JPS5828277A - 微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、互いに共存可能な複数種の分解的エネルギー
生成プラスミツド（ｐｌａｓｍｉｄ　）を含有する微生
物およびその調製方法に関するものである。

微生物遺伝学の術藷は非常にわかり難いから、本発明の
理解を助けるために若干の定義を与えておくこととしよ
う。

「染色体外因子」−細胞の染色体から物理的に独立して
存在する遺伝単位。「染色体外因子」および「プラスミ
ツド」は同義語である。染色体から物理的に分離された
ある種のプラスミツドは、関連する染色体の移行がなく
ても、他の細胞中へ高い頻度で伝達させることができる
。

「エピゾーム」−宿主細胞の染色体中に組込まれた状部
で存在するか、あるいけ独立に増殖する自律的な細胞質
含有物として存在することのできる種類のプラスミツド
。

「伝達可能なプラスミツド」−接合を通じての細胞間移
行を本たらす遺伝的決定因子を自ら有するプラスミツド
。

ｒＤＮＡＪ−デオキシリポ核酸。

「バクテリオファージ」−蛋白質の頭部内に含まれたＤ
ＮＡ片から成沙かつ蛋白質の尾部および尾部繊維を有す
る粒子。

［形質導入７アージｊ−細菌の染色体ＤＮＡを担い持ち
、そして別の細菌への感染時にそのＤＮＡを運び移すバ
クテリオファージ。

「接合」−細菌が別の細菌と細胞接触を確立し、そして
遺伝物質の移行が起る過程。

「除去」−微生物からプラスミツドが選択的に排除され
る過程。

「除去剤」−除去過程を促進する化学的物質または物理
的処置。

「ゲノム」−ある一定の系列を成す遺伝子の組合わせ。

「分解経路」−当初の基質を（微生物にとって正規の食
料物質であるような）ある種の単純な代謝産物に転化享
せる酵素反応系列。　たとえば、微生物によって生産さ
れた５〜７０種の酵累から成る。

（単独炭素源）−一記載の単独炭素源のみでは生長の不
可能な突然変異体を表わす。

（プラスミツド）　一記載のプラスミツドが除去過程に
よって完全に排除されてしまった細胞、またはその中に
記載のプラスミツドがかって全く存在したことのない細
胞を表わす。

（プラスミツド）−一記載のプラスミツドが欠如してい
る細胞、または記載のプラスミツドの非機能的誘導体が
含有されている細胞を表わす。

（アミノ酸）−一記載のアミノ酸を生産することができ
ない菌株を表わす。

（ビタミン）−一記載のビタミンを生産することができ
ない菌株を表わす。

（プラスミツド）十−細胞が記載のプラスミツドを含有
していることを表わす。

さて、プラスミツドは２本鎖のＤＮＡ分子から成ってい
ると信じられる。　遺伝学的構成から見れば、それは少
なくとも１つの複製部位および宿主細胞の構造成分への
付着用の維持部位を含んでいると信じられる。　一般に
、プラスミツドは細胞の生活力にとって不可欠のもので
はない。

これまで、プラスミツドの存在、機能および遺伝学的構
成を裏付ける多くの仕事が行なわれてきた。　「細菌の
染色体外遺伝」と題するリチャードービー拳ノビツク（
Ｒｉｃｈａｒｄ　Ｐ、　Ｎｏｖｉｃｋ　）　ｔｆ）総説
（Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　
雪Ｊｕｎｅ　１５’６９　・２１０〜ｊＡｊ　、　／り
６り）のｎり頁に報告されている通り、「若干のプラス
ミツドに対応するＤＮＡが各種の方法によってプラスミ
ツド含有細胞から単離され、物理化学的に％性決定され
、そして場合によっては電子顕微鏡で検査された。」 ところで、分解経路を定義するようなエネルギー生成プ
ラスミツドの存在はノビツクの総説中において認められ
ていない。　ノビツクの総説の２３７頁の記載によれば
、公知の（非エネルギー生成）プラスミツドについては
、「≠ないし５種のプラスミツドの組合わせ１＆／個の
細胞中において安定であると思われる。」 プラスミツドは、互いに共存可能な場合（すなわち、そ
れらが同じ宿主細胞中に安定に存在できる場合）もあれ
ば、互いに共存不可能な場合（すなわち、それらが同じ
宿主細胞中に安定に存在できない場合）もある。　公知
のプラスミツドとしては、たとえば、性決定因子プラス
ミツドおよび薬剤耐性プラスミツドが挙げられる。

また、ノビツクの総説の２１ＡＯＴ４に述べられている
通り、「細胞はプラスミツドに対して特異的な維持部位
を提供する。　複製および曹製体の分離のためには、か
かる部位への付着が必要であると考えられる。　各゛プ
ラスミツドは特定の維持部位に適合している。」あるプ
ラスミツドが所定の細胞に人や込んだ場合、別のプラス
ミツドが予め占拠しているため維持部位が利用できない
ならば、これらのプラスミツドは互いに共存不可能とな
る。

フェノール、クレゾールおよびサリチル酸エステルのご
とき芳香族炭化水素の生物分解は、どちらかと言えば、
かかる過程の生化学とりわけ酵素の特性決定、関係する
中間生成物の性質および酵素作用の調節機構に重点を置
きながら広汎に研究されてきた、　しかるにかかる生物
分解の遺伝学的基礎は、適当な形質導入ファージやその
他の遺伝学的道具の欠如のため、それほど徹底的に研究
されてはいない。

カフラバーティおよびグンサルス（Ｃｈａｋｒａｂａｒ
ｔｙ＆Ｇｕｎｓａｌｕｓ　）　ｔｙ）研究（Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ　＋　ｌ、ｆ　＊　Ｎｏ、／　ｖ　Ｓ／θｌり７
／　）によれば、カン７アーの分解に係る酵素の合成を
支配する遺伝子はプラスミツドを構成することが示され
た。　この研究はまた、同様にして、オクタン分解経路
がプラスミツドによって定義されることをも示した。　
　しかしながら、ＣＡＭおよびＯＣＴプラスミツドを一
緒に含有する微生物を得ようとする著者等の試みは成功
しなかった。　つま妙、これらのプラスミツドは互いに
共存不可能だったのである。

エシェリキア・コリ（Ｅｇｈｅｒｉｃｂｉａ　ｃｏｌｔ
　）　ＣＤ場合、それぞれに分解経路を定義する伝達可
能なプラスミツド（細胞１個当や７種）が人工的に作ら
れた。　天然には存在しないかかるプラスミツドはＰ　
’　ｌａｃおよびＦ　’　ｇａｌであって、その中の乳
糖およびガラクトース分解遺伝子は微生物の染色体から
誘導されたものである。　かかるプラスミツドは「エシ
ェリキア・コリに／ｊにおけるＦ′因子の形成」と題す
るジェー・スケー７（Ｊ、５ｃａｉｆｅ　ｌの論文（Ｇ
ｅｎｅｔ、Ｒｅｓ、Ｃａｍｂｒ、ｅＪ’＃／Ｊ’り〜／
り６．／９１）乙　）中に記載されている。

ところで、所定の分解経路を定義する互いに共存可能な
複数種のエネルギー生成プラスミツドを含有した微生物
の開発が４し可能になれば、その発明の及ぼす経済上お
よび環境保全上の影響は広大なものとなろう。　かかる
多能な微生物に対しては、たとえば、炭化水嵩からの蛋
白質製造（「石油からの蛋白質Ｊ　−Ｗａｎｇ　、Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｗＡｕｇｕｓＬ、
２６　、１９＆１　ｅタタ）、漏出石油の清掃（「漏出
石油、この環境を脅かすもの」−Ｅｎｖｉ　ｒｏｎｍｅ
ｎＬａｌ　　５ｅｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ　＊　ＩＩ　＋　９７　＋Ｆｅｂｒｕａｒｙ　／
９７０　）　　および使用済みの自動車潤滑油の処分（
「廃棄潤滑油処分のもたらすジレンマ」−Ｅｎｖｉｒｏ
ｎｍｅｎｔａｌ　５ｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ　＊　ｌ、　＊　２５　＊Ｊ　ａｎｕａｒｙ
　／Ｙ７２　）　ＩＣおける応用が即座に思い浮ぶはず
である。

さて乙の度、芳香族炭化水素の１つであるサリチル酸エ
ステル（ＳＡＬ）の分解経路を定義する伝達可能なプラ
スミツドが見出された。　更にまた、多核芳香族炭化水
素の１つであるナフタリン（ＮＦＬ）の分解経路を定義
するプラスミツドも確認された。　かかるＮＰＬプラス
ミツドも伝達可能なものである。

サリチル酸エステルおよびナフタリンに対して別個の分
解経路を定義するプラスミツド由来の能力の存在（およ
び伝達可能性）が確認された結果、ＣＡＭ％ＯＣＴ、Ｓ
ＡＬおよびＮＰＬプラスミツドの各種の安定な組合わせ
を含有する特異表革細胞微生物が開発された。　更にま
た、１個の細胞中における上記のプラスミツドと非エネ
ルギー生成プラスミツド（薬剤耐性因子ｇ−／）との安
定な組合わせも達成された。　かかる新規な微生物の多
能性は、原油やバンカー〇重油のごとき炭化水素複合体
の分解が実質的な程度［ｔで達成されることによって実
証された。

本発明の厳密な性質並びにその目的および利点は、添付
の図面に関連する以下の記載を読めば容易に明らかとな
ろう。

本明細書中に記載の遺伝学的技術によって調製された微
生物の実例としては、米国農務省に現在寄託されている
培養体が挙げら゛れる。　それらの培養体は下記のごと
くに同定されている。

プソイドモナス・アエルーギノーザ（ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　）　
（ＮＲＲＬ　Ｂ　−！；１Ａ７Ｌ２　］−ブラスミッド
の形態を持つカンファー、オクタン、サリチル酸エステ
ルおよびナフタリン分解経路を遺伝学的に移行含有させ
ることによってプソイドモナス・アエルーギノーザ／Ｃ
株（ＡＴＣＣＮｏ、／ｊＡり２）から誘導された菌株。

ブソイドモナスープーチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐ
ｕｔｉｄａ　）　（ＮＲＲＬ　Ｂ　−３１７７３）−プ
ラスミツドの形態を持つカンファー、サリチル酸エステ
ルおよびナフタリン分解経路並びに薬剤耐性因子即−／
を遺伝学的に移行含有させることによってプソイドモナ
ス・ブーチダＰｐＧ１株（ＡＴＣＣＮｏ、　／７４１３
３）から誘導さ−れた菌株、　なお、薬剤耐性因子ρ−
７はネオマイシン／カナマイシン、カーペニシリンおよ
びテトラサイクリンに対する抵抗性を与えるものである
。

これらの各菌株については、米国イリノイ州ペオリア市
の米国農務省農務局北部市場栄養研究部の永久蒐集品中
から閣培養体を入手することができる。

上記微生物の誘導源としての菌株に関する各種培地中で
の形態学的観察、各種培地中での発育、一般的な集団特
性試験、糖の利用および最適発育条件は、「好気性プソ
イドモナス、その分類学的研究」と題するアール・ワイ
・ステーニア（Ｒ。

Ｙ、　８Ｌａｎｉｅｒ　）等の論文（Ｊｏｕｒｎａｌ　
ｏｆ　ＧｅｎｅｒａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　、　
１７３　＋　／３９〜２７ハ／９６６　）中に記載され
ている。　上記微生物の分類学的性質は！！菌株の場合
と同じである。　プソイドモナス・アエルーギノーザｌ
Ｃ株（ＡＴＣＣＮｏ、　／ｊｌ、り２）ａステーニア等
の論文中の７３１株（ＡＴＣＣＮｏ、　／７３０３　）
　ト同じものである。　後になって、「プソイドモナス
の遺伝学」と題するビー・ダブリュー・ホローウェイ（
Ｂ、Ｗ、　Ｈｏｌｌｏｗａｙ　）　Ｏ総説（Ｂｉｏｌｏ
ｇｉｃａｌ　）Ｒｅｖｉｅｗｓ　＊３３　ｍ　ｌＡ／り
〜’Ａｔ／−３，／り６り）中に記載の通り、この菌株
の名称はプソイドモナス・アエルーギノーザＰＡＯと変
更された。　また、プソイドモナス・ブーチダＰｐＧ１
株（ＡＴＣＣＮｏ　、　／７４１！；３　）はステーニ
ア等の論文中の７７株（ＡＴＣＣＮｏ、　／７１１３３
　）と同じものである。

以下に一層詳しく記載されるごとく、これらの微生物は
原油およびバンカーＣ重油をはじめとする極めて広い範
囲の炭化水素を栄養素として発育する。　それらはまた
、プソイドモナスの実験用菌株について一般的に言える
通り、病原性を示さない。

別個の分解経路を定参する互いに共存可能な複数種のエ
ネルギー生成プラスミツドを含有した微生物の調製方法
は、簡潔に言えば、（１）分解されるべき交合体ないし
混合物を選択し、（２）前記複合体ないし混合物の各種
成分を分解するため１個の細胞中に存在すべき複数の分
解経路を確認し、（３）前記各種成分の７つと同一ない
し類似のある特定の選択的基質を栄養素とする所定微生
物（一般に優れた発育能力の実証結果に基づいて遺ばれ
たもの）の菌株を分離し、（４）前記選択的基質を分解
する前記菌株の能力がプラスミツドに由来するかどうか
を判定し、（５）かかる第１の分解経路を接合によって
同じ微生物の別の菌株（またはその分解経路の除去され
た同じ菌株）に移行させる試みを行なって第１のプラス
ミツドの伝達可能性を確認し、（６）接合完了体（すな
わち、接合によって前記プラスミツドを受容した菌体）
を純粋化してから、前記接合完了体の特性の試験によっ
て前記接合完了体が実際に前記分解経路を受容したこと
を確認し、（７）同じ操作を繰返して前記接合完了体に
第２のプラスミツドを導入し、（８）必要ならばプラス
ミツドの癒合によって前記＠ｌおよび第２のプラスミツ
ドを互いに共存可能にさせ、それから（９）プラスミツ
ドの移行（および必要ならば癒合）によって所望の分解
経路が７個の細胞中に完全に補充されるまで以上の操作
を繰返すことから成る。

同じ細胞中に／ｓ以上のエネルギー生成分解経路を存在
させようとする試みの最初の報告（前述のカフラバーテ
ィ等の論文）によれば、ＣＡＭおよびＯＣＴプラスミツ
ドはかかる条件下で安定に存在できないことが見出され
た。　このような結果から、複数種のエネルギー生成プ
ラスミツドをｉｇＢの細胞中に導入できても維持できな
いことが暗示された。　それにもかかわらず、かかるプ
ラスミツドの共ｉ不可能性の間畷を克服する道を発見し
ようという決意がなされた。　結局、前記に指摘された
通り、そしてまたプソイドモナス属におけるエネルギー
生成プラスミツドの移行に関連して後記に一層詳しく記
載される通り、プラスミツドの不安定性の問題は受容細
胞中においてブラスミフドを癒合させることにより今や
解決されたのである。

１個の細胞中に炭化水素複合体の分解および転化能力を
有する微生物の開発は、即時に有益な応用例として、と
りわけプソイドモナスの単一菌株の使用による漏出石油
の遺伝学的制＠に重点を置きながら実施された。　漏出
原油および漏出バンカー０重油圧対処し得るよう、本発
明によって調製されるプソイドモナス誘導体の各細胞は
線状脂肪族、環状脂肪族、芳香族および多核芳香族炭化
水素に対する分解経路を含有すべきであることが断定さ
れた。　その結果、これらの分解能力を有するプソイド
モナス・アエルーギノーザ〔ＮＲＲＬ　Ｂ　−５≠η〕
が開発されたのである。

即座に封じ込めて処分することのできない大量の漏出石
油は水棲生物に対して壊滅的な影響を及ぼす。　ところ
で、原油の個々の成分を分解し得る微生物は知られてい
る。　たとえば、各種の酵母は直鎖状の脂肪族炭化水素
を分解できるが、芳香族および多核芳香族炭化水素はほ
とんど分解できない。　また、プソイドモナスおよびそ
の他の細菌は脂肪族、芳香族および多核芳香族炭化水素
を分解することが知られている。　しかし残念ながら、
各菌株は特定の成分しか分解することができない。　こ
のような理由から、本発明以前には、漏出石油の生物学
的制御と言えば石油複合体の個々の成分を分解し得る各
種細菌菌株の混合−が使用されてきた。　そうすれば、
累積的な分解作用が石油を消費してそれを細胞塊に変え
ると考えられたわけである。　こうして得られた細胞塊
は水棲生物の食物として役立つことになる。　しかしな
がら、細菌菌株は（ａ）各種の炭化水素成分に基づく発
育速度、（ｂ）栄養素要求性や抗生物質その他の毒性物
質の生産性および（ｅ）　ｐ）ｌや温度や無機塩の必要
条件の点で互いに異なるから、混合培養体を使用しても
煙路的に生残るのは当初の細菌菌株のほんの一部に過ぎ
ない。　その結果、炭化水素分解細菌の混合培養体を漏
出石油上に接種した場合でも、石油の大部分は長期間（
数週間）にわたって変化を受けず、従って自由に拡散し
たり沈没したりすることが多い。

ところが、プソイドモナスにおけるＳＡＬおよびＮＰＬ
分解経路が伝達可能なブラスミ・ンドに由来する遺伝子
によって定−されることが確閣され、かつプラスミツド
（たとえばＣＡＭおよびＯＣＴブラスミブド）が癒合に
よって安定化され得ることが発見された結果、複数種の
分解経路を１個の細胞中に有するプソイドモナス菌株を
遺伝学的に調製することが初めて可能となった。　原油
の各種成分を同時に分解する能力を持ったかかる菌株を
使用すれば、混合培養体の場合よりも遥かに早い速度（
数日間）で漏出石油が分解され得る一方、残妙の部分も
合体して大きな油滴を形成する。　このような作用の結
果、石油拡散の機会が迅速に排除され、かつ合体した残
渣の回収も促進されることＫなる。

培養体を発育させるための合成無機培地の組成は、使用
される全てのプソイドモナス菌株について同じであった
。　無機培地の調製に当っては、先ず下記のものが用意
された。

これらのＰＡ濃縮物および１００Ｘ塩類はそれぞれオー
トクレーブ処理によって滅菌された。　その後、下記の
処方に従って／１の無機培地が調製された。

ＰＡ濃縮物　　　　　７７、！；　ｍｔｉｏθ×塩類　
　　　　１０．０　ｍｌ寒　　天　　　　　　　　ｉｓ
、ｏ　ｔ）１２０で／Ｌとする（ｐ阻６．ｆ〜７．０に
調整する）。　％に記載のない限り、全ての実験は３．
２℃で実施された。

ところで、線状脂肪族、環状脂肪族、芳香族および多核
芳香族炭化水素の分解経路をプソイドモナス・アエルー
ギノーザの１つの菌株に移行させることができれば、極
めて有用な炭化水素分解能力が１個の細胞中において達
成されるものと考えられた。　かかる目的のため、≠ｊ
℃もの高温下でも大きい発育速度を有するブソイドモナ
スーアエルーギノーザＰＡＯが選ばれた。　他方、ｎ−
オクタン（線状脂肪族炭化水素）、カンファー（環状１
１１１１７ｊ族炭化水素）、サリチル酸エステル（芳香
族炭化水素）およびナフタリン（多核芳香族炭化水素）
の分解能力をそれぞれに有するμつのプソイドモナス菌
株が選ばれた。

これらの分解経路の各々がプラスミツドに由来すること
をｉｉｇするため、炭化水素を分解し得る各々のプソイ
ドモナス菌株が除去剤で処理された。　公知の除去剤（
たとえばドデシル硫酸ナトリウム、原票、アクリフラビ
ン、リファンピシン、臭化エチジウム、高温、マイトマ
イシンＣ，アクリジンオレンジなど）のうち、大部分は
いずれの分解経路を遮排除することができなかった。　
しかし、これらの菌株の分解経路はマイトマイシンＣＫ
よって除去され得ることが判明した（第１！ｉり。　な
お、上記の分解経路を官有する各々のプソイドモナス菌
株は当業界において公知のものである。

（ａ）ＣＡＭ＋プソイドモナス・プチーダＰ　ｐＧ　１
−Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　（Ｕ、Ｓ、
Ａ、　）　ｅ６０ｒ／１，１．／りｂＩｒ。

（ｂ）　　ＯＣＴ＋プソイドモナス・オレオポランス（
１’ｓｅｕｄｏｍｏｎａａ　ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ　）
　−Ｊ、　Ｂｉｏｌ　。

Ｃｈｅｍ、、　、２ｔ／１２−１４３３４１．／り６７
゜（ｅ）ＳＡＬ＋プソイドモナス・ブーチダＲ−／−Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ　　Ｐｒｏｅｅｅｄｉｎ
ｇｓ＋　　／り７２　、Ｐ　。

ｂｏ、　　　　　　　　・ （ｄ）　　ＮＰＬ＋プソイドモナス拳アエルーギノーザ
ーＢｉｏｃｈｅｍ　、　Ｊ、　＊り／　、　２！／　、
　１５’＃　。

マイトマイシンＣによって各菌株から分解経路を除去す
るためには、先ず、各種濃度のマイトマイシンＣｔ−含
有するし肉汁（イー・ニス・ルノ−（Ｅ、Ｓ　、Ｌｅｒ
ｍｏｘ　）；　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、／　ｔ　／り０．／
９オｊ）が数本の試験管に注入され、そして１０４〜１
０５細胞／ｍｌの個体群密度を与えるように希釈された
所定菌株の定常初期の細胞が接種された。　次いで、か
かる試験管が振盪器上において３２℃で２〜３日間にわ
た抄保温された。　ある程度の発育を示す一定量の培養
体が試験管から抽出希釈され、そしてグルコース最小平
板培地上に接種された。　３，２℃で２≠時間にわたる
保温の後、個々のコロニーが分割され、そしてグルコー
ス最小平板培地および分解経路最小平板培地上に接種さ
れた。　こうして求められたＣＡＭ−１ＯＣＴ−１ＳＡ
Ｌ−″およびＮＰＬ−コロニーの割合から、除去の頻度
が決定された。

その結果、いずれの場合において本分解経路遺伝子はプ
ラスミツド由来のものであることが示された。

カン７アーおよびサリチル酸エステル分解経路に関する
若干の点突然変異体を用いた形質導入研究によれば、除
去されたＤＮＡ断片はプラスミツド遺伝子の全体ないし
主要部分を失なっていることが示唆された。　分解経路
がプラスミツドに由来することはまた、それらが接合に
よっである菌株から別の菌株へ伝達し得るという証拠か
らも確認された（第２表）。　プラスミツド移行の頻度
は個々のプラスミツドに応じて大幅に変動するし、また
プソイドモナス・オレオボ４：５ンスからプソイドモナ
ス・アエルーギノーザＰＡＯへのＯＣＴプラスミツド移
行は検出可能な頻度で起り得ｌないのだが、それでも大
部分のプラスミツドは接合によっである菌株から別の菌
株へ移行すると言える。

プラスミツドの移行はまた、他の１株に対して実施する
代りに、マイトマイシンＣ１アクリジンオレンジまたは
その他の除去剤によって所定分解経路の除去された同一
菌株に対して実施することも可能であろう。

なお、プソイドモナス・ブーチダＵはフェイスト（Ｆｅ
１ｓｔ　）等の論文（Ｊ　、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ
）ｒ　ｅ　１００　＋ｇ６り〜１７７・／り６り）中に
記載されている。

第２麦中に供与菌として示され九各々補助的栄養変異体
（発育のために特定のアミノ酸またはビタミンを含有す
る栄養源を要求する突然変異体）は、少なくとも約ＩＯ
細胞／ｍＡの個体群密度に達するまで、複合栄養培地（
たとえばＬ肉汁）中において振盪なしで６〜．！弘時間
にわたね培養された。　また、分解経路を移行させるべ
き基本有機栄養性の受容菌（ある所定の最小炭素源に基
づいて発育し得る菌株）は、少なくとも約ｌＯ６細胞／
ｍＬｆ）４１体群密度に達するまで、同じ複合栄養培地
中において振盪下で≠〜２６時間にわた９別個に培養さ
れた。　各分解経路の移行に当っては、これらの培養体
が等しい容量で混合され、（接合を行なわせるため）振
盪なしで／５分ないし２時間にわたって３２℃に維持さ
れ、それから特定の基質を単独炭素源として含有する最
小平板培地上に接種された。　供与菌および受容菌の培
養並びに混合のためのかかる操作は、実験室内での接合
およびプラスミツド移行を促進する典型的な方法であっ
て、極めて効率的な移行系を与えるように設計されてい
る。　温度は厳密を要しないが、好適外温度範囲は３０
〜３７℃である。　供与菌ないし受容菌の個体群密度が
約ｌＯ６細胞／　ｍＬ以下に低下したり、あるいは最適
発育条件（供与菌の静止培養、受容菌の攪拌培養、高栄
養含量培地中での培養および対数期の受容菌細胞の採取
）に変化が起ると、プラスミツド移行の頻度は著しく低
下する。

なお、補助的栄養変異体の調製分離に関する詳細は「細
菌およびウィルスの遺伝学」と題するつ４　リ７ム＊　
Ａ％イズ（Ｗｉｌｌｉａｍ　）ｌａｙｓ　）　ノ教科書
（ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社、／り６ｊ）中
に記載されている。

供与菌および受容菌の対照培養体もまた、所定の基質を
単独炭素源として含有する最小平板培地上に別個に接種
された。　これは、供与菌および受容菌における先祖返
りの頻度を決定するだめのものである。

（対照をも含む）全ての平板培地が３θ〜３７℃で数日
間にわたり保温された。　対照平板培地上のコロニーを
上回る数のコロニーが出現した場合には、供与菌と受容
菌との間で分解経路の移行が起ったものと認められた。

　かかる接合完了体を一連の単一コロニー分離培養によ
って純粋化した後、受容菌の発育速度およびその他の特
性が試−験され、それＫより受容菌が実際に所定の分解
経路を受容したことが１Ｉｌｉ！！された。

分解経路がプラスミツドに由来しかつ伝達可能であるこ
とが確認されたため、プソイドモナス・アエルーギノー
ザＰＡＯの１個の細胞中に複数穫のプラスミツドを移行
させる仕事が着手された。

前述のごとき過去の研究によれば、ＯＣＴブラスミフド
はプソイドモナス・オレオポランスからプソイドモナス
・アエルーギノーザＰＡＯへ移行させ得ないことがＷｉ
認されている。　そこで、最初の仕事は（もしそれがあ
るなら）ＯＣＴおよびＣＡＭプラスミツドを互いに共存
可能にさせる方法を発見することにあった。

先ず、ＣＡＭブラスミフドがＣＡＭ　プソイドモナス・
ブーチダからＯＣＴ　　プソイドモナス・オレオポラン
スのＭｅ　ｔ−突然変異体へ移行させられた。

もちろん、接曾完了体は不安定であるから、ＣＡＭまた
はＯＣＴプラスミツドをかなりの速度で排除するはずで
ある。　そこで、接合完了体が先ずカンファー次いでオ
クタンを単独炭素源として培養され、それにより（たと
え不安定であるにせよ）両方の分解経路を含有する細胞
が分離された。　生存した細胞は遠心分離され、Ｏｌり
噛食塩水中に懸濁され、そして（合計匙〃ワブトのゼネ
ラル・エレクトリックＦＳ　−，５−ランプ３個処より
）紫外線照射された。　かかる懸濁液から一定量ずつ３
つの試料が取出された。　すなわち、第１の試料は紫外
線処理前、第１の試料は紫外線照射３０秒後、そして第
３の試料は紫外線照射６０秒後に採取され九。　これら
の照射細胞試料がＬ肉汁中において光なしで３時間にわ
たり培養された。　その後、かかる試料がプソイドモナ
ス・アエルーギノーザＰＡＯ受各菌へプラスミツドを移
行させるための供与筒として使用され、それからオクタ
ン最小平板培地上においてＯＣＴプラスミツドに関する
選抜が行なわれだ。

第３表中に示すしる通り、Ｍｅｔ−ＯＣＴ＋ＣＡＭｄｅ
１プソイドモナス・オレオポランスおよびＭｅ　Ｌ−Ｃ
ＡＭ”０ＣＴｄｅ１プソイドモナス・オレオポランスに
ついても同様な照射懸濁液の試料が作成された。

その後、かかる試料がプソイドモナス・アエルーギノー
ザＰＡＯへのプラスミツド供与体として使用され、それ
から記載のプラスミツドに関して選抜が行なわれた。　
なおＭｅ　Ｌ　−ＣＡＭ十〇ＣＴ　ｄｅ’　７’　ソイ
トモナス・オレオポランスは、プソイドモナス・オレオ
ポランスのＭｅｔ　ＯＣＴ＋突然変異体ＫＣＡＭブラス
ミブドを導入し、それからＯＣＴプラスミツドを失なっ
たＣＡＭ十接合完了体を選抜することにｉつ”ｌｌ製さ
れ＆。　マタ、Ｍｅｔ−ＯＣＴ＋ＣＡＭｄｅｌプソイド
モナス・オレオポランスは野生型プソイドモナス・オレ
オポランスのＭｅｔ−突然変異体であった。

第　　３ Ｍｅ　を−〇万Ｙプソイドモナス・　　　　　プソイド
モナス・アエルオレオボランス　　　　　　　　　　　
ギノーザＰＡＯＭｅ　ｔ−ＣＡ１１ｌｌ”　０ＣＴｄｅ
ｌプソイドモナス・　　プソイドモナス・アエルーオレ
オポランス　　　　　　　　　　　　ギノーザＰＡＯＭ
ｅｔ−ＣＡＭ”ＯＣＴ＋プソイドモナス・　　プソイド
モナス・アエル−オレオポランス　　　　　　　　　　
　　ギノーザＰＡＯ選抜された　　紫外線照射 −？ ３０　　　　　＜１０ １．０　　　　　＜１０−’ ＣＡＭ　　　　　　Ｏ１０−’ ３０　　　　　　１０″″５ 乙ｏ　　　　　　　ｉｏ″″７ ９ ０ＣＴ　　　　　　Ｏ＜１０ ８ ３Ｑ　　　　　　　１０ １０　　　　　＜　／（ｆ’ ＋ 第３！！かられかる通９．　Ｍｅｔ−ＯＣＴ　　プソイ
ドモナス・オレオポランスから受容菌へのＯＣＴプラス
ミツド移行は検出できなかったのく対し、Ｎｅｔ−″Ｃ
ＡＭ＋０ＣＴｄｅｌプソイドモナス・オレオポランスか
ら受容菌へのＣＡＭプラスミツド移行は確証された。　
これらの結果は、紫外線照射によってＭｅｔ　ＣＡＭ”
　ＯＣＴ＋プソイドモナス・オレオポランス中のＣＡＭ
およびＯＣＴ　　プラスミツドが癒合し、次いで（別個
の分解経路を定義しながらも）ＣＡＭ１０ＣＴプラスミ
ツドが共同して受容菌へ移行することにより、（３０秒
間の紫外線照射を受けた）Ｍｅｔ　　ＣＡＭ”ＯＣＴ＋
プソイドモナス・オレオボランスからプソイドモナス・
アエルーギノーザＰＡＯへのＯＣＴプラスミツド移行が
可能になったとする理論を裏付叶ている。

このようなＣＡＭ１０ＣＴ癒合プラスミツドの共同移行
理論は第μ表によって確証される。　本明細書中に記載
されたプラスミツド移行および癒合のための方法によっ
て複数穫のプラスミツドを補充されたＣＡＭ＋ＯＣＴ＋
プソイドモナス・アエルーギノーザＰＡＯのＴｒｐ突然
賢異体が供与薗として使用された。　供与菌およびｏ　
ＣＴ　ｄｅ　１ＣＡＭ　ｄｅ　ｌ　プソイドモナス−プ
チーダＰｐＧ　ｌの接合後、得られた培養体がカン７ア
ーを！有する最小平板培地およびｎ−オクタンを含有す
る最小平板培地上に接種された。　次いで、ＣＡＭ最小
最小平板上地上育した１３２個のコロニーの各々の一部
がＯＣＴ最小最小平板上地上植され、またＯＣＴ最小最
小平板上地上育した２／９個のコロニーの各々の一部が
ＣＡＭ最小最小平板上地上植された。　これらの移植部
分がいずれも発育を示したことにより、（ａ）ＣＡＭお
よびＯＣＴの両プラスミツドが接合完了体へ移行したこ
と、山）移行にはｌ対／の対応が見られたこと、従って
（ｃ）ＣＡＭおよびＯＣＴプラスミツドは互いに癒合し
ていたことが確認される。

第　　弘 供　　与　　菌　　　　　　　　　　受　　容　　菌　
−−０−−１−一一一一−−−−−−−−−−−−−一
一一−−□−Ｔｒｐ−ＣＡＭ　ＯＣＴブンイドモナス・
　　ＯＣＴｄｅＩＩＣＡＭｄｅ１ブソイドモナスアエル
ーギノーザＰＡＯブーチダＰｐＧ　１０ＣＴｄｅ１ＣＡ
Ｍｄｅ１ブソイドモナヌアエルーギノーザＰＡＯ 選抜された　　選抜されない　　　総　数ＣＡＭ　　　
　　　ＯＣＴ　　　　　　／３２７’／３２０ＣＴ　　
　　　　　　ＣＡＭ　　　　　　　　２／９／２／りＣ
ＡＭ　　　　　　ＯＣＴ　　　　　　１０７／１０７０
ＣＴ　　　　　　ＣＡＭ　　　　　　９Ｖ９Ａマタ、Ｔ
ｒｐ−ＣＡＭ”ＯＣＴ＋プソイドモナス・アエルーギノ
ーザＰＡＯおよびＯＣＴｄｅｌＣＡＭｄｅｌプソイドモ
ナス・アエルーギノーザＰＡＯＯ間でも同様なプラスミ
ツド移行が実施゛され、それから同様な選抜操作が行な
われた。　その結果は、移行したＣＡＭおよびＯＣＴプ
ラスミツドが癒合しているという上記の見解を一層補強
するものであった。

ＣＡＭおよびＯＣＴプラスミツドが前述のごとくにして
紫外線照射を受けた場合、ＣＡＭまたはＯＣＴブラスミ
゛ツドを移行させると他方のプラスミツドも必ず同伴す
ることになる。　これは、いずれのプラスミツドが最初
に選抜されるかに関係しない。

また、癒合したプラスミツドの一方を細胞が除去すれば
、両方のプラスミツドが同時に失なわれるととになる。

　そこで、接合完了体がマイトマイｅｌ シンＣで処理され、こうして得られたＣＡＭ　　排除体
が検査された。　その結果、全てのＣＡＭｄｅ１排除体
は常にＯＣＴプラスミツドをも失なっていることが判明
した。　このような２種のプラスミツドの同時除去およ
び共同移行の事実は、プラスミツドのＤＮＡを切断する
手段で互いに共存不可能なプラスミツドを処理すると、
ＤＮＡ断片が癒合して同じレプリコンの一部となること
を強く示唆している。

さて、安定なＣＡＭ＋ＯＣＴ”ＳＡＬ十ＮＦＬ＋プソイ
ドモナスを調製するための障害が全て克服されたため、
前述の接合技術の使用により、第５表のごとくにして各
種の分解的エネルギー生成プラスミツドが１個の細胞中
に移行させられた。　最初に使用されたプソイドモナス
・アエルーギノーザ菌株は以前プソイドモナス・アエル
ーギノーザＩＣ株として知られたプソイドモナス・アエ
ルーギノーザＰＡＯであって、これはＡＴＣＣＮｏ、／
３μυ＞　ヨヒ（ｔ　タｔｄ　）　ＡＴＣＣＮｏ　、　
／’ＲＯ３として入手可能である。　このプソイドモナ
ス・アエルーギノーザ菌株は公知のエネルギー生成プラ
スミツドを全く含有していない。　癒合状態で存在する
ＣＡＭおよびＯＣＴプラスミツドは別個にかつ同時に機
能的であって、互いに共存可能なＳＡＬおよびＮＰＬプ
ラスミツドと完全に共存可能であると思われる。　ＣＡ
Ｍ＋ＯＣＴ＋ＳＡＬ＋プソイドモナス・アエルーギノー
ザＰＡＯおよびＣＡＭ＋ＯＣＴ”ＳＡＬ”＋ ＮＦＬ　プソイドモナス・アエルーギノーザＰＡＯに関
する共存可能性試験によれば、供与菌においてすられる
以上のプラスミツド排除は起らないことが判明した。　
なお、プラスミツドはプソイドモナス・アチドポランス
（Ｐａｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ）
、プソイドモナス・アルカリゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　）およびプソイドモナ
ス・フルオレツツｚ　ンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　
ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ　）ＶＣよつｉも受容維持され
る。　従って、全ての上記プラスミツドはこれらのプソ
イドモナス株およびその他多数のプソイドモナス種たと
えばプソイドモナス・ブーチダ、プソイドモナス・オレ
オボランス、プソイドモナス・ムルチポランス（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓｍｕｌｔｉｖｏｒａｎｓ　）などに対
しでも移行および維持が可ＣＡＭ＋ＯＣＴ＋ＳＡＬ＋Ｎ
ＦＬ＋プソイドモナス−７エルーギノーザＰＡＯのごと
き超菌株はカンファー、ｎ−オクタン、サリチル酸エス
テルおよびナフタリンのいずれの最小平板培地上でも発
育できる上、特異性の緩和現象のため、それらに類似し
た化合物の最小平板培地とでも発育できる。　従って、
個々の分解ブラスミフドが単独に機能を果す能力は同じ
細胞中に他の分解プラスミツドが存在することによって
低下するとは思われない。

全ての分解的ブラスミブドがエネルギー生成に当って同
時に機能を果す能力は、それぞれに／−（最適条件以下
の濃度）の栄養素を含有する別個の肉汁中にＣＡＭ＋Ｏ
ＣＴ＋ＳＡＬ十ＮＦＬ＋プソイドモナス・アエルーギノ
ーザＰＡＯ超菌株を加える試験によって示された。　単
独炭素源として、第１の肉汁はカン７アー、第２の肉汁
はｎ−オクタン、第３の肉汁はサリチル酸塩、そして第
グの肉汁はナフタリンを含有していた。　これら別個の
肉汁中において超菌株は極めてゆっくりと発育した。　
　しかるに、これら弘穐の炭素源を各／＝Ｍの濃度（合
計４ｔ１？ＩＭ）で同時に含有する肉汁中に超菌株が加
えられた場合、発育速度は著しく増大した。　それによ
り、ｌＡ穫の炭素源が同時に利用されたことが確聞され
た。

次に、かかる超菌株の原油分解能力が実証された。　も
ちろん、原油は（童出地、油井の活動期間などに応じ）
Ｉｊｉ状脂肪族、環状脂肪族、芳香族および多核芳香族
炭化水素の相対含有量が大幅に変化する。　とはいえ、
油井から産出した全原油の化学的調合物中には、これら
各群に属するある種の炭化水素がある程度で存在してい
るのが通例である。

第１図には、単独炭素源として原油を使用した場合にお
けるプソイドモナス・アエルーギノーザＰＡＯの≠菌株
の発育能力の差が示されている。

曲線ａはプラスミツド由来のエネルギー生成分解経路を
全く含有しないプソイドモナス・アエルーギノーザの細
胞増殖を時間の関数として示している。　また、曲線す
およびＣはそれぞれＳＡＬ＋プソイドモナス・アエルー
ギノーザおよびＳＡＬ＋＋ ＮＦＬ　プソイドモナス・アエルーギノーザの細胞増殖
を時間の関数として示していて、それらの発育は曲線ａ
の場合よりも顕著である。　更に、曲ＩＩｄはＣＡＭ＋
ＯＣＴ＋ＳＡＬ”ＮＦＬ＋プソイドモナス・アエルーギ
ノーザ超菌株の細胞増殖を時間の関数として示していて
、その発育はなお一層顕著である。　これらの結果から
、本発明に基づいて各種炭化水嵩の遺伝的分解能力を人
為的に補充された細胞はブラスミフド由来の分解経路０
数および種類が増大するのに伴なって原油上で一層急速
かつ活発に発育し得ることがはっきりと確認される。

その理由は、これらの分解経路が全能力をあげて同時に
働き得ることにある。

同様な結果は、単独炭素源としてバンカー〇重油を使用
した場合における同系列の微生物の発育能力を表わす第
２図にも示されている。　バンカー〇′を油は、商業的
に一層有用な成分を原油から除去した後に残留する残油
（またはそれから得られる製品）である。　この残油は
極めて濃厚かつ粘稠であって、それ自体としては特別の
用途を持たない。　粘度を低下させるため、少量の揮発
性炭化水素を添加することが多い。　曲線ｒＶｉプラス
ミツド由来のエネルギー生成分解経路を全く含有しない
プソイドモナス・アエルーギノーザの細胞増殖を時間の
関数として示している。　璽た、曲線８およびＬはそれ
ぞれＳＡＬ＋プソイドモナス−７エルーギノーザおよび
ＳＡＬ＋ＮＰＬ＋プソイドモナス・アエルーギノーザの
細胞増殖を時間の関数として示していて、それらの発育
は曲線ｒの場合よりも顕著である。　更に、曲１ｉ１ｕ
はＣＡＭ＋ＯＣＴ”ＳＡＬ十ＮＦＬ＋プソイドモナス・
アエルーギノーザ超菌株の細胞増殖を時間の関数として
示していて、その発育はなお一層顕著である。

なお、ＳＡＬ＋プソイドモナス・アエルーギノーザおよ
びＳＡＬ＋ＮＰＬ＋プソイドモナス・アエルーギノーザ
培養体は第６表のごとくにして調製さ第　　６ ）ｉｔｓ　　ＳＡＬプソイドモナス・　　　プソイドモ
ナス・アエル−ブーチダＲ−／　　　　　　　　　　ギ
ノーザＰＡＯＴｒｐ　ＮＰＬプソイドモナス−ＳＡＬフ
ッイドモナス・アエルーギノーザ　　　　　　　　アエ
ルーギノーザＰＡＯ選抜された ＳＡＬ　　　　　　　ＳＡＬプソイドモナス・アエルー
ギノーザＰＡＯ ＮＰＬ　　　　　　　ＳＡＬ”ＮＦＬ＋プソイドモナス
・アエルーギノーザＰＡＯ 第１および２図のデータを与えた実験は２ｊθｔｉｔの
三角フラスコ内において実施された。　各フラスコ内Ｋ
Ｆｉ、ｌｙ、Ｉ　〜７．０　ＯＰ）１１１Ｃ＠整された
（＃ｉ述の）無機培地３０ｓｓ１．単独炭素源（原油ま
九はバンカーＣ重油＞　２．！ｒ　ｍｌおよびｊ　Ｘ　
１０〜／×１０　個の細胞が加えられた。　次いで、振
盪しながら３２℃で培養が行なわれ、そこから毎日ｊｍ
ｔずつの試料が取出された。　　バラシュ・アンド・ロ
ム社製の比色計を用いて６６０画における試料の吸光度
が測定され、それにより微生物の密度が求められた。　
また、生菌数計算のため、試料の一部が希釈されてＬ寒
天（Ｌ肉汁含有寒天）平板培地上に接種された。　３２
℃で２≠時間の保温後にコロニーが計数され、その結果
を用いて第１および２図が作成された。　更にまた、後
記に論議される通り、細胞の蛋白質分析も行なわれた。

最初、　、２．ｊ　ｍｌの原油ないしバンカーＣ重油は
本質的に無制限の栄養源を提供するものと思われた。　
しかし、得られた結果は超菌株の全能力に満たなかった
ことを表わしていると言える。

つまり、炭素源中に存在する（ＣＡＭ、　ＯＣＴ。

ＳＡＬおよびＮＰＬプラスミツドにより分解可能な）ｑ
！ｒ棟炭化炭化水素対量が確認されなかったため、数日
後には／８１ないし数種のプラスミツドに対する栄養源
が制限されてしまったと本考えられるのである。

原油およびバンカーＣ重油中における超菌株の発育の極
めてｔ喪な側面を成すのは、漏出石油中から水面上に最
屯早く拡散するような成分が１〜３日以内に消失し、し
かも残留した成分が合体して形成する大きな油滴はもは
や拡散しないという事実である。　その上、微生物は残
留成分を消費し続けるから、機械的回収技術によって油
滴を除去することも一層容易である。

実際には、海洋の植物相や動物相を破壊する石油の拡散
を抑制するため、遺伝学的に調製されたかかる微生物の
乾燥粉末（または凍結乾燥粉末）ｆ！＃株物が（たとえ
ば上空から）できるだけ早く漏出石油上に散布される。

　このようにして、できるだけ多量の石油を微生−に分
解させれば、設備が現場に到着して活動を開始した場合
にも、機械的に回収すべき石油の量は少なくて済むわけ
である。　漏出石油上に接種物を散布するための特に有
益な方法は、接種物を麦藁に含浸させ、そして接種を受
けた麦藁を漏出石油上に投下することである。　　この
場合には、両方の成分が役に立つことになる。　すなわ
ち、接種物（微生物）が石油を分解する一方、麦藁は微
生物の担体および石油の吸収材として働くのである。　
所望ならばその他の吸収材本使用できるが、最も実用的
なのは麦藁である。　乾燥された接種物およびそれで被
覆された麦藁（またはその他の吸収材）の製造および貯
蔵に当っては、特に注意を払う必要はない。

栄養嵩や無機塩を追加する必要もない。　また、対数期
からの培養体が好適であるが、定常初期ないし対数期か
らの培養体を使用してもよい。

ところで、プラスミツドに由来する多数の炭化水素分解
経路が将来発見されると期待することは不当とは言えな
い。　微生物の、生来の分解能力を遺伝学的に拡張する
方法が本発明によって実証された現在、これから発見さ
れるべきプラスミツドがお互い同士あるいは超鉋株（Ｎ
ＲＩ（Ｌ　Ｂ−５ψｌおよびＮＲＲＬＢ−、ｊ≠７３）
中のプラスミツドと共存可能であるかどうかくかかわら
ず、原油中の一層多くの炭化水素を分解し得る新規かつ
有用な単細胞微生物を調製できることが有望視されよう
。

なお、上記の超菌株はいずれも一層多くのプラスミツド
の受容菌として使用できる。　実際、複数種のプラスミ
ツドを官有する接合完了体では、（紫外線またはＸ鉱照
射によって１追加のプラスミツドが癒合して共存可能と
なる可能性は増大していると言える。　なぜなら、新し
く導入されるプラスミツドと癒合し得る安定なプラスミ
ツドがそれだけ多く存在しているのだから。

調製 無機培地および接合技術は上記の場合と同じであった。

　最初の受容菌としては、抗生物質感受性のプソイドモ
ナス・ブーチグＰｐＧｌ培養体からマイトマイシンＣに
よってＣＡＭブラスミツドを除去したものが使用されｆ
ｃ６　　このプソイドモナス・ブーチダ菌株は低濃度（
たとえば２３　ＰＩ／ｍＡ）のネオマイシン／カナマイ
シン、カーペニシリンおよびテトラサイクリンに対して
感受性を示す。

第７表に示される通り、全ての供与菌は補助的栄養変異
体であった。　これは、補助的栄養変異体の供与菌を使
用した場合、かかる供与菌に対して接合完了体を選抜す
ることが容易なためである。

プソイドモナス・アエルーギノーザＲＰ−／株はサイケ
スｒｓｙｋｅｓ）等の論文（Ｎａｔｕｒｅ　−易９り上
２．／り７０）中に記載されている。　ＲＰ　−／プラ
スミツド［１１する選抜はネオマイシン／カナマイシン
平板培地上において実施された。　オた、＋＋＋ ＣＡＭ　　ＳＡＬ　ＮＰＬ　　ＲＰ−／＋プソイドモナ
ス・ブーチダＰｐＧ１はカーペニシリンおよびテトラサ
イクリンに対しても抵抗性を有することがわかった。

従って、ＲＰ−／プラスミツドは実際に存在すること、
そして選抜操作中に生残った微生物は単なる突然変異体
形成の結果ではないことが＊ｇされた。

ＷＫまた、かかる超菌株のプラスミツドは移行させたり
除去したりすることもできる。　超菌株からのプラスミ
ツド排除（自然喪失）の速度は供与筒の場合と同じであ
った。

もちろん、本明細書中に記載されたプラスミツド源以外
に、上記の両超菌株をプラスミツド源として使用するこ
ともできる。　たとえば、ＣＡＭ。

ＳＡＬまたＦｉＮＰＬプラスミツドをＣＡＭ＋ＳＡＬ＋
＋ ＮＰＬ　　ＲＰ−／＋プソイドモナス・ブーチダＰｐＧ
ｌから所定のプソイドモナス受容菌へ移行させる場合、
最適の接合を得るための供与筒および受容菌の発育混合
条件は前述の場合と同じである。　これらのプラスミツ
ドの移行頻度は時間と共に変化する。　移行頻度はＣＡ
Ｍ％ＮＦＬ％ＳＡＬの順序で小さくなる。　ＣＡＭプラ
スミツドの移行については、接合後、ＣＡＭプラスミツ
ドに関して選抜が行なわれる。　生残ったコロニーが分
割され、それからＳＡＬ、ＮＦＬおよびＣＡＭプラスミ
ツドに関して各コロニーの選抜が行なわれる。　単独炭
素源としてカンファーを使用し九場合にのみ生残ったコ
ロニーが、ＳＡＬおよびＮＰＬプラスミツドを伴わずに
ＣＡＭプラスミツドのみを受容したものである。　ＳＡ
ＬおよびＮＰＬプラスミツドの個別移行についても同じ
操作を行なえばよい。

本発明に従えば、前述のととぐ漏出石油の処理能力につ
いて改善が得ら゛れるげかりでなく、単細胞微生物によ
る炭素含有基質からの蛋白質合成についても著しい改善
が得られることになる。

所定の単細胞微生物に複数種のエネルギー生成ブラスミ
フドが補充された場合、実質的に単一成分の基質（たと
えばアルカン、パラフィン、炭水化物など）を便用ぜね
ばならないという制約が取除かれる。　それと同時に、
一定期間中に／個の細胞が生産し得る細胞塊の量を９〜
７００倍に増大させる機会も得られる。　また、細菌に
よる蛋白質生産の最適化が得られることも極めて興味深
い。

なぜなら、細菌の細胞塊は遥かに多量の蛋白質を含有す
る上、大抵の細菌の耐熱性は酵母の場合よりも大きいか
らである。　特に後者の事実は、基質の酸化的分解によ
って発生する熱を除去するために必要な冷却が少なくて
済むという点で重要である。

単細胞微生物による蛋白質生産の一般的な方法および装
置は、（引用によって本明細書の一部を成す）前述のワ
ンプの論文中に記載されている。

複数種のプラスミツドを含有する本発明の単細胞微生物
の大きな利点の７つけ、細胞塊の採集後に炭素源を含有
しない無機培地中において十分な期間だけ保温を行なえ
ば、細胞内に残留する炭化水’Ｊｌ（たとえば、しばし
ば発癌性を有する多核芳香族炭化水翼）の代謝を確実に
完了させ得ることにある。　現在のところ、未変化の炭
化水素を除去するための処理を細胞塊に施せば、蛋白質
製品の品質低下を招くことが多いのである。

本発明はまた、単細胞微生物による蛋白質生産の経済性
をも一層改善する。　なぜなら、所定のプラスミツドを
補充された微生物が利用し得る基質（だとえば、石油精
製後の残油、使用済み潤滑油、原油など）は価格が安い
からである。

ＮＲＲＬ　Ｂ　−５≠７２　を用いて原油中で培養され
た細胞塊が遠心分離によって採集され、１回水洗され、
それからｌ晩にわたり５５℃の空気を吹付けることによ
って乾燥された。　　「蛋白質の酸水解物からのトリプ
トファンの高率回収」と題するマツパラ等の論文（Ｂｉ
ｏｃ）Ｉｅｍ　、ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　、　Ｒｅｓ
　。

Ｃｏｍｍ−，３ｊ；、ＮＯ，２，／７タ〜ＩＩ／　、　
／９１１９）中に記載された技術に従い、乾燥後の細胞
塊が加水分解され、そしてアミノ酸含量が測定された。

　かかるアミノ酸分析の結果、原油中で培養された超菌
株の細胞塊のアミノ酸分布はトレオニン、バリン、シス
チン、メチオニン、インロイシン、ロイシン、フェニル
アラニンおよびトリブファン含量の点で牛肉に匹敵しか
つメチオニン含量の点で酵母より著しく優れていること
が判明した。

更に本発明に従えば、一層多くのプラスミツド由来の分
解経路が発見されるのに伴ない、現在寄託されている超
菌株の分解能力を次々と拡大する余地がある。　　これ
までのところ、プソイドモナス・アエルーギノーザＩｆ
ｎ株には生来の薬剤耐性因子ＲＰ−／以外に≠檀の公知
の炭化水素分解経路（ＯＣＴ、　ＣＡＭ％ＳＡＬおよび
ＮＦＬ）が全て補充されている。　１個の細胞中に受答
維持されるエネルギー生成プラスミツドの数に上限が存
在するにせよ、その上限にはまだ到達していないと言え
る。　プラスミツド（ＣＡＭ、　ＯＣＴおよび５ＡＬ）
を細胞の染色体中に組込ませる試みは、染色体の可動化
の失敗かられかる通り、成功しなかった。

かかる結果により、エネルギー生成プラスミツドおよび
薬剤耐性プラスミツドが染色体外に存在することはなお
一層確証された。　もちろん、炭化水素の分解経路を定
義するプラスミツドしか存在しないと期待する根拠はな
い。　従って、環境汚染物質たとえば殺虫剤、農薬、プ
ラスチックおよびその他の不活性化合物の分解用の酵素
系列を定義するプラスミツドも発見されることがあり得
ると考えられる。

一般に、エネルギー生成プラスミツドは誘導物質および
基質に対して緩やかな特異性を有する（すなわち、構造
的に類似した各種の化合物に対して酵素が形成されかつ
作用する）ことが知゛られている。　たとえばＣＡＭプ
ラスミツドは、グンサルス（Ｇｕｎｓａｌｕｓ　）等の
論文（ｌ５ｒａｅｌ　Ｊ　、Ｍｅｄ　。

Ｓ（！ｉ、＊／＋１０タタ〜／／／９　、　／９１，３
；　）およびハートライン（Ｈａｒｔｌｉｎｅ　）等の
論文（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ
ｙ。

１０７、、ｌＡｕ　４７ｇ、／９７／１　　中１ｅａ（
７）ｌ）、ｉ導物質および基質に対して非常圧緩やかな
特異性を有している。　同様にＯＣＴプラスミツドも、
ピーターソン（ＰｅＬｅｒｓｏｎ　）等の論文（Ｊ　、
　Ｂｉｏｌ　、　Ｃｈｅｍ、　。

、２１Ａ２　、　’Ａ３３≠、／９Ａ’；７１中に記載
の通り、誘導物質および基質に対して緩やかな特異性を
有している。

なお、本発明の実施に当り、接合完了体中のプラスミツ
ドは供与菌中と同程度に緩やかな特異性を示すことが証
明された。

このように本発明に従えば、以前には発見されていなか
った現象（すなわち、プラスミツドに由来するサリチル
酸エステルおよびナフタリン分解経路の存在）および（
または）以前には実現することのできなかった現象（す
なわち、７個の細胞中において互いに共存可能であった
複数種のプラスミツドの安定化）を巧みに取扱うことに
より、有用な単細胞像生物の新規な発育能力が得られた
のである。

／ ／１′ ２、″ ／／ ２／′ 、７／ 一′／ ／′ ／ 昭和４８年６月６日付で工業技術院微生物１．業技術研
究所に保管の申請をした微生物の保管委託申請書受理番
号は下記のとおりです。

１、微生物の名称 プソイドモナス・アニル〜ギノーザ 「ＮＲＲＬＢ−ｊダグ２Ｊ 申請書受理番号　第２０？を号 ユ　微生物の名称 グツイドモナス・グーチダ ［ＮＲＲＬ　　Ｂ−！；’Ｉり３」 申請書受理番号　第２７００号 上記保管申請をした微生物にわいての微生物受託番号は
次のとおりです。

ｌ　微生物の名称 プソイドモナス・アエルーギノーザ ｒＮＲＲＬＢ−！；弘７２］ 微生物受託番号　微工研菌寄第２０９９号ユ　微生物の
名称 グツイドモナス・グーチダ ［ＮＲＲＬＢ−！；弘り３」 微生物受託番号　微工研薗寄第コ１００号

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明に基づく分解的エネルギー生成プラスミ
ツドの種類の増加によって原油中におけるプソイドモナ
スＪｉＩ細面の発育速度が増大したことを示すグラフ、
ま九第２図は本発明に基づく分解的エネルギー生成プラ
スミツドの種類の増加によってバンカーＣ重油中におけ
るグツイドモナス属細菌の発育速度が増大したことを示
すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ｌ　それぞれ別個の炭化水素分解経路を提供する少なく
   とも２種の安定なエネルギー生成プラスミツドを含有し
   たプソイドモナス属の細菌。 ユ　水上に浮揚しうる担体物質及びこれによって担持さ
   れたプソイドモナス属の細菌よりなり、前記細菌の少な
   くとも一部が特許請求の範囲第１項記載の細菌であり前
   記担体物質が炭化水素物質を吸収しうる物質である、水
   上に浮揚する液体炭化水素基質物質分解用の接種媒体。 、ｉ％許請求の範囲第１項に記載の細菌を少なくとも７
   種含んだ微生物培養体を必須−無機塩の存在下発育に好
   都合な温度で炭化水素類の混合物よりなる主要基質と接
   触させ、各プラスミツドによる酵素反応系列が可能な細
   １培養体を使って、前記主要基質を単純な共通代謝産物
   に転化させることからなる、基質を炭化水素源に微生物
   分解する方法。