JPS59206315A - 混成インシユリン分泌増強活性物質およびその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ボルデテラ属産生インシュリン分泌増強活１
ト１物質（以−ト、ＩＡＰと略称する）を構成づる蛋白
性ザブユニット物質（以下、サブユニツ１〜と略称ケる
）の少なくとも１種と所定の蛋白性サブユニット物質の
修飾体である蛋白性修飾ザブ１ニツ１〜物質（以下、修
飾サブユニットと略称する）とからなる混成インシュリ
ン分泌増強活性物質（以下、混成ｒＡＰと略称する）お
よびその製法に関する。

特ｍ昭５２−１０３９７号明細書く特開昭り３−９６３
９２号公報）並びに特願昭５２−４９６４１号明細書特
開特開昭５３−１３６５９２号公報）は、ボルデテラ属
に属する微生物が産生ずるインシュリン分泌増強活性物
質及びこの活性物質を含有する糖尿病治療乃至予防薬を
開示している。そして、特願昭５５−１４２３２３号明
細書く特開昭５７−６７５９１＠公報）並びに特願昭５
５−１４２３２４号明ｍ書（特開昭５７−６７５９２号
公報）は、ボルデテラ属に属する微生物が産生りるイン
シュリン分泌増強活性物質に係る蛋白質性要素物質、再
会合性蛋白質およびそれらの製法を開示している。

本発明は、上記インシュリン分泌゛増強活性物質である
ＩＡＰの改良に係わり、特に有効薬理活性はＩＡＰとほ
ぼ同等でありながら白血球増多作用が著しく減弱された
新規な混成ＩＡＰおよびその製法を提供することを目的
とするものである。

ＩＡＰの調製法は、特願昭５２−１０３９７号明細書（
特開昭５３−９６３９２号公報）、特願昭５２−４９６
４１号明ｌｌ特開（特開昭５３−１３６５９２号公報）
、特願昭５５−１４２３２３号明１１１特開（特開１１
１５７−６７５９１号公報）並びに特願昭５５−１４２
３２４号明細書（特開昭５７−６７５９２号公報）等に
開示されている。

そして、ＩＡＰを少なくとも尿素を含有する水溶液で解
離処理覆ると最終的に５種類のサブユニットになること
が特願昭５５−１４２３２４号明細書（特開昭５７−６
７５９２号公報）に開示されている。これらのサブユニ
ットは高分子量側からサブユニット蛋白質Ｐｓ−１、Ｐ
ｓ−２、Ｐｓ−３、Ｐｓ−４及びｐ　ｓ−５と命名され
ていケ。ＩＡＰは（ＰＳ−１＞　　（ＰＳ−２）（Ｐｓ
−３）　　（Ｐｓ−４）２（ｐｓ−ｓ　＞から構成され
ており、各サブユニット蛋白質自体はインシュリン分泌
増強活性を示さないが、再会合性を有するのでＩＡＰと
同じ構成要素比で会合させるとインシュリン分泌増強活
性が発現することが判明している。

次に各サブユニットの物性値について述べる。

（ｉ）Ｐｓ−１ （ａ）ＳＤＳグル電気泳動法による分子量：２８０００
±　１，２００ （ｂ）アミノ酸分析：Ａｓｐ９．３±０．１Ｔｈｒ７．
４±０．８　　Ｓｅｐ　１０．６±　１．１Ｇｌｕ１０
．６±　１．１　　Ｇ　Ｉｙ　１１．２±　１．２Ａ　
ｌａ　１０．６±　１．Ｉ　　ＣＶＳ／２　１．２±０
．２■ａ１６．７±０．７　　Ｍｅｔ　１．６±　０．
２１　Ｉｅ　３，２±０．４　、　Ｌ　ｅｕ　５．５±
０．６Ｔｙｒ　４．６±０．５　　Ｐ　ｈｅ　３．５＝
１：０．４Ｌ　ｙｓ　　２．２　±　　０．３　　８　
　ｉｓ　　１．７　±　　０．２Ａ　ｒ（１５，９±　
　０．６　　　Ｐｒｏ　　４．４　二ｌ：　　　０．５
（Ｃ）酸性蛋白性物質二等電点５．８ （ｄ　）急性毒性：　５０ｍｇ以上／ｋ（］（百）Ｐｓ
−２ （ａ）ＳＯＳゲル電気電気泳動法る分子量：２３０００
±　１，１００ （ｂ　）アミノ酸分析：Ａｓｐ６．７±０，７Ｔｈｒ　
８．．９±０．９　　Ｓｅｒ　１１．５６±　１．２Ｑ
Ｉｕ９．０±０，９　　Ｑ　ｌｙ　１３．７２±１．４
ＡＩａ６．７±　１．Ｉ　　Ｃｙｓ／、　　１．３±０
．２Ｖａｌ　４．７±０，５　　Ｍｅｔ　１．４±０．
２１　ｌｅ　３．６±０．４　１−ｅｕ　６．４±０．
７Ｔｙｒ７，０±０．７　　ｐｈｅ　３．８±０．４Ｌ
　ｖｓ　３，０±０．３　　日ｉｓ　１．２±０．２Ａ
ｒｇ４．９±０．５　　ｐｒｏ　４．１±０．５（Ｃ）
塩基性蛋白性物質：等電点８．５（ｄ　）急性毒性：　
５０ｍｇ以上／ｋ（１（ｉｉｉ　）　ｐｓ−３ （ａ、）ＳＤＳゲル電気泳動法による分子口：２２００
０±　１，０００ （ｂ　）アミノ酸分析：ＡＳ１１６．７±０．７Ｊ　ｈ
ｒ　　８．１±　０，９　３ｅｒ　　６．２±　０．７
Ｇｌｕ８．５±　０．９　　Ｇ　＋ｙ　　１２．’３　
　±　１．３Ａ　Ｉａ　１２．１　　±　１．３　　Ｃ
ｙＳ／２　１．６±　０．２Ｖａｌ　　５．３±　０，
６　　Ｍｅｔ　　１．２±　０．２１　１ｅ　　５．４
±　０．６　　　Ｌ　ｅｕ　　８．０±　０．８Ｔｙｒ
　　７．６±　０．８　ｐｈｅ　　３．６ゴ、０．４Ｌ
　ｙｓ　　２．８±　０．３　　Ｈｉｓ　　０．３±　
０．１Ａｒ９５．８±　０．６　　Ｐ　ｒｏ　　５．２
±　０．６（Ｃ）塩基性蛋白性物質二等電点８．８（ｄ
　）急性毒性：５０＋＋＋ｇ以上／ｋ（１（ｉＶ）Ｐｓ
−４ （ａ）ＳＤＳグル電気泳動法にＪ、る分子量：１１．７
００±６００ （ｂ　）アミノ酸分析：　Ａ　ｓｐ　５．３±０．６Ｔ
ｈｒ５．１　±　　０．６　　　Ｓ　　ｅｒ　　７．５
：Ｈ０，８Ｇ１１ｊ　　９，０＋　　０．９　　Ｇｌｙ
　８．８±　０．９Ａ　ｌａ　９．４±　１．０　　Ｃ
ＶＳ／２　　１．６±　０．２Ｖａ１９．５±　１．Ｏ
Ｍｅｔ　　４．６±　０．６１　１ｅ　　２．１±　０
．３　　　Ｌ　ｅｕ　　８．２±　１．０Ｔｙｒ　２．
３±　０，３　　Ｐｈｅ　３．８±　０，５１ｙｓ７．
０±　　０．８　　　ト１ｉｓＯ，７±　　０．２Ａｒ
ｏ５．１±　０．７　　Ｐ　ｒｏ　　９．３±　１．０
（ｃａｍ基性蛋白性物質：等電点ａｂｏｖｅ　１０゜（
ｄ　）急性毒性：　５０ｍｇ以上／ｋｇ（Ｖ）ＰＳ−５ （ａ）ＳＤＳゲル電気泳動法による分子量＝９３００±
　１００ （ｂ　）アミノ酸分析：ＡＳ＋）７．４±０．８Ｔｈｒ
　５．２±０．６　　Ｓｅｒ　１４，２±１．５ＱＩｕ
１１．２±　１．２　　Ｇ　Ｉｙ　１５．９．、±　１
．６Ａ　ｌａ　１０．２±　１．１　　ＣＶＳ／２　０
．９±０．２ｖａ１３．９±０．４　　ｖｅｔ　１．ｉ
±０．２１、Ｉｅ２．６±　０．３　１　ｅｕ　　７．
４±　０．８Ｔｙ、ｒ２．７±　０．３　　Ｐｈ８　３
．２±　０．４１ｙｓ４．１　±　　０．５　　　ト１
ｉｓＯ，９±　　０，２Ａｒｇ２．１±　０．３　　Ｐ
ｒｏ　　３．１：　　０，４（ｃ）酸性蛋白性物質二等
電点５．０ （ｄ　）急性毒性：５０Ｉｌ１ｇ以上／ｋａ又、上記サ
ブユニットを製造する中途段階でＰ　ｓ−２とＰ　ｓ−
４とが会合した会合蛋白性物質Ｐ−３及びＰ　ｓ−３と
Ｐ　ｓ−４とが会合した会合蛋白性物質Ｐ−４が単離さ
れたので下記に示す。

（ｖｉ）　ｐ−３ ＜ａ　）上記Ｐ　ｓ−２とｐ　ｓ−４が１＝１モル比で
会合している蛋白性物質 （ｂ）アミノ酸分析：ＡＳρ６．３±００ｌＴｈｒ８．
４±０，９　３ｅｒ　７．７±０．８ＱＩｕ８．７±０
．９　　Ｇ　Ｉｙ　１０，５±　１．１Ａ１ａ７．３±
０．８　　Ｃｙｓ／　２　１．３±０．２Ｖａｔ　　７
，１±　０．８　　Ｍｅｔ　　２，６±　０．３１　　
Ｉｅ　　３．６±　０．４　　　Ｌ　ｅｕ　８．５±　
０．９Ｔｙｒ　　５．７±　０．６　　ｐｈｅ　　３．
７±　０．４１ｙｓ５．０±　０．５　　＠　ｉｓ　　
１．３±　０．２Ａｒｇ５．４±　０．６　　ｐｒｏ　
６．７±　０．７（Ｃ）塩基性蛋白性物質 （ｄ　）急性毒性：　５０ｍｇ以上／ｋｇ（ｖｉｉ　）
　Ｐ−４ （ａ　＞上記のＰ　ｓ−３とＰ　ｓ−４が１：１モル比
で会合してた蛋白性物質 （ｂ　）アミノ酸分析：　Ａ　５＋１６．３±０．７Ｔ
ｈｒ６．８±０，７　　Ｓｅｒ　７，０±０，７Ｇｌｕ
９，４±　１．０　　Ｇ　ｌｙ　１０．４±　１．１△
ｌａ　１０，４±１．Ｉ　　Ｃｙｓ／　２　１．３±０
．２Ｖａ１６．０±０．６　　Ｍｅｔ　３．２±０．４
１１ｅ　３，４±０．４　　Ｌｅｕ　８．５±０．９Ｔ
ｙｒ６．２±０．１　ｐｈｅ３．６±０．４Ｌ　ｙｓ　
４．５±　０．６　８　ｉｓ　　Ｏ，９±　０．２Ａｒ
ｇ　５．２±　０．６　　Ｐ　ｒｏ　６．６±　０．７
（Ｃ）塩基性蛋白性物質 （ｄ　）急性毒性：　５０ｍｇ以上／ｋ（＋ＩＡＰから
各サブユニット又は会合蛋白↑１１物買へ解離する経路
の一員体例を下記に示す。

（以下余白） ＩＡＰ Ｐ−３（Ｐ−４＋　ＩＡＰ）　　　　　（Ｐ、ｓ−１＋
Ｐｓ−５）Ｐｓ−２Ｐｓ−４Ｐ−４１ＡＰ　　　　　Ｐ
ｓ−Ｉ　　　　Ｐｓ−５Ｐｓ−３Ｐｓ−４ 上記の如く生成したサブユニツ１〜あるいは会合蛋白性
物質は再会合性を有することが判明している。さらに再
会合して再生したＩ　Ａ　＋）がインシュリン分泌増強
活性を有することも判明している。

次に、各サブユニット蛋白性物質及び／又は会合蛋白性
物質を使用して再生［ＡＰを合成づる具体例を記す。な
お、下記に示す会合順序のみに再生ＩＡＰの合成は限定
されるものではない。

例　　１ （以下余白） 例　　２ 一一−→再生ＴＡＰ（１モル） 例　　３ 一−−−−→再生ＩＡＰ（１モル） （注）ＣＰ−Ａとは（Ｐｓ−２）　（Ｐｓ−３）（Ｐｓ
−４）：Ｌ（Ｐｓ−５）からなる］ンボーネントである
。

次に、混成ＩＡＰを構成するための修飾サブユニットは
、下記の如く調製されたＩＡＰ誘導体から生成される。

本発明に係るＩＡＰ誘導体とは、ＩＡＰに式Ｒ−Ｃ−Ｏ
Ｒ（式中、Ｒは水素°原子、Ｃ１〜１　　　．１　　　
　　　　　２　　　　　　　　　　　　　　　１Ｎ）Ｉ Ｃ７の低級アルキル基、クロルメチル基、β−ヒドロキ
シエチル基、エトキシカルボニルメチル基、ベンジル基
、フェニル基、ｐ−ヒドロ４ニジフエニル基またはナフ
トキシメチル基を示し、ＲえはＣ１〜Ｃ９の低級アルキ
ル基を示す）で示されるアミジノ化剤を反応させて得ら
れるものであってＩＡＰ中の遊離アミノ基に式Ｒ，−Ｃ
＝ＮＨ（式中、Ｒは前記と同義である）で示されるアル
４ニルイミノ基及び／またはアリルイミノ基を導入した
ＩＡＰアミジノ化誘導体であるか、またはＩＡＰに式Ｒ
３−Ｃ−Ｒ，（式中、Ｒ３は水素１京子またはメチル基
を示し、Ｒ，は水素原子、０１〜Ｃ３の低級アルキル基
を示す）で示されるカルボニル化合物またはビリドキリ
−ルリン酸を還元剤の存在下に反応さｔＵ、ＩＡＰ中の
遊離アミノ基に記と同へである）で示されるアルキル基
または置換ピリジルメチル基を導入したＩＡＰ還元アル
キル化誘導体を示す。ＩＡＰ還元アルキル化誘導体を製
造するのに使用７６還元剤としては水素止車つ索ノー１
−リウム、水素化ホウ素シアノナトリウムおよびピリジ
ン、モルホリン成るいはジメチルアミン等のアミン類と
ボランとの複合体等を例示し得る。

ＩＡｌつアミジノ化誘導体を製造するための有利な反応
条件の幾つかを下記に例示する。

１、反応溶媒：　　ｌ）Ｈ７〜１１、好ましくは９〜１
１の０．０５〜２モル燐酸、硼酸、炭酸 緩！液。

２、ＩＡＰＩ度：　　０．０１〜１ｉｆｆｉ％３、アミ
ジノ化剤の重量及びｍ度： ＩＡＰに対シ１〜１０００重量倍 （５ｍＭ　〜１０００　ｍＭ　） ４、反応時間並びに温度：　Ｏ〜５５℃゛で５〜２４０
分。

ＩＡＰアルキル化誘導体を製造するための有利な反応条
件の幾つかを下記に例示する。

１、反応系のｐＨ：ｐｉ−１６〜１０、好ましくはｐＨ
７〜９゜ ２、反応溶媒：　　０．０５〜０．５Ｍ燐酸緩衝液、好
ましくは０．１Ｍｍ酸緩衝液。

３、ＩＡＰ濃度：　　０，０１〜１重償％４、カルボニ
ル化合物（Ｄ　ＦＪ　ａ　：　４１１１１Ｍ　〜１００
ｍＭ　０５、還元剤の濃度：　５１１１Ｍ　〜１００ｍ
Ｍ、。

６、反応温度二　０〜４０℃。

７、反応時間：　５分間〜２４時間。

本発明に係るＩＡＰ誘尋体は、ＩＡＰ１分子中に存在す
る遊離アミノ”基の４〜９５％が修飾されており、これ
により無処理ＩＡＰとほぼ同等の高血糖抑制作用を有し
ながら白血球増多作用が著しく減弱されているという驚
くべき薬理活性を有している。

得られたＩＡＰ誘導体は、無修飾ＩＡＰの場合と同様に
して修飾サブユニットに分離される。すなわち、ＩＡＰ
誘導体は最終的に修飾ｐｓｉ、修飾ｐｓ−２、修飾ｐｓ
−３、修飾Ｐ　ｓ−４および修飾Ｆ）Ｓ−５の５種の修
飾サブユニットに分離される。

分離の中途段階で、修飾Ｐ　ｓ−２と修飾ｐ　ｓ−４が
会合している修飾Ｐ−３および修飾ｐ　ｓ−３と修飾ｐ
ｓ−４が会合している修飾Ｐ〜４が分離される。

尚、洛飾ＰＳ−１、修飾ｐｓ−２、修飾ｐｓ−３、修ｆ
ｇｌｉ　Ｐ　Ｓ−４、修飾ｐｓ−５、修飾Ｐ−３及び修
飾Ｐ−４はそれぞれに対応する無修飾Ｐｓ−１、Ｐｓ−
２、ｐｓ−３、ＰＳ−４、Ｐｓ−５、Ｐ−３及びｐ−４
から前記ＩＡＩ）誘導体の修飾方法と同様にして製造す
ることもできる。

上記の如くして得られた無修飾ザ／ユニツ１〜の少なく
とも１種と所定のサブユニツＩ−の修飾体である修飾サ
ブユニットを会合さゼる′ことにより、混成ＩＡＰが生
成される。混成（ＡＰの会合例を下記に示す。

例ＩＰｓ−１（１モル）十修飾Ｐ−３＜１［ル）十修飾
Ｐ−４（１モル）　＋Ｐｓ−５（１モル）→混成ＩＡＰ
（１モル） 例２Ｐｓ−１（１モル）＋Ｐ−３（１モル〉→−修飾ｐ
−＋（１モル）十修飾Ｐｓ−５（ｒｒニル）→混成ＩＡ
Ｐ（１モル） 例３Ｐｓ−１（？モル）　十ｒ−）−３（１’Ｌ−ルン
十修飾Ｐ−４（１モル”）　＋ｐｓ−ｓ　　（１モル）
→混成ＩＡＰ（１［ル） 例４　修飾Ｐｓ−１（１モル）十Ｐ−３（１モル）→−
修飾Ｐ−４（１モル）　−１−ＰＳ−５（１モル）→混
成ＩＡＰ（１モル） 例５ｐｓ−１（１モル）十修飾ｐ−３’（１モル）＋修
飾Ｐ−４（１モル）十修飾Ｐ　ｓ−５→混成ＩＡＰ（１
モル） 例６　修飾Ｐｓ−１（１モル）十修飾Ｐ−３（１”Ｅル
）＋修飾ｐ−４（１モル）＋ｐｓ−５ →混成ＩＡＰ（１モル） 例７　修飾Ｐｓ−１（１モル）＋Ｐ−３（１モル）＋修
飾Ｐ−４（１モル）十修飾ｐ　ｓ−５→混成ＩＡＰ（１
モル） ）Ｕ成ＩＡＰを生成するのに有利な会合条件の幾つかを
下記に例示する。

１、会合系のｐｆｌ　：　　ｐｉ−１５〜１０好ましく
はＩＩＨ６〜８゜ ２、会合溶媒：　　０．０１〜０．５Ｍ＊Ｉｆｔｆ緩１
Ｍ　（０，５〜５ＭＩ木素含有） ３、各成分の蛋白濃度＝　１μｇ〜２＋１＋１Ｊ／１１
１＋４、会合温度二　０〜４０℃ ５、会合時間：３０分〜７２時間 得られた混成ＩＡＰは、無修飾ＩＡＰとほぼ同等の有効
薬理活性を右しながら、白血球増多作用が減弱されてい
る。

以下、本発明に係る生成物の精製方法、修飾率の定量法
、電気泳動法、活性測定法等を詳細に説明する。

■、精製方法 反応生成物の２〜３ＩＩ１ｇをセファクリル３−２００
カラム（ファルマシアファインケミカルズ社製：１．５
Ｘ　９５ＣＩｌｌ）を使用し、０．１Ｍ燐酸Ｍ衝液（ｐ
Ｈ７，０，２Ｍの尿素を含有している）を流出液として
ゲル濾過する。各分画の蛋白量は１−ｏｗｒｙらの方法
により、ウシアルブミンを標準蛋白として測定する。

■、修飾率の定量 無修飾ＩＡＰ　（対照）及びＩＡＰ誘導体の各精製試料
を蒸溜水に溶かしく５００μＱ　／ｍｌ）　、その水溶
液４００μｍ　ニ４％Ｎａ　ＨＣＯ３（１）８９．０）
及び０．１％トリニトロベンゼンスルホン酸４００μｍ
を加えて、３７℃で２時間反応後に１０％５ＤＳ４００
μｍを加え３７℃でさらに１０分間放置後、ｌＮＭＣＩ
４００μｔを加えて３３５μｍの吸光度を分光計（１３
９ＨＩＴＡＣＨＩ　　ＵＶ−Ｖｉｓｓｐｅｃｔｒｏ−ｐ
ｌ＋ｏｔｏｍｅｔｅｒ　）により測定する。無修飾ＩＡ
１つまたはサブユニットの吸光度を１００％として、修
飾により生成したＩＡＰ誘導体または修飾サブユニット
の吸光度を百分率で求めることにより修飾率を定ｍする
。

ｌ−」已し乙り力Ｊヒ乙且上］ンＬニゲヱ２９電気泳動
法 Ｉ　Ａ　Ｐ　ｇ　導体の純度は、ポリアクリルアミドゲ
ル（ポリアクリルアミド濃度７．５％、　　ＩＮＫＯＨ
−酢酸緩衝液（ｐｈ＋　４．３）　）ディスク電気泳動
法によって検定される。尚、グル１本当たりの試料は３
０μｇ　（蛋白量として）通電は４ｍＡで２時間行ない
、染色はアミドブラック１０ＢＹ’行ない、脱色は１．
５％酢酸溶液で行なう。

ＩＶ　、■ビネフリン高面糖抑制活性（Ｅｐ　Ｉ活ｆｉ
　）ウィスター系雄性ラット（約１５０ｇ）に静注で各
試料１２μｇ／ｋａを投与し、投与後経口的に絶食下エ
ピネフリン（２００μ（］／ｋ（］）を皮皮下用し、■
ビネフリン投与前と投与から１時間後の血糖値の差をコ
ントロール群のそれと比較することでＥｐＩ活性（％）
を求める。

ΔＧＣ：コントロール群［（１ピネフリン投与後の血糖
値）−（投与前の血糖値）１ ΔＧ□：薬物投与群［（Ｉビネフリン投４後の血糖値）
−（投与前の血糖値）］ Ｅｌｌ　［活性（％＞　＝＝　ＩＪＣ，”Ｇ　　　×１
ｏ。

Δ（（ｃ ■、白血球増多活性（ΔＩ−Ｐ゛１ ウィスター系雄性ラット（約１５０（］）に静注で各試
料１２μ（］／ｋｏを投与し、杼口的に白血球数を測定
し、コントロール群の白血球数との差をもって増加する
白血球数を求める。

△Ｌ　Ｐ活性−（薬物投与群の白血球数）−（コントロ
ール群の白血球数） Ｖｌ、ＩＡＰＯ）製造および精製 特願昭５２−１０３９７月明細古く特開昭５３−９６３
９２号公報）、特願昭５２−４９６４１号明細書く特開
昭５３−１３（ｉ５９２号公報）並びに特願昭、５５−
１４２３２３号明細山（特開昭５７−６７５９１号公報
）を参照しなから［Ａ　Ｐを調製する。

ＩＡＰの物性に関し下記に詳述する。

存在状態及び溶解特性： 脱塩後、凍結乾燥して得られる粉末は、非潮解性白色ま
たは淡褐色粉末であり、約３〜５１１１（１／ｍｌまで
は室温で水に溶解、６Ｎ　　ｌ１ｃＩ中では不溶性自沈
を生じ、ピリジン、ドデシル硫酸ナトリウム、メルカプ
トエタノール、システィン溶液に溶解する。冷時〈　４
℃）、精製活性物質の溶液に硫安、トラスアイス・アセ
１ヘンあるい゛はエタノール、トリクロル酢酸、塩化亜
鉛溶液及びその他の数種の金属イオンを含む溶液等の添
加により、各々白濁、沈澱を生ずる。水とクロロホルム
あるいはｎ−ブタノール混合液では不溶性となり両液の
界面に集まる。

ＩＡＰの水溶液を８０″Ｃ以上に加温すると白濁する。

０．５Ｍ　　ＮａＣｌ含有０．１Ｍリン酸緩衝液（１）
８７．０）に対しｌ　Ａ　＋）を溶解し、次いぐ蒸溜水
を外液として透析すると、一時白濁するが透析の続行に
より完全に再溶解し、白濁は消失する。また、高濃度溶
液では０．０１　Ｍ酢酸緩衝液（１）８４．５）に対し
、徹底的に透析すると淡褐色に着色して溶解することも
ある。

分子団： １０〜３０％の密度勾配のアクリルアミドゲル３７：１
の架橋比で、濃縮ゲルのｐｌ−１が６．８、泳動ゲルの
ＩＩＨが８．８、泳動電圧：９０■で１６時間泳動する
平板法５ＤＳ−ポリアクリルアミド−ディスク電気泳動
法くラムソー法）で処理した後、２０％ＴＣＡで１時間
処理し、次いでクマージーブルーで染色する。尚、蛋白
質のＳＤＳ化を１％ＳＤＳで１００℃５分間処理する。

５ＤＳ−ゲル電気泳動法によるＩＡＰの分子量は１０５
７００±５０００である。

組成： Ｌｏｗｒｙ法による蛋白質９８重量％以上である。

尚、各成分の測定方法は下記各文献に依った。

重工］（ Ｌｏｗｒｙ、　　ＯｏＨ，’、　　Ｎ、　　Ｊ、　　Ｒ
ｏｓｅｂｒｏｕｇｈ、　　Ａ。

Ｌ、　　Ｆａｒｒ、　　ａｎｄ　　Ｒ，Ｊ、　　Ｒａｎ
ｄａｌｌ。

Ｊ、　　Ｂｉｏｌ、　　ＣｈｅＩＩｌ、　　１９３’：
　２６５　　（１９５１）　　、蛋白質成分のアミノ酸
組成及び組成比（μＭ／１００μＭ’：　　　６Ｎ　　
ＨＣＩで１１０℃、２４時間加水分解、日立−８３５高
速アミノ酸分析器にて分析）： アスパラギン酸（Ａ　３＋１）　　７．５〜７．９、ス
レオニン（Ｔ　ｈｒ）　　６．８〜７．８、セリン（Ｓ
　ｅｒ）　　５．９〜７．６、グルタミン酸（Ｇｌｕ）
　　８．８−９．４、プロリン（Ｐ　ｒｏ）　　５．５
〜６．４、グリシン（Ｇｌｙ）８．７〜９．６、アラニ
ン（Ａｌａ）　　９．１〜１０．８、シスチン／２　　
（ＣＶＳ／２　）　　１．０〜２．０、バリン（Ｍｅｔ
）　　６．６〜７．６、メチオニン（Ｍｅｔ）　　２．
５〜３．３、イソロイシン（Ｉ　ｌｅ）　　３．６〜４
．１、ロイシン（ＬｅＬＩ）　　７．５〜８．７、チＬ
」シン（−１’ｙｒ）５．１〜６．６、フェニルアラニ
ン（Ｐｈｅ）３．７〜４．５、リジン（Ｌ　ＶＳ）　　
３．１〜４．４、ヒスチジン（Ｈｉｓ）　　０．９〜１
．４、アルギニン（Ａｒｇ）　　６．１〜６．６であっ
た。

等電点ｐＨ（ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動法
により泳動し、種々の標準蛋白との泳動パターンと比較
測定）　：　　９．３±０．２ディスク電気泳動パター
ン： アクリルアミドゲル（ポリアクリルアミド濃度７．５％
、１Ｎ　　ＫＯ）−１＝氷酢酸緩衝液（ｐｆ−１４，３
）　）　、試料３０μＱ、通電４１１１Ａ、　　２時間
／ゲル１本、アミドブラック１０Ｂによる染色、７％酢
酸溶液による脱色の条件下でのディスク電気泳動におい
て、距離（スペーサ・ゲル先端を基準として）２．３±
０．２ｃｍの位置に極め−Ｃ先鋭な単一のバンドを与え
る。

生物学的性質： 哺乳動物に対しインシュリン分泌増強作用及び耐糖能良
化作用を有し、これらの作用は１回の投与で数週間乃至
数ケ月にわたって持続する。

急性毒性（ＬＤ、ｏ）はｄｄＹ系マウ゛ス（静注）で約
２００μｇ／ｋｇ体重である。

以下、実施例を参照しながら本発明をより詳細に説明す
る。

実施例１　修飾サブユニットの調製 ａ）４ｍｇのＩＡＰを２Ｍ尿素を含有する０、１Ｍ燐酸
緩衝液（ＤＨ７，０）　２１１１＋に溶解し、ピリジン
−ボラン複合体３μｍをメタノール０．１ｍｌに溶解し
た溶液を加え（終部ＰＸ１５１１１Ｍ）、ホルムアルデ
ヒド（３７％ホルマリン２９．４倍希釈液１０μｍ　：
終濃度２０１１１Ｍ−）を加えて、室温（２０〜２５℃
）テ２時間反応させた。反応は１Ｍグリシン（０，５＋
ｎｌ）を加えて停止し、セルロースチューブを用いて蒸
溜水に透析して試薬を除ぎ、さらにセフ１クリルＳ−２
００カラム（１，７ｘ　１２．５ｃｍ）でゲル濾過し、
ＩＡＰ誘心体としてＩＡＰ還元メチル化物（修飾率９２
％）　　３．８ｍｇを得た。得られたＩＡＰｉＨ元メチ
ル化物は前記ディスク電気泳動法において単一バンドを
示″す。得られた還元メチル化Ｉ　Ａ　Ｐ　（４０１１
１ｇ）を０．０２　Ｍ燐酸二す］・リウム（ｐＨ８，５
，４Ｍ尿素含有）溶液（５〜１０１）に溶解し、同緩衝
液で平衡化したＤＥＡＥ−セファロースカラム（１，５
Ｘ１０ｃｍ　）に添加し、０．５Ｍ、　　ＮａＣｌによ
る直線的濃度勾配により溶出した。その溶出図を第１図
に示す。吸着画分であるビークＢは修飾ｐ　ｓ−１であ
るｐ　ｓ−１の還元メチル化物であり、８．４２ｍｇの
還元メチル化Ｐｓ−１が得られた。素通り画分であるビ
ークΔ（３５ｍｇ　）は、０．０５　Ｍ燐酸緩衝液（ｐ
Ｈ６，０，５Ｍ尿素含有）に対して１６時間透析した後
、同緩衝液で平衡化したＣＭ−セファロースＣＬ−６Ｂ
カラム（１，５ｘ　１ｓｃｍ）に添加し、０．２ＭＮａ
　Ｃｌを含む０．１Ｍ＊酸緩笥液（ｐｉ−１７，０，ｓ
Ｍ尿素含有）による直線的濃度勾配により溶出した。そ
の溶出図を第２図に示す。素通り画分であるビークＣは
、修飾ｐ　ｓ−５であるｐ’ｓ−５の還元メチル化物で
あり、３．１ｍＱの還元メチル化ｐ　ｓ−５が得られた
。ビークＤは修飾ｐ−４であるｐ−４の還元メチル化物
であり、１５．４ｍｇの還元メチル化Ｐ−４が得られた
。ビークＥは修飾ｐ−３であるｐ−３の還元メチル化物
であり、９．０ｍａの還元メチル化ｐ−３が得られた。

ｂ）　　　０．７ｍｇのＩＡＰ及び１８．５Ｉｌ１ｇ（
１５０ｍＭ　）の塩酸エチルアセトイミデートを、１Ｍ
尿素含有の１Ｍ炭酸緩衝液（ＤＨｌｏ、０）　１ｍｌに
溶解し、室２ｆｉＡ　テ２０分間反応させた。反応生成
物をセフ７クリルＳ−２００カラム（１，７ｘ１２５ｃ
ｍ　＞でゲル濾過し、ＩＡＰアセトアミジノ化物（修飾
率８２％）　　０．６ｍａｍミラ４゜この物質は前記デ
ィスク電気泳動法にお０て、単−のバンドを示す。この
ようにして得られた■ＡＰアセトアミジノ化物は上記実
施例１、ａ）に記載のＩＡＰ還元メチル化物と同様に４
Ｍ尿素存在下でのＤＥＡＥ−セファロースクロマトグラ
フィーにより修＠ｐｓ−１であるＰ　ｓ−１のアセトア
ミジノ化物（アセトアミジノ化ｐｓ−１）を、さらに５
Ｍ尿素存在下でのＣＭ−セファ０−スクロマ１〜グラフ
イーにより修飾ＰＳ−５であるｐ　ｓ−５のアセトアミ
ジノ化物（アセトアミジノ化ｐｓ−５）、修１１ｆｌｉ
Ｐ−４であるＰ−４のアセトアミジノ化物（アセトアミ
ジノ化Ｐ−４）、及び修飾Ｐ−３であるＰ−３のアセト
アミジノ化物）（アセトアミジノ化Ｐ−３）が得られた
。

Ｃ）　実施例１、ａ）及びｂ）に記述の修飾サブユニツ
１〜は、後述する実施例１、ｄ）の方法で得られた無修
飾サブユニットを、実施例１、ａ）及びｂ）に記述の方
法に従って、直接還元メチル化成るいはアセトアミジノ
化しても得ることができる。

無修飾ＩＡＰより単離されたｐ’ｓ−ｉ　７００μ９を
６．１１１１！Ｊ　（５０１Ｍ　）の塩酸エチルアセト
イミデートとともに、１Ｍ尿素含有の１Ｍ炭酸緩衝液（
ｐＨ１０，０）　ｉｍｌに溶解し、室温で２０分間反応
させた。反応生成物をセファクリル３−２００カラム（
１，７ｘ１２５ｃｍ　）でゲル濾過し、ｐ　ｓ−１アセ
トアミジノ化物（修飾率６０％）　　０．６ｍｇを得た
。

ｄ）　無修飾サブユニットの調製 特願昭５５−１４２３２３号明細書（特開昭５７−６７
５９１号公報）および特願昭５５−１４２３２４号明細
占（特開昭５７−６７５９２号公報）に開示の方法に基
づいて、無修飾Ｐｓ−１，Ｐｓ−２，Ｐｓ−３，Ｐｓ−
４，Ｐｓ−５，Ｐ−３，ｐ−４およびＣＰ−Ａを調製し
た。

ｅ）　混成Ｉ　Ａ　Ｐの合成 還元メチル化Ｐ−４（以下ＲＭＰ−４と略称する）溶液
２１　（濃度：　　５００μｇ／ｍｌ、溶Ｗ、：０．Ｉ
Ｍ燐酸緩衝液ｐＨ７，０，２Ｍ尿素含有）を無修飾サブ
ユニットｐ　ｓ−５溶液０．５１１１１　（濃度：　　
５００μｇ／ｍｌ、溶媒：　　０．ＩＭｖＡ酸Ｍ衝液ｐ
ｔ−１７，０，２Ｍ尿ｉ含有）と混合し、室温に゛Ｃ２
時間撹拌後、無修飾すブユー：ッｈＰ−３溶液２ｍｌ　
　（１度：　　５００μｇ／ｎ＋ｌ、溶ｔｓ：０．１Ｍ
燐酸緩衝液ｐｉ−１７，０，２Ｍ尿素含有）を添加し−
Ｃ温度４℃で１６時間撹拌後、さらに無修飾ザブユニッ
トｐ　ｓ−１溶液１．５１１１１　（濃度＝５００μｇ
／ｍ　ｌ　、溶！　：　　０．ＩＭｍｉＩＩｌ衝液ｐＨ
７，０，２Ｍ尿素含有）を添加し、４℃にて２４時間撹
拌し、次にフィコール４００（ファルマシアファインケ
ミカルズ社製）を使用して、約１ｍｌまで溶液を濃縮し
た。

濃縮された溶液をセファクリル３−２００カラム（１，
５Ｘ　９５ｃｍ）に添加し、０．１Ｍ燐酸緩衝液（＋）
Ｈ７，０，２Ｍ尿素含有）を溶出液として混成ＩＡＰを
溶出した。その溶出図を第３図に示す。

ビークＦは、各サブユニットが会合した混成ＩＡＰ　（
Ｐｇ−１，Ｐ−３，ＲＭＰ−４および“ｐｓ、−５から
なる会合体）であり、混成Ｉ　Ａ　Ｐ　２．０７ｍｇ　
　（収率５７．６％）が得られた。尚、ビークＧは未会
合のサブユニットである。

実施例２ 実施例１、ｂ）およびＣ）で得られたアセトアミジノ化
Ｐ−４（以下、ＡＡ−Ｐ−４と略称する）溶液０．７ｍ
ｌ　（濃度：１．４ｍｇ／ｍｌ、溶媒：　　０．ＩＭ燐
酸緩衝液吐６，７．５Ｍ尿素含有）を無修飾サブユニッ
トｐ　ｓ−５溶液０．５ｍ１Ｃ１１度：５００μＱ　／
ｍｌ、溶媒：　　０．１Ｍ燐酸緩衝液ｐ）（７，０，２
Ｍ尿素含有）と混合し、室温にて１時間撹拌後、無修飾
サブユニットＰ−３溶液２１　（濃度：　　５００μ（
１／ｍｌ、溶媒：０、ＩＭ＊酸緩衝ｌ　１）Ｈ７，０，
２Ｍ尿ＪＲ含有）ヲ添加して、４℃６時間撹拌後、さら
に無修飾サブユニットｐ　ｓ−１溶液２ｎ＋Ｉ（１１１
度：　　４００μｇ／ｍｌ、溶媒：　　０．０２　Ｍｍ
酸二ｔｔ−’ＪウムｐＨ８，３，４Ｍ尿素含有）を添加
し、４℃にて１６時間撹拌し、フィコール４００で約１
１まで濃縮後、セファクリルＳ−２００カラム（ｉ、ｓ
ｘ　９５ＣＩｌｌ）　ニ添加し、０，１Ｍ＊１緩衝液（
ｐＨ７，ｏ、２Ｍ尿素含有）を溶出液として混成ＩＡＰ
を溶出した。その溶出図は、第３図とほとんど同じであ
り、混成ＩＡＰ　１．２３　＋＋＋ｏ（収率４４．２％
）が得られた。

実施例３〜１０ 実施例１および実施例２と同様にして、種々の混成［Ａ
Ｐを生成した。その組成、収量および収率を第１表に示
す。尚、ＲＭは還元メチル化物、ＡＡ−はアセトアミジ
ノ化物を示す。

（以下余白） にＬ五 これら混成ＩＡＰは、ディスク電気泳動において　１本
のバンドを示す。

実施例 前記実施例で得られた混成ＩＡＰの薬理活性および急性
毒性に関して次に記述する。

＜ｉ＞　　実施例１〜１０で得られた混成ＩＡＰをＷｉ
ｓｔａｒ系雄性ラットに１２μ（１／ｋｉｌｌ静注投与
し・投与から１日後の各活性値を第２表に示づ。尚、対
照は無修飾ＩＡＰである。

（以下余白） 凪−」し−人 （ｉｉ）急性毒性値 前記実施例で得られた混成ＩＡＰのｄｄＹマウス（雄性
）に対する静注による急性毒性値＜ＬＤ５．）のいくつ
かを第３表に示す。尚、対照は無修飾ＩＡＰである。

（以下余白） 巌≦Ｌ五 以上、詳述の通り本発明の混成ＩＡＰは、糖尿病の治療
および予防薬として極めて有用であり、人体に対する有
効量はＩＡＰのそれとほぼ同等であるが、活性物質の比
較活性に応じて固形物とし゛Ｃ約数１０Ｕ　ｎ１ｔｓ／
　ｋｏ　（体重）〜致方ｔＪ　ｎ１ｔｓ／　ｈｇ（体重
）の範囲である（活性単位の定義は、特願昭５２−１０
３９７号明細書参照）。

患者に対する投与方法は、静脈内投与が最も有効であり
、その細膜腔内、筋肉内および皮下投与、あるいは消化
管内への直接投与、経口投与、直腸内投与および舌下、
皮肉、の粘膜、動脈、リンパ乃至気管投与も有効である
。

投与形態としては、各活性用途とも注射液、座剤、腸溶
剤、胃溶剤、舌下錠および吸入剤等を例示し得る。注射
液の最も単純な組成を例示覆れば、インシュリン分泌増
強活性１０，０００（Ｊ　ｎ１ｔｓ。

ＮａＣ１９ｍｇおよび滅菌蒸溜水で１１としたものをあ
げ得る。

又、薬剤に調合する際に、活性を劣化せしめることのな
い任意の他成分を混合し得ることも当業者にとり自明で
あろう。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１におけるＤＥＡＥ− ３ｅｐｈａｒｏｓｅ　　ＣＬ−６Ｂカラムクロマトグラ
フイーに関する溶出グラフを示す図であり、第２図は実
施例１におけるＣＭ　−３ｅｐｈａｒｏｓｅ　　Ｃｌ−
６Ｂカラムクロマトグラフイーに関する溶出グラフを示
す図であり、第３図はセファクリル３−２００カラムを
使用して混成ＩＡＰを分離したときの溶出状況に関する
グラフを示す図である。 Ａ：素通り画分を示すビーク ３：ｐｓ−１の還元メチル化物を示すビークＣ：素通り
画分を示すピーク Ｑ：ｐ−４の還元メチル化物を示すピークＥ：Ｐ−３の
還元メチル化物を示すビークＦ：混成ＩＡＰを示ずビー
ク Ｇ：未会合のＩＡＰサブユニットを示ずビーク代理人弁
理士今　　村　　　元 第１図 フラグジョンａｔ クラクション沓号

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. （１）　ボルデテラ属産生インシュリン分泌増強活性物
   質を構成している蛋白性サブユニット物質の少なくとも
   １種と、所定の蛋白性サブユニット物質の修飾体である
   蛋白性修飾サブユニット物質とからなる混成インシュリ
   ン分泌増強活性物質。
2. （２）　蛋白性修飾υブユニット物質がボルデテラ属産
   生インシュリン分泌増強活性物質に、式（式中、「く□
   　は水素、０Ｌ−０４の低級アルキル基、クロルメチル
   基、β−ヒドロキシエチル基、エトキシカルボニルメチ
   ル ニル基、ｐ−ヒドロキシフェニル基またはナフトキシメ
   チル基；Ｒ２　はＣエ　〜Ｃ４　の低級アルキル基であ
   る）で示されるアミジノ化剤を及応させて得られるイン
   シュリン分泌増強活性物質のアミジノ化物を解離処理し
   て得られる修飾サブユニット物質であることを特徴とす
   る特許請求の範囲第１項に記載の混成インシュリン分泌
   増強活性物質。
3. （３）　蛋白性修飾サブユニット物質がボルデテラ属産
   生インシュリン分泌増強活性物質を解離処理して得られ
   る蛋白性サブユニット物質に式（式中、Ｒ　は水素、Ｃ
   　〜Ｃ，の低級アルキル１ 基、クロルメチル基、β−ヒドロキシエチル基、エトキ
   シ力ルポニルメヂル基、ベンジル基、）１ニル基、ｐ−
   ヒドロキシフェニル基またはナフトキシメチル基：Ｒ２
   はＣ工〜Ｃ４の低級アルキル基である）で示されるアミ
   ジノ化剤を反応させて得られる修飾サブユニット物質で
   あることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の混
   成インシュリン分泌増強活性物質。
4. （４）　蛋白性修飾サブユニット物質がボルデテラ属産
   生インシュリン分泌増強活性物質に式Ｒａ　−Ｃ−Ｒ４
   （式中、Ｒ３は水素原子またはメ１ チル基を示し、Ｒ４は水素原子またはＣ□〜Ｃ３の低級
   アルキル基を示す）で示されるカルボニル化合物または
   ビリドキサルリン酸を還元剤の存在下に反応させて得ら
   れるボルデテラ属産生インシュリン分泌増強活性物質誘
   導体を解離処理して得られる修飾サブユニット物質であ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の混成
   インシュリン分泌増強活性物質。
5. （５）　蛋白性修飾サブユニット物質がボルデテラ属産
   生インシュリン分泌増強活性物質を解離処理して得られ
   る蛋白性サブユニット物質に、式Ｒ，−９−Ｒ４（式中
   、Ｒ３は水素原子またはメチル基を示し、Ｒ４は水素原
   子または０１〜Ｃ３の低級アルキル基を示す）で示され
   るカルボニル化合物またはピリドキサルリン酸を還元剤
   の存在下に反応させて得られる修飾サブユニット物質で
   あることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の混
   成インシュリン分泌増強活性物質。
6. （６）　蛋白性ザブユニット物質が、ボルデテラ属産生
   インシュリン分泌増強活性物質を構成しているＰｓ−１
   ，Ｐ−３，Ｐ−４およびｐｓ〜５からなる群から選択さ
   れるサブユニット物質であり、蛋白性修飾サブユニット
   物質が修飾Ｐｓ−１，修飾Ｐ−３゜修飾Ｐ−４および修
   飾Ｐ　ｓ−５からなる群から選択される修飾サブユニッ
   ト物質であることを特徴とする特許請求の範囲第１項乃
   至第５項のいずれかに記載の混成インシュリン分泌増強
   活性物質。
7. （７）　サブユニット物質Ｐ−３がｐ　ｓ−２とｐ　ｓ
   −４とからなる会合体であることを特徴とする特許請求
   の範囲第１項乃至第６項のいずれかに記載の混成インシ
   ュリン分泌増強活性物質。
8. （８）　リブユニット物質Ｐ−４がｐ’ｓ−３とｐ　ｓ
   −４とからなる会合体であることを特徴とする特許請求
   の範囲第１項乃至第６項のいずれかに記載の混成インシ
   ュリン分泌増強活性物質。
9. （９）　修飾サブユニット物質Ｐ−３が修飾ｐ　ｓ−２
   と修飾Ｐ　ｓ−４とからなる会合体であることを特徴と
   する特許請求の範囲第１項乃至第６項のいずれかに記載
   の混成インシュリン分泌増強活性物質。
10. （１０）　　修飾サブユニット物質Ｐ−４が修飾ｐ　ｓ
    −３と修飾ｐ　ｓ−４との会合体であることを特徴とす
    る特許請求の範囲第１項乃至第６項のいずれかに記載の
    混成インシュリン分泌増強活性物質。
11. （１１）　　混成インシュリン分泌増強活性物質が下記
    組合せ（＋　）乃至（ｖｉｉ　）、 （ｉ）　　　（Ｐｓ−１）、（Ｐ−３）、’（修飾Ｐ−
    ４）　。 （修飾Ｐｓ−５）　； （ｉｉ）　　　（修飾Ｐｓ−１’　）　、　　（Ｐ−３
    ）　。 （修飾Ｐ−４）　、　　（ＰＳ−５）　；（ｉｉｉ　）
    　　（Ｐｓ−１）、　　（修飾Ｐ−３）。 （修飾Ｐ−４）　、　　（ＰＳ−５）　：（ｉｖ）　　
    　（Ｐｓ−１）、　　（修飾Ｐ−３）。 （修飾Ｐ−４）、（修飾Ｐｓ−５）　：（Ｖ）　　（修
    飾Ｐｓ−１）、（修飾Ｐ−３）。 （修飾Ｐ　４）　、　　（１）ｓ−５）　；（ｖｉ）　
    　　（修飾Ｐｓ−１）　、　　（Ｐ−３）　。 （修飾Ｐ−４）、（修ｆｌｉｌ＋Ｐｓ−５）　；および （ｖｉｉ　）　　（Ｐｓ−１＞、　　（Ｐ−３）　、　
    　ＤＩ飾Ｐ−４）。 （Ｐｓ−５） の群から選択されるサブユニット物質および修飾Ｖブユ
    ニット物質の組合せの１種を会合し°Ｃ得られる会合体
    であることを特徴とする特許請求の範囲第１項乃至第１
    ０項のいずれかに記載の混成インシュリン分泌増強活性
    物質。
12. （１２）　　蛋白性修飾サブユニット物質１分子中に存
    在するアミノ基の４〜９５％が修飾されていることを特
    徴とする特許請求の範囲第１項乃至第１１項のいずれか
    に記載の混成インシュリン分泌増強活性物質。
13. （１３）　　ボルデテラ属産生インシュリン分泌増強活
    性物質を構成している蛋白性サブユニット物質の少なく
    とも１種と、所定の蛋白性サブユニット物質の修飾体で
    ある蛋白性修飾サブユニット物質とを会合させることを
    特徴とする混成インシュリン分泌増強物質の製法。
14. （１４）　　ボルデテラ属産生インシュリン分泌増強活
    性物質を修飾処理して後に解離処理して蛋白性修飾サブ
    ユニット物質を生成することを特徴とする特許請求の範
    囲第１３項に記載の製法。
15. （１５）　　ボルデテラ属産生インシュリン分泌増強活
    性物質を解離処理して無修飾の蛋白性サブユニット物質
    を得、得られた蛋白性サブユニツ１へ物質を修飾処理し
    て蛋白性修飾サブユニット物質を生成することを特徴と
    する特許請求の範囲第１３項に記載の製法。
16. （１６）　　修飾処理のための修飾化剤が、式（式中、
    Ｒは水素、０１〜Ｃ６の低級アルキル基、クロルメチル
    基、β−ヒドロキシ１チル基、エトキシカルボニルメチ
    ル基、ベンジル基、）工ニル基、ｐ−ヒドロキシフェニ
    ル基及びナフトキシメチル基：Ｒ２はＣ４〜Ｃ，ｆの低
    級アルキル基である）で示されるアミジノ化剤、式 の低級ノフルキル基を示す）で示されるカルボニル化合
    物またはビリドキサルリン酸であることを特徴とする特
    許請求のＷ！囲第１３項乃至第１５項のいずれかに記載
    の製法。