JPS5999258A - 抗免疫複合体抗体の製造方法 - Google Patents
抗免疫複合体抗体の製造方法Info
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- JPS5999258A JPS5999258A JP20765882A JP20765882A JPS5999258A JP S5999258 A JPS5999258 A JP S5999258A JP 20765882 A JP20765882 A JP 20765882A JP 20765882 A JP20765882 A JP 20765882A JP S5999258 A JPS5999258 A JP S5999258A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
うる新規抗体の製造方法に関するものである。
免疫複合体は抗原、抗体及び補体が結合したものであり
、通常は形成されても白血球やマクロファージに取り込
まれて無害化される。しかしながら、抗原が多量に存在
する場合とか抗体が形成されにくい抗原が体内にある場
合には免疫複合体の量が増して、急性の糸球体腎炎とか
血管炎、慢性じん麻疹、血小板減少症など種々の疾患を
ひき起すＯ そこで、この免疫複合体の検出方法が切望され、補体成
分やリューマチファクターが免疫複合体と反応する性質
を利用する方法、細胞の生物活性、特にＦｃレセプター
と免疫複合体が結合する性質を利用する方法、ケ゛ル濾
過法、蔗糖密度勾配法、ポリエチレングリコール沈澱法
などの物理化学的方法など数多くの方法が開発されてき
た。しかしながら、補体成分、リューマチファクターや
Ｆｃレセプターを使用する方法はいずれも凝集ＩｇＧｉ
検出し免疫複合体との識別ができないという重大な欠陥
があシ、物理化学的方法も操作が煩雑であるにもかかわ
らず識別性が充分でないという欠点があった。
、通常は形成されても白血球やマクロファージに取り込
まれて無害化される。しかしながら、抗原が多量に存在
する場合とか抗体が形成されにくい抗原が体内にある場
合には免疫複合体の量が増して、急性の糸球体腎炎とか
血管炎、慢性じん麻疹、血小板減少症など種々の疾患を
ひき起すＯ そこで、この免疫複合体の検出方法が切望され、補体成
分やリューマチファクターが免疫複合体と反応する性質
を利用する方法、細胞の生物活性、特にＦｃレセプター
と免疫複合体が結合する性質を利用する方法、ケ゛ル濾
過法、蔗糖密度勾配法、ポリエチレングリコール沈澱法
などの物理化学的方法など数多くの方法が開発されてき
た。しかしながら、補体成分、リューマチファクターや
Ｆｃレセプターを使用する方法はいずれも凝集ＩｇＧｉ
検出し免疫複合体との識別ができないという重大な欠陥
があシ、物理化学的方法も操作が煩雑であるにもかかわ
らず識別性が充分でないという欠点があった。
一方、最近加納らによって、抗原に抗体が結合すること
によって生ずるＦａｂフラグメントの林造変化を認識す
る接抗体を用いて免疫複合体を検出する方法が開発され
た。この方法は３凝集価の接抗体と抗Ｄ抗体感作血球と
の凝集反応を被検血清中の免疫複合体が抑制することを
利用しており、操作が簡便で凝集ＩｇＧを検出せず免疫
複合体を特易的に検出するすぐれた方法であるが、接抗
体の入手が容易でないという欠点があった。
によって生ずるＦａｂフラグメントの林造変化を認識す
る接抗体を用いて免疫複合体を検出する方法が開発され
た。この方法は３凝集価の接抗体と抗Ｄ抗体感作血球と
の凝集反応を被検血清中の免疫複合体が抑制することを
利用しており、操作が簡便で凝集ＩｇＧを検出せず免疫
複合体を特易的に検出するすぐれた方法であるが、接抗
体の入手が容易でないという欠点があった。
本発明者らは、加納らの方法において用いられている抗
体のかわりに、ヒト抗体を分解して得られだＦ （ａ
ｂ’） ２フラグメントヲ用いて抗原と複合体を形成さ
せ、さらにこの複合体を抗原として新規な抗体を形成さ
せ、この抗体が免疫複合体のみ全特異的に検出しうろこ
とを見出してその内容を特許用＆（特願昭５７−５８２
７４号）した。しかしながら、この方法においてもヒト
血液中の免疫複合体を検出する場合には特定の抗体を含
有しているヒト血清を原料とする必要があって入手に制
限があった。そこで、本発明者らはさらに研究を進めた
結果、ヒト免疫グロブリンのＦ （ａ ｂ’） ２フラ
グメントの凝集物を抗原に用いることによって先願と同
じ機能を有する抗免疫複合体抗体が得られることを見出
し、この方法によれば抗免疫複合体抗体をいつでも容易
に製造しうろことを見出してこれに基いて本発明を完成
するに至った。
体のかわりに、ヒト抗体を分解して得られだＦ （ａ
ｂ’） ２フラグメントヲ用いて抗原と複合体を形成さ
せ、さらにこの複合体を抗原として新規な抗体を形成さ
せ、この抗体が免疫複合体のみ全特異的に検出しうろこ
とを見出してその内容を特許用＆（特願昭５７−５８２
７４号）した。しかしながら、この方法においてもヒト
血液中の免疫複合体を検出する場合には特定の抗体を含
有しているヒト血清を原料とする必要があって入手に制
限があった。そこで、本発明者らはさらに研究を進めた
結果、ヒト免疫グロブリンのＦ （ａ ｂ’） ２フラ
グメントの凝集物を抗原に用いることによって先願と同
じ機能を有する抗免疫複合体抗体が得られることを見出
し、この方法によれば抗免疫複合体抗体をいつでも容易
に製造しうろことを見出してこれに基いて本発明を完成
するに至った。
すなわち本発明は、ヒト免疫グロブリンのＦ （ａ ｂ
’） ２フラグメントの凝集物を抗原として対応する抗
体を産生せしめてこれを採取することを特徴とする抗免
疫複合体抗体の製造方法に関するものである。
’） ２フラグメントの凝集物を抗原として対応する抗
体を産生せしめてこれを採取することを特徴とする抗免
疫複合体抗体の製造方法に関するものである。
ヒト免疫グロブリンの種類は特に限定されるものではな
く、ＩｇＧのほかＩｇＭ ＸＩｇＡ 、 ＩｇＥ及び
ｒｇＤ−ｉ含む。このヒト免疫グロブリンは不純の１ま
であってもよいが、部製してから用いるのがよい。精製
は公知の方法で行なえはよく、コーンらのエタノール分
画法、硫安リパノール分画法、ポリエチレングリコール
分画法、ＤＥＡＥセルロースを用いたイオン交換クロマ
トグラフィーなどいずれの方法で行なってもよい。
く、ＩｇＧのほかＩｇＭ ＸＩｇＡ 、 ＩｇＥ及び
ｒｇＤ−ｉ含む。このヒト免疫グロブリンは不純の１ま
であってもよいが、部製してから用いるのがよい。精製
は公知の方法で行なえはよく、コーンらのエタノール分
画法、硫安リパノール分画法、ポリエチレングリコール
分画法、ＤＥＡＥセルロースを用いたイオン交換クロマ
トグラフィーなどいずれの方法で行なってもよい。
ヒト免疫グロブリンからＦ （ａ ｂ’） ２ノラグメ
ントを製造する方法は公知の方法を用いればよく、通常
はヒト免疫グロブリンにペプシン全作用させる。
ントを製造する方法は公知の方法を用いればよく、通常
はヒト免疫グロブリンにペプシン全作用させる。
被ゾシン分解物はそのま１凝集処理してもよいが、該分
解物からＦ （ａ ｂ’） ２フラグメン）ｋ分解して
から凝集処理するのがよい。分離方法としては、Ｆ （
ａ ｂ’） ２ フラグメントの分子量が原料の免疫
グロブリンの種類を問わず約１０万であるところから蛋
白質を分子量分画する方法によるのがよく、例えばグル
ｐ過法によって分離することができる。
解物からＦ （ａ ｂ’） ２フラグメン）ｋ分解して
から凝集処理するのがよい。分離方法としては、Ｆ （
ａ ｂ’） ２ フラグメントの分子量が原料の免疫
グロブリンの種類を問わず約１０万であるところから蛋
白質を分子量分画する方法によるのがよく、例えばグル
ｐ過法によって分離することができる。
Ｆ （ａ ｂ’） ２フラグメントの凝集は加熱処理、
酸処理、グアニジン塩酸処理、尿素処理などによって行
ないうる。いずれの場合にもＦ （ａ ｂ’） ２フラ
グメントラ生理食塩水、あるいはバッファー含有生理食
塩水に１〜３０ｍｇ／ｍｌ程度になるように加え、加熱
処理の場合には、５５〜７０℃程度に５〜３０分間加熱
すればよい。酸処理の場合には塩酸等の酸ヲ加えてＰＨ
１，５〜３０程度とし１〜１８時間保てばよく、グアニ
ジン塩酸処理の場合にはリン酸バッファーなどでＰＨ６
，０〜８０として、グアニジン塩酸を５〜８Ｍ程度にな
るように添加し、５分間〜１８時間程度保てばよい。
酸処理、グアニジン塩酸処理、尿素処理などによって行
ないうる。いずれの場合にもＦ （ａ ｂ’） ２フラ
グメントラ生理食塩水、あるいはバッファー含有生理食
塩水に１〜３０ｍｇ／ｍｌ程度になるように加え、加熱
処理の場合には、５５〜７０℃程度に５〜３０分間加熱
すればよい。酸処理の場合には塩酸等の酸ヲ加えてＰＨ
１，５〜３０程度とし１〜１８時間保てばよく、グアニ
ジン塩酸処理の場合にはリン酸バッファーなどでＰＨ６
，０〜８０として、グアニジン塩酸を５〜８Ｍ程度にな
るように添加し、５分間〜１８時間程度保てばよい。
こうして得られた凝集物はそのままでも抗原として用い
うるが、グルｐ過等で未凝集のＦ （ａ ｂ’）２フラ
グメントなどを除去し、必要により一旦凍結乾燥してか
ら抗原として使用する。
うるが、グルｐ過等で未凝集のＦ （ａ ｂ’）２フラ
グメントなどを除去し、必要により一旦凍結乾燥してか
ら抗原として使用する。
抗体の産生方法としては生体を利用してもよく、生体外
の細胞培養を利用してもよい。生体を利用（５） する場合には、兎、モルモット、ニワトリなどの温血動
物を広く利用できる。これらの温血動物は予め免疫寛容
性を付与しておくと本発明の抗体の産生率を高めること
ができる。免疫寛容性を付与するには前記抗原の製造に
使用したものと同じＦ （ａ ｂ’）２フラグメントヲ
例えば体重３ ｋｌの兎の場合には１羽あたり１０ｍ９
程度を静脈注射すれば１〜３日後に免疫寛容性が発現す
る。他の動物の場合には、前記の量を基準として体重比
で換算した量を投与すればよい。
の細胞培養を利用してもよい。生体を利用（５） する場合には、兎、モルモット、ニワトリなどの温血動
物を広く利用できる。これらの温血動物は予め免疫寛容
性を付与しておくと本発明の抗体の産生率を高めること
ができる。免疫寛容性を付与するには前記抗原の製造に
使用したものと同じＦ （ａ ｂ’）２フラグメントヲ
例えば体重３ ｋｌの兎の場合には１羽あたり１０ｍ９
程度を静脈注射すれば１〜３日後に免疫寛容性が発現す
る。他の動物の場合には、前記の量を基準として体重比
で換算した量を投与すればよい。
免疫寛容性を付与した生体又はし、なかった生体に前記
の抗原を投与して生体内に本発明の抗体を発現させる。
の抗原を投与して生体内に本発明の抗体を発現させる。
投与方法としては例えば皮下注射すればよく、投与量は
例えば兎の場合には１回あたり０．１〜５ｒｎ９程度を
２日間〜２週間ごとに数回性なう程度でよい。モルモッ
トの場合には１回あたり０．０５〜３ ｍｇ程度、そし
てニワトリの場合には０．１〜１０ｍ９程度を数回投与
すればよい。他の動物の場合には上記の投与量を参考に
して試行錯誤して定めればよい。
例えば兎の場合には１回あたり０．１〜５ｒｎ９程度を
２日間〜２週間ごとに数回性なう程度でよい。モルモッ
トの場合には１回あたり０．０５〜３ ｍｇ程度、そし
てニワトリの場合には０．１〜１０ｍ９程度を数回投与
すればよい。他の動物の場合には上記の投与量を参考に
して試行錯誤して定めればよい。
（６）
一方、本発明の抗体をモノクローナル抗体とし７て側進
する場合には、例えばＢＡＬＣ／Ｃ系のマウス腹腔に５
０〜２００μｍの上記抗原を抄与し、２週間程度経過後
に肺臓を摘出して、この肺臓細胞に例エハマウヌミエロ
ーマをポリエチレングリコールなとを用いて常法により
細胞融合させる。そして、この融合細胞を培養してクロ
ーニングし、本発明の抗体の産生能を有する細胞をイｑ
る。この細胞をマウスの腹腔に注入して腹腔内で増殖さ
せ、腹水を採取すればよい。
する場合には、例えばＢＡＬＣ／Ｃ系のマウス腹腔に５
０〜２００μｍの上記抗原を抄与し、２週間程度経過後
に肺臓を摘出して、この肺臓細胞に例エハマウヌミエロ
ーマをポリエチレングリコールなとを用いて常法により
細胞融合させる。そして、この融合細胞を培養してクロ
ーニングし、本発明の抗体の産生能を有する細胞をイｑ
る。この細胞をマウスの腹腔に注入して腹腔内で増殖さ
せ、腹水を採取すればよい。
血液から本発明の抗体を採取する方法は抗体すなわち免
疫グロブリンを採取する公知の方法に準じて行なえばよ
く、例えば硫安沈澱法、ＤＥＡＥ−セルロースを用いた
イオン交換クロマトグラフィー、グルｐ過法などを適宜
組合わせればよい。コーンらのエタノール分画法、硫安
リハノール分画法、ポリエチレングリコール分画法など
も適用できることはいう丑でもない。これらの精製法に
よって得られた抗体は、さらにこの抗体の製造に用いた
未凝集のＦ （ａ ｂ’） ２フラグメントヲカツプリ
ングした相体ヲ用いてアフィニティークロマトグラフィ
ーで’Ｆ％ａＬ、ｊのＦ （ａ ｂ’） ２フラグメン
トと反応する抗体を除去するととが望ましい。
疫グロブリンを採取する公知の方法に準じて行なえばよ
く、例えば硫安沈澱法、ＤＥＡＥ−セルロースを用いた
イオン交換クロマトグラフィー、グルｐ過法などを適宜
組合わせればよい。コーンらのエタノール分画法、硫安
リハノール分画法、ポリエチレングリコール分画法など
も適用できることはいう丑でもない。これらの精製法に
よって得られた抗体は、さらにこの抗体の製造に用いた
未凝集のＦ （ａ ｂ’） ２フラグメントヲカツプリ
ングした相体ヲ用いてアフィニティークロマトグラフィ
ーで’Ｆ％ａＬ、ｊのＦ （ａ ｂ’） ２フラグメン
トと反応する抗体を除去するととが望ましい。
一方、腹水から採取する場合には、単に硫安塩析後ケ９
ルｐ過を行なうか、あるいは抗マウヌＩｇＧ抗体をカッ
プリングした担体を用いてアフィニティクロマトグラフ
ィーを行なうだけでよく、未凝集のＦ （ａ ｂ’）
２フラグメントヲカツプリングした担体によるアフィニ
ティークロマトグラフィー（・寸不稠である。
ルｐ過を行なうか、あるいは抗マウヌＩｇＧ抗体をカッ
プリングした担体を用いてアフィニティクロマトグラフ
ィーを行なうだけでよく、未凝集のＦ （ａ ｂ’）
２フラグメントヲカツプリングした担体によるアフィニ
ティークロマトグラフィー（・寸不稠である。
後述する実施例１で得られた抗免疫複合体抗体の物性値
を次に示す。
を次に示す。
（１）免疫複合体、凝集ヒトＩｇＧ等に対する反応本発
明の抗体は不活性化した破傷風トキソイドと抗破傷風ト
キソイドヒ） ｒｇＧの免疫複合体と反応し、かつ全身
性エリテマトーデヌ患者血清及び慢性関節リーラマチ患
者血清に含捷れる免疫複合体と反応する。一方、熱凝集
ＴｇＧ及びこの免疫複合体から分離したＩｇＧとは本発
明の抗体は反応しない。尚、これらの測定は後述する実
施例１のＥＬＩＳＡ法と同様にして行なった。
明の抗体は不活性化した破傷風トキソイドと抗破傷風ト
キソイドヒ） ｒｇＧの免疫複合体と反応し、かつ全身
性エリテマトーデヌ患者血清及び慢性関節リーラマチ患
者血清に含捷れる免疫複合体と反応する。一方、熱凝集
ＴｇＧ及びこの免疫複合体から分離したＩｇＧとは本発
明の抗体は反応しない。尚、これらの測定は後述する実
施例１のＥＬＩＳＡ法と同様にして行なった。
才た、破傷風トキソイドと抗破傷風トキソイドヒＭｇＧ
の複合体、破傷風トキソイド、抗破傷風トキソイドヒ１
［εＧ１ ヒトＩｇＧ、凝集ヒトＩｇＧ。
の複合体、破傷風トキソイド、抗破傷風トキソイドヒ１
［εＧ１ ヒトＩｇＧ、凝集ヒトＩｇＧ。
ヒトＦ （ａ ｂ’） ２フラグメント、凝集ヒトＦ
（ａ ｂ’） ２フラグメントについて本発明の抗体と
の反応性を二次元免疫拡散法（オクタログ−法）で測定
したところ、この抗体は前記の複合体及び凝集ヒＦ Ｆ
（ａ ｂ’） ２ノラグメントとの間では沈降線を生
じるが、他のものとは沈降線を形成しなかった。
（ａ ｂ’） ２フラグメントについて本発明の抗体と
の反応性を二次元免疫拡散法（オクタログ−法）で測定
したところ、この抗体は前記の複合体及び凝集ヒＦ Ｆ
（ａ ｂ’） ２ノラグメントとの間では沈降線を生
じるが、他のものとは沈降線を形成しなかった。
（２）分子量
兎及びモルモットの血清から得られたもの１５〜１６万
（ケ゛ル濾過法） 】５万（ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動）ニワトリ
の血清から得られたもの １６〜１８万（ケ゛ルｐ過法） （３）沈降定数 兎及びモルモットの血清から得られたもの６５（高速平
衡法） ニワトリの血清から得られたもの ７１（高速平衡法） （９） （４）糖含１゜ 兎及びモルモットの血清から得られたもの２〜４係（フ
ェノール硫酸法） ニワ） ＩＪの血清から得られたもの ３５〜４．５ｑＡ（フェ／・−ル硫酸法）以上の物性値
はいずれも先願（特願昭５７−５８２７４号）の抗免疫
師合体抗体のそれらと同一であり、特に（１）項の反応
性が同一であるところから本発明の抗免疫複合体抗体は
先願のものと同一であると判断するに至った。
（ケ゛ル濾過法） 】５万（ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動）ニワトリ
の血清から得られたもの １６〜１８万（ケ゛ルｐ過法） （３）沈降定数 兎及びモルモットの血清から得られたもの６５（高速平
衡法） ニワトリの血清から得られたもの ７１（高速平衡法） （９） （４）糖含１゜ 兎及びモルモットの血清から得られたもの２〜４係（フ
ェノール硫酸法） ニワ） ＩＪの血清から得られたもの ３５〜４．５ｑＡ（フェ／・−ル硫酸法）以上の物性値
はいずれも先願（特願昭５７−５８２７４号）の抗免疫
師合体抗体のそれらと同一であり、特に（１）項の反応
性が同一であるところから本発明の抗免疫複合体抗体は
先願のものと同一であると判断するに至った。
この抗体は、凝集１ｇＧとはほとんど反応せず免疫複合
体と特異的に反応するところから、加納らの方法（ＣＩ
１ｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｒｌ Ｉ
ｒｒｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ＋ｖｏｌ、９．ｐｐ４
２５−４３５ （１９７８） ’）において用いられて
いる抗抗体に代替しうるものである。そして、この加納
らの方法が、人体を媒介して生産される抗抗体を利用し
ているために実用化されなかったところを、本発明者ら
は新規な抗体を開発することによって打破したものであ
る。すなわち、本発明の抗体は人体によらず他の動物を
用いある（１０） いはモノクロナール抗体として量産しうるとこイ）に特
徴があり、この抗体によって免疫複合体の正確な定＃全
実用的に行ないうる手段を提供し、従来、原因究明が容
易でなかった免疫複合体に基づく各錘の疾患の治療を容
易にすることができた。
体と特異的に反応するところから、加納らの方法（ＣＩ
１ｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｒｌ Ｉ
ｒｒｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ＋ｖｏｌ、９．ｐｐ４
２５−４３５ （１９７８） ’）において用いられて
いる抗抗体に代替しうるものである。そして、この加納
らの方法が、人体を媒介して生産される抗抗体を利用し
ているために実用化されなかったところを、本発明者ら
は新規な抗体を開発することによって打破したものであ
る。すなわち、本発明の抗体は人体によらず他の動物を
用いある（１０） いはモノクロナール抗体として量産しうるとこイ）に特
徴があり、この抗体によって免疫複合体の正確な定＃全
実用的に行ないうる手段を提供し、従来、原因究明が容
易でなかった免疫複合体に基づく各錘の疾患の治療を容
易にすることができた。
本発明の抗体は各種の免疫複合体と巾広く反応１−１、
ひとつの抗体で免疫複合体の種類を問わす４１１］定で
きるものであり、本発明の方法はこのような抗体を例え
ば輸血用ヒト血液の廃血からいつでも容易に製造しうる
ところに特徴がある。
ひとつの抗体で免疫複合体の種類を問わす４１１］定で
きるものであり、本発明の方法はこのような抗体を例え
ば輸血用ヒト血液の廃血からいつでも容易に製造しうる
ところに特徴がある。
本発明の抗体の用途は加納法の抗抗体の代替にのみ留捷
るものではなく、酵素免疫測定法による免疫複合体の検
出を行なうこともできる。
るものではなく、酵素免疫測定法による免疫複合体の検
出を行なうこともできる。
以下、実施例を示す。
実施例１
保存ヒト血液より分離した血清を常法に従って硫安塩析
し、さらにＤＥＡＥセルロー、ス、１オン交換クロマト
グラフィーで分画してＩｇＧ画分を得た。
し、さらにＤＥＡＥセルロー、ス、１オン交換クロマト
グラフィーで分画してＩｇＧ画分を得た。
このヒトＩｇＧ ］、 ０００ ｍ９ｆ ｐ［−１４，
５の０．０１ Ｍホウ酸緩衡液２００ｍ１に加えて溶液
とし、この溶液に被プシンｌ Ｑ 〃Ｉ９を加えて３７
℃で１８時間攪拌した。このぜプシン分解液をセファデ
ック、ｚＱ −２０Ｑ （ファルマシア社製）でケ９ル
濾過し、流出液の２８０ ｎｍにおける吸光度を測定し
て第２番目のピークの区分を集め、さらにプロティンＡ
をカップリングしたセファロ−７４Ｂ（ファルマシア社
製）で僅かに混在する未反応のｒｇＧ及びＦｃフラグメ
ントを除去し、素通液を凍結乾燥してＦ （ａ ｂ’）
２ニノラグメント”ＯＯｍｔ２ｒ、得た。
５の０．０１ Ｍホウ酸緩衡液２００ｍ１に加えて溶液
とし、この溶液に被プシンｌ Ｑ 〃Ｉ９を加えて３７
℃で１８時間攪拌した。このぜプシン分解液をセファデ
ック、ｚＱ −２０Ｑ （ファルマシア社製）でケ９ル
濾過し、流出液の２８０ ｎｍにおける吸光度を測定し
て第２番目のピークの区分を集め、さらにプロティンＡ
をカップリングしたセファロ−７４Ｂ（ファルマシア社
製）で僅かに混在する未反応のｒｇＧ及びＦｃフラグメ
ントを除去し、素通液を凍結乾燥してＦ （ａ ｂ’）
２ニノラグメント”ＯＯｍｔ２ｒ、得た。
Ｆ （ａ ｂ’） ２フラグメント５０ｍりを生理食塩
水に溶解して１０ｍｙ／ｍｌの溶液とし、６５℃で５分
間加熱後急冷した。この加熱処ＦＩＩ液を凍結乾燥して
抗原として用いた。
水に溶解して１０ｍｙ／ｍｌの溶液とし、６５℃で５分
間加熱後急冷した。この加熱処ＦＩＩ液を凍結乾燥して
抗原として用いた。
３ ｋｙの兎１０羽の耳静脈に前記の未加熱のＦ（ａｈ
’）２ノラグメント生理食塩水溶液を１羽あたり１ ｍ
ｌ宛投与した。３日後に、前記抗原の４ ｍ９ ／ ｍ
ｌ生理食塩水溶液に等量の７０インドの完全アジ−パン
トを加えて乳什シフ／ζ液を前肢と後肢の皮肉及び大腿
筋肉に１毛あたり１回０．５ ｍｌ ｆ隔週ごとに３回
投与した。第３回の投与１週間後に頚動脈より全採血し
た。
’）２ノラグメント生理食塩水溶液を１羽あたり１ ｍ
ｌ宛投与した。３日後に、前記抗原の４ ｍ９ ／ ｍ
ｌ生理食塩水溶液に等量の７０インドの完全アジ−パン
トを加えて乳什シフ／ζ液を前肢と後肢の皮肉及び大腿
筋肉に１毛あたり１回０．５ ｍｌ ｆ隔週ごとに３回
投与した。第３回の投与１週間後に頚動脈より全採血し
た。
得られた血液から５００ ｍｌの血清を分離し、これに
硫安１２１１を加えて３０分間攪拌後８０００ｒｐｍで
３０分間遠心して沈澱物を集めた。この沈澱ｑシ１召・
ＰＬｌ ８． ｏの０．０２ Ｍ ’）リヌー塩酸緩衝
液１００１に対して一夜透析し、透析残液を予めｐＨ８
，０の０、０２ Ｍ トＩＪヌー塩酸緩衝液で平衡化し
ておいたＤＥ−５２（ワットマン社製）のカラム（１５
ｃｍＸ ８０ ｃｍ ）に通液した。素通り画分をＰＨ
８，５の００１Ｍホウ酸緩衝液１００１に対して一夜透
析し、前記の未加熱のＦ （ａ ｂ’） ２フラグメン
トヲカツプリングしたＣＨ−セファローヌ４Ｂを充填し
Ｐト１８５のＯ，ｌ Ｍホウ酸緩衝液で平衡化しておい
た２、 Ｏｏｎ Ｘ ２０ ｃｍのカラムに通液し、素
通シ両分を集めた。
硫安１２１１を加えて３０分間攪拌後８０００ｒｐｍで
３０分間遠心して沈澱物を集めた。この沈澱ｑシ１召・
ＰＬｌ ８． ｏの０．０２ Ｍ ’）リヌー塩酸緩衝
液１００１に対して一夜透析し、透析残液を予めｐＨ８
，０の０、０２ Ｍ トＩＪヌー塩酸緩衝液で平衡化し
ておいたＤＥ−５２（ワットマン社製）のカラム（１５
ｃｍＸ ８０ ｃｍ ）に通液した。素通り画分をＰＨ
８，５の００１Ｍホウ酸緩衝液１００１に対して一夜透
析し、前記の未加熱のＦ （ａ ｂ’） ２フラグメン
トヲカツプリングしたＣＨ−セファローヌ４Ｂを充填し
Ｐト１８５のＯ，ｌ Ｍホウ酸緩衝液で平衡化しておい
た２、 Ｏｏｎ Ｘ ２０ ｃｍのカラムに通液し、素
通シ両分を集めた。
この素通り画分をＰＨ８，０の１／１０００ Ｍ ）リ
ヌー塩酸緩衝液を含む生理食塩水に対して一夜透析し、
透析残液を凍結乾燥して５００ ｍ９の抗体の凍結乾燥
品を得た。
ヌー塩酸緩衝液を含む生理食塩水に対して一夜透析し、
透析残液を凍結乾燥して５００ ｍ９の抗体の凍結乾燥
品を得た。
得られた抗体の凍結乾燥品を用い、各種血清に（１３）
ついてＥＬＩＳＡ法で測定した。すなわち、凍結乾燥し
た抗体ｋ ｐＨ７，２のＯ６０２Ｍ ＩＪン酸緩衝液に
６０μｇ−Ａｎｌになるように溶解し、ＥＬＩＳＡ用９
６ウエルのプレートに１ウエル６０μｔづつ分注し、４
℃で一夜放置して抗体を物理吸着させた。各ウェルを洗
浄後、１％の牛血清アルブミンを含む０．０２ Ｍリン
酸緩衝液を６０μを宛分注した。そして、血清を生理食
塩水で５倍に希釈しだ液１０μｔ６添加し、室温で２時
間反応させた。反応後、液を吸い出してウェルを洗浄し
、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトｒｇＧヤギ抗体を加え、
２時間反応させた。洗浄後、Ｈ２Ｏ２−２，２′−アジ
ノーデー〔３−エチル−ベンジアゾリン硫酸塩〕の被ル
オキシダーゼ基質を加え゛Ｃ室温で３０分間反応させ、
４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。その結果、健常
人では０Ｄ４ｏ５−〇〇２（ｎ−２０）、全身性エリテ
マトーデス（ＳＬＥ）患者の場合には０Ｄ４ｏ５＝ １
．８〜０．５ （ｎ ＝ ４０）、そして慢性関節リュ
ーマチ（ＲＡ）患者の場合には０Ｄ４ｏ５−２０〜１．
２（ｎ−２１）でアジた。また、健常人血清に熱凝集１
ｇＧを血清１ ｍｌあたり（１４） ］ ００ ｐｑを添加して測定したが、０Ｄ４ｏ５値は
やはり０．０２であった。
た抗体ｋ ｐＨ７，２のＯ６０２Ｍ ＩＪン酸緩衝液に
６０μｇ−Ａｎｌになるように溶解し、ＥＬＩＳＡ用９
６ウエルのプレートに１ウエル６０μｔづつ分注し、４
℃で一夜放置して抗体を物理吸着させた。各ウェルを洗
浄後、１％の牛血清アルブミンを含む０．０２ Ｍリン
酸緩衝液を６０μを宛分注した。そして、血清を生理食
塩水で５倍に希釈しだ液１０μｔ６添加し、室温で２時
間反応させた。反応後、液を吸い出してウェルを洗浄し
、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトｒｇＧヤギ抗体を加え、
２時間反応させた。洗浄後、Ｈ２Ｏ２−２，２′−アジ
ノーデー〔３−エチル−ベンジアゾリン硫酸塩〕の被ル
オキシダーゼ基質を加え゛Ｃ室温で３０分間反応させ、
４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。その結果、健常
人では０Ｄ４ｏ５−〇〇２（ｎ−２０）、全身性エリテ
マトーデス（ＳＬＥ）患者の場合には０Ｄ４ｏ５＝ １
．８〜０．５ （ｎ ＝ ４０）、そして慢性関節リュ
ーマチ（ＲＡ）患者の場合には０Ｄ４ｏ５−２０〜１．
２（ｎ−２１）でアジた。また、健常人血清に熱凝集１
ｇＧを血清１ ｍｌあたり（１４） ］ ００ ｐｑを添加して測定したが、０Ｄ４ｏ５値は
やはり０．０２であった。
実施例２
実施例１と同様にして得た抗原全１０００μ７／ｍｌと
し、その０．１ ｍｅ ｆ ８週令のＢＡＬＢ／Ｃマウ
スの腹腔に注射し、１週ｊｔｆｌ後に同様に再度注射を
行なった。そして、それからさらに１週ｌＪｊ後及びそ
のまた１週間後にいずれも尾静脈に５０ ｔｉｙｌｏ、
１ ｍｌの抗斤生理食塩水溶液を注射し、３日後に肺
臓全摘出した。この肺臓を摩砕して肺臓細胞を分離し、
ポリエチレングリコール１５００を用いてマウスミエロ
ーマＰ３０１と細胞融合させた。得られた融合細胞は９
６ウエルのプレートに分注し、ＨＡＴ培地で培養を行な
った。各ウェルの細胞をＥＬＩＳＡ法で調べ、凝集Ｆ
（ａ ｂ’） ２フラグメントと反応し、未凝集のＦ
（ａ ｂ’） ２ノラグ７ノントとは反応しないものを
陽性としたところ６ウエルの細胞が陽性であった。
し、その０．１ ｍｅ ｆ ８週令のＢＡＬＢ／Ｃマウ
スの腹腔に注射し、１週ｊｔｆｌ後に同様に再度注射を
行なった。そして、それからさらに１週ｌＪｊ後及びそ
のまた１週間後にいずれも尾静脈に５０ ｔｉｙｌｏ、
１ ｍｌの抗斤生理食塩水溶液を注射し、３日後に肺
臓全摘出した。この肺臓を摩砕して肺臓細胞を分離し、
ポリエチレングリコール１５００を用いてマウスミエロ
ーマＰ３０１と細胞融合させた。得られた融合細胞は９
６ウエルのプレートに分注し、ＨＡＴ培地で培養を行な
った。各ウェルの細胞をＥＬＩＳＡ法で調べ、凝集Ｆ
（ａ ｂ’） ２フラグメントと反応し、未凝集のＦ
（ａ ｂ’） ２ノラグ７ノントとは反応しないものを
陽性としたところ６ウエルの細胞が陽性であった。
この６ウエルの細胞を限界希釈法で希釈してクローニン
グし、前記の分析法で陽性の７細胞株を得たＯ この細胞株をそれぞれ１０％Ｆｃｓ−ＲＰＭＩ培地で増
殖させ、ＢＡＬＢ／Ｃマウヌの腹腔へ１０７個づつを注
入し、２週間後に腹水約１．０ ｍｌを採取した。この
腹水を実施例１と同様に硫安４５％飽和にして硫安沈澱
を行ない、続いて０．０２ Ｍ ） ＩＪヌー塩酸緩衝
液（ｐＨ８，０）に対して透析を行なった。透析残液を
ＰＨ７，０の０．１ Ｍ ＩＪン酸緩衝液で平衡してお
いたセファデックスＧ−２００（ファルマシア社製）に
通液し、分子量１５万〜２０万のフラクションを集めた
。このフラクションの２８０ ｎｍにおける吸光度を測
定したところ、このフラクションにはＴｇＧとして５〜
１２ｍｇが含才れていた。
グし、前記の分析法で陽性の７細胞株を得たＯ この細胞株をそれぞれ１０％Ｆｃｓ−ＲＰＭＩ培地で増
殖させ、ＢＡＬＢ／Ｃマウヌの腹腔へ１０７個づつを注
入し、２週間後に腹水約１．０ ｍｌを採取した。この
腹水を実施例１と同様に硫安４５％飽和にして硫安沈澱
を行ない、続いて０．０２ Ｍ ） ＩＪヌー塩酸緩衝
液（ｐＨ８，０）に対して透析を行なった。透析残液を
ＰＨ７，０の０．１ Ｍ ＩＪン酸緩衝液で平衡してお
いたセファデックスＧ−２００（ファルマシア社製）に
通液し、分子量１５万〜２０万のフラクションを集めた
。このフラクションの２８０ ｎｍにおける吸光度を測
定したところ、このフラクションにはＴｇＧとして５〜
１２ｍｇが含才れていた。
このフラクションを各々ＥＬＩＳＡ法でＳＬＥ患者血清
から分離した免疫複合体と反応させたところ、３細胞株
から得られたものが反応を示した。
から分離した免疫複合体と反応させたところ、３細胞株
から得られたものが反応を示した。
このフラクションを用いて、健常人血清、ｓＬＥ患者血
清、及びＲＡ患者血清についてＥＬＩＳＡ法で測定した
ところ、いずれも実施例１と同じ吸光度が得られた。
清、及びＲＡ患者血清についてＥＬＩＳＡ法で測定した
ところ、いずれも実施例１と同じ吸光度が得られた。
実施例３
実施例１と同様にして得たヒＦ Ｆ （ａ ｂ’） ２
７ラグソントｉ生理食塩水に溶かしてＩＱｍｇ／ｍｌの
溶液とし、これに０．１ Ｎ ＨＣｌを滴下してＰＨ２
，（１に調整した。この液を４℃で１８時間放心した。
７ラグソントｉ生理食塩水に溶かしてＩＱｍｇ／ｍｌの
溶液とし、これに０．１ Ｎ ＨＣｌを滴下してＰＨ２
，（１に調整した。この液を４℃で１８時間放心した。
Ｑ、 ］ Ｎ ＮａＯＨで中和後この酸処理液に等量の
フロイントの完全アジュパントヲ加えて乳化し、この乳
化液を予め免疫寛容性全伺与［て疑いた３０匹のモルモ
ットの背部に１回１匹あたり０．５ ｍｌ （抗原１
ｍ９含有）宛陥週ごとに４回皮肉注射した。最終回の注
射１週間後に各モルモットとも頚動脈から全採取した。
フロイントの完全アジュパントヲ加えて乳化し、この乳
化液を予め免疫寛容性全伺与［て疑いた３０匹のモルモ
ットの背部に１回１匹あたり０．５ ｍｌ （抗原１
ｍ９含有）宛陥週ごとに４回皮肉注射した。最終回の注
射１週間後に各モルモットとも頚動脈から全採取した。
この血液を実施例１と同様に処理して４０ｍｇの抗免疫
複合体抗体の凍結乾燥品を得た。
複合体抗体の凍結乾燥品を得た。
実施例４
実施例１と同様にして得たヒ） Ｆ （ａ ｂ’） ２
フラグメン） ｋ ｐＨ８，０の０．０２ Ｍ ＩＪン
酸緩衝液に溶解して１０ｍｙ／ｍｌの溶液とし、これに
グアニジン塩酸を８Ｍになるように添加した。この液を
室温にて３時間放置し、生理食塩水に対して透析した・
透析残液に等量の７０インドの完全アジ−パン（１７） トを加えて乳化し、この乳化液を予め免疫寛容性を付与
しておいた１８羽のニヮｌ−ＩＪ ｍ胸部に１回１羽あ
たり０．５ ｍｌ宛隔週ごとに３回筋肉注射した。
フラグメン） ｋ ｐＨ８，０の０．０２ Ｍ ＩＪン
酸緩衝液に溶解して１０ｍｙ／ｍｌの溶液とし、これに
グアニジン塩酸を８Ｍになるように添加した。この液を
室温にて３時間放置し、生理食塩水に対して透析した・
透析残液に等量の７０インドの完全アジ−パン（１７） トを加えて乳化し、この乳化液を予め免疫寛容性を付与
しておいた１８羽のニヮｌ−ＩＪ ｍ胸部に１回１羽あ
たり０．５ ｍｌ宛隔週ごとに３回筋肉注射した。
最終回の栓内１週間後にいずれも頚動脈から全採血した
。
。
この血液を実施例１と同様に処理して１６０ｍ９の抗免
疫複合体抗体の凍結乾燥品を得た。
疫複合体抗体の凍結乾燥品を得た。
特許用廊人 富士臓器製薬株式会社
代理人弁理士田中政浩
（１８）
Claims (1)
- ヒト免疫グロブリンのＦ （ａ ｂ’） ２フラグメン
ト、の凝集物を抗原として対応する抗体を産生せしめて
これを採取することを特徴とする抗免疫複合体抗体の製
造方法
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20765882A JPS5999258A (ja) | 1982-11-29 | 1982-11-29 | 抗免疫複合体抗体の製造方法 |
| EP83301845A EP0091760B1 (en) | 1982-04-09 | 1983-03-31 | Anti immune complex antibody and preparation thereof |
| DE8383301845T DE3364347D1 (en) | 1982-04-09 | 1983-03-31 | Anti immune complex antibody and preparation thereof |
| US06/482,766 US4544640A (en) | 1982-04-09 | 1983-04-07 | Anti immune complex antibody for determining SLE, rheumatoid arthritis or tetanus |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20765882A JPS5999258A (ja) | 1982-11-29 | 1982-11-29 | 抗免疫複合体抗体の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5999258A true JPS5999258A (ja) | 1984-06-07 |
Family
ID=16543413
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20765882A Pending JPS5999258A (ja) | 1982-04-09 | 1982-11-29 | 抗免疫複合体抗体の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5999258A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH06102037B2 (ja) * | 1984-03-30 | 1994-12-14 | ケンブリツジ パテント デベロツプメンツ エルテイデイ | 抗体、製法と用途 |
-
1982
- 1982-11-29 JP JP20765882A patent/JPS5999258A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH06102037B2 (ja) * | 1984-03-30 | 1994-12-14 | ケンブリツジ パテント デベロツプメンツ エルテイデイ | 抗体、製法と用途 |
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