JPS5869898A - 新規なテンペレ−トフア−ジｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規なテンペレートファージＤＮＡに関する。

本発明者らは、先にコート蛋白質製造の遺伝情？１１４
つＤＮＡ部分のみをエンドヌクレアーゼ感受性としたバ
クテリオファージを得（特開昭ｊ３−）３３ｇｔダ号）
−該ファージＤＮＡのコート蛋白質製造の遺伝情報をも
つＤＮＡ部分が目的とする遺伝情報をもつＤＮＡ断片に
置き換えられ一コート蛋白質生産能を欠失した組換え体
ＤＮＡを得ることに成功した（特開昭１３−３１０９６
号−特開昭！ｔｊ−６１７９ｇ号）。

そして該組換え体ＤＮＡを溶原化した宿主細菌を培養し
一該組換え体ＤＮＡの自己複製を誘発した後、宿主細菌
の増殖できる温度で培養すると、数時間（約２時間）以
内に宿主細菌が溶菌し、目的とする遺伝子産物が培養液
中に溶出する知見を得た。

しかし、該組換え体ＤＮＡの自己複製を誘発した後、宿
主細菌の増殖できる温度で培養した場合には、宿主細菌
内に目的とする遺伝子産物が十分に蓄積される前に宿主
細菌が溶菌するため、該遺伝子産物の収率はあまり良く
なかった。

そこで本発明者等は、目的とする物質（遺伝子産物）の
生産量を更に増大させるために種々検討を行った。

一般にバクテリオファージは宿主細菌を溶菌する遺伝子
を有しているが−このファージＤＮＡ上の溶菌に関与す
る遺伝子を宿主細菌が溶菌しないように変異させること
により、宿主細菌内にファージ粒子が著量生産されるこ
とが知られている。

そこでテンペレートファージのＤＮＡの複製及び宿主染
色体への組み込みに関与するＤＮＡ部分にエンドヌクレ
アーゼ開裂部位をもたず、少なぐと敏コート蛋白質製造
の遺伝情報をもつＤＮＡ部分に開裂部位を有するＤＮＡ
で−か？法要に関与する遺伝子が、宿主細菌が溶菌しな
いように変異したＤＮＡをベクターとして用いて組換え
体ＤＮＡを作成した場合には一効率よく目的とする遺伝
子産物を生産することが可能と考えられる。

しかし、テンペレートファージのＤＮＡの複製及び宿主
染色体への組み込みに関与するＤＮＡ部分にエンドヌク
レアーゼ開裂部位をもたず、少なくともコート蛋白質製
造の遺伝情報をもつＤＮＡ部分に開裂部位を有するファ
ージＡ−例えばλｃＩいように変異したファージＢ１例
′えばλｃＩ　１５７８８ｍ７（ＤＮＡとして米国ワシ
ントン社製造−販売）をエンドヌクレアーゼ抵抗性とし
たのち、掛は合わせ、コート蛋白質製造の遺伝情報をも
つＤＮＡ部分がＡファージ由来のＤＮＡであり一ファー
ジのＤＮＡの複製及び宿主染色体への組み込みに関与す
るＤＮＡがＢファージ由来のＤＮＡを有するファージＣ
−例えばλｃＩ　ｇ　ｊ　７　ｈ　ｇ　Ｏａｔｔ”Ｓａ
ｍ’７を作成した場合、自己複画のＤＮＡ部分に存在す
る溶菌に関与するＳ遺伝子が機能しないように変異して
いるにもかかわらず、該ファージを宿主細菌１例えば大
ＤＮＡの複製及び宿主染色体への組み込みに関与するＤ
ＮＡ部分にエンドヌクレアーゼ開裂部位をもたず、少な
くともコート蛋白質製造の遺伝情報をもつＤＮＡ部分に
開裂部位を有するファージとファージＤＮＡの溶菌に関
与するＳ遺伝子が、宿主細菌が溶菌しないように変異し
たファージとを掛は合わせただけでは、目的とするとこ
ろのＤＮＡの複製及び宿主染色体への組み込みに関与す
るＤＮＡ部分にエンドヌクレアーゼ開裂部位をもたず、
少なくともコート蛋白質製造の遺伝情報をもつＤＮＡ部
分に開裂部位を有し−かつファージＤＮＡ上の溶菌に関
与する遺伝子が宿主細菌が溶菌しないように変異した。

宿主ＤＮＡに溶原化される能力を有スるテンペレートフ
ァージＤＮＡを作成することは困難であった。

そこで本発明者らは一種々検討しな結果、ファージＤＮ
Ａの溶菌に関与するＳ遺伝子が宿主細菌が溶菌しないよ
うに変異した１例えばλｃＩ　１５７８８ｍ７と、λｃ
Ｉｈ　ｇ　Ｏａｔｔゞという性質をもつファージとを掛
は合わせることにより、始めてテンペレートファージの
ＤＮＡの複製及び宿主染色体への組み込みに関与するＤ
ＮＡ部分にエンドヌクレアーゼ開裂部位をもたず一少□
なくともコート蛋白質製造の遺伝情報をもつＤＮＡ部分
に開裂部位を有し、かつファージＤＮＡ上の溶菌に関与
する遺伝子が宿主細菌が溶菌しないように変異した。宿
主ＤＮＡに溶原化される能力を有するテンペレートファ
ージＤＮＡを作成することに成功したＯ本発明はこれに
基いて完成されたものであり一本発明のテンペレートフ
ァージＤＮＡをベクターとして用いて組換え体ＤＮＡを
作成することにより、該組換え体ＤＮＡを宿主細菌に感
染させて液体培養を行なっても宿主細菌の溶菌が起らず
一目的とする遺伝子産物を菌体内に著量生産することが
可能となったのである。

以下一本発明について具体的に説明する。

まず１本発明に使用されるバクテリオファージとしては
、宿主細胞に感染した場合−宿主細胞のＤＮＡにファー
ジＤＮＡが組込まれる性質（漆原性）を有するテンペレ
ートファージ（Ｔｅｍｐｅｒａｔｅｐｈａｇｅ　）　カ
用いられる。このテンペレートファージとしてはλ系（
ｌａｍｂｄｏｉｄ　）が好ましく、λ系ファージとして
はλ（ラムダ）（ＩＦＯユ００１６）。

Ｉｔ　、？　ｌＩ（ＩＦＯコ００１ｇ）、ｇユ（ＩＦＯ
ユ００１９）。

φＡ’　０　（ｉｐＱ　　　２００．１０）　　　、　
　φ　ノ　７　０　　ＣＩＦＯｘｏｏａｔ）などが挙げ
られ−また宿主ＤＮＡに組込まれたこれらファージＤＮ
Ａ、例えば大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｔ　）Ｗ３　／　／　
ＯＫ溶原化されたφｔｒｏ〔大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｔ）
に／ニストレイン（５ｔｒａｉｎ　）　Ｗ　３ツノθ（
φｇｏ）（ＡＴＣＣ３ノツク７）〕−大腸菌（Ｅ、　ｃ
ｏｌｔ）　Ｗ３３！θに溶原化された。λ（，１ｇ　ｚ
　７（大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｔ　）　Ｋ　’　２ストレ
イン（５ｔｒａｉｎ）Ｗ、？、？ｊθ（λｃＩｇｊ７）
（ＡＴＣＣＪ）２７ｆｆ）”ｌなども用いられる。

本発明のテンペレートファージのＤＮＡ＆ｌ上ｉ己した
ようなテンペレートファージで、ＤＮＡの複製及び宿主
染色体への組み込みに関与するＤ役人部分にエンドヌク
レアーゼ開裂部位をもたず、少なくともコート蛋白質製
造の遺伝情報をもつＤＮＡ部分に開裂部位を有するファ
ージの溶菌に関係するＳ遺伝子を宿主細菌が溶菌しない
ように変異したファージから容易に得ることができる。

エンドヌクレアーゼとしては、ＤＮＡ鎖の特定の部位を
認識することができ−その認識部位のＤＮＡ二重らせん
を千鳥足状の付着端（ｃｏｈｅｓｉｖｅ　ｅｎｄｓ）を
生じさせるように切断を行なう特異性の極めて高いエン
ド”ヌクレアーゼが好ましく−この酵素としては制限酵
素が好適であり、具体的にをまＥｃｏＲＩ　。

Ｂａｍ１．　Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ　等が挙げられる。なお
制限酵素は生化学工業又はペーリンガー・マンノ・イム
・山之内より入手できる。

まずテンペレートファージで、ＤＮＡの１ｍ及び宿主染
色体への組み込みに関与するＤＮＡ部分にエンドヌクレ
アーゼ開裂部位をもたず、少なくともコート蛋白質製造
の遺伝情報をもつＤＮＡ部分に開裂部位を有するファー
ジ、例えばλｃＩｇｊ７ＲＩ’ｈ　ｆｆ０（ＡＴＣＣ，
７ｔ　ｘ　ｔ　ｓ　）　（例工ｌｄ’％開昭１３−１３
．ｊ１ｇｌｔ号公報記載の方法により作成することがで
きる）を得、該ファージと溶菌に関与するＳ遺伝子が、
宿主細菌が溶菌しないように変異したファージ、例えば
λｃＩ　ｇ　ｊ　７　Ｓａｍ’７フアージとを掛は合せ
る。

そして掛合せの方法としては１例えば各々のファージ液
（ｌθ９〜１０１０／ｍｌ）を両者に感受性のある大腸
菌（１０８〜’　０’／　ｍｅ　）に同時に又は相前後
して混合して、２種のファージを感染させる。　　　　
。

そしてファージを感染させた大腸菌を大腸菌の生育培地
−例えばトリプトン培地に入れ、３７Ｃで７〜２時間振
盪培養するＯ なお感受性の大腸菌としては、一般的なに／ユ株に含ま
れる大腸菌ならばいずれでもよく−例えばＷ、？　／　
／　０　（ＡＴＣＣコ２３コ、ｔ　）　、　Ｗ　３　ｊ
　Ｊ−０（ＡＴＣＣニアｏ２ｏ）、　　ｔ　１００（Ｍ
ａｘ−Ｐｌｌｏｏ（Ｉｎ５ｔｉｔｕｔ　　西独）等力１
挙げられる。また大腸菌は培養液の状態で用いてもよい
力１、培養液を遠、６分離して培養液を除去した後−１
０−のＭｇＣ１ｔに懸濁し、３７Ｃで１時間振盪した後
、使用した方がファージの吸着感染ｈ″−良くなる。

上記の溶菌に関係する遺伝子カー　宿主細菌カー溶菌し
ないように変異したファージとしてλＣＩｇ、ｔ７Ｓａ
ｍ７フアージの他に１例えばＡＴＣＣ２３７コａ−ｆ３
１１が挙げられ、また上記ファージＤＮＡとして＆まλ
ｃＩｇ　ｓ　７　Ｓａｍ７等を挙げることカーできる。

上記のように掛合せて得られる例えばλＣＩｇｊ７ｈ　
ｇ　Ｏａｔｔ　　Ｓａｍ７フアージは、自己複層のＤＮ
Ａ部分に存在する溶菌に関与するＳ遺伝子力１磯能しな
いように変異しているにもかかわらず、該ファージを宿
主細菌に感染させ、液体培養した場合には宿主細菌の溶
菌現象が生じる。

を有するファージとして用いることができ−この場合エ
ンドヌクレアーゼ抵抗性とした後、用いることが好まし
い。

エンドヌクレアーゼ抵抗性のファージ、例えば制限酵素
に全く開裂されない変異株は一λ系ファージを制限酵素
をもっている宿主ともたない宿主に交互に培養する微生
物的濃縮法により一ついには制限酵素の作用を全く受け
ないＤＮＡをもつファージを得ることができる。

なお、溶菌に関係するＳ遺伝子が一宿主細菌が溶菌′し
ないように変異したファージＤＮＡとして、λｃ工ｇ　
ｊ　７　Ｓａｍ７又はλｃＩざｊ７ｈざＯａｔｔ　　Ｓ
ａｍ？を用いる場合には１例えばエンドヌクレアーゼ抵
抗性の欠失変異株と掛合わせ、制限酵素の切断部位を部
分的に欠失させた。溶菌に関係するＳ遺伝子が宿主細菌
が溶菌しないように変異したファージとしだ後−微生物
的濃縮法を行うことＫより、′より早く抵抗性ファージ
を得ることができる。

そして本発明のファージＤＮＡを得るには、溶菌に関与
する遺伝子か−、宿主細菌が溶菌しないように変異した
ファージと、ＤＮＡの複製及び宿主染色体への組み込み
に関与するＤＮＡ部分にエンドヌクレアーゼ開裂部位を
もたず、少なくともコート蛋白質製造の遺伝情報をもつ
ＤＮＡ部分に開裂部位を有するファージで、かつアタッ
チメントサイトが、ＤＮＡの複製及び宿主染色体への組
み込みに関与するＤＮＡ部分と同種のファージ由来のＤ
ＮＡ部分である、例えばλｃＩｈ　ｇ　Ｏａｔｔ　ｓＲ
Ｉλ３ｓＲＩλ２　ｓＲＩλ、とを掛合せる。掛合せの
方法としては前記同様に行うことができる。

得られたファージ液から目的とするファージををもつフ
ァージを分離し、そのファージから常法に従ってＤＮＡ
を調製する。

また−テンペレートファージで、ＤＮＡ１７）［裏及び
宿主染色体への組み込みに関与するＤＮＡ部分にエンド
ヌクレアーゼ開裂部位をもたず、少なくともコート蛋白
質製造の遺伝情報をもつＤＮＡ部分に開裂部位を有し、
かつアタッチメントサイトが、ＤＮＡの複製及び宿主染
色体への組み込みに関与するＤＮＡ部分と同種のファー
ジ由来のＤＮＡである）了−ジを、変異処理により該フ
ァージの溶菌に関与するＳ遺伝子を宿主細菌が溶菌しな
いように変異させることにより得られる。

すなわち、該ファージ培養液を、　ＵＶ処理、ヒドロキ
シルアミン処理等の変異処理−を行ったのち、゛宿主細
菌に感染させ、該宿主細菌を培養し、培養後残った宿主
細菌細胞を遠心分離等により集め、該細胞をクロロホル
ムで溶菌させることにより溶菌に関係するＳ遺伝子が宿
主細菌が溶菌しないように変異したファージを得ること
ができ、これより本発明ベクターとしてのファージＤＮ
Ａを得ることができる。

得られたファージ液から目的とするファージを採取する
Ｋは、該ファージ液をサプレッサー遺伝子をもつ宿主、
例えば大腸菌ＱＤ　１００３．　Ｃ６００゜ＣＢｔ３等
に加えてトリプトン寒天培地上に撒き一７晩培養して出
て（る溶菌斑力島ら竹串でファージをとり、サプレッサ
ーをもたない宿主−例えば大腸菌１１００を撒いたトリ
プトン寒天培地に接種して培養し、溶菌斑をつくらない
ファージを採取することにより得ることができ、該ファ
ージから常法に従ってＤＮＡを調型する。

ここで本発明のテンペレートファージＤＮＡを・溶原化
した大腸菌及び従来知られている宿主細菌が溶菌しない
ように変異していないファージＤＮＡを溶原化した大腸
菌を培養し制得られるファージの収量を実験例で示す。

実験例 コート蛋白質合成に関与するＤＮＡ部分にのみエンドヌ
クレアーゼ感受性を有するファージ〔大腸菌７１θθ（
ｓｉｐ　／　Ｓ　）を誘発処理後、λｃＩ　ｇｊ７（Ａ
ＴＣＣ１，７／ココア）を掛は合せて得たファージ〕が
溶原化した大腸菌／　／　ｏ　ｏ　（ｓｉｐ　／、　／
　）及びコート蛋白質合成に関与するＤＮＡ部分にのみ
エンドヌクレアーゼ感受性を有し−かっＳ遺伝子が、宿
主細菌が溶菌しないように変異したファージ（Ｅ。

ｅｏｌｉ／／コざ（ＦＥＲＭ　Ｐ−６ｏｔｓ）を誘発処
理後。

λｃＩ　ｇ　ｊ　７ＲＩ’ｈ　ｇＯｃＡＴｃｃ　Ｊ　”
　ｇ　ｊ　）を掛は合せて得たファージ〕を溶原化した
大腸菌１／ＱＱ（ｓｉｐ　／　Ｓ　）をＴ−Ｙ培地Ｔ３
０Ｃで一晩培養し、そのコ、ｔｍｔを３ｏｍ６のＴ−Ｙ
培地（ｐ）（７，ｏ）に加え、３３ｃで６３〜９０分間
培養した後、１１３Ｃでコ０分間誘発培養し、その後３
３ｃで培養を続けた時の菌濃度の経時変化を第７図に示
す０　“その結果、大腸菌／１０θ（ｓｌｐ　／　／　
）　（図中。

→−ト）は、−全処理後１１９分で溶菌したが、大腸菌
”　００　（ｓｉｐ　／　Ｓ　）　（図中、→トー参〜
）　ハ誘発後ｑ時間３０分経過しても溶菌現象は全く起
らなかった。そしてどの時の培養物のｐＨ′は２．！で
あった。

培養終了時のファージの収量は一大腸菌７１ｏ。

（ｓｉｐ　／））の場合はノ、ノ×ｌθ”　／　ｍｌで
あり。

大腸菌１１０θ（８１ｐ／　ｓ）　（ｎ場合ニＬｔｔ　
ｇ　ｘ　ｔ　ｏｌｌ／　ｍｌであった。

本発明のテンペレートファージＤＮＡは−そのコート蛋
白質製造の遺伝情報をもつＤＮＡ部分に目的とするＤＮ
Ａ断片を組み換えることができる０そして本発明のテン
ペレートファージＤＮＡを用いて得られた組換え体ＤＮ
Ａを宿主に感染させて宿主のＤＮＡＫ溶原化した宿主細
菌を、該組へ換え体ＤＮＡの自己複ｉが誘発されない条
件下で培養し、ついで組換え体ＤＮＡの自己複製を誘発
した後−更に宿主細菌の増殖できる温度で培養を続ける
ことにより、目的とする遺伝子産物を著量細菌菌体内に
生産せしめることができるので一本発明のテンペレート
ファージＤＮＡの産業的有益性は多大なものがある０ そして目的とする遺伝情報を有するＤＮＡ（供与体ＤＮ
Ａ）としては、微生物（細菌、糸状菌、酵母）高等動植
物又は形質導入ファージ等由来のＤＮＡが挙げられ、新
規組換え体ＤＮＡとして組み込まれる遺伝情報としては
、インターフェロン−インシュリン等の生理活性蛋白質
又はペプチド、各種酵素−ワクチン、抗体、酵素以外の
蛋白質（例えば大豆貯蔵蛋白質−フィブロイン等）を製
造する遺伝情報が挙げられる。

つぎに本発明の実施例を示す０ 実施例 １、λｃＩ　ｇ　ｆ　７　ｈｇ　Ｏｓｌｐ　／　Ｓベク
ターの作成ｌ−１，λｃＩ　ｇ！７ｂｔＯｌコＳａｍ７
の作成溶菌に関係するＳ遺伝子が、宿主細菌が溶菌しな
いように変異したファージＤＮＡλｃＩ　ｇ　ｊ　７　
Ｓａｍ７（米国ワシントン社より入手）をＣａＣｌ２法
により大腸菌ＱＤ１００３にとりこませた後に培養して
得たファージ液（’　０”／　ｍｌ　）　０　、２　ｍ
ＡとλｃＩｇｊ７ＲＩ’ｈ　ｇ０７アー１（ＡＴＣＣ３
／　ｕ　ｇ　ｆ　）ｆｆｌ（１０”７ｍｇ　）’ｏ　、
　２ｍｇ、大腸菌ｌノ００　（ＭａＸ　−Ｐｌａｎｋ二
Ｉｎ５ｔｉｔｕｔ　　西独）　（２Ｘ　／　０８／ｍｌ
）　０　、２ｍｂを混合した後、３７ＣでＩＪ−分間加
温し、そのＪＪｍｌをｔｏｍｌ；のトリプトン培地に添
加し、３７Ｃで３時間振盪培養してファージの掛げ合わ
せを行った。

次に該培養液にクロロホルム数滴を加えてよく混合し、
その０．／ｍｌを大腸菌ＱＤｊ００３／λ株を指示菌と
してトリプトン寒天培地上に撒き一３０Ｃ’１？／晩培
養後、生じた溶菌炎中のにとった溶菌斑で、大腸菌Ｗ３
１ＩＯ（ＡＴＣＣコア３ユり株を指示菌としたトリプト
ン寒天培地上で溶菌斑をつくらないファージを分離し、
λｃＩ　ｇｊ７ｈｇｑｓａｍ７フアージを得た。

なお−大腸菌ＱＤｊ　００３７２株は大腸菌ＱＤ１００
３（元側大学より入手）の中からλｖｉｒ存在下で生育
する変異株として分離したλ耐性株である。

なおまた−λｖｉｒはλファージが溶原化された宿主細
菌を培養し、変異剤処理をしたλファージを感染させ、
溶菌斑をつくるファージを分離することにより得られる
。

次に得られたλｃＩざｊ　７　ｈ　ｇ　ＯＳａｍ７フア
ージとλｅｂｔ０１１ユＲＩｒファージを上記同様の方
法で掛は合わせを行い一該培養液にクロロホルム数滴を
加えてよく混合し−そのθ、１ｍ６を大腸菌ＱＤ１００
３／φざＯを指示菌としてトリプトン寒天培地上に撒き
−ｊＯＣでｌ晩培養後、生じた溶菌炎中のにとった溶菌
斑で一大腸菌Ｗ３　／　／　０株を指示菌としたト１】
プトン寒天培地上で溶菌斑をつくらないファージを分離
し−λｃＩ　ｇオフＭθｑユＳａｍ７フアージを得た。

得られた該ファージのＤＮＡは分子の右端にλケ所のＥ
ｃ　ｏＲＩ切断部位を有する。

なお−λＣｂ６０弓ＲＩ　ファージはλｃＩざｊ７ＭＯ
ａｕＲＩ’ファージを３ＯＣＴ：、トリプトン寒天平板
培地上で大腸ｍ’Ｗ３１１０株を指示菌として培養し透
明な溶菌斑をつ（るファージを分離することにより得た
。

なおまた、ファージλｃＩｇｊ７から欠失変異株ファー
ジλｃＩｇｊ７ｂ６０１１２の分離及びλＣＩｇｊ７ｂ
４０　ｌＩ２　ＲＩ　の分離は特開昭ｊ３−６１７９ｇ
号公報記載の方法により行った。

１−２．λｃＩ　ｇｊ７ｂ６０Ｇユ８７／ＲＩの分離１
−１．で得られたλｃＩ　ｒ　ｊ　７　ｂＡ　Ｏ’ｌ　
２８１ｍ７フアージを、大腸歯ＱＤ６００３株と大腸菌
Ｑｆ）３００３（ＲＩ）を用いて微生物的濃縮法で濃縮
することによ’）　ＥｃｏＲＩ切断部位を全くもたない
λｃ工ｇ　ｊ　７ｂｔｏｑコＳり／ＲＩファージを得た
。

すなわち、トリプトン培地でＪ７Ｃ，ｌ乙時間静置培養
した大腸菌ＱＤＪ−００３培養液ｏ、ａＪ−ｍｔとλｃ
Ｉざｊ７ｂｔ　ｏ　４４２　Ｓａｍ７フアージ液０．／
ｍｌ；とをｌｌ、＜Ｃに加温したＢ、−ソフトアガーＪ
　ｍＪ中で混合し、トリプトン寒天平板培地上に撒き、
３２ｃで４７−４．７時間培養した後に、トリス−淘緩
衝液ＩＩ　ｍｌとクロロホルム３滴を加えて、？７ＣＫ
／Ｊ−分間放置し、その上澄をピペットでゴム栓付の小
試験管に移して、ファージ液を得た。

次にトリプトン培地で３７ｃｍｔ６時間静置培養した大
腸菌ＱＤＪＯＯ３ＣＲＩ）の培養液０．−１１ｍ６と、
上記で得られたファージをＱＤ−ｔｏｏ３（ＲＩ）で測
定した場合に１０７７ｍ１になるように稀釈し−その０
，１ｍ／ｊを用いて上記と全く同様に操作を行ないファ
ージ液を得た。

そして上記の大腸菌ＱＤｊ００３と大腸菌Ｑｌ）ｔｏｏ
　、７（ＲＩ）を用いる方法を交互に１９回繰り返し一
最後に大腸菌ＱＩ）　ｊ　００３の方法で処理したファ
ージ液のフテージ数を大腸菌ＱＤｊｏｏ３（ＲＩ）で測
定したところ一大腸菌ＱＩ）　ｊ　００３で測定した数
と変らない値を示した。

このファージ液を’　０”／　ｍｌに稀釈し−その９．
１ｍｌを大腸菌Ｑｌ）　ｊ　００　、？培養液の０，２
１ｍ１に混合し、トリプトン寒天平板上で互に重ならな
い溶菌斑をつくらせ、そこからＥｃｏＲＩの作用を全く
受けないファージλｃＩ　ｇ　ｊ７ｂ４０４−２８７７
ＲＩ株を単離した。

なお、大腸菌ＱＩ）ｔ　ｏ　ｏ　３　（ＲＩ）株は一薬
剤耐性囚子ＲＩ（ペニシリン、ストレプトマイシン、テ
トラサイクリン、サルファ剤に耐性）をもつ大腸菌ＲＹ
−／、？（カリフォルニア大学、　ＨｌＷ、Ｂｏｙｅｒ
より入手）と大腸菌ＱＪ）　ｊ　００３を混合培養し一
薬剤耐性因子をもつ大腸菌ｒ；Ｈ）ｓ　ｏ　Ｏ、？　（
ＲＩ）を分離した。

ｌ−３，λｅＩＪｌ’Ｊ７１１ざ０８１ｐｌＳベクタ一
ノ作成λｃＩ　ｇ　、ｔ　７　ｈ　ｇ　Ｏａｔｔ’ｓＲ
Ｉλ３ｓＲＩλ；ａＲＩλτファージ液０．１．ｍｌを
大腸菌／　１００を指示菌としてトリプトン寒天上に撒
き、３ｏｃ′ｔ′ｌ晩培養後、生ずる透明な溶菌斑を採
取し、そこからλｅＩｈ　ｇ　Ｏａｔｔ’ｓＲＩλ３　
ｓＲＩλ２　ｓＲＩλ７フアージを分離シタ。

次にλｃＩｈざ０ａｔｔ’ｓＲＩλ３　ｓＲＩλ′２ｓ
ＲＩλ２ファージ液（／　ｏ”／ｍｌ　）、　０　、　
：１ｍｌと１−２．で得られたλｃＩｇｔ７ｂ６ｏａコ
Ｓ？／ＲＩファージ液（）０°／ｍｌ　）　０　、２ｍ
に大腸菌／　ｔｏｏ　（ユ×）０”／ｍ／、）　０　、
ユｍｅを混合した後１．７７１Ｚ’で１３分間加温し−
そのＪｌｍｌを１０ｍ１のトリプトン培地に添加し、３
７Ｃで３時間振盪培養し、ファージの掛は合わせを行っ
た０ 次に該培養液にクロロホルム数滴を加えてよく混合し−
その０．１ｍｅを大腸菌ＱＤｊ　００３７２株を指示菌
としてトリプトン寒天培地上に撒き一３０Ｃ′ｔ″ノ晩
培養後、生じた溶菌炎中のにとった溶菌斑で、大腸菌Ｗ
３１ノ０　（ＡＴＣＣコア３２６）株を指示菌としたト
リゾ）％ン寒天培地上で溶菌斑ヲツくらないファージを
分離し、λｃＩｌｆｊ７ｈｇＯｓｉｐ　／　Ｓベクター
を得た。

なお、ファージλＣＩｇ　ｊ　７　ｈｇ　Ｏａｔｔ″ｓ
ＲＩλ３　ｓＲＩλ；ｓＲＩλ７は例えば特開昭ｊｊ−
１ｇ０９６号公報に記載の方法により得ること力１でき
る。

次に大腸菌１１００と）　＋３ブトン培地を用いて該フ
ァージを大量培養し一〇ｓＣ１密度こう配達Ｉヒを用い
てファージを精製した。得られた精製ファージを−ごＯ
ｍμの吸光度がｇになる様に０．０ＩＭ　Ｔｒｉｓ　−
ＨＣＩ　（ｐＨｇ　、ｏ　）、１ｍＭＭｇＣ１２−及び
０，１ｍＭエチレンジアミンテトラ酢酸よりなる緩衝液
で希釈し、そのｏ、ｒ〜／　ｍｅを１００〜ノｓｏｍｅ
１７）ｔｏ４ホルムアミドと１０ｍＭエチレンジアミン
テトラ酢酸を含むＯ，／Ｍ）リス緩衝液（ｐＨｇ、−ｔ
）に対して２１ｔＣ″″ｃｌ乙時間透析することにより
ＤＮＡを抽出した。これを更にＱ、１ｍ１Ｍエチレンジ
アミンテトラ酢酸を含む０．１Ｍトリス緩衝液ＣｐＨ７
，ｓ）ｉｓｏｍｂに対してりＣでグ回透析してＤＮＡ標
品な得た。

ここで実施例につづいて参考例として本発明の実施例で
得られたλｃＩ　ｇｊ７ｈｇＯ８ｌｐ　／　Ｓ　　ＤＮ
Ａを用いて組換え体ＤＮＡを作成し、該組換え体ＤＮＡ
を宿主細菌に溶原化した微生物の培養法を示す。

参考例 （ａ）大Ｍｆｔ［）リブトファンオペロンのクローニン
グ大腸菌Ｗ３１１００ＮＡ１．ｔμノと大腸菌プラスミ
　　ド　ｐＢＲ３−２−ｔ　　ＤＮＡ　　（Ｆ、　　　
Ｂｏｌｉｖａｒ＋　　ＵｎｉｖｅｓｉｄａｄＮａｃｉｏ
ｎｍｌ　Ａｕｔ６ｎｏｍａ　ｄｅ　Ｍｅｘｉｃｏから得
られる）−ｔμｔをＥｃ　ｏＲＩで切断し両者を混合し
た後にＴ　＜４　ＤＮＡリガーゼ（生化学工業株式会社
よ゛り入手）を加えて６Ｃで＜Ｚｆｆ時間保持し組換え
体ＤＮＡを作成した。組換え体ＤＮＡ３μｔを、？　Ｘ
　／　０１０の大腸菌ＡＢ２　’ｌ　ｌ＝　３　ｔｒｐ
−（ＡＢ２４’＋３はエール大学のＢ、Ｊ、Ｂａｃｈｍ
ａから得られる）にＣａＣｌ２法（Ｍ、　Ｍａｎｄｅｌ
　ａｎｄ　Ａ、　Ｈｉｇａ。

Ｊ、　Ｍｏ１＝、　Ｂｉｏｌ、、　１３　（／　９７θ
）１３９）によってとりこませた後にＣＡ平板培地上に
撒き３７７Ｃで培養してトリプトファン非要求株をｊ１
株得た。そのうちユ株がテトラサイクリンに耐性でクロ
ラムフェニコールに感受性を示しトリプトファンオペロ
ンを組込んだｐＢＲ、？　ｓ　ｊ　ＤＮＡの存在が示さ
れたので、更にこれらの株からプラスミドを調製して調
べたところ、トリプトファンオペロンを有スるＤＮＡ断
片を組込んだプラスミドｐＮＳ　９０６及びｐＮＳ　９
０７の存在が確認された０このプラスミドｐＮＳ　９０
６のＤＮＡをトリプトファンオペロンをもつＤＮＡ断片
として組換え体ＤＮＡの供与体とした。

（ｂ）λｃＩ　ｇｊ７ｈｇＯＢｌｐ　／　Ｓベクターへ
のトリプトファンオペロンの組込ミ （ｂ）　−１，実施例で得られたλｃＩｇｊ７ｂｇＯＢ
ｌｐ／　Ｓ　ＤＮＡとトリプトファンオペロンをもつＤ
ＮＡ断片との組換え体ＤＮＡの作成 常法により制限酵素胎ＲＩ　（Ｍｉｌｅｓ　Ｌａｂ製−
生ｎｎ化学工業株式会社より入手）で切断したｓｉｐ　
／　５ＤＮＡノ、コμノと上記（ａ）で得たプラスミド
ｐＮＳ９０６のＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断した後にアガ
ロースゲル電気泳動法により分離したトリプトファンオ
ペロンをもつＤＮＡ断片０．１μノとを混合し一２０μ
！の蒸溜水−／　ＯｔｉＺのｊ　ＯｒｎＭ　ＭｇＣｌ２
　＊　　’　０　μｉの００７Ｍジチオスレイトール、
ｌＯμ！の／ｍＭＡＴＰ及び／　μｌｋのＴ＆リガーゼ
（Ｍｉｌｅｓ　Ｌａｂ社製、生化学工業株式会社より入
手）７μｋを加えｑＣ〜７Ｃに６乙時間保持し１組換え
体ＤＮＡを含む溶液を得た０（ｂ）　−２，組換え体Ｄ
ＮＡの大腸菌への溶原化トリプトファン要求性大腸菌１
ｌＯＯΔｔｒｐ　ＫλｃＩ　ｇ　ｊ７ＲＩ’ｈｆｆ　Ｏ
（ＡＴＣＣＪ　／　ｓ　ｇ　ｓ　）を溶原化させた菌株
−大腸菌１１００△世（λｃＩｇｊ７ＲＩ’　ｈざＯ）
をＨ−ｔｒｐ培地培地１０釦ｌ種し、３０Ｃで２０時間
前培養を行い−その０．ｒｒｎｌを新しいＨ−ｔｒｐ培
地１０ｍ１に接種して３０Ｃで振盪培養を行った。菌数
がｊ　Ｘ　、／　０”／ｒｎＩ８に達した時に氷で冷却
し、そ１７’）　ｊ　ｍｌをｉＱ、０００回転／分、ユ
Ｏ分間遠心分離り、、　Ｉ　−ｔｒｐ培地ノ　ｔｍＡ（
ＯＣ）に懸濁した。懸濁液を３’ＣＩｌユ分間保温し１
次いでｏｃｖｃｔ分間保った後にＩ　−ｔｒｐ培地に懸
濁した宿主の染色体へのアタッチメン−サイトをもたな
いファージであるλｅＩ　ｇｊ７ｂ’ｔｏ’ｔｔユファ
ージ（２×　）　ｏ”／ｍｅ）　　　／　　、　　ｊｒ
ｎｌ　をカロえ、　　３０　Ｃ′″ｒ：ｌ　　コ分間保
った。再びＯＣに冷却した後に遠、Ｂ分離を行イ、　ｏ
　、　０　／　Ｍ　ＭｇＣ１，と０　、０　’　Ｍ　Ｃ
ａＣｌ２　を含む０　、０　／　Ｍ　）　＋３ス緩衝液
（ｐＨ７，ｊ）’　、ｊｍ乙に再懸濁した０ ついで（ｂ）　−１，で調製した組換え体ＤＮＡ　Ｏ，
２６μノを含む溶液を７３．Ｃ，１０分間力口熱し、急
、冷した後、そのｊ−コ０μ！をｏ　、　０　／　Ｍ　
ＭｇＣｌ２とｏ　０７Ｍ　　ＣａＣｌ２を含むＱ、０ノ
Ｍト１】ス緩衝液（ｐＨ７，ｓ）ｏ　、ｉｍｇＫ加え−
ＯＣに保った後ニ上記の処理をした大腸菌／１００Δｔ
ｒＰ　（λｃＩｇｔ７ＲＩ’ｈ１Ｍ））懸濁液ｏ、ｉｍ
ｌを加え、３ｏＣ。

１１０分間加温して組換え体ＤＮＡをとりこませた０そ
の後ａ、ｇＣに保温したＣＡ平板培地に撒き、３０Ｃ，
−を日間培養して生じたトリプトファン非要求株大腸菌
／ＩＱＱΔ■（λｃ工ｇｊ７ＲＩｈｇＯ。

ｓｌｐ　／　Ｓ−疑）を分離した０ （ｂ）　−３，大腸菌’／　／　Ｑ　Ｑ△川（λｃＩ　
ｇ　ｊ　７ＲＩ’ｈｇＯ，Ｂｌｐ　／Ｓ−ｔｒｐ　）よ
り大腸菌／　／　００△ｔｒｐ（ｓｉｐ　ｉ　３−世）
の分離 大腸菌ノ／ＤＯΔ■（λｃＩ４ｊ７ＲＩ　ｈｇＯ、ｓｉ
ｐ／　Ｓ　−ｔｒｐ　）をＴ−Ｙ培地に、？、　ＯＣで
培養した培養物をｑ−〇′″ＣコＯ分間培養した後ＣＡ
平板培地に撒き３０Ｃ″’（ｕ日間培養して生じたコロ
ニーの中から活性ファージを生産する能力を持たない株
、大腸囚／／ＱＱΔけ（ｓｌｐ　／　Ｓ−亜）を分離し
た。なお−活性ファージを生産する能力を持たない株は
１例えば試験菌株を宿主大腸菌１１００を撒いであるト
リプトン寒天培地上に接種して１ＩｕＣ″Ｔ：ｔ、３時
間培養した後に３７Ｃで７晩培養し接種点の周囲に溶菌
が起らない株である。

なお、得られた大腸菌ノｌｏｏΔｔｒｐ　（ｓｌｐ／　
Ｓ−世）／　／コざは微工研菌寄第１０１コ号（ＦＥＲ
Ｍ　　Ｐ−ｔｏｔユ）として工業技術院微生物工業技術
研究所に寄託されている。

（ｃ）大腸菌１ｌｏｏΔｔｒｐ（ｓｉｐ／５−ｔｒｐ）
によるトリプトファン合成酵素の高度生産大腸菌１１０
０Δｔｒｐ　（ｓｉｐ　／　Ｓ　−ｔｒｐ　）をＴ−Ｙ
培地で３０Ｃでｌ晩前培養し、その。、、ｔｍｇをｔｏ
ｍｌのＴ−Ｙ培地に添加し、ｔ？Ｊｃ”（ｘ　　７時間
培養した後にη３ｃでｌ！分分間光培養し一更に３７Ｃ
″ｒ：４を時間培養した。該培養物を遠心分離して菌体
な集め−これを緩衝液（θ、ｏｊＭＮａＣ１，０，０３
ｍＭピリドキサールリン酸、λθ係グリセリン、／ｍＭ
ジチオスレイトール、ｏ　ｏｊＭリン酸カリウム：ｐＨ
７，１）ユｍｌに懸濁し超音波処理により破砕した後に
超遠心分離により菌体の破片を除き、粗酵素抽出液を得
た。

トリプトファン合成酵素の活性はスミス及びヤノフスキ
ーの方法（Ｓｍ１ｔｈ　＆　Ｙａｎｏｆｓｋｙ＋　Ｍｅ
ｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙｒｎｏｌｏｇｙ＋　Ｖｏｌ、
　Ｖ＋　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅａｓ　Ｉｎｃ、＋Ｎ
ｅｗ　ＹｏｒＫ＋　／　９６コ年、７９ｑ頁）Ｋ！り測
定ｔ、。

その結果を第１表に表示した。

なお、対照としてはＱ３Ｃ，１１分間の誘発処理を行な
わなかったものを表示し一更に溶菌に関係するＳ遺伝子
が変異していない組換え体を溶原化した大腸菌Ｂ、　ｔ
ｒｐ−（λｃＩざｊ７ｈｆｆＯａｔｔ　ｓＲＩλ３ｓＲ
Ｉλ：　ｓＲＩλ：’ｄ　ｔｒｐ　）を上記と同様に誘
発培養して得た培養病（溶菌液）及び１１３Ｃ，１１分
間の誘発処理をしなかった培養液、宿主大腸菌のｔｒｐ
＋株を同様に培養した結果を併せて記載した。

第　　　　　１　　　　　表 なお実験例−実施例及び参考例中で使用する各培地を説
明すると１次の如くである。

■トリプトン寒天平板培地 トリプトン（Ｄｉｆｃｏ　）　’　４　＊　ＮａＣ１０
、ｘ、ｔ％　。

寒天！、ユ憾；加圧滅菌後Ｊｏｍｌずつを直径９ｃｒｎ
のシ、ヤーレに分注した。

■Ｂ、−ソフトアガー トリプト７ＣＤｉｆｃｏ　）　　／　４　＋　ＮａＣ１
０，２ｒ４　。

Ｍｇ０１２１ｍＭ、ビタミンＢ＋　’　、　−ｔ　ｐ？
／　ｍｌ　、寒天ｏ、ｚｔｓ’、３ｎｔずつ小試験管に
分注し加圧滅菌した。

■トリプトン培地 トリプトｙ　（Ｄｉｆｃｏ　）　／　憾、ＮａＣ１０、
コＪ−１１゜■ＣＡ平板培地 に２）（ＰＯ４０，７’　、ＫＨ２ｐｏ、　ｏ　、　Ｊ
　４　、　／　エｙ　酸ｆ　）　ＩＪ　ラム０　、０１
％　、禽ｓＱ４　＊　７Ｈ２００，ｏｔ４゜（ＮＨ４）
２８０４　０．ノ憾、グルコースＯ、’　２　ｅｌｒ　
、　カセイン酸分解物０．／ｊ％、及び寒天ｊ、３４か
らなる平板培地。

■Ｈ−ｔｒｐ培地 Ｏ，／ＭＩＪ／酸カリウム緩衝液ｐＨ７，０，０，０１
ｊＭ　　　（ＮＨ４）２ＳＱ−／　ｍＭ　Ｍｇ５ｏ、、
１．ＩＩ×ｌ０−６ＭＦｅＳＯ４，ｏ　、　ａ４グ／ｌ
／：ｌ−ス、及び０１７ｍ９７　ｍｌトリプトファンか
らなる液体培地。

■Ｉ　−ｔｒｐ培地 ０　、０　／　Ｍ　）リス緩衝液ＰＨ７、ノｅ　ｔ×１
０−ＢＭＭｇＣ１２、６ｘ　ｔ　□″″４Ｍリン酸カリ
ウム緩衝液ｐＨ７，ｌ。

ｊ　　Ｘ　　／　　０−’　　Ｍ　　　（ＮＨ４）２８
０４　１　　”　　Ｘ　　ノ　ｏ−１゜　Ｍ　　　Ｆｅ
ＳＯ４ｈＯｏ−憾グルコース、及びＱ、／■／ｍ６トリ
プトフアンからなる液体培地。

■Ｔ−Ｙ培地 トリプトンノ係、酵母エキスｏ　、　ｊ　４　、　Ｎａ
Ｃｌ０．ｌｊ憾、ｐＨ７，００

【図面の簡単な説明】

第１図は実験例におはる培養時間と菌濃度の関係を示す
図である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. テンペレートファージのＤＮＡの複製及び宿主染色体へ
   の組み込みに関与するＤＮＡ部分にエンドヌクレアーゼ
   開裂部位をもたず、少なくともコート蛋白質製造の遺伝
   情報をもつＤＮＡ部分に開裂部位を有し、かつファージ
   ＤＮＡ上の溶菌に関与する遺伝子が宿主細菌が溶菌しな
   いように変異した。宿主ＤＮＡに溶原化される能力を有
   するテンペレートファージＤＮＡ。