JPS59118091A - エタノ−ルの製造方法 - Google Patents

エタノ−ルの製造方法

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JPS59118091A
JPS59118091A JP58212642A JP21264283A JPS59118091A JP S59118091 A JPS59118091 A JP S59118091A JP 58212642 A JP58212642 A JP 58212642A JP 21264283 A JP21264283 A JP 21264283A JP S59118091 A JPS59118091 A JP S59118091A
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fermenter
producing
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マ−セル・フアバ−
ジエロ−ム・デ−・バ−ンステイン
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    • C12P7/02Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06Ethanol, i.e. non-beverage
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N1/00Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16Yeasts; Culture media therefor
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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12R2001/00Microorganisms ; Processes using microorganisms
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  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はエタノールの製造方法、特KD−糖からエタノ
ールを製造する方法に関する。属サツカロミセスの酵母
は、一般的に天然に産出するD−糖の変種からエタノー
ル看:生成できる良好なアルコール発酵であることは知
られている。サツカロ一般的に用いられている。通常の
生長苛性は糖により供給される炭素およびエネルギー源
、アンモニウム塩、尿素またはペプトンと[−て供給さ
れる窒素源、およびもし若干の天然に生ずる第1を供給
材料に存在していなければ酵母エキスの形態で供給でき
るある種のビタミン源(特にB−複合体源)を包含して
いる。他の必要な物質ノして無機質源または水が、天然
に生ずる供給相打に存在していなければ酵母エキスの形
態で供給することができる。
一般に、酵母は二つの環境条件下でエタノールを生ずる
。これらの条件は(a) 酸素の欠乏(−1Xわち、酸
素制限条件)または(b)高い糖含有(11の存在であ
る。
D−糖からエタノールを作る場合には、A’−続培養に
よって作る必要がある。連続培養は細胞の繁殖を−維持
する必要がある。細胞濃度は、細胞生長速度を+fl1
1胞の消耗または死滅する速度に等しくなる場合に定常
状態にあるようにする。稀釈速度は供給速度に比例し、
かかる定常状態において有機体、すなわち、酵ffi突
然変異株の特定生長速度に等しくする。
エタノールを生成する工業的な連続発酵方法において、
発酵槽流出物における糖濃度はゼロ近くにする必要があ
る。しかしながら、酸素は生長のp−めの必須栄養素と
して酵母にとって必要とされるから、連続発酵は完全な
嫌気条件下で行うことができない。
弗素制御は、庄−発酵槽を用いる場合には、特に連続−
■−タノール培養において臨界的である。酸素が多くな
ると酸化酵素形成を導ひき、このためVC多くの酵IU
、細胞がエタノール生成全犠牲にするミトコンドリア生
物発生(m1tochondrial bioge−n
esis )を生ずる。酸素が少なすぎると生長が停止
し1、このため連続培養が全く不能となる。
エタノールへの連続発酵は、酵素を活性状態に維持する
目的のために、制御さ力た少1石の画素を連続発酵槽に
添加することによって<−iつことができる。この事は
シセウスギーG、R,およびウイルケ0、R,氏「Bi
otechnol、 Bioeng、J 2tl 、 
l 421 (197B)に記載さすtている。
D−糖のエタノールへの連続発酵において、発酵槽の容
n<単位当りエタノールの高い生成割合は望捷しいが発
酵槽の大きさおよびコストに制限される。発酵槽は酵母
細胞を再循環できる↓うeこすることができる。発酵槽
流出物からの醇fせ、Te11胞の分離を容易にするこ
とはかかる再循Fiを行う」−にとって好ましいことで
ある、サツカロミセス セレビシェ−の慣習菌株は発酵
槽流、出物から分離するのが困難であり、高価な遠lし
分離およびθゴ過装置を用いる必要がある。しかし、遠
心分離した酵母は再循環効率を低下する多量の付着液体
を有しているために、再循環エタノールの発酵速度が減
少する。
サツカロミセス酵母の凝固菌株(flocculati
oBStrainS )は発酵槽流出物から分離しやす
ぐなり、経費のかがる遠心分離が不必要となる。
T<ha突然変異株と称されている呼吸−欠乏酵母突然
変異株(respiration −deficien
t yeastmut−ants )(RDM) (ア
イビアS、ンーダMおよびナノチネM氏「Biotec
hnol、Bioeng 、J 10 、845 (1
9,68))fl過剰酸素の存在でグルコースをエタノ
ールに発酵できる。この事は酸素添加を正確に制御する
必要がなく、このために多くのプロセスの制御を軽減で
きるので有利である。十分に通気を行う通常の条件下で
は不十分なエタノール生成が生ずる。なぜならば、良く
知られているパストール作用が、細胞により必要とされ
るエネルギーを誘導するためにエタノール生成をバイパ
スする一連の反応においてグルコースが代謝する場合に
生ずるためである。この反応系列は多くの酵素を含んで
おり、酵素がこの系列において、末端電子受容体として
作用するから呼吸と称される。このプロセスに伴う生産
性の損失を避けるために、突然変異を呼吸活性の消耗に
よって生ずる酵素に誘導することができる。この突然変
異株はアクリフラビン染料を用いるポリスニーフルシー
氏により最初に記載された標準処理によって調製するこ
とができる( unites Biologiques
 Dourees de Contin −)   u
ite Genetique、バリー、6〜7月、ペー
ジ165〜180 、 O,M、R,S出版、パリ=(
1949) )。
コロニーの大きさに作用するベチテ(petite5 
)として知られているこの突然変異は好気環境における
エタノール生成に対して極めて安定で、許容でき、この
ためにパストール作用は避けられる。
アイピア氏らにより記載されているサツカロミセス セ
レビシェ−の呼吸−欠乏突然変異株によるエタノール生
成割合は1時間当りにおいて発酵槽容積17当p 1.
699だけである。Rho突然変異株のこの活性度は1
チのエタノール濃度によって抑制される。このため、供
給ゲルコール濃度は2 C) 171以上にしないよう
にし、またエタノールの収量を10 f/I!またはl
qb越さないようにするが、この事はプロセスを工業規
模に拡大する場合には困難になる。更に1 このシステ
ムから得られる細胞乾燥物は2.2 ?、/l程度であ
った。
上述においては、呼吸−欠乏突然変異株(RDM)HD
−糖からエタノールを工業的に生成するのに有利に用い
ることができないことを示している。
このために、後述するように本発明において空気ノ存在
でエタノールを高収率で生ずるサツカロミーhx  ウ
バリウム(saccharomyces uvarum
 ) (7)呼吸−欠乏突然変異株(RDM )を見出
した。
本発明はエタノールをD−糖から生成する連続方法を提
供する。
本発明の方法は: (a)  発酵111をサツカロミセス ウバリウムノ
凝集菌株の呼吸−欠乏突然変異株で接種し;(b)  
D−糖、窒素源、ビタミン源および無機質源の混合物を
前記発酵圏に酸素含有ガスの存在で供給し;および (C)  カカルD−糖混合物をエタノール生成物全生
成するのに十分な長時間にわたって発酵することを特徴
とする。
この本発明の方法は一過基準(once −throu
ghbasis )または細胞再循環によって操作する
ことができる。細胞再循環は発酵槽流出物から分離する
酵母細胞を再循環して発酵槽に戻すことによって発酵槽
において酵母細胞の密度を高める◎この事は1時間当り
における発酵槽容積単位当りのエタノール生成による発
酵槽の生産性な高める。
細胞再循環操作において、発酵圏の内容物、すなわち、
使用済液(糖の存在しない)の均質混合物はオーバーフ
ローアーム(0VerflOW arm l f介して
細胞沈降タンクに溢流させる〜再循環ループを設けるこ
とによって高い固体含有量のスラッジを細胞沈降タンク
の底部から発酵圏に再循環して戻すと共に・低い固体含
有量の液体を蒸留するために細胞沈殿タンクのオーバー
フローアームから溢流する。
また、本発明においては細胞を再循環量°外の1mの手
段を用いて適当に収集することができる。
本発明において実際的に好ましいD−糖はD−グルコー
スである〇エタノール’tD−糖から生−成する場合、
使・用するのに好ましい呼吸−欠乏突然変異株酵母はサ
ツカロミセス クバリウムの凝固菌株から得る。がかる
D−糖の発酵において、発酵培地は特定する変えつるグ
リコース以外は培地と同じ組成を有している。培地は1
10℃、1 、055kg/J (15psig)で8
0分間にわたりパッチで滅菌するか、またはこれらの条
件下で連続的滅菌することができる。
高い凝集剤(f’1OcOulant )呼吸欠乏突然
変異株はサツカロミセス ウバリウムATO02660
Bの菌株から作る。好気バッチ培養において、突然変異
株はアルコール、すなわち、エタノールを親株よシ約5
0%高い割合で生成することを確めた。本発明を連続シ
ステムで実施する場合に=1)システムは任意に必要な
運転停止をすることな(200日以上にわたり安定に維
持できたこと、2)酵母の高い凝集を細胞のスラッジの
発酵圏への返送にノ よって選択できること、および8)突然変異を操作中、
すなわち、200日以上にわたって安定に維持できたこ
とを確めた。
サツカロミセス ウバリウムAT(302660gの突
然変異株の添加において、サツカロミセスセレビ、シ玉
二ATC08a4 、 ATOO4126、ATOO9
76B 、 ATOO24858およびATGO426
94の突然変異株、および、。
サツカロミセス ウバリウムATO02845の突然変
異1株をD−糖からエタノールを生成する本発明の方法
に用いることができる。
本発明の呼吸−欠乏突然変異株(RDM)、すなゎち、
菌株ATOO26602の突然変異株はパン酵母の突然
変異株を作るためにスズキナガイ氏により    ゝ「
5cience J vol、 18o 、ページ11
88〜1189(1959年lO月)に記載されている
方法で作ることができる。
次に翫本発明を添付図面により更に詳述する。
図面に示すように、細胞再循環によるシステムで本発明
の連続方法を実施する場合に、先づ供給材料を供給装置
lOから発酵圏、すなわち、発酵槽12に圧送し、こ\
で材料はサツカロミセス ラバ先’7 m ATOO2
6602の呼吸−欠乏突然変異株の+・分な分量の細胞
で接種する。供吟材料は嬬動ポンプ(peristal
ic pump ) 1 Bによってライン11を介し
て850呪容積の発酵槽12に圧送する。
発酵槽12はコイル82で自動温度調節して供給材料を
所望温度に維持する。発酵槽12ノの内容物に空気源8
0から酸素含有ガス(例えば、空気)を吹込み、攪拌機
84で攪拌する。発酵槽IBからの材料はライン26を
介してa o o mt容槓の細胞沈降タンク14に溢
流させる。低い酵母含有量の発酵材料の1部分は沈降タ
ンク14からライン214i介してエタノール生成物と
して溢流させる。
酵母の高含有量の他の部分は第二嬬動ボング22により
ライン20を介して発酵槽12に再循環し、こ\で更に
発酵させてエタノール生成物を生成させる。酵母を含有
する残部は第三嬬動ポンプ16によってライン18を介
して酵母コレクターに送る。
特に、エタノールを生成する本発明の連続方法を実施す
る場合には、D−グルコースを空気と呼吸−欠乏酵母突
然変異株、すなわち、サツカロミセス  ウバリウムの
凝固菌株の突然変異”株の存在で発酵圏、すなわち、発
酵槽12に供給することができる。このD−グルコ−ス
に窒素含有材料、すなわち、窒素源、ビタミン源および
無機質源を添加して酵母突然変異株の生長を十分に維持
する。。
次いで、D−グルコース、窒素源、ビタミン源および無
機質源の混合物をエタノール生成物を生成するのに十分
な時間にわたって発酵する。このプロセスにおいて、酵
母は十分な長時間の間に沈降タンク14において沈降さ
せ、次いで発酵圏、すなわち、発酵槽12に再循環して
エタノールの生産高を実質的に高める。
酵母の通常の生長要件は生長細胞に対する他の分子を作
る炭素源としておよびエネルギ源として作用する有機炭
素化合物(すなわち、lまたFi[・種以上の糖からな
る炭素化合物)を含んでいる。
また、この生長のためには有機または無機窒素源を必要
とする。この事はアンモニウム塩、尿素またはペプトン
、利用しうる形態の窒素を含有する酵素によって生成す
る氷解物の形態で供給することができる。
本発明においては、呼吸−欠乏突然変異株(RDM) 
i使用することによって一連の多段発酵槽を有する必要
性を除去することができる。通常、連続エタノール創造
を実施する場合には一連の8個までの発酵槽を用いるこ
とができ、このうちの初めの数個の槽は多くの細胞を生
成する目的のために空気吹込みし、後の発酵槽は細胞に
よりエタノールを生成する目的のために嫌気的に操作す
る。
呼吸−欠乏突然変異株(RDM)の使用によって多段発
酵槽に対する必要性を除去することができる。
なせならば、酸素はエタノール生成において有害作用を
与えることなくして細胞生長するのに添加できるためで
ある。
本発明方法に用いることのできる酵母の多くの菌株は無
機質およびある種のビタミン、特に酵母エキスの形態で
しばしば得られるB−複合体のビタミンの存在で良く生
長する。また、ペプトンおよび酵母エキスはそれぞれ必
要とされる無機質および極微量元素を供給する、 本発明方法におけるビタミン源および無機質源に[デフ
コ  サーチファイド(Difco 0ertifie
cl)jバクト酵母エキス(Bacto yeast 
B;xtract )の商品名で市販され、ミシガン州
デトロイドのデフコラボラトリース(Difco La
boratories ) テ製造された酵母エキスで
得ることができる。
また、酸素は一般に発酵槽に空気を吹込んで液体表面に
適当なガス移動を得る一つの生長要件である。
アルコール燃料工業において要求される多量の酵母を使
用する場合には、酵母を連続フ′ロセスで生長すること
ができる。連続培養においては、供給材料を発酵槽に一
定速度で圧送し、細胞およびアルコールを含有する使用
済液体全一定速度でオーバーフロー アームから溢流す
る。温度、pH。
攪拌速度および空気吹込速度は、一般に標準自動操作に
より一定値に維持する。生物学的「定常状態」の変化は
、糖が発酵槽に導入され直ちに消費される場合におよび
細胞密度を一定に維持し、力)つ細胞を代謝的活性状態
に維持するように生長速度を稀釈速度と一致させる場合
に得られる。また、エタノール生成速度は一定に維持す
る。供給D−糖濃度および稀釈速度は、このシステムに
おいて定常速度条件全保持するおる最高値においてエタ
ノール生成を最大にするように操作することカニできる
。また、細胞再循環の機能としては活性細胞を発酵槽に
戻して高い細胞密度を維持するこの目的に指向する他の
確立された技術を用いることができる。
本発明方法において用いる供給培地はD−グルコース、
酵母エキスおよびペプトンを含有させることができる。
グルコースは発酵に対する抑制剤(limiting 
agent )であるから、発酵槽12に導入されるや
直ちに使用される。この事は上述する定常状態の一つの
特徴である。この結果、発酵槽クルコース濃度は常にゼ
ロ近くになる。
本発明方法の実施において、使用することのできるD−
糖は単糖類(例えばグルコース、ガラクトースおよびフ
ラクトース)、三糖類(例えばマルトース、スクロース
おヨヒメリヒオース)、およびラフィノースの如き三糖
類からなる群から選択することができる。甘しょ糖蜜お
よび殿粉水解物は本発明方法に用いることのできる種々
の糖の1例である。
本発明方法において、発酵開始は発酵槽をサツカロミセ
ス ウバリウムの呼吸−欠乏突然変異株の十分な量の細
胞で接種することを包含している。
エタノール生成において、約110〜約’150r/j
D−グルコース、1%ペフトンおよび0.5チ酵母エキ
スを含有するpH2,5(HOL)および110℃で1
.055切値”(15ps詔)、80分間滅菌した供給
材料を発酵圏に5.0〜5.5m//分の速度で供給す
る。
発酵槽12(容積85 (I ml )に空気を吹込み
(約0.4 //分)、500R,P、M、で攪拌し、
約80〜約85℃の範囲の温度で温度調節し、自動滴下
によってpHを4.0に維持する。発酵槽からの溢流を
600 mlの細胞沈降タンクに送シ、こ\から沈降細
胞およびプロスのスラッジを発酵槽に適当な速度で戻す
。最適再循環速度において、比較的高い固形分のスラッ
ジは発酵槽に戻すけれども、しかしシステムをふさいだ
りまたは運転停止することがあまり生じない。ビールま
たは低固形分含有物は収集するために細胞沈降タンクの
オーバーフローアームから溢流させる。グルコースはエ
タノールに約4.0〜約7.OW/V%の範囲および1
時間当りにおいて発酵槽容積1/当りエタノールの5(
1以上の生産量で転化する。この生産高は細胞再循環を
行う連続システムを用いてサツカロミ2 ウバリウムま
たはサツカロミセスセレビシエ二の他の菌株と比較して
高い。こ\に示す生産高は発酵槽の有効容積に基づくも
のである。発酵槽からの溢流は0.1 ?/l以下のグ
ルコースを含有している。この事は、発酵が発酵槽1z
において殆んど完全に完了していることを示している。
次に、本発明を例について具体的に説明する。
突然変異株−母のエタノール生産高およびエタノール生
成におけるその有効性を定めるために、先づサツカロミ
セス ウバリウムATOO2661の親株を制御に関し
て予じめ定められた条件下でエタノールを生成する能力
を調べるために試験した。
この最初の試験において、連続発酵システムの発酵槽に
245 f/lグルコース、1%ペプトンおよび0.5
1酵母エキスを含有する滅菌培地850frLI!を装
填し、サツカロミセス ウバリウムATOO2660B
親株で接種した。混合物をl)H4,5(自動滴下で)
、82℃に維持し、空気を0.417分の割合で吹込み
、5 U OR,P、M、で攪拌【7た。混合物を、麦
芽汁中のグルコースが欠乏するまで発酵させ、48時間
後にエタノール含有量が21.41で理論値の48%で
あることを確めto 親株に関する突然変異株のエタノール生産高を比較する
ために、連続システムの発酵槽に850 mlの同じ培
地(すなわち、2.80f/l!のグルコース)を装填
し、しかも突然変異株で接種した。
混合物を、グルコースが欠乏するまで例1に記載するよ
うに発酵し、48時間後にエタノール含有量が1.4?
で、理論値の71.5%であることを確めた。
この結果において、突然変異株はこの突然変異株−母の
呼吸−欠乏特性を示す親株で得た収量より45%高い収
量でエタノールが生成したことを示している。
酵母突然変異株を例2に示すようにバッチ発酵で高い生
産高を説明したが、本例では次のように突然変異株を連
続発酵に用いた。
例1および2に示す方法と同様にして、発酵槽に185
171グルコース、1%ペプトンおよび0.5%酵母エ
キスを含有する滅菌供給培地(1)H4,0)を装填し
、サツカロミセス ウバリウムATOO2660gのR
ho突然変異株で接種した。混合物を1)H4,0(自
動滴下で)で82℃に維持し、空気を0.41/分の割
合で吹込み、500 R,P、Mで攪拌した。グルコー
スの完全使用のために、0.’15m1/分の最大供給
速度(また//′io、129hr  の稀釈速度)を
達成させた。エタノールは1時間当りにおいて発酵槽容
積lI!当りエタノール6.7fの生産高を表わす5.
8 ”77%の濃度および理論値の75%の収量で得た
月土  サツカロミセス ウバリウムの凝集剤菌株のい
る連続発酵 連続発酵システムのエタノール生産高を酵母突然変異株
でより一層向上させるために、細胞再循環装置を第1図
に示す連続発酵システムに導入した。
細胞再循環装置を加える以外は例8に記載すると同様に
連続発酵システムにサツカロミセス ウバリウムATO
O26131のRho突然変異株で接種した同じ供給混
合物を同様にして装填し、pH4,0および82℃に維
持し、空気を吹込み、攪拌した。
発酵槽でグルコースを完全に使用させるために、L5m
l1分の最大供給速度(または約0.94hr ’の稀
釈速度〕を用いた。この場合、約50f/1の乾燥細胞
密度を定常状態操作で達成した。エタノールは1時間当
りにおいて発酵槽容積1/当りエタノールの55.8 
fの生産高を表わす6.OW/J%の濃度および理論値
の86チの収量で得た。
このために1第1図に示す細胞再循環装置を導人するこ
とによって、細胞再循環装置を設けない/デテムにおけ
るエタノール生産高の5倍以上の収率?達成することが
できた。
【図面の簡単な説明】
@1図は細胞ゼ)循環を用いてエタノールを生成−する
本づC明方法含:示すフローシートでおる。 10・・・供給装置れL 11、18.2fJ、 24.26・・・ライン12、
・・・発酵圏捷たは発酵槽 18、Ni、22・・・制動ボング 14・・・・Nl+胞沈降タンク  80・・・空気源
82・・・:lJ (/l/       84・・・
攪拌機。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1(a)  発酵圏をザツカロミセス ウバリウムの凝
    固菌株の呼吸−欠乏突然変異株で接種し;(b)  D
    −糖、窒素源、ビタミン源および無機質諒の混合物を前
    記発酵圏に酸素含有ガスの存在で供給し;および (C)  前記り一糖混合物をエタノール生成物を生成
    するのに十分な長時間にわグこって発酵することを特徴
    とするD−糖からエタノールの製造方法。 2 前記り一糖は単糖類、三糖類および三糖類からなる
    群から選択する特許請求の範囲第1項jfd 載のエタ
    ノールの製造方法。 +l  貨Jg己D−aはグルコース、ガラクトース、
    フラクトース、マルトース、スクロース、メリビオース
    およびラフィノースからなる群から選択する特許請求の
    範囲第1項記載のエタノールの製造方法。 表 前記り一糖’<D−グルコースとする特F’F i
    ?を求の範囲第1項記載のエタノールの製造方法、五 
    前記り一糖の供給濃度を約110〜約150y/lの範
    囲にする特許請求の範囲第1項記載のエタノールの製造
    方法。 & 前記酸素含有ガスを空気または酸素とする特許請求
    の範囲第1項記載のエタノールの製造方法。 7 前記窒素源をアンモニウム塩、尿素捷1r−Itま
    ペプトンとする特許請求の範囲第1項記載のエタノール
    の製造方法。 8 発酵を約80〜約85℃の範囲の温度で行う特許請
    求の範囲第1項記載のエタノールの製造方法。 9 酸素含有ガスの流量を約401/分と−rるlFM
    許請求の範囲第1項記載のエタノールの製造方法。 10  発酵圏のpHを約4.0とする特許請求の範囲
    第1項記載のエタノールの製造方法。 】l #紀突然変異株のa胞を前記発酵槽に再循塊して
    戻してエタノールの生産高を5倍以上尚める特許請求の
    範囲第1項記載のエタノールの製造方法。 lλ 前記エタノール生成物は約4.0〜約7 、 O
    WJAJ係のエタノールを含有する特許請求の範囲第1
    項記載のエタノールの製造方法。 1& エタノールの生産高は細胞再循環させないで1時
    間当りにおいて発酵槽容積の11当りエタノールは57
    以上である特許請求の範囲第1項記載のエタノールの製
    造方法。 】4 エタノールの生産高は細胞再循環によって1時間
    当りにおいて発酵槽容積lJ当りエタノールは502以
    上である特許請求の範囲第1項記載のエタノールの製造
    方法。 】6 呼吸−欠乏突然変異株を菌株A’I’C0266
    02の呼吸−欠乏突然変異株とする特許請求の範囲第1
    項記載のエタノールの製造方法つ
JP58212642A 1982-11-15 1983-11-14 エタノ−ルの製造方法 Pending JPS59118091A (ja)

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