JPH11512522A - エナラプリル及びエナラプリラトの異性体の分析法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 応力を加えたエナラプリル及びエナラプリラトの分解生成物を分析する方法を提供する。該方法は、エナラプリル含有化合物に応力を加えるステップ、得られた生成物をクロマトグラフィーにかけて分離するステップ、分離された生成物と既知の標準化合物を比較するステップ、及び分離された生成物を質量分析法により分析するステップを含む。標準化合物は、エナラプリル及びエナラプリラトのＳＲＳジアステレオマー及びＳＳＲジアステレオマーである。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称 エナラプリル及びエナラプリラトの異性体の分析法発明の背景 エナラプリルは、高血圧の治療における使用が指示されているアンギオテンシ ン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤である。最近、エナラプリルは、エナラプリルマレ エートとして、またヒドロクロロチアジドと組み合わせて販売することが認可さ れた。ＡＣＥ阻害剤はカルシウムチャネルブロッカーとの組み合わせについても 研究されている。 エナラプリルの剤形の安定性実験により、エナラプリルの３つのキラル中心で 異性化が生じ得ることが示唆された。これらの異性化生成物は種々のエナラプリ ル含有製剤に係わる物質収支問題に貢献し得ると考えられる。ＳＳＳ−エナラプ リルの異性化に関する情報を提供するために、Ｌ−アラニル−Ｄ−プロリンジペ プチド及びＤ−アラニル−Ｌ−プロリンジペプチドを用いてＳＳＲ−及びＳＲＳ −エナラプリル異性体を合成した。これらの化合物をそのまま用いるか又は前駆 体として間接的に用いて、形成された全てのエナラプリル異性体を定量すること ができる。該化合物 はエナラプリルの構造−活性関係の研究にも用い得る。発明の要旨 本発明は、エナラプリル分解生成物、特に、ＳＲＳ−エナラプリラト（enalap rilat）異性体及びＳＳＲ−エナラプリラト異性体を分析する方法に関する。本 発明はさらに、本発明の方法に有用なＳＲＳ−及びＳＳＲ−エナラプリル異性体 並びにＳＲＳ−及びＳＳＲ−エナラプリラト異性体に関する。図面の簡単な説明 図１ ： ６０℃で４週間応力を加えた５／１８０エナラプリル−ジルチアゼムの錠剤の ｍ／ｚ ３４９の生成物イオンスペクトルの総イオン流（ＴＩＣ）プロフィール 。図２ ： ＴＩＣプロフィールにおける標識されたピーク１のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ生成物イ オンスペクトル。図３ ： ＴＩＣプロフィールにおける標識されたピーク２のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ生成物イ オンスペクトル。図４ ： ＳＲＳ−エナラプリラト異性体のＦＡＢ質量スペクトル。図５ ： テトラメチルシランを用いたＳＲＳ−エナラプリラト異性体の¹Ｈ ＮＭＲス ペクトル。図６Ａ及び図６Ｂ ： （Ａ）Ｓｐｈｅｒｉｓｏｒｂ Ｃ８（５μ）２５０×４．６ｍｍ（内径）〔ＵＶ 検出：２１５ｎｍ；流速：２．０ｍｌ／分；溶離剤：３５：６５のＣＨ₃ＣＮ： ０．００１Ｍ ＫＨ₂ＰＯ₄（ｐＨ２）；カラム温度：４０℃〕を用いた、（６０ ℃で４週間）応力を加えた５／１８０エナラプリル／ジルチアゼム錠剤のＨＰＬ Ｃクロマトグラム。 （Ｂ）Ｓｐｈｅｒｉｓｏｒｂ Ｃ８（５μ）２５０×４．６ｍｍ（内径）〔ＵＶ 検出：２１５ｎｍ；流速：２．０ｍｌ／分；溶離剤：３５：６５のＣＨ₃ＣＮ： ０．００１Ｍ ＫＨ₂ＰＯ₄（ｐＨ２）；カラム温度：４０℃〕を用いた、ＳＲＳ −エナラプリラト異性体のＨＰＬＣクロマトグラム。図７Ａ及び図７Ｂ ： （Ａ）Ｓｐｈｅｒｉｓｏｒｂ Ｃ８（５μ）２５０×４．６ｍｍ（内径）〔ＵＶ 検出：２１５ｎｍ；流速：２．０ｍｌ／分；溶離剤：２０：８０のＣＨ₃ＣＮ： ０．００１Ｍ ＫＨ₂ＰＯ₄（ｐＨ２）；カラム温度：４０℃〕を用いた、（６０℃で４週間）応 力を加えた５／１８０エナラプリル／ジルチアゼム錠剤のＨＰＬＣクロマトグラ ム。 （Ｂ）Ｓｐｈｅｒｉｓｏｒｂ Ｃ８（５μ）２５０×４．６ｍｍ（内径）〔ＵＶ 検出：２１５ｎｍ；流速：２．０ｍｌ／分；溶離剤：２０：８０のＣＨ₃ＣＮ： ０．００１Ｍ ＫＨ₂ＰＯ₄（ｐＨ２）；カラム温度：４０℃〕を用いた、ＳＲＳ −エナラプリラト異性体のＨＰＬＣクロマトグラム。発明の詳細な説明 本発明はエナラプリル分解生成物の分析方法に関する。該方法は、 （ａ）エナラプリルを含む組成物に応力を加えるステップ、 （ｂ）応力を加えたエナラプリル組成物をクロマトグラフィーにかけるステップ 、 （ｃ）応力を加えたエナラプリルのクロマトグラムと全ての既知エナラプリル分 解生成物を比較するステップ、 （ｄ）液体クロマトグラフィー−質量分析法により応力を加えた組成物を分析し て、未知の分解生成物の分子イオン及びフラグメンテーションパターンを検出す るステップ、 （ｅ）エナラプリルの試料とｔ−ブチルリチウムを反応さ せて、エナラプリラトのジアステレオマー混合物を形成するステップ、 （ｆ）エナラプリラトのジアステレオマーをクロマトグラフィーにかけるステッ プ、 （ｇ）応力を加えたエナラプリルのクロマトグラムとエナラプリラトのジアステ レオマー混合物のクロマトグラムを比較するステップ、 （ｈ）未知のエナラプリル分解生成物をエナラプリラトのジアステレオマーとし て同定するステップ、 （ｉ）エナラプリラトのＳＲＳ−及びＳＳＲ−ジアステレオマーの標準試料を合 成するステップ、 （ｊ）エナラプリラトのＳＲＳ−及びＳＳＲ−ジアステレオマーをクロマトグラ フィーにかけるステップ、及び （ｋ）エナラプリラトのＳＲＳ−及びＳＳＲ−ジアステレオマーのクロマトグラ ムと、応力を加えたエナラプリルのクロマトグラムを比較して、エナラプリラト のどのジアステレオマーが未知の分解生成物に対応するかを同定するステップ を含む。 本発明の１つの実施態様は、エナラプリルを含む組成物 を、約４０〜約４０℃の範囲の温度及び約０〜約７５％の相対湿度に約２．５〜 約６ヶ月間暴露して該組成物に応力を加える、上記のようなエナラプリル分解生 成物の分析方法である。 本発明の第２の実施態様は、アセトニトリル及びリン酸塩緩衝液の勾配を用い るＣ−８、５μ ２５０×４．６ｍｍ（内径）カラムを用いた液体クロマトグラ フィーを実施する、上記のようなエナラプリル分解生成物の分析方法である。 本発明の第３の実施態様は、エナラプリラトの試料をテトラヒドロフラン中ｔ −ブチルリチウムで約３０分間処理し、次いで加水分解して、エナラプリラトの ジアステレオマー混合物を形成する、上記のようなエナラプリル分解生成物の分 析方法である。 ＳＲＳ−エナラプリルである化合物又はその医薬上許容し得る塩。 ＳＳＲ−エナラプリルである化合物又はその医薬上許容し得る塩。 ＳＲＳ−エナラプリラトである化合物又はその医薬上許容し得る塩。 ＳＳＲ−エナラプリラトである化合物又はその医薬上許容し得る塩。 本発明は、経時的に生じるエナラプリルに係わる物質収支問題に取り組むため に、エナラプリルの２つの分解生成物、特にＳＲＳ−及びＳＳＲ−エナラプリル 並びにＳＲＳ−及びＳＳＲ−エナラプリラトのジアステレオ異性体を分析する方 法に関する。さらに本発明は、本発明の方法に有用なＳＲＳ−及びＳＳＲ−エナ ラプリル異性体並びにＳＲＳ−及びＳＳＲ−エナラプリラト異性体に関する。 エナラプリル−ＳＳＳマレエート、エナラプリルＤＫＰ−ＳＳ、エナラプリラ ト−ＳＳＳ、エナラプリラト−ＲＳ及びエナラプリラトＤＫＰ−ＳＳＳは、Ｍｅ ｒｃｋ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｒａｈｗａｙ，ＮＪ） から入手した。Ｌ−アナリル−Ｄ−プロリンＴＦＡ塩は、Ｍｅｒｃｋ Ｒｅｓｅ ｒａｃｈ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのＭｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ（Ｗｅｓｔ Ｐｏｉｎｔ，ＰＡ）により提供された。 エチル−２−オキソ−４−フェニルブチレート、シアノホウ水素化ナトリウム、 ドライモレキュラーシーブ（５Å）及びＤｏｗｅｘ ２×５０Ｗ 強酸性イオ ン交換樹脂は、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｌｗ ａｕｋｅｅ，ＷＩ）から入手した。無水エタノール、アセトニトリル（最適グレ ード）、リン酸水素二カリウム（Ａ．Ｃ．Ｓ．認定グレード）、リン酸カリウム （Ａ．Ｃ．Ｓ．認定グレード）、酢酸アンモニア（Ａ．Ｃ．Ｓ．認定グレード） 、トリエチルアミン（Ａ．Ｃ．Ｓ．認定グレード）、酢酸エチル（Ａ．Ｃ．Ｓ． 認定グレード）、ピリジン、塩化ナトリウム（ＨＰＬＣグレード）及び無水硫酸 ナトリウム（ＨＰＬＣグレード）は、Ｆｉｓｈｅｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ．ＰＡ）から入手した。Ｄ−アラニル−Ｌ−プロリン は、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｔ．Ｌｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。化 学物質は全て入手時の状態のまま用いた。移動相と、試料及び標準試料には、Ｍ ｉｌｌｉ−Ｑ系で精製した１８Ｍオーム以上の脱イオン水を用いた。 ＨＰＬＣ法の展開は、Ｓｐｅｃｔｒａ Ｐｈｙｓｉｃｓ（ＳＰ）１００可変波 長ＵＶ検出器を備えたＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ（ＨＰ）１０９０システ ムで実施した。ＬＣ／ＭＳ及びＬＣ／ＭＳ／ＭＳ実験は、Ｓｃｉｅｘ熱ネブライ ザープローブを介してＨＰ１０５０ＬＣにインター フェースしたＰＥ／Ｓｃｉｅｘ（Ｔｈｏｒｎｈｉｌｌ，Ｏｎｔａｒｉｏ）ＡＰＩ III三重四重極質量分析計で行った。¹Ｈ及び二次元ＣＯＳＹ ＮＭＲスペクトル は、Ｖａｒｉａｎ Ｕｎｉｔｙ ４００分析計で測定した。ＦＡＢ質量スペクト ルは、ＶＧ−７０７０Ｅ質量分析計で測定した。 ＨＰＬＣ条件は以下の通りであった：カラムはＰｈａｓｅ Ｓｅｐ．Ｉｎｃ． から購入したＳｐｈｅｒｉｓｏｒｂ Ｃ８カラム（粒径５μｍＮ内径２５０×４ ．６ｍｍ）；カラム温度は４０℃；溶離剤は３５％のＣＨ₃ＣＮ及び６５％の０ ．００１Ｍ ＫＨ₂ＰＯ₄（ｐＨ２）（ｖ：ｖ）の移動相；流速は２ｍｌ／分；Ｕ Ｖ検出は２１５ｎｍ；及び注入量は５０μｌ。 ＬＣ／ＭＳ実験では、移動相に揮発性緩衝液（例えば、酢酸アンモニア）を用 いて液体クロマトグラフィー条件を再展開させた。典型的な条件は以下の通りで ある：カラム、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＰＲＰ−１（内径２５０×４．１ｍｍ）；カ ラム温度、７０℃；流速、０．７〜１ｍｌ／分；溶離剤、５〜１０％のＣＨ₃Ｃ Ｎ及び９５〜９０％の２０ｍＭ ＮＨ₄ＯＡｃの溶媒Ａと、ＣＨ₃ＣＮの溶媒Ｂ； 勾配、 ０〜５−１０分：１００％Ａ、 ５−１０〜２０分：４０％Ａ、６０％Ｂ、 ２０〜２２分：３０％Ａ、７０％Ｂ、 ２２〜２３分：１００％Ａ； 並びに注入量、２０〜２５μｌ。 ＬＣ／ＭＳ及びＬＣ／ＭＳ／ＭＳは、陽イオン化モードの大気圧化学イオン化 （ＡＰＣＩ）源を用いて行った。〔Ｊ．Ａ．Ｂｕｃｋｌｅｙ，Ｊ．Ｂ．Ｆｒｅｎ ｃｈ及びＮ．Ｍ．Ｒｅｉｄ，Ｃａｎ．Ａｅｒｏｎａｕｔ．Ｓｐａｃｅ Ｊ．２０ ，（１９８４），２３１ページ；Ｂ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎ及びＭ．Ｌ．Ｄａｎｙ ｌｅｗｃｈ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ３１ｓｔ Ａｎｎｕａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｏｐｉｃｓ（Ａｍｅｒｃｉａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，Ｂｏｓｔｏｎ，１９８３），８５２ペ ージ；Ｍ．Ｈ．Ａｌｌｅｎ及びＢ．Ｉ．Ｓｈｕｓｈａｎ，ＬＣ−ＧＣ １０，（ １９９２），３５６ページ及び該論文に引用されている参考文献〕。試料の導入 は、上記ＬＣ／ＭＳ及び目的イオンの生成物イオンＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析のため のＬＣ条件を課して行った。カラムからの流れはダ イオードアレイ検出器を通過し、そのまま、ヒーターを５００℃に維持したＡＰ ＣＩプローブに入った。コロナ放電針は３μＡの電流で最適化し、オリフィス電 圧は６０Ｖに設定した。窒素（９９．９９９９９％）ネブライザーのガス圧及び 流量はそれぞれ６０ｐｓｉ及び０．６Ｌ／分に維持した。補助ガス圧（窒素９９ ．９９９９９％）は１．０Ｌ／分に設定した。カーテンガス流量（窒素９９．９ ９９９９％）は１．２Ｌ／分に設定した。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析に用いた衝突ガ スは、約６００×１０¹²原子／ｃｍ^-3の衝突ガス濃度のアルゴン（９９．９９９ ９９％）であり、衝突エネルキーは３０ｅＶであった。 医薬上適当な塩には、金属（無機）塩と有機塩の両方が含まれる。該塩のリス トは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃ ｅｓ ，第１７版，１４１８ページ（１９８５）に記載されている。適切な塩形態 は、物理的及び化学的安定性、流動性、吸湿性及び溶解性に基づいて選択される ことは当業者には周知である。本発明の好ましい塩としては、ＡＣＥ阻害剤及び ／又はＡII受容体拮抗剤のカリウム、ナトリウム、カルシウム及びアンモニウム 塩が含まれるがそれらには限定されない。 以下の実施例は本発明により開示された方法を例示するものであり、添付請求 の範囲に記載されている本発明を限定するものではない。 実施例１ エナラプリルの分解生成物の分析 ステップＡ ：応力を加えたエナラプリル−ジルチアゼム （５／１８０ｍｇ）錠剤中のエキストラ種の 検出 応力を加えた数個のエナラプリル−ジルチアゼム（５／１８０ｍｇ）錠剤中の エキストラ種を検出した。６０℃で４週間応力を加えたこのエナラプリル−ジル チアゼム組み合わせ体のクロマトグラムは、以下のＨＰＬＣ条件：カラム、Ｓｐ ｈｅｒｉｓｏｒｂ Ｃ８（５μ）２５０×４．６ｍｍ（内径）；カラム温度、４ ０℃；ＵＶ検出、２１５ｎｍ；溶離剤、３５：６５のＣＨ₃ＣＮ：０．００１Ｍ ＫＨ₂ＰＯ₄（ｐＨ２）を用いて得た。エナラプリルは１４．３分で溶出した。 エナラプリラト（二酸、エナラプリルの加水分解生成物）は３．５分で溶出した 。未知のエキストラ種は約４分で溶出した。このエキストラ種は、表１に示され ているように、３０℃で１８ヶ月間応力を加えたエナ ラプリル／ジルチアゼム錠剤中にも認められた。該エキストラ種をエナラプリル 関連分解生成物と称する。 ステップＢ：エキストラ種の検査−エナラプリラト異性体 の示唆 未知のエキストラ種を調べると、該エキストラ種がエナラプリル関連分解生成 物、特に、エナラプリラト関連分解生成物であることが示された。この検査結果 を以下の表２にリストする。該表に示されているように、この未知のエ キストラ種は、エナラプリルが存在しなかった初期のもの及び応力を加えた０／ １８０及び０／０エナラプリル／ジルチアゼム錠剤には認められなかった。該エ キストラ種は、初期の５／１８０エナラプリル／ジルチアゼム錠剤には認められ なかったが、応力を加えた数種の５／１８０エナラプリル／ジルチアゼム錠剤に は認められた。この種の量は、応力条件に準じて異なっていた。この種はバルク エナラプリルマレエート及びエナラプリラト標準試料に応力を加えた後にも認め られた。これらの事実は全て、該種が、エナラプリル関連分解生成物、特に、エ ナラプリラト関連分解生成物であることを示している。このエキストラ種はＨＰ ＬＣにおいてエナラプリラト−ＳＳＳ（二酸）近くで溶出したので、該種がエナ ラプリラトのジアステレオマーであり得ると考えるのは妥当であった。この仮定 は、ステップＡに記載のものと同じＨＰＬＣ条件を用い、但し溶離剤として３０ ：７０比のＣＨ₃ＣＮ：ＫＨ₂ＰＯ₄を用いて、（６０℃で４週間応力を加えた） ５／１８０エナラプリル−ジルチアゼム錠剤のクロマトグラムをエナラプリラト −ＲＳＳ標準試料のクロマトグラムと比較したときに支持された。ＲＳＳ標準試 料のクロマトグラムは３つのピークを 示す。４．３１分の主ピークは、ＳＳＳ異性体（４．１４分）の後且つ未知のエ キストラ種（５．２６分）の前に溶出したＲＳＳ異性体と特定される。これには 、エナラプリラトのＲＳＳ異性体由来の未知のエキストラ種は含めなかった。Ｒ ＳＳ標準試料のクロマトグラム中の他の２つのピークは、（１）ＲＳＳ−エナラ プリラトジケトピペリジン（ＲＳＳ−ＤＫＰ）と特定された４．９２分のピーク 、及び（２）５．２４分のピークである。５．２４分のピークは、ＲＳＳ化合物 のものに類似した極性種である。該ピークは極性種であるために、非極性でなけ ればならないエナラプリラト−ＤＫＰのジアステレオ異性体ではあり得ない。従 って、５．２４分のピークは、エナラプリラト異性体であると考えられた（後に 、ＬＣ／ＭＳ実験により確認された）。該末知エキストラ種は、クロマトグラム において、５．２４分で溶出するエナラプリラト異性体とほぼ同じ５．２６分の 保持時間で溶出したので、該エキストラ種はエナラプリラト異性体であると考え られた。 ステップＣ：応力を加えたエナラプリル錠剤中で検出され たエキストラ種の液体クロマトグラフィー− 質量分析 ＬＣ／ＭＳ実験には、移動相に揮発性緩衝液（酢酸アンモニア）を用いた液体 クロマトグラフィー条件を展開した。典型的な条件は： 陽イオン化モードの大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）源 を用いてＰＥ／Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩIII三重四重極質量分析計でＬＣ／ＭＳ及び ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ実験を行った。試料の導入は、全走査ＬＣ／ＭＳ分析及び目的 イオンの生成物イオンＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を用いる上記ＨＰＬＣ法を適用して 実施した。流速は約０．７〜約１ｍｌ／分であった。カラムからの流れは、ダイ オードアレイ検出器を通過し、そのまま、ヒーターを５００℃に維持したＡＰＣ Ｉプローブに入った。コロナ放電針は３μＡの電流で最適化し、オリフィス電圧 は６０Ｖに設定した。窒素（９９．９９９９９％）噴霧器のガス圧及び流量をそ れそれ６０ｐｓｉ及び０．６Ｌ／分に維持した。補助ガス圧（窒素９９．９９９ ９９％）は１．０Ｌ／分に設定した。カーテンガス流量（窒素９９．９９９９９ ％）は１．２Ｌ／分に設定した。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析に用いた衝突ガスは、約 ６００×１０¹²原子／ｃｍ^-3の衝突ガス濃度のアルゴン（９９．９９９９９％） であり、衝突エネルギーは３０ｅＶであった。 図１に、６０℃で４週間応力を加えたエナラプリル−ジルチアゼム錠剤の生成 物イオンＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析（ｍ／ｚ３４９の親）の総イオン流（ＴＩＣ）プ ロフィールを示す。このプロフィールは、この試料中に、エナラプリラ ト陽イオンの質量であるｍ／ｚ ３４９の親イオンと共に２つのピークが存在す ることを示している。ピーク１を、エナラプリラト−ＳＳＳ異性体と特定した。 ピーク１よりはるかに弱いピーク２を、エナラプリラト異性体と特定した。これ ら２つのピークの生成物イオンスペクトルを図２に示す。ｍ／ｚ ２０６で生じ た特徴的なフラグメントイオンがピーク１にもピーク２にも認められ、それによ って、ピーク２がエナラプリラト異性体によるものであることが確認された。し かし、両異性体の分子量が同じであり、エナラプリラト異性体のフラグメンテー ションも類似であると予想されるために、ＬＣ／ＭＳ及びＬＣ／ＭＳ／ＭＳの結 果からは、どの異性体が形成されたのかわからなかった。ステップＤ ：ＳＲＳエナラプリラト異性体の合成及び特性 決定 エナラプリラト自体はＳＳＳであり、そのＲＳＳ異性体は上記のＨＰＬＣ実験 から排除されていたので、該エキストラ種を、ＳＲＳ−及びＳＳＲ−エナラプリ ラト異性体と特定し得ると考えた。該エキストラ種は以下の理由からＳＲＳ異性 体と特定した。ＳＲＳ異性体は錠剤中の塩基性触媒によりエナラプリラト−ＳＳ Ｓから異性化されたと仮定 した。塩基は、エナラプリラト−ＳＳＳの３つのキラル中心の１つから陽子を引 き抜いて対応面性カルボアニオンを形成し得る。これらのカルボアニオンを再び プロトン化すると、カルボアニオンは元の異性体（エナラプリラト−ＳＳＳ）に 戻るか又はキラル中心で構造を変える。該異性体の相対形成速度は３つのキラル 中心の相対酸性度に依存する。キラル中心の相対酸性度を調べてみると、殆どの 酸性中心がエナラプリラトの炭素２に存在することが示される。炭素１及び炭素 ３の陽子は、酸性度を弱める基であるカルボキシル基に隣接しているために低酸 性であるが、炭素２の陽子は、酸性度を強化する２つの基と１つの中性メテン基 に隣接しているためにほぼ酸性である。〔‘Ｄｉｋｅｔｏｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｅｐｉｍｅｒｉｚａｔ ｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｄｉｐｅｐｔｉｄｅ Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ −Ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＲＳ−１００８ ５’Ｌ．Ｇｕら，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９８７ ，４（５），３９２〕。従って、ＳＲＳ異性体が最も形成される可能性が高い異 性体である。 エナラプリラト−ＳＳＳを塩基で異性化してＳＲＳ異性体を形成し得ることを 証明するために、エナラプリラト−ＳＳＳ標準試料を、テトラヒドロフラン中低 温で３０分間、強塩基ｔ−ブチルリチウムと反応させた。用いた２セットのＨＰ ＬＣ条件〔３５：６５及び２０：８０比のＣＨ₃ＣＨ：０．００１Ｍ ＫＨ₂ＰＯ₄ 〕下にエキストラ種と同じ保持時間を有する反応生成物が形成された。従って 、該反応生成物は、エナラプリラト異性体、中でも最も可能性が高いのは、ＳＲ Ｓ−エナラプリラト異性体であると仮定された。 次いで、（１）Ｄ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒａ又はＡｌａ−Ｐｒｏジペプチドをエチ ル２−オキソ−４−フェニルブチレートと縮合し、（２）イミン結合をシアノホ ウ水素化ナトリウムで還元し、次いで、（３）塩基で加水分解して、ＳＲＳ−エ ナラプリラトを合成した。〔‘Ｒｅｄｕｃｔｉｖｅ Ａｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｔｈｙｌｅ ２−Ｏｘｏ−４−ｐｈｅｎｙｌｂｕｔａｎｏａｔｅ ｗｉｔｈ Ｌ−Ａｌａｎｙｌ−Ｌ−ｐｒｏｌｉｎｅ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｅｎａ ｌａｐｒｉｌ Ｍａｌｅａｔｅ’Ｍ．Ｊ．Ｗｙｖｒａｔｔら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈ ｅｍ．１９８４，４９， ２８１６−１９〕。ＳＲＳエナラプリルを単離し、分取ＨＰＬＣにかけて精製し た。質量スペクトル及びＮＭＲに基づいてＳＲＳ異性体の構造特定を行った。（ 精製に用いた）リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ２）の存在下の図３に示されたＳＲ Ｓ異性体のＦＡＢ質量スペクトルは、（ＳＲＳエナラプリラト＋カリウム）（３ ８７）、（ＳＲＳエナラプリラト＋二ナトリウム）（３９２．９）、（ＳＲＳエ ナラプリラト＋二カリウム）（４２４．９）及びエナラプリラト−ＤＫＰ分解生 成物（３３１）のプロトン化イオンをはっきり示している。エナラプリル−ＤＫ Ｐは、エナラプリラトが酸性条件下にそのＤＫＰを迅速に形成し得るので、合成 の副生成物であった。また、電子スプレー技術を用いてエナラプリラト−ＳＲＳ の質量スペクトルを測定したが、該スペクトルは、ＳＲＳ異性体、ＳＲＳのナト リウム類似体及びエナラプリラト−ＤＫＰをはっきり示していた。全てのＳＲＳ 試料をＮＭＲ分析すると、２種の成分：エナラプリラト−ＳＲＳ（主成分）及び エナラプリラト−ＤＫＰ（微量成分）の混合物が示された。エナラプリラト−Ｄ ＫＰの存在は、エナラプリラト−ＳＲＳの特定には干渉しなかった。ＳＲＳ−エ ナラプリラトのＮＭＲスペクトルを図 ４に示す。 合成されたエナラプリラト−ＳＲＳは、図５及び図６に示されているように、 応力を加えた数種のエナラプリル／ジルチアゼム錠剤中で検出されたエキストラ 種の保持時間と正確にマッチしていた。 実施例２ エナラプリルＳＳＲ ５０ｍｌ容の丸底フラスコ中で、エチル−２−オキソ−４−フェニルブチレー ト（０．２８ｇ）及びＬ−アラニル−Ｄ−プロリンＴＦＡ塩（６．３ｍｇ）を２ ０ｍｌのエタノール／水（１：１）に溶解した。恒攪拌下且つ窒素保護下に、該 溶液にトリエチルアミン（０．０３７ｍｌ）を加え、その直後に、３ｍｌのエタ ノール／水（１：１）中のシアノホウ水素化ナトリウム（２６ｍｇ）の溶液をシ リンジを介して滴下した。得られた混合物を室温で一晩攪拌し、Ｄｏｗｅｘ ２ ×５０Ｗ 強酸性イオン交換樹脂上に吸着させた。次いで、該樹脂を、水、次い で１００ｍｌの２％水性ピリジンで洗浄した。最初の画分を廃棄し、残りの画分 を合わせた。最後に、合わせた画分を凍結乾燥して、白色粉末としてエナラプリ ルＳＳＲを得た。質量スペクト ル：３７７（Ｍ＋Ｈ）、２３４（フラグメントイオン）。 実施例３ エナラプリラトＳＳＲ エナラプリルＳＳＲ（実施例２）を２０ｍｌの１Ｍ 水酸化ナトリウムに溶解 した。混合物を一晩攪拌した。分取ＨＰＬＣによりＳＳＲ二酸を単離した。 実施例４ エナラプリルＳＲＳ １２５ｍｌ容の丸底フラスコ中で、エチル−２−オキソ−４−フェニルブチレ ート（０．７０ｍｌ）、Ｄ−アラニル−Ｌ−プロリン（１３３．３８ｍｇ）及び ドライモレキュラーシーブ（５Å，１２４．９２ｍｇ）を５０ｍｌの無水エタノ ールに溶解した（モレキュラーシーブが不溶性であるために懸濁液が形成された ）。恒攪拌下且つ窒素保護下に、５ｍｌの無水エタノール中の６０．１０ｍｇの シアノホウ水素化ナトリウムの溶液をシリンジを介して１時間かけて滴下した。 次いで、反応混合物を室温で１６時間攪拌した。モレキュラーシーブを濾過して 除去し、濾液を真空濃縮して油状物を得、次いで油状物を５０ｍｌの水に分散さ せた。リン酸水素二カリウム（Ｋ₂ＨＰＯ₄）を用 いて溶液のｐＨを８．５に調整し、次いで、酢酸チル（１００ｍｌ）で３回抽出 して、処理されなかったα−ケトエステル及びα−ヒドロキシエステルを除去し た。次いで、１Ｍ リン酸を用いて溶液のｐＨを１．９に調整（注：これは必ず フード下に実施すること!!!）し、ｐＨを３０分間維持した。最後に、リン酸水 素二カリウムを用いて溶液のｐＨを４．０に調整した。塩化ナトリウム（〜１３ ｇ）で飽和した後、溶液を酢酸エチル（１００ｍｌ）で２回抽出した。合わせた 有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水し、真空濃縮（温度を〜３５℃に維持）して 、泡状物としてＳＲＳエナラプリルを得た。質量スペクトル：３７７（Ｍ＋Ｈ） 、２３４（フラグメントイオン）。 実施例５ エナラプリラトＳＲＳ エナラプリルＳＲＳ（実施例３）を２０ｍｌの１Ｍ 水酸化ナトリウムに溶解 した。混合物を一晩攪拌した。分取ＨＰＬＣによりＳＲＳ二酸を単離した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ // Ａ６１Ｋ 38/00 Ｃ１２Ｎ 9/99 Ｃ１２Ｎ 9/99 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ， ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，Ｕ Ｚ，ＶＮ (72)発明者 キン，スー−ツイー アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065−0907、ローウエイ、イースト・リ ンカーン・アベニユー・126 (72)発明者 ビセンテイーニ，ジユゼツピーナ カナダ国、ケベツク・アシユ・９・アシ ユ・３・エル・１、カークランド、トラン ス・カナダ・ハイウエイ・16711 (72)発明者 ワン，キンシー アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065−0907、ローウエイ、イースト・リ ンカーン・アベニユー・126

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． エナラプリル分解生成物の分析方法であって、 （ａ）エナラプリルを含む組成物に応力を加えるステップ、 （ｂ）応力を加えたエナラプリル組成物をクロマトグラフィーにかけるステップ 、 （ｃ）応力を加えたエナラプリルのクロマトグラムと、全ての既知エナラプリル 分解生成物のクロマトグラムを比較するステップ、 （ｄ）液体クロマトグラフィー−質量分析法により応力を加えた組成物を分析し て、未知の分解生成物の分子イオン及びフラグメンテーションパターンを検出す るステップ、 （ｅ）エナラプリラトの試料とｔ−ブチルリチウムを反応させて、エナラプリラ トのジアステレオマー混合物を形成するステップ、 （ｆ）エナラプリラトのジアステレオマーをクロマトグラフィーにかけるステッ プ、 （ｇ）応力を加えたエナラプリルのクロマトグラムとエナラプリラトのジアステ レオマー混合物のクロマトグラムを比較するステップ、 （ｈ）朱知のエナラプリル分解生成物をエナラプリルのジアステレオマーとして 同定するステップ、 （ｉ）エナラプリラトのＳＲＳジアステレオマー及びＳＳＲジアステレオマーの 標準試料を合成するステップ、 （ｊ）エナラプリルのＳＲＳジアステレオマー及びＳＳＲジアステレオマーをク ロマトグラフィーにかけるステップ、及び （ｋ）ＳＲＳジアステレオマー及びＳＳＲジアステレオマーのクロマトグラムと 、応力を加えたエナラプリルのクロマトグラムを比較して、エナラプリラトのど のジアステレオマーが未知の分解生成物に対応するかを同定するステップ を含む方法。 ２． エナラプリルを含む組成物を、約４０〜約８０℃の範囲の温度及び約０〜 ７５％の相対湿度に約２．５〜約６ヶ月間暴露して、該組成物に応力を加える、 請求項１に記載のエナラプリル分解生成物の分析方法。 ３． アセトニトリル及びリン酸塩緩衝液の勾配を用いるＣ−８、５μ ２５０ ×４．６ｍｍ（内径）カラムを用いて液体クロマトグラフィーを実施する、請求 項２に記載の エナラプリル分解生成物の分析方法。 ４． エナラプリルの試料をテトラヒドロフラン中ｔ−ブチルリチウムで約３０ 分間処理し、次いで加水分解して、エナラプリラトのジアステレオマー混合物を 形成する、請求項３に記載のエナラプリルの分解生成物を分析する方法。 ５． ＳＲＳ−エナラプリルである化合物又はその医薬上許容し得る塩。 ６． ＳＳＲ−エナラプリルである化合物又はその医薬上許容し得る塩。 ７． ＳＲＳ−エナラプリラトである化合物又はその医薬上許容し得る塩。 ８． ＳＳＲ−エナラプリラトである化合物又はその医薬上許容し得る塩。