【発明の詳細な説明】
（放射性）標識化ビオチン誘導体類
本発明は、標識化ビオチン化合物類、これらの化合物の製法、これらの化合物
を含む医薬組成物、この組成物の診断および治療のための使用、および放射性医
薬組成物を製造するためのキットに関する。
当分野では、モノクローナル抗体（ＭＡｂ's）などの様々なポリペプチドまた
はタンパク質が高い親和性で腫瘍関連抗原に結合することがよく知られている。
そのため、放射性標識モノクローナル抗体（ＭＡｂ＊'s）が核医学における腫瘍
のインビボ位置決定のためにうまく使用されてきた。ＭＡｂ＊'sの使用における
主な欠点の１つはそれらの血液クリアランスが長引くことである。結果として、
通常、腫瘍／バックグラウンド比は低くなり、正常組織に対する放射線量は高く
なる。
核診断におけるＭＡｂ＊'sの応用において期待される展開はプレターゲッティ
ングアプローチである。この方法では、腫瘍特異的タンパク質（抗体）の投与と
放射能の投与を別の時点で行う。この方法は、アビジン／ビオチンシステムの使
用により可能である。このアビジン／ビオチンプレターゲッティングシステムを
用いる腫瘍位置決定に使用できる２つの異なる基本的プロトコールがあり(Pagan
elli等、Nucl.Med.Commun.12,1991,211-234)、即ち、２段階アプローチと３段階
アプローチである。２段階アプローチでは、インビトロで調製した（ストレプト
）アビジンと腫瘍探索ポリペプチド(tumour-seeking polypeptide)、例えば抗体
とのコンジュゲートをまず注射し、２または３日後放射性標識化ビオチンを注射
する。３段階プレターゲッティングアプローチでは、ビオチニル化ＭＡｂ(第１
段階)、ストレプトアビジン（第２段階）および放射性標識化ビオチン（第３段
階）を連続的に（およそ２４時間間隔で）患者に注射する。この最初の２段階、
並びに２段階アプローチの第１段階により、腫瘍のアビジン化をもたらす。更に
、腫瘍上に局在化せずに血液中を循環したままであるビオチニル化ＭＡｂ'sは、
過剰のアビジンにより大集塊される。これらの高分子量のアビジン／ＭＡｂ添加
物は、迅速に肝臓に取り込まれ、異化される。第３段階は、放射性標識化ビオチ
ン
のインビボ投与を含む。非腫瘍結合ビオチン誘導体の迅速な血液クリアランスの
ため、良好な腫瘍／バックグラウンド比が迅速に到達されると期待される。
腫瘍の可視化のため、放射性核種、好ましくは金属放射性核種で、または常磁
性金属イオンで標識したビオチンが必要である。ビオチンは安定な金属結合に適
した官能基を欠くため、適切な二官能性リガンドをビオチンに結合させて、所望
の金属原子で標識できるようにしなければならない。放射性金属標識化ビオチン
誘導体は、文献、例えば、米国特許第5,283,342号、WO93/25240、およびKochお
zi等（J.Nucl.Med.32,1991,920-Proc.39th.Ann.Mt.,no.403）は、テクネチウム
−９９ｍで標識した１２種の異なるビオチン誘導体類を評価した。これらの著者
らの結論は、調査したＴc−９９ｍ標識化ビオチン誘導体類はインビボで不安定
性を示し、そのため、高レベルのＴc−９９ｍが正常組織中に見られるというこ
とである。
本発明の目的は、ビオチン自身と比較して、アビジンに対し高い親和性を持ち
、かつインビボで安定性の向上、即ち、酵素的破壊に対する抵抗性の向上を示し
、診断および治療におけるその適切な使用を可能にする、標識化ビオチン化合物
を提供することである。
この目的は、ある種の標識化ビオチン化合物により達成でき、該ビオチン化合
物は、一般式、
式中：
ｎは１または２であり、
Ｒは金属原子をキレート化するためのキレート化基であり、
ＳｐはＲからＮＨを隔てる少なくとも４原子を有するスペーシング基である、
で表され、かつ
該ビオチン化合物は、（ａ）放射性同位元素、99mＴc、203Ｐb、66Ｇa、67Ｇa、68
Ｇa、72Ａs、111Ｉn、113mＩn、114mＩn、97Ｒu、62Ｃu、64Ｃu、52Ｆe、52m
Ｍn、51Ｃr、186Ｒe、188Ｒe、77Ａs、90Ｙ、67Ｃu、169Ｅr、117mＳn、121Ｓn
、127Ｔe、142Ｐr、143Ｐr、198Ａu、199Ａu、149Ｔb、161Ｔb、109Ｐd、165Ｄy
、149Ｐm、151Ｐm、153Ｓm、157Ｇd、166Ｈo、172Ｔm、169Ｙb、175Ｙb、177Ｌu
、105Ｒh、および111Ａgからなる群、または（ｂ）常磁性金属原子、Ｃr、Ｍn、
Ｆe、Ｃo、Ｎi、Ｃu、Ｐr、Ｎd、Ｓm、Ｙb、Ｇd、Ｔb、Ｄy、ＨoおよびＥrから
なる群、から選択される金属原子で標識されており、該金属原子は、該キレート
化基によりビオチン化合物に結合しているものである。
上記定義のスペーシング基Ｓｐは、好ましくは一般式、
式中、Ａが式
-ＮＨ-(ＣＨ2)m-または-ＮＨ-Ｃ(=Ｘ)-(ＣＨ2)x-Ｙ-(ＣＨ2)m-Ｃ(ＣＯ2Ｈ)Ｈ-
式中、ＸおよびＹはそれぞれ独立して０または１であり；
ｍは１から４の整数であり；
ｐは０から４の整数であり；
ＸはＯまたはＳであり；そして、
ＹはＮＨ、ＣＯ、またはＳである、
のビラジカルである、
の基である。
上記キレート化基Ｒは、好ましくは、ＮtＰqＳ(4-t-q)四座キレート化剤、式
中、ｔ＋ｑ＝２〜４である、からなる群、またはエチレンジアミンテトラ酢酸(
ＥＤＴＡ)、ジエチレントリアミンペンタ酢酸(ＤＴＰＡ)、シクロヘキシル１,２
−ジアミンテトラ酢酸(ＣＤＴＡ)、エチレングリコール−０,０'−ビス(２−ア
ミノエチル)−Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトラ酢酸(ＥＧＴＡ)、Ｎ,Ｎ−ビス(ヒドロキ
シベンジル)−エチレンジアミン−Ｎ,Ｎ'−ジ酢酸(ＨＢＥＤ)、トリエチレンテ
トラアミンヘキサ酢酸(ＴＴＨＡ)、１,４,７,１０−テトラアザシクロドデカン
−Ｎ,Ｎ',Ｎ",Ｎ'"−トリおよびテトラ酢酸(ＤＯ３ＡおよびＤＯＴＡ)、１,４,
７,１０−テトラアザシクロトリデカン−Ｎ,Ｎ',Ｎ",Ｎ'"−トリおよびテトラ酢
酸(ＴＲＩ３ＡおよびＴＲＩＴＡ)、ヒドロキシエチルジアミントリ酢酸(ＨＥＤ
ＴＡ)、１,４,８,１１−テトラ−アザシクロテトラデカン−Ｎ,Ｎ',Ｎ",Ｎ'"−
テトラ酢酸(ＴＥＴＡ)、置換ＤＴＰＡ、置換ＥＤＴＡから、またはデフェロキサ
ミン（デフェリオキサミン）から、または一般式、
式中、Ｒ1は分枝状または非分枝状の、所望により置換された炭化水素基であり
、
これは、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１またはそれ以上のヘテロ原子、
および／または１またはそれ以上のＮＨ基を間に挟んでいてもよく、Ｑはペプチ
ドのアミノ基と反応する能力があり、好ましくはカルボニル、カルビミドイル、
Ｎ−(Ｃ1−Ｃ6)アルキルカルビミドイル、Ｎ−ヒドロキシカルビミドイルおよび
Ｎ−(Ｃ1−Ｃ6)アルコキシカルビミドイルからなる群から選択される基である、
の化合物から、誘導される基から選択される。
ＮtＰqＳ(4-t-q)四座キレート化剤の適切な例は、
式中：
Ｒ6−Ｒ20はそれぞれ個々に水素原子または(Ｃ1−Ｃ4)アルキル基であり、た
だし、Ｃ6ないしＣ9の少なくとも１つは記号Ｙであり；
Ｒ21は水素原子またはＣＯ2(Ｃ1−Ｃ4)アルキル基であり；
Ｒ22およびＲ23はそれぞれ個々に(Ｃ1−Ｃ4)アルキルカルボニル、ベンゾイル
またはベンジル基であり；
ｖは０または１であり；
ｓは２または３であり；
Ｒ24はＣＨ2ＣＯＯＨまたはその官能性誘導体であり；
Ａは、所望ならばＣＯ2アルキル、ここでアルキル基は１ないし４炭素原子を
有する、で置換された(Ｃ1−Ｃ4)アルキレンであり；
ＧはＮＨまたはＳであり；
Ｙはスペーシング基と結合する能力のある一価結合または官能基であり；そし
て、
ＺはＳまたはＯである、
から選択される。
Ｙが官能基であるならば、Ｙは好ましくは、イソシアナト、イソチオシアナト
、ホルミル、Ｏ−ハロニトロフェニル、ジアゾニウム、エポキシ、トリクロロ−
Ｓ−トリアジニル、エチレンイミノ、クロロスルホニル、アルコキシカルビミド
イル、（置換または非置換）アルキルカルボニルオキシカルボニル、アルキルカ
ルボニルイミダゾリル、スクシンイミド−オキシカルボニルを含み、好ましくは
、その基を(Ｃ1−Ｃ10)炭化水素ビラジカルに結合させる。炭化水素ビラジカル
の適切な例は、ベンゼン、(Ｃ1−Ｃ6)アルカン、(Ｃ2−Ｃ6)アルケン、および(
Ｃ1−Ｃ4)アルキルベンゼンから誘導されるビラジカルである。
一般式IIIの適切なキレート化剤の例は、国際特許出願ＷＯ８９／０７４５６
に記載されており、例えば、非置換または置換２−イミノチオランおよび２−イ
ミノチアシクロヘキサン、特に２−イミノ−４−メルカプトメチルチオランであ
る。上記標識化ビオチン化合物は、インビボ適用が期待できる多くの適切なモデ
ル実験にて試験されてきた。これらの実験は、実施例に記載している。これらの
実施例の結果から、本発明の標識化ビオチン化合物は、それらを診断および治療
目的に適合せしめる特性を有することが明らかである。診断目的に適した原子で
標識した場合、標識化ビオチン化合物は、投与後充分に長く無傷のままであり、
バックグラウンドの混乱を表すことなく、標的腫瘍のイメージングを可能にする
。治療に適した放射性同位元素で標識した場合、かかる標識化ビオチン化合物は
、多くの悪性腫瘍の処置に期待できる治療剤である。
本発明の新規の金属標識化ビオチン化合物は、関連化合物についてそれ自体知
られている方法にて製造できる。このために、ビオチン分子を前記のような望ま
しいキレート化剤、例えば、ＮtＰqＳ(4-t-q)四座キレート化剤またはＥＤＴＡ
で誘導体化する。
一般式
式中：
ｎは１または２であり、
Ｒは金属原子をキレート化するためのキレート化基であり、そして、
ＳｐはＲからＮＨを隔てる少なくとも４原子を有するスペーシング基である；
を有するＤＴＰＡなどは、上記のスペーシング基の導入後、その化合物が得られ
た後、塩の形態または比較的弱いキレート化剤に結合させたキレートの形態の前
記定義の金属と反応させて、錯体を形成させる。
所望の金属の塩またはキレートの適切な例は：111Ｉn−シトレートおよびアセ
テート、99mＴc−タートレート等である。錯体形成反応は、一般に、簡単な方法
でまた穏やかな条件で実施できる。
本発明はまた、上記定義の一般式Ｉのビオチン化合物に関し、この化合物は、
標識化ビオチン化合物を製造する上記方法に使用できる。
本発明は更に、医薬的に許容できる担体物質および所望ならば少なくとも１種
の医薬的に許容できるアジュバントに加えて、有効成分として前記標識化ビオチ
ン化合物を含む医薬組成物に関する。
本発明はまた、温血生物の体内の腫瘍を検出および位置決定する方法に関し、
これは、（ｉ）該腫瘍に対する選択的親和性を有するポリペプチドとコンジュゲ
ートさせた(ストレプト)アビジンを含む組成物を該生物に投与し、（ii）その上
、該腫瘍をアビジン化後、前記定義の標識化ビオチン化合物で（ａ）99mＴc、20 3
Ｐb、67Ｇa、68Ｇa、72Ａs、111Ｉn、113mＩn、97Ｒu、62Ｃu、64Ｃu、52Ｆe、52m
Ｍn、および51Ｃrからなる群から選択される放射性金属同位元素、または（
ｂ）Ｃr、Ｍn、Ｆe、Ｃo、Ｎi、Ｃu、Ｐr、Ｎd、Ｓm、Ｙb、Ｇd、Ｔb、Ｄy、Ｈo
およびＥrからなる群から選択される常磁性金属原子で標識されている化合物を
外
部イメージングに十分な量で含む組成物を該生物に投与し、そして、（iii）最
後に、該生物を外部イメージングにかけ、バックグラウンド活性と比して該生物
体内の標的化部位を決定することからなる。
上記２段階プロトコールの代わりに、上記の３段階プレターゲッティング法を
使用してもよい。この方法では、次のプロトコール：(i−a)該腫瘍に対する選択
的親和性を有するビオチニル化ポリペプチドを含む組成物を該生物に投与し、(i
−b)次いで(ストレプト)アビジン組成物を投与する、を使用し、この両段階を上
記段階（ｉ）の代わりに使用する。
本発明はまた、温血生物の体内の腫瘍を手術中に検出および位置決定する方法
に関し、これは、（ｉ）該腫瘍に対する選択的親和性を有するポリペプチドとコ
ンジュゲートさせた(ストレプト)アビジンを含む組成物を該生物に投与し、（ii
）その上、該腫瘍をアビジン化後、前記定義の標識化ビオチン化合物で161Ｔbで
標識されている化合物をガンマ検出プローブによる検出に十分な量で含む組成物
を該生物に投与し、そして、（iii）最後に、有効物質を該腫瘍に結合させて該
腫瘍に取り込ませた後、そして放射能の血液クリアランス後、ガンマ検出プロー
ブを用いることにより、該生物を該生物体内の問題領域において放射性免疫検出
技術にかけることからなる。
上記放射性同位元素、即ち、161Ｔbは、ガンマ検出プローブにより患者体内の
問題の組織を手術中に検出および位置決定できる放射能誘導外科手術の技術にお
けるかかる標識化ペプチド化合物の使用を可能にする。外科医は、手術中このプ
ローブを使用して、低エネルギーガンマ光子エミッターである該放射性同位元素
で標識された化合物の取り込みが起こった病片をみつけることができる。上記２
段階プロトコールの代わりに、３段階プレターゲッティング法を前記のように使
用できることは、明らかであろう。
本発明のビオチン化合物は、それらがかかる目的に適した同位元素で放射性標
識されているならば、腫瘍の治療的処置に使用できる。そこで、本発明は更に、
温血生物体内の腫瘍の治療的処置法に関し、これは、（ｉ）該腫瘍に対する選択
的親和性を有するポリペプチドとコンジュゲートさせた(ストレプト)アビジン
を含む組成物を該生物に投与し、（ii）その上、該腫瘍をアビジン化後、前記定
義の標識化ビオチン化合物で、114mＩn、186Ｒe、188Ｒe、77Ａs、90Ｙ、66Ｇa
、67Ｃu、169Ｅr、117mＳn、121Ｓn、127Ｔe、142Ｐr、143Ｐr、198Ａu、199Ａu
、149Ｔb、161Ｔb、109Ｐd、165Ｄy、149Ｐm、151Ｐm、153Ｓm、157Ｇd、159Ｇd
、166Ｈo、172Ｔm、169Ｙb、175Ｙb、177Ｌu、105Ｒh、および111Ａgから選択さ
れる金属同位元素で標識されている化合物を、腫瘍と戦うかまたは腫瘍を制御す
るのに有効な量で含む組成物を該生物に投与する、ことからなる。
上記２段階プロトコールの代わりに、３段階プレターゲッティング法を上記の
ように使用できることは明らかであろう。
放射性標識化ビオチン化合物を診断剤として使用する場合、放射性標識化化合
物の貯蔵寿命がしばしば乏しいことおよび／または使用される放射性核種の半減
期が短いことから、使用者の自由に組成物の使用準備を整えるのは不可能である
ことが頻繁にある。このような場合、使用者は臨床病院または実験室において放
射性核種による標識反応を実施するであろう。そのためには、様々な反応成分を
いわゆる“キット”の形態で使用者に提供する。所望の反応を実施するのに必要
な操作は、使用者が自分の自由になる設備を用いてキットから放射性標識化組成
物を調製できるようにできるだけ簡単であるべきであることは明らかである。よ
って、本発明は、放射性医薬組成物を調製するためのキットにも関する。
本発明に従うかかるキットは、（ａ）腫瘍に対する選択的親和性を有するポリ
ペプチドとコンジュゲートさせた(ストレプト)アビジンを含む組成物、（ｂ）上
記に示した一般式Ｉ、式中の記号は上記の意味を有する、のビオチン化合物で、
所望ならば、その化合物に不活性の医薬的に許容できる担体および／または調剤
用成分および／またはアジュバントを加えたもの、（ｃ）203Ｐb、66Ｇa、67Ｇa
、68Ｇa、72Ａs、111Ｉn、113mＩn、114mＩn、97Ｒu、62Ｃu、99mＴc、186Ｒe、188
Ｒe、64Ｃu、52Ｆe、52mＭn、51Ｃr、77Ａs、90Ｙ、67Ｃu、169Ｅr、117mＳn
、121Ｓn、127Ｔe、142Ｐr、143Ｐr、198Ａu、199Ａu、149Ｔb、161Ｔb、109Ｐd
、165Ｄy、149Ｐm、151Ｐm、153Ｓm、157Ｇd、166Ｈo、172Ｔm、169Ｙb、175Ｙb
、177Ｌu、105Ｒh、および111Ａgから選択される金属同位元素の塩またはキレー
ト
の溶液、および（ｄ）キット中に存在する成分を反応させる処方を含む使用説明
書を含むことができる。好ましくは、上記キットの成分として使用されるビオチ
ン化合物は、前記定義のスペーシング基Ｓｐおよびキレート化剤Ｒにより修飾し
ておく。得られたビオチン化合物は、簡単な方法で放射性核種をしっかりと結合
させるのに便利である。ビオチン分子を修飾するのに適したキレート化剤は、前
記に詳しく記載している。前記した化合物類のようなＮtＰqＳ(4-t-q)四座キレ
ート化剤またはＮ−含有ジ−またはポリ酢酸またはその誘導体類は、Ｉn−１１
１およびＩn−１１３mなどの様々な金属放射性核種を結合させるのに顕著に適し
ている。使用者に供給されるキットもまた、上記（ａ）および（ｂ）に定義した
成分を使用説明書と共に含むことができ、その一方で、上記（ｃ）に定義した放
射性核種の塩またはキレートの溶液は、限られた貯蔵寿命を有しており、別個に
使用者の自由に任せることができる。
上記キットは、２段階プロトコールでの使用を予定している。もし、そうでは
なく、前記の３段階プレターゲッティング法を使用するつもりならば、次のキッ
ト：（a−i）該腫瘍に対する選択的親和性を有するビオチニル化ポリペプチドを
含む組成物、および（a−ii）(ストレプト)アビジンを含む組成物；が適してお
り、両方の組成物は、上記組成物（ａ）の代わりに使用する。
キットがＴc−９９m、Ｒe−１８６、またはＲe−１８８で標識した放射性医薬
組成物の調製に役立つ場合、本発明に従うようなキットは、上記（ａ）および（
ｂ）に定義した成分に加えて、（ｃ）還元剤、および所望ならば、キレート化剤
および（ｄ）キットの成分を過テクネテート溶液の形態のＴc−９９mと、または
過レネート溶液の形態のＲe−１８６またはＲe−１８８と反応させる処方を含む
使用説明書を含むこともできる。所望ならば、キットの成分のいくらかを、それ
らが融和性であるならば合わせてもよい。使用者は、適切なジェネレーターから
過テクネテートまたは過レネート溶液を簡単に得ることができる。
放射性核種がキット自体に存在する場合、上記一般式Ｉのビオチン化合物との
錯体形成反応は、中性または緩衝化媒体中で成分を合わせ、それらを反応させる
ことにより、簡単に引き起こすことができる。このためには、その放射性核種を
、
前記定義の比較的弱いキレート化剤に結合させたキレートの形態で該ビオチン化
合物に与えてもよい。
キットが前記定義のビオチン化合物を含み、Ｔc−９９m、Ｒe−１８６、また
はＲe−１８８で標識した放射性医薬組成物の調製を意図する場合、放射性核種
は、好ましくは過テクネテートまたは過レネート溶液の形態で別個に加えられる
。その場合、キットは適切な還元剤および所望ならばキレート化剤を含み、前者
は過テクネテートまたは過レネートを還元するためのものである。還元剤として
、例えば、ジチオナイトまたは金属還元剤が使用できる。上記キット用の還元剤
として、好ましくは金属還元剤、例えば、Ｓn(II)、Ｃe(III)、Ｆe(II)、Ｃu(Ｉ
)、Ｔi(III)またはＳb(III)が使用され、Ｓn(II)はすばらしく適している。適切
なＳn(II)−化合物の例は、ＳnＣl2、Ｓn(II)−タートレート、Ｓn(II)−ホスホ
ネートまたは−ピロホスフェート、およびＳn(II)−グルコヘプトネートである
。上記キットの修飾ビオチン構成成分、即ち、好ましくはビオチン化合物は、溶
液として、例えば、生理的食塩水溶液の形態で、またはいずれかの緩衝溶液の形
態で供給でき、または、乾燥状態、例えば、凍結乾燥状態で与えてもよい。注射
液用成分として使用する場合、それは滅菌状態であるべきであり、構成成分が乾
燥状態である場合、使用者は滅菌生理食塩水溶液を溶媒として使用すべきである
。所望ならば、上記構成成分は、適切な安定化剤、例えば、アスコルビン酸、ゲ
ンチシン酸またはそれらの酸の塩類を用いて常法で安定化させてもよく、または
、その他の補助剤、例えば、グルコース、ラクトース、マンニトールおよび同等
物などの増量剤を含んでいてもよい。
本発明は次の具体的な実施例を参照して、より詳細に説明される。
実施例１
６−(Ｎ−(ビオチニルスルホキシド)−ｐ−アミノベンジル)−１,４,８,１１
−テトラアザウンデカン(６)（図式１）の合成
図式１。ビオチンスルホキシド−Ｎ4
ビオチンスルホキシドは、Melville（D.B.Melville,J.Biol.Chem.,1954,208,4
95）に従い合成する。スルホキシドは、２つの異性体形態：α−(＋)−ビオチン
スルホキシドおよびβ−(−)−ビオチンスルホキシドで存在する（図式２）。
図式２。ビオチンスルホキシドの２つの異性体形態。
これらは、分別結晶化および／またはシリカゲルクロマトグラフィーにより分
離できる。
６−(ｐ−ニトロ−ベンジル)−１,４,８,１１−テトラアザ−５,７−ジオキソ
ウンデカン(１)
ｐ−ニトロベンジルマロン酸ジエチルエステル（G.Ruser等、Bioconj.Chem.19
90,2,345）４ｍＭol（１.０７g）をメタノール４０mlに懸濁し、エチレンジアミ
ン５.３ml（８０mmol）を加え、混合物を還流下で１２時間加熱する。溶媒およ
び過剰のエチレンジアミンを蒸発させ、粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィ
ー（ＣＨＣl3／ＭeＯＨ／ＮＨ3(２５％)＝５：５：１、Ｒf＝０.３）により精製
した。収量１.４g。
ＭＳ（ＦＡＢ）m／z（相対強度）：３２４（ＭＨ+、１００）；1Ｈ−ＮＭＲ(３
００ＭＨz；ｄ6−ＤＭＳＯ)：８.１４（ｄ，２Ｈ，ｏ-Ａr-Ｈ-），８.０４（ｔ,
２Ｈ，ＣＨ2-ＮＨ-ＣＯ），７.４６（ｄ，２Ｈ，ｍ-Ａr-Ｈ），３.４５（ｔ，１
Ｈ，ＣＨ-ＣＨ2-Ａr），３.１５（ｄ，２Ｈ，ＣＨ 2-Ａr），３.０５（ｍ，４Ｈ,
ＣＨ 2-ＮＨ-），２.５０（ｍ，４Ｈ，ＣＨ-ＮＨ2）；13Ｃ−ＮＭＲ(９０ＭＨz，
ｄ6−ＤＭＳＯ)：１６８.２５（２Ｃ，Ｃ=Ｏ），１４７.７１（１Ｃ，Ｃ(Ａr)-
ＮＯ2），１４５.８６（１Ｃ，ＣＨ2-Ｃ(Ａr)），１２９.９５（２Ｃ，Ａr），
１２３.０６（２Ｃ，Ａr），５４.００（１Ｃ，ＣＨ-ＣＨ2-Ａr），４１.９３（
２Ｃ，ＣＨ2-ＮＨ(ＣＯ)），４０.８６（２Ｃ，ＣＨ2-ＮＨ2），３４.４８（１
Ｃ，ＣＨ2-Ａr）。
元素分析はＣ14Ｈ21Ｎ5Ｏ4に相当する。
６−(ｐ−ニトロベンジル)−１,４,８,１１−テトラアザウンデカン(２)
粗製の（１）（４８０mg、１.４８mmol）をＲＴで１Ｍ ＢＨ3／ＴＨＦ溶液（
３０ml、２０当量）と反応させ、反応混合物を６０時間還流させる。過剰のＢＨ3
を分解するために、予め０℃まで冷却しておいた反応混合物にＭeＯＨを慎重に
滴下添加する。ＭeＯＨを真空で蒸発させ、残渣をＥtＯＨに懸濁し、数分間超音
波処理する。非溶解部分を濾去し、ＨＣlガスを濾液に２０分間導入する。形成
された沈殿を集め、更にカラムクロマトグラフィー（ＳiＯ2；ＣＨＣl3／ＭeＯ
Ｈ／２５％ ＮＨ3 ５／５／２）により精製する。得られた精製アミンをＥtＯＨ
に溶解し、ＨＣlガスをこの溶液に通すことにより、対応する塩酸塩が白色固体
として得られる(４６０mg)。あるいは、クロマトグラフィーにより前以て精製せ
ずに、沈殿をＨＣlガス飽和ＭeＯＨから直接再結晶する。
収率＝７０％；Ｒf：０.３６（ＳiＯ2；ＣＨＣl3／ＭeＯＨ／２５％ ＮＨ3 ５／
５／２）；ＭＳ（ＦＡＢ）m／z（相対強度）：２９６（ＭＨ+、１００）；1Ｈ−
ＮＭＲ(３６０ＭＨz；ｄ6−ＤＭＳＯ)（塩酸塩）：８.２１（ｄ，２Ｈ，Ｏ-Ａr-
ＮＯ2-），７.６８（ｄ，２Ｈ，ｍ-Ａr-ＮＯ2），３.５０−２.６４（ｍ，１５
Ｈ）；13Ｃ−ＮＭＲ(９０ＭＨz，ｄ6−ＤＭＳＯ)：１４６.２９（２Ｃ，Ｃ(Ａr)
-ＮＯ2，ＣＨ2-Ａr），１３０.４６（２Ｃ，Ａr），１２３.３６（２Ｃ，Ａr）,
４７.５６，４４.６８，３５.０４，３４.９７。
元素分析はＣ14Ｃl4Ｈ29Ｎ5Ｏ2に一致する。
Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ"'−テトラブチルオキシカルボニル−６−(ｐ−ニトロベンジル)
−１,４,８,１１−テトラアザウンデカン(３)
（２）１.５g（３.５mＭol）をジオキサン５mlに懸濁し、１Ｎ ＮaＯＨをｐＨ
１２まで加える。氷温で、ジオキサン３０mlおよび１Ｎ ＮaＯＨ４０ml中ジ−te
rt−ブチル−ジカーボネート４.５ml（２１mＭol／６当量）を加える。混合物を
ＲＴで一晩撹拌する。この混合物にジエチルエーテル１００mlおよびＨ2Ｏ５０m
lを加える。エーテル層を分離し、水３０mlで４回抽出し、Ｎa2ＳＯ4で乾燥させ
、蒸発濃縮する。得られた油状物は結晶化できないが、ＦＡＢ−ＭＳ(m／z：６
９６)を確認する構造を示し、ＴＬＣ（シリカゲル、Ｒf＝０.５、酢酸エチルエ
ステル：ヘキサン＝９：１）では純粋である。収量：２.２g、９０％。ＦＡＢ−
ＭＳ：m／z：６９６。1Ｈ−ＮＭＲおよびＩＲはその構造と一致する。
Ｎ,Ｎ',Ｎ",Ｎ'"−テトラブチルオキシカルボニル−６−(ｐ−アミノベンジル
)−１,４,８,１１−テトラアザウンデカン(４)
（３）１.３g（１.９mmol）を８０％ＭeＯＨ ４０mlに溶解し、Ｐd／Ｃ（１０
％）１５０mgを加え、室温で３時間水素化を実施する。触媒を濾過により除去し
、混合物を蒸発濃縮し、純粋な生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（シリカ
ゲル６０、３２cm×２cm、溶離液：ヘキサン：酢酸エチルエステル＝２：３）に
より得る。収量０.５３g（４３％）。この化合物はＴＬＣおよびＨＰＬＣでは純
粋であり、ＦＡＢ−ＭＳ（m／z＝６６６）および1Ｈ−ＮＭＲにより特性化する
。
６−(Ｎ−(ビオチニルスルホキシド)−ｐ−アミノ−ベンジル)−Ｎ,Ｎ",Ｎ'"
−テトラブチルオキシカルボニル−１,４,８,１１−テトラアザウンデカン(５)
α−(＋)−ビオチンスルホキシド３４.４mgをＤＭＦ７００μlに溶解し、ＨＡ
ＴＵ（０−(７−アザベンゾチアゾル−１−イル)−１,１,３,３−テトラメチル
ウロニウムヘキサフルオロホスフェート）４２.５mgおよびジイソプロピルエチ
間続ける。反応混合物を酢酸エチル２mlおよび５％ＮaＨＣＯ3溶液２mlに加える
。有機層を炭酸水素ナトリウムおよび飽和塩化ナトリウム溶液で２回洗浄し、硫
酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発濃縮して、ジエチルエーテル／イソプロピルエー
テル／ヘキサンから結晶化する。収量：９６mg（８０％）。生成物はクロマトグ
ラフィーでは純粋であり、ＦＡＢ−ＭＳ（m／z＝９０８）により特性化する。
６−(Ｎ−ビオチニルスルホキシド)−ｐ−アミノベンジル)−１,４,８,１１−
テトラアザウンデカン(６)（図式１）
（５）９６mgをトリフルオロ酢酸：チオアニソール：水＝９６：２：２ ２ml
に溶解し、室温で２時間放置する。その後、ジエチルエーテル２mlを加えて生成
物を沈殿させ、高真空下で乾燥させる。収量：９６mg。少量の不純物および残っ
たチオアニソールを除去するために、化合物をＣ１８−ＨＰＬＣにより精製する
。ＦＡＢ−ＭＳ：m／z＝５０８。
実施例II
（６）の99mＴc−標識
実施例Ｉに記載のようにして得られた（６）５μgをクエン酸ナトリウム二水
和物（５mg）の水溶液３００μlに溶解する。この溶液に、99mＴcＯ4 -ジェネレ
ーター溶出液２００〜４００μl（１００００〜２０００ＭＢq）および新たに準
備したＮ2−充填ＳnＣl2・２Ｈ2Ｏ溶液（１０mg／１０ml ０.１Ｍ ＨＣl）２０
μl（２０μg）を加える。ＮaＯＨを用いてｐＨを１０に調整する。室温で３０
分間インキュベーションする。錯体形成収率は９７％以上である。Hamilton PRP
-1（１０μm、４.１×１５０mm）カラムおよび１０mＭリン酸緩衝液（ｐＨ７、
０〜５分）１００％、続いて直線勾配（５〜１０分；２０％ＭeＣＮ／８０％リ
ン酸緩衝液）でのアイソクラチック溶出、および１５分までのアイソクラチック
溶出により、99mＴc錯体が１０'０４"で溶出する（流速：１.５ml／分）。同じ
条件で[99mＴ
c]６−(ｐ−アミノベンジル)−１,４,８,１１−テトラアザウンデカンは８'４５
"で溶出する。錯体は、クエン酸およびリン酸緩衝液中で少なくとも１０時間安
定である。
実施例III
[99mＴc]−(６)のアビジンへの結合
実施例IIに記載のようにして得られた[99mＴc]−(６)を、リン酸緩衝液（ｐＨ
８.９）１.５mlで３回予め調整しておいたビーズ化アガロースに結合させたアビ
ジンのカラムにのせる。カラムをリン酸緩衝液１.５mlで５回洗浄する。カラム
上に保持された活性は９７±３％（ｎ＝３）である。カラムを冷ビオチンで予め
飽和させておけば、２％以下の活性が保持される。そこで、アビジンへの結合は
特異的であると結論する。
実施例IV
ヒト血清中の[99mＴc]−(６)の安定性
ビオチニダーゼは、ビオチンアミドアミドヒドロラーゼとして機能する、様々
な器官およびヒト血清中で見い出された酵素であり、例えば、これは、(Ｎ−(ｄ
−ビオチニル)−ｐ−アミノ安息香酸およびビオシチンを加水分解する。新鮮な
ヒト血清におけるアミド結合の安定性は研究されている。実施例IIに従い得られ
た無傷の[99mＴc]−(６)の量は、４時間以内のインキュベーションで、約１５±
２％まで減少し、これは、対応するビオチンとのコンジュゲートよりもかなり優
れたものである。99mＴc−標識ビオチンコンジュゲートの場合のシンチグラフィ
ーの最適時間が注射後２時間以内であるという事実を考慮すると、ヒト血清中の
[99mＴc]−(６)の安定性は、ヒトの研究に適している。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
(Radioactive) labeled biotin derivatives
The present invention relates to labeled biotin compounds, a method for producing these compounds,
Pharmaceutical composition containing the same, use of the composition for diagnosis and treatment, and radionuclide
The present invention relates to a kit for producing a pharmaceutical composition.
In the art, various polypeptides such as monoclonal antibodies (MAb's) or
It is well known that proteins bind to tumor-associated antigens with high affinity.
Therefore, radiolabeled monoclonal antibodies (MAb * 's) are
Has been successfully used for in vivo localization of In the use of MAb * 's
One of the major disadvantages is their prolonged blood clearance. as a result,
Usually the tumor / background ratio is low and the radiation dose to normal tissue is high
Become.
The potential development of MAb * 's applications in nuclear diagnostics is Pretargetty
Approach. In this method, administration of tumor-specific protein (antibody)
The administration of the radioactivity takes place at another time. This method uses the avidin / biotin system.
It is possible depending on the application. This avidin / biotin pretargeting system
There are two different basic protocols that can be used for tumor localization (Pagan
elli et al., Nucl. Med. Commun. 12, 1991, 211-234), a two-step approach and a three-step approach.
Approach. In a two-step approach, the in vitro prepared (strept)
) Avidin and tumor-seeking polypeptides, eg antibodies
Conjugate first and then radiolabeled biotin 2 or 3 days later
I do. In the three-step pre-targeting approach, the biotinylated MAb (first
Step), streptavidin (second step) and radiolabeled biotin (third step)
Floor) is injected into the patient continuously (at approximately 24 hour intervals). The first two stages,
As well as the first step of the two-step approach results in avidinization of the tumor. Further
Biotinylated MAbs, which remain circulating in the blood without being localized on the tumor,
Large agglomeration due to excess avidin. Addition of these high molecular weight avidin / MAb
Things are rapidly taken up by the liver and catabolized. The third step is radiolabeled biotin
N
In vivo administration. Rapid blood clearance of non-tumor-bound biotin derivatives
Therefore, a good tumor / background ratio is expected to be reached quickly.
Radionuclide, preferably metal radionuclide, or paramagnetic for tumor visualization
Biotin labeled with a neutral metal ion is required. Biotin is suitable for stable metal binding
A suitable bifunctional ligand is attached to biotin,
Must be capable of being labeled with a metal atom. Radiotin-labeled biotin
Derivatives are described in the literature, for example, U.S. Patent No. 5,283,342, WO 93/25240, and Koch and
zi et al. (J. Nucl. Med. 32, 1991, 920-Proc. 39th. Ann. Mt., no. 403)
Twelve different biotin derivatives labeled with -99m were evaluated. These authors
They conclude that the investigated Tc-99m labeled biotin derivatives are unstable in vivo.
And that high levels of Tc-99m are found in normal tissues.
And
The purpose of the present invention is to have a higher affinity for avidin compared to biotin itself.
And improved stability in vivo, ie, increased resistance to enzymatic destruction
Biotin compounds that enable their proper use in diagnosis and therapy
It is to provide.
This objective can be achieved with certain labeled biotin compounds,
The thing is a general formula,
Where:
n is 1 or 2,
R is a chelating group for chelating a metal atom,
Sp is a spacing group having at least 4 atoms separating NH from R,
Represented by, and
The biotin compound comprises: (a) a radioisotope;99mTc,203Pb,66Ga,67Ga,68
Ga,72As,111In,113mIn,114mIn,97Ru,62Cu,64Cu,52Fe,52m
Mn,51Cr,186Re,188Re,77As,90Y,67Cu,169Er,117mSn,121Sn
,127Te,142Pr,143Pr,198Au,199Au,149Tb,161Tb,109Pd,165Dy
,149Pm,151Pm,153Sm,157Gd,166Ho,172Tm,169Yb,175Yb,177Lu
,105Rh, and111A group consisting of Ag, or (b) a paramagnetic metal atom, Cr, Mn,
From Fe, Co, Ni, Cu, Pr, Nd, Sm, Yb, Gd, Tb, Dy, Ho and Er
A metal atom selected from the group consisting of:
It is bonded to a biotin compound by a chemical group.
The spacing group Sp as defined above preferably has the general formula:
Where A is the formula
-NH- (CHTwo)m-Or -NH-C (= X)-(CHTwo)x-Y- (CHTwo)m-C (COTwoH) H-
Wherein X and Y are each independently 0 or 1;
m is an integer from 1 to 4;
p is an integer from 0 to 4;
X is O or S; and
Y is NH, CO, or S;
Is a biradical,
It is a group of.
The chelating group R is preferably NtPqS(4-tq)Tetradentate chelating agent, formula
Wherein t + q = 2 to 4, or ethylenediaminetetraacetic acid (
EDTA), diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA), cyclohexyl 1,2
-Diaminetetraacetic acid (CDTA), ethylene glycol-0,0'-bis (2-A
(Minoethyl) -N, N, N ', N'-tetraacetic acid (EGTA), N, N-bis (hydroxy
(Sibenzyl) -ethylenediamine-N, N'-diacetic acid (HBED), triethylene
Triamine hexaacetic acid (TTHA), 1,4,7,10-tetraazacyclododecane
-N, N ', N ", N'"-tri and tetraacetic acid (DO3A and DOTA), 1,4,
7,10-tetraazacyclotridecane-N, N ', N ", N'"-tri and tetra vinegar
Acid (TRI3A and TRITA), hydroxyethyldiaminetriacetic acid (HED
TA) 1,4,8,11-tetra-azacyclotetradecane-N, N ', N ", N'"-
From tetraacetic acid (TETA), substituted DTPA, substituted EDTA, or deferoxa
From min (deferrioxamine) or the general formula:
Where R1Is a branched or unbranched, optionally substituted hydrocarbon group.
,
This is one or more heteroatoms selected from N, O and S;
And / or one or more NH groups may be interposed, and Q is a peptide
Capable of reacting with the amino group of the compound, preferably carbonyl, carbimidyl,
N- (C1-C6) Alkylcarbimidoyl, N-hydroxycarbimidoyl and
N- (C1-C6A) a group selected from the group consisting of alkoxycarbimidyl,
Selected from the groups derived from
NtPqS(4-tq)A suitable example of a tetradentate chelator is
Where:
R6-R20Are each independently a hydrogen atom or (C1-CFour) An alkyl group,
But C6Or C9At least one is the symbol Y;
Rtwenty oneIs a hydrogen atom or COTwo(C1-CFour) An alkyl group;
Rtwenty twoAnd Rtwenty threeAre individually (C1-CFour) Alkylcarbonyl, benzoyl
Or a benzyl group;
v is 0 or 1;
s is 2 or 3;
Rtwenty fourIs CHTwoCOOH or a functional derivative thereof;
A is CO if desiredTwoAlkyl, wherein the alkyl group has 1 to 4 carbon atoms
(C1-CFour) Is alkylene;
G is NH or S;
Y is a monovalent bond or a functional group capable of binding to a spacing group;
hand,
Z is S or O;
Is selected from
If Y is a functional group, Y is preferably isocyanato, isothiocyanato
, Formyl, O-halonitrophenyl, diazonium, epoxy, trichloro-
S-triazinyl, ethyleneimino, chlorosulfonyl, alkoxycarbimide
Yl, (substituted or unsubstituted) alkylcarbonyloxycarbonyl, alkyl
Including rubonylimidazolyl, succinimide-oxycarbonyl, preferably
, The group of which (C1-CTen) Attaches to hydrocarbon biradicals. Hydrocarbon biradical
A suitable example of is benzene, (C1-C6) Alkane, (CTwo-C6) Alkenes, and (
C1-CFour) Biradical derived from alkylbenzene.
Examples of suitable chelators of general formula III are described in International Patent Application WO 89/07456.
For example, unsubstituted or substituted 2-iminothiolane and 2-i
Minothiacyclohexane, especially 2-imino-4-mercaptomethylthiolane
You. The labeled biotin compounds are suitable for many suitable models for in vivo applications.
Have been tested in the experiment. These experiments are described in the examples. these
From the results of the examples, the labeled biotin compounds of the present invention can be used to diagnose and treat them.
Obviously, it has properties that make it fit for purpose. Atoms suitable for diagnostic purposes
When labeled, the labeled biotin compound remains intact long enough after administration,
Enable imaging of target tumors without showing background confusion
. When labeled with a therapeutically suitable radioisotope, such labeled biotin compounds
It is a promising therapeutic agent for the treatment of many malignant tumors.
The novel metal-labeled biotin compounds of the present invention are known per se for related compounds.
It can be manufactured by the method that is used. For this purpose, a biotin molecule is desired as described above.
New chelating agents such as NtPqS(4-tq)Tetradentate chelator or EDTA
Derivatization.
General formula
Where:
n is 1 or 2,
R is a chelating group for chelating a metal atom, and
Sp is a spacing group having at least 4 atoms separating NH from R;
DTPA and the like, the compound is obtained after the introduction of the above spacing group
Before the salt form or before the chelate form bound to a relatively weak chelator
Reacts with the metals defined above to form complexes.
Suitable examples of the desired metal salt or chelate are:111In-citrate and acetate
Tate,99mTc-tartrate and the like. Complex formation reactions are generally simple methods
And can be carried out under mild conditions.
The present invention also relates to a biotin compound of the general formula I as defined above,
It can be used in the above method for producing a labeled biotin compound.
The invention further relates to a pharmaceutically acceptable carrier substance and, if desired, at least one
In addition to the pharmaceutically acceptable adjuvant, the labeled biotin as an active ingredient
And a pharmaceutical composition comprising the compound.
The present invention also relates to a method of detecting and locating a tumor in a body of a warm-blooded organism,
This includes (i) polypeptides and conjugates with selective affinity for the tumor.
Administering to the organism a composition comprising oxidized (strept) avidin, and (ii)
After avidinization of the tumor, (a) with a labeled biotin compound as defined above99mTc,20 Three
Pb,67Ga,68Ga,72As,111In,113mIn,97Ru,62Cu,64Cu,52Fe,52m
Mn, and51A radioactive metal isotope selected from the group consisting of Cr, or (
b) Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Pr, Nd, Sm, Yb, Gd, Tb, Dy, Ho
And a compound labeled with a paramagnetic metal atom selected from the group consisting of
Outside
Administering to the organism a composition comprising an amount sufficient for bilateral imaging; and (iii)
Later, the organism is subjected to external imaging and the organism is compared to background activity.
It consists of determining a targeting site in the body.
Instead of the two-step protocol, use the three-step pretargeting method described above.
May be used. In this method, the following protocol: (ia) selection against the tumor
Administering to the organism a composition comprising a biotinylated polypeptide having affinity for
-B) then administer the (strept) avidin composition using both steps
Used in place of step (i) above.
The present invention also relates to a method for intraoperatively detecting and locating a tumor in a body of a warm-blooded organism.
With respect to (i) a polypeptide having a selective affinity for the tumor.
Administering to the organism a composition comprising conjugated (strept) avidin, (ii)
) Furthermore, after avidinization of the tumor, it is labeled with a labeled biotin compound as defined above.161At Tb
A composition comprising a labeled compound in an amount sufficient for detection by a gamma detection probe
Is administered to the organism, and (iii) finally, an active substance is bound to the tumor and
After incorporation into the tumor and after blood clearance of radioactivity, a gamma detection probe
Radioimmunodetection of the organism in problem areas within the organism
It consists of applying technology.
The radioisotope, ie,161Tb is measured in the patient's body by a gamma detection probe.
Radiation-guided surgical techniques allow intraoperative detection and localization of the tissue in question.
The use of such labeled peptide compounds. The surgeon will be
The radioisotope is a low energy gamma photon emitter using a lobe
The disease piece in which the incorporation of the compound labeled with has occurred can be found. 2 above
Instead of a step protocol, use a three step pretargeting method as described above.
It should be clear that it can be used.
The biotin compounds of the present invention are radiolabeled with isotopes suitable for such purposes.
If known, it can be used for therapeutic treatment of tumors. Therefore, the present invention further provides
A method for the therapeutic treatment of a tumor in a warm-blooded organism, comprising: (i) selecting against the tumor
(Strept) avidin conjugated to a polypeptide with high affinity
And (ii) avidinizing the tumor, and then
A labeled biotin compound114mIn,186Re,188Re,77As,90Y,66Ga
,67Cu,169Er,117mSn,121Sn,127Te,142Pr,143Pr,198Au,199Au
,149Tb,161Tb,109Pd,165Dy,149Pm,151Pm,153Sm,157Gd,159Gd
,166Ho,172Tm,169Yb,175Yb,177Lu,105Rh, and111Selected from Ag
Compounds labeled with metal isotopes that fight or control tumors
Administering to the organism a composition comprising an effective amount of the composition.
Instead of the two-step protocol described above, a three-step pre-targeting method
It will be clear that it can be used as such.
When using a radiolabeled biotin compound as a diagnostic,
Often have a poor shelf life and / or halve the radionuclide used
Due to the short period of time, it is not possible for the user to freely prepare the composition for use
Often there are. In such cases, the user should be released at the clinical hospital or laboratory.
A radionuclide labeling reaction will be performed. To that end, various reaction components
Provided to the user in the form of a so-called "kit". Required to carry out the desired reaction
The simple procedure involves using the radioactive labeling composition from the kit using the equipment at your disposal.
Obviously, it should be as simple as possible so that the product can be prepared. Yo
Thus, the present invention also relates to a kit for preparing a radiopharmaceutical composition.
Such a kit according to the present invention comprises (a) a poly-
A composition comprising (strept) avidin conjugated to a peptide, (b)
A biotin compound of the general formula I shown above, in which the symbols have the meanings described above,
If desired, pharmaceutically acceptable carriers and / or preparations inert to the compounds
(C) to which an ingredient and / or an adjuvant has been added203Pb,66Ga,67Ga
,68Ga,72As,111In,113mIn,114mIn,97Ru,62Cu,99mTc,186Re,188
Re,64Cu,52Fe,52mMn,51Cr,77As,90Y,67Cu,169Er,117mSn
,121Sn,127Te,142Pr,143Pr,198Au,199Au,149Tb,161Tb,109Pd
,165Dy,149Pm,151Pm,153Sm,157Gd,166Ho,172Tm,169Yb,175Yb
,177Lu,105Rh, and111Salt or chelate of metal isotope selected from Ag
G
Instructions for use, including a solution of (d) and a formulation for reacting the components present in the kit
Book. Preferably, bioti used as a component of the kit
The compound is modified with the spacing group Sp and the chelating agent R as defined above.
Keep it. The resulting biotin compound tightly binds radionuclides in a simple manner
It is convenient to let. Chelating agents suitable for modifying biotin molecules are described above.
In detail. N such as the compounds described abovetPqS(4-tq)Four seats sharp
The oxidizing agent or N-containing di- or polyacetic acid or derivatives thereof is In-11.
Notably suitable for binding various metal radionuclides such as 1 and In-113m
ing. The kit supplied to the user is also as defined in (a) and (b) above.
The ingredients can be included with instructions for use, while the release as defined in (c) above
Solutions of radionuclide salts or chelates have a limited shelf life and can be separately
It can be left to the user.
The kit is intended for use in a two-step protocol. If so
If you intend to use the three-step pre-targeting method described above,
G: (a-i) a biotinylated polypeptide having selective affinity for the tumor
And (a-ii) a composition comprising (strept) avidin.
Alternatively, both compositions are used in place of composition (a) above.
Radiopharmaceutical kit labeled with Tc-99m, Re-186, or Re-188
When useful in the preparation of a composition, a kit as in accordance with the present invention may comprise (a) and (
In addition to the components defined under b), (c) a reducing agent and, if desired, a chelating agent
And (d) combining the components of the kit with Tc-99m in the form of a pertechnetate solution, or
Includes a formulation to react with Re-186 or Re-188 in the form of a perlenate solution
Instructions for use can also be included. If desired, remove some of the components from the kit
If they are compatible, they may be combined. The user can use the appropriate generator
A pertechnetate or perrenate solution can be easily obtained.
If the radionuclide is present in the kit itself, it can be combined with the biotin compound of general formula I above.
Complex formation reactions combine the components in a neutral or buffered medium and react them
This can easily be triggered. To do this, the radionuclide must be
,
The biotinylation in the form of a chelate bound to a relatively weak chelator as defined above
May be given to the compound.
The kit comprises a biotin compound as defined above, Tc-99m, Re-186, and
Is intended to prepare a radiopharmaceutical composition labeled with Re-188,
Is separately added, preferably in the form of a pertechnetate or perrenate solution
. In that case, the kit contains a suitable reducing agent and, if desired, a chelating agent,
Is for reducing pertechnetate or perrenate. As a reducing agent
For example, dithionite or metal reducing agents can be used. Reducing agent for the above kit
Preferably, metal reducing agents such as Sn (II), Ce (III), Fe (II), Cu (I
), Ti (III) or Sb (III) are used, Sn (II) being excellently suitable. Appropriate
Examples of suitable Sn (II) -compounds are SnClTwo, Sn (II) -tartrate, Sn (II) -phospho
Or -pyrophosphate, and Sn (II) -glucoheptonate
. The modified biotin component of the kit, that is, preferably a biotin compound,
As a liquid, for example, in the form of a saline solution or in the form of any buffer solution
It can be supplied in a dry state or it can be provided in a dry state, for example a lyophilized state. injection
When used as a liquid component, it should be sterile and must contain dry components.
When dry, users should use sterile saline solution as solvent
. If desired, the above components may be combined with suitable stabilizers, such as ascorbic acid,
Stabilized in a conventional manner using cintic acid or salts of these acids, or
, Other adjuvants such as glucose, lactose, mannitol and the like
It may contain a bulking agent such as a substance.
The invention will be described in more detail with reference to the following specific examples.
Example 1
6- (N- (biotinyl sulfoxide) -p-aminobenzyl) -1,4,8,11
−tetraazaundecan (6) (Scheme 1)
Scheme 1. Biotin sulfoxide-NFour
Biotin sulfoxide is available from Melville (D.B.Melville, J. Biol. Chem., 1954, 208, 4).
Synthesize according to 95). Sulfoxide has two isomeric forms: α-(+)-biotin
Present in sulfoxide and β-(−)-biotin sulfoxide (Scheme 2).
Scheme 2. Two isomeric forms of biotin sulfoxide.
These can be separated by fractional crystallization and / or silica gel chromatography.
You can release.
6- (p-nitro-benzyl) -1,4,8,11-tetraaza-5,7-dioxo
Undecane (1)
p-nitrobenzylmalonic acid diethyl ester (G. Ruser et al., Bioconj. Chem. 19
90,2,345) 4 mMol (1.07 g) was suspended in methanol (40 ml).
5.3 ml (80 mmol) are added and the mixture is heated under reflux for 12 hours. Solvent and
And excess ethylenediamine are evaporated and the crude product is chromatographed on silica gel.
ー (CHClThree/ MeOH / NHThree(25%) = 5: 5: 1, Rf= 0.3)
did. Yield 1.4 g.
MS (FAB) m / z (relative intensity): 324 (MH+, 100);1H-NMR (3
00 MHz; d6-DMSO): 8.14 (d, 2H, o-Ar-H-), 8.04 (t,
2H, CHTwo-NH-CO), 7.46 (d, 2H, m-Ar-H), 3.45 (t, 1
H, CH-CHTwo-Ar), 3.15 (d, 2H, CH Two-Ar), 3.05 (m, 4H,
CH Two-NH-), 2.50 (m, 4H, CH-NHTwo);13C-NMR (90 MHz,
d6-DMSO): 168.25 (2C,C= O), 147.71 (1C,C(Ar)-
NOTwo), 145.86 (1C, CHTwo-C(Ar)), 129.95 (2C, Ar),
123.06 (2C, Ar), 54.00 (1C,CH-CHTwo-Ar), 41.93 (
2C,CHTwo-NH (CO)), 40.86 (2C,CHTwo-NHTwo), 34.48 (1
C,CHTwo-Ar).
Elemental analysis is C14Htwenty oneNFiveOFourIs equivalent to
6- (p-nitrobenzyl) -1,4,8,11-tetraazaundecane (2)
Crude (1) (480 mg, 1.48 mmol) at RT with 1 M BHThree/ THF solution (
30 ml, 20 eq.) And the reaction mixture is refluxed for 60 hours. Excess BHThree
MeOH was carefully added to the reaction mixture, which had been pre-cooled to 0 ° C, to decompose
Add dropwise. Evaporate the MeOH in vacuo, suspend the residue in EtOH and sonicate for a few minutes.
Wave treatment. The undissolved portion is filtered off and HCl gas is introduced into the filtrate for 20 minutes. Formation
The precipitated precipitate is collected and further subjected to column chromatography (SiO 2).TwoCHClThree/ MeO
H / 25% NHThree 5/5/2). The obtained purified amine is replaced with EtOH
And the corresponding hydrochloride is converted to a white solid by passing HCl gas through this solution.
(460 mg). Alternatively, previously purified by chromatography
Instead, the precipitate is recrystallized directly from HCl gas saturated MeOH.
Yield = 70%; Rf: 0.36 (SiO 2TwoCHClThree/ MeOH / 25% NHThree 5 /
5/2); MS (FAB) m / z (relative intensity): 296 (MH+, 100);1H-
NMR (360 MHz; d6-DMSO) (hydrochloride): 8.21 (d, 2H, O-Ar-
NOTwo-), 7.68 (d, 2H, m-Ar-NOTwo), 3.50-2.64 (m, 15
H);13C-NMR (90 MHz, d6-DMSO): 146.29 (2C,C(Ar)
-NOTwo,CHTwo-Ar), 130.46 (2C, Ar), 123.36 (2C, Ar),
47.56, 44.68, 35.04, 34.97.
Elemental analysis is C14ClFourH29NFiveOTwoMatches.
N, N, N ', N "'-tetrabutyloxycarbonyl-6- (p-nitrobenzyl)
-1,4,8,11-tetraazaoundecan (3)
(2) 1.5 g (3.5 mMol) was suspended in 5 ml of dioxane, and 1N NaOH was added to pH
Add up to 12. At ice temperature, di-te in 30 ml of dioxane and 40 ml of 1N NaOH.
4.5 ml of rt-butyl-dicarbonate (21 mMol / 6 equivalents) are added. The mixture
Stir at RT overnight. 100 ml of diethyl ether and HTwoO50m
Add l. The ether layer was separated and extracted four times with 30 ml of water.TwoSOFourDry with
And evaporate. The resulting oil could not be crystallized, but FAB-MS (m / z: 6).
96), showing the structure to be confirmed, TLC (silica gel, Rf = 0.5, ethyl acetate
In steal: hexane = 9: 1), it is pure. Yield: 2.2 g, 90%. FAB-
MS: m / z: 696.11 H-NMR and IR are consistent with the structure.
N, N ', N ", N'"-tetrabutyloxycarbonyl-6- (p-aminobenzyl
) -1,4,8,11-Tetraazaundecane (4)
(3) 1.3 g (1.9 mmol) was dissolved in 40 ml of 80% MeOH, and Pd / C (10
%) And hydrogenation is carried out at room temperature for 3 hours. The catalyst is removed by filtration
, The mixture is evaporated down and the pure product is chromatographed on silica gel (silica gel).
Gel 60, 32 cm × 2 cm, eluent: hexane: ethyl acetate = 2: 3)
Get more. Yield 0.53 g (43%). This compound is pure by TLC and HPLC.
Smart, FAB-MS (m / z = 666) and1Characterize by H-NMR
.
6- (N- (biotinyl sulfoxide) -p-amino-benzyl) -N, N ", N '"
-Tetrabutyloxycarbonyl-1,4,8,11-tetraazaundecane (5)
34.4 mg of α-(+)-biotin sulfoxide was dissolved in 700 μl of DMF, and HA
TU (0- (7-azabenzothiazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyl
Uronium hexafluorophosphate) 42.5 mg and diisopropylethyl
Continue for a while. The reaction mixture was washed with 2 ml of ethyl acetate and 5% NaHCO3.ThreeAdd to 2 ml of solution
. The organic layer was washed twice with sodium bicarbonate and saturated sodium chloride solution,
Dried over sodium citrate, evaporated and concentrated, diethyl ether / isopropyl ether
Crystallize from ter / hexane. Yield: 96 mg (80%). The product is chromatog
Raffy is pure and characterized by FAB-MS (m / z = 908).
6- (N-biotinyl sulfoxide) -p-aminobenzyl) -1,4,8,11-
Tetraazaoundecan (6) (Scheme 1)
(5) 96 mg of trifluoroacetic acid: thioanisole: water = 96: 2: 2 2 ml
And left at room temperature for 2 hours. Then, add 2 ml of diethyl ether to form
The material is allowed to settle and dried under high vacuum. Yield: 96 mg. Small amounts of impurities and residuals
The compound is purified by C18-HPLC to remove thioanisole
. FAB-MS: m / z = 508.
Example II
(6)99mTc-label
5 μg of (6) obtained as described in Example I, sodium citrate dihydrate
Dissolve in 300 μl of an aqueous solution of the hydrate (5 mg). In this solution,99mTcOFour -Genere
200-400 μl (1000-2000 MBq) and newly prepared
N equippedTwo-Filled SnClTwo・ 2HTwoO solution (10 mg / 10 ml 0.1 M HCl) 20
Add μl (20 μg). The pH is adjusted to 10 using NaOH. 30 at room temperature
Incubate for minutes. The complex formation yield is 97% or more. Hamilton PRP
-1 (10 μm, 4.1 × 150 mm) column and 10 mM phosphate buffer (pH 7,
0-5 min) 100% followed by a linear gradient (5-10 min; 20% MeCN / 80%
Elution with acid buffer) and isocratic up to 15 minutes
By elution,99mThe Tc complex elutes at 10'04 "(flow rate: 1.5 ml / min).
Condition99mT
c] 6- (p-aminobenzyl) -1,4,8,11-tetraazaundecane is 8'45
The complex was allowed to stand for at least 10 hours in citrate and phosphate buffers.
It is fixed.
Example III
[99mTc]-(6) binding to avidin
Obtained as described in Example II [99mTc]-(6) in a phosphate buffer (pH
8.9) Avis bound to beaded agarose previously prepared three times with 1.5 ml
Place on gin column. The column is washed five times with 1.5 ml of phosphate buffer. column
The activity retained above is 97 ± 3% (n = 3). Pre-column with cold biotin
If saturated, less than 2% activity is retained. So the binding to avidin
Conclude that it is specific.
Example IV
In human serum [99mTc]-(6) stability
Biotinidase is a diverse biotinamide amide hydrolase
Enzymes found in various organs and human sera, such as (N- (d
-Biotinyl) -p-aminobenzoic acid and biocytin are hydrolyzed. Fresh
Amide bond stability in human serum has been studied. Obtained according to Example II.
Intact [99mThe amount of Tc]-(6) was about 15 ±
2%, which is significantly better than the corresponding conjugate with biotin.
It was a thing.99mScintigraphy for Tc-labeled biotin conjugate
Taking into account the fact that the optimal time for
[99mThe stability of Tc]-(6) is suitable for human studies.
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(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
Ａ６１Ｋ 51/00 Ａ６１Ｋ 43/00
37/02
49/02 Ｂ ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code FI A61K 51/00 A61K 43/00 37/02 49/02 B