JPH1169971A - Isolation, recovery, concentration and preparation of sample, of virus - Google Patents

Isolation, recovery, concentration and preparation of sample, of virus

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JPH1169971A
JPH1169971A JP27029897A JP27029897A JPH1169971A JP H1169971 A JPH1169971 A JP H1169971A JP 27029897 A JP27029897 A JP 27029897A JP 27029897 A JP27029897 A JP 27029897A JP H1169971 A JPH1169971 A JP H1169971A
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JP
Japan
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virus
sample
recovery
concentration
substance
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Hiroaki Okamoto
宏明 岡本
Kouei Satou
功栄 佐藤
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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for isolation, recovery, concentration, and preparation of a sample, of a virus, by which a highly sensitive virus assay capable of being carried out even in an ordinary facility is provided to the study and diagnosis of the virus. SOLUTION: This method for isolation, recovery, concentration and preparation of a sample, of a virus comprises a step for allowing a lipoprotein- combining and precipitating material to act on a sample including a virus, and a step for solubilizing the precipitated material. A divalent metal ion is preferable as the lipoprotein-combining and precipitating material, and the addition of a polyvalent anionic material as a precipitation accelerator is preferable. As the result, a virus sample is prepared in a research organization or a medical facility without requiring a special equipment, and the method contributes to the study of the virus, and the diagnosis, treatment and prevention of a virus disease through an antigen examination and a gene examination.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【0001】[0001]

【発明が属する技術分野】本発明は、資料中に存在する
ウイルスを分離・濃縮し、回収し、試料を調製する方法
に関する。
BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a method for separating and concentrating a virus present in a material, recovering the virus, and preparing a sample.

【0002】[0002]

【従来の技術】ウイルスはヒトや動・植物に対する各種
疾患・病害の原因となっていることは広く知られてい
る。したがって、疾患・病害に対する予防・診断・治療
法を確立するためには原因ウイルスの存在を確認するこ
とが出発点であり、これが極めて重要である。ところ
が、エイズや各種ウイルス性肝炎の研究史に見られるよ
うに、原因ウイルスの探求と診断は容易ではない。
2. Description of the Related Art It is widely known that viruses cause various diseases and diseases on humans, animals and plants. Therefore, in order to establish a method for preventing, diagnosing, and treating diseases and diseases, the starting point is to confirm the presence of the causative virus, which is extremely important. However, as seen in the research history of AIDS and various viral hepatitis, it is not easy to search for and diagnose the causative virus.

【0003】最も一般的なウイルス診断法は、ウイルス
抗原ならびに抗ウイルス抗体の測定である。しかし、こ
れらの測定にあたっては一定量以上のウイルス抗原ある
いはウイルス抗体の存在が必要である。ところが、感染
状態にあるにもかかわらずウイルス量が少なく測定感度
以下であるために抗原検査が診断に利用できない場合も
少くない。培養細胞を用いた試験管内でのウイルス増殖
法が確立しているウイルスに関しては、ウイルスを感染
させた細胞を培養した後、適当な方法で細胞からウイル
スを分離回収して測定用試料に供することもできるが、
試験管内培養法が確立しているウイルスは極めて少な
く、この方法を実際には採用できないことが多い。ま
た、上記の方法が確立しているケースであっても分離回
収には特別な施設、設備、技術を要し、一般的に簡便に
利用できる方法とは云えない。
[0003] The most common virus diagnostic method is the measurement of viral antigens as well as antiviral antibodies. However, these measurements require the presence of a certain amount or more of a virus antigen or virus antibody. However, in many cases, antigen testing cannot be used for diagnosis because the amount of virus is low and the sensitivity is lower than the measurement sensitivity despite the infection state. For viruses for which a virus propagation method in vitro using cultured cells has been established, after virus-infected cells are cultured, the virus must be separated and recovered from the cells by an appropriate method, and used as a sample for measurement. You can also
Very few viruses have established an in vitro culture method, and in many cases this method cannot be practically adopted. Further, even in the case where the above method is established, special facilities, equipment and technology are required for separation and recovery, and it cannot be said that the method can be generally used simply.

【0004】近年、遺伝子を増幅する方法が開発され、
ウイルス遺伝子を増幅することにより、微量のウイルス
でも検出測定する途も開けた。しかし、この方法におい
ても、極めて少ない量のウイルスを測定するには複雑で
高度の測定技術が必要であり、また施設内環境からの汚
染に対し敏感であり、特殊な汚染対策が必要となる。さ
らに、試料の採取、保存法にも特別な注意が求められる
こともあり、一般施設で容易に実施しうる技術レベルに
至っていないのが現状である。
In recent years, methods for amplifying genes have been developed,
By amplifying the viral gene, the possibility of detecting and measuring even a small amount of virus has been opened. However, even in this method, measurement of an extremely small amount of virus requires complicated and sophisticated measurement techniques, is sensitive to contamination from the environment in the facility, and requires special pollution control measures. Furthermore, special precautions are required for the sample collection and preservation methods, and the technology has not yet reached a technical level that can be easily implemented in general facilities.

【0005】ウイルス研究・診断の状況が上記のようで
あることから、通常の施設でも実施可能な高感度のウイ
ルス測定法の開発が望まれていた。この問題を解決する
一つの方法としては、通常の測定技術でも検出可能なレ
ベルまでウイルスを濃縮する方法が考えられている。
Since the situation of virus research and diagnosis is as described above, it has been desired to develop a highly sensitive virus measurement method that can be carried out in ordinary facilities. As a method for solving this problem, a method has been considered in which the virus is concentrated to a level that can be detected by ordinary measurement techniques.

【0006】従来使用されているウイルス濃縮法の一つ
は超遠心分離を利用した方法である。この方法にはウイ
ルス粒子を遠心力により単純に沈殿させるものから、連
続ショ糖密度勾配平衡遠心でウイルス分画を得たのち、
さらに浮上遠心により精製するものまである。密度勾配
平衡遠心を利用した方法は、物質が密度勾配をつけた担
体内で遠心分離されると物質密度と同一の担体の位置で
平衡状態になることを利用して濃縮する方法である。各
ウイルスが固有の密度を有することから、この方法を利
用してウイルスを濃縮することが可能になる。しかし、
この方法は試料調整が煩雑であり、長時間の高速遠心分
離が必要なこと、必要機器が高価なこと、測定前に密度
勾配担体を透析等により除去しなければならない場合が
あること等から、一度に多数の試料処理が必要な診断検
査等の試料調整法には適していない。
One of the conventionally used virus concentration methods is a method utilizing ultracentrifugation. In this method, virus particles are simply precipitated by centrifugal force, and then a virus fraction is obtained by continuous sucrose density gradient equilibrium centrifugation.
Further, there are some which are purified by floating centrifugation. The method using the density gradient equilibrium centrifugation is a method of concentrating by utilizing the fact that when a substance is centrifuged in a carrier having a density gradient, an equilibrium state is established at the same carrier position as the substance density. Because each virus has a unique density, this method can be used to concentrate the virus. But,
In this method, sample preparation is complicated, long-time high-speed centrifugation is required, necessary equipment is expensive, and the density gradient carrier may need to be removed by dialysis or the like before measurement. It is not suitable for a sample preparation method such as a diagnostic test which requires processing of many samples at once.

【0007】一方、Einarssonらは、B型肝炎
ウイルス表面抗原(HBs抗原)がヘパリンと結合する
性質を利用し、ヘパリンセファロース担体に用いたクロ
マトグラフィー法によりHBs抗原精製方法を報告して
いる。しかし、この方法は単一試料の調整には有効であ
るが、多数の試料を一度に処理する方法としては作業に
労力や時間がかかり、また試料の数だけ設備を用意する
必要がある等によって、一般施設内における検査用の試
料調製法として利用するのは同様に困難である。
On the other hand, Einarsson et al. Have reported a method for purifying HBs antigen by a chromatography method using a heparin sepharose carrier, utilizing the property that a hepatitis B virus surface antigen (HBs antigen) binds to heparin. However, although this method is effective for preparing a single sample, it requires a lot of labor and time to process a large number of samples at once, and it is necessary to prepare equipment for the number of samples. However, it is similarly difficult to use it as a sample preparation method for inspection in a general facility.

【0008】別の方法としては、硫酸アンモニウムを用
いてウイルスを沈殿させる方法、ポリエチレングリコー
ルを用い沈殿させる方法、2相分配法によるウイルスの
分離回収法等が報告されているが、いずれも分離回収後
に試料調製が必要であるとの問題があり、簡便な試料調
製法とは言えない。またエンベロープを有するウイルス
の場合は、エンベロープを維持したまま分離するのに
は、その物理化学的性質から沈殿法は不向きであると言
われている。
As another method, a method of precipitating a virus using ammonium sulfate, a method of precipitating using a polyethylene glycol, and a method of separating and recovering a virus by a two-phase partitioning method have been reported. There is a problem that sample preparation is necessary, and it cannot be said to be a simple sample preparation method. In the case of a virus having an envelope, it is said that the precipitation method is unsuitable for separating the virus while maintaining the envelope because of its physicochemical properties.

【0009】[0009]

【発明が解決しようとする課題】上記のように、従来の
ウイルス分離回収・濃縮法は操作が煩雑で、同時に多数
のサンプルを処理するには不向きであった。さらに、こ
れを実施するには培養設備や特殊な遠心分離装置、分離
担体、多数のクロマトグラフィー関連設備など特別な設
備が必要とされるので、ウイルス診断のための濃縮法と
して一般の医療施設で使用することはできなかった。本
発明は、これらの問題点を解決し、通常の施設でも利用
できる程度に簡便で、かつウイルス測定の結果に悪影響
を与えることのないウイルス分離回収・濃縮方法、試料
調製法を提供することを目的とする。
As described above, the conventional virus separation / recovery / concentration method is complicated in operation and unsuitable for processing a large number of samples at the same time. Furthermore, performing this requires special equipment such as culture equipment, special centrifugal separators, separation carriers, and many chromatography-related equipment. Could not be used. The present invention solves these problems and provides a virus separation / collection / concentration method and a sample preparation method which are simple enough to be used in ordinary facilities and do not adversely affect the results of virus measurement. Aim.

【0010】本発明者らは、一部のウイルスがリポ蛋白
と同一の密度を有していること、さらにかかるウイルス
ではその外皮にリポ蛋白を多く含むことを見いだした。
このことから本発明者らは、ウイルスを分離回収・濃縮
する目的のために、リポ蛋白が有する化学的性質を利用
することができる可能性があると着眼し、研究を続け
た。しかし、リポ蛋白を沈殿させる方法として従来利用
されているデキストラン、デキストラン硫酸あるいはリ
ンタングステン酸を試料に加える方法の応用を試みた
が、ウイルスを分離回収・濃縮することはできなかっ
た。このため、本発明者らはウイルスを分離回収 濃縮
する目的には単にリポ蛋白を沈殿させる条件では十分で
ないと考え、種々研究を続けた結果本発明を完成するこ
とができた。
[0010] The present inventors have found that some viruses have the same density as lipoproteins, and that such viruses contain a large amount of lipoproteins in their outer coats.
From this, the present inventors have focused on the possibility that the chemical properties of lipoproteins may be used for the purpose of separating, collecting, and concentrating viruses, and continued their research. However, an attempt was made to apply a method of adding dextran, dextran sulfate or phosphotungstic acid to a sample, which has been conventionally used as a method for precipitating lipoproteins, but was unable to separate, collect and concentrate the virus. For this reason, the present inventors thought that the conditions for simply precipitating lipoproteins were not sufficient for the purpose of separating, collecting and concentrating the virus, and as a result of continuing various studies, the present invention could be completed.

【0011】本発明者らが解明することができた事実の
一つは、二価金属陽イオン塩を用い、また、これに各種
の多価陰イオン分子、例えば硫酸多価糖類と共存させる
ことによって、ウイルスを通常の遠心分離法で十分に沈
澱させることができることであった。この沈澱には、超
遠心分離法のような特別な方法は必要でなかった。
One of the facts that the present inventors were able to elucidate is that a divalent metal cation salt is used and coexists with various polyanion molecules such as sulfate polysaccharide. Thus, the virus can be sufficiently precipitated by the ordinary centrifugation method. No special method such as ultracentrifugation was required for this precipitation.

【0012】つぎに本発明の目的を達成するためには、
単に低濃度のウイルスを分離回収・濃縮するだけではな
く、分離回収・濃縮したウイルスを各種の測定法に使用
可能な状態にすること、即ち沈澱により分離回収・濃縮
したウイルスを可溶化する必要があった。そこで本発明
者らは沈澱を可溶化する条件を検討した。その結果、沈
澱物から金属イオンを取り除くこと、またはリポ蛋白沈
澱物からリポ蛋白を分離させることによって沈澱が可溶
化することを見い出した。すなわち、2価の金属イオン
を沈澱物から取り除く物質、あるいはリポ蛋白沈澱物か
らリポ蛋白を分離する作用を有する物質、またはその双
方を沈澱に作用させることによって沈澱物が可溶化し、
その後の測定に利用可能な試料が得られることを見いだ
した。例えば金属イオンを取り除く方法としては金属イ
オンキレート剤、あるいはNaHCOの様な他の金属
イオン塩が有用であり、またリポ蛋白沈澱物質からリポ
蛋白を分離させる作用を有する物質としては臭化カリウ
ムや臭化ナトリウムが有用であることを見いだした。
Next, in order to achieve the object of the present invention,
It is necessary not only to separate and collect and concentrate low-concentration viruses, but also to make the separated and recovered and concentrated viruses usable for various measurement methods, that is, to solubilize the separated and recovered and concentrated viruses by precipitation. there were. Therefore, the present inventors studied conditions for solubilizing the precipitate. As a result, it was found that removing the metal ions from the precipitate or separating the lipoprotein from the lipoprotein precipitate solubilized the precipitate. That is, the precipitate is solubilized by allowing the substance to remove divalent metal ions from the precipitate, the substance having an action of separating lipoprotein from the lipoprotein precipitate, or both, on the precipitate,
It was found that a sample was obtained that could be used for subsequent measurements. For example, a metal ion chelating agent or another metal ion salt such as NaHCO 3 is useful as a method of removing metal ions, and potassium bromide or potassium bromide is used as a substance having an action of separating lipoprotein from a lipoprotein precipitated substance. Sodium bromide has been found to be useful.

【0013】このように、本発明は、リポ蛋白を外皮に
もつウイルスが2価金属イオンの作用で沈殿することに
着眼してウイルス回収・濃縮法を提供するものである。
回収・濃縮効率を上げるためには多価陰イオン物質と併
用することが有用である。さらに、当該方法で回収した
濃縮ウイルスは、抗原測定ならびに遺伝子測定に利用可
能な状態に調製することができる。
As described above, the present invention provides a method for collecting and concentrating a virus, focusing on the fact that a virus having a lipoprotein in its outer coat is precipitated by the action of divalent metal ions.
In order to increase the recovery / concentration efficiency, it is useful to use a polyvalent anion substance in combination. Furthermore, the concentrated virus recovered by the method can be prepared in a state that can be used for antigen measurement and gene measurement.

【0014】ウイルスは一般にその構造としてエンベロ
ープを有するが、その構成成分はウイルスにより異なる
と推測される。しかし、幾つかのウイルスではエンベロ
ープにリポ蛋白が含まれていることが知られており、一
定以上の割合でリポ蛋白が含まれる場合にはウイルスの
外皮がリポ蛋白としての物理的・化学的性質を強く示す
ことがありうる。エンベロープにリポ蛋白が含まれるウ
イルスとしてはC型肝炎ウイルス(以下「HCV」と略
記する)ならびにのGBウイルス−C(以下「GBV−
C」と略記する)があることが本発明者らにより証明さ
れた。本発明ではこれらHCVならびにGBV−Cにつ
いての実施例が記されているが、外皮がリポ蛋白を含
み、そしてその性質が顕著なウイルスであれば、本発明
の原理は、これらウイルスに対しても同様に適用でき
る。本発明における「ウイルス」は、リポ蛋白沈澱剤で
十分に沈澱される程度にエンベロープにリポ蛋白を含有
するウイルスを意味する。対象ウイルスが本発明におけ
る「ウイルス」であるか否かは本発明に開示した方法に
より容易に確かめることができる。
A virus generally has an envelope as its structure, but it is presumed that its components differ from virus to virus. However, it is known that the envelope of some viruses contains lipoproteins, and when the lipoproteins are contained in a certain percentage or more, the outer coat of the virus has physical and chemical properties as lipoproteins. May be strongly indicated. Hepatitis C virus (hereinafter abbreviated as “HCV”) and GB virus-C (hereinafter “GBV-
C "). In the present invention, examples for these HCV and GBV-C are described. However, if the coat contains a lipoprotein and the virus has a remarkable property, the principle of the present invention can be applied to these viruses. The same applies. The "virus" in the present invention means a virus containing lipoprotein in the envelope to such an extent that it can be sufficiently precipitated with a lipoprotein precipitant. Whether or not the target virus is the “virus” in the present invention can be easily confirmed by the method disclosed in the present invention.

【0015】本発明に使用する多価陰イオン分子として
はリポ蛋白と結合する多価陰イオン分子であればいずれ
でも良い。例えば、硫酸多糖体、特にデキストラン硫酸
エステル、アミロペクチン硫酸エステル、ヘパリンであ
る。
The polyvalent anion molecule used in the present invention may be any polyvalent anion molecule that binds to lipoprotein. For example, sulfated polysaccharides, especially dextran sulfate, amylopectin sulfate, heparin.

【0016】本発明で使用するリポ蛋白結合・沈殿物質
としては2価金属陽イオンがあるが、好ましくはMn
2+、Zn2+である。
The lipoprotein-binding / precipitating substance used in the present invention includes a divalent metal cation.
2+ and Zn 2+ .

【0017】金属陽イオン存在下で形成されたウイルス
と多価陰イオン分子との不溶結合体を回収・濃縮する方
法としては、ウイルスの不溶結合体を物理的に分離・回
収する方法、粒子を回収する方法等がある。物理的分離
回収法としては、通常使用する遠心分離法がある。好ま
しくは12000rpm程度の回転数で数十分以上遠心
分離することで不溶性の結合体が沈澱として回収でき
る。
The method of recovering and concentrating the insoluble conjugate of the virus and the polyvalent anion molecule formed in the presence of the metal cation includes the method of physically separating and recovering the insoluble conjugate of the virus, and the method of collecting particles. There is a method of collecting. As a physical separation and recovery method, there is a commonly used centrifugation method. The insoluble conjugate can be recovered as a precipitate by centrifugation at a rotational speed of preferably about 12,000 rpm for tens of minutes or more.

【0018】上記方法により回収・濃縮したウイルスは
不溶性の結合体を形成している。このため、このままの
形ではウイルス抗原あるいはウイルス遺伝子を測定する
のに適切でなく、不可能なこともある。ウイルスが不溶
性の結合状態にある場合には、ウイルス抗原とその抗原
に対する抗体の結合が物理的に阻害されるため、抗原と
抗体の反応を利用したウイルス抗原の測定が不可能なた
めである。また、ヘパリンやデキストラン硫酸エステル
は、遺伝子を高感度に測定するための方法であるポリメ
ラーゼチェインリアクション法(以下「PCR」と略記
する)を阻害する。したがって、本発明の目的を達成す
るためには、回収・濃縮したウイルスを不溶性結合体か
ら解離させ、かつウイルスと結合している多価陰イオン
分子をウイルスから外し、共存する阻害作用物質を除去
・低減させることによってウイルスを測定できる状態に
する工程が必要である。
The virus recovered and concentrated by the above method forms an insoluble conjugate. For this reason, in this state, it is not appropriate and sometimes impossible to measure a virus antigen or a virus gene. This is because when the virus is in an insoluble binding state, the binding between the virus antigen and the antibody to the antigen is physically inhibited, so that it is impossible to measure the virus antigen using the reaction between the antigen and the antibody. Heparin and dextran sulfate inhibit the polymerase chain reaction method (hereinafter abbreviated as “PCR”), which is a method for measuring a gene with high sensitivity. Therefore, in order to achieve the object of the present invention, the recovered and concentrated virus is dissociated from the insoluble conjugate, the polyvalent anion molecule bound to the virus is removed from the virus, and the coexisting inhibitory substance is removed. -It is necessary to have a step of making the virus measurable by reducing it.

【0019】多価陰イオン分子とウイルスからなる結合
体を解離し可溶化する方法としては、塩を作用させて、
多価陰イオン分子とリポ蛋白との結合を解離させる方法
がある。例えば飽和濃度の臭化カリウムあるいは1.5
M塩化ナトリウム、1mMリンタングステン酸を作用さ
せる方法がある。その他の塩でも同様の作用を有するも
のであれば使用することができる。不溶結合体を形成す
る2価金属陽イオンと結合し、またはキレートする物質
を加えることにより沈殿物質を除去したうえ、上記の解
離作用を有する塩を加えることにより解離させ可溶化す
る方法がある。例えば、不溶結合体に炭酸水素ナトリウ
ムあるいはクエン酸を作用させて、Mnイオンを除去し
たうえ、これに臭化カリウムを加えウイルスを可溶化す
ることができる。同様の作用を有するものであれば炭酸
水素ナトリウム、クエン酸以外のものも使用できる。
As a method for dissociating and solubilizing a conjugate comprising a polyvalent anion molecule and a virus, a salt is allowed to act,
There is a method of dissociating the bond between the polyvalent anion molecule and the lipoprotein. For example, potassium bromide at a saturated concentration or 1.5
There is a method in which M sodium chloride and 1 mM phosphotungstic acid are allowed to act. Other salts having the same action can be used. There is a method in which a precipitated substance is removed by adding a substance that binds or chelates to a divalent metal cation forming an insoluble conjugate, and then dissociated by adding the above-described salt having a dissociating action to solubilize. For example, sodium bicarbonate or citric acid is allowed to act on the insoluble conjugate to remove Mn ions, and potassium bromide is added thereto to solubilize the virus. Other than those having the same action, those other than sodium hydrogen carbonate and citric acid can be used.

【0020】つぎに、上記の方法で分離回収・濃縮した
ウイルスをPCRに利用しようとする場合には多価陰イ
オン分子の阻害作用が問題となることもある。この問題
に対処するためには阻害物質を直接排除する方法があ
る。例えば阻害物質と結合し沈澱を形成する物質を加
え、阻害物質を沈澱させて可溶化ウイルスを分離すれば
よい。例えば、デキストラン硫酸エステル−塩化マンガ
ンにより分離回収・濃縮したウイルスに10%のNaH
COを加えてMn(HCOを形成させる方法が
ある。またMnをキレートした後飽和臭化カリウムを加
えることでデキストラン硫酸エステルを沈澱させる方法
もある。
Next, when the virus separated / recovered / concentrated by the above-mentioned method is to be used for PCR, the inhibitory effect of polyvalent anion molecules may be a problem. One way to address this problem is to eliminate inhibitors directly. For example, a substance that binds to the inhibitor and forms a precipitate may be added, and the inhibitor may be precipitated to separate the solubilized virus. For example, 10% NaH was added to the virus separated and collected and concentrated using dextran sulfate-manganese chloride.
There is a method of forming Mn (HCO 3 ) 2 by adding CO 3 . There is also a method in which dextran sulfate is precipitated by adding saturated potassium bromide after chelating Mn.

【0021】[0021]

【作用】本発明によれば従来特別な機器や熟練した技術
と長い操作時間を要したウイルスの分離、回収・濃縮お
よび試料調製が特別な機器や技術を用いることなく、短
時間で簡便に実行できる。これにより従来測定できなか
った、あるいは十分な感度を実現できなかったウイルス
抗原あるいはウイルス遺伝子の測定が可能となり、その
結果ウイルス疾患の診断、治療、予防に貢献することが
できる。
According to the present invention, virus separation, recovery, concentration, and sample preparation that required special equipment and skilled techniques and long operation time can be performed in a short time and without any special equipment or techniques. it can. This makes it possible to measure viral antigens or viral genes that could not be measured conventionally or could not achieve sufficient sensitivity, thereby contributing to the diagnosis, treatment and prevention of viral diseases.

【0022】[0022]

【実施例】以下、本発明の実施例について述べるが、も
とより本発明の範囲がこれら実施例に限定されることは
ない。
EXAMPLES Examples of the present invention will be described below, but the scope of the present invention is not limited to these examples.

【0023】[0023]

【実施例1】ヘパリン−塩化マンガンを用いたC型肝炎
ウイルスの分離回収・濃縮、濃縮ウイルスの可溶化 (1)血漿からのHCVの分離回収・濃縮 HCVの存在が確認されているヒト血漿1mlにヘパリ
ン溶液(159/uspunits/mgを0.15M
塩化ナトリウム溶液5mlで溶解したもの)10μlを
加え、さらに1MのMnClを75μl加えて室温で
20分間反応させた。反応終了後15000rpmで1
0分間、冷却微量遠心機にて分離し、上清を捨て沈澱を
得た。 (2)分離回収・濃縮ウイルスの可溶化 上記作業にて得た沈澱に飽和臭化カリウム50μlを加
え沈澱を可溶化した(分離回収分画)。最終容量は約5
0μlであった。 (3)分離回収率の確認 分離回収に使用した血漿を予めHCV−RNA陰性であ
ることが確められているヒト血漿を用いて希釈系列を作
成し、これを測定用サンプルとした。このサンプルより
通常の方法を用いてRNAを抽出した。この抽出RNA
についてHCV遺伝子の5’UTR領域を対象として一
般的に実施されているPCR法によるHCV−RNA量
は10であった。次に分離回収分画より2μlを取り
上記同様に希釈サンプルを調整しHCV−RNA量を測
定したところ、回収分画のHCV−RNA量は10
あった。上記の結果より、当該実施例におけるウイルス
回収率はほぼ100%であり、濃縮率は25倍になるこ
とがわかった(表1)。
Example 1 Separation / recovery / concentration of hepatitis C virus using heparin-manganese chloride, solubilization of concentrated virus (1) Separation / recovery / concentration of HCV from plasma 1 ml of human plasma confirmed to have HCV Heparin solution (159 / usunits / mg in 0.15M)
10 μl of a solution dissolved in 5 ml of sodium chloride solution) was added, and 75 μl of 1 M MnCl 2 was further added, followed by reaction at room temperature for 20 minutes. After the reaction, 15000 rpm
Separation was carried out for 0 minute with a cooling microcentrifuge, and the supernatant was discarded to obtain a precipitate. (2) Solubilization of separated / collected / concentrated virus 50 μl of saturated potassium bromide was added to the precipitate obtained in the above operation to solubilize the precipitate (separation / collection fractionation). Final volume is about 5
0 μl. (3) Confirmation of Separation / Recovery Rate A dilution series was prepared from the plasma used for separation / recovery using human plasma which was previously confirmed to be HCV-RNA negative, and this was used as a measurement sample. RNA was extracted from this sample using a conventional method. This extracted RNA
HCV-RNA amount by PCR method, which is generally implemented as a target 5'UTR region of the HCV gene for was 10 5. Then place the adjusted HCV-RNA amount in the same manner as described above diluted sample takes 2μl than separated and recovered fraction was measured, HCV-RNA amount of collected fractions was 10 5. From the above results, it was found that the virus recovery rate in this example was almost 100%, and the concentration rate was 25 times (Table 1).

【0024】[0024]

【表1】 [Table 1]

【0025】[0025]

【実施例2】デキストラン硫酸エステルと塩化マンガン
を用いたヒト血漿からのGBV−Cの分離回収・濃縮
と、その試料を用いたGBV−C遺伝子の測定 (1)血漿からのGBV−Cの分離回収・濃縮 GBV−Cウイルスの存在が確認されているヒト血漿1
mlに最終濃度が0.25%になるようにデキストラン
硫酸エステルを加えた。さらに1MのMnClを50
−75μl加えて室温で20分間反応させた。反応終了
後15000rpmで10分間、冷却遠心分離を行って
から上清を捨て沈澱を得た。 (2)分離回収・濃縮ウイルスからのデキストラン硫酸
エステルの除去と可溶化。 分離回収・濃縮したウイルスに10%NaHCOを5
0−75μl加えた。この操作で濃縮ウイルスを可溶化
した後、飽和臭化カリウムを適当量加えデキストラン硫
酸エステルを沈澱させた。試料を適当な条件で遠心分離
し上清を採取して可溶化ウイルスを回収分離した。上清
の容量は120μlであった。 (3)分離回収の確認 実施例1と同様の方法で、分離回収・濃縮に使用した血
漿サンプルについて分離回収前のRNA濃度を求め、総
ウイルス量を計算した。次に分離回収・濃縮、デキスト
ラン硫酸エステルを除去した可溶化ウイルスの全量を用
いてGBV−C−RNA測定を実施し回収率を求めた。
分離回収前のサンプルのGBV−C−RNA量測定は血
漿100μlより、また分離回収後のサンプルのGBV
−C−RNA量測定は回収された120μl全量より希
釈系列を作成し実施した。その結果、回収率はほぼ10
0%であり、濃縮率はおよそ8倍であることが確認され
た(表2)。
Example 2 Separation, collection and concentration of GBV-C from human plasma using dextran sulfate and manganese chloride, and measurement of GBV-C gene using the sample (1) Separation of GBV-C from plasma Collection and concentration Human plasma 1 for which the presence of GBV-C virus has been confirmed
Dextran sulfate was added to a final concentration of 0.25% per ml. Further, 50 M of MnCl 2 was added.
-75 µl was added and reacted at room temperature for 20 minutes. After completion of the reaction, the mixture was centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was discarded to obtain a precipitate. (2) Removal and solubilization of dextran sulfate from separated / collected / concentrated virus. 5% of 10% NaHCO 3 was added to the separated, collected and concentrated virus.
0-75 μl was added. After the concentrated virus was solubilized by this operation, an appropriate amount of saturated potassium bromide was added to precipitate dextran sulfate. The sample was centrifuged under appropriate conditions, the supernatant was collected, and the solubilized virus was recovered and separated. The volume of the supernatant was 120 μl. (3) Confirmation of separation / recovery In the same manner as in Example 1, the RNA concentration of the plasma sample used for separation / recovery / concentration before separation / recovery was determined, and the total virus amount was calculated. Next, GBV-C-RNA measurement was performed using the total amount of the solubilized virus from which the dextran sulfate was removed, and the recovery rate was determined.
The amount of GBV-C-RNA in the sample before separation and recovery was determined from 100 μl of plasma, and the GBV of the sample after separation and recovery.
The measurement of the amount of -C-RNA was performed by preparing a dilution series from the total amount of the collected 120 µl. As a result, the recovery rate was almost 10
0%, and the enrichment rate was confirmed to be about 8 times (Table 2).

【0026】[0026]

【表2】 [Table 2]

【0027】[0027]

【実施例3】デキストラン硫酸エステルと塩化マンガン
を用いたヒト血漿からのHCVの分離回収・濃縮と、そ
の試料を用いたHCV遺伝子の測定 (1)血漿からのHCVの分離回収・濃縮。 HCVの存在が確認されているヒト血漿1mlに最終濃
度が0.25%になるようにデキストラン硫酸エステル
を加え、さらに1MのMnClを50〜75μl加え
て室温で20分間反応させた。反応終了後15000r
pmで10分間、冷却遠心分離を行ってから上清を捨て
沈澱を得た。 (2)分離回収・濃縮ウイルスからのデキストラン硫酸
エステル除去と可溶化。 分離回収・濃縮したウイルスに10%のNaHCO
50−75μl加えた。この操作で濃縮ウイルスを可溶
化した後飽和臭化カリウムを適当量加えデキストラン硫
酸エステルを沈澱させた。試料を適当な条件で遠心分離
し上清を採取して可溶化ウイルスを回収分離した。上清
の容量は120μlであった。 (3)分離回収の確認 実施例1と同様の方法で、分離回収・濃縮に使用した血
漿サンプルについて分離回収前のRNA濃度を求め、総
ウイルス量を計算した。次に分離回収・濃縮、デキスト
ラン硫酸エステル除去した可溶化ウイルスの全量を用い
てHCV−RNA測定を実施し回収率を求めた。分離回
収前のサンプルのHCV−RNA量測定は血漿100μ
lより、また分離回収後のサンプルのHCV−RNA量
測定は得られた120μl全量より希釈系列を作成し行
った。その結果回収率はほぼ100%であり、およそ8
倍の濃縮率であることが判明した(表3)。
Example 3 Separation and collection and concentration of HCV from human plasma using dextran sulfate and manganese chloride, and measurement of HCV gene using the sample (1) Separation and collection and concentration of HCV from plasma. Dextran sulfate was added to 1 ml of human plasma in which the presence of HCV was confirmed so as to have a final concentration of 0.25%, and 50 to 75 μl of 1 M MnCl 2 was added, followed by reaction at room temperature for 20 minutes. 15000r after completion of reaction
After centrifugation at 10 pm for 10 minutes, the supernatant was discarded to obtain a precipitate. (2) Removal and solubilization of dextran sulfate from the separated and concentrated virus. 50-75 μl of 10% NaHCO 3 was added to the separated, collected and concentrated virus. After the concentrated virus was solubilized by this operation, an appropriate amount of saturated potassium bromide was added to precipitate dextran sulfate. The sample was centrifuged under appropriate conditions, the supernatant was collected, and the solubilized virus was recovered and separated. The volume of the supernatant was 120 μl. (3) Confirmation of separation / recovery In the same manner as in Example 1, the RNA concentration of the plasma sample used for separation / recovery / concentration before separation / recovery was determined, and the total virus amount was calculated. Next, HCV-RNA was measured using the total amount of the solubilized virus from which separation, collection, concentration, and dextran sulfate had been removed, and the recovery rate was determined. HCV-RNA content of the sample before separation and recovery was measured using 100 μM plasma.
For the measurement of the amount of HCV-RNA in the sample after separation and recovery, a dilution series was prepared from the entire 120 μl obtained. As a result, the recovery was almost 100%, about 8%.
The enrichment was found to be twice as high (Table 3).

【0028】[0028]

【表3】 [Table 3]

【0029】[0029]

【実施例4】血漿からのヘパリン−塩化マンガンを用い
て分離回収・濃縮したHCVを用いたHCVエンベロー
プ抗原の測定。 (1)抗HCVエンベロープ抗体固相化プレートの作
成。 HCVエンベロープ抗原を免疫源として作成した抗HC
Vエンベロープ抗体を通常のポリスチレン製96穴型タ
イタープレートの壁面に固相化した。即ち、280nm
吸光度が0.01になるよう0.2M Carbona
te緩衝液で希釈した抗体液をプレート穴に50μlづ
つ加え、室温で1時間振とう反応させ物理的に壁面に吸
着させ、その後2%のTween80含有のリン酸緩衝
液で洗浄した。洗浄した穴に2%のスキムミルク(TB
S緩衝液)を加え1時間室温で反応させブロッキングす
る。反応終了後先述の洗浄液にて十分洗浄し抗体固相化
プレートを作成した。 (2)測定 2mlの容量のエッペンドルフ型チューブにサンプル希
釈液(2%NP−40、0.4%スキムミルク、TBS
緩衝液)を加えた。このチューブに実施例1記載の方法
で分離回収・濃縮後可溶化し調整した測定用検体(血
漿)50μlを加え、室温にて1時間反応させた。反応
終了後先述の洗浄液にて十分洗浄した後、ウマ西洋ワサ
ビパーオキシダーゼ標識抗HCVエンベロープ抗体を作
用させ室温で30分間反応させた。反応終了後、前記の
洗浄液で洗浄し、反応基質を加えて発色させ、停止液添
加後測定を行った。対照として健康人の測定を行った
(表4)。
Example 4 Measurement of HCV envelope antigen using HCV separated and recovered and concentrated from plasma using heparin-manganese chloride. (1) Preparation of anti-HCV envelope antibody-immobilized plate. Anti-HC prepared using HCV envelope antigen as immunogen
The V envelope antibody was immobilized on the wall surface of an ordinary polystyrene 96-well titer plate. That is, 280 nm
0.2M Carbona so that the absorbance becomes 0.01
The antibody solution diluted with the te buffer solution was added to the plate wells in an amount of 50 μl each, and the plate was shake-reacted at room temperature for 1 hour to be physically adsorbed on the wall surface, and then washed with a phosphate buffer solution containing 2% Tween 80. 2% skim milk (TB
(S buffer) and block for 1 hour at room temperature. After the reaction was completed, the plate was sufficiently washed with the above-mentioned washing solution to prepare an antibody-immobilized plate. (2) Measurement A sample diluent (2% NP-40, 0.4% skim milk, TBS) was placed in an Eppendorf tube having a capacity of 2 ml.
Buffer). To this tube, 50 μl of a test sample (plasma) solubilized and adjusted after separation / recovery / concentration by the method described in Example 1 was added, and reacted at room temperature for 1 hour. After completion of the reaction, the plate was sufficiently washed with the above-mentioned washing solution, and allowed to react with horseradish peroxidase-labeled anti-HCV envelope antibody at room temperature for 30 minutes. After completion of the reaction, the plate was washed with the above-mentioned washing solution, a reaction substrate was added to develop a color, and the measurement was performed after adding a stop solution. As a control, a healthy person was measured (Table 4).

【0030】[0030]

【表4】 [Table 4]

【0031】[0031]

【発明の効果】本発明により従来煩雑で手間のかかって
いたウイルスの分離回収・濃縮が容易に実施できること
となった。本発明方法により、特別の設備を要すること
なく研究機関、医療施設でウイルス試料を調整でき、こ
れによってウイルスの研究ならびに抗原検査や遺伝子検
査を通じてウイルス疾患の診断、治療、予防に大きく貢
献することができる。
According to the present invention, it has become possible to easily carry out the separation, recovery and concentration of a virus, which has conventionally been troublesome and troublesome. According to the method of the present invention, a virus sample can be prepared in a research institution or a medical facility without requiring special equipment, thereby greatly contributing to the diagnosis, treatment and prevention of viral diseases through virus research and antigen testing and genetic testing. it can.

Claims (11)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項1】 ウイルスを含む資料にリポ蛋白結合・沈
澱物質を作用させる行程と、沈澱した物質を可溶化する
行程とからなることを特徴とするウイルスの分離回収・
濃縮・試料調製方法。
1. A method for separating and recovering a virus, comprising: a step of causing a lipoprotein-binding / precipitating substance to act on a material containing a virus; and a step of solubilizing the precipitated substance.
Concentration and sample preparation methods.
【請求項2】 沈澱促進物質を加える請求項1記載の方
法。
2. The method according to claim 1, wherein a precipitation promoting substance is added.
【請求項3】 リポ蛋白結合・沈澱物質として2価金属
イオンを用いる請求項1または2の方法。
3. The method according to claim 1, wherein a divalent metal ion is used as the lipoprotein-binding / precipitating substance.
【請求項4】 沈澱促進物質として多価陰イオン物質を
用いる請求項1ないし3の方法。
4. The method according to claim 1, wherein a polyanionic substance is used as the precipitation promoting substance.
【請求項5】 沈澱促進物質として硫酸多糖類を用いる
請求項1ないし4の方法。
5. The method according to claim 1, wherein a polysaccharide sulfate is used as the precipitation promoting substance.
【請求項6】 沈澱促進物質としてヘパリンを用いる請
求項1ないし5の方法。
6. The method according to claim 1, wherein heparin is used as a precipitation promoting substance.
【請求項7】 沈澱促進物質としてデキストラン硫酸エ
ステルを用いる請求項1ないし5の方法。
7. The method according to claim 1, wherein dextran sulfate is used as a precipitation promoting substance.
【請求項8】 2価金属イオン物質を除去して可溶化す
る請求項1ないし7の方法。
8. The method according to claim 1, wherein the divalent metal ionic substance is removed for solubilization.
【請求項9】 臭化カリウムまたは臭化ナトリウムを作
用させて可溶化する請求項1ないし7の方法。
9. The method according to claim 1, wherein the compound is solubilized by the action of potassium bromide or sodium bromide.
【請求項10】 NaHCOを作用させて可溶化する
請求項1ないし7の方法。
10. The method according to claim 1, wherein NaHCO 3 is allowed to act to solubilize.
【請求項11】 クエン酸溶液を作用させて可溶化する
請求項1ないし7の方法。
11. The method according to claim 1, wherein the solubilization is effected by the action of a citric acid solution.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005100984A1 (en) * 2004-04-14 2005-10-27 N.S.Tech Inc. Method of separating and concentrating protein and conditioning sample
JP2013505431A (en) * 2009-09-21 2013-02-14 エフ ホフマン−ラ ロッシュ アクチェン ゲゼルシャフト Method for performing a reaction in an analyzer

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WO2005100984A1 (en) * 2004-04-14 2005-10-27 N.S.Tech Inc. Method of separating and concentrating protein and conditioning sample
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