JPS60166624A - Adult t-cell leukemia virus antigen polypeptide - Google Patents
Adult t-cell leukemia virus antigen polypeptideInfo
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- JPS60166624A JPS60166624A JP59016952A JP1695284A JPS60166624A JP S60166624 A JPS60166624 A JP S60166624A JP 59016952 A JP59016952 A JP 59016952A JP 1695284 A JP1695284 A JP 1695284A JP S60166624 A JPS60166624 A JP S60166624A
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Abstract
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、env遺伝子によりコードされる成人T細胞
白血病ウィルス抗原ポリペプチド、該ぺプチドをコード
するDNA断片を組み込んだ組換え体プラスミド、該プ
ラスミドを含む微生物および該微生物を用いるenv遺
伝子によりコードされる成人工細胞白面病ウィルス抗原
ポリペプチドの製造法に関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to an adult T-cell leukemia virus antigen polypeptide encoded by the env gene, a recombinant plasmid incorporating a DNA fragment encoding the peptide, a microorganism containing the plasmid, and the microorganism. This invention relates to a method for producing an adult artificial cell Shiromen disease virus antigen polypeptide encoded by the env gene.
成人工細胞白血病ウィルス〔adult T cell
leukemia virus、 以下△TLVと略記
する。ATLVは、またヒトr細胞白血病ウィルス(I
ITI、V)とも言うがここではATLVを用いる。〕
は、成人工細胞白血病(adult T cell l
eukemia 、以下Δ1゛Lと略記する。)患者よ
り分離されたC型レトロウィルスである[吉川ら、 P
roc、Natl、八cad。Adult T cell
leukemia virus, hereinafter abbreviated as ΔTLV. ATLV is also known as human r-cell leukemia virus (I
Although it is also called ITI, V), ATLV is used here. ]
is adult T cell leukemia (adult T cell leukemia).
eukemia, hereinafter abbreviated as Δ1゛L. ) is a type C retrovirus isolated from a patient [Yoshikawa et al., P.
roc, Natl, 8cad.
Sci、、ll5A、 79.2031−2036 (
]982) ] oATT−患者の予後は不良であり、
有効な治療法もなく、患者の半数は10ケ月以内に死亡
するという報告が多い。Sci, ll5A, 79.2031-2036 (
]982)]oATT-The patient's prognosis is poor;
There are no effective treatments, and there are many reports that half of patients die within 10 months.
近年、ATL患者血清中に、ATL由来培養株であるM
T−1細胞と特異的に反応する抗体の存在が発見された
〔日沼ら、Proc、 Natl、 Acad、 Sc
i、。In recent years, an ATL-derived cultured strain, M.
The existence of antibodies that specifically react with T-1 cells was discovered [Hinuma et al., Proc. Natl., Acad., Sc.
i.
11s八、711.6476−6480 (1981)
) 。以後ATL患者全例にこの抗体の存在が確認され
、この抗体に対する抗原はAT L−関連抗原(八Tl
、−associatedantigen、以下AT
LΔと略記する)とよばれている。このATLΔに対す
る抗体(以下抗ATLA抗体と略記する)はATI−多
発地帯の正常健康人の25%にも存在すること、さらに
抗ΔTLΔ抗体保持者の分布はATL多発地域に一致す
ることが判明している。A T LΔの主体がこのレト
ロウィルス抗原であり、また患者末梢血リンパ球中には
、ATLVのゲノムの存在が証明されるとともに、正常
人で抗ΔTLΔ抗体陽性者のリンパ球を培養してもAT
LVが検出される。11s 8, 711.6476-6480 (1981)
). Since then, the presence of this antibody has been confirmed in all patients with ATL, and the antigen for this antibody is ATL-related antigen (8Tl).
, -associateddantigen, hereinafter AT
(abbreviated as LΔ). It was found that this antibody against ATLΔ (hereinafter abbreviated as anti-ATLA antibody) is present in 25% of normal healthy people in ATI-prone areas, and that the distribution of anti-ΔTLΔ antibody carriers corresponds to ATL-prone areas. ing. The main body of ATLΔ is this retrovirus antigen, and the presence of the ATLV genome in patient's peripheral blood lymphocytes has been proven, and even if the lymphocytes of normal people who are positive for anti-ΔTLΔ antibodies are cultured, A.T.
LV is detected.
ATLとATLVは密接な関係があり、ATLVはAT
Lの原因ウィルスと考えられているが、いまだ感染経路
等は明確でない。輸血が感染経路の1つであることが示
されている。ATL and ATLV are closely related; ATLV is AT
Although it is thought to be the causative virus of L, the route of infection is still unclear. Blood transfusion has been shown to be one route of infection.
ATLの多発地域では健康人の25%が抗ΔTLA抗体
陽性であり、これらの人々は八T[、■のキャリヤであ
る可能性が極めて高いため、これらの人々からの輸血は
避けるべきである。In areas where ATL is prevalent, 25% of healthy people are positive for anti-ΔTLA antibodies, and these people are highly likely to be carriers of 8T[,■, so blood transfusions from these people should be avoided.
抗ATLΔ抗体を検出できれば、そのような輸血を回避
でき、またATLの早期発見もできる。If anti-ATLΔ antibodies can be detected, such blood transfusions can be avoided and ATL can be detected early.
現在、抗ATLA抗体の検出は、ATL由来培養細胞株
のアセトン固定スライドを用いて行われている。しかし
、より簡便、迅速な抗ATL△抗体の検出およびATL
の早期発見が望まれている。Currently, anti-ATLA antibodies are detected using acetone-fixed slides of ATL-derived cultured cell lines. However, simpler and faster detection of anti-ATL△ antibodies and ATL
Early detection is desired.
本発゛明者らは、抗ΔTLΔ抗体の検出ならびにATL
Vの感染予防に役立つAT LΔを大量かつ安価に供給
できる方法について研究を行った。その結果、ATLV
ゲノムの外被蛋白質抗原(表面抗原)ペプチド遺伝子(
env遺伝子とよばれる)を組換えDNAの手法を用い
てベクターDNAに組み込み、得られる組換え体DNA
を含む酵母を培養した結果、env遺伝子によりコード
されるΔTLV抗原ポリペプチドが著量生成蓄積される
ことを見出し、本発明を完成した。The inventors have proposed the detection of anti-ΔTLΔ antibodies and the detection of ATL.
We conducted research on a method for supplying AT LΔ in large quantities and at low cost, which is useful for preventing V infection. As a result, ATLV
Genome coat protein antigen (surface antigen) peptide gene (
env gene) into vector DNA using recombinant DNA techniques, and the resulting recombinant DNA
As a result of culturing yeast containing the env gene, it was found that a significant amount of the ΔTLV antigen polypeptide encoded by the env gene was produced and accumulated, and the present invention was completed.
env遺伝子産物の1つが分子量6.2万の糖蛋白質(
gp62)であることについては既に報告CHatto
riら:Gann、 74.790−793 (198
3)]があり、またΔTLVの全DNA配列は本発明者
らが決定した〔特願昭57−214287. Proc
。One of the env gene products is a glycoprotein with a molecular weight of 62,000 (
gp62) has already been reported.
ri et al.: Gann, 74.790-793 (198
3)], and the entire DNA sequence of ΔTLV was determined by the present inventors [Patent Application No. 57-214287. Proc
.
Natl、八cad、 Sci、[、USA 80.
3618−3622 (1983)]が、微生物におい
てenv遺伝子によりコードされるATLV抗原ポリペ
プチドの生産を行ったのは本発明がはじめてである。Natl, 8cad, Sci, [, USA 80.
3618-3622 (1983)], the present invention is the first to produce an ATLV antigen polypeptide encoded by the env gene in a microorganism.
本発明で生産されるATLV表面抗原蛋白質は、表面抗
原の蛋白質の全体を含むので、表面抗原上に複数存在す
る抗原決定基の全部を含み、診断用。The ATLV surface antigen protein produced in the present invention contains the entire surface antigen protein, and thus contains all of the multiple antigenic determinants present on the surface antigen, and is useful for diagnosis.
ワクチン用の抗原として適していると考えられる。It is considered suitable as an antigen for vaccines.
以下本発明の詳細な説明する。The present invention will be explained in detail below.
本発明は、ATLVのenv遺伝子をコードするDNA
断片を組み込んだ組換え体プラスミド。The present invention provides DNA encoding the env gene of ATLV.
Recombinant plasmid incorporating the fragment.
該プラスミドを含む微生物および該微生物を用いるAT
L V抗原ペプチド(env遺伝子産物)の製造法を
提供する。A microorganism containing the plasmid and an AT using the microorganism
A method for producing L V antigen peptide (env gene product) is provided.
本発明の組換え体プラスミドの造成は以下のとおり行う
。The recombinant plasmid of the present invention is constructed as follows.
A T L Vのenv遺伝子をコードするDNAを組
換えDNA技法によりベクターDNAに組み込むことに
よって組換え体プラスミドを造成することができる。A recombinant plasmid can be constructed by incorporating DNA encoding the ATL V env gene into vector DNA using recombinant DNA techniques.
ATLVのenv遺伝子をコードするDNAとしては、
たとえば清水らによってクローン化されたpΔTK10
0[清水ら、 Proc、 Natl、八cad。The DNA encoding the env gene of ATLV is
For example, pΔTK10 cloned by Shimizu et al.
0 [Shimizu et al., Proc, Natl, 8 cad.
Sci、、 USA、80.3613−3622 (1
983))を用いることができる。AT L Vのゲノ
ムは、両端のI−T Rとgag、pol、env、p
Xの少なくとも4つの遺伝子とからなる。このうちen
v遺伝子にコードされる蛋白質は、ATLVの感染によ
り発現する外被蛋白質抗原(表面抗原)であることが知
られているのでATLV感染の診断、AT L V感染
の阻止、ATLVにより生じた白血病の治療。Sci,, USA, 80.3613-3622 (1
983)) can be used. The ATLV genome consists of I-TR at both ends, gag, pol, env, p
It consists of at least four genes of X. Of these en
The protein encoded by the v gene is known to be a coat protein antigen (surface antigen) expressed by ATLV infection, so it can be used to diagnose ATLV infection, prevent ATLV infection, and treat leukemia caused by ATLV. Treatment.
さらには蛋白質自体のワクチンとしての使用などにも利
用することが期待される。Furthermore, the protein itself is expected to be used as a vaccine.
pATKl、00は、env遺伝子を全て含むクローン
であり、env遺伝子をコードするDNA断片の供給源
として用いることができる。pATKl,00 is a clone containing the entire env gene, and can be used as a source of a DNA fragment encoding the env gene.
ベクターD NΔきしては、挿入した目的DNAが微生
物中で発現できるものなら、いかなるものも用いること
ができる。好ましくは、適当なプロモーター、たとえば
酵母の3−ホスホグリセレートキナーゼ(PGK>系、
トリプトファン(T RPl)系、アルコール脱水素酵
母I(△D +−11)系。Any vector can be used as long as the inserted target DNA can be expressed in microorganisms. Preferably, a suitable promoter is used, such as the yeast 3-phosphoglycerate kinase (PGK> system,
tryptophan (TRPl) system, alcohol dehydrogenation yeast I (ΔD +-11) system.
ガラクトース・キナーゼ(GΔL1)系、グリセルアル
デヒドー3−リン酸脱水素酵素(GΔP D H)系、
P’−60などのプロモーターを持ち、その下流に目的
DNAを挿入できるプラスミドを用いることができる。Galactose kinase (GΔL1) system, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GΔP DH) system,
A plasmid having a promoter such as P'-60 and into which the target DNA can be inserted downstream can be used.
プラスミドとしてはp Y e HB s 。The plasmid is pYeHBs.
pM△36.pMΔ56.pMA82などを用いること
ができるが、具体的に好適なプラスミドとしては、pΔ
M82をあげることができる。pAM82 は Miy
anohara et al、Proc、Natl、八
cad、Sci。pM△36. pMΔ56. Although pMA82 etc. can be used, a specifically suitable plasmid is pΔ
I can give you the M82. pAM82 is Miy
anohara et al, Proc, Natl, 8cad, Sci.
IsA、80. ]〜5 (1983) に記載された
方法で製造される。pAM82はpBR322由来の複
製開始点、アンピシリン耐性(Δp11)遺伝子および
酵母由来のarsl遺伝子、1eu2遺伝子。IsA, 80. ] ~ 5 (1983). pAM82 contains a replication origin derived from pBR322, an ampicillin resistance (Δp11) gene, and arsl and 1eu2 genes derived from yeast.
2μDNAの複製開始点を有し、大腸菌および酵母菌内
での自己複製およびプラスミド保持閑の選択が可能なプ
ラスミドである。This plasmid has a 2μ DNA replication origin and is capable of self-replication in E. coli and yeast and selection of plasmid retention.
さらにpΔM82は酵母菌の抑制型酵母ホスファターゼ
のポリペプチド(P −、−60>遺伝子のプロモータ
ー領域を有しており、本プラスミドに唯一存在するXh
o1部位に翻訳開始点を有する遺伝子を挿入することに
より、外来DNAを発現させることができる。Furthermore, pΔM82 contains the promoter region of the polypeptide (P-, -60> gene of the inhibitory yeast phosphatase of yeast, and the Xh
Foreign DNA can be expressed by inserting a gene having a translation initiation site into the o1 site.
ΔT L Vのenv遺伝子をコードするDNA。DNA encoding the env gene of ΔTLV.
たとえばpΔTK100からのDNAと、ベクターDN
AたとえばpΔM82との組換えは、制限酵素を用いて
両DNAを消化後、T4DNAリガーゼを用いて結合す
る一般的組換えDNA技法を用いて行うことができる。For example, DNA from pΔTK100 and vector DNA
For example, recombination with pΔM82 can be carried out using common recombinant DNA techniques in which both DNAs are digested using restriction enzymes and then ligated using T4 DNA ligase.
結合に際してはDNAポリメラーゼ■・K]enow断
片を用いる埋め込み反応(fill−in ) や、D
NAリンツノ−を用いる方法によって行うことができる
。For ligation, fill-in reaction using DNA polymerase [K]enow fragment or D
This can be carried out by a method using NA rintsuno.
具体例として示したpATKl 00とpΔM82の場
合は、第1図に示したごとく、pΔTK100のenv
遺伝子を制限酵素PstTで消化後、T4DNΔポリメ
ラーゼで末端を平滑末端にし、さらにH10d■および
Ha emで次々に消化して得られる断片をpΔM82
のXho1部位に挿入することによって組換え体プラス
ミドpΔTYE307を造成することができる。In the case of pATKl 00 and pΔM82 shown as specific examples, as shown in Fig. 1, the env of pΔTK100 is
After digesting the gene with the restriction enzyme PstT, the ends were made blunt with T4DNΔ polymerase, and the fragments obtained by successively digesting with H10d■ and Haem were transformed into pΔM82.
Recombinant plasmid pΔTYE307 can be constructed by inserting into the Xho1 site of .
−F記組換えプラスミド作成に必要な反応の条件は次の
とおりである。The reaction conditions necessary for constructing the recombinant plasmid described in -F are as follows.
DNAの制限酵素による消化は通常0.1〜100μg
のDNAを2〜200ミリモル(好ましくは10〜40
ミリモル)のトリス塩酸(Tris−HCIl) (p
t(6,O〜9.5、好ましくはp H7,0〜8.
0)、1〜150ミリモルのNaCl!、、2〜20ミ
リモル(好ましくは5〜10ミリモル)のM g CE
2中で制限酵素0.1〜300屯位(好ましくは1μ
gのDNAに対し1〜3単位の酵素)を用い、18〜4
2℃(好ましくは32〜38℃)において、15分〜2
4時間消化反応を行う。反応の停止は通常55〜75℃
(好ましくは63〜70℃)で5〜30分間加熱するこ
とによるが、フェノールやジエチルピロカーボネートな
どの試薬により制限酵素を失活させる方法も用いること
ができる。Digestion of DNA with restriction enzymes is usually 0.1 to 100 μg.
2 to 200 mmol (preferably 10 to 40 mmol) of DNA
mmol) of Tris-HCIl (p
t(6,0-9.5, preferably pH7,0-8.
0), 1-150 mmol NaCl! , 2-20 mmol (preferably 5-10 mmol) M g CE
2, restriction enzyme 0.1 to 300 tons (preferably 1μ
Using 1-3 units of enzyme per g of DNA, 18-4
At 2°C (preferably 32-38°C), for 15 minutes to 2
Perform the digestion reaction for 4 hours. The reaction is usually stopped at 55-75℃
(preferably 63 to 70°C) for 5 to 30 minutes, but a method of inactivating the restriction enzyme with a reagent such as phenol or diethylpyrocarbonate can also be used.
DNA断片を結合させる場合は2〜200ミリモル(好
ましくは10〜70ミリモル)のトリス塩酸(p t(
6,0〜9.5、pH7,Q〜8.0)、2〜20ミリ
モル(好ましくは5〜10ミリモル)のMgCR2,0
,1〜10ミリモル(好ましくは0.5〜2ミリモル)
のΔTP、1〜50ミリモル(好ましくは5〜10ミリ
モル)のジチオスレイトール中でT4DNAリガーゼ0
.1〜10単位を用いて1〜37℃(好ましくは3〜2
0℃)で15分〜72時間(好ましくは2〜20時間)
結合反応を行う。When linking DNA fragments, 2 to 200 mmol (preferably 10 to 70 mmol) of Tris-HCl (pt(
6,0-9.5, pH 7, Q-8.0), 2-20 mmol (preferably 5-10 mmol) of MgCR2,0
, 1-10 mmol (preferably 0.5-2 mmol)
ΔTP of T4 DNA ligase 0 in 1-50 mmol (preferably 5-10 mmol) dithiothreitol.
.. 1 to 37°C (preferably 3 to 2°C) using 1 to 10 units.
0℃) for 15 minutes to 72 hours (preferably 2 to 20 hours)
Perform the binding reaction.
DNA断片、組換え体プラスミドなどの精製はアガロー
スゲル電気泳動法によって行う。Purification of DNA fragments, recombinant plasmids, etc. is performed by agarose gel electrophoresis.
組換え体プラスミド、JことえばpΔTYE30Tを微
生物に形質転換して入れ、得られる形質転換株を培養す
ることによってenv遺伝子によりコードされるΔTl
、■抗原ポリペプチドを得ることができる。By transforming a recombinant plasmid, ie, pΔTYE30T, into a microorganism and culturing the resulting transformant, ΔTl encoded by the env gene can be obtained.
, ■An antigen polypeptide can be obtained.
微生物としては、酵母が好ましく用いられ、具体的に好
適には、Saccharomyces cerevis
iae AlI22(a、]eu2. his4. c
anL cir4) [:lto、 If、 et a
l、。As the microorganism, yeast is preferably used, and specifically preferred is Saccharomyces cerevis.
iae AlI22(a,]eu2.his4.c
anL cir4) [:lto, If, et a
l.
J、Bacteriol、 153.163−168
(19B3) ]が用いられる。J, Bacteriol, 153.163-168
(19B3) ] is used.
形質転換はH,ltoらの方法[:J、 Bacl:e
riol、 153゜163−168 (1983)]
に従って行うことができる。形質転換株はpATYE3
07の場合、ロイシン非要求性株として得ることができ
る。Transformation was performed using the method of H. lto et al. [:J, Bacl:e
riol, 153゜163-168 (1983)]
This can be done according to the following. The transformed strain is pATYE3
In the case of 07, it can be obtained as a leucine non-auxotrophic strain.
形質転換株によるATLV抗原ポリペプチドの発現はた
とえばこの菌株をプルクボールダーの最小培地またはそ
の改良培地にて培養後、菌体破砕してフェニルメチルス
ルフォニルフルオライドを含むリン酸緩衝液で抽出し、
得られる抽出液をSDS存在下のゲル電気泳動にかけ、
Towbinらの方法[Towbin It、 et
al、、 Proc、 Natl、 Acad、 Sc
i。Expression of the ATLV antigen polypeptide by a transformed strain can be achieved, for example, by culturing this strain in Pulck-Boulder's minimal medium or its modified medium, then disrupting the cells and extracting with a phosphate buffer containing phenylmethylsulfonyl fluoride.
The resulting extract was subjected to gel electrophoresis in the presence of SDS,
The method of Towbin et al. [Towbin It, et al.
al,, Proc, Natl, Acad, Sc
i.
IIs八0へ、 4350−4354 (1979)]
により、酵母中に産生されたATLV外被蛋白質を検出
することにより確認する。ここで検出されたポリペプチ
ドは患者血清と特異的に免疫沈降することが確認でき、
△T L V抗原ペプチドとしての性質を保有している
ことがわかる。IIs 80, 4350-4354 (1979)]
This is confirmed by detecting the ATLV coat protein produced in yeast. It was confirmed that the polypeptide detected here was specifically immunoprecipitated with patient serum.
It can be seen that it possesses the properties as a ΔT L V antigen peptide.
酵母からのプラスミドの分離はに、 5tru旧ら、P
roc、Natl、八cad、Sci、 USA、76
1035 (1979)の方法によって行う。Isolation of plasmids from yeast is described by 5tru et al., P.
roc, Natl, 8cad, Sci, USA, 76
1035 (1979).
pATYE307の形質転換株は、米国アメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクションにSaccharom
yces cerevisiae C11l ATCC
としてそれぞれ国際寄託が行われている。The transformed strain of pATYE307 was purchased from Saccharom at the American Type Culture Collection.
yces cerevisiae C11l ATCC
International deposits have been made for each.
以下本発明の実施例を示す。Examples of the present invention will be shown below.
実施例1゜
プラスミドp A TK 100 [5eiki、 M
、 et al、。Example 1 Plasmid pATK 100 [5eiki, M
, et al.
Proc、Natl、八cad、Sci、ll5A 8
0 、 3618−3622 ] の200μgを、5
0mM NaCl!、IOmMTr i 5−HCI
(pH7,5)、7mM MgCβ2および6mM 2
−メルカプトエタノールからなる緩衝液1000μβに
溶かし、さらに制限酵素PstI(全酒造社製、以下特
記しないかぎり制限酵素は同社製である)200単位を
加え、37℃で1時間反応させた。反応物を0.9%ア
ガロースゲル電気泳動にかけ、1μg /mlのエチジ
ウム・ブロマイドで染色してDNA断片を検出し、en
v遺伝子を含む2.425塩基対(bpと略記する)の
DNA断片を得た。このDNA断片41μgを30mM
Tris−酢酸(p I−17,9)、66mM酢酸
カリウム、10mM酢酸マグネシウム、0.5 m M
ジチオスレイトール、O,L m MdΔTP、0.1
.mM dTTP、0.]、mM dGTPおよび0.
1mM clcTPを含む液300μj2に加え、さら
にT4DNΔポリメラーゼ(全酒造社製)4単位を加え
て、37℃で10分間反応した。Proc, Natl, 8cad, Sci, ll5A 8
0, 3618-3622], 5
0mM NaCl! , IOmMTr i 5-HCI
(pH 7,5), 7mM MgCβ2 and 6mM 2
- It was dissolved in 1000 μβ of a buffer consisting of mercaptoethanol, and 200 units of restriction enzyme PstI (manufactured by Zenshuzo Co., Ltd.; unless otherwise specified, restriction enzymes are manufactured by the same company) was further added, and the mixture was allowed to react at 37° C. for 1 hour. Reactions were subjected to 0.9% agarose gel electrophoresis and stained with 1 μg/ml ethidium bromide to detect DNA fragments.
A DNA fragment of 2.425 base pairs (abbreviated as bp) containing the v gene was obtained. 41μg of this DNA fragment was added to 30mM
Tris-acetic acid (p I-17,9), 66mM potassium acetate, 10mM magnesium acetate, 0.5mM
Dithiothreitol, O, L m MdΔTP, 0.1
.. mM dTTP, 0. ], mM dGTP and 0.
In addition to 300μj2 of a solution containing 1mM clcTP, 4 units of T4DNA polymerase (manufactured by Zenshuzo Co., Ltd.) were added, and the mixture was reacted at 37°C for 10 minutes.
この反応で、該DNA断片のPstI切断による接着末
端(Cohesive end)は修復されて、平滑末
端(blunt end)になった。In this reaction, the cohesive end of the DNA fragment caused by PstI cleavage was repaired and became a blunt end.
このDNA断片40μgを、50mM NaCl、10
mM Tris−HCj! (pH7,5)、7mMM
gCβ2および6mM 2−メルカプトエタノールから
なる緩衝液200μlに溶かし、さらに制限酵素Hin
dnI50単位を加え、37℃で1時間反応させ、en
v遺伝子を含むL 743 b pのDNA断片を得た
。この1.743 b pのDNA断片2’/1−1g
を50mM NaCl2、 ]、OmMTr i 5−
H(J! (pH7,5>、7mM MgCjLおよび
6mM 2− メルカプトエタノールカ)らなる緩衝液
250μβに溶かし、さらに制限酵素Ha em42単
位を加え、37℃で25分間反応させた。反応物を1.
4%アガロースゲル電気泳動にかけ、1μg /m+の
エチジウム・ブロマイドで染色してDN断片を検出し、
env遺伝子を含む、1.590bpのDNA断片を得
た。40 μg of this DNA fragment was mixed with 50 mM NaCl, 10
mM Tris-HCj! (pH 7,5), 7mM
Dissolve gCβ2 in 200 μl of a buffer consisting of 6mM 2-mercaptoethanol, and add restriction enzyme Hin.
Add 50 units of dnI, react at 37°C for 1 hour, and en
A DNA fragment of L 743 bp containing the v gene was obtained. This 1.743 bp DNA fragment 2'/1-1g
50mM NaCl2, ], OmMTri 5-
H (J! (pH 7,5>, 7mM MgCjL and 6mM 2-mercaptoethanol) was dissolved in 250μβ of a buffer solution, 42 units of restriction enzyme Ha em were added, and the reaction was carried out at 37°C for 25 minutes. ..
4% agarose gel electrophoresis and staining with 1 μg/m+ ethidium bromide to detect DN fragments.
A 1.590 bp DNA fragment containing the env gene was obtained.
一方、ベクタープラスミドp A MB2 (Miya
nohara。On the other hand, vector plasmid pA MB2 (Miya
nohara.
A、 et aユ、、Proc、Natl、 八cad
、Sci、[ISA、 80 。A, et ayu, Proc, Natl, 8cad
, Sci, [ISA, 80.
1〜5.1983 >の3μgを100mM NaCl
1゜10mM Tris−HCj2 (pH7,5)、
?mMMgc、g2および6mM 2−メルカプトエタ
ノールからなる緩衝液20μlに溶かし、さらに制限酵
素Xhol 8単位を加え、37℃で1時間反応させた
。DNA断片を含むこの反応液を50mM Tr i
5−H(1! (pH7,8)、5mMMgCβ2.1
0mM2−メルカプトエタノール、5μg/ml BS
Δ(牛血清アルブミン)、0.1mM dΔTP、0.
1mM dTTP、0.1mM dGTPおよび0.1
mM dCTPを含む液25μβに加え、さらにDNA
ポリメラーゼI(Klenow断片)3単位を加えて、
22℃で30分間反応した。この反応で、該DNA断片
のXh。1-5.1983 > 3μg in 100mM NaCl
1°10mM Tris-HCj2 (pH 7,5),
? The mixture was dissolved in 20 μl of a buffer consisting of mM Mgc, g2 and 6 mM 2-mercaptoethanol, 8 units of restriction enzyme Xhol were added, and the mixture was reacted at 37° C. for 1 hour. This reaction solution containing DNA fragments was diluted with 50mM Tri
5-H (1! (pH 7,8), 5mM MgCβ2.1
0mM 2-mercaptoethanol, 5μg/ml BS
Δ(bovine serum albumin), 0.1mM dΔTP, 0.
1mM dTTP, 0.1mM dGTP and 0.1
In addition to 25 μβ of a solution containing mM dCTP, add DNA
Add 3 units of polymerase I (Klenow fragment),
The reaction was carried out at 22°C for 30 minutes. In this reaction, Xh of the DNA fragment.
■切断による接着末端が修復されて平滑末端になった約
1]、、000 b pのDNA断片が得られた。(2) A DNA fragment of about 1,000 bp was obtained in which the sticky ends caused by the cleavage were repaired and became blunt ends.
pΔTK100由来のDNA断片(1,590bp)0
.23μgと、pΔM82由来のDNA断片(約11.
0OObp) 0.84μgとを66mM Tris−
HCI(pH7,5)、6.6mM Mg(1!2.1
.0mMジチオスレトールおよび0.5mMATPから
なる液50μβに加え、さらにT4DNA!Jガーゼ(
全酒造社製)3単位を加えて、4℃で1日間結合反応を
行った。DNA fragment derived from pΔTK100 (1,590 bp) 0
.. 23 μg and a DNA fragment derived from pΔM82 (approximately 11.
0OObp) 0.84μg and 66mM Tris-
HCI (pH 7.5), 6.6mM Mg (1!2.1
.. In addition to 50μβ of a solution consisting of 0mM dithiothretol and 0.5mM ATP, T4DNA! J gauze (
3 units (manufactured by Zenshuzo Co., Ltd.) were added thereto, and a binding reaction was carried out at 4°C for 1 day.
反応液をフェノール抽出して除蛋白して得られる液を用
いて常法に従い大腸菌HBIOI[:Boliver
ら、Gene 275 (1977)]を形質転換した
。形質転換株は、L −13roth(I R中バクト
ドリプトン10g1酵母エキス5g、Na(,1!5g
を含む培地)にアンピシリン25μg /mlを含む培
地上で生育してくる菌株として選択した。形質転換株の
1株からプラスミドをIt、 CoBirnboim
ら、Nucleic 八cids Re5earch
7.1513 (1979) に記載の方法に従い分離
し、pATYE307と命名した。The reaction solution was extracted with phenol and protein was removed. Using the solution obtained, E. coli HBIOI[:Boliver]
et al., Gene 275 (1977)]. The transformed strain was prepared using L-13roth (10 g of Bactodrypton in IR, 5 g of yeast extract, 1!5 g of Na).
The strain was selected as one that grows on a medium containing 25 μg/ml of ampicillin. A plasmid was extracted from one of the transformed strains by CoBirnboim.
Nucleic 8cids Re5earch
7.1513 (1979) and named pATYE307.
pATYE307はベクタープラスミドpAM82のP
−60プロモーターと同じ転写方向にenv遺伝子が組
み込まれた組換え体であり、P−60プロモーターの支
配下にATLVのeT′Iv遺伝子の発現が可能な構造
(下記構造参照)をしていることを、Maxam−Gi
lbertの方法[A、 M、 Maxamら : P
roc、Natl、八cad、Sci、USA、74
.560(1977) :]1こよって確言忍した。pATYE307 is the P of vector plasmid pAM82.
- It is a recombinant with the env gene integrated in the same transcription direction as the P-60 promoter, and has a structure that allows expression of the ATLV eT'Iv gene under the control of the P-60 promoter (see structure below). , Maxam-Gi
Albert's method [A, M, Maxam et al.: P
roc, Natl, 8cad, Sci, USA, 74
.. 560 (1977):] 1.
一−−TGAAACGTATへTへAGCGCTGAT
GTTTTGCTへへGTCGAGG11ogness
box
TCGCCCCGCCG八TCCCA八AGAへAAA
GAへCACCAAC八CC←4
このプラスへドpATYE307を用いてLi+AlI
22 (a、 Ieu2. his4. canl、
cir” ) (同上文献記載)を形質転換した。形質
転換株は、6.7 g /pのYeast nitro
gen base without amino ac
ids(Difco社製)、20g/j?のグルコース
、および20μg /mlのヒスチジンを含む培地上で
生育してくる菌株として選択した。1--TGAAACGTAT to TAGCGCTGAT
To GTTTTGCTGTCGAGG11ogness
box TCGCCCCGCCG8TCCCA8AGA
To GA CACCAAC8CC←4 To this plus using pATYE307 Li+AlI
22 (a, Ieu2. his4. canl,
cir” (described in the above-mentioned literature). The transformed strain was transformed with 6.7 g/p Yeast nitro
gen base without amino ac
ids (manufactured by Difco), 20g/j? of glucose and 20 μg/ml of histidine.
pΔTYE307を含む形質転換株は米国アメリカ・タ
イプ・カルチャー・コレクションにSaccharom
yces cerevisiae CT 1 ] A
T CCとして寄託されている。The transformed strain containing pΔTYE307 was stored in the American Type Culture Collection at Saccharom.
yces cerevisiae CT 1 ] A
It has been deposited as TCC.
実施例2゜
実施例1で得られた形質転換株C11lおよびpAM8
2をA322株に導入したし−82−1株を改良したプ
ルクホールダーの最小培地(pH5、(1)I:1β中
に次の成分を含む培地ニゲルコース20g、アスパラギ
ン2g、KH2PO41,5g、CaCL ” 2H2
00,33g、Mg304・7H200,5g、(NH
4)230. 2g。Example 2゜Transformed strain C11l and pAM8 obtained in Example 1
2 was introduced into the A322 strain, and the -82-1 strain was modified with a Purukholder's minimal medium (pH 5, (1) A medium containing the following components in I:1β: 20 g of Nigelcose, 2 g of asparagine, 1.5 g of KH2PO4, CaCL” 2H2
00,33g, Mg304・7H200,5g, (NH
4) 230. 2g.
K I Q、1+++g、H3BO460ug、Mn5
Os30μg、ZTISO4・7H20300μg。K I Q, 1+++g, H3BO460ug, Mn5
Os30μg, ZTISO4・7H20300μg.
Cu5Oa ・5H2040μg、FeCj!3・68
20 250μg、Na2M004 ・282025μ
g、チ了ミン200μg、ビリ1’+シン200μg、
ニコチン酸200μg、パントナイン酸200μg、ビ
オチア2μg、イノシトールIQmg、ヒスチジン20
mg〕に植菌し、30℃で1晩振盪(2QOrpm)培
養した。集菌し、菌体を滅菌水で洗浄後、生産培地(改
良したプルクホールグー最小培地のKH2PO4濃度を
30mg/llに下げて、1.5 g / 12のKC
lを添加した培地)にOD6.、が0.05どなるよう
に懸濁し、30℃で20〜24時間振盪(20Orpm
)培養した。集菌し、菌体を滅菌水で洗浄後、1mMの
フェニルメチルスルフォニルフルオロライドを含む50
mMリン酸緩衝液(pH7,2)0.5mlに懸濁し、
ガラスピーズを用いて粉砕して抽出液を調製した。抽出
液を、0.1%SDS存在下のポリアクリルアミドゲル
電気泳動にかけ、jowbinらの方法[:Tov+b
in、tt、、 et al、、 Proc、 Nat
l、八cad。Cu5Oa ・5H2040μg, FeCj! 3.68
20 250μg, Na2M004 ・282025μ
g, Chiryomin 200 μg, Biri 1' + Shin 200 μg,
Nicotinic acid 200μg, Pantonic acid 200μg, Biothia 2μg, Inositol IQmg, Histidine 20
mg] and cultured overnight at 30°C with shaking (2Q Orpm). After collecting the bacteria and washing the cells with sterile water, reduce the KH2PO4 concentration of the production medium (improved pulquehol-goo minimal medium to 30 mg/l, and add 1.5 g/12 KC).
OD6. , to a concentration of 0.05, and shaken at 30°C for 20 to 24 hours (20 Orpm).
) was cultured. After collecting the bacteria and washing the cells with sterile water, the cells were washed with 50% water containing 1mM phenylmethylsulfonyl fluoride.
Suspend in 0.5 ml of mM phosphate buffer (pH 7,2),
An extract was prepared by grinding using glass beads. The extract was subjected to polyacrylamide gel electrophoresis in the presence of 0.1% SDS using the method of Jowbin et al. [:Tov+b
in, tt,, et al,, Proc, Nat
l, 8 cad.
Sci、 USA、76、 4350−4354 (1
979) :]により”Western blotti
ng” (蛋白質ブDッティング)を行い、酵母中で産
生されたATLV外被蛋白質を検出した。上記方法での
一次抗体および二次抗体としては、ATL患者血清およ
び〔+25■〕標識抗ヒト免疫グロブリン(4Hers
ham社製)を用いた。Sci, USA, 76, 4350-4354 (1
979):] by “Western blotti
ng'' (protein binding) to detect the ATLV coat protein produced in yeast.The primary and secondary antibodies used in the above method were ATL patient serum and [+25■] labeled anti-human immunotherapy. Globulin (4Hers)
(manufactured by ham) was used.
この結果、分子量約43. OOOの蛋白質が特異的バ
ンドとして検出された。正常人血清を一次抗体として用
いた場合にはこのバンドは検出されず、またベクターと
して用いたpAM82により形質転換した酵母菌L−8
2−1中にもこのバンドが検出されないことから、この
蛋白質はATLV外被蛋白質遺伝子産物であることがわ
かる。As a result, the molecular weight was approximately 43. OOO protein was detected as a specific band. This band was not detected when normal human serum was used as the primary antibody, and yeast L-8 transformed with pAM82 used as a vector
Since this band was not detected in 2-1, it was found that this protein was an ATLV coat protein gene product.
第1図はプラスミドpATYE307の構成ヲ示すフロ
ーシートである。図中Hはl(a e m部位を示す。
矢印→はP−60による転写の方向性、−÷はenv遺
伝子転写の方向性をそれぞれ表わしている。
手続補正書
昭和59年3月ノ2日
特許庁長官殿
昭和59年特許願第16952号
2、発明の名称
成人下細胞白血病ウィルス抗原ポリペプチド3、補正を
する者
事件との関係 特許出願人
郵便番号 170
明細書の発明の詳細な説明の欄および願書の添付書類の
目録の欄
5、補正の内容
(1)明細書箱11頁13行目の[ΔTCCJの後にr
20697Jを加入する。
手続補正書
昭和bo年3月20日
事件の表示
昭和59年特許願第16952号
2、発明の名称
成人下細胞白血病ウィルス抗原ポリペプチド3、補正を
する者
事件との関係 特許出願人
郵便番号 170
ト シマク カミイケブクロ
主 所 東京都豊島区」−池袋一丁目37番1号明細書
の発明の詳細な説明の欄
5、補正の内容
(1)明細書第3頁12−13行目のrProc、 N
atl。
^cad、Sci、 Jを[プロシーディング・オブ・
ザ(2)明細書箱5頁11行目のrGann、Jを[ガ
ン(Gann)、Jに訂正する。
(3)明細書第7頁7行目の1脱水素酵母■」を「脱水
素酵素I」に訂正する。
(4)明細書第7頁13行目のrpMA82 Jをrp
AM82 Jに訂正する。
(5)明細書第7頁24行目の「抑制型酵母」を「抑制
型酵素」に訂正する。
(6)明細書第10頁13行目の「J、 Bacter
iol、 Jを[ジャーナル・オブ・バクテリオロジイ
(J。
Bacteriol、) Jに訂正する。
(7)明細書第11頁14行目の「それぞれ」を削除す
る。
(8)明細書第14頁12行目のrGeneJを[ジー
ン(Gene) Jに訂正する。
(9)明細書箱14頁18行目の[Nucleic 八
cidsResearch Jを[ヌクレイツク・アシ
ッヅ・リサーチ(Nucleic Ac1ds Re5
earch) Jに訂正する。
OQ 明細書箱16頁1行目の「とじて」の前にr 2
0697Jを加入する。
(2)
77−FIG. 1 is a flow sheet showing the construction of plasmid pATYE307. In the figure, H indicates the l(a e m site. The arrow → represents the direction of transcription by P-60, and -÷ represents the direction of env gene transcription. Procedural amendment document, March 1982, No. 2) To the Commissioner of the Japan Patent Office, Patent Application No. 16952 of 1982 2. Name of the invention: Adult subcellular leukemia virus antigen polypeptide 3. Relationship with the person making the amendment: Patent applicant postal code: 170 Detailed description of the invention in the specification column and Column 5 of the list of attached documents to the application, contents of amendment (1) Specification box page 11, line 13, [r after ΔTCCJ]
Add 20697J. Procedural amendments filed on March 20, 1980 Display of the case Patent Application No. 16952 of 1982 2 Title of the invention Adult subcellular leukemia virus antigen polypeptide 3 Person making the amendment Relationship to the case Patent applicant postal code 170 Column 5 of the detailed description of the invention in the specification of Ikebukuro 1-37-1, "Toshimaku Kamiikebukuro Principal Place: Toshima-ku, Tokyo" - Contents of the amendment (1) rProc on page 3, lines 12-13 of the specification, N
atl. ^CAD, Sci, J [Proceedings of
The (2) rGann, J on page 5, line 11 of the specification box is corrected to [Gann, J]. (3) On page 7, line 7 of the specification, 1 dehydrogenase yeast ■ is corrected to ``dehydrogenase I.'' (4) rpMA82J on page 7, line 13 of the specification
Corrected to AM82 J. (5) "Suppressed yeast" on page 7, line 24 of the specification is corrected to "suppressed enzyme." (6) “J, Bacter” on page 10, line 13 of the specification
iol, J to [Journal of Bacteriology (J. Bacteriol,) J. (7) Delete "each" on page 11, line 14 of the specification. (8) rGeneJ on page 14, line 12 of the specification is corrected to [Gene J]. (9) Enter [Nucleic Acids Research J] on page 14, line 18 of the specification box.
(each) Correct to J. OQ Statement box page 16, line 1, before “close” r 2
Add 0697J. (2) 77-
Claims (1)
ードされる成人T細胞白血病ウィルス抗原ポリペプチド
。 (2)成人下細胞白血病ウィルスのenv遺伝子をコー
ドするDNA断片が組み込まれた組換え体プラスミド。 (3)P−60プロモーターを有することを特徴とする
特許請求の範囲第2項記載の組換え体プラスミド。 (4) p A T Y E 307であることを特徴
とする特許請求の範囲第3項記載の組換え体プラスミド
。 (5)成人T細胞白血病ウィルスのenv遺伝子をコー
ドするDNA断片が組み込まれた組換え体プラスミドを
保有する微生物を培地に培養し、培養物中にenv遺伝
子によりコードされる成人T細胞白血病ウィルス抗原ポ
リペプチドを生成蓄積せしめ、該培養物から該ペプチド
を採取することを特徴とするenv遺伝子によりコード
される成人T細胞白血病ウィルス抗原ポリペプチドの製
造法。 (6)該組換え体プラスミドがP−60プロモーターを
有する組換え体プラスミドであることを特徴とする特許
請求の範囲第5項記載の方法。 (7)該微生物がサツカロミセス属に属することを特徴
とする特許請求の範囲第5項記載の方法。 (8)該微生物がサツカロミセス・セレビシェに属する
ことを特徴とする特許請求の範囲第7項記載の方法。 (9)該組換え体プラスミドがpATYE307である
ことを特徴とする特許請求の範囲第5項記載の方法。 αQ 成人T細胞白血病ウィルスのenv遺伝子をコー
ドするDNA断片が組み込まれた組換え体プラスミドを
含む微生物。 (11)該組換え体プラスミドが1−60プロモーター
を有する組換え体プラスミドであることを特徴とする特
許請求の範囲第10項記載の微生物。 (12) 該微生物がサツカロミセス・セレビシェに属
することを特徴とする特許請求の範囲第11項゛記載の
微生物。[Scope of Claims] (1) An adult T-cell leukemia virus antigen polypeptide encoded by the adult-induced cell leukemia virus env gene. (2) A recombinant plasmid incorporating a DNA fragment encoding the env gene of adult hypocellular leukemia virus. (3) The recombinant plasmid according to claim 2, which has a P-60 promoter. (4) The recombinant plasmid according to claim 3, which is pATYE307. (5) A microorganism carrying a recombinant plasmid into which a DNA fragment encoding the env gene of the adult T-cell leukemia virus has been integrated is cultured in a medium, and the adult T-cell leukemia virus antigen encoded by the env gene is contained in the culture. A method for producing an adult T-cell leukemia virus antigen polypeptide encoded by the env gene, which comprises producing and accumulating the polypeptide and collecting the peptide from the culture. (6) The method according to claim 5, wherein the recombinant plasmid is a recombinant plasmid having a P-60 promoter. (7) The method according to claim 5, wherein the microorganism belongs to the genus Satucharomyces. (8) The method according to claim 7, wherein the microorganism belongs to Satucharomyces cerevisiae. (9) The method according to claim 5, wherein the recombinant plasmid is pATYE307. αQ A microorganism containing a recombinant plasmid into which a DNA fragment encoding the env gene of adult T-cell leukemia virus has been integrated. (11) The microorganism according to claim 10, wherein the recombinant plasmid is a recombinant plasmid having a 1-60 promoter. (12) The microorganism according to claim 11, wherein the microorganism belongs to Satucharomyces cerevisiae.
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP59016952A JPS60166624A (en) | 1984-02-03 | 1984-02-03 | Adult t-cell leukemia virus antigen polypeptide |
EP85101063A EP0152030A3 (en) | 1984-02-03 | 1985-02-01 | Adult t cell leukemia virus antigen polypeptide |
DE1985101063 DE152030T1 (en) | 1984-02-03 | 1985-02-01 | ADULT T CELL LEUKEMIAVIRUS ANTIGEN POLYPEPTIDE. |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP59016952A JPS60166624A (en) | 1984-02-03 | 1984-02-03 | Adult t-cell leukemia virus antigen polypeptide |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS60166624A true JPS60166624A (en) | 1985-08-29 |
Family
ID=11930454
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP59016952A Pending JPS60166624A (en) | 1984-02-03 | 1984-02-03 | Adult t-cell leukemia virus antigen polypeptide |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS60166624A (en) |
-
1984
- 1984-02-03 JP JP59016952A patent/JPS60166624A/en active Pending
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