JPS587561A - Enzyme immunity analyzing method - Google Patents
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- JPS587561A JPS587561A JP11246582A JP11246582A JPS587561A JP S587561 A JPS587561 A JP S587561A JP 11246582 A JP11246582 A JP 11246582A JP 11246582 A JP11246582 A JP 11246582A JP S587561 A JPS587561 A JP S587561A
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- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/745—Assays involving non-enzymic blood coagulation factors
- G01N2333/75—Fibrin; Fibrinogen
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。(57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、ある物質を含有すると推定される媒体中のそ
の物質の存在を決定しあるいは定量するための酵素免疫
分析法に関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to an enzyme immunoassay for determining or quantifying the presence of a substance in a medium suspected of containing the substance.
酵素免疫分析法はさまざまなテクニックが既知であり、
それらの中にはその存在を検出すべき抗体または抗原と
酵素が結合される方法も含まれている。酵素免疫分析法
特に均質酵素免疫分析法痕U、に、特許出d4tr号2
,043.245 Aにおいて概括されている。この特
定の荷許出顧は一酵素とその#Aに対する非可逆的阻害
剤が存在し、その非可逆的酵素阻害剤が検出されるべき
配位子の類似物質に摺合されてその抱合体がその酵素と
反応して共有結合を形成することができ、その共有結合
が酵素の構造を変化させることによって非可逆的にその
酵素活性を阻害するような均質酵素免疫分析に関するも
のである。検出されるべき配位子に結合oT能な結合蛋
白砧よび配位子抱合体もまた存在するがその抱合体は結
合蛋白に結合された時不活性化される。検出されるべき
配位子の量は、抱合体と結合蛋白の間の結合に影響を及
ぼし、したがってその抱合体が酵素の活性に対してもつ
作用をもたらす。酵素活性をそこで測定し、配位子の存
在しない時の活性と比較し存在する配位子量を定量する
。Various enzyme immunoassay techniques are known;
These include methods in which an enzyme is coupled to an antibody or antigen whose presence is to be detected. Enzyme immunoassay method, especially homogeneous enzyme immunoassay method U, patent issued d4tr No. 2
, 043.245 A. This particular release states that there is an enzyme and an irreversible inhibitor for #A, and that the irreversible enzyme inhibitor is conjugated to an analogue of the ligand to be detected to form a conjugate. It relates to homogeneous enzyme immunoassays that can react with the enzyme to form a covalent bond that irreversibly inhibits the enzyme's activity by changing the structure of the enzyme. There are also binding proteins and ligand conjugates capable of binding the ligand to be detected, but the conjugates are inactivated when bound to the binding protein. The amount of ligand to be detected influences the binding between the conjugate and the binding protein, and thus the effect the conjugate has on the activity of the enzyme. The enzyme activity is then measured and compared to the activity in the absence of the ligand to quantify the amount of ligand present.
IFKBS 1etters第16巻、1980年7月
の285画から288頁もまたそのようなシステムを記
載しているが、更に、同じ原理上で慟〈均質#素免疫シ
ステムのいくつかの代りをも示唆している。しかしなが
ら、これらは例証されていない。IFKBS Volume 16, July 1980, pages 285 to 288, also describes such a system, but also suggests some alternatives to the homogeneous immune system on the same principle. are doing. However, these are not illustrated.
そのようなシステムは、野性型−大腸−β−ガラクトシ
ダーゼに対する抗体のごとき酵素活性化剤の使用を含む
ことができると示唆されている。It has been suggested that such a system may include the use of an enzyme activator such as an antibody to wild-type colon-β-galactosidase.
本発明は、不活性酵素の活性化に基き、その酵素の活性
化の度合がそこに存在する物質量に左右されるような存
在すると信じられるある物質の定量のための一新規均質
酵素免疫分析法に関するものである。The present invention is a novel homogeneous enzyme immunoassay for the quantification of a substance believed to be present, which is based on the activation of an inactive enzyme and in which the degree of activation of the enzyme depends on the amount of the substance present. It is about law.
従って本発明はある物質を含有すると推定される媒体中
のその物質の存在を決定し、あるいは定量するための一
方法を提供し、その方法は、a) ’!質的に不活性
の酵素を活性化し得る抗体と結合した物質から成る抱合
体、その物質に特異的な結合蛋白あるいは抗体、および
実質的に不活性の酵素の過剰と媒体とを共に混合し、そ
の構成成分の添加の順序は、媒体中のいかなる物質も、
その物質忙特異的な結合蛋臼または抗体と反応する機会
をもつまでにその酵素が抱合体と混合されないように添
加してゆく。Accordingly, the present invention provides a method for determining or quantifying the presence of a substance in a medium suspected of containing the substance, the method comprising: a) '! mixing together a conjugate of a substance bound to an antibody capable of activating a qualitatively inactive enzyme, a binding protein or antibody specific for the substance, and an excess of the substantially inactive enzyme and a vehicle; The order of addition of its components is such that any substance in the medium
The enzyme is added so that it does not mix with the conjugate before it has had a chance to react with the agent-specific binding matrix or antibody.
b)酵素に対する基質を加えその酵素活性を測定する ことからなる。b) Add a substrate for the enzyme and measure the enzyme activity It consists of things.
一つの好ましい具体例として、本発明は、a)媒体をそ
の物質に特異的な結合蛋白または抗体を実質的に不活性
の酵素の過剰との混合物に添加し、
b)実質的に不活性の酵素を活性化し得る抗体に結合し
た物質から成る抱合体を加え、そして
C)その酵素に対する基質を加え、酵素の活性を定量す
る
ことからなる、ある物質を含有すると推定される媒体中
のその物質の存在を決定しまたは定量するための一方法
を提供する。In one preferred embodiment, the invention comprises: a) adding a medium to a mixture of a binding protein or antibody specific for the substance with an excess of a substantially inactive enzyme; C) adding a conjugate of the substance bound to an antibody capable of activating the enzyme; and C) adding a substrate for the enzyme and quantifying the activity of the enzyme in a medium suspected of containing the substance. provides a method for determining or quantifying the presence of.
更に好ましい実施例として、本発明は(al実質的に不
活性の酵素を活性化し得る抗体に結合した物に特異的な
結合蛋白または抗体を加え、(C1実質的に不活性の酵
素の過剰を加え、((1)酵素に対する基質を加えてそ
の酵素活性を定量することからなる、ある物質を含有す
ると推定されるある媒体中のその物質の存在の決定また
は定量のための一方法を提供している。In a further preferred embodiment, the present invention comprises adding a binding protein or antibody specific for (C1) conjugated to an antibody capable of activating a substantially inactive enzyme; In addition, it provides a method for determining or quantifying the presence of a substance in a medium suspected of containing the substance, which comprises (1) adding a substrate for the enzyme and quantifying its enzymatic activity; ing.
望ましくは、実質的に不活性の酵素を活性化し得る抗体
は単クローン性抗体である。Desirably, the antibody capable of activating a substantially inactive enzyme is a monoclonal antibody.
その物質に特異的な結合蛋白あるいは抗体は、その物質
が抱合されていない時または活性化抗体に抱合されてい
る時、その物質に結合することができる。その物質に特
異的な抗体または結合蛋白が抱合体に結合される時、こ
れは観察される酵素活性化のレベルを減少させる。抗体
を標準技法で精製してあれば適当でありたとえば硫酸ア
ンモニウムを用いる沈澱化を含む分画化とそれに続くイ
オン交換セルローズ上でのカラムクロマトグラフィによ
り精製する。この精製された抗体は実質的に他の蛋白質
を含まぬ状態すなわち他の蛋白の含量が10優より少な
いことが過当である。A binding protein or antibody specific for the substance can bind to the substance when the substance is unconjugated or when conjugated to an activated antibody. When an antibody or binding protein specific for the substance is attached to the conjugate, this reduces the level of enzyme activation observed. Suitably, the antibodies have been purified by standard techniques, eg, by fractionation, including precipitation with ammonium sulfate, followed by column chromatography on ion-exchange cellulose. It is appropriate that this purified antibody be substantially free of other proteins, that is, the content of other proteins should be less than 10%.
実質的に不活性の酵素を活性化し得る更にもう一つの抗
体を、酵素を他の成分のいずれかに添加する前にその#
索と混合することが適切である。Yet another antibody capable of activating a substantially inactive enzyme is added to the enzyme prior to adding it to any of the other ingredients.
It is appropriate to mix it with cables.
実質的に不活性の酵素とは、活性化された時にその活性
がβ−ガラクトシダーゼの活性の10憾より小さく、適
切には5張より小さく、好ましくは1優より小さいβ−
がラクトシダーゼの不活性変異株のごとき酵素を意味し
ている。そのよりなβ−がラクトシダーゼの変異型は大
腸菌の突体変異株の培養によって調製するのが望ましい
。A substantially inactive enzyme is one whose activity when activated is less than 10, suitably less than 5, preferably less than 1, that of β-galactosidase.
means an enzyme such as an inactive mutant of lactosidase. The more β-lactosidase mutant is preferably prepared by culturing a mutant strain of E. coli.
大腸菌の突然変異株培養により作られた実質的に不活性
のβ−がラクトシダーゼの多くのタイプは不安定である
ことが発見されている。実質的に不活性のβ−ガラクト
シダーゼの多くのタイプは背景に高いノイズを生ずるこ
と、すなわち活性化抗体の存在なしに基質と混合された
時、発色反応をおこすことも発見された。したがって当
該方法の甲に含むに適する実質的に不活性のβ−ガラク
トシダーゼは安定なもの(すなわち数ケ月にわたつに活
性化される能力を保持し何分間もの間、直線的な反応を
触媒する)であって重大な背景のノイズを生じないもの
である。β−がラクトシダーゼの特に通するタイプはに
、coliのWM 298株すなわちA11ele :
lac aba (527,−r 7 クスブランク
研究所のW、1llesser博士1Berlin 3
3(DAHIJM)。Many types of substantially inactive β-lactosidase produced by culturing mutant strains of E. coli have been found to be unstable. It has also been discovered that many types of substantially inactive β-galactosidase produce a high background noise, i.e., a color reaction when mixed with a substrate without the presence of an activating antibody. Therefore, the substantially inactive β-galactosidase suitable for inclusion in the method A is stable (i.e., retains the ability to be activated for months and catalyzes linear reactions for many minutes). ) without producing significant background noise. A particular type of β-lactosidase is the WM 298 strain of E. coli, namely A11ele:
lac aba (527,-r 7 W, 1lesser of the Kusblanc Institute 1Berlin 3
3 (DAHIJM).
工hnestragse 66−73から得られた一株
からつくられる。It is produced from a single strain obtained from P. hnestragse 66-73.
この技法で用いられる活性化率クローン性抗体は、免疫
グロブリンの断片もまた用いられるけれども無傷のまま
の免疫グロブリンであることが適当である。試験される
べき物質に特異的な抗体もしくは結合蛋白は望ましくは
高力価の多クローン性抗体がまたはこの物質に特異的な
単クローン性抗体である。The activation rate clonal antibodies used in this technique are suitably intact immunoglobulins, although fragments of immunoglobulins may also be used. The antibody or binding protein specific for the substance to be tested is preferably a high titer polyclonal antibody or a monoclonal antibody specific for this substance.
本発明は血清、血漿、を髄液、そして尿のような生物学
的液体中の物質の測定に特に適した方法に関する。本発
明の方法により検出し定量するのに適した物質はホルモ
ン、蛋白質、ビタミン、毒物、薬品または薬品の代mi
i物を含む。本発明の方法は医学的K11lllな物質
の検出に特に適している・そのような物質はステロイド
、Cりjン、蛋白質および蛋白質の断片、葉酸、セロト
ニン、プロスタグランディ/、アドレナリン、ノルアド
レナリン、阿片、テオフィリ/、シランチン、パルピッ
レート、アミノグリコシド抗生物質、アシクロヴイルそ
して抗ヴイルス剤である。望ましくは、その物質は抗て
んかん剤、抗生物質、抗ヴイルス剤、ホルモンまたは蛋
白質である。この方法は、ジフェニル ヒダントイン、
コルチゾール、アシクロヴイル、フイブリノーゲンそし
てフイデリノーrノ分解童物りの定量tcIK便利であ
ることが発見された。本発明の方法は、蛋白質および蛋
白質の断片のような高分子量の物質すなわち10,00
0から、i、、o o o、o o oの関め物質の検
出に適しているということは、特に’lN<べきことで
あシ、有駒なことであると考えられる。The present invention relates to a method particularly suitable for the determination of substances in biological fluids such as serum, plasma, spinal fluid, and urine. Substances suitable for detection and quantification by the method of the invention include hormones, proteins, vitamins, poisons, drugs or drug substitutes.
Including i-things. The method of the invention is particularly suitable for the detection of medical substances such as steroids, carbon, proteins and protein fragments, folic acid, serotonin, prostaglandi, adrenaline, noradrenaline, opium, Theophyllic acid, cilanthine, pulpyrate, aminoglycoside antibiotic, acyclovir, and antiviral agent. Desirably, the substance is an antiepileptic, an antibiotic, an antiviral, a hormone or a protein. This method uses diphenyl hydantoin,
The determination of cortisol, acyclovir, fibrinogen, and fidelinol has been found to be useful in tcIK. The method of the invention is suitable for high molecular weight substances such as proteins and protein fragments, i.e.
The fact that it is suitable for the detection of related substances from 0 to i, o o o, and o o o is considered to be particularly valuable.
定型されるべき物質は、通常1ナノモル以上の濃度で存
在するであろう。コルチゾールの場合には40ナノモル
以上の濃度、アシクロヴイルの場合には250ナノモル
以上の濃度、ジフェニルヒ/ントインの場合には10マ
イクロモル以上の濃度、フイブリノーゲンとフイブリノ
ーゲンの分解産物りの場合には60ナノモル以上の濃度
が適尚である。The substance to be formulated will usually be present in a concentration of 1 nanomolar or more. In the case of cortisol, a concentration of 40 nanomolar or more, in the case of acyclovir, a concentration of 250 nanomolar or more, in the case of diphenylhintoin, a concentration of 10 micromolar or more, and in the case of fibrinogen and fibrinogen breakdown products, a concentration of 60 nanomolar or more. The appropriate concentration is
その物質と、実質的に不活性の酵素を活性化しうる抗体
とから成る抱合体は、尚業者にとり曳く知られた伝統的
な方法によって調製される。その物質は通常の架橋基に
よって抗体に結合されるであろう。コルチゾール、アシ
クはヴイルそしてジフェニル ヒダントインに対して共
に、41に適切な方法は、これらの配位子中へカルギン
酸基を導入し、次に単りロー/性抗体の適切な基へ容易
に結合するN−ヒドロキシ サクシェミド エステルへ
と変換させることであった。フィデリノーrノ分解産物
DJC対しては、特Fc遁幽な方法はD断片中に像映さ
れたチオール基な導入し、マレイばド残基な単クローン
性抗体中に導入し、それからチオール残基から保護グル
ープを除去してこの2つの蛋白質を容易にカップリング
させるように混合することであった。その他の適切な抱
合方法は、Kabakoffによって酵素免疫分析C,
R,C1Proms。Conjugates of the substance and antibodies capable of activating a substantially inactive enzyme are prepared by traditional methods well known to those skilled in the art. The substance will be attached to the antibody by conventional bridging groups. For both cortisol, asic, and diphenyl hydantoin, a suitable method is to introduce calginate groups into these ligands and then easily conjugate them to the appropriate groups of the monoclonal antibody. The purpose was to convert it into the N-hydroxy succimide ester. For the Fidelino degradation product DJC, a special Fc isolated method is to introduce the imaged thiol group into the D fragment, introduce it into a maleivalent monoclonal antibody, and then introduce the thiol residue into The aim was to remove the protecting group from the base and mix the two proteins to facilitate coupling. Other suitable conjugation methods include enzyme immunoassay C by Kabakoff;
R, C1Proms.
H,T、 Maggio編集1980.71−104の
中に概括されている。Compiled in H, T. Maggio eds. 1980.71-104.
ギ発明の分析は、通常では−の4囲5から10まで望ま
しくは約−7,4で水性液体媒体中で実施されるであろ
う。本分析は−を約−10にまで上ケIcDTAのよう
なマグネシウムに対するキレート化剤を加え、コール酸
ナトリウムまたはデオキシコール酸ナトリウムのような
脂質可溶化剤を加えることにより停止させるのが便宜で
ある。アルカノールかポリオールがその水性液体媒体中
に存在することが望ましい。メタノール、エタンジオー
ル、プロパン−1,2−ジオール、マンニトール、フル
ビトールおよびD−アラビトールはこの水性媒体中に含
有させるのに特に適して−る。、璽〈べきことにはD−
アラビトールはメタノールの作用機序とは異なり、それ
に附加的なある機序によって分析の感度を増加させ同時
に分析の実施に要する時間の長さを減少させることが発
見された。本発明の方法の実施中液体媒体の温度は通常
10℃から45℃の間であり、37℃であると都合がよ
い。The assays of the present invention will normally be carried out in an aqueous liquid medium at a temperature of -4 to 5 to 10, preferably about -7.4. The assay is conveniently stopped by adding a chelating agent for magnesium, such as IcDTA, up to about -10 and a lipid solubilizer, such as sodium cholate or sodium deoxycholate. . Preferably, an alkanol or polyol is present in the aqueous liquid medium. Methanol, ethanediol, propane-1,2-diol, mannitol, flubitol and D-arabitol are particularly suitable for inclusion in this aqueous medium. , seal〈should be D-
It has been discovered that arabitol increases the sensitivity of the assay and at the same time decreases the length of time required to perform the assay by a mechanism that is different from, and additional to, that of methanol. The temperature of the liquid medium during carrying out the process of the invention is usually between 10°C and 45°C, advantageously 37°C.
適切な免疫学的反応をおこさせるためには、すなわちそ
の物質に特異的な抗体もしくは結合蛋白と抱合体および
もしその物質が存在する時には媒体中のその物質との反
応をおこさせ、又、酵素をその適切な活性化状態に到達
させ得るためにある時間が必要である(保温培養期)こ
とは当業者には明らかであろう。インキュベーションの
実施を要する正確な段階は分析の特殊状況によって左右
さ汰る。たとえば試薬の添加順序に依存しているが、イ
ンキュベーションは常に基質の添加前におこなわれるで
あろう、当業者は特別なインキュベーション段階がいつ
適切であるかという時期を判断することができるであろ
う。In order to generate an appropriate immunological reaction, the conjugate and the antibody or binding protein specific for the substance and, if present, react with the substance in the medium, and the enzyme It will be clear to the person skilled in the art that a certain amount of time is required (incubation period) in order for the microorganism to reach its proper activation state. The exact steps at which incubation must be carried out will depend on the particular circumstances of the analysis. For example, depending on the order of addition of reagents, incubation will always occur before addition of substrate; a person skilled in the art will be able to judge when special incubation steps are appropriate. .
その物質、抱合体酵素および抗体はこの方法が実施され
る媒体に通常可溶である。基質は媒体にf#解するかあ
るいは不溶であるかもしれないが、媒体に可溶の方が便
利である。ある状況においては不溶の合成基質を用意す
るかまたは不溶の天然基質を用いることが望ましいこと
もある。The substance, conjugate enzyme and antibody, are usually soluble in the medium in which the method is carried out. Although the substrate may be soluble or insoluble in the medium, it is more convenient if it is soluble in the medium. In some situations it may be desirable to provide an insoluble synthetic substrate or to use an insoluble natural substrate.
媒体中に偶然存在して実質的に不活性の酵素を活裡化し
得る抗体と相互作用をおこすかもしれない抗体の効果を
中オロするために本発明の分析にお一七たとえば標準的
ヒツジ免疫グロブリンのような標準的免疫グロブリンの
過剰を含有せしめることは都合がよい。β−がラクトシ
ダーゼの変異減はその活性に必須のチオール基を含むこ
とが知られている。そのような#素が当該発明の分析に
用いられる時にはジチオールトレイトールまたは同様の
試薬を存在するチオール基の酸化防止のために通常含め
られる。ナトリウムアジ化りのように適当な防腐剤を本
発明の分析中に加えることは便利であり、利益となる。For example, standard sheep immunization is used in the assays of the present invention to neutralize the effects of antibodies that may be incidentally present in the medium and interact with antibodies that may activate a substantially inactive enzyme. It may be advantageous to include an excess of standard immunoglobulin, such as globulin. It is known that mutations in β-lactosidase contain a thiol group essential for its activity. When such bases are used in the assays of the present invention, dithiolthreitol or similar reagents are usually included to prevent oxidation of the thiol groups present. It is convenient and advantageous to add a suitable preservative, such as sodium azide, during the analysis of the present invention.
本発明の方法においては、定量されるべきその物質が存
在する場合にはその物質と、実質的に不活性の酵素を活
性化しうる抗体およびその物質とから成る抱合体との間
に特異的な抗体または結合蛋白への結合をめぐって競合
がおこなわれる。酵素活性化のレベルはその抱合体、と
特異抗体または結合蛋白との閣の結合度に正確に左右さ
れるから、サンプルの酵素活性はサンプル中の物質量に
より左右される。In the method of the present invention, a specific bond exists between the substance to be quantified, if it exists, and a conjugate consisting of the substance and an antibody capable of activating a substantially inactive enzyme. Competition occurs for binding to the antibody or binding protein. Since the level of enzyme activation depends precisely on the degree of association of the conjugate with a specific antibody or binding protein, the enzyme activity of a sample depends on the amount of substance in the sample.
酵素活性の分析方法は、必要に応じて変化する。The method for analyzing enzyme activity varies as necessary.
分光測光法的測定または螢光針的測定が酵素活性レベル
を測定するのに都合よく用いられる。Spectrophotometric or fluorescent measurements are conveniently used to measure enzyme activity levels.
定量されるべき物質が、実質的に不活性の酵素を活性化
し得る抗体に結合して成り立つ抱合体は新規なもので本
発明の東に重要な部分をなしている。Conjugates in which the substance to be quantified is bound to an antibody capable of activating a substantially inactive enzyme are novel and form an important part of the present invention.
本発明はまた
試薬1:実質的に不活性の酵素と混合された分析される
べき物質に特異的な抗体
試薬2:抱合体
試薬6:酵素に対する基質
試薬4:停止剤
からなる試験キットをも提供する。The present invention also provides a test kit consisting of reagent 1: an antibody specific for the substance to be analyzed mixed with a substantially inactive enzyme, 2: a conjugate reagent, 6: a substrate reagent for the enzyme, 4: a stop agent. provide.
試薬1は実質的に不活性の酵素を活性化しうる抗体を含
むことが適切である。その実質的に不活性の酵素はβ−
がラクトシダーゼの変異型であることが適切でその場合
には、試薬1は通常β−ガラクトシダーぜ中に含まれる
チオール基の酸化防止のためにジチオトレイトールまた
は同等の試薬を蒼む。試41はまた標準的免4gtグロ
ブリンをも含むと便利であり、又、標準的ヒツジの免疫
グロブリンを含むことが望ましい。試薬1および2はポ
リオールの1つ好まC<はD−アラ−トールを含むこと
が適、当である。Suitably, reagent 1 comprises an antibody capable of activating a substantially inactive enzyme. The substantially inactive enzyme is β-
Suitably, it is a variant of lactosidase, in which case reagent 1 contains dithiothreitol or an equivalent reagent for the prevention of oxidation of the thiol groups normally contained in β-galactosidase. Conveniently, Test 41 also includes standard immunoglobulin, and preferably standard sheep immunoglobulin. Suitably, reagents 1 and 2 contain one of the polyols, preferably C<D-alator.
試薬2は標準的免疫グロブリンを望ましくは標準的ヒツ
ジ免疫グロブリンを含むことが適当である。Reagent 2 suitably comprises standard immunoglobulin, preferably standard sheep immunoglobulin.
試゛薬6はメタノールのようなアルカノールの1つを含
むことが望ましい。停止剤は−の高い緩衝溶液、マグネ
シウムに対するキレート化剤および脂質可溶化剤の混合
物である。−緩衝溶液はグリシン中に水酸化ナトリウム
を含み、キレート化剤はKDTAであって脂質可溶化剤
はコール酸す) +7ウムであると適当である。当該試
験法の諸成分の調製および試験法の操作は以下に例証さ
れている:酵素の精製
MelchersとMesser (Bur、 、r、
Biochem、 17(1970)、267)Kより
紀−されたような活性化しうる変異型のβ−がラクトシ
ダーゼな産生した大腸菌の一株をコハク酸ナトリウムと
チアミンを補給した鉱r!It項培地中で成長させた(
FOW18r、 J、Bacterial、112
(1972)、856)、更にb″ow1er (上8
己参照)ノ1ie41KLfようなA3245株を酵素
的に活性の野性タイプのβ−がラクトシダーゼを用意す
るために成長させた。Preferably, reagent 6 includes one of the alkanols, such as methanol. The terminating agent is a mixture of a high buffer solution, a chelating agent for magnesium, and a lipid solubilizer. - The buffer solution contains sodium hydroxide in glycine, the chelating agent is KDTA and the lipid solubilizing agent is cholic acid. The preparation of the components of the test method and the operation of the test method are illustrated below: Enzyme Purification Melchers and Messer
Biochem, 17 (1970), 267) A strain of Escherichia coli that produced an activated mutant β-lactosidase, as developed by K., was supplemented with sodium succinate and thiamine. Grown in It section medium (
FOW18r, J, Bacterial, 112
(1972), 856), and furthermore b″ow1er (upper 8
(self reference) A3245 strain such as No.1ie41KLf was grown to provide enzymatically active wild-type β-lactosidase.
細菌を遠心分離により収穫し、必要時まで冷凍廚蔵した
。解凍と高周波分解の後β−ガラクトシダーゼとその種
々の抗体活性化可能変異型をoravenら(、r、
B1C11,Ohem、 240 (1965)、24
68)とTenuら(l1iur0.T、Bioche
m 2 Q、(1981)、663)の記述したような
古典的クロマトグラフィー法により精製した。親和性ク
ロマトグラフィもまた用いることができるが、カラム溶
媒の合成費用が高いことと容量の低いことという不利点
がある。典型的な精製においては、60リツトルの細菌
成長培地が収穫されそれから細菌は高周波分解され、そ
の懸濁液を遠心分離する。縮重からのすべてのβ−ガラ
クトシダーゼな含む上澄液約1リツトルが得られその酵
素を部分的に精製してtA酸アンモニウムで15係から
45俤の間の飽和により沈澱する物質を集めることによ
って濃縮させる。透析またはrルP通の後に酵素をDI
BAE−セルローズのカラムに適用し、ある勾配で浴出
する。酵素を結合しているDEARカラムからの分画を
プールし、直接に水酸化燐灰石のカラムに適用し、燐酸
の勾配で溶出する。再び酵素を含んでいる分画をプール
し、それからDEAR−セファローズ0L4Bのカラム
に直接適用する。ある勾配での溶出は500〜1000
#の均質なβ−がラクトシダーゼを産生じた。水酸化燐
灰石のカラムは効率を損することなくセファクリル56
000カラムによっておきかえることができる。Bacteria were harvested by centrifugation and stored frozen until needed. After thawing and radiofrequency digestion, β-galactosidase and its various antibody-activatable mutants were isolated by Oraven et al.
B1C11, Ohem, 240 (1965), 24
68) and Tenu et al. (l1iur0.T, Bioche
It was purified by classical chromatographic methods as described by M2Q, (1981), 663). Affinity chromatography can also be used, but has the disadvantages of high cost of column solvent synthesis and low capacity. In a typical purification, 60 liters of bacterial growth medium is harvested, the bacteria are then radiofrequency digested, and the suspension is centrifuged. Approximately 1 liter of supernatant containing all the β-galactosidase from the degeneracy is obtained and the enzyme is partially purified by collecting the precipitated material by saturation between 15 and 45 volumes with ammonium tA acid. Concentrate. DI enzyme after dialysis or rP.
Apply to a column of BAE-cellulose and wash out with a gradient. Fractions from the DEAR column binding the enzyme are pooled and applied directly to a hydroxyapatite column and eluted with a phosphoric acid gradient. The enzyme-containing fractions are again pooled and then applied directly to a DEAR-Sepharose 0L4B column. Elution in a certain gradient is 500-1000
# of homogeneous β- produced lactosidase. The hydroxide apatite column can be used with Sephacryl 56 without loss of efficiency.
Can be replaced by 000 columns.
との′dIgされた酵素は、メルカゾトエタノールまた
はその他のスルフィドリル保譲剤を含む50俤飽和硫酸
アンモニウムの緩衝溶液中に懸濁させることにより実質
的あるいは潜在的触媒作用活性を損することなく何ケ月
も貯そうすることができる。The 'dIg'enzyme can be prepared without loss of substantial or potential catalytic activity by suspending it in a buffer solution of 50 ml of saturated ammonium sulfate containing mercazotoethanol or other sulfhydryl preservative. You can try to save even months.
抗体の生産
マウスを精製した野性タイプのβ−ガラクトシダーゼで
兄疫化し、KohlerとMiletein (Bur
、J。Antibody-producing mice were incubated with purified wild-type β-galactosidase, and the mice were incubated with Kohler and Miletein (Bur
, J.
工mLnunox ; (5(1975)、511)に
由来する方法に従ってその膵臓を骨髄嘘細胞系と共に溶
融した。その融解した細胞をマルチウェルプレート甲で
試験管内培養し、上澄溶液をそうでなければ不活性の変
異型酵素を活性化した抗β−がラクトシダーゼ抗体につ
いて検索した。望む抗体を産生じたウェルからの細胞を
限定稀釈法により反覆クローンせしめた。単クローン性
抗体細胞系はかくして形成され組織培養を用いて試験管
内でかあるいはマウスの腹腔内で腹水を与えて生体内で
かのいずれかで必要に応じて成長させられた。抗体はイ
オン交換セルロース上クロマトグラフィによって培養培
地または腹水から精製された。The pancreas was lysed along with a bone marrow cell line according to the method derived from Eng. Lnunox; (5 (1975), 511). The thawed cells were cultured in vitro in multiwell plates, and the supernatant solution was probed for anti-β-lactosidase antibodies that activated the otherwise inactive mutant enzyme. Cells from wells that produced the desired antibody were replicate cloned by limited dilution. Monoclonal antibody cell lines were thus formed and grown as needed either in vitro using tissue culture or in vivo by inoculating mice intraperitoneally with ascites fluid. Antibodies were purified from culture media or ascites fluid by chromatography on ion-exchange cellulose.
抗体ヲ産生ずる4本の細胞系統が形成されBG−18、
k3G−19、BG−79、J3G−81と番号をつけ
られた。これらの系統により産生された兎唖ゲロプリン
は不活性の精製変異!!11酵素と混合された時、β−
ガラクトシダーゼ活性を与えた。Four cell lines producing antibodies were formed, BG-18,
They were numbered k3G-19, BG-79, and J3G-81. The rabbit geloprine produced by these strains is an inactive purified mutation! ! When mixed with 11 enzymes, β-
conferred galactosidase activity.
BG−79系統からの抗体は特殊な性質を示した。Antibodies from the BG-79 strain showed special properties.
他の6系統のいずれかからの抗体と混合し、不活性の変
異減酵素に加えると、酵素活性が相乗作用的に増加して
、それぞれ単独に用いた抗体のいずれについての飽和か
ら期待されるよりも大きい活性をもたらせるということ
が発見された。その活性ハメタノール、エタンジオール
、プロパン−1゜2−ジオールまたは水酸官能基を含む
その他の化合物の使用により増加されるし、父、附加的
に別の機序によって糖アルコール、特にソルビトールお
よびマンニトールしかしとりわけD−アラビトールによ
って増加される。When mixed with antibodies from any of the other six strains and added to the inactive mutant enzyme, there was a synergistic increase in enzymatic activity that would be expected from the saturation for any of the antibodies used alone. It has been discovered that it is possible to produce greater activity than Its activity is increased by the use of hamethanol, ethanediol, propane-1°2-diol or other compounds containing a hydroxyl function, and additionally by another mechanism sugar alcohols, especially sorbitol and mannitol. But it is especially increased by D-arabitol.
観察された相乗作用と添加したメタノールの効果は第1
表に示しである。The observed synergy and the effect of added methanol are the first
It is shown in the table.
41表
BG−79による 7.6士肌16 4.
6±0.4BG−810,86±0.04 0.
2±0.0048G−18゛ 12.5±0.0!+
32±0.258G−191,0±o、oi
o、ss ±0.003BG−79十BG
−8128± 1.2 46 ± 1.8BG
−79十BG−1910,9±0.2 16.
9±0.1BG−79+BG−1842,5±0.5
95.5±6.5BG−18十BG−1918
−
過剰の抗体の存在下での酵素活性は、μmole(7)
O−ニトロフェノール/ n mole酵素/分で表現
され、O−ニトロフェニル−β−D−ガラクトンドを基
質として用いて定量される。According to Table 41 BG-79 7.6 Shihada 16 4.
6±0.4BG-810,86±0.04 0.
2±0.0048G-18゛ 12.5±0.0! +
32±0.258G-191,0±o,oi
o, ss ±0.003BG-790BG
-8128± 1.2 46 ± 1.8BG
-790BG-1910,9±0.2 16.
9±0.1BG-79+BG-1842,5±0.5
95.5±6.5BG-180BG-1918
- Enzyme activity in the presence of excess antibody increases in μmole (7)
It is expressed as O-nitrophenol/n mole enzyme/min and is quantified using O-nitrophenyl-β-D-galactone as substrate.
単クローン性抗体番号BG−18、BG−19、BG−
79、BG−81はWellcomea Diagno
atics。Monoclonal antibody numbers BG-18, BG-19, BG-
79, BG-81 is Wellcomea Diagno
tics.
Dartford、イギリスから入手できる。Available from Dartford, UK.
抗体の調製
凍結乾燥粉末として保存された単クローン性抗体を再水
和化し、ついで50憾飽和硫酸アンモニウムを用いる沈
澱化により分画化した。収量した沈澱の再懸濁化とゲル
ー過の後にその為クローン性抗体をD B A、に−セ
ルローズのカラムまたはBlo−Ge1 D Bを置換
したProcion −6Bのカラムに1QmMの燐酸
緩衝浴液中でp)l 7.0で適用した。Antibody Preparation Monoclonal antibodies stored as lyophilized powders were rehydrated and then fractionated by precipitation with 50 ml of saturated ammonium sulfate. After resuspension and gel filtration of the harvested precipitate, the clonal antibodies were then transferred to a DB A-cellulose column or a Procion-6B column replacing the Blo-Gel DB in a 1QmM phosphate buffer bath. Applied at p)l 7.0.
浴出した抗体は実質上均質で再懸濁した凍結乾燥粉末1
0−につき45ノ9までの抗体の収量であった。The bathed antibody is a substantially homogeneous resuspended lyophilized powder 1
The yield of antibodies was up to 9 out of 45 per 0-.
精製された率クローン性抗体なN−ヒドロキシサクシニ
ミドエステルまたは問題の配位子のその他の適当な活性
誘導体で処理することにより置換した。コルチ・戸−ル
に対しては最適濃度10分子のN(コルチゾールー21
−へミサクシニル)−サクシネートを各分子の精製抗体
と16−20時間O℃で10係ジメ卆ルフオルマミド、
[1、食塩水を含む緩衝溶液中でpi−17,4で反応
せしめた。Purified clonal antibodies were displaced by treatment with N-hydroxysuccinimide ester or other suitable active derivative of the ligand in question. For Cortisol and Tortoise, the optimal concentration of 10 molecules of N (cortisol-21
-hemisuccinyl)-succinate with purified antibodies of each molecule and 10 volumes of dimethylformamide at 0°C for 16-20 hours.
[1. Reacted with pi-17,4 in a buffer solution containing saline.
置換された抗体は、70%飽和硫酸アンモニウムで沈澱
させ、70壬飽和硫酸アンモニウム中再−濁により洗滌
後、少くとも2回遠心分離し、蛋白結合しているもの以
外のすべてのコルチゾール−21−ヘミサクシネートの
痕跡をrルp過により除去した。製品を適当に稀釈し、
凍結乾燥法は置換し得るけれども凍結して貯蔵した。Displaced antibodies were precipitated with 70% saturated ammonium sulfate, washed by resuspension in 70 g of saturated ammonium sulfate, and centrifuged at least twice to remove all cortisol-21-hemisuccinate except for protein-bound. Traces were removed by filtration. Dilute the product appropriately,
Freeze-drying methods could be substituted for storage frozen.
ジフェニルヒダントインニ対しては、!1−(N−カル
ボキシルメチル)−ジフェニルヒダントインのN−ヒド
ロキシサクシニミドエステルの20分子を精製された抗
体の各分子と16時間室温(20℃)で、燐酸0.01
Mと食塩を含む緩薗浴液中pal 7.4で反応せし
められた。置換された抗体は遊離の3−(N−カルボキ
シメチル)−ジフェニルヒダントインからBiOgel
P 1Qのカラムを用いるrルp過で、200−40
0メツシユで6−のペソドコリウムに14のサンプルで
食塩水0.15 Mと平衡にされたカラムを用いて分離
された、フイブリノーゲンおよびフイブリノーゲンの分
解域生産物りに対してはその精製された蛋白またはD断
片を保護されたチオール基を導入するために8−アセチ
ルメルカプト無水コハク酸と反応さ奢た。単クローン性
の抗体はマレイミド残分を導入するためにサクシニミジ
ル4−(N−?L/ノミトメチル)シクロヘキサン−1
−カルボキシレートと反応させた。カップリングのため
にフィブリノ−rンまたはDfi片中の保傾されたチオ
ール基をヒドロキシラミン25mMと−7で室温で1時
間処理することによって4出させた。そのチオール蛋白
または断片りをそれからマレイミド−単クローン性抗体
と混合させた。−昼夜のカップリングの後、抱合体なメ
ルカプトエタノールで処理して過剰のマレイミド残分な
ふさぎ次にN−エチルマレイミドを過剰のチオール基を
ふさぐために処理する。抱合体をそれからフイデリノー
rンー抗体に対してセファローズCL−4B上で断片り
一抗体に対してセファクリル8−300上でのクロマト
グラフィにより精製したが最初の溶出された蛋白質は有
用である。For diphenylhydantoinni,! 20 molecules of N-hydroxysuccinimide ester of 1-(N-carboxylmethyl)-diphenylhydantoin were incubated with each molecule of purified antibody at room temperature (20°C) for 16 hours at 0.01 phosphoric acid.
The reaction was carried out at pal 7.4 in a slow bath solution containing M and sodium chloride. The substituted antibody was converted from free 3-(N-carboxymethyl)-diphenylhydantoin to BiOgel.
200-40 rp filtration using a P1Q column.
Fibrinogen and fibrinogen degradation products were separated using a column equilibrated with 0.15 M saline in 14 samples of 6-Pesodocorium at 0 mesh. The D fragment was reacted with 8-acetylmercaptosuccinic anhydride to introduce a protected thiol group. Monoclonal antibodies were prepared using succinimidyl 4-(N-?L/nomitomethyl)cyclohexane-1 to introduce the maleimide residue.
- reacted with carboxylates. For coupling, the tethered thiol groups in fibrinone or Dfi pieces were released by treatment with hydroxylamine 25mM and -7 for 1 hour at room temperature. The thiol proteins or fragments were then mixed with maleimide-monoclonal antibodies. - After day and night couplings, excess maleimide residue is blocked by treatment with conjugate mercaptoethanol and then N-ethylmaleimide is treated to block excess thiol groups. The conjugate was then purified by chromatography on Sepharose CL-4B for the fiderinone antibody and Sephacryl 8-300 for the single antibody, but the initial eluted protein is useful.
化学名9− (2−ヒドロキシ−エトキシメチル)グア
ニンなる抗ヴイルス剤アシクロヴイル(acyclov
ir )に対しては、サクシニルアシクロヴイルのN−
1,ドロキシテクシニミドエステルの10分子を精製さ
れた抗体の各分子と室温(20℃)で16時間燐酸0.
01 Mと食塩を含む緩衝溶液中で−7,4にて反応せ
しめた。置換された抗体は遊離の小さい分子からBiO
gel P i Qのカラムを用いるデルー過により、
200−400メツシユで6wtのペットボリウム11
1dのサンプルを用す1食塩水0.15 Mと平衡させ
たカラムで分離した。Chemical name: 9-(2-hydroxy-ethoxymethyl)guanine Antiviral agent acyclovir
ir), N- of succinyl acyclovir
1. Ten molecules of droxytechnimide ester were added to each molecule of purified antibody and phosphoric acid was added for 16 hours at room temperature (20°C).
The reaction was carried out at -7.4 in a buffer solution containing 0.1 M and sodium chloride. Displaced antibodies are converted from free small molecules to BiO
By Delu filtration using a column of gel P i Q,
6wt pet volume 11 with 200-400 mesh
The 1d sample was separated on a column equilibrated with 0.15 M monosaline.
0から1000ピコモル(picomolea )のコ
ルチゾールを含むと信じられる血清または尿のサンプル
50a#を、1ピコモルのコルチゾール−単クローン性
B()−79抗体抱合体、20μj中のコルチゾールに
対して向けられた抗血清からの精製工g060ピコモル
、2mMのナトリウム8−アニリノ−1−ナフチレンス
ルフオーネート50μIc?7.6)と混合した。37
℃で30分間イン中ユペートシたi、130ナノモルの
ジチオトレイトールと20ピコモルの第2非置換活性化
抗体BG−81にすでに混合された活性化しうるβ−ガ
ラクトシダーゼの約1ピコモルを、10mメタノールを
含む−7,40の燐酸緩衝溶液100 mM中の7mM
のo−ニトロフェニル−β−D −カ9 / )シト基
質の200μ!に添加した。インキュペータヨンを更に
もう30分間継続し、それから光学濃度を420 nm
で読んで記録し、反応を10憾ジメチル−スルフオキシ
ドまたはその他の有機溶媒または11のデオキシコール
酸ナトリウムを含む0.4Mの炭酸ナトリウム1−で停
止させた。標準を適切な範囲にわたって用意し、又各サ
ンプルに対するブランク(抗−コルチゾールなし置換さ
れた抗体なし)もまた準備した。その結果は下記の第2
表に示されている。A sample of serum or urine 50a# believed to contain 0 to 1000 picomolea of cortisol was directed against cortisol in 1 pmol of cortisol-monoclonal B()-79 antibody conjugate, 20 μj. Purification from antiserum: g060 pmol, 2mM sodium 8-anilino-1-naphthylenesulfonate 50μIc? 7.6). 37
Approximately 1 pmol of activatable β-galactosidase, already mixed with 130 nmol dithiothreitol and 20 pmol of the second unsubstituted activating antibody BG-81, was incubated for 30 min at °C in 10 methanol. -7mM in 100mM phosphate buffer solution containing -7,40
200 μ of o-nitrophenyl-β-D-ka9/)cytosubstrate! added to. Continue the incubation for another 30 minutes and then reduce the optical density to 420 nm.
The reading was recorded and the reaction was stopped with 0.4 M sodium carbonate containing 10 dimethyl-sulfoxide or other organic solvent or 11 sodium deoxycholate. Standards were prepared over the appropriate range, and blanks (no anti-cortisol, no substituted antibodies) were also prepared for each sample. The results are shown in the second section below.
shown in the table.
コルチゾールの存在 光学濃度420(p
mol )
0 0.6B5
0.9510
1.0720 1
.1240 1.18
60 1.21100
1.251000
1.36fIJ2−ジフ
ェニルヒダントインに対する分析0.5かう2.5 n
mobのジフェニルヒダントインを含むと信じられる
血清サンプル25μlを25μl中のジフェニルヒダン
トイン−単りローン性BG−79抗体抱合体4ピコモル
およびジフェニルヒダントインに対抗して向けられた抗
血清からの25μ!中の精製工gG90Qピコモルと混
合させた。そのチューブを67℃でインキュベーション
におき、500ナノモルのジチオトレイトールおよび2
0ピコモルの第2非置換活性化抗体BG−81をすでに
混合しである活性化しうるβ−ガラクトシダーゼ酵素の
6ぎコモルを添加した。−7,4の100 mMの燐酸
緩衝溶液中の7 mMの〇−二トロフェニルーβ−D−
ガラクトシド基質の200μ−をそれから添加し総イン
キュベーション量325μぎとした。インキュベーショ
ンは6ノ℃で15分間継続し、それから11のデオキシ
コール酸ナトリウムを含む肌2Mの炭酸ナトリウムの1
−で反応を停止し、光学濃度を420 nmでdみとっ
た。ジフェニルヒダントインの標準を5から20μg/
lrtの血清の適切な範囲にわたって準備し、又、各サ
ンプルに対するブランク(抗フェニトインなし、ジフェ
ニルヒダントイン抱合抗体なし)をも用意した。その結
果は下記の第3表に示されている。Presence of cortisol Optical density 420 (p
mol ) 0 0.6B5
0.9510
1.0720 1
.. 1240 1.18
60 1.21100
1.251000
Analysis for 1.36fIJ2-diphenylhydantoin 0.5 to 2.5 n
A sample of 25 µl of serum believed to contain diphenylhydantoin of M. moba was prepared with 4 picomoles of diphenylhydantoin-singular BG-79 antibody conjugate in 25 µl and 25 µl of the antiserum directed against diphenylhydantoin! It was mixed with picomole of refinery gG90Q. The tube was placed incubating at 67°C and 500 nmoles of dithiothreitol and 2
Six moles of activatable β-galactosidase enzyme were added to 0 pmol of the second non-substituted activating antibody BG-81, which was already mixed. -7,4 in 100 mM phosphate buffer solution of 7,4
200μ of galactoside substrate was then added for a total incubation volume of 325μ. Incubation lasted for 15 minutes at 6 °C, then 1 part of 2M sodium carbonate containing 11 parts of sodium deoxycholate.
The reaction was stopped at - and the optical density was measured at 420 nm. 5 to 20 μg/diphenylhydantoin standard
A suitable range of lrt sera were prepared and blanks (no anti-phenytoin, no diphenylhydantoin-conjugated antibodies) for each sample were also prepared. The results are shown in Table 3 below.
oO,175
50,225
100,241
200,247
コントロール:抗体なし 0.328コン
トロール:抱合体なし 0.0740.6か
ら24ピコモルの断片D’g含むと信じられる血清のサ
ンプル10μlを試薬1と室温で混合し5分間反応せし
めた。次に20μlの試薬2ヲ添加し、イン中ユベーシ
ョンを67℃で10分間始めた。次に500μlの基質
を加え、インキュベーション1t67℃で5分間継続し
た。次−で反応を100μIの停止剤の添加により停止
させ。oO,175 50,225 100,241 200,247 Control: No antibody 0.328 Control: No conjugate 0.074 A 10 μl sample of serum believed to contain 0.6 to 24 pmol of fragment D'g was mixed with Reagent 1 at room temperature. The mixture was mixed and reacted for 5 minutes. Next, 20 μl of reagent 2 was added and incubation was started at 67° C. for 10 minutes. Then 500 μl of substrate was added and incubation continued for 5 minutes at 67°C. The reaction was then stopped by the addition of 100 μl of stopper.
浴液の光学濃度を420 nmで読みとった。断片りの
標準を適切な範囲5から200μg/+d血清にわたっ
て調製した。使用した試薬と得られた結果を第4表およ
び第5表にそれぞれ示しである。The optical density of the bath solution was read at 420 nm. Fragment standards were prepared over the appropriate range 5 to 200 μg/+d serum. The reagents used and the results obtained are shown in Tables 4 and 5, respectively.
第4表
フィブリノーゲン分解産物DK対する分析試薬ジチオト
レイトール250 mM水中400μl試薬2 率クロ
ーン性工gG−D断片の抱合体=800μl、アラビ、
トール6001Rfi/l、115μl−標準ヒツジ免
疫グロブリンニア、200μl緩衝溶液中。Table 4 Analytical reagents for fibrinogen degradation product DK Dithiothreitol 250 mM in water 400 μl Reagent 2 Conjugate of cloned gG-D fragment = 800 μl, arabic,
Toll 6001 Rfi/l, 115 μl - standard sheep immunoglobulinnia, in 200 μl buffer solution.
試薬1および2ならびに基質に用いられる緩衝溶液
50 mM )リス
25mM塩化ナトリウム
10mM塩化マグネシウム
1m M II!DTA
−7,5
基質2.5モラルメタノールを含む緩衝溶液中の0−ニ
トロフェニルβ−D−がラクトシIP2.5119/s
g停止試薬 2Mグリシン
0.2係コール酸ナトリウム
第5表
断片Dμg/ld 光学濃度420
nm0 0.4041
5 0.40925
0.41240
0.42665
0.464100
0.548200
0.566例4−フイブリノーゲンに対する分
析
0から31Jv/−のフイブリノーゲンを含むと信じら
れる血清のサンプル20μlをフィブリノ−rンに対抗
して向けられた抗血清からの精製工gGの260μg/
−溶液の20μlと混合した。抱合されたフイデリノー
デンーエgG(79)20μl、光学濃度28”hm
+ 0.22 Kそれから酵素混合物20μlc#l素
の硫酸アンモニウム懸濁液6μ/、10ダ/−のジチオ
トレイトール100μJ、250mMのトリス緩fI溶
液1−とフラスコ成長率クローン性抗体BG−811m
g)を加えた。その混合溶液を5分間67℃でインキュ
ベートしそれから10憾メタノールを含むトリス緩衝溶
液中のo−ニトロフェニル−β−D−ガラクトシド7m
Mの200μl’を加、tた。インキュベーションY2
0分間37℃で継続し、それから反応を1優のデオΦシ
コール酸ナトリウムを含む0.4Mの炭酸ナトリウム5
00μlで停止した。標準を適切な範囲にわたり調製し
、各々のサンプルに対する置換された単クローン性抗体
を含まぬブランクもまた用意した。Buffer solutions used for reagents 1 and 2 and substrate 50mM) Lith 25mM Sodium chloride 10mM Magnesium chloride 1mM II! DTA-7,5 substrate 2.5 0-nitrophenyl β-D- in a buffer solution containing moral methanol is lactose IP2.5119/s
g Stop reagent 2M glycine 0.2 Sodium cholate Table 5 Fragment Dμg/ld Optical density 420
nm0 0.4041
5 0.40925
0.41240
0.42665
0.464100
0.548200
0.566 Example 4 - Analysis for Fibrinogen A 20 μl sample of serum believed to contain 0 to 31 Jv/- of fibrinogen was purified from an antiserum directed against fibrinogen.
- mixed with 20 μl of the solution. 20 μl of conjugated fiderinoden-egG(79), optical density 28”hm
+ 0.22 K then enzyme mixture 20 µl c#l of ammonium sulfate suspension 6 µ/, 10 da/- dithiothreitol 100 µJ, 250 mM Tris mild fl solution 1- and flask growth rate clonal antibody BG-811m
g) was added. The mixed solution was incubated at 67°C for 5 min and then 7 m O-nitrophenyl-β-D-galactoside in Tris buffer containing 10 methanol was added.
200 μl' of M was added. Incubation Y2
Continue at 37°C for 0 min and then react with 0.4 M sodium carbonate containing 1 ml of sodium deo-sicolate.
Stopped at 00 μl. Standards were prepared over the appropriate range and blanks containing no substituted monoclonal antibodies for each sample were also prepared.
その結果は下記の第6表に示しである。The results are shown in Table 6 below.
第6表 フィブリノ−rン標準曲線
0 0.518
0.031 0.626
0.063 0.667
0.125 0.769
0.25 0.892
0.50 0.955
1.0 1.102
むと信じられる崩清をdk衝浴溶液4倍に稀釈し、それ
から10μlのサンプルを室温で20μlの試4Aと混
合し、5分間反応せしめた。それから20μぎの試薬B
を加え、インキュベーションを室温で10分間継続した
。前もって37℃にあたためた500μlの基質を加え
67℃の水浴で5分間インキュベーションを開始した。Table 6 Fibrinone standard curve 0 0.518 0.031 0.626 0.063 0.667 0.125 0.769 0.25 0.892 0.50 0.955 1.0 1.102 The trusted disintegration was diluted 4 times in dk buffer solution, then 10 μl of the sample was mixed with 20 μl of Trial 4A at room temperature and allowed to react for 5 minutes. Then 20 μm of reagent B
was added and incubation continued for 10 minutes at room temperature. 500 μl of substrate, previously warmed to 37° C., was added and incubation was started for 5 minutes in a 67° C. water bath.
それから、反応を100μgの停止試薬の添加により停
止させ、溶液の光学濃度を420 nmで読みとった。The reaction was then stopped by the addition of 100 μg of stop reagent and the optical density of the solution was read at 420 nm.
アシクロヴイルの標準を、血清中1から10μMの適切
な範囲にわたって調製した。使用した試薬と得られた結
果は第7表および第8表にそれぞれ示しである。Acyclovir standards were prepared over the appropriate range from 1 to 10 μM in serum. The reagents used and the results obtained are shown in Tables 7 and 8, respectively.
第7表
丁シクロヴイルの分析用試薬
試薬A
D(+)アラビトール 1.2
g緩衝溶液 6000μ!
試薬B
O,11v/−標準ヒツジ免疫グロブリンと共に、緩衝
浴液中20μg/−での単りローン性工gG−アシクロ
ヴイルの抱合体、
試薬AおよびBならびに基質に用いられた緩衝溶液50
mM)リス
25mM塩化ナトリウム
’l [3mM塩化マグネシウム
1m M EDTA
塩酸でp)17.5に調整する
基質
2.5モラールのメタノールを含む緩衝溶液中0−ニト
ロフェニルβ−D−がラクトシl&2+4’/−6停止
試薬
2M〆リシン
2 Q Q m M EDTA
0.2係コール酸ナトリウム
水酸化ナトリウムでp)110.1にaMi整する第8
表
アシクロヴイル標準曲線
0 0.529
0.345
2.5 0.3910.595
5 0.569
0.575
7.5 0.6450.629
10 0.675
0.665
代理人 浅 村 皓
外4名Analytical reagent for No. 7 Cyclovir Reagent A D(+)arabitol 1.2
g buffer solution 6000μ!
Reagent B O, 11 v/- conjugate of single clone gG-acyclovir at 20 μg/- in buffer bath with standard sheep immunoglobulin, buffer solution used for reagents A and B and substrate 50
25mM sodium chloride [3mM magnesium chloride 1mM EDTA; -6 stop reagent 2M lysine 2 Q Q m M EDTA 0.2 Sodium cholate Adjust aMi to 110.1 p) No. 8
Table Acyclovir standard curve 0 0.529 0.345 2.5 0.3910.595 5 0.569 0.575 7.5 0.6450.629 10 0.675 0.665 Agent Asamura Kangai 4 people
Claims (1)
の物質の存在を決定し、または定量する方法であって、 a)実質的に不活性の酵素を活性化できる抗体に結合し
た物質からなる抱合体、その物質に41員的な抗体もし
くは結合蛋白、および実質的に不活性の酵素の過剰とそ
の媒体を共に混合し、媒体中のいかなる物質屯その物質
に特異的な結合蛋白もしくは抗体と反応する機会をもつ
までに酵素が抱合体と混合しな―ような順序でその構成
成分を添加し、そして b)酵素に対する基質を加え、その酵素の活性を測定す
ること、 からなる方法。 +21&) その物質に特異的な結合蛋白もしくは抗体
と実質的に不活性の酵素の混合物へ媒体を加え。 −1)) ’*質的に不活性の酵素を活性化できる抗
体と結合したその物質の抱合体を加え、そしてC)dI
素に対する基質を加えてその酵素活性を測定すること からなる上糾第(11項の方法。 (31!L) 実質的に不活性の酵素を活性化できる
抗体に結合した物質からなる抱合体:およびその物質に
t!!iJA的な結合蛋白もしくは抗体と媒体を共に混
合し、 b)実質的に不活性の酵素の過剰を添加し、そして C)その酵素の基質を添加して酵素活性を定量すること
からなる上記第(11項の方法。 (4) 実質的に不活性の酵素を活性化できる抗体が
巣クローン性抗体である上記1X(1)項からta)項
までのいずれか一つの方法。 (5) 実質的に不活性な#!eを活性化し傅るJl
!にもう一つの抗体を酵素が他の成分のいずれかに添加
される前にその#素と混合させる上記第(11項から(
4)項までの−ずれか一つの方法。 (6)実質的に不活性の#累が活性化された時にβ−が
ラクトシダーゼの活性の1憾より小さめ活性をもつβ−
がラクトシダーゼの変14型である上記第(11%から
(5)項までのいずれか一つの方法。 (7) β−がラクトシダーゼの変異型が大腸−の突
然変異株の培養によりa4製されるような上記第(6)
項の方法。 (8)試験される脂質が抗てんかん薬、抗生物質、抗ヴ
イルス剤、ホルモンまたは蛋白質である上記証(1)項
から(7)項までのいずれか一つの方法。 (9)その分析が制約7.4、アルカノールまたは?リ
オールの存在下に10℃から45℃の間で実施される上
IE[(11項から(8)項までのいずれか一つの方法
。 (II D−アラピタールの存在下に実施される上記
第(1)項から(9)項までのいずれか一つの方法。 (1υ メタノールの存在下に実施される上記第(1)
項から01項までのいずれか一つの方法。 (至) その分析が−を約−10にまで変化させマグネ
シウムに対するキレート化剤と脂質可溶化剤をから09
項までのいずtか一つの方法。 U 実質的に不活性の酵素を活性化可能な抗体に結合し
た、前記に定義したような測定されるべき物質からなる
抱合体。 α荀 試薬1:実質的に不活性の酵素と混合した分析さ
れるべき物質に特異的な抗体 試薬2:実質的に不活性な酵素を活性化し得る抗体に結
合した物質から成る抱合 体 試薬3:実質的に不活性の酵素に対する基質試薬4:停
止剤 からなる試験キット。[Scope of Claims] (1) A method for determining or quantifying the presence of a substance in a medium presumed to contain the substance, comprising: a) an antibody capable of activating a substantially inactive enzyme; A conjugate consisting of a substance bound to the substance, a 41-membered antibody or binding protein to the substance, and an excess of a substantially inactive enzyme are mixed together with the medium, and any substance in the medium is specific for the substance. b) adding the components in an order such that the enzyme does not mix with the conjugate before it has had a chance to react with the binding protein or antibody; and b) adding a substrate for the enzyme and measuring the activity of the enzyme. , a method consisting of. +21&) Adding medium to a mixture of a binding protein or antibody specific for the substance and a substantially inactive enzyme. -1)) '*adding a conjugate of that substance conjugated to an antibody capable of activating a qualitatively inactive enzyme, and C) dI
(31!L) A conjugate consisting of a substance bound to an antibody capable of activating a substantially inactive enzyme: and the substance together with a t!!iJA-like binding protein or antibody and a medium, b) adding an excess of a substantially inactive enzyme, and C) adding a substrate for the enzyme to increase enzyme activity. (4) Any one of the above paragraphs 1X(1) to ta), wherein the antibody capable of activating a substantially inactive enzyme is a focal clonal antibody. Two ways. (5) Substantially inert #! Jl that activates e and fulfills
! Mix another antibody with the enzyme before it is added to any of the other ingredients (from paragraph 11 above).
4) - Any one of the methods. (6) β- has an activity less than one of the activity of lactosidase when the substantially inactive # is activated.
Any one of the above-mentioned methods from (11% to (5)), in which β- is a mutant type 14 of lactosidase. (6) above as
Section method. (8) The method according to any one of items (1) to (7) above, wherein the lipid to be tested is an antiepileptic drug, an antibiotic, an antiviral agent, a hormone, or a protein. (9) Is the analysis constrained by 7.4, alkanol or? The method of the above IE [(any one of paragraphs 11 to (8)) carried out at between 10 °C and 45 °C in the presence of D-arapital. Any one of the methods from item 1) to item (9). (1υ The above method (1) carried out in the presence of methanol.
Any one method from item 01 to item 01. (to) The analysis changed the - to about -10 and the chelating agent and lipid solubilizer for magnesium to 09
Any one way to the term. U A conjugate consisting of the substance to be measured as defined above in which a substantially inactive enzyme is linked to an activatable antibody. Reagent 1: An antibody specific for the substance to be analyzed mixed with a substantially inactive enzyme Reagent 2: Conjugate reagent 3 consisting of a substance bound to an antibody capable of activating a substantially inactive enzyme : A test kit consisting of: a substrate reagent for a substantially inactive enzyme; 4: a stop agent.
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Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS58211662A (en) * | 1982-05-24 | 1983-12-09 | マイルス・ラボラトリ−ズ・インコ−ポレ−テツド | Uniform system combination analysis method for measuring sample in test sample and reagent system used for said method |
JPS59164960A (en) * | 1983-03-11 | 1984-09-18 | Fujirebio Inc | Assay of antigenic determinant-containing substance |
JPS59178361A (en) * | 1983-03-29 | 1984-10-09 | Fujirebio Inc | Measurement of antigen determinant-containing substance |
JPS59178360A (en) * | 1983-03-29 | 1984-10-09 | Fujirebio Inc | Measurement of antigen determinant-containing substance |
JPS59194906A (en) * | 1983-04-15 | 1984-11-05 | 株式会社荏原製作所 | Throw-in chute for air transporter |
JPS6170462A (en) * | 1984-08-22 | 1986-04-11 | ベーリンガー・マンハイム・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング | Method and reagent for measuring substance immunologically having connection capacity |
JPH0728043U (en) * | 1993-11-01 | 1995-05-23 | 公之 宿岩 | Container stand |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5847491A (en) * | 1981-09-18 | 1983-03-19 | Ajinomoto Co Inc | Suspension of beta-d-galactosidase action |
IL67289A (en) * | 1982-03-18 | 1985-12-31 | Miles Lab | Homogeneous immunoassay with labeled monoclonal anti-analyte |
AU559576B2 (en) * | 1983-01-31 | 1987-03-12 | Boots-Celltech Diagnostics Limited | Immunoassay |
FR2569276B1 (en) * | 1984-08-14 | 1988-02-05 | Stago Diagnostica | METHOD FOR DETERMINING FIBRINOGENIC DEGRADATION PRODUCTS |
US4629689A (en) * | 1984-08-29 | 1986-12-16 | Allied Corporation | Binding assay with amplified read-out and gas-phase detection |
GB2511761A (en) * | 2013-03-11 | 2014-09-17 | Cancer Rec Tech Ltd | Methods for detecting molecules in a sample |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA1028643A (en) * | 1975-02-20 | 1978-03-28 | Judith I. Blakemore | Polylodothyronine immunoassay |
IT1105734B (en) * | 1977-07-14 | 1985-11-04 | Syva Co | TEST OF COMPETITION LINK OF HOMOGENEOUS ANTI-ENZYME |
-
1982
- 1982-06-28 GB GB8218641A patent/GB2102946B/en not_active Expired
- 1982-06-29 JP JP11246582A patent/JPS587561A/en active Pending
- 1982-06-29 FR FR8211366A patent/FR2508486A1/en active Granted
- 1982-06-29 DE DE19823224217 patent/DE3224217A1/en not_active Withdrawn
Cited By (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS58211662A (en) * | 1982-05-24 | 1983-12-09 | マイルス・ラボラトリ−ズ・インコ−ポレ−テツド | Uniform system combination analysis method for measuring sample in test sample and reagent system used for said method |
JPS59164960A (en) * | 1983-03-11 | 1984-09-18 | Fujirebio Inc | Assay of antigenic determinant-containing substance |
JPS59178361A (en) * | 1983-03-29 | 1984-10-09 | Fujirebio Inc | Measurement of antigen determinant-containing substance |
JPS59178360A (en) * | 1983-03-29 | 1984-10-09 | Fujirebio Inc | Measurement of antigen determinant-containing substance |
JPH0317101B2 (en) * | 1983-03-29 | 1991-03-07 | Fujirebio Kk | |
JPH0377462B2 (en) * | 1983-03-29 | 1991-12-10 | Fujirebio Kk | |
JPS59194906A (en) * | 1983-04-15 | 1984-11-05 | 株式会社荏原製作所 | Throw-in chute for air transporter |
JPS6357328B2 (en) * | 1983-04-15 | 1988-11-10 | Ebara Mfg | |
JPS6170462A (en) * | 1984-08-22 | 1986-04-11 | ベーリンガー・マンハイム・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング | Method and reagent for measuring substance immunologically having connection capacity |
JPH0728043U (en) * | 1993-11-01 | 1995-05-23 | 公之 宿岩 | Container stand |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE3224217A1 (en) | 1983-01-13 |
GB2102946B (en) | 1984-11-28 |
FR2508486B1 (en) | 1984-12-28 |
FR2508486A1 (en) | 1982-12-31 |
GB2102946A (en) | 1983-02-09 |
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