JPS6012974A - ギ酸デヒドロゲナ−ゼの製造法 - Google Patents
ギ酸デヒドロゲナ−ゼの製造法Info
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- JPS6012974A JPS6012974A JP58118161A JP11816183A JPS6012974A JP S6012974 A JPS6012974 A JP S6012974A JP 58118161 A JP58118161 A JP 58118161A JP 11816183 A JP11816183 A JP 11816183A JP S6012974 A JPS6012974 A JP S6012974A
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- dehydrogenase
- acid dehydrogenase
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、シュードモナス・オキザラティクス（Ｐｓｅ
ｕｄｏ−ｍｏｎａｓ ｏｘａｌａＬｉｃｕｓ）を用いて
ギ酸デヒドロゲナーゼを製造する方法に関するものであ
る。
ｕｄｏ−ｍｏｎａｓ ｏｘａｌａＬｉｃｕｓ）を用いて
ギ酸デヒドロゲナーゼを製造する方法に関するものであ
る。
シュードモナス・オキザラティクスが生産するギ酸デヒ
ドロゲナーゼは、ギ酸の微量定量にとわめて有用な酵素
である。
ドロゲナーゼは、ギ酸の微量定量にとわめて有用な酵素
である。
すなわも、公知のギ酸定量法のうもホルミルテトラヒド
ロ葉酸シンセターゼまたはギ酸デヒドロゲナーゼを用い
る酵素法は、測定操作が簡単で感度も高く、現在もっと
もすぐれた定量法であるが、なかでもギ酸デヒドロゲナ
ーゼを用いる方法は、ホルミルテトラヒドロ葉酸シンセ
ターゼを用いる方法よりもかなり安価である点で有利で
ある。そしてギ酸デヒドロゲナーゼの中でもシュードモ
ナス・オキザラティクス起源のものは、他の動植物また
は微生物から採取されたギ酸デヒドロゲナーゼよりも基
質特異性が高く、したがってこの酵素を用いるギ酸定量
法は分析試料中に共存する池の物質の影響を受けにくい
から、多くの試料をはとんと前処理なしに分析すること
ができるという長所がある（以下、ギ酸デヒドロゲナー
ゼというときはこのシュードモナス・オキザラティクス
起源のものを意味する）。
ロ葉酸シンセターゼまたはギ酸デヒドロゲナーゼを用い
る酵素法は、測定操作が簡単で感度も高く、現在もっと
もすぐれた定量法であるが、なかでもギ酸デヒドロゲナ
ーゼを用いる方法は、ホルミルテトラヒドロ葉酸シンセ
ターゼを用いる方法よりもかなり安価である点で有利で
ある。そしてギ酸デヒドロゲナーゼの中でもシュードモ
ナス・オキザラティクス起源のものは、他の動植物また
は微生物から採取されたギ酸デヒドロゲナーゼよりも基
質特異性が高く、したがってこの酵素を用いるギ酸定量
法は分析試料中に共存する池の物質の影響を受けにくい
から、多くの試料をはとんと前処理なしに分析すること
ができるという長所がある（以下、ギ酸デヒドロゲナー
ゼというときはこのシュードモナス・オキザラティクス
起源のものを意味する）。
このようにすぐれた性質を持っキ酸デヒドロγ゛ナーゼ
ではあるが、その欠点は、酸素に対する感受性が強く、
空気中できわめて不安定なことである。この欠点がある
ため、ギ酸デヒドロゲナーゼの製造にはがなりの困難が
ともなう。すなわも、シュードモナス・オキサラティク
スの菌体がら抽出された直後から失活が始まるため、抽
出および精製の各工程における歩留りがきわめて悪いの
である。したがってこの酵素は、分析試薬として必要な
品質の安定性に欠けるものであった。
ではあるが、その欠点は、酸素に対する感受性が強く、
空気中できわめて不安定なことである。この欠点がある
ため、ギ酸デヒドロゲナーゼの製造にはがなりの困難が
ともなう。すなわも、シュードモナス・オキサラティク
スの菌体がら抽出された直後から失活が始まるため、抽
出および精製の各工程における歩留りがきわめて悪いの
である。したがってこの酵素は、分析試薬として必要な
品質の安定性に欠けるものであった。
本発明者らは、上述のように不安定なギ酸デヒドロゲナ
ーゼの安定化に有効な物質をめて種々検討を重ねた結果
、Ｌ−システィン、ニコチン酸アミドアデニンジヌクレ
オチド（以下、ＮＡＤという）および第一鉄イオンがす
ぐれた性質を有することを知り、これらの物質の存在下
にギ酸デヒドロゲナーゼの抽出・精製を行うことを特徴
とするギ酸デヒドロゲナーゼの製造法の発明を完成する
に至った。
ーゼの安定化に有効な物質をめて種々検討を重ねた結果
、Ｌ−システィン、ニコチン酸アミドアデニンジヌクレ
オチド（以下、ＮＡＤという）および第一鉄イオンがす
ぐれた性質を有することを知り、これらの物質の存在下
にギ酸デヒドロゲナーゼの抽出・精製を行うことを特徴
とするギ酸デヒドロゲナーゼの製造法の発明を完成する
に至った。
また、シュードモナス・オキザラティクスにギ酸デヒド
ロゲナーゼを生産させるための培養に用いる培地に、ビ
タミンを含まないカザミノ酸（商品名： Ｄｉｆｃｏ社
製品）全製品するときは１．菌体内に生産されるギ酸デ
ヒドロゲナーゼの量が著しく増加することを知り、上記
カザミノ酸を添加した培地でシュードモナス・オキザラ
ティクスを培養したのち上記安定化に有効な物質の存在
下に抽出・精製を行うことにより高能率でギ酸デヒドロ
ゲナーゼを製造する方法の発明をも完成するに至った。
ロゲナーゼを生産させるための培養に用いる培地に、ビ
タミンを含まないカザミノ酸（商品名： Ｄｉｆｃｏ社
製品）全製品するときは１．菌体内に生産されるギ酸デ
ヒドロゲナーゼの量が著しく増加することを知り、上記
カザミノ酸を添加した培地でシュードモナス・オキザラ
ティクスを培養したのち上記安定化に有効な物質の存在
下に抽出・精製を行うことにより高能率でギ酸デヒドロ
ゲナーゼを製造する方法の発明をも完成するに至った。
以下、本発明を工程順に説明する。
ギ酸デヒドロゲナーゼを生産させるために培養するシュ
ードモナス・オキザラティクスには制限がなく、どのよ
うな菌株でも使用することができるが、この菌のＮＣ１
８８６４２株は特に好適なものである。
ードモナス・オキザラティクスには制限がなく、どのよ
うな菌株でも使用することができるが、この菌のＮＣ１
８８６４２株は特に好適なものである。
シュードモナス・オキザラティクスを培養して菌体内に
ギ酸デヒドロゲナーゼを生産させる方法は、たとえばＭ
ｅＬｂｏｄｓｏｆ Ｅｎｚｙ＋ｎａｔｉｃ Ａｎａｌｙ
ｓｉｓ＋ ３＋ １５５１ （１９７０）に記載されて
いて公知であり、本発明の製法におけるシュードモナス
・オキザラティクスの培養も、基本的には、ギ酸、ピル
ビン酸、シュウ酸等を炭素源とするこれらの公知培養法
に準して行うことができる。特に好ましい培養法は、ほ
かに上記カザミノ酸を添加した培地を用いる方法である
が、ここで用いるカザミノ酸は、Ｄｉｆｃｏ社から市販
されている周知のカゼイン加水分解物であって“Ｖ ｉ
ｔａｍｉｎ Ｆ ｒｅｅ”と呼ばれる規格のもの（以下
、特に断わらない限り、１カザミノ酸」というときはこ
の規格のものを意味する）である。カザミノ酸でも“’
Ｖ ｉＬａｍｉｎ Ｆｒｅｅ”でないものは、理由は定
がでないが、添加してもほとんど効果がない。標準的な
培地組成および培養条件は次のとおりである。
ギ酸デヒドロゲナーゼを生産させる方法は、たとえばＭ
ｅＬｂｏｄｓｏｆ Ｅｎｚｙ＋ｎａｔｉｃ Ａｎａｌｙ
ｓｉｓ＋ ３＋ １５５１ （１９７０）に記載されて
いて公知であり、本発明の製法におけるシュードモナス
・オキザラティクスの培養も、基本的には、ギ酸、ピル
ビン酸、シュウ酸等を炭素源とするこれらの公知培養法
に準して行うことができる。特に好ましい培養法は、ほ
かに上記カザミノ酸を添加した培地を用いる方法である
が、ここで用いるカザミノ酸は、Ｄｉｆｃｏ社から市販
されている周知のカゼイン加水分解物であって“Ｖ ｉ
ｔａｍｉｎ Ｆ ｒｅｅ”と呼ばれる規格のもの（以下
、特に断わらない限り、１カザミノ酸」というときはこ
の規格のものを意味する）である。カザミノ酸でも“’
Ｖ ｉＬａｍｉｎ Ｆｒｅｅ”でないものは、理由は定
がでないが、添加してもほとんど効果がない。標準的な
培地組成および培養条件は次のとおりである。
培地組成例
カザミノ酸（Ｖｉｔａｍｉｎ Ｆｒｅｅ） ３ ｇＭ
ｇ Ｓ Ｏ＋・７８２０ ０ 、２ ｇＣａＣ１２・２
Ｈ２Ｏ１Ｉｎｇ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２０５ｍｇ ＭｎＳＯ４・５Ｈ２０２，５■ Ｎａ２ＭｏＣＬ Ｈ２Ｈ２Ｏ２，５ｍＢＫ ２ ＨＰ
Ｏ＊ ８ 、７ ｇ ＮＩＩＨ２Ｐ○、・２Ｈ２０７，８ｇ （Ｎｌ−１，）２Ｓｏ、 ２．５ ｇ シュウ酸二ナトリウム ６．７ｇ 水 １ｅ （１＋８７．５） 培養条件 温度約３０℃で約４０〜４８時間、通気しながら培養を
行う。培養中、シュウ酸が消費されてｐＨが上昇し、放
置すると増殖可能なｒ＋Ｈをこえるので、ＩＩＨが約８
．０以下に保たれるようにシュウ酸溶液を添加するｐＨ
制御培養を行う。
ｇ Ｓ Ｏ＋・７８２０ ０ 、２ ｇＣａＣ１２・２
Ｈ２Ｏ１Ｉｎｇ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２０５ｍｇ ＭｎＳＯ４・５Ｈ２０２，５■ Ｎａ２ＭｏＣＬ Ｈ２Ｈ２Ｏ２，５ｍＢＫ ２ ＨＰ
Ｏ＊ ８ 、７ ｇ ＮＩＩＨ２Ｐ○、・２Ｈ２０７，８ｇ （Ｎｌ−１，）２Ｓｏ、 ２．５ ｇ シュウ酸二ナトリウム ６．７ｇ 水 １ｅ （１＋８７．５） 培養条件 温度約３０℃で約４０〜４８時間、通気しながら培養を
行う。培養中、シュウ酸が消費されてｐＨが上昇し、放
置すると増殖可能なｒ＋Ｈをこえるので、ＩＩＨが約８
．０以下に保たれるようにシュウ酸溶液を添加するｐＨ
制御培養を行う。
培養が終った後は常法により培養液から菌体を分取し、
適当な培地または緩衝液（例えばｐＨ６，５〜７．０の
リン酸緩衝液）で洗浄する。この後、任意の方法で菌体
からギ酸デヒドロゲナーゼを抽出し、かつ抽出された酵
素を精製するが、本発明の製法においては、抽出の開始
から精製の終了まで、好ましくはこれらの工程のあらゆ
る段階に、Ｌ−システィン、ＮＡＤ、第一鉄イオン、ま
たはこれらの２種以上の混合物を酵素と共存させて酵素
の失活を防ぐ。用いるし一システィンとしては、Ｌ−シ
スティン塩酸塩が適当であり、また第一鉄化合物として
は、硫酸第一鉄、塩化第一鉄などが適当である。
適当な培地または緩衝液（例えばｐＨ６，５〜７．０の
リン酸緩衝液）で洗浄する。この後、任意の方法で菌体
からギ酸デヒドロゲナーゼを抽出し、かつ抽出された酵
素を精製するが、本発明の製法においては、抽出の開始
から精製の終了まで、好ましくはこれらの工程のあらゆ
る段階に、Ｌ−システィン、ＮＡＤ、第一鉄イオン、ま
たはこれらの２種以上の混合物を酵素と共存させて酵素
の失活を防ぐ。用いるし一システィンとしては、Ｌ−シ
スティン塩酸塩が適当であり、また第一鉄化合物として
は、硫酸第一鉄、塩化第一鉄などが適当である。
これらの失活防止剤は、抽出処理液または精製処理液に
、下記範囲の濃度で存在させることが望ましい。
、下記範囲の濃度で存在させることが望ましい。
Ｌ−システィン： ２０２０−１Ｏ０１０またはそれ以
」二）ＮＡＤ ： ０．０５−１０＋ｎＭ （またはそ
れ以上）第一鉄イオン：０．０１〜０．３珀Ｎ１なお、
空気中の酸素により失活し易い酵素の安定化にクルタチ
オン、２−メルカプトエタノール、２，３−ン′メルカ
プト−１−プロパ７ール、ジチオスレイトール等、一部
のＳ ｌ−１化合物が有効なことがあることは公知であ
るが、ギ酸デヒドロゲナーゼに対しては、これらのＳＨ
化合物はまったく効果がないか、かえって有害である。
」二）ＮＡＤ ： ０．０５−１０＋ｎＭ （またはそ
れ以上）第一鉄イオン：０．０１〜０．３珀Ｎ１なお、
空気中の酸素により失活し易い酵素の安定化にクルタチ
オン、２−メルカプトエタノール、２，３−ン′メルカ
プト−１−プロパ７ール、ジチオスレイトール等、一部
のＳ ｌ−１化合物が有効なことがあることは公知であ
るが、ギ酸デヒドロゲナーゼに対しては、これらのＳＨ
化合物はまったく効果がないか、かえって有害である。
次に標準的な抽出・精製の方法を説明する。
まず菌体を、１＋）１６〜７の適当な緩衝液に懸濁させ
る。なお４１衝液にはＬ−システィン、ＮＡＤ、および
第一鉄イオン等の失活防止剤を、濃度がそれぞれ上記好
適範囲になるよう添加しておく。次いで懸濁液を好まし
くは約１０’Ｃ以下に冷却した状態で、かつ嫌気的条件
下に、超音波処理等の方法により菌体を破砕し、遠心分
離して粗抽出液を得る。粗抽出液は硫酸プロタミンで処
理し、生じた沈殿物を遠心分離して除く。」二基を硫安
塩析し、３０％飽和から４０％飽和の間の沈殿画分を取
り、直ちに酵素抽出に用いたのと同様の、失活防止剤を
含有する緩衝液に溶解する。得られた溶液を分画分子量
が１．３．００９〜５００００程度の限外濾過膜を用い
て限外濾過することにより脱塩し、酵素を残液中に濃縮
する。得られた濃縮液中の酵素を、失活防止剤の共存下
、更にハイドロキシアパタイトを用いるカラムクロマト
グラフィー法等により精製すると、精製ギ酸デヒドロゲ
ナーゼが得られる。精製酵素は凍結＊’ｔ、燥して粉末
化し、使用に供する。
る。なお４１衝液にはＬ−システィン、ＮＡＤ、および
第一鉄イオン等の失活防止剤を、濃度がそれぞれ上記好
適範囲になるよう添加しておく。次いで懸濁液を好まし
くは約１０’Ｃ以下に冷却した状態で、かつ嫌気的条件
下に、超音波処理等の方法により菌体を破砕し、遠心分
離して粗抽出液を得る。粗抽出液は硫酸プロタミンで処
理し、生じた沈殿物を遠心分離して除く。」二基を硫安
塩析し、３０％飽和から４０％飽和の間の沈殿画分を取
り、直ちに酵素抽出に用いたのと同様の、失活防止剤を
含有する緩衝液に溶解する。得られた溶液を分画分子量
が１．３．００９〜５００００程度の限外濾過膜を用い
て限外濾過することにより脱塩し、酵素を残液中に濃縮
する。得られた濃縮液中の酵素を、失活防止剤の共存下
、更にハイドロキシアパタイトを用いるカラムクロマト
グラフィー法等により精製すると、精製ギ酸デヒドロゲ
ナーゼが得られる。精製酵素は凍結＊’ｔ、燥して粉末
化し、使用に供する。
なお失活防止剤は、精製された酵素の安定化にももちろ
ん有効であるから、最終的な精製品がら除去しておく必
要はなく、むしろ積極的に再添加して、酵素製剤として
の安定性を向」二させることが望ましい。
ん有効であるから、最終的な精製品がら除去しておく必
要はなく、むしろ積極的に再添加して、酵素製剤として
の安定性を向」二させることが望ましい。
本発明の製法は、上述のような失活防止剤の存在下に酵
素の抽出と精製を行うことによりシュードモナス・オキ
ザラティクスが生産したギ酸デヒドロゲナーゼをきわめ
て高い収率で抽出し精製するものであり、しかも得られ
る精製酵素は安定性のすぐれｔこものであるから、保存
性のよいギ酸デヒドロゲナーゼを安価に製造することの
できるきわめて有利な方法である。
素の抽出と精製を行うことによりシュードモナス・オキ
ザラティクスが生産したギ酸デヒドロゲナーゼをきわめ
て高い収率で抽出し精製するものであり、しかも得られ
る精製酵素は安定性のすぐれｔこものであるから、保存
性のよいギ酸デヒドロゲナーゼを安価に製造することの
できるきわめて有利な方法である。
以下、実施例および参考例により本発明を説明する。
実施例 １
さきに例示した組成の半合成培地２０Ｃを１２０’Ｃに
１５分間加熱して滅菌後、空気を２０ Ｃ／ｌｌ１ｎの
割合で吹込みながら、３０℃まで冷却した。これにシュ
ードモナス・オキサラティクスＮＣＩＢ８Ｇ−１２株の
前培養液６００ｍ１を接種し、同様の通気下で、飽和シ
ュウ酸溶液添加による１〕ｌ］制御培養（制御ｐＨ８，
０）を４０時間行なった。培養終了後、培養液を遠心分
離して、含水菌体１３ （ｌ ｇを相な。この菌体を３
回洗浄し、その４０ｇをとり、Ｌ−システィン塩酸塩（
濃度３０＋ｎＭ）、ＮＡＤ （濃度１ｍＭ）およびＦｅ
５Ｏ−＜ＩＲ度０．１＋ｎＭ）を含む０．１Ｍリン酸カ
リウム緩衝液（Ｉ＋８６．５）２５０ｍｌに懸濁させ、
懸濁液に高純度窒素ガスを吹込んて溶存酸素を除去した
。この後、同し窒素ガスを噴射しながら、１０℃以下で
、超音波処理（２０にＩｌｚ、 ２分間）による菌体破
砕を行なった。処理後の液を遠心分離すると、抽出され
たギ酸デヒドロゲナーゼを含む上清２５７ｍ１が得られ
た。これに約５℃で３．８％プロタミン硫酸４ｍｌを撹
拌しながら加え、生じた沈殿物を遠心分離して上清２５
０ｍ１を得た。この上清に硫安４０．５ｇを攪拌しなが
ら加え、生じた沈殿を遠心分離により除いたのち再び硫
安１５．１ｇを撹拌しながら加えて、析出した沈殿を採
取した。得られた塩析画分は、直ちにさきの抽出処理に
用いたものと同し組成の失活防止剤を含有するｐＨ６，
５の０．０２Ｍリン酸カリウム緩衝液１０＋ｎｌに溶解
し、分画分子量、１３．０００の膜を用いて限外濾過す
ることにより脱塩しｔこ。濾過後の残液４．３ｍｌをハ
イドロキシアパタイトカラム（Ｂｉｏ−Ｇｅｌ ＨＴ：
２．７ｃｍφＸ ８．５ ａｍ）に通して酵素を吸着
させ、その後、さきの抽出処理に用いたものと同し組成
の失活防止剤を含有するｐＨ６，５の０．０７Ｍリン酸
カリウム緩衝液で溶出処理を行なった。得られた溶出液
の濃縮液６１１１を１ｍｌずつアンプルに分注し、凍結
乾燥して、精製ギ酸デヒドロゲナーゼ粉末３７２ｍｇ（
比活性１．２７単位／ ｍｇＰｒｏＬｅｉｎ）を得た。
１５分間加熱して滅菌後、空気を２０ Ｃ／ｌｌ１ｎの
割合で吹込みながら、３０℃まで冷却した。これにシュ
ードモナス・オキサラティクスＮＣＩＢ８Ｇ−１２株の
前培養液６００ｍ１を接種し、同様の通気下で、飽和シ
ュウ酸溶液添加による１〕ｌ］制御培養（制御ｐＨ８，
０）を４０時間行なった。培養終了後、培養液を遠心分
離して、含水菌体１３ （ｌ ｇを相な。この菌体を３
回洗浄し、その４０ｇをとり、Ｌ−システィン塩酸塩（
濃度３０＋ｎＭ）、ＮＡＤ （濃度１ｍＭ）およびＦｅ
５Ｏ−＜ＩＲ度０．１＋ｎＭ）を含む０．１Ｍリン酸カ
リウム緩衝液（Ｉ＋８６．５）２５０ｍｌに懸濁させ、
懸濁液に高純度窒素ガスを吹込んて溶存酸素を除去した
。この後、同し窒素ガスを噴射しながら、１０℃以下で
、超音波処理（２０にＩｌｚ、 ２分間）による菌体破
砕を行なった。処理後の液を遠心分離すると、抽出され
たギ酸デヒドロゲナーゼを含む上清２５７ｍ１が得られ
た。これに約５℃で３．８％プロタミン硫酸４ｍｌを撹
拌しながら加え、生じた沈殿物を遠心分離して上清２５
０ｍ１を得た。この上清に硫安４０．５ｇを攪拌しなが
ら加え、生じた沈殿を遠心分離により除いたのち再び硫
安１５．１ｇを撹拌しながら加えて、析出した沈殿を採
取した。得られた塩析画分は、直ちにさきの抽出処理に
用いたものと同し組成の失活防止剤を含有するｐＨ６，
５の０．０２Ｍリン酸カリウム緩衝液１０＋ｎｌに溶解
し、分画分子量、１３．０００の膜を用いて限外濾過す
ることにより脱塩しｔこ。濾過後の残液４．３ｍｌをハ
イドロキシアパタイトカラム（Ｂｉｏ−Ｇｅｌ ＨＴ：
２．７ｃｍφＸ ８．５ ａｍ）に通して酵素を吸着
させ、その後、さきの抽出処理に用いたものと同し組成
の失活防止剤を含有するｐＨ６，５の０．０７Ｍリン酸
カリウム緩衝液で溶出処理を行なった。得られた溶出液
の濃縮液６１１１を１ｍｌずつアンプルに分注し、凍結
乾燥して、精製ギ酸デヒドロゲナーゼ粉末３７２ｍｇ（
比活性１．２７単位／ ｍｇＰｒｏＬｅｉｎ）を得た。
この製品を一２０°Ｃのフリーザー中で保存し、６力月
後に活性を調べたが、保存による活性の１氏下はほとん
ど認められなかった。
後に活性を調べたが、保存による活性の１氏下はほとん
ど認められなかった。
上記抽出と精製による酵素活性の推移および精製の各段
階における酵素活性の回収率（粗抽出液の全活性を基準
とする）を表１に示す。
階における酵素活性の回収率（粗抽出液の全活性を基準
とする）を表１に示す。
表 １
活 性 比活性 活性回収率
（単位／ｍ１）（単位／ｍｇｒ’ｒ＞ （％）粗抽出液
３，７４ １）、（＋７ −硫酸プロタミン処理後
３ 、５５ （’、１ 、０８ ９５硫安塩析画分溶液
２０．１ ０．２５ ４６限外濾過後 ８６．４ ｆ
、１．２５ ４５Ｂｉｏ−Ｇｅｌカラム溶出液 ７０．
７ １．２７ ４５比較のため、失活防止剤を使用せず
に」二記と同様の酵素抽出処理を行なったところ、酵素
活性は硫酸プロタミン処理を終わった段階で０．３７単
位／＋ｎｌＬかなかった。
３，７４ １）、（＋７ −硫酸プロタミン処理後
３ 、５５ （’、１ 、０８ ９５硫安塩析画分溶液
２０．１ ０．２５ ４６限外濾過後 ８６．４ ｆ
、１．２５ ４５Ｂｉｏ−Ｇｅｌカラム溶出液 ７０．
７ １．２７ ４５比較のため、失活防止剤を使用せず
に」二記と同様の酵素抽出処理を行なったところ、酵素
活性は硫酸プロタミン処理を終わった段階で０．３７単
位／＋ｎｌＬかなかった。
参考例
精製ギ酸デヒドロゲナーゼの安定性も二対する種／Ｚの
物質の影響を下記の方法で調べた。その結果を表２〜表
５に示す。
物質の影響を下記の方法で調べた。その結果を表２〜表
５に示す。
試験方法
ギ酸デヒドロゲナーゼ：実施例１で製造した酵素を限外
濾過により精製したもの。
濾過により精製したもの。
保存条件二上記酵素溶液の一定量をとり、密栓して５℃
にて静置保存する。
にて静置保存する。
結果の表示：保存試験開始時の酵素活性を１００とした
場合の残存活性を表示する。
場合の残存活性を表示する。
表 ２ ギ酸デヒドロゲナーゼの安定性に及ぼすし一シ
スティンの影響 １−システィン濃度 残存酵素活性 （＋ｎＭ ） １日後 ５日後 ０ ３２ ０ １、０ ３９ １９ ２ ＋） ７６ ２７ ３０ ９２ ３５ ５０ ９３ ３９ １００ ９６ ４２ 表 ３ ギ酸デヒドロゲナーゼの安定性に及ぼすＮＡＤ
の影響 ＮＡＤ濃度 残存酵素活性 ｂｎＭ ） ２日後 ４日後 ０ ６９ ３７ ０．０５ ７ ５２ ０．１ ８３ ６６ １ ８７ ７５ １０ ９０ ７８ 表 ４ ギ酸デヒドロゲナーゼの安定性に及ぼす第一鉄
イオンの影響 Ｆｅ５Ｏ＝濃度 残存酵素活性 （＋ｎＭ ） ２日後 ４日後 １） ６９ ３７ ０．０１ ７５ ４８ ０．０５ ７り ５２ ０．１ ８０ ５９ ０．３ ７３ ４７ 表 ５ ギ酸デヒドロゲナーゼの 種々の還元剤の影響 還元剤 月 無添加 ３ ２−メルカプトエタノール ２ ２．３−ジメルカプト−１−プロパツール １ジチオス
レイトール １ グルタチオン（還元形） ３ 注：還元剤の濃度はいずれも１０１１ 安定性に及ぼす 残存酵素活性 １采旦薄ｊ旦猜 ３ ２５ ９ ７ ２２ １１ ５ １１ ４ ９ １５ ５ ０ ２３ １０
スティンの影響 １−システィン濃度 残存酵素活性 （＋ｎＭ ） １日後 ５日後 ０ ３２ ０ １、０ ３９ １９ ２ ＋） ７６ ２７ ３０ ９２ ３５ ５０ ９３ ３９ １００ ９６ ４２ 表 ３ ギ酸デヒドロゲナーゼの安定性に及ぼすＮＡＤ
の影響 ＮＡＤ濃度 残存酵素活性 ｂｎＭ ） ２日後 ４日後 ０ ６９ ３７ ０．０５ ７ ５２ ０．１ ８３ ６６ １ ８７ ７５ １０ ９０ ７８ 表 ４ ギ酸デヒドロゲナーゼの安定性に及ぼす第一鉄
イオンの影響 Ｆｅ５Ｏ＝濃度 残存酵素活性 （＋ｎＭ ） ２日後 ４日後 １） ６９ ３７ ０．０１ ７５ ４８ ０．０５ ７り ５２ ０．１ ８０ ５９ ０．３ ７３ ４７ 表 ５ ギ酸デヒドロゲナーゼの 種々の還元剤の影響 還元剤 月 無添加 ３ ２−メルカプトエタノール ２ ２．３−ジメルカプト−１−プロパツール １ジチオス
レイトール １ グルタチオン（還元形） ３ 注：還元剤の濃度はいずれも１０１１ 安定性に及ぼす 残存酵素活性 １采旦薄ｊ旦猜 ３ ２５ ９ ７ ２２ １１ ５ １１ ４ ９ １５ ５ ０ ２３ １０
Claims (2)
- （１）シュードモナス・オキザラティクス（Ｐｓｅｕｄ
ｏ＋ｎｏｎａｓ ｏｘａ−１ａｔｉｃｕｓ）を培養して
その菌体内にギ酸デヒドロゲナーゼを生産させ、生産さ
れたギ酸デヒドロゲナーゼを、Ｌ−システィン、ニコチ
ン酸アミドアデニンジヌクレオチド、第一鉄イオン、ま
たはこれらの２種以上の混合物の存在下に抽出し且つ精
製することを特徴とするギ酸デヒドロゲナーゼの製造法
。 - （２）ビタミンを含まないカザミノ酸を添加した培地を
用いてシュードモナス・オキザラティクスの培養を行う
特許請求の範囲第１項記載の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58118161A JPS6012974A (ja) | 1983-07-01 | 1983-07-01 | ギ酸デヒドロゲナ−ゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58118161A JPS6012974A (ja) | 1983-07-01 | 1983-07-01 | ギ酸デヒドロゲナ−ゼの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6012974A true JPS6012974A (ja) | 1985-01-23 |
Family
ID=14729608
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58118161A Pending JPS6012974A (ja) | 1983-07-01 | 1983-07-01 | ギ酸デヒドロゲナ−ゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6012974A (ja) |
-
1983
- 1983-07-01 JP JP58118161A patent/JPS6012974A/ja active Pending
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