JPS60160891A - Production of l-phenylalanine - Google Patents
Production of l-phenylalanineInfo
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- JPS60160891A JPS60160891A JP60000011A JP1185A JPS60160891A JP S60160891 A JPS60160891 A JP S60160891A JP 60000011 A JP60000011 A JP 60000011A JP 1185 A JP1185 A JP 1185A JP S60160891 A JPS60160891 A JP S60160891A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。(57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は一般的に死んだa胞を用いる生物的アミノ基転
移反応によるし一フェニルアラニン(以下においてフェ
ニルアラニンと呼ぶ)の製造に関する。更に特定的には
、本則a鉾に記載された方法は、フェニルアラニン前駆
物質が完全に消費されそして90パ一セント以上のフェ
ニルアラニン収率を達成することが出来るような方法で
反応が完rせしめることによジフェニルアラニン製造の
ための従来のアミン基転移反応を顕著に改善する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention generally relates to the production of phenylalanine (hereinafter referred to as phenylalanine) by biological transamination reactions using dead A-vesicles. More specifically, the method described in the main rule A-hoko requires that the reaction be completed in such a way that the phenylalanine precursor is completely consumed and a phenylalanine yield of 90 percent or more can be achieved. This significantly improves the conventional transamination reaction for the production of diphenylalanine.
フェニルアラニン前駆物質を酵素の作用によυ相当する
し一アミノ酸に転化し得ることは公知である。例えば、
アメリカ合衆国特許第3.133.868号〔タケスエ
(Takesue)等〕はDL−フェニル乳酸を用いて
脱硝酸菌または霊菌を発酵させてL−フェニルアラニン
を製造することを発表している。アメリカ合衆国特許第
3.957.588号〔ヤマダ(Yatnada)等〕
はL−フェニルアラニンアンモニアリアーゼを用いて
トランス桂皮酸をフェニルアラニンに転化するための酵
素的方法を発表している。アメリカ合衆国特許第3.1
83.170号〔キタイ(Kitai)等〕は1、(B
菌細胞、乾燥、r+H胞、細胞漬軟物または酵素溶液を
含む柚々の酵素源から得られた多酵素系の存在下でフェ
ニルピルビン#にアミノ基転移する方法を発表している
。It is known that phenylalanine precursors can be converted into the corresponding υ amino acids by the action of enzymes. for example,
U.S. Pat. No. 3,133,868 (Takesue et al.) discloses the production of L-phenylalanine by fermenting denitrifying bacteria or S. marcescens using DL-phenyllactic acid. United States Patent No. 3.957.588 (Yatnada et al.)
describe an enzymatic method for converting trans-cinnamic acid to phenylalanine using L-phenylalanine ammonia-lyase. United States Patent No. 3.1
No. 83.170 [Kitai, etc.] is 1, (B
A method for the transamination of phenylpyruvin # in the presence of a multienzyme system obtained from yuzu enzyme sources including bacterial cells, dried, r+H cells, cell pickles or enzyme solutions is presented.
アミノ酸の像中物的製法(1’he Microbfa
lProduction of Am1no Ac1d
s) (ヤマダ等編)第16唱、「前駆物質ケト酸から
の製造」(’Production from Pre
curser Ket。Physical production method of amino acids (1'he Microbfa)
lProduction of Am1no Ac1d
s) (edited by Yamada et al.) Chapter 16, 'Production from Precursor Keto Acids'('Production from Pre
Curser Ket.
Ac ids” ) 440〜46頁(1972年)、
においてオイシ(Ois旧)はフェニルアラニンを得る
ために微生物のアミノ基転移または還元的アミン化活性
のための基質として化学的合成フェニルピルビン酸を用
いることを発表している。Acids”) pp. 440-46 (1972),
In , Ois (formerly Ois) describes the use of chemically synthesized phenylpyruvate as a substrate for microbial transamination or reductive amination activity to obtain phenylalanine.
アミノ基転移は通常二つの出発物質の間のアミノ基及び
ケト基の転移を起すアミノ酸とケト酸との間の反応とし
て定義される。酵素的アミノ基転移が平衡反応であるこ
とが一般に認められている。Transamination is usually defined as a reaction between an amino acid and a keto acid that results in the transfer of amino and keto groups between the two starting materials. It is generally accepted that enzymatic transamination is an equilibrium reaction.
例えば、オイ7の章はアミノトランスフェラーゼを用い
る場合高中e7物収率を得るには高濃度のアミノ基供与
体を必要とすることを述べている。アメリカ会衆国特許
第3.183.170号(キタイ等)には、アミノ基供
与体としてL−グルタミン酸を用いるアミノ基移転反応
においては、アミノ基転移の結果生ずるアルファーケト
グルタル酸をそれが生成したときに出来るだけ速かKゐ
°元帥アミン化によってL−グルタミン酸に逆転化する
ことに “よシ平衡が好ましく右方向に移行せしめられ
ることが報告されている。For example, the Oy7 chapter states that high concentrations of amino group donors are required to obtain high e7 product yields when using aminotransferases. American Congregational Patent No. 3.183.170 (Kitai et al.) states that in a transamination reaction using L-glutamic acid as an amino group donor, when it produces alpha-ketoglutaric acid as a result of the transamination, It has been reported that the equilibrium can be favorably shifted to the right by converting L-glutamic acid to L-glutamic acid as quickly as possible by K-marshal amination.
従来のアミノ基転移法においては、多数の化合物がアミ
ン基供与体として用いられている。ヤマダ等の著書の4
35〜52頁6でおいてオイシは、最良ノアミン基供与
体がL−アスパラギン酸、L−ロイシン、L−インロイ
シン及びL−グルタミン酸であること及びこれ、らのア
ミノ酸を単独で用いるよりも組合わせて用いる場合の方
がより良い゛。In conventional transamination methods, a large number of compounds are used as amine group donors. 4 of the book by Yamada et al.
On pages 35-52, 6, Oishi states that the best noamine group donors are L-aspartic acid, L-leucine, L-inleucine, and L-glutamic acid, and that these amino acids are more effective in combination than when used alone. It is better when used together.
結果が得られることを述べている。It states that results can be obtained.
オギザロ酢酸(オギザル酢酸、オキシ琥珀酸またはケト
琥珀酸としても知られている)はアスパラギン酸をアミ
ノ基供与体としたときのアミノ基転化反応の酬生成物で
ある。オギザロ酢酸は他の□関連において研死されてお
りそして棹々の機構によシ分/IIγすることが見出さ
れている。ベスマン(Bessman)、[オギザル酢
酸の調法と分析」(”Preparation and
As5ay of 0xala−cetic Ac1
d”)、Arch、 Biochem、 、 26巻4
18〜21頁(1950年)、は多数の物質によりp「
1;媒されるオギザル酢酸の自発的分解を報告している
。クレブス(Krebs)、rオギザロ酢酸のケトン分
解に対する無機1狂の死神J (” i’heh:fr
ect or inorganic 5alts on
theKetone ])ecomposition
of 0xaloaceticAcid”)、j3i
ochem、、 36巻3113〜Q5’N(1942
年)、は多くの無機塩がオギシ′口酢酸のピルビン酸及
び炭rfガスへの分解速度を増大させるごとを報告して
いる。Ogizaloacetic acid (also known as ogizaloacetate, oxysuccinic acid or ketosuccinic acid) is the product of the transamination reaction when aspartic acid is used as the amino group donor. Ogizaloacetate has been shown to be oxidized in other □ relationships and has been found to split/IIγ by a similar mechanism. Bessman, “Preparation and analysis of oxalacetic acid.”
As5ay of Oxala-cetic Ac1
d”), Arch, Biochem, Volume 26 4
pp. 18-21 (1950), p'' by a large number of substances.
1; Spontaneous decomposition of oxalacetic acid mediated by catalytic agents has been reported. Krebs, Inorganic 1 Mad Reaper J ("i'heh: fr
ect or inorganic 5 alts on
theKetone ])ecomposition
of Oxaloacetic Acid”), j3i
ochem, Volume 36, 3113-Q5'N (1942
(2003) reported that many inorganic salts increased the rate of decomposition of acetic acid to pyruvic acid and charcoal RF gas.
本発明において、アスパラギン〜を唯一のアミン基供与
体として用いることによりそして生物的メfJ11+
*7.、、例えばアミノ基転移を行うことが出来、好1
しくはフェニルアラニン前EX伺りlqの存在のもとで
生育させた微生物蘭株に属する乾燥細胞を用いることに
よジフェニルアラニン前駆物質のフェニルアラニンへの
アミノ基転移反応が高いフェニルアラニン収率にて完r
せしめられることが見出さノ1.た。この方法によシ、
前駆物質とアスパラギン酸のほぼ当モルの溶液を用いて
100係の前駆物質転化及び85乃、1100%のフェ
ニルアラニン収率を達成することかり能である。In the present invention, by using asparagine ~ as the sole amine group donor and biological
*7. ,, for example, transamination can be carried out, preferred 1
Alternatively, the transamination reaction of diphenylalanine precursor to phenylalanine can be completed with a high phenylalanine yield by using dried cells belonging to a microbial orchid strain grown in the presence of 1q of phenylalanine pre-EX.
No. 1. Ta. By this method,
It is possible to achieve precursor conversions of 100% and phenylalanine yields of 85% to 1100% using approximately equimolar solutions of precursor and aspartic acid.
シ(本釣方法は、フェニルアラニン前駆物質にアミノ基
転移して高収率にてL−フェニルアラニンにすることが
出来る微生物を選択しそして調製し、唯一または支配的
アミノ基供与体としてアスパラギン酸を含む溶液を調製
し、フェニルアラニン前駆物質を含む溶液を調製し、上
記のW、j製された微生物と該溶液とをほぼ当モル割合
のアスパラギン酸及びフェニルアラニン前駆物質が存在
するように接触させそしてアミノ基転移反応を進行させ
ることを含む。反応はアミン基転移酵素活性に好ましい
条件下で行われるべきである。(The Hontsuri method involves selecting and preparing microorganisms capable of transaminating phenylalanine precursors to L-phenylalanine in high yield, containing aspartic acid as the sole or predominant amino group donor. A solution containing a phenylalanine precursor is prepared, and the microorganism prepared above W and J is brought into contact with the solution so that aspartic acid and the phenylalanine precursor are present in approximately equimolar proportions, and the amino group The reaction should be carried out under conditions that favor transaminase activity.
本発明の主目的の一つは、アスパラギン酸及びフェニル
アラニン前駆物質を基準として向上したフェニルアラニ
ン収率を与える、顕著に向上した細胞生産性を有する生
物的アミン基転移反応を扶供することである。この反応
系を用いて、所望の 〜生成物収率を達成するのに必要
な前駆物質の比例酌量を減少させることが可能である。One of the main objectives of the present invention is to provide a biological transamination reaction with significantly improved cell productivity that provides improved phenylalanine yields based on aspartic acid and phenylalanine precursors. Using this reaction system, it is possible to reduce the proportionate amount of precursor needed to achieve the desired ~ product yield.
関連する一つの目的は、最終生成物が特に未転化フェニ
ルアラニン前駆物質及びフェニルアラニンでないアミン
基転移生成物に関して不純物を殆んど含まない結果を与
えるような方法でフェニルアラニンを製造することであ
シ、従って時間がかかりそして高価な分離工程を僻ける
ことが出来る。A related objective is to produce phenylalanine in such a way that the final product is substantially free of impurities, in particular with respect to unconverted phenylalanine precursors and transamination products that are not phenylalanine; Time-consuming and expensive separation steps can be avoided.
更に、#IIl胞の生育を所要の反応から分離すること
により同時的な発酵及び反応の必要性をなくすことを意
図している。Additionally, it is intended to eliminate the need for simultaneous fermentation and reaction by separating #IIl cell growth from the required reactions.
本発明の全体としての目的はフェニルアラニンの製造に
伴う経費を驚異的且つ顕著に少なくすることである。The overall object of the present invention is to surprisingly and significantly reduce the expense associated with the production of phenylalanine.
本明細件に記載された本発明はアスパラギン酸と前駆物
質の両者を基準として高い、収率にてフェニルアラニン
前WX物質のフェニルアラニンへのアミノ基転移反応を
行わしめ、他方同時に前駆物質を完全に消費させる独特
の方法を提供する。本方法はほぼ当モル址のアスパラギ
ン敵及びフェニルアラニン前駆物質を用いる。微生物を
前駆物質の存在のもとで生育させる場曾に、触媒の酵素
活性を驚異的に^めることか出来る。The invention described herein allows for the transamination reaction of pre-phenylalanine WX material to phenylalanine in high yields based on both the aspartic acid and the precursor, while simultaneously completely consuming the precursor. provides a unique way to The method uses nearly equimolar asparagine precursors and phenylalanine precursors. By growing microorganisms in the presence of precursors, the enzymatic activity of the catalyst can be increased tremendously.
この方法において有用であることがすでに見出された微
生物はプンイドモナス・プンイドアルカリゲネス、大腸
菌及びブレビバクテリウム・チオゲニタリス(Brev
lacterium thiogenita−1is)
である。本発明において有用と考えられる1;;を生物
群は勿論はるかに広範囲であろう。反応速度及び効率は
恐らく菌株によシ異るであろうが、プソイドモナス属、
ブレビバクテリウム属及び大腸菌の他の菌株も適してい
ることが予想される。Microorganisms previously found to be useful in this method include Punidomonas punido alcaligenes, Escherichia coli and Brevibacterium thiogenitalis (Brev
lacterium thiogenita-1is)
It is. The group of organisms that would be useful in the present invention would of course be much broader. Although reaction rates and efficiencies likely vary between strains, Pseudomonas spp.
It is anticipated that other strains of Brevibacterium and E. coli may also be suitable.
史に、すべてのそれ自身のアミノ酸を生産し得ることが
知られている如何なる微生物はこの方法に心壁なトラン
スアミナーゼ活性度を示すことが予想され得る。例えば
、有用な微生物はベニシラム(アオカビ属)に属する菌
類を含むことが出来る。Any microorganism known in history to be capable of producing all its own amino acids could be expected to exhibit significant transaminase activity in this manner. For example, useful microorganisms can include fungi belonging to the Benicillum family.
更に、適当な菌株の混合培養を用いることが出来ること
が考えられる。Additionally, it is contemplated that mixed cultures of appropriate strains may be used.
非阻害#度のフェニルアラニン前駆物質の存在のもとで
生育させた微生物が前駆物質の存在しない状卯で生育さ
せた場合より速い速1(で前駆物質のフェニルアラニン
へのアミン基転移反応を触媒することが見出された。転
化(またはアミン基転移反応)の速度の増大は極めて重
侠であシ、その理由は前駆物質であるフェニルピルビン
酸が溶液中で不安定であシそして徐々に分解されるから
である。アミン基転移速度の増大は前駆物質が分解する
前によシ多くの前g物質にアミノ基転移することによシ
全体的収率を高める。帥えば0.5t/lフx=ルビル
ピン酸の存在下でプンイドモナス・プンイドアル力すゲ
ネスを生育させると、その結果75チのフェニルアラニ
ン収率を与える系が得られ、それに対し前駆物質を存在
させないで細胞を生育させると収率は59チである;、
a胞は約10、Of/lまでの前駆物質と共に生育させ
ることが出来、この濃度以上では細胞の生育は阻害され
るように思われる。微生物の触媒活性度を最適にする最
も好ましい範囲は約0.05乃至約5.0f/lの前駆
物質である。A microorganism grown in the presence of a non-inhibiting phenylalanine precursor catalyzes the transamination reaction of the precursor to phenylalanine at a faster rate than when grown in the absence of the precursor. It was found that increasing the rate of conversion (or transamination reaction) is extremely important because the precursor phenylpyruvate is unstable in solution and gradually decomposes. The increase in transamination rate increases the overall yield by transaminating more precursors before they are decomposed, for example 0.5 t/l. Growing Punidomonas punidoalusgenes in the presence of rubirpic acid results in a system that gives a phenylalanine yield of 75%, whereas growing the cells in the absence of the precursor yields is 59chi;,
A cells can be grown with up to about 10 Of/l of precursor, and above this concentration cell growth appears to be inhibited. The most preferred range for optimizing microbial catalytic activity is about 0.05 to about 5.0 f/l precursor.
フェニルアラニン前駆物質はアルファーケトカルボン酸
またはその塩である。この方法においては高度に精製し
た形のフェニルアラニン前駆物質を用いる必要はない。The phenylalanine precursor is an alpha-ketocarboxylic acid or a salt thereof. There is no need to use a highly purified form of the phenylalanine precursor in this method.
これに対し、従来の方法は前駆物質が精恥されているこ
とを必挟とするかまたは好み、その理由は不純物船細胞
の生長及び活性を阻害する順向を示すからである。本発
明は細胞生長を目的とする反応から分離しているので、
この不純物混入の問題は起らない。前駆物質は、精製し
たものとすることが出来、または水酸化ナトリラム、水
酸化カリウムもしくは水酸化アンモニウム加水分解物ま
たは硫酸沈殿物のごとき未精製の形とすることが出来る
。In contrast, conventional methods require or prefer that the precursor be purified because the impurity tends to inhibit cell growth and activity. Since the present invention is separated from reactions aimed at cell growth,
This problem of impurity mixing does not occur. The precursor can be purified or in crude form such as sodium hydroxide, potassium hydroxide or ammonium hydroxide hydrolyzate or sulfuric acid precipitate.
生育条件は用いられる特定の微生物に基づいて選ばれる
べきであシそしてこの分野に精通した人々の知識及び技
術の範囲内にあるであろう。この条件が健全な細胞の迅
速な生育に利することが好ましい。例えば、プソイドモ
ナス・プソイドアルカリゲネスを用いる場合、温度は好
ましくは約35乃至約39℃にそしてpHは約7.5に
保たれ、好気的環境を与えるために攪拌及び/′またけ
通気操作が用いられる。Growth conditions should be selected based on the particular microorganism used and will be within the knowledge and skill of those skilled in the art. Preferably, this condition favors rapid growth of healthy cells. For example, when using Pseudomonas pseudoalcaligenes, the temperature is preferably maintained at about 35 to about 39°C and the pH is maintained at about 7.5, with stirring and/or bubbling operations to provide an aerobic environment. used.
本発明の方法においては、選択された微生物を蛋白抽出
物、とうもろこし浸漬液等のごとき一種または二種以上
の複合もしくは天然炭素源を含む媒質中にて生育させる
ことが好ましい。ペプチドの形で提供される炭素源を用
いて、微生物は強制的に炭素源を所望のトランスアミナ
ーゼ活性を一発するアミノ酸成分に分解する作用を示す
。逆に、微生物がエタノールのごとき炭素源を用いて生
育される場合、トランスアミナーゼ活性度は全く低いこ
とが見出された。In the method of the present invention, the selected microorganisms are preferably grown in a medium containing one or more complex or natural carbon sources, such as protein extracts, corn steeps, and the like. Using a carbon source provided in the form of a peptide, microorganisms are forced to degrade the carbon source into amino acid components that exhibit the desired transaminase activity. Conversely, transaminase activity was found to be quite low when microorganisms were grown using carbon sources such as ethanol.
微生物は所望の細胞密度に生育せしめられる。The microorganisms are grown to a desired cell density.
正確な生育時間及び細胞密度は決定的に重要ではなく、
その理由は遠心分離または沖過のどとき従来の方法によ
シ必要ならば生育後に密度を増加させることが出来るか
らである。約48時間の典型的生育時間により通常操作
可能な数の細胞が提供される。The exact growth time and cell density are not critical;
This is because the density can be increased if necessary after growth by conventional methods such as centrifugation or sieving. A typical growth time of about 48 hours usually provides a workable number of cells.
次に細胞が捕集される。本発明の好ましい具体例に従え
ば、細胞は遠心分離され、洗浄されそ、して乾燥される
。この方法での細胞の調製には従来の方法が用いられる
。細胞は燐酸塩またはトリス緩衝液のごとき生物適合性
の如何なる物質を用いて洗浄することが出来る。細胞は
従来の乾燥方法、例えば32℃の真空オラン中で一夜乾
燥することが出来る。乾燥細胞の形の生物触媒が湿潤細
胞、超音波処理細胞等と比較して酵素の安定性を高める
ことが見出された。然しなから、細胞の乾燥は全反応系
に一つの工程段階を加えることになるので、他の細胞調
製法を用い得ることが考えられる。別法の具体例として
、微生物をこの方法に用いる適当な基質の中または上に
固定化することが出来る。The cells are then collected. According to a preferred embodiment of the invention, the cells are centrifuged, washed and dried. Conventional methods are used to prepare cells for this method. Cells can be washed using any biocompatible material such as phosphate or Tris buffer. Cells can be dried using conventional drying methods, such as overnight in a vacuum oran at 32°C. It has been found that the biocatalyst in the form of dry cells increases the stability of the enzyme compared to wet cells, sonicated cells, etc. However, since drying the cells adds one process step to the overall reaction system, it is conceivable that other cell preparation methods could be used. As an alternative embodiment, the microorganism can be immobilized in or on a suitable substrate for use in this method.
調製された細胞は次に本明細書に記載のアミノ基転移反
応に用いるまで室温または冷凍下で貯蔵することが出来
る。The prepared cells can then be stored at room temperature or frozen until used in the transamination reactions described herein.
基質溶液1リットル当り乾燥細胞を少くとも約2.0乃
至約10.Of用いることが一般に好ましい。At least about 2.0 to about 10.0% dry cells per liter of substrate solution. It is generally preferred to use Of.
低い触媒濃度ではアミノ基転移反応を受ける前にかなシ
の量のフェニルアラニン前駆物質が分解されるであろう
。従ってアミノ基転移反応において出来るだけ多くの前
駆物置を利用するためには系の触媒添加量を多くするこ
とが望ましい。At low catalyst concentrations, a small amount of the phenylalanine precursor will be degraded before undergoing the transamination reaction. Therefore, in order to utilize as much precursor storage space as possible in the transamination reaction, it is desirable to increase the amount of catalyst added to the system.
本発明のアミノ基転移反応のためのアミノ基供与体はア
スパラギン酸でなければならないかまたは事実上アスパ
ラギン酸を含むべきである。反応系中にアスパラギン酸
が唯一のアミン基供与体として存在する場合に最高のフ
ェニルアラニン収率が得られることが見出された。更に
、アスパラギン酸をアミノ基供与体として用いることに
より、オギザロ酢酸がアミノ基転移反応の副生成物とし
て生成される。オギザロ酢酸は容易に分解して二酸化炭
素とピルビン酸を生成する。上記のベスマンの従来の方
法は1時間当り約1.7X10−”モル/リットルの自
発的分解速度を報告している。本発明に関するアミノ基
転移から生成するオギヂロ酢酸の分解速度は自発的分解
について報告されている値にほぼ等しい。分解による反
応系からのオギザロ酢rλの除去は前駆物・11のフェ
ニルアラニンへの転化の完rせしめるであろう。The amino group donor for the transamination reaction of the present invention must be or substantially contain aspartic acid. It has been found that the highest phenylalanine yields are obtained when aspartic acid is present as the only amine group donor in the reaction system. Furthermore, by using aspartic acid as an amino group donor, ogizaloacetate is produced as a byproduct of the transamination reaction. Ogizaloacetate easily decomposes to produce carbon dioxide and pyruvate. The prior method of Bessman, described above, reports a spontaneous decomposition rate of about 1.7 x 10-'' moles/liter per hour. Approximately equal to the reported value. Removal of Ogizalo vinegar rλ from the reaction system by decomposition will complete the conversion of precursor 11 to phenylalanine.
本発明の好ましい具体1り11においては、生物適合性
緩衝液中はぼ当モル量のアスパラギン酸及びフェニルア
ラニン前駆物質を含む基質溶液が好ましい。本発明に関
して、「はぼ当モル」とは当モルであるかまたは当モル
から約20%までずれていることを意味している。然し
々がら、未転化のアスパラギンicy iたはフェニル
アラニン前駆q勿質の分離の必要性を減するかまたはな
くすためには、実際当モルに近い脅を用いることが好ま
しい。反応系を約7.0乃至約8.5の所望のpH範囲
に保ちそして反応過程を妨害しない如何なる生物適合性
溶媒または緩衝液を用いることが出来る。1り11えば
、約0.1乃至0.5M燐酸塩緩衝液が適していること
が見出された。或いはまた、オギザロ酢酸分解生成物と
して二酸化炭素が放出されるにつれてpHが低下するの
を防ぐのに必要な塩基を供給するためのpH制御剤を糸
に加えることによりpHを制御することが出来る。In preferred embodiment 11 of the invention, a substrate solution containing equimolar amounts of aspartic acid and phenylalanine precursors in a biocompatible buffer is preferred. In the context of this invention, "equal molar" means equimolar or up to about 20% off from equimolar. However, in order to reduce or eliminate the need for separation of unconverted asparagine or phenylalanine precursors, it is preferred to use near equimolar concentrations. Any biocompatible solvent or buffer that maintains the reaction system at the desired pH range of about 7.0 to about 8.5 and does not interfere with the reaction process can be used. For example, a phosphate buffer of about 0.1 to 0.5M has been found to be suitable. Alternatively, the pH can be controlled by adding a pH control agent to the yarn to provide the necessary base to prevent the pH from dropping as carbon dioxide is released as the oxyaloacetic acid decomposition product.
適当な反応容器中で、調製された細胞を当モル割合のア
スパラギン酸−前駆物質溶液と接触させる。死んだまた
は無生育性の細胞、好ましくは乾燥した細胞を用いるこ
とが好ましい。この形の細胞は湿潤したもしくは超音波
処理した細胞または組81J酵素抽出液と比較して向上
した酔゛累安定Lvを有する点で有利であると考えられ
る。更に、死んだまたは無生育性の細胞はフェニルアラ
ニン前駆物)Nを消費しない。超音波処理した)細胞を
用いることが出来るが、少くとも大部分の細胞の膜が確
実に破壊されることをだしかめるよう留意すべきである
。更に、この形の細胞は取扱いがよシ容易であり、他の
細#Ijl調製物よ#)幾分堅牢1つ頑丈である。また
適当な基質に細胞を固定化することが望ましいことがあ
シ得る。In a suitable reaction vessel, the prepared cells are contacted with an equimolar aspartate-precursor solution. It is preferred to use dead or non-viable cells, preferably dried cells. This form of cells is believed to be advantageous in having improved intoxication stability Lv compared to wet or sonicated cells or Group 81J enzyme extracts. Furthermore, dead or non-viable cells do not consume the phenylalanine precursor (N). (sonicated) cells can be used, but care should be taken to ensure that at least the majority of the cell membranes are destroyed. Furthermore, cells in this form are easier to handle and are somewhat more robust than other preparations. It may also be desirable to immobilize the cells on a suitable substrate.
本発明の方法の反応条件は酵素安定度を高めるように選
択されるべきである。温度範囲は約20乃至約50℃、
好ましくは約30乃至約400とすることが出来る。p
Hは約6.5乃至約9.01好ましくは約7.5乃至約
8.0とすることが出来る。The reaction conditions of the method of the invention should be selected to increase enzyme stability. The temperature range is about 20 to about 50℃,
Preferably, it can be about 30 to about 400. p
H can be about 6.5 to about 9.01, preferably about 7.5 to about 8.0.
p l(調節は好ましくはアンモニアまたは水酸化カリ
ウムを用いて行われ、そのいづれもアスパラギン酸及び
前駆物質の可溶化を助ける。反応は通風を必要としない
が、細胞−基質相互作用を高めるために基質と相対的な
細胞の動きまたはある程度の攪拌が行われるべきである
。p l (adjustment is preferably done with ammonia or potassium hydroxide, both of which help solubilize the aspartate and precursors. The reaction does not require ventilation, but to enhance cell-substrate interactions Movement of the cells relative to the substrate or some degree of agitation should occur.
アミン基転移反応は、高い生物触媒纜度を用いる場合、
約40時間以内、好ましくは24時間以内に完了するこ
とが予想され得る。然しなから、反応のよ)よい指標は
比反応速度、即ち1時間当シの乾燥細J@重針lf当シ
の転化されたフェニルアラニン前駆物質のt数であろう
。本発明の方法においては、この指標は1時間当り乾燥
細胞重賞12当シ生成されるフェニルアラニン約0.0
1乃至約10.Ofの範囲となシ得る。然しなから、典
型的には比反応速度は1時間当シ乾燥細胞重量12当り
フェニルアラニン約0.1乃至約2.02となるであろ
う。The transamination reaction can be performed using high biocatalyst intensity.
It can be expected to be completed within about 40 hours, preferably within 24 hours. However, a better indicator of the reaction would be the specific reaction rate, ie, the number of phenylalanine precursors converted per hour. In the method of the present invention, this index is approximately 0.0 phenylalanine produced per 12 dry cells per hour.
1 to about 10. You can get the range of. Typically, however, the specific reaction rate will be from about 0.1 to about 2.02 phenylalanine per 12 dry cell weight per hour.
アミノ基転移反応副生成物であるオギザロ酢酸はこの反
応条件下で容易に分解して二酸化炭素及して排出または
他のプロセスに使用することが出来る。ピルビン酸の少
くとも少須部分はアスパラギン酸の存在下での脱カルボ
キシル化またはアミン基転移によりアラニンに転化され
ると信じられる。従って、ピルビン酸と少賛のアラニン
の両者が存在するが、いづれも従来の分離法によシ容易
に除去することが出来る。The transamination reaction byproduct, ogizaloacetic acid, easily decomposes under the reaction conditions to release carbon dioxide or can be used for other processes. It is believed that at least a minor portion of pyruvate is converted to alanine by decarboxylation or transamination in the presence of aspartic acid. Therefore, both pyruvate and a small amount of alanine are present, but both can be easily removed by conventional separation methods.
本発明の生物的アミン基転移反応はアスパラギン酸また
はフェニルアラニン前駆物質に関して極めて高いフェニ
ルアラニン収率を与えることが出来る。即ち、85チま
たd:それ以上のアスパラギン酸を反応中にアミノ基転
移することが出来そして85チまたはそれ以上のフェニ
ルアラニン前駆物質をフェニルアラニンに転化すること
が出来る。The biological transamination reaction of the present invention can provide extremely high phenylalanine yields with respect to aspartic acid or phenylalanine precursors. That is, 85 or more aspartic acids can be transaminated during the reaction and 85 or more phenylalanine precursors can be converted to phenylalanine.
反応完了後、フェニルアラニン生成物は従来の方法によ
り回収することが出来る。回収及び分離は従来の発酵方
法を用いる場合よりこの方法を用いる方がよシ複雑でな
いと考えられる。発酵をアミノ基転移反応から分離する
ために、発酵副生成物及び代謝物(り11えば、II+
I(I胞外蛋白、脂質)を反応溶液から除く必要はない
。史に、本発明の方法は除去されるべき夾雑アミノ酸剃
生成物の生成が少ない。更に、アミノ基転移反応は完全
に行われるので、未反応の前駆物質が反応溶液中に残ら
ない。)TJr ”Aのフェニルアラニン生成物の回収
の典型的な方法はイオン交換及び/または分別結晶法を
含むことが出来る。After the reaction is complete, the phenylalanine product can be recovered by conventional methods. Recovery and separation are believed to be less complicated using this method than using conventional fermentation methods. In order to separate fermentation from transamination reactions, fermentation by-products and metabolites (e.g. II+
There is no need to remove I (extracellular protein, lipid) from the reaction solution. Historically, the method of the present invention produces less contaminant amino acid shave product that must be removed. Moreover, since the transamination reaction is complete, no unreacted precursor remains in the reaction solution. ) Typical methods for recovery of the phenylalanine product of TJr''A can include ion exchange and/or fractional crystallization methods.
下記の実施例は例示のために記載されるものであシ、木
切111111hjtに記載の本発明を何ら限定するも
のではない。本発明の記述において下記の略記号が用い
られている。The following examples are provided for illustrative purposes and are not intended to limit the invention described in Kikiri 111111hjt. The following abbreviations are used in the description of the invention.
℃:摂氏度
?または2n〕:ダラム
HPLC:高圧液体クロマトグラフィーh「、:時間
t:リットル
M:モル
ク:ミリグラム
d:ミリリットル
RPM:毎分回転数
チ:パーセント
トリス/HCI : ) リス(ヒドロキシメチル)−
アミノメタン−HCl
実施例において得られた結果を例示する表中、選択率、
転化率及び収率は下記のごとく計算された。℃: Celsius degree? or 2n]: Durham HPLC: High Pressure Liquid Chromatography h',: Time t: Liter M: Molk: Milligram d: Milliliter RPM: Revolutions per minute Ch: Percent Tris/HCI: ) Lis(hydroxymethyl)-
Aminomethane-HCl In the table illustrating the results obtained in the examples, selectivity,
Conversion and yield were calculated as follows.
実施例■
プソイドモナスプソイドアルカリゲネスATCC128
15、大腸菌ATCC13005、大腸菌ATCC13
070、及びプレピバクテリアチオゲニタリスATCC
31723を下記のごと〈生育させそして調製した。各
菌株の培養体をトリブチカーゼ・ンイ(Tryptic
ase 5oy)斜面培養基上で35℃にて24時間生
育させた。各斜面培養基を燐酸塩緩衝滅菌塩水5.9
mlを用いて洗浄しそして得られた懸濁液を500 m
l震盪フラスコ中のトリブチカーゼ・ソイ汁100d中
に移した。トリブチカーゼ・ソイ汁はBBLデイビジョ
7−オプ・ペクトy (Division of Be
cton)、デイキンンン・アンド・カンパニー(Di
ckinson& (:n、)から得られた。トリブチ
カーゼ・ソイ斜面培養基は209m/l寒天及び30℃
m/l トリブチカーゼ・ソイ汁から作られた。Example ■ Pseudomonas pseudoalcaligenes ATCC128
15, E. coli ATCC13005, E. coli ATCC13
070, and Prepibacteria thiogenitalis ATCC
31723 was grown and prepared as follows. Cultures of each strain were cultured with Tributicase nii (Tryptic).
ase 5oy) on a slanted culture medium at 35°C for 24 hours. Add each slant culture medium to 5.9 mL of phosphate-buffered sterile saline.
ml and the resulting suspension was washed with 500 ml
100 d of tributicase soy broth in a shake flask. Tributicase and soy juice is BBL Division of Be
cton), Dikinen & Co.
Obtained from ckinson & (:n,). Tributicase soy slant culture medium is 209 m/l agar and 30°C
m/l tributicase made from soy juice.
培養体は、RPM設定が不注意に250に増した場合、
生育時間の半分まで20ORPM、35℃にて561庁
間震盪フラスコ中で生育せしめられた。各菌株は別々に
捕集され、遠心分離されそして塩水で洗浄され、そして
真空オゾン中32℃にて12時間乾燥された。The culture is
The cells were grown in 561 intermittent shake flasks at 35° C. at 20 ORPM for up to half of the growth time. Each strain was collected separately, centrifuged and washed with saline, and dried in vacuum ozone at 32°C for 12 hours.
精製フェニルピルビン酸〔アルドリツヒ・ケミカ/l、
−カンパニー社(Aldrich ChemicalC
o、、 Inc、 )] 7.6 fm/l及びアスパ
ラギン酸18rm/lの溶液を燐酸カリウム緩衝液中に
て作りそしてpHをアンモニアで7.5に調節した。Purified phenylpyruvic acid [Aldrich Chemika/l,
-Aldrich Chemical Company
A solution of 7.6 fm/l and aspartic acid 18 rm/l was made in potassium phosphate buffer and the pH was adjusted to 7.5 with ammonia.
この実験では、本明細書に記載の本発明のほぼ当モルの
アスパラギン酸/前駆物質溶液が用いられなかったこと
に留意されたい。20m栓付き試験管中で、この溶液の
四つの10.011部分に四つのw株の各溶液IR1当
シ乾燥細胞2.0■を加えfC^該試験管を35℃、2
0ORPMの定温震借浴中に置いた。試料を5.8及び
24時間後に採取しそして(下記の′)フェニルピルビ
ン酸のための塩化第二鉄比色分析によシ且つフェニルア
ラニン及びアスパラギン酸のためのHPLCによシ分析
した。結果は第1表に示されており、該表は用いら実l
Jm例11
プソイドモナス・プソイドアルカリゲネスATCC12
815細胞をトリブチカーゼ・7451面培養基上で3
5℃にて24時間生育させた。Note that the approximately equimolar aspartic acid/precursor solution of the invention described herein was not used in this experiment. In a test tube with a 20 m stopper, add 2.0 μl of dried cells per IR of each solution of the four W strains to four 10.011 portions of this solution.
It was placed in a constant temperature shaking bath at 0ORPM. Samples were taken after 5.8 and 24 hours and analyzed by ferric chloride colorimetry for phenylpyruvic acid (see below) and by HPLC for phenylalanine and aspartic acid. The results are shown in Table 1, which is based on the actual results used.
Jm Example 11 Pseudomonas pseudoalcaligenes ATCC12
815 cells were grown on tributicase-7451 culture medium for 3 days.
It was grown for 24 hours at 5°C.
−組の斜面培養基(試料1)に対して、各培養基を5.
Oat地水で洗浄しそして得られた懸濁液を1リアト
ル再盪フラスコの1001のトリブチカーゼ・ソイーP
PA生育媒質に移した。トリブチカーゼ・ンイーPPA
生育媒質はトリブチカーゼ・ソイ汁(BBLディビジョ
ン・オプ・ペクトン、デイキンソン・アンド・カンパニ
ー)フェニルピルビンa(PPA)(アルドリツヒ・ケ
ミカル・カンパニー社)0.5 fm /lを加えて作
製された。- For a set of slant cultures (sample 1), 5.5% of each culture medium was added.
Wash with Oat ground water and transfer the resulting suspension to 1001 Tributicase Soy P in a 1 liter re-shake flask.
Transferred to PA growth medium. Tributicase Nyi PPA
The growth medium was made by adding 0.5 fm/l of tributicase soy juice (BBL Division op Pectone, Dickinson & Company) phenylpyruvin a (PPA) (Aldrich Chemical Company).
フラスコは35℃にて12時間定温器に入れられそして
1リツトル震倉フラスコ中にて5001dトリブチカー
ゼ・ソイ汁に接種するために用いられた。第二の組の斜
面培養基(試料■)に対しては、PPAの添加なしに同
じ操作を行った。試料■及び試料■の両者のフラスコを
細胞の捕果前に35℃、20ORPMにて48時間培養
した。細胞ペレットは遠心分離されそして直ちに37℃
の、久空オブン中に12時間入れることにより乾燥され
た。The flask was placed in an incubator for 12 hours at 35° C. and used to inoculate 5001d tributicase soy broth in a 1 liter shaker flask. A second set of slants (sample ■) was subjected to the same procedure without the addition of PPA. The flasks of both Sample 1 and Sample 2 were cultured at 35° C. and 20 ORPM for 48 hours before harvesting the cells. Cell pellets were centrifuged and immediately incubated at 37 °C.
It was dried by placing it in a Kuzora oven for 12 hours.
燐酸塩緩衝液中18.8tm/lアスパラギン酸及び2
3.2 fm / ttfl製フェニルピルビン酸(ア
ルドリツヒカンパニー)の溶液を作製した。pHをアン
モニアによシフ、5に調節した。この溶液100I+I
t部分に試料Iまたは試料■からの乾燥細胞z、nym
/lをそれぞれ加えた。該混合物を37℃、2QORP
Mにて24時間培養した。5.7及び24時間経過時に
、各試料から2.Oaづつ採取しそして実施例Iと同様
に分析した。第■表に示された紡果かられかるように、
PPAの発酵@買への添加によシこれらの微生物の比ア
ミノ基転移活性度が驚異的に増大する。18.8 tm/l aspartic acid in phosphate buffer and 2
3.2 A solution of fm/ttfl phenylpyruvic acid (Aldrich Company) was prepared. The pH was adjusted to 5 by sifting with ammonia. This solution 100I+I
Dry cells from sample I or sample ■ in part t, z, nym
/l were added to each. The mixture was heated at 37°C in 2QORP.
The cells were cultured for 24 hours in M. 5. At 7 and 24 hours, 2. Oa portions were collected and analyzed as in Example I. As can be seen from the results shown in Table ■,
The addition of PPA to the fermentation process dramatically increases the specific transamination activity of these microorganisms.
第■
(前駆物質を用いる生育6
5時間
PPA1(t/l) 16.2 12.IASP2(t
/l)1 z、8 11.3PHE3(9/l)4.5
8.6
選択率(PHE/PPA ) 64.0% 80.0%
転化率(PPA) 30.0% 48.0%収率(PH
E/’PPA ) 19.2係 38.4係選択率(P
T−TE/ASP) 60.0% 93.0%転化率(
AsP) 37.0% 40.0%収率(PHE/AS
P) 22.2% 37.2係反応速度(M PHE/
hr−IFm細胞) 2.7xlO−’ 5.2xlO
−3反応速度(M PHE/hr−1m細胞) 5.4
X10−3 1.0X10−I PPA=フェニルピル
ビン酸
2 ASP=アスパラギン酸
3 PHE=フェニルアラニン
よる誘発効果)
8.20 3.26 0.00 0.008.98 3
.46 5.26 2.1311.30 17.10
14.10 21.0075.00 85.00 fi
l、00 90.5065、no 86.00 100
.00 100.0048.70 73.10 61.
00 90.5091.00 90.00 84.00
101.0054.00 83.On 72.00
89.0049.10 74.70 60.50 89
.901.3X10−32.3X10− 1.7X10
°” 2.5X10−’2.5X10−’ 4.6X1
0−” 3.4X10−” 5.0X10’実施例1
増大触媒負荷
乾燥し冬シン・イドモナス・プンイドアル力すゲネスA
TCC12815,10胞を実施例Hの試料■に対する
操作に従って調製した。燐酸塩緩衝液中Q、 l 5
M74度になるように25f’m/lフェニルピルビン
酸(アルドリツヒeカンパニー)及ヒ20Pm/lアス
パラギン酸を含む溶液Aを調製した。アンモニアでpI
−1を7.5に調節した。燐酸塩緩衝液中0.12M1
PJ度になるように20fm/lフェニルピルビン酸及
び16fm/lアスパラギンを字を含む溶液Bを調製し
、pI(をアンモニアで7.5 K調節した。Part ■ (Growth using precursors 6 5 hours PPA1 (t/l) 16.2 12. IASP2 (t
/l)1 z, 8 11.3PHE3(9/l)4.5
8.6 Selectivity (PHE/PPA) 64.0% 80.0%
Conversion rate (PPA) 30.0% 48.0% Yield (PH
E/'PPA) Section 19.2 Section 38.4 Selection rate (P
T-TE/ASP) 60.0% 93.0% conversion rate (
AsP) 37.0% 40.0% yield (PHE/AS
P) 22.2% 37.2 reaction rate (M PHE/
hr-IFm cells) 2.7xlO-' 5.2xlO
-3 reaction rate (M PHE/hr-1m cells) 5.4
X10-3 1.0X10-I PPA = phenylpyruvic acid 2 ASP = aspartic acid 3 PHE = induced effect by phenylalanine) 8.20 3.26 0.00 0.008.98 3
.. 46 5.26 2.1311.30 17.10
14.10 21.0075.00 85.00 fi
l, 00 90.5065, no 86.00 100
.. 00 100.0048.70 73.10 61.
00 90.5091.00 90.00 84.00
101.0054.00 83. On 72.00
89.0049.10 74.70 60.50 89
.. 901.3X10-32.3X10- 1.7X10
°"2.5X10-'2.5X10-' 4.6X1
0-"3.4X10-"5.0X10'Example 1 Increased Catalyst Load Drying Winter Syndrome Idomonas Punidoalusgenes A
TCC12815,10 cells were prepared according to the procedure for sample ① in Example H. Q in phosphate buffer, l 5
A solution A containing 25 f'm/l phenylpyruvic acid (Aldrich e Company) and 20 Pm/l aspartic acid was prepared so that M was 74 degrees. pI with ammonia
-1 was adjusted to 7.5. 0.12M1 in phosphate buffer
Solution B was prepared containing 20 fm/l phenylpyruvic acid and 16 fm/l asparagine so as to have a pI of 7.5 K with ammonia.
これらの浴液にそれぞれ5.0fm/を及び2.02m
/lの濃度にて乾燥+i:fll胞を加え、そして実施
例■に記載された反応条件にて24時間培養した。5.0 fm/ and 2.02 m for these baths, respectively.
Dried +i:fl cells were added at a concentration of /l and cultured for 24 hours under the reaction conditions described in Example ■.
実施例Iと同様に5乃至24時間経過時に試料を実施例
EV
ドアルリゲネスATCC12815を実施例Hの試料I
の方法に従って調製した。三つの反応物質溶液をl!l
jMシ、その各々は燐酸塩緩衝液中16.4?m/lフ
ェニルピルビン酸(アルドリツヒ・ケミカル・カンパニ
ー社)を含んだ。溶液Iは13.92 fm /lアス
パラギン酸を含んだ。溶液Uは15.83fm/lグル
タミン酸を含んだ。溶液胃は6.68tm/lアスパラ
ギン酸及び8.78tm/Lグルタミン酸を含んだ。各
溶液に2.0fm/1乾燥細胞を加えそして該混合物を
実施例Iに記載された反応条件にて25時間培養した。Similarly to Example I, after 5 to 24 hours, a sample was prepared from Example EV.
It was prepared according to the method of l of the three reactant solutions! l
jM, each of which is 16.4 in phosphate buffer? m/l phenylpyruvate (Aldrich Chemical Company). Solution I contained 13.92 fm/l aspartic acid. Solution U contained 15.83 fm/l glutamic acid. The solution stomach contained 6.68 tm/L aspartic acid and 8.78 tm/L glutamic acid. 2.0 fm/1 dry cells were added to each solution and the mixture was cultured for 25 hours under the reaction conditions described in Example I.
試料を5及び26時間経過時に実施例Iと同様に分析し
た。第■表に示された結果はアスパラギン酸を唯一のア
ミン基供与体とした場合驚異的にすぐれた収率が得られ
ることを示している。Samples were analyzed as in Example I at 5 and 26 hours. The results shown in Table 2 show that surprisingly good yields can be obtained when aspartic acid is used as the sole amine group donor.
実施例V
イドアルカリゲネスATCC12815を実施例■の試
料Iの方法に従って生育させた。細胞を捕集しそして一
部分を遠心分離で濃縮し、次に35℃真窒オブン中で1
2時間乾燥した。燐酸塩緩衝液(pH7,5)中フェニ
ルピルビン酸(xq、srm/1)及びアスパラギン酸
(16,0tm/l )の0.12当モル溶液を調製し
そしてその100dづつを二つの温度制御され(37℃
)且つ攪拌された( 1s ORPM)0.2リツトル
容器に入れた。Example V Idoalcaligenes ATCC 12815 was grown according to the method of Sample I of Example (2). Cells were collected and aliquots concentrated by centrifugation, then 1 hour in a nitrogen oven at 35°C.
It was dried for 2 hours. A 0.12 equimolar solution of phenylpyruvate (xq, srm/1) and aspartic acid (16,0 tm/l) in phosphate buffer (pH 7,5) was prepared and 100 d of it was added to two temperature-controlled (37℃
) and stirred (1s ORPM) into a 0.2 liter container.
一つの容器に2.0 tm /を乾燥細胞を加えた。他
方の容器に2.0fm/を乾燥細胞型りに相当する湿潤
細胞(85チ水分)を加えた。反応混合物を18時間培
養した。5.5及び18時間経過時に液体を採取しそし
て実施例1と同様にしてフェニルアラニン、アスパラギ
ン酸及びフェニルピルビンフェニルピルビン酸ナトリウ
ム塩の塩化第二鉄比色分析原理:フェニルピルビン酸(
PPA)は第二鉄イオンと緑色の錯体を形成する。緑色
の強度力よ存在するPPAの坦に比例する。2.0 tm/dry cells were added to one container. To the other container was added 2.0 fm/wet cells (85 fm water) corresponding to the dry cell mold. The reaction mixture was incubated for 18 hours. 5. At the end of 5 and 18 hours, the liquid was collected and the colorimetric analysis of phenylalanine, aspartic acid and phenylpyruvate phenylpyruvate sodium salt was carried out in the same manner as in Example 1.Principle: Phenylpyruvic acid (
PPA) forms a green complex with ferric ions. The intensity of green color is proportional to the amount of PPA present.
試薬:
1、発色液: (1oooaz)
下記の成分を混合しそして水浴中にて室温まで冷却する
。1 リットル容フラスコに成分を入れそして脱水イオ
ン水にて標線まで満たす。Reagents: 1. Color developer: (1ooooaz) Mix the following ingredients and cool to room temperature in a water bath. Place the ingredients in a 1 liter flask and fill to the mark with dehydrated ionized water.
成分: 0.5 fm FeC1,・6H,0,20m
氷酢酸、600dジメチルスルホキシド、200+11
7脱イオン水。Component: 0.5 fm FeC1, 6H, 0,20m
Glacial acetic acid, 600d dimethyl sulfoxide, 200+11
7 Deionized water.
2、Na−PPA標準液(1(1fm/l−)500
”f Na PPA −HtO(アルドリッヒ・ケミカ
ル・カンパニー社、98チ〜looチ純度)を401N
/ 0. I M )リス/Hcl緩衝液(pH8,0
)K34℃にて加える。溶解するまで攪拌する。該溶液
を5Qyrl容フラスコに入れそしてトリス/)JCI
緩衝液にて標線まで満たす。冷蔵庫中に貯蔵する。2. Na-PPA standard solution (1 (1 fm/l-) 500
"f Na PPA-HtO (Aldrich Chemical Company, purity of 98% to 10%) to 401N
/ 0. IM) Lis/Hcl buffer (pH 8,0
)K Add at 34°C. Stir until dissolved. The solution was placed in a 5Qyrl flask and added with Tris/)JCI
Fill to the marked line with buffer solution. Store in the refrigerator.
スK 900 ml脱イオン水を加え、I(CIでpH
を8.0に調節し、容量フラスコに入れ、脱イオン水を
加えて1000 mlとする。Add 900 ml deionized water and adjust pH with I (CI).
Adjust the volume to 8.0, place in a volumetric flask, and make up to 1000 ml with deionized water.
検量線:
Na−PPA標準液及び4.954I/発色液をガラス
jI41の吸光光度計用チューブに入れる。渦攪拌によ
り混合する。最初チューブに発色液を加えた時から正確
に10分間静置する。640 nmにて光学的濃度(O
D)を抗みとるo Na−PPA−HtO標準検量線を
作成する(垂直軸が吸光度、水平軸がりNa−PPA−
H,0/m1DSである)。Calibration curve: Place Na-PPA standard solution and 4.954I/color developer into a glass jI41 spectrophotometer tube. Mix by vortexing. Let stand for exactly 10 minutes from the time you first added the coloring solution to the tube. Optical density (O
D) Create a standard calibration curve for Na-PPA-HtO (vertical axis is absorbance, horizontal axis is Na-PPA-HtO).
H,0/m1DS).
Q Na−PPA−HtO
5μt O,01
10μt O,02
15μt ’ 0.03
20μt O,04
25μt O,05
30μt O,06
または
本発明の原理、好ましい具体例及び操作の型式を木切4
書に記述した。然しなから、それらは本発明を何ら制限
するものでなく例示のためのものであるので、これによ
り保護されるべきとする本発明の内容は本明細#に記載
された特定の形態に制限されるべきでないことをr解さ
れたい。本発明のfIv神から離れることなく種々の変
形及び修旧がこの分野に精通した人々により可能である
。Q Na-PPA-HtO 5μt O,01 10μt O,02 15μt ' 0.03 20μt O,04 25μt O,05 30μt O,06 Or the principle, preferred embodiment and operation type of the present invention
It was written in the book. However, they do not limit the present invention in any way and are for illustrative purposes only, and therefore the content of the present invention to be protected is not limited to the specific forms described in this specification. Please understand that I shouldn't do this. Various modifications and modifications can be made by those skilled in the art without departing from the fIv nature of the invention.
特許出願人 ダブリュー・アール・ブレイス・アンド・
カンパニーPatent applicant W.R. Brace &
company
Claims (1)
して高収率にてL−フェニルアラ ニンにすることが出来る微生物を選択 しそして調製し、 (i))唯一のまたは支配的なアミン基供与体としてア
スパラギン酸を含む溶液を調 製し、 (c) フェニルアラニン前駆物質を含む溶液を調製し
、 (d) 上記の調製された微生物と段階rb)及び(c
)から得られた溶液とをはぼ当モル割合のアスパラギン
酸及びフェニルアラ ニン前駆物質が存在するように、且つ トランスアミナーゼの活性に好ましい 条件下で接触させ、そして (e) アミノ基転移反応を進行させる、ことを特徴と
するL−フェニルアラニンの製造方法。 2、上記微生物がシンイドモナスJ’s、大m菌、ブレ
ビバクテリア(brevibacteria)及びペニ
シラムから成る群から選らばれる特許請求の範囲第1項
記載の方法。 3、上記微生物がグンイドモナス・シンイドアルカリゲ
ネス(Pseudomonas pseudnalca
l i−genes) ATCCl 2815 fある
特許請求の範囲第2項記載の方法。 4、 上記微生物が非阻害濃度のフェニルアラニンの存
在下で生育されたものである特許請求の範囲第2項記載
の方法。 5、上記微生物が1リットル当り約10.Orまでの前
駆物質の存在のもとで生育されたものである特許請求の
範囲第4項記載の方法。 6、上記微生物が複合炭素源の存在下で生育されたもの
である特許請求の範囲第2項記載の方法。 7、上記微生物が乾燥によシ調製されている特許請求の
範囲第2項記載の方法。 8、 フェニルアラニン前駆物質がフェニルピルビン酸
である特許請求の範囲第1項記載の方法。 9、 フェニルピルビン酸が精製したものであるかまた
は水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたは水酸化アン
モニウムによる加水分解物であるかまたは硫酸による沈
殿物である特許請求の範囲第8項記載の方法。 10、段階(d)が約20〜約50℃の温度及び約6.
5〜約9,0のpHにて行なわれる特許請求の範囲第1
項記載の方法。 11、温度が約30〜約40℃であシそしてpf(が約
7.5〜約8.0である特許請求の範囲第10項記載の
方法。 12、段階(e)のアミン基転移反応によシ生成したオ
ギザロ酢酸がその場で分解される特許請求の範囲第1項
記載の方法。 13、オギザロ酢酸の分解が自発的に起る特許請求の範
囲第10項記載の方法。 14、フェニルアラニン前駆物質が反応中に完全に消費
される牡許請求の範囲第1項記載の方法。 15、 L−フェニルアラニンの収率が少くとも90〜
約100パーセントである特許請求の範囲第1頂記載の
方法。 16、(a) 生物的触媒を用いてアミン基転移反応を
起させ、 (b) 主アミノ基供与体としてアスパラギン酸を用い
、そして (e) オギザロ酢酸アミン基転移反応副生成を反応系
から除去する、 ことを特徴とするフェニルアラニン前駆物質のL−フェ
ニルアラニンへのアミノ基転移反応を完了せしめる方法
。 17、生物的触媒がブンイドモナス属、大腸菌、ブレビ
バクテリア及びペニシラムから成る群から選ばれる細胞
を含む特許請求の範囲飢16項記載の方法。 18、上記細胞が菌株プンイドモナス・プソイドアルカ
リゲネスATCC12Fl 15からのものである特許
請求の範囲第17項記載の方法。 19、上記細胞が死んだものまたは無生育性のものであ
る特許請求の範囲第17Jl″I記載の方法。 20、上記細胞が収穫されそして乾燥されたものである
特許請求の範囲第19項記載の方法。 21、非阻害濃度のフェニルピルビン酸を含む媒質中で
上記細胞を生育させることにより触媒のトランスアミナ
ーゼ活性度が増大された特許請求の範囲g17項記載の
方法。 22、生育媒質1リットル当り約i o、 o rまで
のフェニルピルビン酸が存在する特許請求の範囲第21
項記載の方法。 23、過料の生物的触媒が反応を完結に導くべく用いら
れる特許請求の範囲第17項記載の方法。 24、生物的触媒濃度が約2.0〜約10.(1/リツ
トルである特許請求の範囲第23項記載の方法。 25、アスパラギン酸が11(を−のアミノ基供与体で
ある特許請求の範囲第16項記載の方法。 26、アミノ基転移反応系中のアスパラギン酸対フェニ
ルアラニン前躯物質の比がほぼ当モルである特許請求の
範囲第16項記載の方法。 27、アスパラギン酸及びフェニルアラニン前駆物質の
生物的アミン基転移反応によシL−フエニルアラニンを
生成させる方法であって、アミノ基転移を行い得る死ん
だまたは無生育性の微生物をほぼ当モル量のアスパラギ
ン酸及びフェニルアラニン前駆物質を含む一つまたは二
つ以上の溶液と接触させることを特徴とする方法。 2B、7xニルアラニン前駆物質がフェニルピルピン酸
である特許請求の範囲第27項記載の方法。 29、 フェニルピルビン酸が精畠11シたものである
かまたは水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたは水酸
化アンモニウムによる加水分解物であるかまたは硫酸に
よる沈殿物である特許請求の範囲第28項記載の方法。 30、上記微生物がプソイドモナス属、大腸菌、ブレビ
バクテリア及びベニシラムがら成る群から選ばれる特許
請求の範囲第27項記戦の方法。 31、上記微生物が非阻害濃蛭のフェニルアラニン前駆
物質の存在のもとで生育されたものである%許諸求の範
囲第30項記載の方法。 32、 上記微生物が1リットル当シ約10.Ofまで
の前駆物質の存在のもとで生育されたものである特許請
求の範囲第31項記載の方法。 33、上記微生物が複合炭素源の存在のもとで生育され
たものである、特許請求の範囲第30項記載の方法。 34、上記微生物が乾燥によシ調製されたものである特
許請求の範囲第30項記載の方法。[Claims] 1. (a) Selecting and preparing a microorganism capable of transaminating a phenylalanine precursor to L-phenylalanine in high yield; (c) preparing a solution containing aspartic acid as an amine group donor; (d) combining the above prepared microorganism with steps rb) and (c)
(e) allowing the transamination reaction to proceed; A method for producing L-phenylalanine, characterized in that: 2. The method according to claim 1, wherein the microorganism is selected from the group consisting of Sinidomonas J's, E. m., Brevibacteria, and Penicillum. 3. The above microorganism is Gunidomonas sinidoalcaligenes (Pseudomonas pseudonalca).
li-genes) ATCCl 2815 f. 4. The method according to claim 2, wherein the microorganism is grown in the presence of a non-inhibitory concentration of phenylalanine. 5. The above microorganisms are about 10. 5. The method according to claim 4, which is grown in the presence of precursors up to Or. 6. The method according to claim 2, wherein the microorganism is grown in the presence of a complex carbon source. 7. The method according to claim 2, wherein the microorganism is prepared by drying. 8. The method according to claim 1, wherein the phenylalanine precursor is phenylpyruvic acid. 9. The method according to claim 8, wherein the phenylpyruvic acid is purified, or a hydrolyzate with sodium hydroxide, potassium hydroxide or ammonium hydroxide, or a precipitate with sulfuric acid. 10. step (d) at a temperature of about 20 to about 50°C; and 6.
Claim 1 carried out at a pH of 5 to about 9.0
The method described in section. 11. The method of claim 10, wherein the temperature is from about 30 to about 40°C and pf is from about 7.5 to about 8.0. 12. The transamination reaction of step (e). 13. The method according to claim 1, in which the oxyaloacetic acid produced by the reaction is decomposed on the spot. 13. The method according to claim 10, in which the decomposition of ogizaloacetic acid occurs spontaneously. 14. The method according to claim 1, wherein the phenylalanine precursor is completely consumed during the reaction. 15. The yield of L-phenylalanine is at least 90%
100%. 16. (a) Using a biological catalyst to cause the transamination reaction, (b) Using aspartic acid as the main amino group donor, and (e) Removing the ogizaloacetate transamination reaction byproduct from the reaction system. A method for completing a transamination reaction of a phenylalanine precursor to L-phenylalanine, comprising: 17. The method of claim 16, wherein the biological catalyst comprises cells selected from the group consisting of Bunidomonas, Escherichia coli, Brevibacteria, and Penicillum. 18. The method of claim 17, wherein said cells are from the strain Punidomonas pseudoalcaligenes ATCC12Fl 15. 19. The method according to claim 17Jl''I, wherein said cells are dead or non-viable. 20. The method according to claim 19, wherein said cells are harvested and dried. 21. The method of claim g17, wherein the transaminase activity of the catalyst is increased by growing the cells in a medium containing a non-inhibitory concentration of phenylpyruvate. 22. Claim 21, wherein up to about i o, o r of phenylpyruvate is present
The method described in section. 23. The method of claim 17, wherein a biocatalyst in the feedstock is used to drive the reaction to completion. 24, the biological catalyst concentration is about 2.0 to about 10. (1/liter). 25. The method according to claim 16, wherein aspartic acid is an amino group donor for 11 (-). 26. Transamination reaction. 17. The method of claim 16, wherein the ratio of aspartic acid to phenylalanine precursor in the system is approximately equimolar.27. A method of producing enylalanine comprising contacting a dead or non-viable microorganism capable of transamination with one or more solutions containing approximately equimolar amounts of aspartic acid and a phenylalanine precursor. 28. The method of claim 27, wherein the 2B,7x nylalanine precursor is phenylpyruvic acid. 29. The phenylpyruvic acid is purified or sodium hydroxide; 29. The method of claim 28, wherein the microorganism is a hydrolyzate with potassium hydroxide or ammonium hydroxide or a precipitate with sulfuric acid. 31. The method according to claim 27, wherein the microorganism is grown in the presence of a non-inhibited leech phenylalanine precursor. 32. The method of claim 31, wherein the microorganism is grown in the presence of up to about 10.Of precursor per liter. 33. The method of claim 31, wherein the microorganism is grown in the presence of up to about 10. The method according to claim 30, wherein the microorganism is grown in the presence of. 34. The method according to claim 30, wherein the microorganism is prepared by drying.
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