional portion of the maleimidized HRP prepared above. The resulting product The product was separated from monomer HRP by gel filtration and lyophilized.
この工程は多層HRP−BSA生成物V得るのに必要な
回数だけ繰返すことができる。This process can be repeated as many times as necessary to obtain the multilayer HRP-BSA product V.
ACG分子をMC8で軽くマレイミド化し、ACG1モ
ル当り1ないし2当量のマレイミド基が存在するように
した。前記多層HRP−BSA生成物を次いでジチオス
レイトール(または1,6−ジチオヘキサン)と反応さ
せてHRP分子の最後の層上に一8H基を導入した。マ
レイミド化したhCGとチオール化し?、:HRP−B
SA生成物(各酸分のモル比1:10)を次いでN2−
飽和0.1 Mスクシネート、pH6,0,0,04%
EDTA に溶解し、生成物ケゲル濾過で分離した。酵
素標識ホルモン接合体生成物中のHRPとACGの割合
を。The ACG molecule was lightly maleimidated with MC8 so that 1 to 2 equivalents of maleimide groups were present per mole of ACG. The multilayer HRP-BSA product was then reacted with dithiothreitol (or 1,6-dithiohexane) to introduce 18H groups onto the last layer of HRP molecules. Maleimidated hCG and thiolated? , :HRP-B
The SA product (1:10 molar ratio of each acid) was then treated with N2-
Saturated 0.1 M succinate, pH 6,0,0,04%
Dissolved in EDTA and separated the product by Kegel filtration. The proportion of HRP and ACG in the enzyme-labeled hormone conjugate product.
I(RPに対するスペクトロフォトメトリー(基負には
、フェノール中の4−アミノアンチピリン溶液をホス7
エートバツフアー、pH7,0,中〕希過酸化水素と混
合したものを用いた)および。Spectrophotometry for I (RP)
ate buffer, pH 7.0, mixed with dilute hydrogen peroxide) and.
ACGに対するRIAによって測定した。Measured by RIA for ACG.
r−グロブリン標識ナイロンプレートのいくつかは、別
に前記調製各ACG7BSA−HRP接合体を含む0.
2%BSA−PBS溶液(BSA溶11m7当り約1〜
7IU力価の接合体)に5日間浸漬して抗原結合サイト
を飽和させた。Some of the r-globulin-labeled nylon plates were prepared separately as described above, containing each ACG7BSA-HRP conjugate.
2% BSA-PBS solution (approx.
The antigen binding sites were saturated by immersion in a conjugate with a titer of 7 IU for 5 days.
実施例 3
HRP−フィコール−ACG
方法A
021Mボレートバッファー、p)T8.5.の最少量
中に溶解したアミンへキシル−フィコ−/”70’42
0モル過剰量のN−スクシンイミジル−3−(2−ピリ
ジルチオ)−プロピオネ−) (DMFに溶解した5P
DP)と、室温で45分間反応させた。チオール化フィ
コール7o生成物をセファ、デックスG25水性カラム
でゲル濾過して精製し、カラムのボイド部分から回収し
た物質を凍結乾燥した。5PDP変性の程度は、スペク
トロフォトメトリーにより、チオール化合物2例えばシ
スティンを反応させてフィコール7oから遊離された2
−チオピリドンの分子吸光係数8.0O8X103M−
1(’を用いて決定した。最適数の5PDP基はフィコ
ール7゜1モル当り5ないし加当量であった。Example 3 HRP-Ficoll-ACG Method A 021M borate buffer, p) T8.5. amine hexyl-phyco-/”70'42 dissolved in the minimum amount of
0 molar excess of N-succinimidyl-3-(2-pyridylthio)-propione-) (5P dissolved in DMF)
DP) for 45 minutes at room temperature. The thiolated Ficoll 7o product was purified by gel filtration on a Sepha, Dex G25 aqueous column, and the material recovered from the column void was lyophilized. The extent of 5PDP denaturation was determined by spectrophotometry when 2 was released from Ficoll 7o by reacting with thiol compounds 2, such as cysteine.
-Molecular extinction coefficient of thiopyridone 8.0O8X103M-
The optimum number of 5PDP groups was determined using 1(').
A CGのチオール誘導体は、HRPのチオール化につ
いて前記したようにして、チオール化試薬に ′5PD
Pを使用し1調製した。チオール化の程度は担体分子中
のアミン基の消費を追跡し又螢光法によりモニターした
。チオール化の最適程度は。The thiol derivative of ACG was added to the thiolating reagent as described above for the thiolation of HRP.
1 was prepared using P. The extent of thiolation was followed by consumption of amine groups in the carrier molecule and monitored by fluorescence. What is the optimal degree of thiolation?
ACGI当量当り一8HI当量である。チオール化hC
G生成物v0.2 M酢酸溶液を用いたセファデックス
G−25のゲル濾過に付した。カラムのボイド部分から
回収した精製チオール化A CG ’/ r回収量およ
び一8Hm含量に関してスペクトロフォトメトリーで分
析した。生成物を窒素雰囲気中で炭酸水素ナトリウムの
添加によりpH4,7とし。There are 18 HI equivalents per ACGI equivalent. thiolated hC
G product v was subjected to gel filtration on Sephadex G-25 using a 0.2 M acetic acid solution. The purified thiolated ACG'/r recovered from the void section of the column was analyzed spectrophotometrically for recovery and -Hm content. The product was brought to pH 4.7 by addition of sodium bicarbonate under nitrogen atmosphere.
前記調整チオール化フィコールとのカップリングに使用
した。It was used for coupling with the prepared thiolated Ficoll.
pH調節したチオール化hCG溶液に十分量の凍結乾燥
5PDP−フィコールを添加して、夫々のモル比をl:
2とした。この反応は窒素雰囲気中で室温で実施し2反
応の進行を2−チオピリドンの遊離をスペクトロフォト
メトリー(0,D。Sufficient amount of lyophilized 5PDP-Ficoll was added to the pH-adjusted thiolated hCG solution to adjust the respective molar ratio to l:
It was set as 2. The reaction was carried out at room temperature in a nitrogen atmosphere, and the progress of the two reactions was monitored by spectrophotometry (0, D).
343nm)でモニターすることにより追跡した。343 nm).
0、D、343nmが最大値に達したとき2反応混合物
をPMIO膜を通して限外濾過して約25rrQ /m
lにに濃縮した。0, D, 343 nm when the maximum value was reached.2 The reaction mixture was ultrafiltered through a PMIO membrane to approximately 25 rrQ/m
Concentrated to l.
1M炭酸水素ナトリウムに溶解したHRPのアミ7基を
シトラコニル化し、過ヨウ素酸ナトリウムの添加により
酸化してその炭水化物の一部を除いてアルデヒド基を生
じさせ、このアルデヒド基を次いでb 6−ジアミツヘ
キサンの2M溶液による遣元的アミン化に付した。次い
で生成物を脱塩し、凍結乾燥した。アミノ化HRPをA
HTLにより、HRP−NH2各モル当りAHTLをた
だ1モルのみ受け取る程度にチオール化した。チオール
化HRPを0.01酢酸−セファデックスG−25カラ
ムでゲル濾過して精製した。ボイド部分の物質を回収し
、N2雰囲気中で炭酸水素ナトリウム粉末?添加し1そ
のpHv4.7に調節した。The ami7 group of HRP dissolved in 1M sodium bicarbonate is citraconylated and oxidized by the addition of sodium periodate to remove a portion of its carbohydrate to yield an aldehyde group, which is then converted to b6-diamid. It was subjected to radical amination with a 2M solution in hexane. The product was then desalted and lyophilized. Aminated HRP
HTL thiolated to the extent that only one mole of AHTL was received for each mole of HRP-NH2. The thiolated HRP was purified by gel filtration on a 0.01 acetic acid-Sephadex G-25 column. Collect the material in the void area and powder it with sodium bicarbonate in an N2 atmosphere. The pH was adjusted to 4.7.
最後にチオール化HRR溶液を、濃縮したACG−フィ
コール接合体溶液(pH4,7)と混合し、混合物vN
2雰囲気で室温にて16時間振とうした。Finally, the thiolated HRR solution was mixed with the concentrated ACG-Ficoll conjugate solution (pH 4,7) and the mixture vN
The mixture was shaken at room temperature under 2 atmospheres for 16 hours.
(hca:フイコール:)IRPのモル比は2:1:(
4−15)である)。反応?止めるため十分量のシステ
ィンを添加して、フィコールフロ分子上の残存遊離5P
DP基を非反応性S−システイニル−8−プロピオニル
付加物に転換した。生成物を0.2M硫酸アンモニウム
、0.05Mリン酸ナトリウム+I)H6,8中のセフ
ァクリル200カラムを通過するゲル透過クロマトグラ
フィーで精製し、未接合のACG 、HRPおよびシス
ティンを除去した。ボイド部分の物質をカラムから回収
し、ACG 含量をRIAにより、そしてHRP含量を
スペクトロフォトメトリーにより分析した。生成物’&
0.05%ツイーン20−0.1Mリン酸ナトリウム、
pH6,8で約1.0 I U / mlとなるよう希
釈した。The molar ratio of (hca:ficoll:)IRP is 2:1:(
4-15)). reaction? Add enough cysteine to stop the remaining free 5P on the Ficoll-furo molecule.
The DP group was converted to a non-reactive S-cysteinyl-8-propionyl adduct. The product was purified by gel permeation chromatography through a Sephacryl 200 column in 0.2 M ammonium sulfate, 0.05 M sodium phosphate + I)H6,8 to remove unconjugated ACG, HRP and cysteine. The void material was collected from the column and analyzed for ACG content by RIA and HRP content by spectrophotometry. product'&
0.05% Tween 20-0.1M sodium phosphate,
It was diluted to approximately 1.0 IU/ml at pH 6.8.
友迭」−
アミノ−HRPおよびACG分子各々を、別々に前記記
載に従い5PDPによってチオール化し、生成したチオ
ール化誘導体を精製および凍結乾燥した。アミノ−へキ
シル−フィコール7o試薬なAHTLでチオール化しく
チオール化の液適程度はアミンへキシル−フィコール7
01モル当す10ないし加当量である)、HE成物を0
1〜4’Cで0.1モル酢酸−セファデックスG−25
カラムを通してゲル濾過して精製した。ボイド部分の物
質を回収し、粉末炭酸水素ナトリウムを用いて酸性をp
H4,7に調節した。凍結乾燥したHCGおよびHRP
の各5PDP誘導体を、ゲル濾過後のチオール化“フィ
コール7oの希釈溶液に添加した。この反応は室温でA
CG:フイコール70:HRPの最適モル比2:1:(
4−15)により実施した。この接合反応の終了時に9
反応混合物に十分量のS(2−ピリジルチオール)シス
ティンを添加してフィコール7o上に残存するチオール
基を非架橋性側鎖に転換させた。得られた生成物を、0
.2モル硫酸アンモニウム−005モルリン酸ナトリウ
ム+I)H6,8,溶液中のセファクリルS −200
カラムを通してゲル濾過して精製した。Amino-HRP and ACG molecules were each separately thiolated with 5PDP as described above, and the resulting thiolated derivatives were purified and lyophilized. Thiolate with amino-hexyl-ficoll 7o reagent AHTL.The appropriate amount of thiolation is amine-hexyl-ficoll 7.
0 to 1 mole), the HE composition is 0
0.1 molar acetic acid at 1-4'C - Sephadex G-25
It was purified by gel filtration through a column. Collect the material in the void area and remove the acidity using powdered sodium bicarbonate.
Adjusted to H4.7. Lyophilized HCG and HRP
of each 5PDP derivative was added to a dilute solution of thiolated "Ficoll 7o" after gel filtration. The reaction was carried out at room temperature with A
Optimum molar ratio of CG: Ficoll 70: HRP 2:1:(
4-15). 9 at the end of this conjugation reaction
A sufficient amount of S(2-pyridylthiol) cysteine was added to the reaction mixture to convert the remaining thiol groups on Ficoll 7o to non-crosslinkable side chains. The obtained product was reduced to 0
.. 2 molar ammonium sulfate - 005 molar sodium phosphate + I) H6,8, Sephacryl S -200 in solution
It was purified by gel filtration through a column.
実施例 4
実施例3の方法により、ACG、HRPおよびフィコー
ル7oの接合体を調製し、実施例1の方法で得たr−グ
ログリン感作ナイロンプレートに、この接合体を結合さ
せた。5個の長方形試験容器に非妊婦尿0.5miを添
加した。容器の/I62. 3. 4および5に添加し
た尿には、尿1 ml当り各々12,525、50およ
び100mIUのACG (第二回国際標準品)も添加
した。Example 4 A conjugate of ACG, HRP and Ficoll 7o was prepared by the method of Example 3, and this conjugate was bonded to the r-globulin sensitized nylon plate obtained by the method of Example 1. 0.5 mi of non-pregnant urine was added to 5 rectangular test vessels. /I62 of the container. 3. To the urine added in 4 and 5, 12,525, 50 and 100 mIU of ACG (second international standard) per ml of urine were also added.
各容器に接合体を結合したナイロンプレートラ同時に挿
入し、室温に30分放置した。次いで各プレートを取り
除いた。次いで各容器に基質溶液0、5 mlを添加し
た。基質溶液は、1,6%フェノール水溶液中の005
%アミノアンチピリン’&、0.2M K 2 HP
04 ハラ77 + pH7−0+中ノQ、 03%H
,02溶液と1量比1:1で混合したものである。The conjugate-bonded nylon plates were simultaneously inserted into each container and left at room temperature for 30 minutes. Each plate was then removed. Then 0.5 ml of substrate solution was added to each container. The substrate solution was 005 in 1.6% phenol aqueous solution.
% Aminoantipyrine'& 0.2M K 2 HP
04 Hara 77 + pH7-0+NakanoQ, 03%H
, 02 solution at a ratio of 1:1.
10分後に容器A l l’lj被検尿の色の変化を示
さなかった。容器/162および/163は深い桃色を
、そして容器屑4および扁5は暗い赤紫色な呈した。After 10 minutes, the container A l l'lj showed no change in the color of the test urine. Containers /162 and /163 had a deep pink color, and container scraps 4 and 5 had a dark reddish-purple color.
これらの結果は9本アッセイ法が尿中の12.5mIU
/m/!程度の少量のhCGを検出でき、しかも非妊婦
尿中にはACGが検出されぬことケ示すもので−ある。These results show that the nine assay methods yielded 12.5 mIU in urine.
/m/! This shows that a relatively small amount of hCG can be detected, and ACG is not detected in the urine of non-pregnant women.
第1図は本発明の試薬の模式図を表わし9例えば妊婦尿
中のACGの測定時における交換反応の模様も示す。
第2図はH1図における測定反応の結果生じた交換生成
物の模式図を表わす。
なお図中各記号は次の意味である。
−一ノ抗体1例えばr−グロブリン
ーーー\
O試薬の抗原9例えばACG
CII)担体分子9例えばフィコール7゜◇
マーカー、例えばHRPの様な酵素
△ 測定すべき抗原9例えば妊婦尿中のCG
図面の浄書(内容に変更なし)
手続補正書
昭和’go年夕月 2日
昭和り年特許願第 12/ψ1号
事件との関係 特許出願人
住所
%11 り01シ“’<Z・lクス・インコーホに一テ
21μ゛4、代 埋 人
5、補正の対象
/FIG. 1 shows a schematic diagram of the reagent of the present invention, and also shows the exchange reaction pattern when measuring ACG in urine of pregnant women, for example. FIG. 2 represents a schematic representation of the exchange products resulting from the reaction measured in diagram H1. Each symbol in the figure has the following meaning. -Antibody 1 For example r-globulin \ Antigen of O reagent 9 For example ACG CII) Carrier molecule 9 For example Ficoll 7 ◇ Marker, for example enzyme like HRP △ Antigen to be measured 9 For example CG in pregnant woman's urine (No change in content) Procedural amendment 2nd day of Showa 'go' Yuzuki 2nd Showa 1999 Patent Application No. 12/ψ1 Relationship to Case Patent Applicant Address %11 ri01shi"'<Z・lx・incoho Itte 21μ゛4, Substitute person 5, Subject of correction/
Claims (1)
と抗原、担体分子および色原体応答性マーカーのコンジ
−ゲート(以下、接合体という)との反応生成物; (bl抗原を結合した同相支持体マトリックスと抗体、
担体分子および色原体応答性マーカーの接合体との反応
生成物; (clリセプターを結合した同相支持体マトリックスと
りセプター結合性分子、担体分子および色原体応答性マ
ーカーの接合体との反応生成物;および (d) IJセプター結合性分子を結合した固相支持体
マトリックスとりセプター、担体分子および色原体応答
性マーカーの接合体との反応生成物;よりなる、群から
選択される反応生成物である。ことを特徴とする。抗体
−抗原反応またはりセプターーリセプター結合性分子反
応の一反応成分の測定用試薬。 (2)反応生成物が(atまたは(blOものである特
許請求の範囲第1項記載の試薬。 (3)試薬製造のために、成分の混合物を使用する特許
請求の範囲第1項記載の試薬。 (4)マトリックスがナイロン、ポリブタジェン。 ホリスチレン、ブタジェン、−スチレンコポリマー。 ガラスピーズ、アガロース、セルロース、リン脂質二層
膜であるリポソーム、ラテックス、デキストランおよび
濾紙よりなる群から選択される特許請求の範囲第1項記
載の試薬、 (5)マトリックスがナイロンである特許請求の範囲第
4項記載の試薬。 (6)抗原がゴナドトロピン糸ホルモンである特許請求
の範囲第2項記載の試薬。 (7) マーカーカ;酵素、フェノール、ヘム、酵素の
コファクター、染料、化学発光物質前側体、酵素基質、
螢光色素、螢光端、螢光消去剤およびそれらの混合物よ
りなる群から選択される特許請求の範囲第1項記載の試
薬。 (8)マーカーが酵素よりなる特許請求の範囲第7項記
載の試薬。 (9)酵素がペルオキシダーゼである特許請求の範囲第
8項記載の試薬。 ad 接合体の担体分子が、シ−−ロースポリマー、ウ
シ血清アルブミンまたはそれらの混合物である特許請求
の範囲第1項記載の試薬。 a■ 接合体の担体分子がシェークロースポリマーから
なる特許請求の範囲第10項記載の試薬。 t21 接合体が抗原または抗体の1分子当り約1ない
し15分子のマーカーを含有する特許請求の範囲第2項
記載の試薬。 aj 接合体が抗原または抗体の1分子当り約4ないし
15分子の酵素を含有する特許請求の範囲第2項記載の
試薬。 a4 反応生成物(a)がシュークロースポリマー1分
子当り1または2分子のヒト絨毛性ゴナドトロピンおよ
び約4ないし15分子のベルオキ7ダーゼを有、するシ
ュークロースポリマー担体よりなる3合体と反応させた
、抗β−ヒト絨毛性ゴナドトロピンを結合したナイロン
−6支持体マトリック7よりなる特許請求の範囲第1項
記載の試薬。 as (a)固相支持体マ) IJワックス抗体を共有
結合で結合させ。 (bl上記と別に抗原の担体分子および色原体応答性マ
ーカーの接合体を形成し、そしてことよりなる、抗体−
抗原反応の一成分の測定に有用な試薬の製造方法。 16)試薬製造のために成分の混合物を使用する特許請
求の範囲第15項記載の方法。 aり 同相支持体マトリックスがナイロンよりなる特許
請求の範囲第15項記載の方法。 t8 抗原と抗体ケ逆に使用して反応ケ行なう特許請求
の範囲第15項記載の方法。 番9 抗原がゴナドトロピン系ホルモンである特許請求
の範囲第15項記載の方法。 (ハ)色原体応答性マーカーが、酵素、フェノール、ヘ
ムおよびそれらの混合物よりなる群から選択される特許
請求の範囲第15項記載の方法。 (21)マーカーが酵素である特許請求の範囲第四項記
載の方法。 (22) 酵素力ベルオキシダーゼである特許請求の範
囲第1項記載の方法。 (23)接合体が担体分子1個当り1または2分子の抗
原および約4ないし15分子のマーカーを有する特許請
求の範囲第15項記載の方法。 (24)固相支持体マトリックスがナイロンであり。 担体分子がウシ血清アルブミンまたはシュークロースポ
リマーであり、マーカーが酵素であり、そして抗原がヒ
ト絨毛性ゴナドトロピンである特許請求の範囲第23項
記載の方法。 (25) (a)抗体を結合した同相支持体マトリック
スと抗原の担体分子および色原体応答性マーカーの接合
物との反応生成物である試薬を用意し。 (b)測定すべき成分を含有するサンプルを。 免疫反応が生じるに十分な時間、上記試薬と接触させ。 (C)上記支持体マトリックスを上記サンプルとの接触
状態から取り除き。 (d)上記マーカーに応答性の色原体を上記サンプルに
添加し、そして fe)上1己サンプルケ袈察してその中の上記測定すべ
き成分の検出閾値を示す色の発生が生じたか否かを判定
する1、 ことよりなる抗原−抗体反応の一成分の免疫学的測定方
法。 (26)同相支持体マトリックスがナイロンであり。 マーカーが酵素であり、抗原がゴナドトロピン系ホルモ
ンである特許請求の範囲第23項記載の方法。 (27)ホルモンがヒト絨毛性ゴナドトロピンである特
許請求の範囲第24項記載の方法。 (28)酵素がペルオキシダーゼである特許請求の範囲
第25項記載の方法。 (29)接合体の担体分子がシー−クロースポリマーで
ある特許請求の範囲第25項記載の方法。 (30)試薬製造のために成分の混合物を使用する特許
請求の範囲第25項記載の方法。 (31)工程(diで色原体の混合物を使用する特許請
求の範囲第30項記載の方法。 (32)工程(diを各回に異なる色原体により連続的
に繰返す特許請求の範囲第30項記載の方法。 (33) (a)の試茗がニストロジエンとLI−(の
混合物。 それらの各抗体および色原体応答性マーカーから形成さ
れ、そして工程(dlにおいて複数の色原体を混合物と
してまたは連続的に添加することよりなる。ニストロジ
エンと黄体形成ホルモン(LH)の両者を測定するため
の特許請求の範囲第25項叢己戴の方法。 (34)マーカーがアルカリホスファターゼよりなり、
そして工程(dlがp−二トロフェノールおよびエンド
キシルホスフェート(endoxyl phospha
−1e)を任意の順序で連続的に添加することにより行
なわれろ、今許請求の節、囲第33項記載の方法。 (35)一方の成分が不溶化体であり、他方の成分が酵
素に結合されているタイプの抗体−抗原反応またはりセ
ブターーリガンド反応の一成分を測定および (bl上記篇二蘂→→他方の成分におよび該成分1分子
当り約4ないし15分子の色原体応答性マーカーを有す
る担体分子の接合体の形で供給される屏銅二成分。 よりなることを特徴とする試薬。 (36)色原体応答性マーカーが酵素である特許請求の
範囲第35項記載の試薬。 (37)第一成分が抗体またはりセンターであり。 そして第二成分が抗原またはリガンドである特許請求の
範囲第35項記載の試薬。[Scope of Claims] (il (reaction product of a solid support matrix bound with an al antibody and a conjugate (hereinafter referred to as a conjugate) of an antigen, a carrier molecule, and a chromogen-responsive marker; (bl a homogeneous support matrix bound to an antigen and an antibody;
Reaction product of a conjugate of a carrier molecule and a chromogen-responsive marker; (reaction product of a conjugate of a receptor-binding molecule, a carrier molecule, and a chromogen-responsive marker with an in-phase support matrix bound to a cl receptor; a reaction product selected from the group consisting of: A reagent for measuring one reaction component of an antibody-antigen reaction or a receptor-receptor binding molecule reaction. (2) The reaction product is (at or (bIO). A reagent according to claim 1. (3) A reagent according to claim 1, wherein a mixture of the components is used for the preparation of the reagent. (4) The matrix is nylon, polybutadiene. Folystyrene, butadiene, -styrene copolymer. (5) The reagent according to claim 1, which is selected from the group consisting of glass beads, agarose, cellulose, liposomes that are phospholipid bilayer membranes, latex, dextran, and filter paper; (5) the matrix is nylon; (6) The reagent according to claim 2, wherein the antigen is a gonadotropin hormone. (7) Marker: enzyme, phenol, heme, enzyme cofactor, dye, chemiluminescence. substance anterior body, enzyme substrate,
A reagent according to claim 1 selected from the group consisting of fluorescent dyes, fluorescent ends, fluorescent quenchers and mixtures thereof. (8) The reagent according to claim 7, wherein the marker is an enzyme. (9) The reagent according to claim 8, wherein the enzyme is peroxidase. 2. The reagent of claim 1, wherein the carrier molecule of the ad conjugate is a searose polymer, bovine serum albumin, or a mixture thereof. The reagent according to claim 10, wherein the carrier molecule of the a■ conjugate comprises a Shakrose polymer. 3. The reagent of claim 2, wherein the t21 conjugate contains about 1 to 15 molecules of marker per molecule of antigen or antibody. 3. The reagent of claim 2, wherein the aj conjugate contains about 4 to 15 molecules of enzyme per molecule of antigen or antibody. a4 reaction product (a) is reacted with a triad consisting of a sucrose polymer carrier having 1 or 2 molecules of human chorionic gonadotropin and about 4 to 15 molecules of berooxidase per sucrose polymer molecule; The reagent according to claim 1, comprising a nylon-6 support matrix 7 to which anti-β-human chorionic gonadotropin is bound. (a) Solid phase support M) Covalently bond IJ wax antibody. (bl) An antibody-
A method for producing a reagent useful for measuring one component of an antigen reaction. 16) A method according to claim 15, in which a mixture of components is used for the preparation of the reagent. 16. The method of claim 15, wherein the in-phase support matrix is made of nylon. 16. The method according to claim 15, wherein the reaction is carried out by using the t8 antigen and the antibody in reverse. No. 9: The method according to claim 15, wherein the antigen is a gonadotropin hormone. 16. The method of claim 15, wherein (c) the chromogen-responsive marker is selected from the group consisting of enzymes, phenols, heme, and mixtures thereof. (21) The method according to claim 4, wherein the marker is an enzyme. (22) The method according to claim 1, wherein the enzyme is peroxidase. (23) The method of claim 15, wherein the conjugate has 1 or 2 molecules of antigen and about 4 to 15 molecules of marker per carrier molecule. (24) The solid support matrix is nylon. 24. The method of claim 23, wherein the carrier molecule is bovine serum albumin or a sucrose polymer, the marker is an enzyme, and the antigen is human chorionic gonadotropin. (25) (a) Providing a reagent that is a reaction product of a homogeneous support matrix bound to an antibody and a conjugate of a carrier molecule of an antigen and a chromogen-responsive marker. (b) A sample containing the component to be measured. Contact with the reagent for a sufficient time to generate an immune response. (C) removing the support matrix from contact with the sample; (d) adding a chromogen responsive to the marker to the sample; and (fe) examining the sample to determine whether a color indicative of the detection threshold of the component to be measured occurs in the sample; 1. A method for immunologically measuring a component of an antigen-antibody reaction. (26) The in-phase support matrix is nylon. 24. The method according to claim 23, wherein the marker is an enzyme and the antigen is a gonadotropin hormone. (27) The method according to claim 24, wherein the hormone is human chorionic gonadotropin. (28) The method according to claim 25, wherein the enzyme is peroxidase. (29) The method according to claim 25, wherein the carrier molecule of the conjugate is a sea-close polymer. (30) The method according to claim 25, wherein a mixture of components is used for producing the reagent. (31) The method according to claim 30, wherein the step (di) uses a mixture of chromogens. (32) The method according to claim 30, wherein the step (di) is continuously repeated each time with a different chromogen. The method described in Section 3. (33) The test sample of (a) is a mixture of nistrogien and LI-() formed from their respective antibodies and a chromogen-responsive marker, and in step (dl) a mixture of multiple chromogens is formed. (34) The marker consists of alkaline phosphatase,
and step (dl is p-nitrophenol and endoxyl phosphate)
-1e) in any order, the method according to claim 33 of the present claim. (35) Measurement of one component of an antibody-antigen reaction or a receptor-ligand reaction in which one component is an insolubilized form and the other component is bound to an enzyme; A reagent characterized in that it is supplied in the form of a conjugate of a component and a carrier molecule having about 4 to 15 molecules of a chromogen-responsive marker per molecule of the component.(36) The reagent according to claim 35, wherein the chromogen-responsive marker is an enzyme. (37) The reagent according to claim 35, wherein the first component is an antibody or an antibody center, and the second component is an antigen or a ligand. Reagent according to item 35.
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