JPS5873867A - 白血球付着阻止検定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は癌の存在を検査する方法に関する。更に詳しく
は分画され、かつ１５１Ｃ「−標識された白血球を使用
する癌の検査方法に係る。

悪性腫瘍に対する細胞並びに体液性免疫応答が広範に研
究されている。細胞−媒介免疫性検定（ＣＭＩ）は５つ
の一般的カテゴリーに分けらねる。

即ち、細胞−媒介細胞毒性（ＣＭＣ）、ＩＪン・９球刺
激（胚発生）およびリンホカイン分泌（遊走阻止）を測
定する３株の試験である。細胞毒性および胚発生検定は
無菌培養条件のめんどうな維持を必要とし、かつ検定完
了までに数日かかる。遊走阻止検定は癌患者におけるＣ
ＭＴ応答全監視するのに極めて有用であるが完了するの
に２日ヲ蚤する。更に、これらを定量化する土でいくつ
かの困難がある。迅速かつ簡単な方法の研究において、
Ｈａｌｌｌｄａｙ　＆　Ｍｉｌｌｅｒ　（ｆｒｅｔ、　
Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　、　　７　、１（１９７１））は
白面球付ｓ阻止テス）（ＬＡＩ）ｉ導入した。この１日
検定法は、幾分かの免疫性リンパ細胞が特定の膿瘍抗原
の存在下にて、ガラス表面に付着する能力を喪失すると
いう観桜に基いてなされた。原方法において、Ｈａｌｌ
ｉｄａｙ　　はリンパ細胞と抗原との混合物を血球計室
内で培養した。

ＬＡＩの程度は穏かに洗浄した後残留する、ガラス−付
着細胞を数えることによル決定された。この方法を簡略
化するためになされた、その後の試みはＨｏｊａｎの試
験管法並びにＨａｌｔ　　のミクロプレート法を含んで
いた。試験管法においては、混合物はガラス管内で装置
され、流体中に残留した非−付着細胞が血球計で計数さ
れた（　Ｃｅ１ｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、。

１３．１０７（１９７４））。Ｈａｌｔ　　等は、これ
に対して、プラスチック組織培養グレートを使用した（
　Ｊ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　８．
２７７　（１９７５））。これらの改良を利用して、多
くの研究者等が、細胞−媒介反応性の他に、白鹿球付着
明止テストによっても腫瘍の進行段階にあ・る患者の血
清目止因子を検出し＝るというＨａ　Ｉ　Ｉ　１ｄａｙ
　　の観察を確認した。

これら最近の進歩にもかかわらず、癌患者中の細胞−媒
介免疫性を監視するための方法としてのＬＡＩは依然と
して広範に利用されてはいない。

主たる欠点の１つはこの方法が付着（もしくは非−付着
）細胞数を視覚的に数値化しなければならないという点
にある。各混合物中に存在する数百個の細胞を計数して
信頼し得る結果を得なければならない。抗原もしくは血
清の多数の組をテストしようとする場合、時間的な要因
が決定的なものとなシ得る。これは−日に実施し得る試
験数を著しく制限する。細胞数の計数の自動化による該
検定の最近の改善については、めんどうな計測操作を必
要とする。１９’７４年に、ＰｉｅｒｃｅとＤｅｖａｌ
ｄ（Ｉｎｔ、　Ｊ、Ｃａｎｃａｒ、　１４．８３３（１
９７９））はマイクログレート内でネズミのりンノｆ細
胞をテクネチウム９９ｍによって標識することからなる
ＬＡＩ検定法の同位体による変更を導入した。この方法
は視覚的計数法の不正確さを補償するが、９９ｍＴｃの
短い半減期はいくつかの問題を提示した。なぜならば、
すべてのテストが数時間内に完了される必要があるから
である。この方法も完了させるためには労力消費かつ困
難を伴った。

これらの技術的困難さは、更に応答を生ずる免疫学的機
構の理解の不十分さと組合されて一層困難さが増す。大
部分の研究者は、白血球と腫瘍抗原との直接的な相互作
用が存在するという意見を持っているが、特定の細胞の
型および含まれている正確な機構についてはかなシの不
一致がある。

幾人かは、阻止が特定の抗原の存在下で感作リン／４球
により放出される可溶性因子によって媒介されるものと
主張していた。ある情況下で作動し得るとされた別の機
構は循環している単核細胞の表面上における抗原と細胞
親和性の抗体との間の反応および感作単核細胞上での抗
原の直接作用を包含する。これらの争点は、大多数の研
究が不十分なキャラクタリゼーションしかなされていな
い白血球区分を使用して実施されていたという事実に帰
せられる。

我々は、これまでに文献に記載されたＬＡＩ検定法の感
度並びに選択性が、この検定を以下の如〈実施すること
によって実質的に改善されることを見出した。

（ａ）検定すべき血液試料を、そこから白血球を回収す
ぺ〈処理する。末梢崩液試料は臨床的に最も入手が容易
であり、かつ検定に適した白血球を与えてくれる。

（ｂ）　　白血球を放射性化合物で標識する。該放射性
化合物は、細胞の生存性に殆ど影響を与えることなしに
、細胞膜に吸収されるかもしくはこれと反応するか、ま
たは細胞内液中に浸透するようなものである。この化合
物はｒ−線放出体であるべきであり、かつ少なくとも５
日の半減期を有するものである。我々は、ＬＡＩ検定の
目的に対しては　Ｃ「　標識が特に適していることを見
出した。

（Ｃ）　　放射性−標識白血球を分画して、Ｔ−細胞を
分離することが好ましい。以下に説明するような理由か
ら、分画は単核細胞の分離をも結果する。細胞を、■−
細胞おより単核細胞区分に分画することによシ、以下に
述、べろように改善された選択性がもたらされる。しか
しながら１以下に述べるような特別にあつらえた血清も
しくは血漿の使用並びに５ＩＣｒ　８４＠白血球の使用
に係る我々の発見は、Ｔ−細胞または単核細胞の分画を
行うことのないＬＡＩ検定の実施に対しても応用し得る
ものと理解すべきである。

（ｄ）　　分離されたもしくは未分離白血球は細胞生存
性を維持するのに適した培地の存在下で、検定皿内で培
養される。該培地は腫瘍抗原を含み、かつまた約７〜約
２０係のヒト同種血液血漿または血液血清をも含み、こ
の血漿または血清は患者の赤血球と抗原的に相客性であ
シ、かつその結果補体が除去されるか、もしくは失活さ
れる。補体の失活は変性によって有利に達成することが
できる。

（・）培養の結果において、非−付着性細胞は除かれ、
検定容器に付着している細胞の放射能が測定される。腫
瘍抗原の存在下で培養された被検試料と、培養中（腫瘍
抗原が省かれている対照試料とを比較することによシ白
血球付着阻止の′１゜ 指標が与えられる。

本明細書で後に記載されるような改良された細胞分画法
を利用し、高い均一性のＴ−細胞、Ｂ−細胞および単核
細胞を与えるべく分画された放射性−標識した白血球を
用いて、我々は前述の検定法を実施した。この研究は、
精製されたＴ−細胞がＬＡＩ検定において腫瘍特異的応
答をもたらすことだけでなく、単核細胞が侵入性癌の抗
原に対し非特異的反応をもたらすことによっても証明さ
、れる。該抗原は侵入性癌にかかった患者と正常な健康
人とを区別するものである。

我々が開発した付随的な比較テストは患者内の腫瘍特異
的応答を検出可能とするばかりでなく、腫瘍の軽重を検
定することをも可能とする。このような一層の改良は、
ＬＡＩが、実質的に腫瘍をわずらっている患者からの白
血球に適用した場合に、患者自身の血漿が往々にして正
常なＬＡＩ反応を阻止する阻害因子を有しているという
事実に基いてなされたものである。培養媒体中における
同種性の、抗原的に相客性の血清または血漿について行
われたＬＡｌ榛定ε１同種血漿または血清の代りに自己
性血漿または血清が使用されたＬＡＩ検定とを比較する
ことにより、阻止因子を定量化し得る。

紡述の検定は以下の如くいくつかの重要な局面によって
特徴付けられる １、好ましくは１０　細胞膜たシ、少なくとも１０７分
　もしくはそれ以上の細胞内放射能を有する　Ｃｒ標識
リすノｆ細胞を使用する。このような細胞はそれ自体新
規であシ、か゛っ以下に記載するような新規標識方法に
よシ得られるものである。

２、以下に記載される新規な２一段階法が、予め標識し
た白血球からりンノ９細胞区分を単離するために利用さ
れる。各単離された画分、即ちＴ−およびＢ−リンツク
球および単核細胞は表面標識、形態的因子並びにミ）ｒ
ン応答によシ検出されるように著しく均一であることが
わかった。すべての画分における生存能力、　　Ｃｒの
結合性および５１　（、、の自然放出の程度は精製処置
によって何等影響されない。この方法は高度に精製され
た放射性同位体標識した白血球区分を、被験者における
悪性腫瘍の存存を特異的に診断しかつ監視するためのＬ
ＡＩ検定検定用適用ことを可能とする。

６、我々は、患者の赤血球と抗原的に相容性の正常なヒ
トの異形血漿もしくは血清を含むことおよび補体を含ま
ないことによシ、相関のない腫瘍抗原に対する非−特異
的Ｌ＾１応答が防止されていることを見出した。ＡＢ血
漿または血清が便利であシかつ好ましい。かかる非−特
異的反応は初期のＬＡＩ検定について共通の問題であっ
た。最良の結果は血清が培養混合物の約７〜２０チ（容
量）を含む場合に得られることがわかった。約１０係の
濃度で使用することが好ましい。

Ｉ 更に、他の方法と比較して、　　Ｃｒ　　Ｌ＾１検定は
よシ精確、精斐よく、よ少労力節約的で、よシ少ない時
間消費でかつよシ客観的である。更に、白血球、Ｔ−ま
たはＢ−サシＡ１球もしくは単核細胞区分の全個体密度
が、顕微鏡視野から無秩序に選ばれた少量の試料の代り
に、解析することができる◎これらの考察は本発明を独
特かつ腫瘍増殖の検出、治療すべき癌患者の応答および
宿主免疫応答を研究する際における有用な道具として特
徴ずけている。我々の発見は以下の如く要約される。

１、　我々は相関腫瘍抗原に対する特異的応答として付
着力減少をこうむる反応性細胞が７−ＩＪンパ球である
ことを確立した。我々の確定したこの結果は、癌患者か
らの９　＋　ＩＪンノｆ球がＬＡＩにおいて腫瘍抗原に
対して非−反応性であることを示している。他方、単核
細胞は一連の腫瘍抗原に対し非−選択的に応答するが、
正常な組織の抗原に対しては応答しない。未分離　Ｃｒ
標識白血球と比較して、Ｔ−リンパ球は癌患者のＬ＾１
反応性を高い頻度かつ著しく高い特異性と共に反映する
。臨床研究において、我々は侵入性癌にかかった患者群
と良性の決意にかかった患者群と番極めて高い信頼度で
区別することが可能であった。

２、正常な被験者にあっては、７　＋　ＩＪン・や球は
腫瘍抗原に対して非反応性である。非−特異的ＬＡＩ応
答が、単核細胞について、腫瘍抗原に対して検出された
が、反応性の相変は癌患者から単離された感作単核細胞
において観察されるよシも一般的に低かった。我々は、
これら非−特異的ＬＡＩ応答が感作並びに非−感作単核
細胞両者によシ、すべての新生細胞について共通の表面
抗原に向けられているものと推定した。

３、　正常な同種血漿を患者の自己血漿に変えると、進
行性腫瘍にかかった殆どすべての患者において特異的阻
止因子が見出″された。これらの血清阻止因子によって
、相関腫瘍抗原に対するＴ−リンノ９球の特異的鹸識を
阻止することができた。

本発明において使用する抗原は、ＬＡＩ検定に関連して
前記した通常の方法のいずれかに従って調製することが
できる。しかしながら、特別の方法を利用することが好
ましく、それによれば他の細胞物質による汚染が殆どな
い、血漿膜起原の抗原を得ることができることがわかっ
た。

第１図はＬＡＩ検定用抗原を調製するための新規な好ま
しい方法を概略的に示した図である。本発明の検定処理
を発展しかつ応用し得る一方で、以下に記載する方法は
、勿論他のＬＡＩ検定法においても利用することができ
る。

悪性癌単−細胞懸濁液を調製するための第１工程におい
ては、悪性癌の外科的に取出した試験片を抗原の源とし
て使用するために小片に切断し、結合組織をｒ８化する
のに効果的なタンｉ４り分解酵素で該小片を処理した。

こうして単一細胞の懸濁液が得られ、該細胞は分裂組織
の沈降後に吸引によシ取出すことができる。コラーｒナ
ーゼが消化工程において使用するのにとシわけ適してい
ることがわかった。普通、消化は約１５分間、適度の攪
拌を使用する公知の条件下で行われる。被検悪性腫瘍、
即ち胸部癌、中皮腫、黒色腫、結腸直腸癌、肺癌、膵臓
癌、白血癌などの種々の組織学的起源に対して、かかる
処方が必要とされる。

次に１前記単一細胞処方物を洗浄して過剰の酵素を除き
、かつ機械的に均質化して細胞膜を破壊する。これは、
例えば単一細胞懸濁液を氷冷したｉ１票キャビテーショ
ン容器内で、３０気圧下で１５分間処理することにより
達成することができる。急激な圧力解除は細胞破壊を生
ずる。容器内に解放された破壊された細胞の懸濁液は、
完全な細胞、細胞核およびミトコンドリアを除去するの
に十分な条件下で遠心分離に付される。

上澄液中の原形質膜ミクロソームおよびリージンームは
集められ、かつ不連続スクロース勾配（例えば、４０〜
６０俤のａ＃Ｌ範囲を有する）下で再遠心処理して、ミ
クロソームおよびリンンームから原形質膜を分離する。

リンンームからの原形質膜の除去は、リンンームが加水
分解酵素を放出する限９重壺なことであシ、これが除去
されない場合には原形質膜が消化される傾向がある。

９０．０００ｘｉにて２時間に亘る遠心処理はこのよう
な分離を十分に達成する。卵形質膜粒子を含有する界面
バンドを集め、２度洗浄し、そのタンパク含量を決定し
、これを調節して最終タン／４’り製電が２０嗟スクロ
ース・培液１−当たシ２〜５ｍ９となるようにする。こ
の処方物ＩＬＡＩ検定法においてｌ腫瘍抗原〃と呼び、
以下においてもそのように記載する。

経験によれば、すべての腫瘍抗原処方物が腫瘍特異的応
答を喚起する能力を有するわけではないことが示される
。従って、腫瘍抗原は活性および交叉反応性について、
例えば本発明によるＬＡＩ検定を利用してテストして、
同じ組織学的起源の悪性であることが知られている患者
およびかかる悪性を有さないことが知られている患者の
白血球と共に培養した場合に、候補の腫瘍抗原が白血球
付着の腫瘍−特異的阻止を生ずるか否かを決定する。こ
れらの活性であるものと証明され、かつ腫瘍−特異的応
答を有する抗原処方物は、次いで本発明に従って検定に
おいて使用するために一１９６℃にて貯蔵する。解凍後
、抗原処方物は常に使用する前に２０００　ｘｆにて１
０分間遠心処理に付される。

第２図けＬＡＩテスト用の末梢血液白血球（１１１ ＰＢＬ）の調製□方法を概略的に示すものである。

ヘノ４リン化血液試料は被検患者から採られ、血液は分
画されて、リン・９球および単核細胞が分離される。リ
ンフ９球および単核細胞を含有する画分は回収されて、
Ｃ「　クロム酸ナトリウムで放射能−標識される。未標
識白血球試料をも、７　＋　ＩＪンノ４’球、８−リン
パ球並びに単核細胞密度および生存能力についてキャラ
クタリゼーションすることが好ましい。生存能力は、継
続的なテスト処理の完結のために生きたリンパ球および
単核細胞が必要とされる限りにおいて重要である。

５１Ｃ「標識は１０ＰＢＬ当たり少なくとも１０４７分
の細胞内放射能を有する標識白血球密度を達成するため
に有効であり、また標識白血球のキャラクタリゼーショ
ンは、■−リンノ９球、Ｂ−リンノ母球および単核細胞
密度並びに生存性および機能性がすべて実質的に初めの
白血球画分と類似していることを示している。

好ましい状態よりも低い状態で標識された、即ち１０５
白血球当たｊＤ１０’／分よシ少い細胞内放射能を有す
る白血球も使用し得ることが理解されよう０しかしなが
ら、かかる低い放射能はテストを完了するための計数時
間を増大させ、かつ感度が非−比例関係で減少する。

ＲＰＭＩ−１６４０、生理塩水および生理塩水とグルコ
ースの混合物などの媒体は、白血球を５Ｉｃｒで標識す
る際に使用することができる。一般に、これらの媒体は
本発明の好ましい実施のために十分な放射能を有する標
識白血球密度を与えないことがわかった。放射能の改良
された収率を得るためには、培養用培地も１〜６１／ｌ
の塩化カリウム並びに生理学的に許容されるｍｕの塩化
ナトリウムおよびグルコースまたはデキストロースなど
の滋養分としての糖をも含有すべきであることがわかっ
たｃ以下ＧＮＫという）。我々は継続的に、０．９１Ｎ
ａα、２１／ｌのにα、１１／ｌのデキストロース：０
．９１のＮａα、４？／ｌのにα、１ｙ／ｌのデキスト
ロース（最適培地）：および帆９優のＮａα、６？／ｌ
のにα、１？／ｌのデキストロースを夫々含有する培地
を使用した。

患者から回収した白血球を適当な各課、例えば上記の最
適培地中に懸Ｙ−させて、クロム酸ナトリウムを添加し
て、少なくとも１５０μＣ１の　Ｃｒを付与する。この
混合物を、次に適当な時間、典型的には１〜２時間、３
７℃にて培養して、標識細胞が、１０５細胞当たシ少な
くとも１０４７分の細胞内放射能を示すのに十分な量で
ＰＡＬか　Ｃｒｆ取シ込むようにする。培養後、試験管
を取シ出し、氷水で急速に冷却する。混合物を遠心分離
に掛けて、標識ＰＢＬを分離し、これを洗浄して細胞外
５１Ｃｒを除去する。洗浄した白血球を、次いで適当な
溶媒、例えばＲＰＭＩ−１６４０中で保存し、本発明の
ＬＡＩ検定に従って後の使用に付し、かつ更なる分離に
供する。　４ Ｔ−１７７１球、ｓ−０７８球および単核細胞を分離す
るだめの伝統的な方法は２一工程法全含み、そこでは単
核細胞が最初に極めて重質の元素、例えば鉄の取シ込み
を生じ、これによって単核細胞は遠心法によシ分離され
る。その後、残部の９７７１球は羊の赤血球ｃＳＲＢＣ
，）で処理される。

１１ ＳＲＢＣはＴ−リンパ球と共にロゼツトを形成し、その
結果遠心分離法によｊ）　Ｔ　＋　リンｉ４’球を回収
することか可能となる。■−リンノ臂球は羊赤血球を溶
解することによｐ　５Ｒ８Ｃから分離される。

我々はＴ−細胞、８−細胞および単核細胞を分離するた
めの新規方法を見出した。該方法は従来法の改良である
。というのは、我々の方法が単核細胞を肉眼視できる形
で回収することを可能とするものであるからである。我
々の、Ｔ−およびＢ　＋　１７ンノ母球並びに単核細胞
の好ましい分離方法は第３図に概括されている。初めの
工程においては、白血球懸濁液が５ＲＢＣで処理され、
該５ＲＢＣは７　＋　１７ンパ球と共にロゼツトを形成
するので、これを遠心操作により分離することができる
。このロゼツト法は一般に５ＲＢＣとＴ−細胞との間に
高重力遠心操作に耐え得るのに十分強力な結合を形成す
るわけではないので、Ｔ−細胞回収効率は低い可能性が
ある。我々はこの方法について、まｆｓＲＢｃをハロダ
ン化剤で処理して、ハロゲンイオンを５ＲＢＣＫ’付着
さぜることによシ改良した。

白血球混合物をハロゲン化５ＲＢＣで処理することによ
シ、ハロゲノがＴ−細胞と付随的なイオン性結合を形成
し、この結合がロゼツト形成の強度を改善する、倉、こ
のようにして、遠心力下でのロゼツトの回収効率が著し
く改善される。

本発明において使用するノ１０ｒン化剤は担体イオンお
よび負のハロゲンイオン、好ましくは臭素イオンを含む
。該担体イオン５ＲＢＣおよびリンノ臂球両者に対して
生理学的に無害でなければならず、かつこのものが担持
するノ・口ｒンイオンｉ、５ＲＢＣと接触させた際に遊
離することのできるものでなければならない。我々は、
アミノアルキルチオウロニウムハライド、例えばアミノ
エチルインチオウロニウムゾロミド（Ａ　Ｅ　Ｔ　）　
（Ｓｉｇｍａ　Ｃｏｍｐａｎｙ）が特に好ましいもので
あることを見出した。

本発明によれば、ＡＥＴ−処理した５ＲＢＣｒＳＲ８Ｃ
を１５分間、９ＲＢＣ１０−当たり０゜５ｉＡＥＴで処
理）は２０優５ＲＢＣ−吸収ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ
−１６４０中で１００：１の比で標識細胞と混合した。

この懸濁液を、次いで３７℃にて５分間培養し、２０ｏ
ｘｙで５分間回転させ、かつ４℃にて１時間培養した。

次いで懸濁細胞をフィコール−ノーイノ母−り（Ｆｉｃ
ｏｌ　１−ｈｙｌ）ａＱｕｅ　）上で層状とし、４００
Ｘｌｉ’にて４０分間力１けてロゼツトを小球化した。

４レツト中の５ＲＢＣは自己血漿によシ、５７℃にて１
５分間免疫溶解し、Ｔ−リンパ球を媒質ＲＰＭＩ−１６
４０で洗浄した。

Ｂ−細胞、零リンノ９球および単核細胞に富む、界面に
おける非ロゼツト化部分をも集めた。

ロゼツト化並びに遠心操作によｆｉＴ−細胞を分離した
後に残留する上澄液は単核細胞およびＢ−細胞を含有し
ている。我々の方法は、次に単核細胞と８−細胞の分離
を、これらの間の密蜜差の利益を有効に利用するような
条件下で、密度勾配遠心分離手段によって行う。不連続
・９−コル（Ｐｅｒｃｏｌ　Ｉ　）　Ｗ！勾配法を利用
することが有利である。ノ臂−コル、即ち変性コロイド
シリカをＰｈａｒｍａｃｌａ社から入手した。９容のノ
母−コルを１．５ＭＮａｃ１！１容で稀釈して、ｐＨ８
、４、密度１．１２４Ｐ／−の等張性ノや一コル規準液
を調製した。工程１に従って、Ｆ−Ｈ遠心操作からの単
核ハンドを（１、１’５　Ｍ’Ｎａαで７−に稀釈し、
９．１５ＭＮａａ中の５０％（ｖ／ｖ）等張ノ母−：Ｔ
　ル溶液３−上に層状に展開した。第２の、４℃、ｓｏ
ｏ、ｘｙ下で６０分に亘る遠心操作によシ、単核細胞を
含む界面バンドおよび非−Ｅ−ロゼツト化リンパ球（Ｂ
−９２７９球および零リンパ球）を含有する底部層とを
形成した。単核細胞は集められかつ貯えておいた。補体
Ｃ３に対する受容体を含むＢ−リンノ母球はＥＡＣロゼ
ツト化法により底部層から単離された。ウサギＩｇＧ抗
−５ＲＢＣで感作した５Ｒ８Ｇおよびヒト補体Ｃ，（Ｅ
　Ａ　Ｃ）はＣｏｒｄｉｓ　Ｂｌｏｌｏｇｉｃａｌから
入手した。ロゼツト化法はＥＡＣと非−Ｅ−ロゼツト化
すンノ臂球とを、２０係５ＲＢＣ−吸収ＦＣ８含有ＲＰ
ＭＩ中で、１００：１なる比率で混合することにより行
った。

かくして形成されるロゼツトは３７℃にて５分間培養さ
れ、かつ２ｏｏｘｙにて沈降処理に付された。

３７℃にて１時間培養した後、ロゼツトを再度懸濁させ
、フィコール・Ｉ・イ、パーク上に層状に載せ、かつ４
００　ｘｐにて４０分間かけてベレット化した。ペレッ
ト中の５ＲＢＣはＮＨ４αノ々ツフア−で溶解し、Ｂ−
リンノや球を２回媒貿ＲＰＭＩ−１６４０で洗浄した。

第４図をみると、検定法が概略的に示されている。貯藏
媒質と１０係自己血清もしくはＡＳ血漿との混合物中の
　Ｃｒ標識ＰＢＬ、Ｔ−１Ｂ−リンパ埼または単核細胞
は検定を行うだめの適当な培養容器に移された。各培養
容器に移す数が、培養皿上における完全被検がなされて
、単分子層を形成するような量を越えない限シ任意の有
利な数の白血球を移すことができる。典型的には、我々
は培養皿のサイズに応じて上記数の白血球よシも一層少
ない値で使用する。例えば、１３ｄＸ１００１の培養用
ガラスまたはポリエチレン管を使用した場合には、白血
球を１×１０〜１×１０　細胞／−なる濃度で調製して
、アリコートを各培養容器に、夫々１０４〜１０６の白
血球を含有するように移すことができる。

第２の工程に卦いては、悪性であるとされた、同一の組
織学的−一から得た腫瘍抗原を前記培養容器の１つに添
加する。もう一つの培養容器ヲも照として使用し、該対
照は”ＣｒＰＢＬを接種され、かつ腫瘍抗原を添加する
ことなしに培養される。

追加の対照品を必要に応じて使用することができる。例
えば、追加の対照として、被検白血球もしくは白血球画
分の試料を非相関腫瘍抗原と共に培養するか、もしくは
該試料を正常な器官からの組織抗原に対して培養するこ
とによｒ−製することができる。

培養は、対照培養皿中の白血球の大部分がその表面上を
榎い尽くすのに十分な条件１時間、温度、雰囲気）下で
継続する。典型的には、この培養は３７℃にて１〜３時
間程度続けられる。培養時間の経過後、非−付着性白血
球の懸濁液を除去し、培養容器を洗浄して、残留するす
べての非−付着白血球を除去する。乾燥後、各試料中に
おける付着”ＣｒＰＢＬの放射能を計数する。ＬＡＩ検
定の実施中に１標識リンフ９球からの結合放射能の２０
〜２５１の自然放出が観察される。上記の如く、これは
４本の管から１つにおける、遠心操作後の上澄液の放射
能を検定することによシ監視した。

ＬＡＩの計算において、放射能の全観測値から自然放出
のパックグランドの値を差し引くことにょシ、前記デン
タを考慮した。正味の放射能は使用した条件下で補正さ
れた実験値ｔ−表している。結果は次式： ただし、Ａは自然放出に対する補正後の、抗原なしの付
着細胞の平均カウント７分を表し、Ｂは自然放出に対す
る補正後の、抗原を含む場合の付着細胞の平均カウント
７分を表す、によって計算されたＬＡＩ指数によシ評価
される。

本発明は以下の如き本発明の方法の臨床的テストによシ
更に具体的に示される。

物質と方法 （＾）被検体 血液試料は手術前に４８名の予め治療されていない、胸
部癌もしくは良性胸部疾患をわずらっているとされた女
性（年令２５〜７３、平均年令５６．５）から得た。診
断は数日以内にバイオプシー検体の組織学的実験によシ
確認された。確認された病理上の診断は検定の時点にお
いて入手されなかったっまたテストは診断の知見なしに
行われた。外見上健康な１年令−調整した女性提供者（
２４〜５９、平均４９．６オ）５２名からの対照試料を
血液銀行から得た。更に、両性の急性骨髄球性白血病患
者１５名（臨床的に軽快状態にある者）についても研究
した。

末梢血液をへ・ｆリン化シラδチックシリンジ（防腐剤
を含まないへｔＲＩＪン１０単単位−血液）内に採取し
た。リンパ球はフィコール−ハイバーク勾配（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　）　　ｆ
単離し。

２０℃にて１０００　ｘｇ　で′５０５０分間遠心【７
た。

勾配の界面に局在する単核細胞を集め、３回燐酸塩で緩
衝した塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、２×１０細胞／−なる
濃度でグルコース−塩溶液（Ｇ　ＮＫ）に再懸濁した。

ＧＮＫは１ｔのデキストロース。

４ｆの塩化カリウムおよｉ’％　ｙの塩化ナトリウムを
３度蒸留して得た水１を中に含み、ｐＨは７．４に調節
されている。リン・９球の生存態はトリパンブルーを使
用する。生体染色排除により測定した場合９８〜１００
チであった。

（Ｃ）ＰＢＬ密度の定量化 （１）■−リンパ球 ■−細胞の割合はＥ−ロゼツト形成試験（Ｗｙｂｒａｄ
　ｅｔ　　ａｌ、、　　Ｔｒａｎｓ、　Ａ６ＳＯＣ轡Ａ
ｍ。

Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ、　　８４．　２３９（１９７６
））に従って見積った。等容量のＡｌ５ｅｖｅｒの溶液
（Ｃｏｒｄｉｓから週二回新鮮なものを得た）中に懸濁
した２−の羊の赤血球（Ｅ）を５０ｍ７！の遠沈管に入
れ、ＲＰＭＩ−１６４０で＃度１×１０　細胞／−とな
るように５０艷に希釈した。単一ロッドからの熱失活化
した胎児子牛血清（Ｆ　ＣＳ　、　Ｇｉｂｃｏｌを圧縮
したＥに３７℃にて２分間３：１なる比率で繰返し吸収
させ、少１アリコートとして凍結させる前に、更に４℃
にて３０分間吸収させた。０．２−の吸収されたＦｅ２
を１２Ｘ７５１（ｌｌ’ｌｌ・　。

−の使い捨てガラス−ｆｉ　（Ｆｉｓｈｅｒ　５ｃｉｅ
ｎｔｉｆｉｃ　１中の０．１−のＰＢＬｆｉ濁液（２Ｘ
１０　　細胞／−）に添加した。次いで、０．２−のＥ
＠濁液を添加し、ＰＢＬとＥとを含有する管を培養器内
で３７℃にて５分間培養した。培養後、前記管内容物を
２００　ｘｇ　で２０℃にて２５分間遠心分離に掛け、
４℃にて一夜維持した。Ｅ−ロゼツト形成ＰＢＬの定量
化に先立って、細胞をゆるやかに再懸濁させた。リンパ
球を０・２％トルイジンブルー（Ｆｉｓｈ、ａｒ　　５
ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　）の滴で染色し、計数するために
血球針に入れた。

Ｅ−ロゼツト形成リンパ球（Ｅ−ＲＦＣ）の割合をまず
ロゼツトを計数することによシ決定し。

次いでロゼツト形成に関与しないリンパ球を計数した。

表面に強固に結合した３またはそれ以上の赤血球を有す
るリンパ球をＥ−ＲＦＣと呼ぶ。Ｅ−ＲＦＣの割合は１
００　＋Ｊンパ球ニついての計数から計算した。

（Ｕ）　　ａ−り７７９球 補体Ｃ３に対する受容体を有する日−細胞をＥＡＣＯゼ
ット法により決定した。ウサギＩｇＧ抗−５ＲＢＣで感
作した羊のＲＢＣとヒト補体Ｃ３（ＥＡＣＩとはＣｏｒ
ｄｉｓ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　から入手した。ロゼツ
ト検定は等容量（０、１ｍｇｌのＥＡＣとＰＢＬとを混
合し、この混合物を３７℃にて５分間培養し、かつ混合
物を２００ｘｇにて５分間沈降させることにより実施し
た。

ロゼツトは３７℃にて１時間培養した後、前述のように
して計数した。

伽）　単核細胞 単核細胞は・９−オキシダーゼ組織化学的染色（にａｚ
ｉｍｉｅｒａ　ｅｔ　　ａｌ、、　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　
　１ｍｍｕ−ｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　　１ｍｍｕｎＯｐ
ａｔＦＩＯＩＯｇＹ＋　１Ｌ２９２（１９７７１）およ
びラテックス−摂取法（Ｅｖａｎｓ、　　Ｂｒ　、　　
Ｊ−Ｃａｎｃｅｒ　　２８．５ｕｐｐｌ。

１、　１９　　（１９７３））　　両者によって同定し
た。染色法において、塗抹はベレット化細胞から調製し
、エタノール溶液（，０，２５Ｆペンシソ／、０．５ｔ
ナトリウムニトロプルシエート、９６チエタノール、全
ｊ１１００ｄｌで３分間固定させ、洗浄し、かつ史に５
分間、３チ過酸化水素溶液２滴と混合したエタノール溶
液で被った。

次いで、スライドをＰＢＳ（ＤＨ７，２）で洗浄シ、乾
燥し、かつグリセロールバッフ７−Ｋｌ／ｉれた。単核
細胞は淡いブルーに染まった。

これとは別に、細胞濁顕液（２Ｘ１０／ｍｌを、２［］
’％ＦＣ３を含有し、５μｔの均一ラテックス粒子（径
２　μｍ、　ＤｏｗｌＣｈｅｍ＊、　　Ｉｎｄ。

社）を含む１−のＲＰＭＩ−１６４０中で培養した。培
養Ｆ１５７℃にて振盪ウメ−ターパス（Ｆｉｓｈｅｒ　
　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　）内で６０分間行った。

次いｆ細胞を穏かに３００　ｘｇにて　ＰＢＳで洗浄し
、ライトージエムサ（Ｗｒ　ｉｇｈｔ　Ｇｉｅｍｓａｌ
染料（Ｆｉｓｈｅｒ　　５ｃｉｅｎｔｌｆｉｃｌで染色
し、かつ食細胞により摂取されたラテックス粒子を顕微
鏡観察した。

（０）　　　血　　清 自己性血清は血液を凝固させることにより、各被検体か
ら得た。これは２時間以内に４０　Ｑ　ｘｇ−５− にて２０分間遠心分離した。ヒトのＡＢ型のデー１′［
１ ルした血清はＮｏｒｔｈ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｂｉｏｌ
ｏｇｉｃａｌｌｎｃ＊から入手した。Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌｏｇｉｃａｌ　　Ａｓｓからの胎児子牛血清およびＰ
ｈａｒｍａｃｉａ　ＦｉｎｅＣｈｅｍｉｃａｌｓからの
ヒト血清アルブミノも以下で論するいくつかの研究にお
いて使用した。これら血清中に存在する補体は、使用前
に５６℃で１時間加熱することにより変性した。

（Ｅ）　　白血球標識 比活性５５　［１〜５００　μｃｉ’／ｕｇの５１Ｃｒ
りＯム酸ナトリウム（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃ
ｌｅａｒｌをこの研究全体を通して使用した。精製した
末梢血液白血球を、ポリアロマ−（ｐｏｌｙａｌｌｏｍ
ｅｒｌ管（日ｅｃｋｍａｎ）内で、滋養性糖、例えばダ
ルコースま、たけデキストロース（１ｆ／ｌ　ｌ　、　
ＮａＣｔ（９９／ｌ）およびにＣ１（４９／ｌ）　　を
含有する媒質（ＧＮＫ）中に懸濁した。最終的白血球濃
度は０．５〜２Ｘ１０７　細胞／ｍｔであった。培養は
Ｄｕｂｎｏｆｆウォーターパス中で３７℃にて”’Ｃｒ
２０ＱμＣ１の存在下で、４５分間、１００ｃ／分の速
度で振盪しつつ行った。電、！後、管を取り出し、５〇
−の氷冷ＧＮにを添加することによって即座に冷却し、
混合し、かつ４℃にて、１０分間、４００　ｘｇにて遠
心分離した。標識白血球を３回４０−の前記水冷ＧＮＫ
で洗浄し、最終濃度１×１０細胞／−となるように、Ｒ
ＰＭＩ−１６４０とへ８血清のＲＰＭＩ−１６４０液と
自己血清との混合液中に再懸濁した。この時点で、ＰＢ
Ｌ中への全５１Ｃ「結合蓋を、タリウム−活性化ナトリ
ウムアイオダイド井戸型ｒ−カウンター（Ｐａｃｋａｒ
ｄ　　ｌｎｓｔｒｕ−ｍｅｎｔｓ）において計数するた
めに、１０５白血球を計数管内に移すことにより決定し
た。

５１Ｃｒ　　で標識する前と後におけるＰＢＬの顕微鏡
検査によれば白血球のほんのわずかな密蜜変化がみられ
たにすぎない。クロム化後、Ｔ−細胞の平均数は６８．
２係で、Ｂ−細胞は１８．３チかつ単核細胞は１６．２
％であった。ＰＢＬを　Ｃ「を省いた以外同様な実験条
件下で培養した場合にも同様な値が得られた。

（Ｆ）ＰＢＬ画分の単離 新規な２段階法を利用して、正常体および腫瘍にかかっ
た検体の予め標識したＰＢＬから濃厚細胞画分を分離し
た。■−１８−細胞および単核細胞の各細胞画分中にお
ける割合は表面標識体で監視され、食細胞である単核細
胞はラテックス粒子の摂取およびパーオキシダーゼに対
する組織学的染色により同定された。これら種々のＰＢ
Ｌ密集体の単離のための実験的プロトコルは第４図に模
式的に示されている。第１表の結果は単離後、ロゼツト
化密集体は９５土３チの７”−ＩＪンパ球を含み、Ｃ５
受容体ボッチイブ細胞（Ｂ−細胞）はみかけ上なく、＊
核性食細胞もなく（〈１％）、かつ１〜６チの零細胞（
εまたはＣ受容体のない細胞）を含むことを示している
。他方、フィコール勾配の界面における非−Ｅ−ロゼツ
ト化画分はＴ−細胞を滅失させ、かつＢ−細胞、単核細
胞および零細胞について濃縮させた。単核細胞は・や−
コル（Ｐｅｒｃｏ　ｌ　ｌ　）勾配眞心分離によってこ
の混合物から選択的に除かれた。界面パントは殆ど排他
的に単核食細胞＋９２．３％）からなっていた。残部の
細胞混合物からＥＡＣロゼツト法により単離されるＢ−
リン・９球画分は約８５％の０３　受容体４ジテイブ細
胞を含んでいた。

’ＬＩＪ 観１ 、ｌ 各工程において、比較約９い収率が達成された。

１００Ｘ１０Ｏ標ｗ＆Ｐ８Ｌを、Ｅロゼツト沈降部分に
付与すると、はぼ６５　　Ｘ　　１０’のロゼツト形成
細胞がＴ−細胞画分中に回収され、一方３０×１０　の
非−ロゼット什細胞がフィコ−ルーツ−イｉ４−り界面
から回収された。Ｂ−細胞、零細胞および単核細胞の細
胞混合物は、パーコル密度勾配に掛けられた場合に、１
２　　Ｘ　　１０　　の食細胞を与エル。ＥＡＣロゼツ
ト化法によりｅ離されるＢ−ｙンパ球の最終収率は１Ｘ
１０　　細胞であった。かくして、分離法からの全収率
はＴ−細胞、Ｂ−細胞および単核細胞夫々に対して９２
．６％、７７．８％および７５．１％であった。すべて
の両分は分離後において約９８％の生存度を有していた
。

（Ｇ）　　胚発生検定によるＰＢＬ画分の機能の監視種
々のＰＡＬ”、画分を合成ミトゲン、ＰＨＡ、ＣｏｎＡ
　およびｐｗ・Ｍに対するこれらの応答から、機能的に
評価した。ヒト末梢血液Ｔ　−ＩＪンノｅ球（ただし＄
　＋　ＩＪンノ譬球ではない）ｔ−ＰＨＡおよびＣｏｎ
Ａ　　によシ活性化し、増殖させた。このものの特異性
を利用して、分離された細胞画分純度を決めることがで
きる。■−細胞、Ｂ−細胞および単核細胞の単離画分は
孔当たり生細胞１×１０なる濃度でミクロタイタープレ
ート内で培養し冬。該孔には２００μノ　ＯＲＰＭＩ−
１６４０媒質を含み、該媒質は１０％の自己性血清を含
み、該培養は５％ｃｏ２雰囲気中で行った。孔大々の三
つ当たシ１つに０．３μｔのＰＨＡ（Ｍｌｃｒｏｂｊｏ
ｌ　、　Ａｓ５ｏｃ、）と５μｔのＣｏｎＡ　（Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ、　Ａｓ５ｏｃ、　）とを添加した。２日
間の培養後、０．５μＣＩの３ＨＴチミノン（Ｎｅｗ　
Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ　）を孔の夫々に添加
し一細胞を更に２４時間培養した。次いで、細ｊ！ｌを
多重自動式試料採取機（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、＾５ｓｏ
ｃ、　）を使用して採取した。

増殖は、液体シンチレーションカウンター（Ｐａｃｋａ
ｒｄ、　Ｄｏｗｎｅｒｓ　Ｇｒｏｖｅ　、Ｉｌ［）で測
定したチミノン取シ込みの程度によって評価した。■−
リンパ球に富む画分は、非−分離細胞と比較して、Ｔ−
細胞ミトゲンＰＨＡ（５０９６増加）およびＣｏｎＡ（
３５％増加）に対する高い反応性を示した。逆に％Ｂ−
細胞に富む画分は前記両■−細胞ミトダンに対して最低
の応答を示し、従って機能的に反応性のＴ−細胞の数を
減じることが示唆される。

単核細胞は、期待されるように、いずれのミトゲンに対
しても本質的に非反応性であった（第２表）。

（Ｑ抗原の調製 抗原は乳房悪性癌、良性腫瘍および他の腫瘍にかかつて
いる患者の新しい組織から無菌状態で調製した。乳癌お
よび良性胸部疾患を患う患者の新たな組織は手術の１時
間以内に外科検体から得た・トリミングして脂肪並びに
壊死組織を除いた後、腫瘍検体を・・サミで細く切断し
１、スチールメツシュ篩にかけ、コラ−ゲナーゼ（組織
１１当たシ２〜）で処理した。かくして得られたルー細
胞懸濁液をＧＮＫで２度洗浄して、酵素を除き、次いで
水冷した窒素キャビテーション容器内で、６０気圧下に
て１５分間ホモヅナイズした。ホモｌネートを４℃、１
０００　ｘｔ　　にて１０分間遠心分離して、完全な細
胞、核およびミトコンドリアを除去した。上澄液を集め
て、不連続スクロース勾配（４０〜６０％）で、再度遠
心機に掛けて、粒状原形質膜を単離した。、ｉ４抗原を
含有する界面バンドを得、そのタン・す１有率を決定し
、これ全最終濃度２〜５〜／−となるように調節した。

この抗原処方物は容量０．５ｄずつに分けて一８０℃に
て貯蔵した。解凍後、該抗原処方物は使用に先立って常
に２０００　ｘｔ　　にて１０分間遠心分離処理に付さ
れた。

（１）検　定 ５１Ｃｒ　　で標識した末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）の
ＲＰＭＩ−１６４０＋１０％ＡＢ血清またはＲＰＭＩ−
１６４０＋１０％自己血清の溶液（濃度ｌＸ１０６　細
胞／ｒｎｌ）を使用した。１０５細胞をき有するリンパ
球懸濁液の１００μノ　アリコートをガラス培養管（Ｆ
ｉｓｈｅｒ　、　１５１ｍ×１００■）またはポリエチ
レン糾織培養管（ＮＵＮＣ，１３■Ｘ１００Ｍ）中で、
Ｈａｍｉ　ｌ　ｔｏｎ　　ディスペンサーを使用して分
取した。等容量の正常もしくは腫瘍抗原のＲＰＭＩ−１
６４０抽出液を管当たシ１００μＶ　とするに十分な量
で添加した。混合後、リンパ球は湿った、５％ｃｏ２含
有雰囲気内で、３７℃にて１２０分間培養した。その後
、管を取シ出し、穏かに２度３−のＧＮＫで洗浄し、２
紙上で排液のために逆転させた。次いで、乾燥した管を
１分間ガンマカウンターで計数した。テストは三回行つ
た。各実験点において第４の試験管は通常の仕方で培養
した。培養終了時に、第４の管を２０分間８００　ｘｔ
　　で遠心処理した。次いで、上澄液を除き、遊離の　
Ｃ「　を決定した。これは培養中のリンパ球からの５１
Ｃｒ　　の自然放出を表す。

結　　　果 （＾）　　ＬＡＩ反応における反応性細胞の同定正常な
被検体および段階■の乳癌患者からの未分離ＰＡＬおよ
び単離画分（Ｔ　−、’Ｂ　−ＩＪンノぐ球および単核
細胞）ｉ、Ａｓ血清十乳腫瘍抗原；へ８血清士良性胸部
組織抗原（ＢＢＴ＾）：およびへ８血清十非相関腫瘍抗
原（即ち結腸直腸癌、中皮腫、急性骨髄球白血病、胃癌
、肺癌および他の癌）中で培養した。”Ｃｒ　−Ｌ　Ａ
　ｌ検定によって測定して、これら抗原の認識を第５図
および第３および第４表に示した。

第　４　表　　　　正常検体における −−−−、−、Ｑ （０〜１９ｍ）　　　　　　（０〜７％）結腸直腸癌Ｃ
ａ　Ａｇ　　−５，７±２．５’４　　　　　６．２±
３．４チ（０〜９チ）　　　　　　　（０〜１４チ）中
皮ａ２．５±１．３チ　　　１．９±１．７チ（０〜１
４チ）　　　　　　（１〜４％）白血病Ａｇ　　　２．
ａ±０．９１　　　　Ｌ７土２．０１（０〜４チ）　　
　　　　（１〜４％）胃　　癌　　Ｃａ　　Ａ１　　　
　　４．８　　±　３．５％　　　　　　　　　　　　
５．５　　±　３．６チ（０〜１０チ）　　　　　　（
０〜１６剣細胞応答 ＬＡＩ指数平均士Ｓ−Ｄ、　　ＬＡＩ指数平均土５．０
゜２２．６±１４．５チ　　　　２．７±２．０チ（７
〜３９チ）　　　　　　（０〜５チ）１０．７±６．４
％　　　　２．７±２．１％ＣＯ〜２０１）　　　　　
　　（０〜６チ）１５．８±８．２％　　　　　４．７
±３．２チ（０〜２６チ）　　　　　　（０〜１５チ１
１１．３±８．４％　　　　４．３±３．５チ（５〜１
８％）　　　　　　　（０〜１１チ）８．８士６．１チ
　　　　　３６１±２．４俤（５〜１４チ）　　　　　
　（０〜５チ）２．７±０．６チ　　　　２．０±１．
０係（０〜４％）　　　　　　　　（０〜３１１乳癌患
者において（第３表）みられるように、乳腫抗原に対す
る応答における未分離ＰＢＬは１７〜５９１（平均３５
．８チ）の白血球付着阻止範囲を示した。これら未分離
白血球はＢＢＴ＾および非相関腫瘍抗原に対して応答性
ではなかった（平均ＬＡＩ指数は１２チ以下）。これら
乳癌患者からの種々の単離白血球画分の反応性を比較す
ると、腫瘍抗原に対する応答において大きな差が観察さ
れた。７−　ＩＪン・９球および単核細胞両者は付着性
における大きな減少を伴って乳癌抗原に対して応答した
。■−リンパ球の反応性は特異的かつ選択的であった。

というのは、これらが他のいずれの重傷抗原に対しても
応答しなかったからである。他方、単核細胞はテストし
た４種の非相関膿瘍抗原のうち３稽に対して応答した。

単離Ｂ−リン・９球は腫瘍抗原の認−には含まれないよ
うに思われた。　　　　　　、。

被検正常検体においてｉ、第４表は未分離ＰＢＬ　。

７　１Ｊンパ球および９−　リン・９球がすべて腫瘍抗
原に対して非反応性であることを示した。単離単核細胞
は腫瘍抗原に対して非−特異的ＬＡＩ応答を生じたが、
反応性のレベルは一般的に癌患者のレベルよりも低かっ
た。このデータは、単核細胞による非−特異的ＬＡＩ応
答がすべての１瘍細胞にとって共通の表面抗原を指向し
ていることを示唆しているように推定される。かかる非
−特異的応答は、従来のＰＢＬを使用するＬ＾１研究に
よって、健康な対象においてみられた時として誤った陽
性に応もし得る可能性がある。

第５図は　Ｃｒ　ＬＡＩ　　テストにおける腫瘍抗原の
認識に関するＴ−リンフ４球の中−心的−役１を示して
いる。未分離ＰＢＬに比して、Ｔ−リン・譬球は乳癌患
者のＬ＾１反応性における高い頻度と著しい特異性（Ｌ
ＡＩ指数３０〜７５チ］とを反映している。ここに提示
したデータから、正の応答は′（ ２０１以上の付着阻止率を示すものとして規定さ：′１ れた。このような解釈は研究したすべての乳癌Ｔ１・・
、１ 一す／パ球画分において明確かつ精確な悪性か否かの予
測を可能とする。同一の研究対象についての未分離ＰＢ
Ｌの１史用によれば、１０例のうち２例においてＬＡ　
ｌ　２０％を与えた。これらの新規知見に照らして、我
々は、所定の特異性を達成するためには、癌患者のＰＢ
Ｌから単離したＴ−リ１ ンノク球を、　　　ＣｔＬＡｌテストの妥当な性能を得
る上で使用しなければならないものと結論付けた。

（−手術前の癌患者に関する臨床的研究血液試料は、胸
部生検に先立って、良性または悪性の胸部病巣を有する
と思われる４６名の患者から採取した。対照用検体は３
２名の健康な女性と１５名の急性骨髄゛球性貧血にかか
り、完全に臨床的に軽快した患者からなっていた。

培養はすべて１０チの正常ＡＢ血清の存在下で行った。

第６図に概略的に示した結果は、４６名の胸部病巣を有
する患者から得た未分離ＰＢＬが５１ＣｒＬＡｌ検定に
おける乳癌抗原に対する応答様式に応じて、２つの群に
分類し得ることを示している。２７名の患者からなる１
群は胸部腫瘍抗原に対する応答として、２７〜５６チ（
平均４２．０４±９．２８％）の範囲の強い白血球付着
阻止を示した。この同じ患者のＰＢＬを良性胸部組織抗
原の存在下で培養したものはＬＡＩＯ〜１０チを示した
。２７の場合すべてにおいて、段階１および墓の胸部癌
を有することが、組織病理学によって後で確認された。

他方、胸部塊を有する１９名の女性は乳癌抗原に対して
低い応答を示し、そのＬＡＬ、、値は３〜１Ｂ’ｌＡで
あった。彼女等は同様に良性胸部組織抽出液に対し、０
〜１５チと低い応答性を示した。これら１９名の患者は
良性胸部病巣を有するものと診断された。

（Ｃ）　　進行した乳癌 手術前の段階ＩおよびＨの乳癌患者に関する結果は、正
常ＡＢ血清の存在下での小さな唾瘍を有する対象におけ
る。特異的な細胞−媒介免疫性を証明しているものとい
えた。乳房切除後、ＬＡＩは転移および再発癌において
並びに残留腫瘍を有さない患者において陽性であった。

この特異性並びに唾瘍−宿主関係における腫瘍軽重の効
果の更なる評価のために、ＬＡＩテストはより進行した
乳癌にかかった患者を含めるように拡張された。

正常へＢ血清の存在下での、種々の臨床的腫瘍段階にあ
る乳癌患者の５群からの未分離ＰＢＬによゐ、胸部腫瘍
抗原に対する応答を第７図に概括し九。研究した群は胸
部のみに臨床上局在した疾病を有する患者（段階■）、
胸部および締リン・９節に局在化した腫瘍を有する患者
（段階ｎ）および広範囲に転移した者（段階■）を含む
。この結果はＬＡＩ応答とこれら乳癌患者の臨床的状態
（腫瘍軽重）との間には何の統計的差異がないことを示
している。

第８図に示したように、段Ｍｌおよび■の乳癌にかかっ
た対象においては、患者自身Ｏ崩清による、細胞媒介免
疫性の脱落は見られなかった。

平均ＬＡＩ指数は自己血清中で段階１に対して３９．６
であシ、かつ段階■に対して５０．５±４Ｎ、一方正常
ＡＢ血漿の存在下では夫々４１．２１１′ ±６Ｘおよび３４．４±５％であった。逆に、段ｉ・・
′ぐ 階Ｗの乳癌を有する患者（６５名中５１名）は自己愈清
の存在下での胸部腫瘍抗原の認識低下を示した（５Ｂ、
２±５％〜１０．８±５％）。

ｅ）最適標識条件 最適標識条件をテストするために、末梢血液白梅球をポ
リアロマ−管（８ｅｃｋｍａｎ　）中で以下に示す媒質
の１種内に懸濁させた。

（〜ＲＰＭ　５−１６４　ａ　；（Ｅｌ）ｏ　、　９５
Ｘ塩化ナトリウム；（Ｃ）０．９％塩化ナトリウム＋１
９／ｊｌグルコース；（Ｄ）０．９％塩化ナトリウム＋
４９７１ＫＣＪ　　；（Ｅ）０　　、　９　％ＮａＣノ
＋　２　　ｆ／ノ　　にＣノ＋　１　　ｆ／１１グルコ
ースａ　（’１　ｏ　”　ｑ％ＮａＣ）＋４９／Ｉｔ　
にＣｊ＋１２／ノ　にＣノ　；および（Ｇ）　０　、９
％　ＮａＣｊ　＋　６９／ｊＫＣノ＋１ｆ／ノグルコー
ス。

３００〜５００μＣｉ／μｔの比活性を有する　Ｃ「ク
ロム酸ナトリウムを、この研究全体を通じて使用した。

最終りン・ｆ球濃度は０．５〜２Ｘ１０’細胞／−であ
った。上記の如く３７℃にて４５分間培養した後、標識
リン／９球を洗浄し、ＲＰＭＩ−１６４０中にＩ　Ｘ　
１０’細施／ｄで再懸濁し、１００μノ　の細胞懸濁液
を計数した。媒質（〜、（８）、（Ｃ）および（０）は
１０５ＰＢＬ当たり１０．０００もしくはそれ以上の細
胞内放射能を有する標ａｌＰＢＬを与えなかった。媒質
（Ｅ）、（Ｆ）および（Ｇ）はすべて本発明の好ましい
具体例において使用するのに適した標識ＰＢＬを与え、
その活性は１０　細胞当たシ２０Ｘ１０　　にまで達し
ていた。

乍）　最轡培養時−および最適白奥畔弊−リンノ９球濃
度Ｉ　Ｘ　１０３〜５　ｘ　１０５／−の、乳癌患者か
ら得た標識ＰＢＬは、１０％＾Ｂ血清および１００μｆ
／管の乳癌抗原もしくは正常胸□部抗原を含有するＲＰ
ＭＩ−１６４０中で培養した。

予め定めた時間経過後、培養を停止し、付着細胞の放射
能を測定した。第８Ａ図は、ＢＡＴ＾もしくは乳癌抗原
と共に１２０分間培養した後にプラトー゛に達すること
を示している。１２０分より長時間培養してもＬＡＩ値
を更に変化させることはなかった。

１２０分の培養期間の用いた場合、検定管内で育生し九
細胞数と観測された付着細胞数とめ間には直接的な線形
関係がみられた（第８Ｂ図）、１×１０５細胞で育生し
た管では、腫瘍抗原なしで１０％八〇へ清中での付着の
基準線値は４８±７％であり、平均カウント数は培養前
１４，９００カウント／分であ）、その後７，１００カ
ウント／分となった。１００μｔ　の腫瘍抗原を混合物
に添加した場合、培養後の平均放射能Ｆｉ４６１５　ｃ
ｐｍ（カウント７分）、即ちＬＡＩ指数３１±８％であ
った。比較のために、抗原なしで１ｏＸ八８血清中でわ
ずかに１０４細胞を含む管は培養前１ｅ５００ｃｐｍ、
培養後７００　ｃｐｍなる放射能を有していた。同様な
相関々係が１００μｆ　の腫瘍抗原を添加した場合にも
観測され、付着体の放射能およびＬＡＩ指数は夫々４６
２　ＣＥｌｍおよび５１％であった。これらの観測は驚
くほどのものではない。なんとなれば、各管の底部表面
積（４，５×１０８岬２　と見積もられた）が、飽和す
る前ｋ、３・９Ｘ１０’付着リン・９球を蓄積するはず
であるからである。従って、テストした範囲内で、使用
するり７７１球数は５１Ｃｒ−ＬＡＩ検定値を変えない
ことがわかった。、 （Ｆ）ＬＡＩ実施の際における培養管の型の違いによる
効果 １０ＸのＡＢ血清および１００μＶ　の良性胸部組織抽
出物を含有する２００μノ　ＯＲＰＭＩ−１６４０中に
おける、１０名の正常な対象から得、標識したリンｚｆ
球（１×１０５）の三重反復試験試料を、硼珪酸ガラス
培養管（Ｆｉｓｈｅｒ　）またＦｉポリスチレン組織培
養管（ＮＵＮＣＡ６０２０１）内で２時間培養し、付着
細胞の割合を測定した。ガラスもしくはポリスチレン管
のいずれを使用しても、平均％付着指数の間には殆ど差
がみられなかつ九（Ｐ＜＜０．０５）ので、データは完
全に相関々［Ｋあった（γ＝ｔ、ａ）。ポリスチレン管
がすべての後の実験において使用された。というのは、
これらがよシ一層耐破壊性であるからである。

■論 ＬＡＩ検定は細胞−媒介１疫性の検出のための研究手段
として極めて適したものであり、また免疫適格性の評価
における血−：″阻止、残留腫瘍の軽重および癌患者に
おける治療効果の検査のために極めて有用な研究手段で
ある。

新規表放射性同位体ＬＡＩ検定を応用する際、我々は７
　、　ＩＪン／ｆ球の、ＬＡＩ応答における指標として
並びに応答細胞としての中心的役割を確立した。

数種の新規な方法をとった。第１の方法は単離並びにキ
ャラクタリゼーション前に未分離ＰＢＬを予め標識する
ことである。分離終了時点において、すべての細胞画分
は大多数の配合された〇ｒ−同、位体を均一に保持して
いた。このことは５１Ｃ，−ＬＡＩ検定においてこれら
を引き続き使用することを可能とし、かつて肉眼的計数
を含む他の方法で可能であったよシもよシ一層客観的か
つ定量的な付着／ｆターンの監視をもたらす。実験的工
夫におけるもう−りの独特な特徴は２段階分離法におけ
るＥ−ロゼツト沈降とそれに続くノ奢−コル勾配分離の
利用である。この技術の新規な組合せを適用することに
よル、８５％以上、のＴ−，８−リンノ量球および単核
□細”ｍを、同一の細胞集団から回収することができる
り高い収率を与え□る他に、この方法は他の重要な特徴
全盲する。Ｅを＾Ｅ丁で予め処理するととＫよ）ロゼツ
トはＥとＴ−リンノや球との間のよル一層効果的な相互
作用を生ずるととｋより安定化される。このロゼッ）１
１未処理Ｅはど脆くはなく、そのために分離における取
扱いが容易となル純度も増す。かくして得られるＴに富
む画分は表面積繊体および機能的基準両者において均一
である。これらは増殖にょ）■−細胞ミトグンに対して
応答性であった（未分離ａＪＩｉｌに比して６９％増大
）。

非−ロゼツト化細胞はＢ−細胞と単核細胞とを含有して
いた。単核細胞はパーコル勾配分離によ）分離された。

この単核細胞を単離する方法は、七ファデックスＧＩＯ
カラム、ガラスビードもしくはナイロンウールなどのＩ
差分付着Ｉに基〈一般に利用されている他の方法よシも
有利である。

ａｍすることによる単核細胞の付着および脱離機構社と
れも細胞を活性化し、かつ不可逆的な損傷を与えること
は周知である。・母−コル勾配遠心による負の分離法は
かかる活性化を防止する。・ｆ　−コル勾配における底
部層は主として８−リンａＪ？球と零細胞からなってい
る。ＥＡＣロゼツト化法の利用によシ、８−リンパ球を
零細胞から分離し得、これはＥ並びに０５　　受容体を
まったく含まない。

かくして得られるＢ−リンパ球に富む両分はすべて表面
標識並びに機能的基準Ｋｊ？Ｌ／）て均質である。

濃厚化ＰＢＬ画分は違った１養条件の下で５ＩＣ，−Ｌ
ＡＩ検定におｈて応用された。

腫瘍抗原に対する特異的応答として、付着における減少
を示す反応性細胞の同一性が次に研究された。侵入性癌
患者において、付着率の減少は■−リンノ７球および即
核細胞両者によって示される。

しかしながら、同一の型の腫瘍抗原に対する腫瘍特異的
Ｌ＾１応答は７−＋７７Δ球についてのみ観測された。

この結果は同族腫瘍抗原て感作した場合にＴ−リン４球
がリンホカインを分節し、願にそれ自身の付着性に影響
を与えることを示している。リンホカインが正しく同定
された場合、このようなりンホカインは他の方法、即ち
酵素−結合免疫吸着剤検定、放射線卑疫検定、免疫螢光
検査法並びに単クローン性抗体その他を、新生物疾患の
診断および治療中の患者の応答の監視において使用する
仁とを可能とするであろうｅ Ｔ−細胞、８−細胞および単核細胞０ＬＡＩ検定におけ
る我々の研究に照らして、我々はＬＡＩ検定においては
異った白血球画分を含む２種の免疫学的反応が同時に発
生することを結論する０ＴＳＴ＾と感作７−　ＩＪンノ
４球との一次相互作用は、癌患者において観測された腫
瘍特異的ＬＡＩ応答を導き出すも加えて、感作着びに非
感作単核細胞両者による共通のネオ抗ｙＡ（恐ら（ＣＥ
＾）に対する非−特異的応答があシ、これは幾つかの健
康は対象においてみられ喪、折々の誤った陽性Ｌ＾１反
応に導いた。我々の発見に照らしてみると、ＬＡＩ検定
において腫瘍特異的反応が望まれる際には、単核細胞を
培養混合物から除去しておくべきであシ、即ち精製Ｔ−
りンノや球を使用すべきであると結論付けることが！３
．き１．る。我々の継続している臨床研究においては、
第５図において太い矢印で示した行程が通常行われてい
る。他方において、腫瘍の同一性が未知もしくは未確認
である場合には、単核細胞をその非−特異的応答性のた
めに、ＬＡＩ検定において使用して、患者が新生物　　
　、性疾患を有しているか否かを確認し、その場所を一
層明らかにするよう検査することができる・かかる新規
発明の予測運びに識別能力は癌患者の手術前および手術
後における我々の臨床的研究の結果から正しく評価する
ことができる。

正常人８ヒト血清中の単離Ｔ−リンａ４球に関してなさ
れた　Ｃｒ−ＬＡＩ検定はヒトの腫瘍の組織的型の異同
本しくは起源となった位置間の識別を可能ならしめた。

検定した特定の型以外の腫瘍にかかってｂるすべての患
者は、このような特殊な腫瘍の抗原に対し、陰性のＬＡ
１反応を与えた。

手術前の患者に関する二重ブラインド研究にょ勺、明瞭
かつ精確な癌存在の予測がなされた。この新規発明は、
初期−階の癌にかかった患者と良性疾患の患者との間め
効果的な識別を可能とした。自ｌ−） 己血清を添加した場合、進行した腫瘍を患う患者の血清
中に存在する液性阻止因子はＴ　−Ｕン・９球の膜と結
合し、かつ後の腫瘍抗原と４！異的属受容体との間の相
互作用を阻止する。特異的血清因子は進行した癌を患う
殆どすべての患者について見出された。

単離丁−リン／ｆＲに関する”’Ｃｒ−ＬＡＩ検定を適
用する上で、我々ｉｊｃＭｌおよび血清阻止活性両者を
同時に監視することが可能である。Ｌ′＾１反応は、Ｔ
ＳＴ＾に対する特異的リン／ｆ球−媒介応答並びに単核
細胞による共通のネオ抗原Ｃ恐ら（ＣＥ＾）に対する非
−特異的反応の両者を立証していることが示された。従
って、この新規発明は抗−腸瘍免疫性の種々の成分を詳
細に調べることを可能とし、かつその結果癌研究におけ
る無制限の可能性並びに応用を提供してくれる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明にょるＬＡＩ検定用抗原の調製法の概略
図であシ、 第２図は本発明におりて使用する末梢崩液白崩璋を卑離
し１、キャラクタリゼーションし、かつ標識するための
手続きの概略図であシ、 ＃１５図は白血球区分の卑離手続きの概略図であ）、 第４図は本発明の白血球付着阻止検定の基本的工程の概
略図であシ、 第５図は白血球の種々の区分について、本発明に従って
測定した、白血球付着阻止を示す図でる）、 第６．７および８図は夫々本発明の白血球付着阻止法に
従って実施した棟々のテスト結果を表す図である。 １２−ｉｉｔｌｋ浚イ＊ｉｒ：Ｉｚ艙ｆ＆Ｗ：４１１’
−朋畦 １、＃＊＊ｓｒミクｏソーｈ Ｆ／に、／ 台数ぼ叡の第１臆 ５１Ｃｒｌ：基るｆＪ阻球宅駅１叡イＣ（りａム改良ナ
トリウム２ＦＩ６．２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ｆｉｌ　（ａ）　　侵入性筋についてテストすべき患者
   から血液試料を採取し、そこから白血球を分離し、（ｂ
   ）　　工程（ａ）で回収した白血球を放射性標識化合物
   と共に培養し、ただし該標識化合物はｒ−線を放出し、
   少なくとも約５日の半減期を有しかつ実質的に生存能力
   を損うとと々しに該白血球に放射能を付与するのに有効
   でｉｂ、前記培養の条件は該白血球に、１０５　白血球
   当たシ少なくとも１０　カウント７分の細胞内活性を付
   与するのに有効な条件である、（Ｃ）　　前記放射性標
   識白血球を分画して、実質的に８−細胞および単核細胞
   を含まない放射性標識Ｔ−細胞を回収し、 （ｄ）（ｉ）　　ｆｍ記工程（Ｃ）の放射性標識Ｔ−細
   胞のテスト部分を、前記白血球の生存性を維持し得る媒
   質中で、検定すべき癌として同一の組織学的起源の侵入
   性筋から得た同種性抗原と混合し、ただし７該媒質は約
   ７〜約２［１％の同種性ヒト血液血清または血漿をよみ
   、該血清または血漿はテストすべき患者の赤血球と抗原
   的に相容性であシかつ補体を含んでいない、 （１１）　　前記同種性血清または血漿の存在下で、か
   つ前記悪性筋の同種性抗原の不在下にて、前記工程（Ｃ
   ）の放射性標識Ｔ−細胞の対照用部分を前記媒質と混合
   し、 （ｅ）　　実質的に等量の■−細胞の前記テスト部分お
   よび対照部分両者を別々の検定用容器内で培養し、ただ
   し該容器上で前記■−細胞の対照部分は付着層を形成す
   ることができ、前記検定容器のサイズに関して、前記テ
   スト部分および対照部分の量は■−細胞の単一層を形成
   する量よりも少量であシ、前記培養は対照部分における
   Ｔ−細胞が該検定容器上を覆うのに十分な時間継続され
   る、 （ｆ）　　培養期間の経過後に、前記テスト部分および
   対照部分から非−付着Ｔ−細胞を除去し、かつ、 軸）対照部分が培養された検定容器の放射能と、Ｔ−細
   胞が検定すべき癌の抗原と共に培養された検定容器の放
   射能とを比較する、 工程を含む、患者内の侵入性癌の存在を検査する方法。 （２）　　前記抗原的に相容性の血漿または血清がヒト
   ＡＢ血清または血漿であり、そこにもともと存在してい
   た補体が変性されていることを特徴とする特許請求の範
   囲第（１１項記載の方法。 （３）　　前記白血球が、滋養性糖、生理学的に許容さ
   れる濃度の塩化ナトリウムおよび１〜６２７ノの塩化カ
   リウムを含有する媒質中で５１Ｃ「　　によって放射性
   標識されていることを特徴とする特許請求の範囲第０）
   または（２）項記載の方法。 （４）　（ａ）　　検査すべき患者から血液試料を採取
   し、かつそこから白血球を分離し、 （ｂ）　　該白血球を放射性−一・化合物と共に培養し
   、ただし該標識化合物は少なくとも約５日の半減期でγ
   −線を放出し、かつ生存性を実質的に損うことなしに該
   白血球に放射能を付与するのに効果的々ものであり、前
   記培養条件は該白血球に、白血球１０　　当たり少なく
   とも１０　　カウント７分の細胞内活性を付与するのに
   十分な条件である、 （Ｃ）　　前記放射性標識白血球を分画して、実質的に
   ８−細胞および単核細胞を含まない放射性標＠Ｔ−細胞
   を回収し、 （ｄ）（ｉ）　　工程（Ｃ）で得た放射性標識■−細胞
   のテスト部分を、生存性を維持し得る媒質中で、検査す
   べき癌からの同一の組織学的起源を有する侵入性癌から
   得た同種抗原と混合し、ただし該媒質は約７〜約２０％
   の同種ヒト通液血清または前装を含んでおシ、かつ該血
   清または血漿は抗原を含まずかつ被検患者の赤血球と相
   客性である、 ；１； （ｉＤ　　工程（Ｃ）カ、らの放射性標識白血球の第２
   の１□ テスト部分盆、前記媒質中で、検査すべき癌として同一
   の組織学的起源ヲ南する侵入性癌から得た同種抗原と混
   合し、ただし該媒質は約７〜約２０％の検査すべき患者
   からの自己血清を含有し、かつ （１１Ｄ　　前記工程（Ｃ）の放射性標識Ｔ−細胞の対
   照部分と前記媒質とを、−記同種血清または血漿の存在
   下で、かつ前記悪性癌の同種抗原の不在下で混合し、 （ｅ）　　実質的に等量の前記白血球の第１並びに第２
   部分両者および前記対照部分を夫々別々の検定用容器内
   で培養し□、ただし該検定容器上で前記白血球の対照部
   分は付着層を形成゛することができ、該検楚容器のサイ
   ズに関連して、該対照部分の量は白血球の単一層を形成
   する量よ）も少量であり、前記培養は該対照部分の白血
   球の大部分が前記検定容器上を覆うのに十分な時間継続
   される、 （ｆ）　　該培養期間の経過後、テスト用および対照用
   検定容器から非−付着白血球金除去し、かつ （ｇ）　　夫々２種のテスト部分を含有する検定容器の
   放射能と、対照部分を培養した検定容器の放射能とを比
   較する、 各工程を含む、患者内における腫瘍軽重度を検査する方
   法。 （５）前記抗原的に相容性の血清または血漿がヒトＡＢ
   血漿または血清であわ、その中の補体が変性されている
   ことを特徴とする特許請求の範囲第（４）項記載の方法
   。 （６）　　前記白血球が、滋養性糖、生理学的に許容さ
   れる濃度の塩化ナトリウムおよび１〜６２７ノの塩化カ
   リウムを含有する媒質中で５１０ｒ／ｌｃよって放射性
   標識されていることを特徴とする特許請求の範囲第（４
   ）または（５）項記載の方法。 （７）白血球の懸濁液中に含まれる細Ｎｆ！ｌを、■−
   細胞、Ｂ−細胞および単核細胞に分離する方法であって
   、 伽）　羊赤血球とへログン化剤との懸濁液を、負のハロ
   ダンイオンを発生する条件下で処理して、該羊赤血球と
   ハロゲンイオンとをイオン的に結合させ、ただし該ハロ
   ヶ０ン化剤は前記羊赤血球および白血球に対して生理学
   的に無害である、 （ｂ）　　前記白血球をＰｉｉｌ記・・ロケ゛ン化羊赤
   血球によシ、該ハロケ゛ン化羊赤血球が前記白血球懸濁
   液中に含まれるＴ−細胞とロゼツ）１−形成する条件下
   で処理し、 （Ｃ）　　前記白血球と、処理された羊赤血球との懸濁
   液を遠心分離して、基質としてロゼツト化羊細胞を分離
   し、かつ単核細胞と８−細胞との混合物を含有する上澄
   液を回収し、 （ｄ）　　ｊ１核細胞と８−細胞とを含有する該上澄液
   を、Ｂ−細胞が沈降体を形成しかつ上澄液内に単核細胞
   を残すことを可能とする遠心分離条件下で、密度勾配媒
   質上で更度遠心分離処理し、かつ （ｅ）　　その後、前記第２遠心分離工程の上澄液の単
   核細胞を回収する、 各工程′ｌｉ−含む、上記分離方法。 （８）上記ノ・ログン化剤がアミノアルキルチオウロニ
   ウムハライドであることを特徴とする特許請求の範囲第
   （７）項記載の方法。 （９）　　ｆｍ記ハロケ°ン化剤がアミノエチルイソチ
   オウロニウムプロミドであることを特徴とする特許請求
   の範囲第（８）項記載の方法。 （ＩＩ　（ａ）　　侵入性価に関しテストすべき患者か
   ら血液試料を採取し、かつそこから白血球を分離し、（
   ｂ）　　工程（ａ）で回収した白血球を放射性標識化合
   ダｒ゛ 物と共に培養し、ただし該化合物はγ−線を放出し、少
   なくとも約５日の半減期を有し、かつ白血球の生存性を
   実質的に損うことなしにこれに放射能を付与することが
   できるものであシ、前記培養条件は該白血球に１０　細
   胞当た多少なくとも１０　カウント／分の細胞内活性を
   付与し得る条件である、 （Ｃ）　　前記放射性標識白血球を分画して、実質的に
   Ｔ−細胞およびＢ−細胞を実質的に含まない放射性機ｗ
   ＆単核細胞を回収し、 ｈ）（ｉ）　　工程（Ｃ）からの放射性標識単核細胞の
   テスト部分と　、、ｌ　ト、ｌｊ侵入性癌から得た抗原
   とを、該単核細胞の生存性を維持し得る媒質中で混合し
   、ただし該媒質は約７〜約２０％の同種ヒト血液血清ま
   たは血漿を含有し、該血清または血漿はテストすべき患
   者の赤血球と抗原的に相容性であシかつ補体を含ま々い
   、および （１１）工程（ｃ）からの放射性標識単核細胞の対照部
   分と前記媒質とを、前記同種血清または血漿の存在下で
   、かつ前記悪性筋の同種抗原の不在下にて混合し、 （ｅ）実質的に等量の単核細胞の前記テスト部分および
   対照部分を、別々の検定容器中で培養し、ただし該容器
   上で対照部分の単核細胞が付着層を形成することができ
   、前記検定容器のサイズに関連して該テスト部分および
   対照部分の量は核部核細胞の単一層を形成する量よシも
   少量であシ、前記培養は対照部分における単核細胞の大
   部分が前記検定容器上を覆うのに十分な時間継続し、 ０）培養時間の経過後、前記テスト用および対照用検定
   容器から非−付着単核細胞を除去し、かつ ω　対照部分が培養された検定容器の放射能を、単核細
   胞が検査すべき癌から得た抗原と共に培養された検定容
   器の放射能と比較する、各工程を含む、患者内の侵入性
   価の存在を検査する方法。 （ロ）　前記抗原的に相容性の血清または血漿がヒトＡ
   Ｓ血清または血漿であり、その中にもともと存在してい
   た補体が変性されていることを特徴とする特許請求の範
   囲第［１（１項記載の方法。 ■　上記白血球が、滋養性糖、生理学的に許容される濃
   度の塩化ナトリウムおよび１〜６１７〕の塩化カリウム
   を含有する媒質中で　Ｃｒ　　によって放射性機織され
   ているものであることを特徴とする特許請求の範囲第［
   １（ｌまたはａυ項記載の方法〇