JPH116831A - Method for detecting and measuring blood platelet including premature rete blood platelet and adoption of the same to clinic - Google Patents
Method for detecting and measuring blood platelet including premature rete blood platelet and adoption of the same to clinicInfo
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Abstract
Description
【発明の属する技術分野】本発明は、未熟網血小板を含
む血小板の検出・測定方法及び該方法の臨床への適用に
関し、より詳細には、未熟網血小板を含む血小板の検出
・測定方法及び該方法の臨床への適用に関する。The present invention relates to a method for detecting and measuring platelets containing immature retinal platelets and the clinical application of the method. More specifically, the present invention relates to a method for detecting and measuring platelets containing immature retinal platelets, To the clinical application of the method.
【０００１】[0001]
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】哺乳動
物の血液は、赤血球、種々の白血球、血小板等を含む多
数の細胞型から構成されている。血小板は、骨髄中の巨
核球により生成され、赤血球と同様、それらが成熟する
と、その大きさ及びＲＮＡ含有量が減少することが知ら
れている（カルパッキン(Karpatkin) S.の報告（Ann.Re
v.Med.(1972)23 101-128）参照）。また、血小板のなか
で、巨核球から現れた幼若な血小板が確認されており、
この血小板は「網血小板（ＲＰ）」と呼ばれ、活動して
いる一番若い血小板であると仮定されていた（アルトと
ノーレス(Knowles) の報告(Exp.Hemat. (1995)23 996-1
001)参照）。BACKGROUND OF THE INVENTION Mammalian blood is composed of many cell types, including red blood cells, various white blood cells, platelets, and the like. Platelets are produced by megakaryocytes in the bone marrow and, like red blood cells, are known to decrease in size and RNA content as they mature (reported by Karpatkin S. (Ann. Re
v. Med. (1972) 23 101-128). Also, among the platelets, juvenile platelets that emerged from megakaryocytes have been confirmed,
This platelet is called "retinal platelets (RP)" and was assumed to be the youngest active platelet (Alto and Knowles report (Exp. Hemat. (1995) 23 996-1).
001)).
【０００２】一般に、例えばガン患者において、骨髄機
能が抑制されると血小板生成は大きく減少するか又は全
く起こらなくなる。よって、正常なドナーから血小板輸
血を受けていない患者の血液中では成熟血小板のみが循
環することとなる。一方、自己骨髄移植を行った患者に
おいて、骨髄機能が回復した状態では、新しい血小板が
巨核球から生成され、この新しい血小板は、ＲＮＡが豊
富で網血小板であることが明らかにされている（ランプ
(Romp)らの報告(Am.J.Hen.(1994)46 319-324)参照）。
つまり、網血小板は、より多量のリボ核酸（ＲＮＡ）を
含む点において成熟血小板とは異なる特徴を有してい
る。In general, for example in cancer patients, when bone marrow function is suppressed, platelet production is greatly reduced or not at all. Therefore, only mature platelets circulate in the blood of patients who have not received platelet transfusion from normal donors. On the other hand, in patients undergoing autologous bone marrow transplantation, when bone marrow function has been restored, new platelets are generated from megakaryocytes, and the new platelets are rich in RNA and have been shown to be reticulated platelets (lamp platelets).
(Romp) et al. (See Am. J. Hen. (1994) 46 319-324).
That is, reticulated platelets have characteristics different from mature platelets in that they contain a larger amount of ribonucleic acid (RNA).
【０００３】よって、網血小板は、赤血球の網赤血球前
駆体にたとえられることがある。従来から、ＲＮＡ含有
量が増大した網赤血球は、核酸結合性蛍光色素で染色
し、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトリーを使用して検
出・同定できることが知られている（アルト(Ault)らの
報告(Am.J.Clin.Path.(1992)98 637-646) 参照）。[0003] Thus, reticulocytes may be compared to reticulocyte precursors of erythrocytes. It has been known that reticulocytes having an increased RNA content can be stained with a nucleic acid-binding fluorescent dye and detected and identified using FACScan flow cytometry (Ault et al. (Am. J. Clin. Path. (1992) 98 637-646)).
【０００４】また、以前から、ＦＡＣＳｃａｎフローサ
イトメーターにより測定された非常に蛍光性の高い血小
板集団に基づく血小板成熟指数（ＰＭＩ）について論議
されている（ハウェン(Houwen)らの報告(Blood(1995)86
989a 及びLaboratory Hematology(1995)1 53)参照）。
この測定方法は、蛍光色素オーラミンＯでラベルされた
血小板細胞集団の蛍光の検出のみに頼っており、細胞容
積は考慮に入れていなかった。つまり、ＰＭＩは、全血
小板の割合として表されており、網血小板の割合として
表されているものではなかった。さらに、より重要なこ
とには、その測定方法は、蛍光でラベルされたより大き
いサブポプレーションの血小板（網血小板）を排除して
いた。このように、内部標準を利用するサイズとＲＮＡ
含有量とに基づく成熟血小板と網血小板とを明確にする
方法は、未だ確立されていなかった。本発明は、上記課
題に鑑みなされたものであり、全段階の網血小板を正確
に定量的に測定し、実際の血小板産生をより正確に分析
することにより、血小板の代謝回転速度を測定する方法
を確立することを目的としている。いいかえれば、従来
は弁別及び分離されていなかった初期血小板前駆体細胞
（未熟網血小板）集団の存在を測定し、各人の血小板集
団における変化の観察、種々の疾患や化学療法等による
骨髄機能抑制状態からの回復を観察し、ひいては患者の
健康回復を正確に測定する方法を確立することを目的と
する。There has also been a previous discussion of the platelet maturation index (PMI) based on a highly fluorescent platelet population as measured by a FACScan flow cytometer (Houwen et al. (Blood (1995)). 86
989a and Laboratory Hematology (1995 ) 153)).
This method of measurement relied solely on the detection of the fluorescence of a platelet cell population labeled with the fluorescent dye Auramine O, and did not take cell volume into account. That is, PMI was expressed as a percentage of total platelets, not as a percentage of reticulated platelets. More importantly, the assay excluded larger subpopulations of platelets (retinal platelets) that were fluorescently labeled. Thus, the size and RNA using the internal standard
A method for defining mature platelets and reticulated platelets based on their content has not yet been established. The present invention has been made in view of the above problems, and a method for accurately and quantitatively measuring reticulated platelets at all stages and more accurately analyzing actual platelet production to measure the turnover rate of platelets. The purpose is to establish. In other words, the presence of a population of early platelet precursor cells (immature retinal platelets), which had not been discriminated and separated before, was measured, changes in the platelet population of each individual were observed, and bone marrow function was suppressed by various diseases and chemotherapy. The aim is to observe the recovery from the condition and thus establish a method for accurately measuring the recovery of the patient's health.
【０００５】[0005]
【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
を行うことにより、従来明確に測定することができなか
った網血小板を正確かつ明確に測定することができ、し
かも、その中に含まれるよりＲＮＡが豊富な未熟網血小
板画分（ＩＰＦ）を測定することができる方法を見出
し、本発明の完成に至った。すなわち本発明によれば、
(a) 全血サンプルを固定及び洗浄し、(b) 得られたサン
プルを、核酸を染色可能な蛍光色素と反応させ、(c) さ
らに得られた反応物を、非蛍光の成熟血小板、蛍光染色
された網血小板及び該網血小板よりも高蛍光染色された
未熟網血小板のためにそれぞれ予め設定されたＲ１、Ｒ
２及びＲ３ゲートウィンドウを用い、かつ蛍光と前方散
乱光とを利用するフローサイトメトリに付し、(d) 前記
Ｒ１ゲートウィンドウで画定された非蛍光の成熟血小板
を測定し、(e) 前記Ｒ２ゲートウィンドウで画定された
網血小板を測定し、(f) 前記Ｒ３ゲートウィンドウで画
定された未熟網血小板を測定することからなる未熟網血
小板を含む血小板の検出・測定方法が提供される。ま
た、本発明によれば、骨髄機能抑制状態にある患者の全
血を、上記方法に付して、骨髄機能の回復状態を観察す
る方法が提供される。さらに、本発明によれば、核酸染
色可能な蛍光色素により染色され、Ｒ２ゲートウィンド
ウで画定された網血小板よりも高蛍光染色可能な未熟網
血小板の画分であり、実質的に成熟血小板の画分及び網
血小板の画分を含まない未熟網血小板画分が提供され
る。Means for Solving the Problems The present inventors have conducted intensive studies, and thus can accurately and clearly measure reticulated platelets which could not be clearly measured in the past. The present inventors have found a method capable of measuring the immature retinal platelet fraction (IPF), which is richer in RNA, and completed the present invention. That is, according to the present invention,
(a) fixing and washing a whole blood sample, (b) reacting the resulting sample with a fluorescent dye capable of staining nucleic acids, and (c) further reacting the resulting reaction product with non-fluorescent mature platelets, R1 and R which are respectively preset for the stained reticulated platelets and the immature reticulated platelets which are more fluorescently stained than the reticulated platelets
2 and R3 gate windows and subjected to flow cytometry utilizing fluorescence and forward scattered light, (d) measuring non-fluorescent mature platelets defined by said R1 gate window, and (e) measuring said R2 A method for detecting and measuring platelets including immature reticulated platelets, comprising: measuring reticulated platelets defined by a gate window; and (f) measuring immature reticulated platelets defined by the R3 gate window. Further, according to the present invention, there is provided a method of observing a state of recovery of bone marrow function by subjecting whole blood of a patient in a state of bone marrow function suppression to the above method. Furthermore, according to the present invention, it is a fraction of immature retinal platelets stained with a nucleic acid-stainable fluorescent dye and capable of higher fluorescent staining than the retinal platelets defined by the R2 gate window, and substantially the fraction of mature platelets A fraction of immature reticular platelets is provided that does not contain a fraction of retinal and platelet fractions.
【０００６】本発明の工程(a) においては、全血サンプ
ルを固定及び洗浄する。ここで全血サンプルとは、測定
対象となる血液成分を含有するサンプルであればどのよ
うなサンプルであってもよい。例えば、抗凝固剤処理し
た末梢血液又は骨髄液等が挙げられる。また、固定と
は、血液細胞のもとの形態や構造内容物を保持して変化
させないようにする処理法を意味し、通常このような処
理に使用することができる溶液、例えば、ホルマリン
液、グルタールアルデヒド液、ブアン氏液、酢酸アルコ
ール、メタノール等を使用することができる。なかで
も、ホルマリン液が好ましい。また、洗浄は、サンプル
から不要な固定化溶液等を除去するために行われるため
の処理であり、例えば、生物学的試料用の緩衝剤を含有
する溶液を使用して、通常このような洗浄に使用される
方法で行うことができる。工程(b) においては、得られ
たサンプルを核酸染色可能な蛍光色素と反応させる。こ
こで、核酸を染色可能な蛍光色素としては、主としてＲ
ＮＡを染色することができる蛍光色素が挙げられ、具体
的には、チアゾールオレンジ、オーラミンＯ等が挙げら
れる。これらの蛍光色素の使用濃度、反応方法等は、特
に限定されるものではなく、通常血液サンプルを測定す
るために用いることができる使用濃度、反応方法から適
当なものを選択して使用することができ る。工程(c)
においては、得られた反応物を、蛍光と前方散乱光とを
利用したフローサイトメトリに付す。ここで、蛍光と
は、使用する蛍光色素の励起波長付近の光、例えば、ア
ルゴンレーザ、Ｈｅ／Ｎｅレーザー、半導体レーザー等
による光源からの光の照射により放射される光を意味
し、細胞内部に含まれる物質の情報（例えばＲＮＡ量）
を反映する。また、前方散乱光とは、上記光源からの光
の照射により前方に散乱される散乱光を意味し、血液細
胞のサイズ情報を反映する。ここで使用されるフローサ
イトメトリにおいては、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３ゲートウィ
ンドウは、それぞれ、非蛍光の成熟血小板、蛍光染色さ
れた網血小板及び該網血小板よりも高蛍光染色された未
熟網血小板のために予め設定されている。また、このよ
うなフローサイトメトリにおいては、蛍光と前方散乱光
とが利用される。なお、これらＲ１、Ｒ２及びＲ３ゲー
トウィンドウの設定は、任意設定に基づくものではな
く、以下に示す各患者又は正常人の血液サンプルを、工
程(a) 及び(b) と同様の方法により蛍光染色し、各段階
の網血小板及び血小板をＦＡＣＳｃａｎのようなフロー
サイトメータを用いて実際に計数して、非蛍光血小板、
蛍光染色された網血小板及びこの網血小板よりも高蛍光
染色された未熟網血小板をそれぞれ画定することにより
行うことができる。また、このＲ１、Ｒ２及びＲ３ゲー
トウィンドウは、被験血液サンプルについての未熟網血
小板画分を測定するに前に設定されていればよく、被験
サンプルの調製、測定とは別個の工程で予め設定してお
いてもよいし、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３ゲートウィンドウの
設定のための血液サンプルの調製、測定を、被験血液サ
ンプルの調製、測定と同時に行って、被験血液サンプル
についての未熟網血小板画分を検出・測定する際に設定
されていてもよい。例えば、Ｒ１ゲートウィンドウは、
骨髄機能抑制状態の患者からの全血サンプルを利用する
ことにより設定することができる。ここで、骨髄機能抑
制状態の患者とは、例えば、何らかの病気で骨髄機能
が抑制された状態の患者、癌等の化学療法によって、
副作用として骨髄機能が抑制された状態の患者、骨髄
移植等を行うために、積極的に骨髄機能を抑制する治療
を受けている患者等が挙げられ、かつ過去５日間程度に
わたって血小板輸血を受けておらず、ほとんど新しい血
小板を産生することができない、重篤な骨髄機能抑制状
態にある患者を意味する。このような患者の血液は、主
として核酸染色可能な蛍光色素に染色されない又はほと
んどされない成熟血小板を含むため、非染色の成熟血小
板画分としてＲ１ゲートウィンドウを画定することがで
きる。また、Ｒ２ゲートウィンドウは、正常人からの全
血サンプルを利用することにより確立することができ
る。正常人、つまり健康な成人のドナーからの血液は、
成熟血小板と核酸染色可能な蛍光色素に染色される若干
の網血小板を含み、網血小板画分についての内部標準と
しての役割を果たすため、Ｒ２ゲートウィンドウを画定
することができる。さらに、Ｒ３ゲートウィンドウは、
初期骨髄機能回復過程にある患者からの全血サンプルを
利用することにより設定することができる。つまり、重
篤な骨髄機能抑制状態から回復過程（巨核球産生等）の
初期にある患者においては、骨髄機能抑制状態の患者に
見られるような成熟血小板のほかに、より多くの網血小
板及び「未熟網血小板画分（ＩＰＦ）」と名づけられて
いる非常に蛍光性の高い未熟な網血小板をも含むため、
このような血液を用いることにより、Ｒ３ゲートウィン
ドウを画定することができる。[0006] In the step (a) of the present invention, a whole blood sample is fixed and washed. Here, the whole blood sample may be any sample as long as it contains a blood component to be measured. For example, peripheral blood or bone marrow fluid treated with an anticoagulant may be used. In addition, fixation refers to a treatment method that retains the original form and structure contents of blood cells so as not to change them, and a solution that can be generally used for such treatment, for example, formalin solution, Glutaraldehyde solution, Bouin's solution, acetic acid alcohol, methanol and the like can be used. Among them, formalin solution is preferred. Washing is a process for removing an unnecessary immobilization solution or the like from a sample.For example, such washing is usually performed using a solution containing a buffer for a biological sample. Can be performed by the method used for In the step (b), the obtained sample is reacted with a fluorescent dye capable of staining nucleic acids. Here, the fluorescent dye capable of staining nucleic acids is mainly R
Examples include a fluorescent dye capable of staining NA, and specific examples include thiazole orange and auramine O. The concentration of these fluorescent dyes used, the reaction method, and the like are not particularly limited, and it is possible to select and use an appropriate concentration from the used concentrations and reaction methods that can be used for measuring a blood sample. it can. Step (c)
In, the obtained reaction product is subjected to flow cytometry using fluorescence and forward scattered light. Here, the fluorescence means light near the excitation wavelength of the fluorescent dye to be used, for example, light emitted by irradiation with light from a light source such as an argon laser, a He / Ne laser, or a semiconductor laser. Information on contained substances (eg, RNA amount)
To reflect. Further, the forward scattered light means scattered light scattered forward by irradiation of light from the light source, and reflects size information of blood cells. In the flow cytometry used herein, the R1, R2 and R3 gate windows are for non-fluorescent mature platelets, fluorescently stained reticulated platelets, and immature reticulated platelets that are more fluorescently stained than the reticulated platelets, respectively. Is set in advance. In such flow cytometry, fluorescence and forward scattered light are used. The settings of the R1, R2 and R3 gate windows are not based on arbitrary settings, and the blood samples of each patient or normal person shown below are fluorescently stained by the same method as in steps (a) and (b). The reticulated platelets and platelets at each stage were actually counted using a flow cytometer such as a FACScan, and the non-fluorescent platelets,
The determination can be performed by defining the fluorescently-stained reticulated platelets and the immature reticulated platelets that are more fluorescently stained than the reticulated platelets. The R1, R2 and R3 gate windows may be set before measuring the immature reticular platelet fraction of the test blood sample, and may be set in advance in a step separate from the preparation and measurement of the test sample. Alternatively, the preparation and measurement of the blood sample for setting the R1, R2 and R3 gate windows may be performed simultaneously with the preparation and measurement of the test blood sample, and the immature reticular platelet fraction of the test blood sample may be determined. It may be set when detecting and measuring. For example, the R1 gate window is
It can be set by using a whole blood sample from a patient in a myelosuppressed state. Here, a patient in a state of bone marrow dysfunction, for example, a patient in a state where bone marrow function is suppressed due to some disease, by chemotherapy such as cancer,
Side effects include patients with suppressed bone marrow function, patients who are actively receiving treatment to suppress bone marrow function to perform bone marrow transplantation, etc., and who have undergone platelet transfusion for the past 5 days or so. Means patients with severe myelosuppressive status, who can produce few or no new platelets. Since the blood of such patients contains predominantly mature platelets that are not or rarely stained by nucleic acid stainable fluorescent dyes, the R1 gate window can be defined as the unstained mature platelet fraction. Also, the R2 gate window can be established by utilizing a whole blood sample from a normal person. Blood from a normal person, a healthy adult donor,
An R2 gate window can be defined to contain mature platelets and some reticulated platelets stained with nucleic acid stainable fluorescent dyes and serve as an internal standard for the reticulated platelet fraction. In addition, the R3 gate window
This can be set by utilizing a whole blood sample from a patient who is in the process of initial bone marrow function recovery. That is, in patients in the early stages of recovery from a severe myelosuppressive state (eg, megakaryocyte production), in addition to mature platelets as seen in patients with myelosuppressive states, more reticulocytes and “ It also contains highly fluorescent immature retinal platelets, termed "immature retinal platelet fraction (IPF)"
By using such blood, an R3 gate window can be defined.
【０００７】工程(d) 〜(f) においては、予めＲ１、Ｒ
２及びＲ３のゲートウィンドウが設定されたフローサイ
トメトリを利用して、Ｒ１ゲートウィンドウで画定され
る成熟血小板の画分、Ｒ２ゲートウィンドウで画定され
る網血小板の画分及びＲ３ゲートウィンドウで画定され
る未熟網血小板画分を測定する。ここでの測定は、上記
工程により蛍光染色された各血小板を各ゲートごとに分
類、計数することにより行うことができる。なお、本発
明においては、フローサイトメトリを利用して得られた
データを、血小板のサイズのパラメーター（前方散乱光
のデータ）を加えてスキャッタグラムに表すので、従来
は弁別されていなかった未熟網血小板画分（ＩＰＦ）の
存在及び／又は量を同定することが可能となる。In the steps (d) to (f), R1, R
Using flow cytometry with gate windows of R2 and R3, the fraction of mature platelets defined by the R1 gate window, the fraction of reticulocytes defined by the R2 gate window, and the R3 gate window are defined. The immature reticular platelet fraction is measured. The measurement here can be performed by classifying and counting each platelet that has been fluorescently stained in the above step for each gate. In the present invention, data obtained by using flow cytometry is represented in a scattergram by adding a parameter of platelet size (data of forward scattered light). It is possible to identify the presence and / or amount of the platelet fraction (IPF).
【０００８】また、本発明は、骨髄機能抑制から回復過
程にある患者からの全血サンプルから未熟網血小板画分
を測定し、この画分を、少なくともＲ２ゲートウィンド
ウで画定された網血小板画分及びＲ３ゲートウィンドウ
で画定された未熟網血小板画分と比較することにより、
骨髄機能抑制から回復過程にある患者において、新しい
血小板（未熟網血小板）の生産速度を観察するために利
用することができる。すなわち、未熟網血小板画分は、
正常な安定状態の若い網血小板レベルと比較して、蛍光
染色される物質をより大量に有する種々のサイズの細胞
を含んでおり、血小板生成増大の指標となる。The present invention also provides a method for measuring the immature retinal platelet fraction from a whole blood sample from a patient who is in the process of recovery from myelosuppression, and using this fraction as a fraction of at least the R2 gate window. And by comparison with the immature retinal platelet fraction defined in the R3 gate window,
It can be used to monitor the rate of production of new platelets (immature reticular platelets) in patients recovering from myelosuppression. That is, the immature reticular platelet fraction
It contains cells of various sizes with higher amounts of fluorescently stained material compared to normal steady state young reticulated platelet levels, and is indicative of increased platelet production.
【０００９】以下に、本発明の網血小板を含む血小板の
検出・の測定方法について説明する。The method for detecting and measuring platelets containing reticulated platelets of the present invention will be described below.
【００１０】Ｒ１、Ｒ２及びＲ３ゲートウィンドウを設
定するために、以下に示すサンプルをフローサイトメト
リーに付した。まず、癌化学療法後の重篤な骨髄機能抑
制状態にある患者２名（骨髄機能抑制状態が可能な限り
の最低レベルにある患者）からの全血サンプルをそれぞ
れ採取し、１％パラホルムアルデヒドの固定液中で固定
する。次いで、サンプルを遠心分離し、バッファー中に
懸濁し、洗浄する。続いて、血液サンプルの５μｌを核
酸を染色可能な蛍光色素であるチアゾールオレンジ（５
４０ｎｍ）と混合し、室温暗所でインキュベーションし
た。得られたサンプルを、ＦＡＣＳｃａｎを使用したフ
ローサイトメトリーに付し、各サンプルについて、前方
散乱（ＦＳ）と蛍光（ＦＬ1 ）とを測定した。その結果
を図１及び図２に示す。なお、これらの図においては、
前方散乱（ＦＳ）と蛍光（ＦＬ1 ）とはいずれも対数グ
ラフを用いてプロットした。これらのプロットから、図
１及び図２に示したように、成熟血小板を示すＲ１ゲー
トウィンドウを設定することができる。To set the R1, R2 and R3 gate windows, the following samples were subjected to flow cytometry. First, whole blood samples were collected from two patients with severe myelosuppression after cancer chemotherapy (patients with myelosuppression at the lowest possible level), and 1% paraformaldehyde Fix in fixative. The sample is then centrifuged, suspended in buffer and washed. Subsequently, 5 μl of the blood sample was treated with a fluorescent dye thiazole orange (5.
40 nm) and incubated in the dark at room temperature. The obtained sample was subjected to flow cytometry using FACScan, and forward scatter (FS) and fluorescence (FL 1 ) were measured for each sample. The results are shown in FIGS. In these figures,
Both forward scatter (FS) and fluorescence (FL 1 ) were plotted using a logarithmic graph. From these plots, an R1 gate window indicating mature platelets can be set, as shown in FIGS.
【００１１】次に、正常人である健康な成人ドナーから
の全血サンプルを、上記と同様の方法でチアゾールオレ
ンジと反応させ、フローサイトメトリーに付し、前方散
乱（ＦＳ）と蛍光（ＦＬ1 ）とを測定した。その結果を
図３に示す。これらのプロットから、図３に示したよう
に、ＲＮＡ豊富な血小板、つまり網血小板を示すＲ２ゲ
ートウィンドウを設定することができる。なお、図１〜
３に示したグラフにおいて、Ｒ１及びＲ２ゲートウィン
ドウにプロットされた血小板は、異なる血小板集団によ
り明確にされており、正常人からのリボヌクレアーゼで
処理（室温で１mg/ mlのリボヌクレアーゼで処理）した
全血サンプルを利用して確認できる。そのようなリボヌ
クレアーゼ処理した血小板集団は、癌化学療法後の骨髄
機能抑制状態が可能な限り最低レベルにある患者からの
血液サンプルによって設定されたＲ１ゲートウィンドウ
と同じになる。なお、Ｒ１ゲートウィンドウの外側の血
小板はＲＮＡ豊富な血小板又は網血小板とみなされる。Next, a whole blood sample from a normal healthy adult donor is reacted with thiazole orange in the same manner as described above, subjected to flow cytometry, and subjected to forward scatter (FS) and fluorescence (FL 1 ). ) Was measured. The result is shown in FIG. From these plots, as shown in FIG. 3, an R2 gate window showing RNA-rich platelets, ie, reticulated platelets, can be set. In addition, FIG.
In the graph shown in FIG. 3, the platelets plotted in the R1 and R2 gate windows are defined by different platelet populations, and whole blood treated with ribonuclease from normal individuals (treated with 1 mg / ml ribonuclease at room temperature) You can check using the sample. The population of such ribonuclease-treated platelets will be the same as the R1 gate window set by blood samples from patients with the lowest possible myelosuppression following cancer chemotherapy. Note that platelets outside the R1 gate window are considered RNA-rich platelets or reticulated platelets.
【００１２】さらに、癌化学療法後の患者からの全血サ
ンプルを上記と同様の方法で、チアゾールオレンジと反
応させ、フローサイトメトリーに付し、前方散乱（Ｆ
Ｓ）と蛍光（ＦＬ1 ）とを測定した。その結果を図４に
示す。図４から明らかなように、癌化学療法後の患者か
らの全血サンプルにおいては、強度に蛍光染色された種
々のサイズの血小板が観察される。これらは、幼若赤血
球系の網赤血球産生において観察される変化と同様であ
る。これらのプロットから、図４に示したように、ＲＮ
Ａが非常に豊富な血小板、つまり未熟網血小板を示すＲ
３ゲートウィンドウを設定することができる。Further, a whole blood sample from a patient after cancer chemotherapy was reacted with thiazole orange in the same manner as described above, subjected to flow cytometry, and subjected to forward scatter (F
S) and fluorescence (FL 1 ) were measured. FIG. 4 shows the results. As is clear from FIG. 4, in a whole blood sample from a patient after cancer chemotherapy, platelets of various sizes that are strongly fluorescently stained are observed. These are similar to the changes observed in reticulocyte production of the immature erythroid lineage. From these plots, as shown in FIG.
A is very abundant platelets, that is, R indicates immature retinal platelets
Three gate windows can be set.
【００１３】次いで、被験対象である全血サンプルにつ
いて説明する。正常人として健康な志願者１０例、１人
の急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）１例、急性リンパ球性白
血病（ＡＬＬ）５例、脳腫瘍２例、肉腫３例及び乳癌１
例の１２例の癌患者からの合計２２例の末梢血液サンプ
ルを採取した。なお、癌患者の末梢血液サンプルは、重
篤な骨髄機能抑制状態にある患者及び化学療法後の初期
骨髄機能回復過程にある患者からそれぞれ採取した。こ
れらの末梢血液サンプル２００μｌを、それぞれ、室温
で２０分間、Ｋ3 ＥＤＴＡバッファー及び１％パラホル
ムアルデヒド（フィッシャーサイエンテフィック(Fishe
r Scientific,NJ)）固定溶液中で固定した。次いで、サ
ンプルを５分間、５００Ｇで遠心分離することにより洗
浄し、１ｍｌのダルベッコりん酸バッファー塩水ｐＨ
７．２（シグマケミカル会社）と１５％Ｋ3 ＥＤＴＡバ
ッファーの１ｍｌ中に懸濁し、室温暗所で３０分間イン
キュベートした。なお、リボヌクレアーゼ処理を行うサ
ンプルには、室温で２０分間、１ｍｇ／ｍｌのリボヌク
レアーゼ（シグマ社）中でインキュベートした。Next, the whole blood sample to be tested will be described. 10 healthy volunteers, 1 acute myeloid leukemia (AML), 5 acute lymphocytic leukemia (ALL), 2 brain tumors, 3 sarcomas, and 1 breast cancer
A total of 22 peripheral blood samples were collected from 12 of the 12 cancer patients. Peripheral blood samples from cancer patients were collected from patients in severe bone marrow dysfunction and from patients undergoing initial bone marrow function recovery after chemotherapy. 200 μl of each of these peripheral blood samples was respectively added to K 3 EDTA buffer and 1% paraformaldehyde (Fisher Scientific) at room temperature for 20 minutes.
r Scientific, NJ)) fixed in fixation solution. The sample was then washed by centrifugation at 500 G for 5 minutes and 1 ml of Dulbecco's phosphate buffered saline pH
The suspension was suspended in 1 ml of 7.2 (Sigma Chemical Company) and 15% K 3 EDTA buffer, and incubated at room temperature in the dark for 30 minutes. The sample to be treated with ribonuclease was incubated in 1 mg / ml ribonuclease (Sigma) at room temperature for 20 minutes.
【００１４】洗浄、固定した血液サンプルの５μｌを、
ベクトン・ディキンソン社、イムノサイトメトリーシス
テム(Becton Dickinson,Immunocytometry System,San J
ose,CA) から得たチアゾールオレンジ溶液（レチック．
カウント(Reti c.-COUNT))１ｍｌと混合した。なお、細
胞染色とＦＡＣＳｃａｎ分析の間の時間差（+/-3分) に
生じる変化が最小になるように注意されなければならな
い。5 μl of the washed and fixed blood sample is
Becton Dickinson, Immunocytometry System, San J
ose, CA) obtained from thiazole orange solution (Retic.
1 ml of Count (Retic.-COUNT). Care must be taken to minimize the changes that occur in the time difference (+/− 3 minutes) between cell staining and FACScan analysis.
【００１５】次いで、得られたサンプルを、ＦＡＣＳｃ
ａｎ（ベクトン・ディキンソン社）を使用したフローサ
イトメトリに付し、前方散乱と蛍光とを測定した。なお
全てのサインプルにおいて、血小板ゲートウィンドウ中
で５０００点プロットした。Next, the obtained sample was subjected to FACSc
Forward scatter and fluorescence were measured by flow cytometry using an (Becton Dickinson). In all the samples, 5000 points were plotted in the platelet gate window.
【００１６】得られた結果から、 成熟血小板（Ｒ１：％）＝Ｒ１／（Ｒ１＋Ｒ２＋Ｒ３）
×１００、 網血小板＋未熟血小板（Ｒ２＋Ｒ３：％）＝Ｒ２＋Ｒ３
／（Ｒ１＋Ｒ２＋Ｒ３）×１００、 未熟網血小板（Ｒ３：％）＝Ｒ３／（Ｒ１＋Ｒ２＋Ｒ
３）×１００ として計算した。その結果を表１に示す。From the results obtained, mature platelets (R1:%) = R1 / (R1 + R2 + R3)
× 100, reticulated platelets + immature platelets (R2 + R3:%) = R2 + R3
/ (R1 + R2 + R3) × 100, immature reticular platelets (R3:%) = R3 / (R1 + R2 + R)
3) Calculated as x100. Table 1 shows the results.
【００１７】[0017]
【表１】 [Table 1]
【００１８】表１の結果から、正常人の血液サンプルに
おいては、種々のサイズの高蛍光性の未熟網血小板と網
血小板とを含んでいることが分かる。また、大きい血小
板が除かれる従来の方法では、網血小板及び未熟血小板
の大部分が除かれ、未熟血小板の測定（弁別及び計数）
に重大な影響を及ぼすことがわかる。From the results shown in Table 1, it can be seen that a normal human blood sample contains highly fluorescent immature retinal platelets of various sizes and retinal platelets. In the conventional method in which large platelets are removed, most of the reticulated platelets and immature platelets are removed, and the measurement of immature platelets (discrimination and counting)
Has a significant effect on
【００１９】[0019]
【発明の効果】本発明によれば、各段階にある網血小板
及び血小板を検出・測定することができ、ことに、従来
正確に測定できていなかった網血小板画分、従来知られ
ていなかった網血小板よりも高蛍光性を示す未熟網血小
板を、フローサイトメトリによる蛍光及び前方散乱光を
利用することにより、明確かつ正確に測定することがで
きる。よって、例えば、骨髄機能抑制状態にある患者の
骨髄機能の回復を、未熟網血小板画分の測定により診断
あるいはモニターすることができ、ひいては患者の健康
回復を測定することが可能となる。According to the present invention, platelet reticulum and platelets at each stage can be detected and measured. In particular, the reticulum platelet fraction, which could not be measured accurately conventionally, has not been known so far. Immature reticulated platelets showing higher fluorescence than reticulated platelets can be measured clearly and accurately by utilizing the fluorescence obtained by flow cytometry and forward scattered light. Therefore, for example, the recovery of bone marrow function of a patient in a state of bone marrow dysfunction can be diagnosed or monitored by measuring the immature retinal platelet fraction, and the recovery of the patient's health can be measured.
【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]
【図１】本発明の未熟網血小板を含む血小板の検出・測
定方法においてゲートウインドウを画定するために使用
される骨髄機能抑制状態にある癌患者の全血サンプルか
ら得られたフローサイトメトリのデータグラフである。FIG. 1 is flow cytometry data obtained from a whole blood sample of a cancer patient in a myelosuppressed state used to define a gate window in the method for detecting and measuring platelets containing immature reticulated platelets of the present invention. It is a graph.
【図２】本発明の未熟網血小板を含む血小板の検出・測
定方法においてゲートウィンドウを画定するために使用
される別の骨髄機能抑制状態にある癌患者の全血サンプ
ルから得られたフローサイトメトリのデータグラフであ
る。FIG. 2 is a flow cytometry obtained from a whole blood sample of another cancer patient in a myelosuppressed state used to define a gate window in the method for detecting and measuring platelets including immature reticulated platelets of the present invention. It is a data graph of.
【図３】本発明の未熟網血小板を含む血小板の検出・測
定方法においてゲートウィンドウを画定するために使用
される正常人における全血サンプルから得られたフロー
サイトメトリのデータグラフである。FIG. 3 is a data graph of a flow cytometry obtained from a whole blood sample in a normal person used for defining a gate window in the method for detecting and measuring platelets including immature reticulated platelets of the present invention.
【図４】本発明の未熟網血小板を含む血小板の検出・測
定方法においてゲートウィンドウを画定するために使用
される初期骨髄機能抑制状態からの回復過程にある患者
の全血サンプルから得られたフローサイトメトリのデー
タグラフである。FIG. 4 is a flow obtained from a whole blood sample of a patient undergoing a recovery process from an initial myelosuppressive state used to define a gate window in the method for detecting and measuring platelets including immature reticulated platelets of the present invention. It is a data graph of cytometry.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ナディア スチュアート アメリカ カリフォルニア 92373 レッ ドランズ テネシー ストリート 11 エ ーピーティー．110 ──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (72) Inventor Nadia Stuart USA 92373 Redlands Tennessee Street 11 A.P. 110
Claims (7)
(b) 得られたサンプルを、核酸を染色可能な蛍光色素と
反応させ、(c) さらに得られた反応物を、非蛍光の成熟
血小板、蛍光染色された網血小板及び該網血小板よりも
高蛍光染色された未熟網血小板のためにそれぞれ予め設
定されたＲ１、Ｒ２及びＲ３ゲートウィンドウを用い、
かつ蛍光と前方散乱光とを利用するフローサイトメトリ
に付し、(d) 前記Ｒ１ゲートウィンドウで画定された非
蛍光の成熟血小板を測定し、(e) 前記Ｒ２ゲートウィン
ドウで画定された網血小板を測定し、(f) 前記Ｒ３ゲー
トウィンドウで画定された未熟網血小板を測定すること
からなる未熟網血小板を含む血小板の検出・測定方法。(1) fixing and washing a whole blood sample,
(b) reacting the resulting sample with a fluorescent dye capable of staining nucleic acids; (c) further reacting the resulting reaction product with non-fluorescent mature platelets, fluorescently stained reticulated platelets and higher than the reticulated platelets. Using pre-set R1, R2 and R3 gate windows for fluorescently-stained immature reticulated platelets,
And subjecting it to flow cytometry using fluorescence and forward scattered light, (d) measuring non-fluorescent mature platelets defined in the R1 gate window, and (e) measuring reticulated platelets defined in the R2 gate window And (f) measuring the immature retinal platelets defined by the R3 gate window.
状態にある患者からの全血サンプルを利用することによ
り予め設定されたものである請求項１記載の方法。2. The method of claim 1, wherein the R1 gate window is preset by utilizing a whole blood sample from a patient in a myelosuppressed state.
全血サンプルを利用することにより予め設定されたもの
である請求項１又は２記載の方法。3. The method according to claim 1, wherein the R2 gate window is preset by using a whole blood sample from a normal person.
回復過程にある患者からの全血サンプルを利用すること
により予め設定されたものである請求項１〜３のいずれ
かに記載の方法。4. The method according to claim 1, wherein the R3 gate window has been preset by utilizing a whole blood sample from a patient undergoing an early bone marrow function recovery process.
されたものである請求項２〜４記載の方法。5. The method according to claim 2, wherein the whole blood sample has been treated with ribonuclease.
請求項１の方法に付して、骨髄機能の回復状態を観察す
る方法。6. Whole blood of a patient in a myelosuppressed state,
A method for observing a state of recovery of bone marrow function according to the method of claim 1.
サンプルから未熟網血小板画分を測定し、この画分を、
少なくともＲ２ゲートウィンドウで画定された網血小板
画分及びＲ３ゲートウィンドウで画定された未熟網血小
板画分と比較することからなる請求項６記載の骨髄機能
抑の回復状態を観察する方法。 【０００１】7. A method for measuring a fraction of immature retinal platelets from a whole blood sample from a patient undergoing a process of bone marrow function recovery,
7. The method for observing the recovery state of myelosuppression according to claim 6, comprising comparing at least the reticulated platelet fraction defined by the R2 gate window and the immature reticulated platelet fraction defined by the R3 gate window. [0001]
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US87467697A | 1997-06-13 | 1997-06-13 | |
| US08/874676 | 1997-06-13 |
Publications (1)
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|---|---|
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Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP10163734A Pending JPH116831A (en) | 1997-06-13 | 1998-06-11 | Method for detecting and measuring blood platelet including premature rete blood platelet and adoption of the same to clinic |
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| Country | Link |
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