JPS5983055A - 多粒子洗浄システムおよび使用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、溶液中の多量密度・識別可能粒子の選別、収
集、洗浄のための装置および方法に関するものであって
、そのような装置および方法は、血液試料、その他、の
大量処理に容易に適用し得るものである。

試験の目的のために、又は医学的適用のために、血液試
料を個々の成分−例えば個々の細胞成分（赤血球および
白血球）および血清に分解することが必要であり且つ好
ましいことはずっと以前から認識されていた。例えば、
輸血を実施する前に、受血者の血清を給血者の赤血球上
に存在する抗原と反応する抗体があるかないかについて
調べなければならない。この抗体および同様の抗体を検
出する操作で、クームス血清の添加前に赤血球の洗浄を
必要とする操作は、米国では年間的２５０．０００．Ｏ
Ｑ　０回行われている。これらの抗体検出試験において
は、供血者細胞を受血者血清と一緒にし、その後供血者
の赤血球を受血者の血清から分離しなければならない。

そのような分離は、大きくした重力をかけることによっ
て赤血球を遠沈管の底に沈め、血清およびその他の密度
の比較的小さい成分を上部に集める、という遠沈法によ
り達成されることは、よく知られている。赤血球層のみ
を必要とする操作では、血清部分は傾譚され、赤血球は
水溶液に再懸濁されるのが普通である。一般にはこの溶
液は、塩を基にした溶液である。細胞の再懸濁は一般に
物理的にかきまぜることによって行われるから、遠心分
離時に細胞開腔に閉じ込められた血清は、−緒にその溶
液中に再Ｍ濁されてしまう。新だに懸濁された赤血球を
含む溶ｇは、普通は再び遠心分離され、赤血球は遠沈管
の底部に集まり、混入血清を含む上澄液は又傾消される
。赤血球の洗浄を最大にし、クームス試験を妨害するガ
ンマグロブリンおよび補体成分を含む血清を除去し、そ
れで尚できるだけ多くの血球を保有するために、この遠
沈および再懸濁操作は一般に３回繰返される。

この標準回収システムは、血液中に存在する他の成分の
混入を最小にして、比較的きれいな赤血球集団を提供す
るとはいえ、赤血球に対して行われる多数の物理的操作
のために２０〜３０％という桁の大量の赤血球が喪失す
るのが普通である。

更に、要求される物理的操作の性質上、自動処理を行う
のはむづかしく、複雑、危介な、高価な装置が必要とな
る。その上標準回収システムは、血液試料の３洗浄サイ
クルにつき平均５〜６分を必要とし、大量の試料を処理
しなければならない時には人的および装置資源に大きな
負担がかかる。

多くの種類の分離法があるとはいえ、それらは懸濁液か
らの母液部分の回収を容易にしようとするものが多く、
本発明によって提起された上述の問題を解決することを
意図した工夫は一つもない。

Ｍｅ　Ｄｅ　ｒｍｏ　ｔ　を等による米国特許Ｎｏ、　
３，９３２，２７７は、１本のチューブがもう１本のチ
ューブに挿入できるようなチューブ系を記載している。

この場合、血清上澄液を傾斜中に細胞と血清とが混合す
るのを阻止する試みから、遠沈後、１本のチューブが血
清を赤血球から分離するための障壁を挿入する。内側チ
ューブが挿入されている間、この時障壁は上記の部分の
間に置かれる血清は内側チューブの内部は通過して入っ
てくるから、血清をろ取することができる。このように
この発明は血清を回収する方向に向けられており、ち密
に固まった赤血球部分の表面に障壁が置かれる時、その
昇面に不注意な混合がおきないように非常に＃１心の注
意をしなければならない。ひとたび定位置に置かれたな
らば、その障壁は、血清の傾消時に、赤血球を取出すこ
とを阻止するであろう。こうして、その障壁は、その赤
血球層を得るところから、赤血球層を研９じしようと思
っている技術者を失望させる。更に、この障壁は、本発
明の目的である赤血球又はその他の密度の異なる粒子か
ら白血球を分離並びに分配することを妨害する。

Ｇｒｅｅｎｓｐａｎによる米国特許Ｎｏ、　３，７９９
．３４２は血清の除去を容易にし、赤血球の遠沈容器中
における永久的保存を容易にするために、赤血球層と上
部血清との間に障壁を置こうとしているという点でＭｅ
　Ｄｅ　ｒｍｏ　ｔ　ｔの１２７７特許に類似している
。

Ｍｅ　Ｄｅ　ｒｍｏ　ｔ　ｔの忠告に従い障壁は遠沈後
に置かれるようになっており、そのため、この場合も本
発明が提起している問題の解決の助けにはならない。

Ｌａｎｄｅｒｓ等の、米国特許Ｎｏ、　４，０３５，２
９４も、遠心分離後の上澄液の収集、ろ過および除去に
向けられている。Ｌａｎｄｅｒｓ等は、底にフィルター
ｑ０をとりつけた内側チューブを、内側チューブに力を
加えることによって挿入し、上澄液はその膜を通ってろ
過され、内側チューブに集められて取り出される、と記
載している。既述の参照例によると、Ｌａｎｄｅｒｓ等
の開示は液状上澄物質の改善されたろ過−および処理方
法を教え、本発明の目的である、溶液から分離された粒
子をより良く処理するために必要な装置および方法を用
意することはできなかった。

Ｆａ　ｒ　ｉ　ｎａ等による米国特許Ｎｏ、　４，２４
４，６９４は、自動的固相イムノアッセーに使用するり
アクタ−／セパレーター装置の使用について記載してい
る。この装置は、免疫吸収剤、不動化抗血清、イオン交
換樹脂および遠沈時に内側チューブに加えられる試薬と
反応するためのその他の同様の物質を支持することので
きる、水の浸み通らない円盤を用いる。望壕れる反応後
、付加的遠心力をかけてその力により、水相をフィルタ
ーを通過せしめ、フィルターを水透過性にし、好ましい
成分の分離を可能にする。Ｆａｒｉｎａ　　の発明は、
水を透過しない円盤によって収集室から分離されたりア
クタ−室において混合、移動および分離のために遠心力
が用いられる装置を提供する。そのような装置は上に列
挙した問題、特に溶液中に懸濁した均−又は多重−密度
の粒子の収集および洗浄に関係する。最小のステップお
よび最大の経済性が望まれる問題を解決することはでき
ない。

血液試料からの赤血球成分の収集については報告されて
いるとはいえ、これが実例によって行われ、記載された
先行技術の手順も本発明も、重力、電気力又は磁気力を
用いる方法で母溶液から一般的形で粒子を分離するため
に、等しく適用されることは理解される。

１ワン−ステップ（一段階）ｆ操作で溶液から粒子を速
かに分離するととを可能にするのが本発明の目的である
。粒子を含む溶液から粒子を分離している間に、その粒
子を洗いすべての非特異的血清被覆物（コーティング）
を除去し、付着混入してくる溶質をうすめるのがもう一
つの目的である。混入（汚染）ｆ：減らすために、最初
の母溶液を除去できるように、最初の含有溶液を、生じ
た赤血球濃度の高い部分から分離して維持することが本
発明のもう一つの目的である。異なる密度を持つ粒子を
分離して、そのような粒子の少くとも１種類をとり出し
、他を除去することを可能にすることがもう一つの目的
である。典型的試験管の容量より顕著に大きい容量を処
理することのできる装置および方法を用意することが本
発明の今一つの目的である。これらの目的が、経済的生
産を可能ならしめ、一般に入手できる簡単な、高価でな
い遠心分離器内で操作され得る単純なシステムにおいて
実現されることが、本発明のもう一つの目的である。本
発明の装置および方法が、現在用いられている高価な自
動的細胞洗浄機に代シ得ることがもう一つの目的である
。目的が達成される方法のみ力らず、好ましい目的に合
う装置をも用意することが本発明の更にもう一つの目的
である。

これらおよびその他の目的はここに明らかにされる説明
に照らして、熟練せる当粟者には容易に理解されるであ
ろう。

本発明は、液中に含まれる粒子を効率的且つ経済的に分
離するための、洗浄溶液試薬を含む方法および装置に関
するものであって、分離操作中に粒子が母溶液から除か
れるのみならず、′ワン−ステツブ１操作で、第二の溶
液で洗われる。といつものである。

最も単純な型の場合、装置は洗浄浴ｆ１．を含む試験管
内に置かれた中空、開口チューブ又はシリンダーから成
り、中空チューブは少くとも洗浄溶液のレベルの上まで
伸び、試験管の底によって支えられている。典型的ＫＦ
ｉ、洗浄溶液は、分離しようとする粒子の密度より小さ
い＠度をもつが粒子を含む溶液の密度よりは大きい密度
をもつように選ばれる。これｔよ、二溶液間の混合を最
小にするためである。成る溶液が、他の溶液との界面に
おいて他の溶液中へ拡散する状態Ｕ、Ｉｉ’ｉｃｋ　　
の法則によって支配される。従って用意されたシステム
にとって、洗浄容液又は第二液は、塩化ナトリウム、グ
リシノ、砂糖、血清アルブミン、天然ポリマー、天然コ
ポリマー、合成ポリマー、合成コポリマー、デキストラ
ンおよびフィコール（商品名）から成る群の巾から選は
れた少くとも１成分を、上記第二液の密度調節のために
含む。血清アルブミンは、動物血清アルブミンおよびヒ
ト血清アルブミンから成る群から選ばれるかも知れない
。血清アルブミンは、適合するためには、ヒトガンマグ
ロブリン又はヒト補体を含有してはいけない。

洗浄溶液および母溶液の容箪は、これら溶液間の界面が
内側中空チューブの中に含まれるように選ばれる。遠心
力が加わると、中空内側シリンダーにより形成されｆｒ
：、腔内に入れられた母溶液中に含渣れる粒子は、沈降
係数又は、粒子を特徴づけるスペドベルグ単位に従って
母溶液中を試験管の底へと移動させられる。中空の内側
シリンダーは、単に外側試験管の底に静止しているたり
であるから、洗浄溶液は内側中空シリンダーの中へ、又
シリンダーから外へとＶ透することができ、そのため一
部装置される。そこで、粒子を含む母溶液を内側チュー
ブの内部に加えると、洗浄溶液および母溶液間に界面が
形成され、その界面は、液量を適当に調節することによ
り、内４１１＋１中空チューブの中に含まれるようにす
るのが好１１〜い。遠心力の適用の結果、望ましい粒子
が試験管底部に薄膜状になるであろう。その後次の三方
法のどちらかによって傾消が行われる。その一つは、残
る母溶液を中空シリンダー状チューブから吸引し、その
後チューブをとり出すか、内側チューブのてっぺんをシ
ールしてから、その内側チューブと共に母溶液をとり除
く、第二の、より簡単な方法（、址、外側チューブを逆
さにすることによって４１）溶液、中空シリンダーおよ
び外側洗浄溶液を１つの傾瀉スデッグ（段階）でとり除
くことができる。

このシステムにおいては、粒子を分離し、集めると同時
に、それらの洗浄を行うために、母溶液が入れられた容
器の壁面を被覆する汚染母溶液をとり除くために、内側
チューブが心安とされる。

内側チューブがなければ、母溶液は試験管の内壁に被膜
を作り、傾瀉および望ましい粒子の再懸濁後に、再懸濁
液が試験管壁に残った少量の母溶液によって汚染される
であろう。

本発明の原理および目的に従えば、第−液に含まれる粒
子を洗浄し収集するだめのシステムは、（少くとも第−
液と等しい密度および粒子の密度よりゃよ大きくない密
度をもち、上端が開いている第一の収容手段中に含まれ
る第二液」および［上記第一の収容手段の開口端を通っ
て第二液中に挿入され、実質的には」−記第一液を含み
、上記第−液を第二／Ｐｉと分けて保持するように、そ
して又粒子が第−液から第二液へ移動できるように適合
させて挿入された第二の手段」とから成る。このシステ
ムを更に詳細に述べるならば、第二液を含む第一の手段
は、上端が開き、下端が閉じた外側チューブであり、」
二記第−ｆｉを実質上含み、分離して維持するだめの第
二の手段は、開口上端および少くとも一部は外側チュー
ブ内に挿入できる位の大きさの、開口下端をもつ内側チ
ューブで、その内側チューブの中には、上記第−液の、
上記第二液への流入を制限するための液流制限手段（レ
ストリクター）が含まれる。これに代る実施例では、内
側中空シリンダーは、孔のあいた隔壁又は、少くとも７
ミクロンの直径又は大きさをもつ孔、又は分離すべき粒
子の直径又は大きさをもつ孔を有するフィルター型物質
、又は、粒子を含む第−溶液又は母溶液と、試験管であ
る第一の収容手段の中に含まれる第二液との間の拡散効
果および混合流を減らずだめのその他の液流制限手段を
具備する。

又別の実施例は、第二液が赤血球を溶解もせず、免疫学
的又は血清学的反応を妨害もしないように赤血球と適合
する第二液を付加的に用意する。

又、第一ゾーンを形成する液の中に含まれる粒子を洗浄
、収集する方法であって、第一ゾーンを第二ゾーン（第
二ゾーンは少くとも２Ｂ−ゾーンの液の密度にほぼ等１
〜い密度をもつ液体を含み、第二ゾーン自身は貯臓手段
の中に含まれる）から実質的に分離して維持するだめの
手段によって形成される腔の中に、第一ゾーンを挿入す
る段階、粒子を上記第一ゾーンから上記第二ゾーンへ実
質的には上記第二ゾーンを通して移動させる力を加える
段階、および第一ゾーンに生じた液をとり出し、同時に
分解手段および第二ゾーンの液をもとり出す段階から成
る方法も用意式れる。

又、第−ｔＷに含まれる粒子を洗浄し、収集する方法で
あって、液流制限手段をとりつけられ、実質的に上記Ｎ
Ｇ−Ｍを含む内側チューブを、少くとも第−液の密度に
ほぼ等しいが、粒子の密度よりＣよ大きくない密度をも
つ第二液を含む外側チューブに挿入する段階、第−液を
内側チューブに加える段階、上記外側チューブの底の方
向に向かう力を加え、それによって粒子は上記液流制限
手段および上記第二１はを通過して上記外［＋１１チユ
ーブの底に移！ＩＩＩＪする段階、および上記内側チュ
ーブ、上記第−液および上記第二液をとシ出す段階から
成る方法も記される。

好ましい実施例においては、内側チューブは、制限され
た開口又はしぼり（オリフィス）のような液流制限手段
をもち、それら手段は内側チューブ内に位置するが底部
には位置しない。そし、て内側チューブはその底部に、
インキュベーション中熱の分布に役立つように下方内部
領域含有する。

本発明は、洗浄剤を含み、分離中に粒子から、１母溶液
からの汚染物（混入物）１を洗い去るようにして液中の
粒子を分離することのできる方法および装置を記載する
。更に本発明は、粒子の分離後桟る母溶液、即ち上澄液
を除去して、上澄液と望まれる粒子との間の混合および
その結果生じる混入（汚染）を最小にするであろう。

第１図はその糊の装置の実施例を示しており、内側チュ
ーブ２１の中に、分離すべき粒子を含む母溶液２２が入
れられる。内側チューブ２１は、外側チューブ又は貯蔵
手段２５の中に挿入された後、直径のより大きい部分２
４が内側チューブ２１の外側チューブ２５へのそれ以上
の挿入を阻止し、その上、遠心分離後内側チューブを容
易にとり出すだめの握り表面となるように、てっぺんに
直径のより大きい部分２４を有することが好棟しい。

内［１１１１チユーブ２１には更に、チューブ底に７０
−．１／ストリクタ−（流れ制限器）２６がとりつけら
れる。フロー、レストリクターは母溶液２２に官僚れる
粒子が通過できる程、十分に通過性である。

別の実施例では、流れ制限手段２６は少くとも母溶／？
νに含まれる粒子の直径に等しい直径の開口部（１コお
よびチャンネル）をもった、不溶性、多孔性マトリクス
はフィルター型物質でおる。マトリクス又はバッフルは
、母溶液と洗浄溶液の分離性を最大にするために、適当
な湿シ係数をもつプラスチックタイプの材料から成るの
が好ましい。こうして、＋／１径７ミクロンの赤血球を
分離するために４′、ｉ１小さくても直径７ミクロンの
孔をもつバッフルが使用される。一層好ましいように、
沈降時間を減少させると同時に、赤血球がバッフルを通
過する時３こる赤血球の機械的変形号減らすためＶＣ１
分Ｐ：Ｌすべき赤血球の直径よりも大きい直径の孔をも
つバッフルを使用するのが好都合であることがわかった
。

洗浄液２６に、母溶液２２の密度よシ大きい密度をもつ
ように選ばれるのが好ましく、その上分離すべき粒子と
適合しなければならない。例えは、もし粒子が赤血球で
ある場合、ここに用いた意味での適合性とは、外側洗浄
液が赤血球を溶解することもできず、血清学的又は免疫
学的反応も妨害しない。ということを意味する。理想的
には、そのような溶液は、溶解（１ｙｓｉｓ　）を防ぐ
ために、食塩Ｍ液中４−１５％濃度の半血清アルブミン
（ＢＳＡ）から成るであろう。クームスのテストにおい
て典型的なように、母溶ｉ２２は、患者血清２部分、　
０ｒｔｈｏ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｓｙｓｔｅｍ社（
Ｕ、Ｓ。

１えｏｕｔｅ　＋　２０２　、　Ｒａｒｉｔａｒ、Ｎ、
Ｊ、０８８６９　）から入手できる０ｒｔｈｏ　Ａｎｔ
ｉｂｏｄＶ　Ｅｎｌ＋ａｎｃｅｍｍｔ　５ｏｌｕｔｉｏ
ｎ（０／ｕｓ　）のような増強剤２部分、そして３％の
赤血球を含むアルセベルー又は食塩溶ｇ１部分から成る
のが理想的である。これらの作用物質は室温では約１．
０１４から１．０１９４での比重を示すであろう。下記
のものは、赤血球を分離、収集するための正しい密度、
血清学的性質および免疫学的性質をもった外部洗浄液に
ついて示−ｊ：４％ＢＳＡ／１．２％ＮａＣ１（１，０
１６）、７％ＢＳＡ／１．２チＮａＣ１（１，０３（１
）、１５％ＢＳＡ／１．２％ＮａＣＡ！　（１，０４８
）、５％ススクロース／。％ＮａＣ１（１，０２５）、
６％スクｏ　−ス／　、９％ＮａＣ１（１，０２９）、
１０％グリシン７．９チ食塩水（１，０４７）、ここで
は室温における比重をかっこ内に示しである。更に、も
し食塩水濃度が若干大きくなって、細胞に対して高滲透
圧を形成するならば、細胞はよりち密になり、従って遠
心力の適用に対してより敏感になるであろう。もし電気
的力又は磁気力（例えば磁気分極をおこした粒子又は磁
気的材料でラベル化した粒子に磁場をかける）のような
別の力を用いる場合は、干渉効果を避けるために、外部
洗浄液は適当に調節される。囲りを取り巻く外部溶液２
６の密度がよシ大きくなると、それはフローレストリク
ターと共同して、遠心分離中における内部母溶液２２の
周囲層中への流入を減らし、それによって外部洗浄溶液
２６の混入を実質的に減らすように作用する。

これらの考察は第１図に関して述べられているとはいえ
、これは一般罠すべての実施例にめてはまることは当然
である。

第２図に関しては、内側チューブ２１を外側チューブ２
５に、内側チューブ２１土の広くなった直径２４によっ
て阻止されるレベルまで挿入した後、外部溶液２６は、
内側チューブ２１、溶液２２およびフロー、レストリク
ター２６によって、外部液表面２６が内部溶液２２の表
面より高いレベルにまで上り、その後両面は同じレベル
になるように、置換されるのが好ましい。表面レベルの
このような調整は、母溶液が外部溶液とその後混合する
のを制限するために好ましい。なぜならばこれら二浴液
間の界面は、内側チューブ２１の中に含まれるからであ
る。第２図に示（７たような、粒子洗浄装置は、これで
遠心分離の用意ができたことになる。遠心分離において
は点２７に向かう力が溶液２２中に含まれる粒子に加え
られ、粒子はフローレストリクター２６のオリフィス部
を通り、続いて外部浴液２６を通って外（ｉｌｌチュー
ブ２５の底２７に移動する。粒子が外部溶液２６を通過
する時、ひきずり込オれたＰ１質による汚染か、又は粒
子表面に非特異的に付滑した汚染物質は、粒子が外部溶
液２６を通コ関しながら洗い去られ、除去きれるであろ
う。粒子を好ましい方向に十分に移動さヒ゛、外側チュ
ーブ２５の点２７にバッキング又Ｑ；Ｌ沈１腎物として
蓄Ｉｌ（はするが、粒子に物理的変形又はＪｊｉ　１７
１をおこす程大きくはない遠心力を選ぶ。

フローレストリクター２６と沈降点２７０間の距＃＃ｔ
ｅｌ１、母溶液２２から分離される粒子の洗浄を最大に
しなお且つ分離のだめの時間を最小にするように都合１
（＜選ばれる。更に、溶液２６の容量は、フローレスト
リクター２６を通過した汚染物が大巾に稀釈されるよう
に、理想的に選ばれる。もしも粒子が凝集可能だったり
、孔の直径より大きい抜合体を生成したりするならば、
この実施例の効果は著しく減退するものであろう。

第３図は第１図に示した粒子洗浄装置の断面図である。

ここには直径の大きくなった部分２４、内壁２１および
フローレストリクター２６が図示されている。

分離粒子および母溶液の物理的混合による汚染を最小に
する好ましい目的を達成するために、フローレストリク
ターを母溶液と外部溶液との間にＪ？ｔ１人するのが好
ましい。このフローレストリクターは、両液を安定させ
、対流、密度勾配による逆ｂｌｃ、　、そして外部溶液
２６に対する内側チューブ２１の物理的動きによって誘
起されるその他の流れによっておこる混合を最小にする
のに役立つ、従ってフローレストリクターは、粒子のフ
ローレストリクター通過は許すが、内部溶液２２と外部
溶液２６との間で混合する量を最小にするように選ぶの
が好ましい。このフローレストリクター又は安定装置に
よって生ずる効果は、その代りに２混合液間に普通存在
する表面張力を大きくすることによって達成される。そ
のような表面張力マルチグライヤー（増加させるもの）
は第４図に示す内側チューブ４１の穴の直径４５を小さ
くするというような物理的構造によって形成されるかも
知れないし、別の方法として内側チューブのこのレベル
に化学物質又は化学的コーティングを適用することによ
って作り出すこともできる。

遠！し分離又ｔまその他の電気的又は磁気的力の適用後
に母溶液中に含まれる望ましい粒子はフローレストリク
ター２６、外部溶液２６を通り、外側チューブ２７の底
に押しつけられ、そこで沈殿するのが好ましい。この時
点で、残る母溶液上澄液訃よびフローレストリクターを
含む内側チューブを、外側ｆ＠液の物理的振動を最小に
し、従って沈降粒子の＋＋＋　？ｌｒｌ濁を最小にする
ようにして、とり出すのが好捷しい。内側チューブを用
いることの利点は、母溶液は、入れられている容器の側
面を被恍するが、内側チューブはこの母溶液を除去する
ことを可能とするのである。内側チューブを除去するこ
とによって、この潜在的汚染源は速かに且つ効率的に除
去され、粒子が再懸濁され死時粒子が汚染されるのを免
れる。沈殿した粒子の上にある外部溶液は、傾泊、サイ
フオン等のよう寿、当業者には周知の技術によって除去
できる。

第４し１は、内側チューブ４１が小さい開口４５をもつ
ように作られた、別の実施例を示す。内側チューブ４１
は、物理的に外側チューブ４６の内部に合うような大き
さで、チューブ４１の内陸に粒子含有溶液２２を入れた
佐に、少くとも外部洗浄溶液２６０レベルより上に上っ
ているような大きさである。内側チューブ４１に、史に
空気抜き（通気口）４４をそなえつける。空気抜きは、
これがなければ内側チューブ４１を外部溶液２６に挿入
した時下方内部領域４２に捕捉されるであろう比較的多
１律の亀ヲ、逃げさせるのに効果的である。しかしなが
ら空気抜きは、遠心分ｈｌの前に、母溶液と外部洗浄溶
液を分離して維持するのに都合良く役立つところの、開
口４５の比較的小さい空気泡の維持に役立つのが好まし
い。空気抜き４４の開口４８の直径は、下方内部領域４
２と大気との間の自由な往来全可能とする太き筋である
ことが好ましい。空気抜きは、内側チューブ４１が偶発
的に上の方へ動いた場合、母溶液２２が開［」４５を不
注意に通過するのを阻止するためにも好都合である。空
気抜きは、外部溶液２６が内側チューブ４１のつば４９
によって形成される下方内部領域４２へ理想的に鯰紬す
るのを可能とし、これによって熱を外部浴液２６から内
側チューブ４１の下方反応室部分４６の内部溶液へ容易
に伝えることができる。そのような熱伝導は、ダメ試験
法又は抗体検出操作におけるクームスのテストに先立っ
て行われるのが好ましいところの、母溶液および反応物
質のインキュベーションを必要とする反応において好都
合である。好ましい実施例において内イ則チューブ４１
は、外側チューブ４６に自由に置かれる。力の適用は好
都合なことに、粒子の１４ｒｌ　１．：ｌ　４５を）口
１つて外側チューブ４６の底４７への移動をひきおこす
であろう。開口４５と点４７との間の距離は、熱伝導を
最大にすると同時に外側洗浄溶液２６の容量を最小にし
、しかもなお粒子の洗浄および汚染物の稀釈を最大にす
るように、都合良く選ばれる。開口４５ｉｉ、、チュー
ブ４１に都合よく位ｆＮ：ｔ、、そのため加わる力が正
確に内側チューブ４１の中心縦軸と一直線にならなくて
も、−ノ°べての粒子はその開口を通過するであろう。

そのような状態が起こるのは、例えば、ロータの回転中
試験管４６の完全９０°の運動をおこすことのできない
ロータをもった遠心分離機器本発明がとりつけられた場
合である。

第５図に示す別の組み合わせでは、中空シリンダー５１
になった内側チューブが外側チューブ５６の中に挿入さ
れ、その底に自由に置かれる。内側チューブの長さは、
粒子を含む溶液をシリンダー５１の中空部に加えた後、
外側洗浄溶液のレベルより上っているように、十分長く
なけれはならない。

第６Ａ、６Ｂ　、６０図は使用中の異なる段階における
好ましい実施例を図示しだものである。特に、第６Ａ図
株、挿入前の内側チューブ６２および外側チューブ６６
を示す。第６Ｄ図は内側チューブ６２の断面図である。

外側チューブ６６は、わかり易いように、内側チューブ
６２より比例的により大きくして示される。内側チュー
ブは、オリフィス部（オリフィスとチャンネル）６４を
もつ。これは、母溶液６９が下部室６１に流れ込まない
ように、そして、究極的には洗浄液７０に流入しないよ
うに、実質的に分離して保つためでろる。下部室６１は
、その他に、インキュベーション段階を必要とする操作
中に熱伝導をよくするために役立つ。内側チューブ６２
には、更に、外側チューブ６６内に固定されるように、
サポートノツチ６７、又はそれに代るものとして、サポ
ートリッジ（固定するためのみぞ）がつけられている（
両方共ｉ６Ａ図に示される）。内側チューブ６２は更に
室７１の底部に、オリフィス部６４に通づる角αをもっ
たロート状構造を有する。このロート状の形は、遠心分
離器のロータが回転にあたって完全９０度ひろがること
ができない場合でも、粒子が遠心分離中に、しぼり（オ
リフィス）部分に向かうために都合よく設計されている
。従って角αは、そのロータによる回転中の試験管の角
度の２倍以下であることが好都合であることがわかる。

内側チューブ６２は、ポリエチレン、ポリスチレン又は
ポリプロピレンのようなプラスチック材料で作られるの
が好ましい。外部洗浄液７０をもつ外側チューブ６６も
図示される。第６Ｂ図は内側チューブ６２を外側チュー
ブ６６に挿入した後、そして遠心分離前の、外部洗浄液
７０および内部粒子含有液レベル６９の比較を示す。内
部母溶液６９に比較して外部洗浄液７００レベルが相対
的に高いことが、これら二Ｍｅ分離して維持するのに役
立つ。第６Ｃ図は、遠心分離して、収集。

洗浄すべき粒子が外側試験管６６の下部分６５に沈積し
た後に達するレベルを示す。内側チューブ６２は外側チ
ューブ６６とほぼ同じ長さであることがわかるが、内側
チューブは遠心分離後容易にとり出せるようにより長く
作ってもよい。

第７図はもう一つの実施例を示す。ここでは内側チュー
ブ７１は外側チューブ７６に挿入され得る大きさで、そ
の下方部分を封するような形に、多孔性グラスチックか
ら成るノくツフル型のフローレストリクターフ４をとり
つけるような構造になっている。内側チューブ７１は底
部に、制限量ロア５の形のもう一つのフローレストリク
ター全もつ。粒子が外側チューブ７６の底の方へ移動す
る時、バッフル７４と開ロア５との間の空間で粒子は外
部洗浄液によって洗われる。

第８図は、大量の母溶液から粒子を分離し、同時に異る
密度の粒子を分離するのに特に有用な、本発明の最も好
捷しい実施例を示す。８図の実施例り２、実施例３で用
いられる実際の装置に対してほぼ１：１のスケールで示
されているが、この実施例はそのようなサイズに限られ
ているわけでなく、血液のような、粒子を含む液体全大
量に処理するためにはそれに適した大きさにしてもよい
。

第８図の装置の操作の例として抑液を用いる時、赤血球
が、外側試験管に含まれる洗浄液を通過して、その底部
６５に沈殿することになる。分離装置（内側チューブ）
８０Ｈ洗浄液中に挿入され母Ｍ’ｌｌｌが内側チューブ
内に加えられる。前述のように、適当な力を加えると、
粒子は一般には下方へ、液流制限手段およびオリフィス
８１を通って、末（・呂６５に向かって動く。

内１１１１１チューブ８０を試験管内に支持し、オリフ
ィス８１を、外側試験管底部６５から離れた成る点にＱ
ｒ！＋シく維持するだめに、内側チューブは拡がった部
分８２をもつ。このおかげで大量の赤血球沈積物が内側
チューブ８０によって機械的妨害を受けることなく蓄積
される。特記すべきことｔよ、外側洗浄液が、母溶液中
に含まれる多−粒子（マルチ）の密度と母溶液の密度と
の間にあるように適当に選んだ密度をもった液でおって
もよいし、又は底部６５の」［＜が最も高い密度の部分
で、外側チューブのてっぺんに行くにつれて密度がだん
だん小さくなるというような密度勾配をもっていてもよ
い。こうして母溶液中の神々の密度の混合粒子は、遠心
分離中に、外部溶液として選んだ密度により、又は密度
勾配によって、個々に分離さｉする。

容量および密度を適当に選択することによって、例えば
赤血球が点６５に沈殿し、内側チューブ８０内にほとん
ど残り保持されている白血球のリンパ球部分と分けられ
る。白血球ＩｖＩＩＩ胞は容易に除去され、処理される
。最上部分８４は、母液および／又は内側チューブ８０
内に含才れる中間密度層をとり出すために特に有用であ
る。遠心分離後、キャップ手段８４０部分８６は、取り
外し自由でｄあるがぴったりとすり合わせになって、内
側チューブの拡大部分８２に挿入される。挿入は、最上
１〜１１分８４の拡大部８５によって示されるように、
膨大部によって理想的に制限される。最上部分８４は、
指の圧によって封することのできる管腔８６に続く。こ
うして、内側チューブ８０は、液および／又はその中に
含まれる粒子の損失なく、外側チューブの点６５に沈殿
した粒子の振動を最低にして、ｌｆ↓上部分８４と共に
とり出される。管腔８６は比較的小さいので、内側チュ
ーブ８０から内部液を指でコントロールしながら分配す
ることができる、例えばリン只球性白血球層が、外部の
点６５にある赤血球のような他の粒子とは別に、オリフ
ィス８１を３ｉ（１つて１又は２滴分配されるかも知れ
ない。本発明はその他に、ヴイールス、細菌又はその他
の汚染物による感染のリスクを潜在的に減らずために、
輸血に先立って血液を徹底的に洗浄するのに用いられる
。この好ましい実施例の原理および操作は、以後実施例
３を参照することにより更に良く理解されるであろう。

実施例 １、第５図に示す実施例を用いる抗体検出の例両端が開
いていて、直径４鯖および長さ約９０−９５朋の内側中
空チューブを、比重１．０３０の７チ牛血清アルブミン
／　１．２　％　ＮａＣｌ　　から成る洗浄液１．５　
ｍｌを含む、清潔で透明な１０Ｘ７５１肩試験管に挿入
した。室温で約１．０１４〜１．０１９の比重をもち、
３７℃水浴上で１０分間個々にインキュベートされた患
者血清２部分、増強剤（Ｏｒｔｌｌ。

Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ　５ｏｌｕ
ｔｉｏｎ　）２部分および３％ヒト赤血球（Ｓｅｌｅｃ
ｔｏｇｅｎ　　）食塩溶液１部分から成る、反応物試料
１５０μｌを内側中空チコ、−プに導入した。全システ
ムをＳｅｒｏｆｕｇｅ　（Ｃ１ａｙ　−Ａｄａｍｓの商
標）遠心分離器に入れ、３４００　ｒ、ｐ、ｍで約３０
−６０秒回転させ（９００１０００ｒｃｆ）、赤血球を
底に沈殿させた。外側チューブの全内容物を逆さにする
ことによってワン−ステップで傾瀉し、外側チューブの
へりについた液は、吸収性ペーパータオルでふきとった
。０ｒｔｈｏ抗ヒト血清２滴（クームス血？′ｆｆ）を
沈殿細胞に加え、ゆるく振動することによって再懸濁お
よび混合を行い、チューブおよび内容物を、既述のよう
な方法で１５秒間再遠ＩＬ／分離した。再懸濁が行われ
ている間、アメリカ血＃銀行協会が提示した方法に従っ
て、食塩凝集の親類が行われた。遠心分離後、血清学的
反応７５’　？ｔｆｔ、みとられ／ζ、　ｐｔｊｉみと
り後、細胞が正しく洗浄され、クームス血清を中和する
血清汚染物がないことを確実にするために、クームス・
コントロールテストが行われた。このコントロールテス
ト＆−１，，ＩｇＧ　（免疫グロブリン）コーティング
赤血球試薬１滴を加え、混合し１５秒間遠心分離するこ
とにより（既述のように）行われた。このテストは、細
胞が正しく・洗われ、クームス血清を中和する血清汚染
物はないことを保証する。

８種類の血清（０ｒｔｈｏ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｓ
５’ｏｔｅｍ社のＡＡＢＢ−認定Ｐｈｔｌｉｐ　Ｌｅｖ
ｉｎｅ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ研究所から入手した抗−Ｆ
ｙ、抗−〇、抗−山、抗−１．ｅ。

抗−［＜ｅｌｆＯ例を含む）を種々の濃度で用い、３０
０個々の読みをとり、０〜４　範囲のＭ、集反応（〇−
凝集なし、４−＃、大凝集）を調べて、装置の有効性を
試験するために同様の操作を行った、本発明の装置は、
プラスの読みの２３係において、典型的三段階式手動洗
浄技術よりより良いフルリーディング（ｆｕｌｌ　ｒｅ
ａｄｉｎｇ　）　ｋ与え、プラスの読みの３チにおいて
、感度のより小さいフルリーディング（ｆｕｌｌ　ｒｅ
ａｄｉｎｇ　１を与えた。

赤血球上の抗原に結合した抗体は、５６℃水浴中で１０
分間加熱することによって除去（溶出）することができ
る。この操作では、回収された抗体が赤血球に吸着して
いたのか、それとも残りの血清中に存在していて、用い
た洗浄方法では正しく除去されなかったのかどうかを明
らかにするために、細１１ｉ１．を、それらの抗体を含
む血清又は血漿から分離することが必要でおる。

Ｒｈｏ（Ｄ）　　マイナス血液のｌ□ｍ（！試料を遠心
分離し、血漿を除去した。細胞を、抗−Ｄを含む等容積
の血漿に再懸濁し、１１Ｒ１部分に分ける。各部分を遠
心分離し、血す；ｌを除去した。溶液および細胞金含ん
で全体で３　ｍｌになるように、細胞ｅ０．１５Ｍ塩化
す）　ＩＪウム溶液に再懸濁した。外側チューブ７１＆
よ１６Ｘ１００朋チユーブで、内側チューブ７１　ｆｒ
ｊ　ｌ　Ｉ　Ｘ　７０　ｍｒｎチューブで、孔の大きさ
７０ミクロンの、多孔性プラスチック製フィルター７４
全含み、外側チューブ７６の中には、１２チ牛アルフミ
ン５．４　ｍｌから成る外部洗浄溶液が含まれる。

装置を２０００　Ｘ　、９で５分間遠心分離し、内側チ
ューブをとり出し、外部洗浄液を吸引した。５％牛アル
ブミン０．５　ｍｌ　ｆ加え、おだやかに混合すること
により、外側チューブの底部に詰った赤血球を再懸濁さ
せた。それから赤血球細胞を５６°０水浴中に１０分間
置くことにより抗体を溶出濱せ、まだ温いうちに前記の
ように遠心分離した。溶出液２滴をＲｈｏ（Ｄ）　　プ
ラス細胞と共に３７℃で３０分間インキュベートし、食
塩溶液で３回洗っだ後その赤血球を、抗ヒト・グロブリ
ンを使って、赤血球に結合した抗体が存在するかどうか
を調べた。

溶出液中の抗−Ｄｔ調べるテストにおいてマイナスの結
果が出たことは、本発明の装置において細胞から抗−Ｄ
が十分に除去されることを示した。

従来の洗浄では、赤血球の１１ｎ１部分を０．１５Ｍ塩
化ナトリウムｉｌ　ｉ（５８ｍ／！を追加してうすめ、
１〜７回洗い、最後に５％牛アルブミン０．５　ｍｌ中
に５６℃で溶出した。結果を比較すると、本発明の装置
で１回の洗浄ステップで除去できる抗−Ｄと同じｙｔ除
去するには、３〜４回の従来の洗浄ステップが必狭であ
ることがわかった。

長さ約９５１”％下方内径約５朋、上方内径約１０１で
１０す長さのつは（カラー）をもつプラスチック製内側
チューブが１６Ｘ１００ｍガラス製試験管に挿入され、
上方の縁からぶら下がる。つばは、内側チューブの下端
がガラス製試ＤＩＡ管の底につくのを効果的に阻止した
。内側チューブの上方端は、内径約３Ｍで、指先で封す
ることのできる最上端部分（、トップポーション）？：
もつアダプターと、ぴったりと合わされた。

密度の大きいＦ’１ｃｏｌｌ　−Ｐａｑｕｅ　（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａの商標）溶液８　ｍ１３をガラス製１６Ｘ
１００朋試験管に入れた。あらかじめ収集し、ヘパリン
抗凝固剤で処耶した全血を食塩溶液で１−１に稀釈した
。稀釈した血液４　ｍｌを内側チューブの中へ、＠Ｆｉ
ｃｏｌｌ−Ｐａ、ｑｕｅ溶液上へ重なるように入れた。

ガラス試験管ｆ：ＩＥｃ臨床用遠心分離器に、スイング
−アウト−ヘッドに合わせて挿入し、最大速度で３０分
間遠沈した。遠心分離後、種々のノーが観察された。赤
血球がガラス試験管の底に沈殿し、赤血球の一番１−に
白血球の層がみえた。内側１チューブの中に界面が明ら
かにみえた。フィンガーチップ（指先で押さえる）アダ
プターを使って内側チューブをガラス製試験管からとり
出し、内側チューブ内のフランクジョンを一滴づつ、個
別の清潔な試験管に回収しプこ。それらフラクションを
ライト血液染料で染色後検鏡すると同時に装置＋ｉ　Ｅ
　Ｌ　Ｔ　−８（０ｒｔｈｏ　ｌ）ｉａｇｎｓｔｉｃ　
Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ、から人手）を用いるフローシ
トメトリーによって調べた。

これらの研究により、白血球−主に顆粒球−の、赤血球
に勝る存在が、若干の血小板の存在と同時に確認された
。内側チューブの、密度の大きい二層（母溶液およびＦ
ｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ溶液により形成さる）間の界面
に、主として白血球から成る細胞と、血小板があった。

血小板は種々のフラクションに、白血球より多くあられ
れるのが見出された。

本発明は以上の実施例によって説明されたとはいえ、こ
こに用いられた利料に限られると解釈すべきではなく、
むしろ本発明はこれ以前に開示された粒子分離・洗浄の
全体的領域を包含する。本発明の数多の変更および実施
例をこの発明の精神および範囲から逸脱することなくお
こなうことが出来ることは、この領域の当業者には明ら
かであろう。

【図面の簡単な説明】

本発明の目的および原理、および本発明の好ましい実施
例は、添付図面を参照することによって最も良く理解さ
れる： 第１図は、内側チューブを外側チューブに挿入する前の
粒子洗浄システムの実施例の側面図である。 第２図は、内側チューブを外側チューブへ挿入後の、第
１Ｍに示した粒子洗浄並びに収集システムの側面図であ
る。 第３図は、第１図の粒子洗浄並びに収集システムの内側
チューブの断面図である。 第４図は、粒子洗浄並びに収集システムの別の実施例の
側面図である。 第５図は、粒子洗浄システムの又別の実施例の側面図で
ある。 第６図のシリーズは、粒子洗浄システムの好ましい実施
例を操作中の側面図を示す。 ８１）７図ｄ１、粒子洗浄システムの又別の実施例の１
１１ｊ面図である。 第８図は、粒子洗浄システムの最も好ましい実施例の分
解側面図である。 第１頁の続き ０発　明　者　ローズマリー・ケイ・チャフハウスキー アメリカ合衆国０８８３５ニユージ ヤーシイ州マンビル・ノース・ フィツス・アベニュー１１９ ３１５−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）ＢＦＳ＞１１に含−まノＬる、異なる密度又は異
   なる沈降速度をもった粒子集団から所望の粒子を洗浄収
   集するためのシステムであって、 ａ）　少くとも第−液の密度とほぼ等しく、所望の粒子
   の密度よりは大きくない密度をもったＰｔ！：二欣と、 １】）　　第二液を入れるだめの第一の手段でろって、
   開ロ上端ケ有する手段と、 （り　　上記第一の収容手段の開口上端を通って第二液
   に挿入される第二の手段であり、実質上上記第−液を含
   み、第−液を第二液から分離して維持し、かつ所望の粒
   子が第−液から上記第二液の既知部位へ移動することを
   可能とするように適合させた第二の手段であってこれに
   より、もし上記所望の粒子が上記第一手段に含まれ、上
   記第二手段には含まれていないならは、すべての他の粒
   子および上記第−液は除去することができ、またもし上
   記所望の粒子が上記第二手段に含捷れているならは、所
   望粒子は上記第二手段により取り出され、その後上記第
   二手段から掬えられる手段と、から成るシステム。 （２）第−液に含まれる異る密度又は異る沈降速度をも
   った粒子を洗浄、収集および分離するためのシステムで
   あって、 ａ）開口上端および閉鎖底部端をもち、少くとも第−液
   の密度に等しく、最も密度の大きい粒子のそれよりは大
   きくないという密度範囲の第二液を含む外側チューブと
   、 ｂ）上記第−液を含み、上記外側チューブの開目端に挿
   入されるように作られた、開口上端および開口底部端を
   もつ内側チューブ、お上び Ｃ）上記第−液の、上記第二液への流入を制限するため
   の、上記内側チューブ内の、上記第−液の表面下の手段
   と から成るシステム。 （３）更に上記外側チューブ内に上記内側チューブを支
   持するための手段を含む、特許請求の範囲第２世記載の
   システム。 （４１更に、上記粒子が液流制限手段（フルードフルー
   レストリクター）を通って、上記外側チューブの底部端
   に移動することができるように、上記粒子に、上記外側
   チューブの底部端の方へ向かう力をかけるだめの手段を
   含む、特許請求の範囲第２項記載のシステム。 （５）上記第−液を実質上含み（他から）分離して維持
   するだめの第二手段が、開口」部端および上記外側チュ
   ーブに少くとも部分的には挿入できる大きさの開口底部
   端をもち、上記第−液の」二記第二液への流入を制限す
   る手段を内部にもった内側チューブである特許請求の範
   囲第１９項記載のシステム。 （６）上記内側チューブを上記外側チューブ内に支持す
   る手段を更に含む、特許請求の範囲第５項記載のシステ
   ム。 （７）液流制限手段が表面張カマルヂグライヤ−（増加
   させるもの）である、特許請求の範囲第２又は第５項記
   載のシステム。 （８）内側チューブを外側チューブへ挿入し、第−液を
   内側チューブへ加えた後、上記第−液および第二液の界
   面が内側チューブ内に形成されるように、第−液および
   第二液の容量を調節することを特徴とする特許ｉｆｆ求
   の範囲第２又は第５項記載のシステム。 （男第−液に含まれる、特殊の密度又は沈降速度をもつ
   望ましい粒子を洗浄、収集する方法であって、 ａ）　開口上端および閉鎖底部端をもち、少くとも第−
   液の密度にほぼ等しいが、第二液の成るレベルで、所望
   の粒子の密度よりは大きくない密度をもった第二液を含
   む外側チューブｂ）開口上端および開口底部端をもち、
   実質上上記第−液を含み、上記外側チューブの開口端に
   挿入されるように作られた内側チューブの中に位置する
   内側チューブレストリクタ一手段から成るシステムにお
   いて、上記内側チューブを、上記第二液を含む上記外側
   チューブに挿入し、 上記内ＩＨ［１チユー“ブに上記第−液を加え、上記粒
   子に、上記外側チューブの底の方へ向かう力を加え、粒
   子は上記液流制限手段および上記第二液を通過して、上
   記第二液の密度が望ましい粒子の密度とほぼ等しいレベ
   ルまで移動し、 ぞして 上記粒子が上記の液流レストリクターを通過して移動し
   た場合は上記内側チューブ、上記ｐ（４−？Ｉｖおよび
   上記第二液を必要に応じてとり出し、望ましい粒子を得
   、 又は 上記所望の粒子が上記内側チューブに含まれる場合は、
   上記内側チューブを、その中に含まれる上記第一および
   第二液と共にとり出し上記第一および第二液を分配し、
   所望の粒子を得る、 という段階から成る方法。 ００上記第二液が、上Ｒ１２第二沿の密度を調節するた
   めに、塩化ナトリウム、グリシン、砂糖、血清アルブミ
   ン、天然ポリマー、天然コポリマー、合成ポリマー、合
   成コポリマー、デキストランおよびＦｉｃｏｌｌ　　か
   ら成る群から選んだ少くとも１成分を含むことを特徴と
   する特許請求の範囲第１゜第２又は第５項記載のシステ
   ム。 ０刀上記第二液がＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ　　である
   、特許請求の範囲第１．第２又は第５項記載のシステム
   。 ０２更に、上記第二手段に挿入するように適合して作ら
   れたコントロールキャップ手段を含み、上記第一および
   第二液が上記第二手段から分配される、特許請求の範囲
   第１項記載のシステム。 αｊ更に、上記第二手段のてっぺんに挿入するように適
   合して作られたコン）・ロールキャップ手段を含み、上
   記第一および第二液が、」二記第二手段から分配される
   、特許請求の範囲第５項記載のシステム。