JPH1169991A - Production of taxane-type diterpene - Google Patents
Production of taxane-type diterpeneInfo
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Abstract
Description
【0001】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、卵巣癌、乳癌、肺
癌等の治療薬として有用であるタキソールを含むタキサ
ン型ジテルペンの製造法に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for producing a taxane-type diterpene containing taxol, which is useful as a therapeutic agent for ovarian cancer, breast cancer, lung cancer and the like.
【0002】[0002]
【従来の技術】卵巣癌、乳癌、肺癌等の治療薬として有
用であるタキソール(Taxol)は、イチイ科イチイ属植物
であるタイヘイヨウイチイ(Taxus brevifolia NUTT) よ
り単離同定されたタキサン型ジテルペンであり、活性と
関連する複雑なエステルグループを有している。タキソ
ールはタイヘイヨウイチイ植物体中のどの部位にも存在
し、その含量は樹皮で最も高いことが報告されている。
現在、タキソールは天然のまたは栽培された植物体中か
ら採取されているが、イチイ属植物は地上20 cmの高さ
に成長するのに10年以上かかる生育の遅い植物であり、
また樹皮を剥ぐと木が枯れてしまうことから容易に大量
のタキソールを得ることは困難である。もし、タキソー
ルおよびタキソールの前駆物質であるバッカチンIII 等
のタキサン型ジテルペンの合成が細胞培養を利用して行
うことができれば、樹木を伐採することなく、これらを
大量にかつ容易に得ることができるので有利である。2. Description of the Related Art Taxol, which is useful as a therapeutic agent for ovarian cancer, breast cancer, lung cancer, etc., is a taxane-type diterpene isolated and identified from Taxus brevifolia NUTT, a plant of the genus Taxus. And have complex ester groups associated with activity. It has been reported that taxol is present in all parts of the yew tree plant, and its content is highest in bark.
Currently, taxol is taken from natural or cultivated plants, but Taxus plants are slow-growing plants that take more than 10 years to grow to a height of 20 cm above the ground,
Moreover, it is difficult to easily obtain a large amount of taxol because the tree will die if the bark is peeled off. If taxol and a taxane-type diterpene such as baccatin III, which is a precursor of taxol, can be synthesized using cell culture, these can be obtained in large quantities and easily without cutting down trees. It is advantageous.
【0003】これまでの植物の培養細胞を利用したタキ
ソール生産方法については、タイヘイヨウイチイ(Taxu
s brevifolia NUTT)培養細胞によるタキソール生産が米
国で特許(US Patent 5,019,504)になっているが、その
タキソール生産量は1〜3 mg/lと記載されており、工業
的生産には不十分である。また、細胞培養によるタキソ
ールの生産性は不安定であり、選抜で一次的には生産性
の高い細胞が得られるが、継代培養してその含量を維持
することは難しい [E.R.M.Wickremesine et al.,World
Congress on Cell and Tissue Culture (1992)]。A method for producing taxol using cultured cells of a plant has been described in detail in the text
(s brevifolia NUTT) Taxol production by cultured cells is patented in the United States (US Patent 5,019,504), but the taxol production is described as 1-3 mg / l, which is insufficient for industrial production . In addition, the productivity of taxol by cell culture is unstable, and cells with high productivity can be obtained primarily by selection, but it is difficult to maintain the content by subculture (ERMWickremesine et al., World
Congress on Cell and Tissue Culture (1992)].
【0004】かかる状況の下、タキソールの生産性を向
上させるために数々の方法が試みられており、それらの
例として、タキソールの含有量が高い中国イチイTaxus
chinensis の培養細胞を用いる方法 (US Patent 5,407,
816) 、連続培養プロセスを用いる方法 (特開平7-25549
5, EP 683232)、情報伝達物質であるジャスモン酸メチ
ルを培地に添加する方法 (特開平8-33490, EP 683232)
などをあげることができる。しかし、上記いずれの方法
も実用化には結びついておらず、一層の生産性向上が望
まれている。[0004] Under such circumstances, various methods have been attempted to improve the productivity of taxol, such as the Chinese yew Taxus having a high taxol content.
chinensis using cultured cells (US Patent 5,407,
816), a method using a continuous culture process (JP-A-7-25549)
5, EP 683232), a method of adding methyl jasmonate which is a signal transmitting substance to a culture medium (JP-A-8-33490, EP 683232)
And so on. However, none of the above methods has led to practical use, and further improvement in productivity is desired.
【0005】一方、タキソール生産法の先行技術とし
て、タキソール生合成前駆体であるバッカチンIII また
は10-デアセチルバッカチンIII からの半合成法がHolto
nらの米国特許[US Patent 5,015,744]明細書に開示され
ており、すでに欧米ではこの半合成由来のタキソールが
認可され、臨床に使用されている。植物の細胞培養法を
用いれば、バッカチンIII 等の半合成原料の生産も可能
であり、前記半合成法によるタキソール生産にも利用で
きる。On the other hand, as a prior art of taxol production method, a semi-synthesis method from baccatin III or 10-deacetylbaccatin III, which is a precursor of taxol biosynthesis, is known as Holto.
The semi-synthetic taxol has already been approved and used clinically in the United States and Europe, as disclosed in US Pat. No. 5,015,744. If a plant cell culture method is used, semi-synthetic raw materials such as baccatin III can be produced, and can also be used for the production of taxol by the semi-synthetic method.
【0006】植物の培養細胞は、一般に個々の細胞を接
着している細胞壁が強固なため、液体培地中で振盪培養
しても単細胞にはならず、数十μmから数mmの細胞塊を
生成する。本発明で使用されるイチイ属植物など、木本
植物はリグニンなどの二次細胞壁の発達によって、特に
細胞の連結が強固である。近年の植物細胞培養における
二次代謝産物生産に関する研究によって、二次代謝産物
がこれらの細胞塊ごとに異なることが知られている[Y.
Yamada and Y. Fujita, Handbook of Plant Cell Cultu
re, vol. 1, eds. by D. A. Evans et al., Macmillan
Publishing Co., New York, pp. 717-728 (1983); Y. H
ara et al., Planta Med., 55, pp. 151-154 (1989)]。
しかし、細胞塊の粒径とタキサン型ジテルペンの生産性
の関係については全く報告がない。[0006] In general, plant cultured cells do not become single cells even if they are cultured in a liquid medium with shaking because they have strong cell walls to which individual cells adhere. I do. Woody plants such as Taxus plants used in the present invention have particularly strong cell connections due to the development of secondary cell walls such as lignin. Recent studies on secondary metabolite production in plant cell cultures have shown that secondary metabolites are different for each of these cell masses [Y.
Yamada and Y. Fujita, Handbook of Plant Cell Cultu
re, vol. 1, eds. by DA Evans et al., Macmillan
Publishing Co., New York, pp. 717-728 (1983); Y.H.
ara et al., Planta Med., 55, pp. 151-154 (1989)].
However, there is no report on the relationship between the particle size of the cell mass and the productivity of the taxane-type diterpene.
【0007】一方、米国特許第5,344,775 号には、イチ
イ植物の、1 〜10個の細胞からなる小細胞塊を取得する
方法として以下のプロセス: (i) オーキシンとしてα−ナフタレン酢酸およびサイト
カイニンとして6−ベンジルアミノプリンとを含む培地
を保持する支持体上で、細胞分裂組織を含むイチイ属植
物の切片からカルス塊を得る、 (ii)得られたカルス塊を上記オーキシンと上記サイトカ
イニンを含む液体培地で培養し、細胞の接着力が弱く、
1 〜10個の細胞からなる細胞塊で構成される懸濁培養物
を得る; (iii) 得られた懸濁培養物から細胞を分離し、上記オー
キシンと上記サイトカインを含む培地を保持する支持体
の表面にプレーティングする; (iv) (iii) で得られた細胞を上記支持体上で増殖さ
せ、シュードカルス、すなわち分化した維管束や器官ま
たは明らかに識別できる細胞分裂部位を含まない不定形
細胞からなり、細胞接着力が弱く、細胞塊が柔らかいた
めに、物理的な衝撃を加えた際、多数の単細胞および小
細胞塊を生じやすく、増殖培地上での細胞全体の倍加時
間が (i)で得られたカルスよりも大きく、またタキサン
の生産性が(i)で得られるカルスよりも大きく、またタ
キサンの生産性が(i) で得られるカルスよりも大きい細
胞集団を得る; が開示されている。On the other hand, US Pat. No. 5,344,775 discloses a method for obtaining a small cell mass consisting of 1 to 10 cells of a yew plant by the following processes: (i) α-naphthaleneacetic acid as auxin and 6 as cytokinin -On a support holding a medium containing benzylaminopurine, to obtain a callus mass from a Taxus plant section containing cell meristem tissue, (ii) the obtained callus mass is a liquid medium containing the auxin and the cytokinin And the cell adhesion is weak,
Obtaining a suspension culture composed of a cell mass consisting of 1 to 10 cells; (iii) separating the cells from the obtained suspension culture and holding a medium containing the auxin and the cytokine (Iv) growing the cells obtained in (iii) on the above-mentioned support and forming pseudocallus, ie, a differentiated vascular bundle or organ or an amorphous form that does not contain clearly discernable cell division sites. Since cells consist of cells, have low cell adhesion, and have a soft cell mass, they tend to produce large numbers of single cells and small cell masses when subjected to physical shock, and the doubling time of the whole cell on the growth medium is (i ), A cell population having a higher taxane productivity than the callus obtained in (i) and a higher taxane productivity than the callus obtained in (i). Have been.
【0008】しかしながら、1 〜10個の細胞からなる小
細胞塊(イチイ属植物の培養細胞は、通常直径が20〜30
μm であり、10個からなる細胞塊の直径は100 μm 未満
と推定される)で、増殖または二次代謝産物の生産能力
を持ったものを取得するのは極めて困難であり、当該特
許に開示されているように、培地や培養条件を巧妙に組
み合わせない限り、取得することは不可能である。すな
わち、本発明者らが使用している細胞を含む多くのイチ
イ属植物の培養細胞では、液体培養の攪拌条件を高めた
だけでは、1〜10個の健全細胞からなる小細胞塊が得ら
れず、孔径100 μm の篩を用いて分画できるのは、増殖
または二次代謝産物の生産能力を持たない老化した細胞
の残骸のみである。However, a small cell mass consisting of 1 to 10 cells (cultured cells of Taxus plants usually have a diameter of 20 to 30 cells)
μm, and the diameter of a cell mass consisting of 10 cells is estimated to be less than 100 μm), and it is extremely difficult to obtain a cell mass capable of growing or producing secondary metabolites. As described above, it is impossible to obtain it unless the culture medium and culture conditions are carefully combined. That is, in cultured cells of many Taxus genus plants including cells used by the present inventors, a small cell mass consisting of 1 to 10 healthy cells can be obtained only by increasing the stirring conditions of the liquid culture. Only the remnants of aged cells that do not have the ability to grow or produce secondary metabolites can be fractionated using a 100 μm pore size sieve.
【0009】したがって、前記米国特許に見られる小細
胞塊の分離は、小細胞塊を遊離しやすいカルスを作成す
ることにポイントがあり、小細胞塊を遊離させるための
振盪や攪拌条件を規定している本発明とは、基本的な考
え方や方法が異なる。換言すれば、前記米国特許に記載
されている1 〜10個の健全細胞からなる小細胞塊を遊離
させるための振盪や攪拌条件は、明細書から読み取る限
り従来の範囲にあり、本発明の記載の方法のように従来
の細胞培養に用いられる条件範囲を超えるものではな
い。[0009] Therefore, the separation of the small cell mass found in the above-mentioned US patent has a point in producing a callus that easily releases the small cell mass, and the shaking and stirring conditions for releasing the small cell mass are defined. The basic concept and method are different from the present invention. In other words, the shaking and stirring conditions for releasing the small cell mass composed of 1 to 10 healthy cells described in the above-mentioned U.S. Patent are within the conventional range as read from the specification, and are described in the present invention. The method does not exceed the range of conditions used in conventional cell culture as in the method (1).
【0010】[0010]
【発明の解決しようとする課題】本発明の目的は、植物
細胞培養によるタキサン型ジテルペンの生産性を向上さ
せることにある。An object of the present invention is to improve the productivity of taxane-type diterpenes by plant cell culture.
【0011】[0011]
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究の結果、タキサン型ジテルペンを
産生する植物の細胞を培養するにあたって、粒径の小さ
な細胞塊を培養細胞とすることにより、タキサン型ジテ
ルペンの生産性が向上することを見い出し、本発明を完
成するに至った。Means for Solving the Problems The present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and as a result, when culturing plant cells that produce taxane-type diterpenes, a cell mass having a small particle size was combined with the cultured cells. As a result, it has been found that the productivity of the taxane-type diterpene is improved, and the present invention has been completed.
【0012】すなわち、本発明は、タキサン型ジテルペ
ン産生植物の細胞を培養してタキサン型ジテルペンを生
産するにあたり、生産に適したサイズ範囲の細胞塊の割
合を増加させるための以下の工程: (a)タキサン型ジテルペンの生産を目的とした培養に供
するための前培養中、前培養から次の前培養への細胞移
植時のいずれかに、篩および/またはフィルターを用い
て細胞群から大細胞塊を除去する操作を少なくとも一回
設ける; (b)当該培養細胞を強攪拌条件下で培養する; のいずれか、または両者を含むことを特徴とする、タキ
サン型ジテルペンの製造方法である。That is, the present invention provides a method for producing a taxane-type diterpene by culturing the cells of a taxane-type diterpene-producing plant by increasing the proportion of cell mass in a size range suitable for production by the following steps: ) A large cell mass from a cell group using a sieve and / or a filter during preculture for subjecting to culture for the purpose of producing a taxane-type diterpene, either during cell transplantation from the preculture to the next preculture. (B) culturing the cultured cells under a vigorous stirring condition, or both of them; and a method for producing a taxane-type diterpene.
【0013】ここで、生産に適したサイズ範囲とは、長
径と短径の中間値で表される平均直径が通常0.12mm以上
1.6mm 以下、好ましくは0.12mm以上1.0mm 以下である。
また、細胞の総新鮮重量に対して、当該生産に適したサ
イズ範囲の細胞塊の割合を、65% 以上、特には80% 以上
に増加させることが好ましい。以下、本発明を詳細に説
明する。Here, the size range suitable for production means that the average diameter represented by an intermediate value between the major axis and the minor axis is usually 0.12 mm or more.
1.6 mm or less, preferably 0.12 mm or more and 1.0 mm or less.
In addition, it is preferable to increase the proportion of cell clumps in a size range suitable for the production to 65% or more, particularly 80% or more, based on the total fresh weight of the cells. Hereinafter, the present invention will be described in detail.
【0014】[0014]
【発明の実施の形態】本発明の製造方法に用いられるタ
キサン型ジテルペンを産生する植物としては、イチイ属
植物、例えば、セイヨウイチイ(Taxus baccata LINN)、
イチイ(T. cuspidata SIEB.et ZUCC) 、キャラボク(T.
cuspidata SIEB.et ZUCC var. nana REHDER) 、タイヘ
イヨウイチイ(T. brevifolia NUTT)、カナダイチイ(T.
canadensis MARSH)、中国イチイ(T. chinensis)、ヒマ
ラヤイチイ(T. wallichiana ZUCC) 、T.media 等が挙げ
られる。これらの中でもセイヨウイチイおよびT.media
が特に好ましい。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Plants producing taxane-type diterpenes used in the production method of the present invention include Taxus genus plants, for example, Taxus baccata LINN,
Yew (T. cuspidata SIEB.et ZUCC), Caraboku (T.
cuspidata SIEB.et ZUCC var.nana REHDER), Thai yew (T. brevifolia NUTT), Canada yew (T.
Cannadensis MARSH, Chinese yew (T. chinensis), Himalayan yew (T. wallichiana ZUCC), T.media and the like. Among them, Yoichi yew and T.media
Is particularly preferred.
【0015】先ずイチイ属に属する植物の植物体、例え
ば根、生長点、葉、茎、種子などから採取される植物片
を殺菌処理後、ゲランガムで固めたウッディー・プラン
ト・メディウム(以下、WP培地と略記する)の固体培地
上に置床し、10〜35℃で14〜60日程度経過させて組織片
の一部をカルス化させる。このようにして得られたカル
スを継代培養すると生育速度が漸次高まり安定化したカ
ルスが得られる。ここで、安定化したカルスとは、培養
中にカルスの一部がシュートや根に分化しないでカルス
の状態を保持する性質をもち細胞の生育速度が均質であ
るものをいう。この安定化したカルスを増殖に適した液
体培地、例えば液体WP培地に移して増殖させると更に生
育速度が高められる(この段階の前培養を特に増殖培養
という)。[0015] First, a woody plant medium (hereinafter referred to as WP medium) obtained by sterilizing a plant body of a plant belonging to the genus Taxus, for example, a plant piece collected from a root, a growing point, a leaf, a stem, a seed, or the like, is solidified with gellan gum. Abbreviated as a), and allowed to elapse at about 14 to 60 days at 10 to 35 ° C. to allow some of the tissue pieces to callus. When the callus thus obtained is subcultured, the growth rate gradually increases and a stabilized callus is obtained. Here, the term "stabilized callus" refers to a callus having a property that a portion of the callus does not differentiate into shoots or roots during culture and retains the state of the callus and has a uniform cell growth rate. When the stabilized callus is transferred to a liquid medium suitable for growth, for example, a liquid WP medium and grown, the growth rate is further increased (the preculture at this stage is particularly called growth culture).
【0016】本発明では、この安定化した細胞から、タ
キサン型ジテルペンの生産に適したサイズ範囲の細胞塊
を増加させるため、次の二つの工程のいずれかまたは両
者を行う。第一の工程としては、培養細胞を篩にかける
ことにより大細胞塊を除去する。本除去操作は、篩に代
えてフィルターを用いてもよく、篩とフィルターの両方
を組み合わせてもよい。篩の孔径は、大細胞塊が除ける
ものであれば制限がないが、目的物質の生産性向上の効
率の点から、1410μm 以下が好ましく、中でも 840μm
以下がさらに好ましい。In the present invention, one or both of the following two steps are carried out in order to increase the cell mass in a size range suitable for the production of a taxane-type diterpene from the stabilized cells. In the first step, the cultured cells are sieved to remove large cell clumps. In this removal operation, a filter may be used instead of the sieve, or both the sieve and the filter may be combined. The pore size of the sieve is not limited as long as the large cell mass can be removed.However, from the viewpoint of the efficiency of improving the productivity of the target substance, it is preferably 1410 μm or less, particularly 840 μm.
The following are more preferred.
【0017】イチイ属植物の培養細胞の細胞塊は球形で
はないので、短径が上記各孔径よりも短い細胞塊は、上
記の各篩を通過しえる。各篩を通過しえる細胞塊の長径
と短径の中間値で表される平均直径は、篩の孔径が1410
μm の場合は1.6 mm以下、篩の孔径が840μm の場合は
1.0 mm以下である。なお、孔径100 μm の篩を通過し得
る平均直径0.12mm以下の細胞塊は、増殖能力およびタキ
サン型ジテルペンの生産能力が著しく低下しているの
で、細胞集団から除去しても、除去しなくてもどどちら
でもよい。Since the cell mass of a cultured cell of a Taxus genus plant is not spherical, a cell mass having a shorter diameter than the above-mentioned pore sizes can pass through the above-mentioned sieves. The average diameter represented by the median of the major and minor diameters of the cell mass that can pass through each sieve is the pore size of the sieve is 1410.
1.6 mm or less for μm, and 840 μm for sieve pore size
1.0 mm or less. The cell mass having an average diameter of 0.12 mm or less that can pass through a sieve having a pore size of 100 μm has a markedly reduced growth ability and taxane-type diterpene production ability. Either one is fine.
【0018】培養細胞を篩にかける時期は、前培養中、
または前培養から次の前培養への細胞移植時であればよ
いが、作業効率ならびに経済性の点から前培養から次の
前培養への細胞移植時が好ましい。また、タキサン型ジ
テルペンの生産を目的とした培養から遡って過去2〜10
回の培養の間および/またはそれらの培養開始時の細胞
移植の際に、大細胞塊を除去する操作を少なくとも1回
行うのが好ましい。また、前培養から本培養への細胞移
植時にも篩にかける操作は実施可能であるが、本培養の
直前の前培養では細胞量が多く、篩にかける操作中の雑
菌汚染の危険性が大きい上に、廃棄される大粒径細胞塊
の量も多いため、無駄になる培養コストや廃棄物処理コ
ストが高くなる欠点がある。The sieving of the cultured cells is performed during the pre-culture.
Alternatively, it is sufficient to transfer the cells from the preculture to the next preculture, but it is preferable to transfer the cells from the preculture to the next preculture from the viewpoint of working efficiency and economy. In addition, from the culture for the purpose of producing taxane-type diterpene,
It is preferable to perform at least one operation of removing large cell masses during the culture and / or at the time of cell transplantation at the start of the culture. In addition, although the operation of sieving is also possible during the cell transplantation from the preculture to the main culture, the cell amount is large in the preculture immediately before the main culture, and there is a high risk of bacterial contamination during the sieving operation. In addition, the large amount of large-diameter cell mass to be discarded has a disadvantage in that wasteful culture costs and waste disposal costs are increased.
【0019】WO95/14103(EP683232)には、前培養から本
培養への細胞移植時に細胞を粒径によって分画する方法
が開示されているが、本操作は実験の精度を上げること
が目的であり、本発明に用いられている方法とは考え方
ならびに操作が全く異なる。すなわち、本発明により達
成される、篩にかけることによってタキサン型ジテルペ
ンの生産に適したサイズ範囲の細胞塊の割合を増加させ
るという効果は、それ以降の細胞移植時に同様の操作を
実施しなくとも通常2代以上10代程度までは持続するの
で、本操作を前培養から本培養への細胞移植時に実施す
る必要はない。[0019] WO95 / 14103 (EP683232) discloses a method of fractionating cells according to particle size at the time of cell transplantation from preculture to main culture, but this operation is intended to increase the precision of experiments. There is a completely different concept and operation from the method used in the present invention. That is, the effect achieved by the present invention, that is, the effect of increasing the proportion of cell clusters in a size range suitable for the production of taxane-type diterpene by sieving, can be achieved without performing the same operation during subsequent cell transplantation. This operation usually lasts from the second generation to about the tenth generation, so there is no need to perform this operation at the time of cell transplantation from preculture to main culture.
【0020】培養細胞を篩にかける操作を培養中に行う
場合は、細胞をいったん取り出して篩にかけるか、また
は培養装置中に付属品として篩や濾過槽を組み込んでお
いて、自動的に大細胞塊を除去できるようにしてもよ
い。さらに、細胞を新しい培地に移植する際、定期的に
上記篩分けを実施することによって、安定した小細胞塊
群を得ることもできる。ここで、前培養とは本培養に供
給する種細胞増殖を主目的とし、細胞量の増加に従って
段階的に培養規模を上げていくための培養をいい、タキ
サン型ジテルペンの生産の場合通常2〜10回行う。ま
た、本培養とは、最終的に目的物質であるタキサン型ジ
テルペンの生産を目的とした培養をいう。When the operation of sieving the cultured cells is performed during the culturing, the cells are once taken out and sieved, or a sieve or a filtration tank is installed as an accessory in the culturing apparatus, and the cells are automatically sized. The cell mass may be removed. Furthermore, when cells are transplanted to a new medium, a stable small cell mass group can be obtained by performing the above-mentioned sieving periodically. Here, the pre-culture is intended mainly for seed cell growth to be supplied to the main culture, and refers to a culture for increasing the culture scale in a stepwise manner according to an increase in the amount of cells. Do 10 times. In addition, the main culture refers to culture for the purpose of finally producing a taxane-type diterpene that is a target substance.
【0021】第二の工程としては、大細胞塊が砕いて小
細胞塊を生成するために、個々の細胞には損傷を与えな
い程度の強攪拌条件下で細胞を培養する。ここで、強攪
拌条件とは、平均直径0.12mm以上1.6mm 以下、好ましく
は0.12mm以上1.0mm 以下の細胞塊が、細胞の総新鮮重量
に対して65% 以上、好ましくは80% 以上となるように粉
砕できる攪拌条件をいう。このような攪拌条件は、攪拌
翼の回転速度増加や形状の変更、または培養槽内へのバ
ッフルの取り付けによって得られる。この攪拌条件下で
の培養は、タキサン型ジテルペン生産のための本培養ま
たは前培養のいずれにおいても実施できる。また、培養
期間中、攪拌強度はある特定の期間のみ強めても良い
し、また、全期間にわたって強めても良い。In the second step, the cells are cultured under a strong stirring condition that does not damage individual cells in order to break up the large cell mass to form a small cell mass. Here, the strong stirring conditions mean that the cell mass having an average diameter of 0.12 mm or more and 1.6 mm or less, preferably 0.12 mm or more and 1.0 mm or less is 65% or more, preferably 80% or more of the total fresh weight of the cells. Is a stirring condition that can be pulverized. Such stirring conditions can be obtained by increasing the rotation speed or changing the shape of the stirring blade, or by installing a baffle in the culture tank. The culture under the stirring conditions can be carried out in either main culture or preculture for producing a taxane-type diterpene. During the culture period, the stirring intensity may be increased only during a specific period, or may be increased over the entire period.
【0022】上記攪拌条件を攪拌翼の回転速度の増加に
より得るには、例えば、翼径が槽内径の1/2で翼高が
液深の1/4のパドル型攪拌翼を使用し、平均的な細胞
間接着強度を有する細胞の場合、30〜180rpm、好ましく
は40〜120rpmで行うことができる。上記攪拌条件を攪拌
翼の形状の変更により得るには、例えば、穴あきパドル
型、スクリュー型、あるいはタービン型により行うこと
ができる。上記攪拌条件を培養槽内へのバッフルの取り
付けにより得るには、培養槽内壁面からバッフル先端ま
での張り出し距離の延長および/またはバッフル設置数
の増加により行うことができる。かくして得られた上記
の細胞塊を、タキサン型ジテルペンの生産を目的とした
培養(本培養)に供する。In order to obtain the above stirring conditions by increasing the rotation speed of the stirring blade, for example, a paddle type stirring blade having a blade diameter of 1/2 of the inner diameter of the tank and a blade height of 1/4 of the liquid depth is used. In the case of cells having a specific intercellular adhesive strength, the reaction can be performed at 30 to 180 rpm, preferably 40 to 120 rpm. In order to obtain the above stirring conditions by changing the shape of the stirring blade, for example, a perforated paddle type, a screw type, or a turbine type can be used. In order to obtain the above stirring conditions by installing a baffle in the culture tank, it is possible to extend the overhang distance from the inner wall of the culture tank to the baffle tip and / or increase the number of baffles installed. The cell mass thus obtained is subjected to culture (main culture) for the purpose of producing a taxane-type diterpene.
【0023】本発明の製造方法の対象となるタキサン型
ジテルペンとしては、タキサン骨格を有するジテルペン
であれば特に制限はなく、具体的には、タキソール、10
-デアセチルタキソール、7-エピタキソール、バッカチ
ンIII 、10-デアセチルバッカチンIII 、7-エピバッカ
チンIII 、セファロマニン、10-デアセチルセファロマ
ニン、7-エピセファロマニン、バッカチンVI、タキサン
1a、キシロシルセファロマニン、キシロシルタキソー
ル、タキソールC、10-デアセチルタキソールC、タキシ
シンI、タキシシンII、タキシンI、タキシンII、タキ
サギフィン等を例示できる。The taxane-type diterpene to be used in the production method of the present invention is not particularly limited as long as it is a diterpene having a taxane skeleton.
-Deacetyltaxol, 7-epitaxol, baccatin III, 10-deacetylbaccatin III, 7-epibaccatin III, cephalomannine, 10-deacetylcephalomanine, 7-episephalomanin, baccatin VI, taxane
1a, xylosylcephalomanine, xylosyltaxol, taxol C, 10-deacetyltaxol C, taxin I, taxin II, taxin I, taxin II, taxa gifin and the like.
【0024】本発明の細胞培養に使用される培地として
は、従来から知られている植物の細胞培養に用いられる
培地、例えばムラシゲ・スクーグ(1962年)〔Murashige
& Skoog〕の培地、リンスマイヤー・スクーグ(1965年)
〔Linsmaier Skoog〕の培地、ウッディー・プラント・
メディウム(1981年) 〔Woody Plant Medium〕、ガンボ
ルグ〔Gamborg〕のB-5培地、藤田らのM-9培地等が挙げ
られる。これら培地に植物ホルモンを添加し、更に必要
に応じて炭素源、無機成分、ビタミン類、アミノ酸等を
添加することもできる。As the medium used for the cell culture of the present invention, conventionally known mediums used for cell culture of plants, for example, Murashige Skoog (1962) [Murashige
&Skoog's medium, Rinsmeier Skoog (1965)
[Linsmaier Skoog] Medium, Woody Plant
Medium (1981) [Woody Plant Medium], B-5 medium of Gamborg, M-9 medium of Fujita et al. Plant hormones can be added to these media, and if necessary, carbon sources, inorganic components, vitamins, amino acids and the like can be added.
【0025】炭素源としては、シュクロース、マルトー
ス、ラクトース等の二糖類、グルコース、フルクトー
ス、ガラクトース等の単糖類、デンプンあるいはこれら
糖源の2種類以上を適当な比率で混合したものを使用で
きる。As the carbon source, disaccharides such as sucrose, maltose, and lactose, monosaccharides such as glucose, fructose, and galactose, starch, and a mixture of two or more of these sugar sources at an appropriate ratio can be used.
【0026】無機成分としては、例えばリン、窒素、カ
リウム、カルシウム、マグネシウム、イオウ、鉄、マン
ガン、亜鉛、ホウ素、銅、モリブデン、塩素、ナトリウ
ム、ヨウ素、コバルト等が挙げられ、これらの成分は例
えば硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、硝酸カルシウム、
塩化カリウム、リン酸一水素カリウム、リン酸二水素カ
リウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナト
リウム、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄、硫酸マンガン、硫酸
亜鉛、ホウ酸、硫酸銅、モリブデン酸ナトリウム、三酸
化モリブデン、ヨウ化カリウム、塩化コバルト等の化合
物として添加できる。Examples of the inorganic component include phosphorus, nitrogen, potassium, calcium, magnesium, sulfur, iron, manganese, zinc, boron, copper, molybdenum, chlorine, sodium, iodine, cobalt and the like. Potassium nitrate, sodium nitrate, calcium nitrate,
Potassium chloride, potassium monohydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, calcium chloride, magnesium sulfate, sodium sulfate, ferrous sulfate, ferric sulfate, manganese sulfate, zinc sulfate, boric acid, copper sulfate, sodium molybdate, It can be added as a compound such as molybdenum trioxide, potassium iodide, and cobalt chloride.
【0027】植物ホルモンとしては、例えばインドール
酢酸(IAA)、ナフタレン酢酸(NAA)、2,4-ジクロロフェノ
キシ酢酸(2,4-D)等のオーキシン類、カイネチン、ゼア
チン、ジヒドロゼアチン等のサイトカイニン類が用いら
れる。ビタミン類としては、例えばビオチン、チアミン
(ビタミンB1)、ピリドキシン(ビタミンB6)、パント
テン酸、イノシトール、ニコチン酸等が用いられる。ア
ミノ酸類としては、例えばグリシン、フェニルアラニ
ン、ロイシン、グルタミン、システイン等を添加でき
る。一般に前記の各成分は、無機成分が約0.1 M〜100 m
M、炭素源が約1〜約30 g/l、植物ホルモン類が約0.01〜
約10 M、ビタミン類およびアミノ酸類がそれぞれ約0.1
〜約100 mg/lの濃度で用いられる。Examples of plant hormones include auxins such as indoleacetic acid (IAA), naphthaleneacetic acid (NAA) and 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), and cytokinins such as kinetin, zeatin and dihydrozeatin. Are used. As the vitamins, for example, biotin, thiamine (vitamin B 1 ), pyridoxine (vitamin B 6 ), pantothenic acid, inositol, nicotinic acid and the like are used. As amino acids, for example, glycine, phenylalanine, leucine, glutamine, cysteine and the like can be added. Generally, each of the above components has an inorganic component of about 0.1 M to 100 m.
M, carbon source about 1 to about 30 g / l, plant hormones about 0.01 to
About 10 M, about 0.1 each for vitamins and amino acids
Used at a concentration of ~ 100 mg / l.
【0028】本発明の細胞培養においては、前記植物の
根、生長点、葉、茎、種子、花粉、葯、がく等の組織片
または細胞、あるいはこれらを上記培地あるいは他の従
来の培地によって細胞培養して得られる培養細胞を使用
することができる。以上のようにして得られた培養組織
または培養細胞および/または培地から、メタノール等
の有機溶媒による抽出によってタキサン型ジテルペンを
分離することができる。また、培地中に適当な吸着剤や
有機溶媒を共存させ、連続的にタキサン型ジテルペンを
回収することもできる。In the cell culture of the present invention, tissue fragments or cells such as roots, growing points, leaves, stems, seeds, pollen, anthers, sepals or the like of the above-mentioned plants, or these are cultured in the above-mentioned medium or other conventional medium. Cultured cells obtained by culturing can be used. The taxane-type diterpene can be separated from the cultured tissue or cultured cells and / or culture medium obtained as described above by extraction with an organic solvent such as methanol. In addition, a taxane-type diterpene can be continuously collected by allowing an appropriate adsorbent or an organic solvent to coexist in the medium.
【0029】また、タキサン型ジテルペンの生産を目的
とした培養では、生産促進剤としてジャスモン酸メチル
などのジャスモン酸誘導体(特開平8−33490号)
の他、特開平8−56680号明細書に記載されている
重金属を含む化合物および/または重金属イオン、特開
平8−56681号明細書に記載されているアミン類、
サイクロデキストリンなどの環状多糖類(特開平8−1
40690号)を添加することにより、タキサン型ジテ
ルペンの生産性をさらに高めることができる。In a culture for producing a taxane-type diterpene, a jasmonic acid derivative such as methyl jasmonate is used as a production promoter (Japanese Patent Application Laid-Open No. 8-33490).
And compounds containing heavy metals and / or heavy metal ions described in JP-A-8-56680, amines described in JP-A-8-56681,
Cyclic polysaccharides such as cyclodextrin (JP-A-8-1
No. 40690), the productivity of the taxane-type diterpene can be further increased.
【0030】本発明の細胞培養における培養温度として
は、通常は約10〜約35℃、特に23〜28℃が増殖速度が大
きいので好適である。また、培養期間としては、7〜42
日間が好適である。本発明の培養方法において液体培地
を用いた場合には、培養終了後に培養細胞をデカンテー
ションまたは濾過等の方法によって培地から分離し、培
養細胞および/または培地から目的とするタキサン型ジ
テルペンを有機溶媒による抽出等の方法によって分離す
ることができる。さらに、本発明の効果を高める方法と
して、特開平7−135967号、特開平8−3349
0号明細書に開示されている、細胞を比重の違いにより
複数の層に分け、少なくとも一つの層に含まれる細胞を
培養する方法との併用が挙げられる。As the culturing temperature in the cell culture of the present invention, usually about 10 to about 35 ° C., and particularly preferably 23 to 28 ° C., is preferable because the growth rate is high. In addition, the culture period, 7-42
Days are preferred. When a liquid medium is used in the culture method of the present invention, the cultured cells are separated from the medium by a method such as decantation or filtration after completion of the culture, and the desired taxane-type diterpene is separated from the cultured cells and / or the medium by an organic solvent. Can be separated by extraction or other methods. Further, as a method for enhancing the effects of the present invention, JP-A-7-135567 and JP-A-8-3349
The method disclosed in the specification of Japanese Patent Publication No. 0-90 may be used in combination with a method of dividing cells into a plurality of layers depending on a difference in specific gravity and culturing cells contained in at least one layer.
【0031】また、本発明は、特開平8−9983号明
細書に記載されている、培養器内の気相中の酸素濃度を
培養初期より大気中の酸素濃度未満の条件下に制御して
培養を行うか、或いは組織および/または細胞と接する
流動性の培地中の溶存酸素濃度を培養初期よりその温度
に於ける飽和溶存酸素濃度未満である条件下に制御して
培養する方法と併用することによって生産性向上を図る
こともできる。The present invention also relates to a method for controlling the oxygen concentration in the gas phase in an incubator from the initial stage of cultivation to a level lower than the oxygen concentration in the atmosphere as described in JP-A-8-9983. This method is used in combination with a method of culturing or controlling the dissolved oxygen concentration in a fluid medium in contact with tissues and / or cells under conditions that are lower than the saturated dissolved oxygen concentration at that temperature from the beginning of the culture. This can improve productivity.
【0032】[0032]
【実施例】以下、実施例および比較例により本発明を更
に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例
に限定されるものではない。 〔実施例1〕 (前培養時の攪拌速度の篩による細胞塊
分別への影響) (1) 前培養 2%アンチホルミン溶液または70%エタノール溶液等で
滅菌処理したTaxus media の種子から無菌的に胚を取り
出した。その一部を、ナフタレン酢酸を10-5 Mの濃度に
なるように添加し、オートクレーブ殺菌した固体WP培地
(ゲランガム0.25重量%)に置床し、25℃で暗所にて静
置培養してカルスを得た。次にこのカルス4 g(新鮮
重)を、ナフタレン酢酸を上記と同濃度で添加し、オー
トクレーブ殺菌した液体WP培地(以下標準培地という)
100ml入りの300 ml三角フラスコに移し、ロータリーシ
ェーカー上で旋回培養(振幅25 mm、100 rpm)し、14日
毎に5回植え継ぎ、該カルスの生育速度を速めた。こう
して得られた細胞を以下標準細胞という。得られた標準
細胞を上記と同じ条件でフラスコに移植し、振盪速度を
170 rpmに設定した同型のロータリーシェーカー上で14
日間培養した。EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to Examples and Comparative Examples, but the scope of the present invention is not limited to these Examples. [Example 1] (Effect of agitation speed during pre-culture on cell mass fractionation by sieve) (1) Pre-culture Aseptically from seeds of Taxus media sterilized with 2% antiformin solution or 70% ethanol solution, etc. Embryos were removed. A part of the solution was added to a concentration of 10 -5 M with naphthalene acetic acid, placed on an autoclave-sterilized solid WP medium (0.25% by weight of gellan gum), and cultured at 25 ° C. in a dark place for callus. I got Next, 4 g of this callus (fresh weight) was added to naphthalene acetic acid at the same concentration as above, and autoclaved in a liquid WP medium (hereinafter referred to as a standard medium).
The callus was transferred to a 300 ml Erlenmeyer flask containing 100 ml, and subjected to vortex culture (amplitude: 25 mm, 100 rpm) on a rotary shaker, and subcultured five times every 14 days to increase the growth rate of the callus. The cells thus obtained are hereinafter referred to as standard cells. The obtained standard cells are transferred to a flask under the same conditions as above, and the shaking speed is increased.
14 on the same rotary shaker set at 170 rpm
Cultured for days.
【0033】(2) 篩分け 得られた細胞を孔径が1410μm 、840μm 、500μm のス
テンレス製篩を用いて、細胞塊サイズによって順次分画
し、各画分の細胞新鮮重量比を測定した。一方、比較と
して、得られた標準細胞について振盪速度170 rpmでの
培養を行わず、そのまま同様にして篩分けして細胞塊サ
イズによって順次分画し、各画分の細胞新鮮重量比を測
定した。これらの結果を併せて表1に示す。振盪速度170
rpmで前培養を行った方は、篩分け操作によって平均直
径の小さい細胞塊の細胞の総新鮮重量に対して占める割
合が増加していくように分画できた。(2) Screening The obtained cells were sequentially fractionated according to the cell mass size using stainless steel sieves having pore diameters of 1410 μm, 840 μm and 500 μm, and the cell fresh weight ratio of each fraction was measured. On the other hand, as a comparison, the obtained standard cells were not cultured at a shaking speed of 170 rpm, but were sieved in the same manner and fractionated sequentially according to the cell mass size, and the cell fresh weight ratio of each fraction was measured. . Table 1 also shows these results. Shaking speed 170
In the case of pre-culture at rpm, fractionation could be performed by sieving so that the ratio of the cell mass having a small average diameter to the total fresh weight of cells increased.
【0034】[0034]
【表1】 [Table 1]
【0035】〔実施例2〕 (各粒径画分由来の細胞の
タキソール生産性) 実施例1で得られた4画分の細胞をそれぞれ2g(新鮮
重)ずつ、タキサン型ジテルペンの生産促進剤であるジ
ャスモン酸メチル100μM を含む標準培地20 ml(100 ml
三角フラスコ入り)に移して、25℃、暗所、振盪速度を
100 rpmに設定した前記と同型のロータリーシェーカー
上で14日間振盪培養した(本培養)。培養終了後、細胞
を濾過により採取し凍結乾燥した。乾燥重量を測定し、
液体培地1L当たりの培養細胞の生育重量を求めた。得
られた乾燥カルスからメタノール等を用いてタキサン型
ジテルペンを抽出し、高速液体クロマトグラフィーを用
いて標準品と比較定量することによってタキソール収量
を測定した。また、培養ろ液からジクロロメタンを用い
てタキサン型ジテルペンを抽出し、以下上記と同様に定
量した。その結果を表2に示す。Example 2 Taxol Productivity of Cells Derived from Each Particle Size Fraction 2 g (fresh weight) of each of the four fraction cells obtained in Example 1 was used as a taxane-type diterpene production promoter. 20 ml of standard medium containing 100 μM methyl jasmonate (100 ml
Transfer to an Erlenmeyer flask)
Shaking culture was performed for 14 days on the same type of rotary shaker set at 100 rpm (main culture). After completion of the culture, the cells were collected by filtration and freeze-dried. Measure the dry weight,
The growth weight of the cultured cells per 1 L of the liquid medium was determined. Taxane type diterpene was extracted from the obtained dried callus using methanol or the like, and the taxol yield was measured by quantitatively comparing with a standard product using high performance liquid chromatography. In addition, a taxane-type diterpene was extracted from the culture filtrate using dichloromethane, and quantified in the same manner as described above. The results are shown in Table 2.
【0036】[0036]
【表2】 表2によれば、孔径が小さいステンレス製篩を用いて分
画した細胞ほど、タキソール収量が多くなることがわか
る。[Table 2] According to Table 2, it can be seen that the taxol yield increases as the cells are fractionated using a stainless steel sieve having a smaller pore size.
【0037】〔実施例3〕(タキソール生産に対する前
培養時の振盪速度の影響) (1) 前培養 実施例1に記載の標準細胞4 g(新鮮重)を標準培地100
ml(300 ml三角フラスコ入り)に移植し、25℃、暗所、
振盪速度を170 rpmに設定した前記と同型のロータリー
シェーカー上で14日間振盪培養した。 (2) 本培養 得られた細胞を濾過によって液体培地から分離し、その
うちの2g(新鮮重)をジャスモン酸メチル100μM を含
む標準培地20 ml(100 ml三角フラスコ入り)に移して、
25℃、暗所、振盪速度を100 rpmに設定した前記と同型
のロータリーシェーカー上で14日間振盪培養した。得ら
れた細胞と培地を実施例2に記載の方法で処理し、乾燥
細胞収量およびタキソール収量を測定した。また、前培
養におけるロータリーシェーカーの振盪速度が100 rp
m、80 rpmとする以外は、上記と同様に操作し、乾燥細
胞収量およびタキソール収量を測定した。さらに、前培
養で使用するフラスコが攪拌強度を増加させるため底部
にバッフルの役目をする襞を設けたフラスコ(図1)で
あること以外は、上記と同様に操作し、乾燥細胞収量お
よびタキソール収量を測定した。以上の測定結果を併せ
て表3に示す。Example 3 (Effect of Shaking Speed During Preculture on Taxol Production) (1) Preculture 4 g of the standard cells described in Example 1 (fresh weight) was added to standard medium 100
ml (with 300 ml Erlenmeyer flask), 25 ℃, dark place,
Shaking culture was performed for 14 days on a rotary shaker of the same type as described above, with the shaking speed set to 170 rpm. (2) Main culture The obtained cells were separated from the liquid medium by filtration, and 2 g (fresh weight) of the cells were transferred to 20 ml of a standard medium containing 100 μM of methyl jasmonate (in a 100 ml Erlenmeyer flask).
Shaking culture was performed for 14 days on a rotary shaker of the same type as described above, which was set at 25 ° C., in a dark place, and at a shaking speed of 100 rpm. The obtained cells and medium were treated by the method described in Example 2, and the yield of dried cells and the yield of taxol were measured. In addition, the shaking speed of the rotary shaker in the preculture was 100 rp.
Except for changing the m and 80 rpm, the same operation as above was performed, and the yield of dried cells and the yield of taxol were measured. Furthermore, the same procedure as above was performed except that the flask used in the preculture was a flask provided with a fold that served as a baffle at the bottom to increase the stirring intensity (FIG. 1), and the yield of dried cells and the yield of taxol were obtained. Was measured. Table 3 shows the above measurement results.
【0038】[0038]
【表3】 表3によれば、振盪速度を上げて前培養した細胞ほど、
タキソール収量が多くなることがわかる。[Table 3] According to Table 3, the cells pre-cultured at a higher shaking rate,
It can be seen that the taxol yield increases.
【0039】〔実施例4〕(タキソール生産に対する本
培養時の攪拌速度の影響、および攪拌速度の細胞塊粒径
への影響) 撹拌速度を40 rpm、60rpmおよび80rpmに設定した変型パ
ドル型撹拌翼付きジャーファーメンターに、ジャスモン
酸メチル100μM を含む標準培地1リットルおよび標準細
胞100g(新鮮重)を移植し、1%の炭酸ガスを含む空気を
0.1 vvmの速度で通気しながら、25℃、暗所で14日間培
養した。得られた細胞の一部と培地を実施例2に記載の
方法で処理し、乾燥細胞収量およびタキソール収量を測
定した。残りの細胞は、孔径840μm の篩を用いて、こ
れを通過する小粒径細胞の割合を調べた。結果を表4に
示す。Example 4 (Effect of stirring speed during main culture on taxol production, and the effect of stirring speed on cell mass particle size) Modified paddle-type stirring blade in which stirring speed was set to 40 rpm, 60 rpm and 80 rpm. Transfer 1 liter of standard medium containing 100 μM methyl jasmonate and 100 g of standard cells (fresh weight) to a jar fermenter with
The cells were cultured for 14 days in the dark at 25 ° C. with aeration at a rate of 0.1 vvm. A part of the obtained cells and the medium were treated by the method described in Example 2, and the yield of dried cells and the yield of taxol were measured. The remaining cells were screened using a sieve with a pore size of 840 μm to determine the percentage of small size cells passing through the sieve. Table 4 shows the results.
【0040】[0040]
【表4】 表4によれば、攪拌速度を上げて本培養した細胞ほど、
タキソール収量が多くなることがわかる。また、攪拌速
度を上げて本培養した細胞は、小粒径細胞の細胞の総新
鮮重量に占める割合が増加する。[Table 4] According to Table 4, the more the cells were cultured at a higher stirring speed,
It can be seen that the taxol yield increases. In addition, the ratio of the small-diameter cells to the total fresh weight of the cells increases in the cells cultured at the higher stirring speed.
【0041】〔実施例5〕(タキソール生産に対する篩
による細胞塊分別の影響) 実施例1に記載の標準細胞から、孔径1410μm または84
0 μm のステンレス製篩を通過する細胞塊群を分離した
後、濾過によって液体培地から分離し、そのうちの4g
(新鮮重)を標準培地100 ml(300 ml三角フラスコ入
り)に移して、25℃、暗所、振盪速度を100 rpmに設定
した前記と同型のロータリーシェーカー上で14日間振盪
培養した。得られた細胞全量をそのまま濾過によって液
体培地から分離し、そのうちの2 gを100μM のジャスモ
ン酸メチルを含む標準培地20 ml(100 ml三角フラスコ
入り)に移して、25℃、暗所、振盪速度を100 rpmに設
定した前記と同型のロータリーシェーカー上で14日間振
盪培養した。得られた細胞と培地を実施例2に記載の方
法で処理し、乾燥細胞収量およびタキソール収量を測定
した。結果を表5に示す。また、篩を用いた大細胞塊の
除去を行わないこと以外は上記と同様に処理して乾燥細
胞収量およびタキソール収量を測定した。結果を併せて
表5に示す。[Example 5] (Effect of cell mass fractionation by sieve on taxol production) From the standard cells described in Example 1, the pore diameter was 1410 µm or 84.
After separating the cell mass passing through a 0 μm stainless steel sieve, the cell mass was separated from the liquid medium by filtration, and 4 g of
(Fresh weight) was transferred to a standard medium (100 ml, 300 ml Erlenmeyer flask), and cultured with shaking on a rotary shaker of the same type as described above at 25 ° C., in a dark place and at a shaking speed of 100 rpm. The total amount of the cells obtained was separated from the liquid medium by filtration as it was, and 2 g of the cells were transferred to 20 ml of a standard medium containing 100 μM methyl jasmonate (in a 100 ml Erlenmeyer flask) at 25 ° C., in a dark place, with shaking speed. Was shake-cultured for 14 days on a rotary shaker of the same type as set above at 100 rpm. The obtained cells and medium were treated by the method described in Example 2, and the yield of dried cells and the yield of taxol were measured. Table 5 shows the results. Further, the same treatment as described above was conducted except that the large cell mass was not removed using a sieve, and the yield of dried cells and the yield of taxol were measured. Table 5 also shows the results.
【0042】[0042]
【表5】 表5によれば、前培養の細胞移植時に孔径が小さいステ
ンレス製篩を用いて分画した細胞ほど、タキソール収量
が多くなることがわかる。[Table 5] According to Table 5, it can be seen that the taxol yield increases as the cells are fractionated using a stainless steel sieve having a smaller pore size during cell transplantation in preculture.
【0043】〔実施例6〕〔孔径500 μm 以下の篩分け
による細胞の粒径分布、および得られた画分のタキソー
ル生産性〕 実施例1に記載の標準細胞について篩分けを行う際に、
孔径が500 μm 、250μm 、100 μm のステンレス製篩
を用いて分画する以外は同様に操作し、各画分の細胞新
鮮重量比を測定した。結果を表6に示す。[Example 6] [Particle size distribution of cells by sieving with a pore size of 500 µm or less, and taxol productivity of the obtained fraction] When sieving the standard cells described in Example 1,
The same operation was performed except that fractionation was performed using stainless steel sieves having pore sizes of 500 μm, 250 μm, and 100 μm, and the fresh cell weight ratio of each fraction was measured. Table 6 shows the results.
【0044】[0044]
【表6】 [Table 6]
【0045】孔径が100 μm の篩を通過した細胞を顕微
鏡で観察したところ、振盪速度に関わらず10個以下の細
胞からなる細胞塊も僅かに認められたが、すべて褐変し
た老化細胞の集団、またはその残骸であった。また、実
施例2に従って、これらの細胞を再度培養したが、新た
な細胞増殖ならびにタキサン型ジテルペンの生産は全く
認められなかった。よって、実施例2にてタキソール生
産性の向上を確認した孔径500 μm の篩を用いて分別し
た画分であっても、孔径100 μm の篩を通過する画分は
本発明のタキサン型ジテルペンの生産には適しないこと
が認められた。Microscopic observation of the cells passing through a sieve having a pore size of 100 μm revealed a small amount of cell clusters consisting of 10 or less cells regardless of the shaking speed. Or the remnants of it. These cells were cultured again according to Example 2, but no new cell growth and no production of taxane-type diterpenes were observed. Therefore, even if the fraction separated using a sieve having a pore diameter of 500 μm, which was confirmed to improve the productivity of taxol in Example 2, the fraction passing through the sieve having a pore diameter of 100 μm is the same as the fraction of the taxane-type diterpene of the present invention. Not suitable for production.
【0046】[0046]
【発明の効果】本発明によれば、タキサン型ジテルペン
産生植物の細胞培養によって、大量のタキサン型ジテル
ペンを簡便に得ることが可能になる。According to the present invention, a large amount of taxane type diterpene can be easily obtained by cell culture of a taxane type diterpene producing plant.
【図1】底部にバッフルの役目をする襞を設けたフラス
コの図を示す。FIG. 1 shows a view of a flask with a fold that serves as a baffle at the bottom.
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 FI C12R 1:91) Continued on the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code FI C12R 1:91)
Claims (9)
培養してタキサン型ジテルペンを生産するにあたり、生
産に適したサイズ範囲の細胞塊の割合を増加させるため
の以下の工程: (a)タキサン型ジテルペンの生産を目的とした培養に供
するための前培養中、前培養から次の前培養への細胞移
植時のいずれかに、篩および/またはフィルターを用い
て細胞群から大細胞塊を除去する操作を少なくとも一回
設ける; (b)当該培養細胞を強攪拌条件下で培養する; のいずれか、または両者を含むことを特徴とする、タキ
サン型ジテルペンの製造方法。1. In producing a taxane-type diterpene by culturing cells of a taxane-type diterpene-producing plant, the following steps for increasing the proportion of cell mass in a size range suitable for production: (a) taxane-type diterpene Operation of removing large cell clumps from a cell group using a sieve and / or a filter during preculture for use in culture for the purpose of production of cells, either at the time of cell transplantation from the preculture to the next preculture. At least once; (b) culturing the cultured cells under vigorous stirring conditions; or a method of producing a taxane-type diterpene.
の中間値で表される平均直径が0.12mm以上1.6mm 以下の
細胞塊である請求項1記載の方法。2. The method according to claim 1, wherein the cell mass suitable for the production is a cell mass having an average diameter represented by an intermediate value between a major axis and a minor axis of 0.12 mm or more and 1.6 mm or less.
の中間値で表される平均直径が0.12mm以上1.0mm 以下の
細胞塊である請求項1記載の方法。3. The method according to claim 1, wherein the cell mass suitable for the production is a cell mass having an average diameter represented by an intermediate value of a major axis and a minor axis of 0.12 mm or more and 1.0 mm or less.
適したサイズ範囲の細胞塊の割合を、65% 以上に増加さ
せる請求項1〜3記載の方法。4. The method according to claim 1, wherein the ratio of the cell mass in a size range suitable for the production to the total fresh weight of the cells is increased to 65% or more.
適したサイズ範囲の細胞塊の割合を、80% 以上に増加さ
せる請求項1〜3記載の方法。5. The method according to claim 1, wherein the ratio of the cell mass in a size range suitable for the production to the total fresh weight of the cells is increased to 80% or more.
の生産を目的とした培養から遡って過去2〜10回の培
養の間および/またはそれらの培養開始時の細胞移植の
際に、少なくとも1回設けることを特徴とする請求項1
記載の方法。6. The method according to claim 6, wherein the operation of the step (a) is performed at least during the past 2 to 10 cultures and / or at the time of cell transplantation at the start of the culture, starting from the culture for producing the taxane-type diterpene. 2. The device according to claim 1, wherein the device is provided once.
The described method.
10-デアセチルタキソール、7-エピタキソール、バッカ
チンIII 、10-デアセチルバッカチンIII 、7-エピバッ
カチンIII 、セファロマニン、10-デアセチルセファロ
マニン、7-エピセファロマニン、バッカチンVI、タキサ
ン1a、キシロシルセファロマニン、キシロシルタキソー
ル、タキソールC、10-デアセチルタキソールC、タキシ
シンI、タキシシンII、タキシンI、タキシンII、タキ
サギフィンから選ばれる少なくとも1種以上である請求
項1〜6に記載の方法。7. A taxane-type diterpene comprising: taxol,
10-deacetyltaxol, 7-epitaxol, baccatin III, 10-deacetylbaccatin III, 7-epibaccatin III, cephalomanine, 10-deacetylcephalomanine, 7-episephalomanin, baccatin VI, taxane 1a, xylosyl The method according to any one of claims 1 to 6, wherein the method is at least one selected from cephalomannine, xylosyltaxol, taxol C, 10-deacetyltaxol C, taxisin I, taxisin II, taxin I, taxin II, and taxaxifin.
イチイ属植物である請求項1〜7に記載の方法。8. The method according to claim 1, wherein the plant producing the taxane-type diterpene is a Taxus genus plant.
イヨウイチイ(Taxus baccata )である請求項8に記載
の方法。9. The method according to claim 8, wherein the Taxus plant is Taxus media or Taxus baccata.
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