JPH11511981A

JPH11511981A - Identification of bases in nucleic acid sequences

Info

Publication number: JPH11511981A
Application number: JP9510940A
Authority: JP
Inventors: ミンター，スティーブン
Original assignee: テプネル・メディカル・リミテッド
Priority date: 1995-09-02
Filing date: 1996-09-02
Publication date: 1999-10-19
Also published as: IL123513A0; CA2230893A1; NO980837L; WO1997009449A1; EP0850317A1; GB9517914D0; NO980837D0; AU6833996A

Abstract

(57)【要約】特定塩基が核酸配列の特定位置に存在するか否かの判定方法。該方法は、以下の工程：（ａ）固体支持体上に固定化された形態で、研究されるべきである配列の一本鎖試料（「試料配列」）を準備し、（ｂ）該試料配列にプライマーをハイブリダイズさせて、３'側の特定位置にすぐ隣接している該試料の塩基に該プライマーの３'末端の塩基をハイブリダイズさせ、（ｃ）特定塩基が該位置に存在する場合、試料配列の特定位置に対応する位置でプライマーの伸長単位を提供することができる標識部分を用いて伸長条件下で該プライマーを処理し（ここで、伸長条件は、プライマーの伸長が、標識部分による別の伸長による以外に試料配列の特定位置を超えて継続しないような条件である）、（ｄ）支持体を洗浄して未反応標識部分および他の試薬を除去し、次いで、（ｅ）プライマーにおける標識部分の取り込みについて試験することからなる。 (57) [Summary] A method for determining whether a specific base is present at a specific position in a nucleic acid sequence. The method comprises the following steps: (a) providing a single-stranded sample ("sample sequence") of the sequence to be studied in immobilized form on a solid support; The primer is hybridized to the sequence, and the base at the 3 ′ end of the primer is hybridized to the base of the sample immediately adjacent to the specific position on the 3 ′ side, and (c) the specific base is present at the position. In the case where the primer is treated under an extension condition using a labeling moiety capable of providing an extension unit of the primer at a position corresponding to a specific position of the sample sequence (where the extension condition is such that the extension of the primer is Conditions that do not continue beyond a particular position in the sample sequence except by another extension by the moiety), (d) washing the support to remove unreacted labeled moiety and other reagents, and then (e) ) Labeling part in primer Consisting be tested for incorporation.

Description

【発明の詳細な説明】核酸配列における塩基の同定本発明は、核酸配列における塩基の同定に関する。さらに詳しくは、本発明は、特定の塩基が核酸配列における特定の位置に存在するか否かを判定するための方法に関する。本発明の特定の用途は、遺伝子に突然変異が存在するか否かを判定する際である。現在、多くの病状が患者の遺伝子で生じた少なくとも１つの突然変異の結果として生じることがよく確立されている。該突然変異は、例えば、トランケートしたｍＲＮＡの形成を生じ、次いで、正しくないアミノ酸を有するタンパク質の形成を生じる結果、該タンパク質が正しくない機能を有するかまたは全く機能を有しなくなる欠失である。別には、該突然変異は、大規模な挿入（例えば、ウイルス配列の導入）もしくは進化による小規模な挿入またはＤＮＡポリメラーゼ誤読の結果としての単一または多重のヌクレオチドの導入である。突然変異の別の例は、遺伝暗号内の特定部位での塩基変化の結果である点突然変異である。遺伝子の突然変異により生じる病状の例としては、ゴーシェ、嚢胞性線維症ならびにαおよびβサラセミアが挙げられる。かかる疾患を生じる突然変異の多くが知られており、したがって、患者由来のＤＮＡを検査して病状を生じる突然変異がＤＮＡ中に存在するか否を判定することにより、患者が特定の病状に罹患するか、または罹患し易いかを判定することが可能である。これは、特異的な塩基が、ある遺伝子配列の特定位置に存在するか否かを判定することを含む。かかる検査法の例は、WO-A-9009455（Geneco）に開示されており、ここでは、研究されるべきである塩基の３'側で遺伝子配列にプライマーをハイブリダイズし、該プライマーは、検出要素または分離要素を取り込むものである。次いで、伸長反応を行い、その結果、特定の塩基が存在する場合、該プライマーを、研究している配列の特異的塩基に対して（のみ）伸長させる。研究下の配列の特異的塩基に相補的である伸長したプライマーの塩基は、検出要素および／または分離要素を取り込み、その結果、伸長したプライマーは、全体として検出要素および分離要素の両方を取り込む。次いで、伸長したプライマーの分離要素の存在により、該プライマーは、初期配列から変性され、分離要素に対して親和性を有する部分を有する固体支持体に暴露される。次いで、該支持体を処理して、該支持体上に固定化された標識プライマーの存在（または不在）を判定する。該標識が検出される場合（のみ）、これは、研究下の配列の特定位置に特異的塩基が存在したという確認である。該プライマーの親和性分離の必要性は、これがプロセスにさらなる工程を導入し、結果として自動化の可能性を制限するので、Geneco明細書に開示されている技術の欠点である。単一および多重の両方の突然変異の自動化の要求は、同時に、技術の汎用化を非常に増大させるであろう。これは、前記方法では容易には行われない。したがって、本発明の目的は、前記欠点を未然に防ぐか緩和することである。本発明によると、特定塩基が核酸の特定位置に存在するか否かの判定方法であって、以下の工程：（ａ）固体支持体上に固定化された形態で、研究されるべきである配列の一本鎖試料（「試料配列」）を準備し、（ｂ）該試料配列にプライマーをハイブリダイズさせて、３'側の特定位置にすぐ隣接している該試料の塩基に該プライマーの３'末端の塩基をハイブリダイズさせ、（ｃ）特定塩基が該位置に存在する場合、試料配列の特定位置に対応する位置でプライマーの伸長単位を提供することができる標識部分を用いて伸長条件下で該プライマーを処理し（ここで、伸長条件は、プライマーの伸長が、標識部分による別の伸長による以外に試料配列の特定位置を超えて継続しないような条件である）、（ｄ）支持体を洗浄して未反応標識部分および他の試薬を除去し、次いで、（ｅ）プライマーにおける標識部分の取り込みについて試験することからなることを特徴とする判定方法が提供される。かくして、本発明方法は、特定塩基が試料核酸の特定位置に存在するか否かを判定するために用いられる。該塩基が該位置に存在する場合、標識は、工程(ｃ) の結果として産生されるプライマー伸長産生物に取り込まれる。工程（ｅ）により検出されるように、該標識の存在により、特定塩基が研究下の位置に存在したことが確認される。該検出は、試料配列にハイブリダイズしたプライマーを用いて、またはその変性後に行われる。いずれの場合にも、未反応標識部分による妨害は、全てのかかる未反応標識部分（または他の試薬）を検出工程前に確実に除去する工程（ｄ）の洗浄工程により回避される。本発明方法は、分離要素の伸長プライマーへの取り込みおよび次の支持体上に伸長プライマーを固定化するアフィニティ工程の必要性を回避する。したがって、本発明は、自体、容易に自動化される。標識部分は、例えば、試料配列の特定位置の塩基に相補的な塩基を取り込んでいるジデオキシヌクレオチドである。特定塩基が試料配列の特定位置に存在する場合にのみ、そのままでプライマーの伸長が生じるであろうし、ジデオキシヌクレオチドが伸長反応を停止させるので、該伸長は、それ以上は続かないであろう。次いで、該プライマーにおける標識種の存在により、明らかに、特定位置での特定塩基の存在が確認される。ジデオキシヌクレオチド（または伸長反応を停止させる他の種）を用いる代わりに、判定される塩基に相補的な塩基を取り込んでいる標識ヌクレオチドを用いることが可能である。この結果、同一の塩基が（５ '側に）あった場合には特定位置の塩基を超えてプライマーが伸長する。しかしながら、この場合、標識は、特定塩基が特定位置にあった場合にはプライマー伸長産生物に取り込まれ、伸長プライマーにおける余分の標識の存在は、該工程を妨害しない。標識は、第２の標識を導入させるビオチン、フルオロフォア、酵素、化学発光性標識または同様の基であってもよい。試料核酸は、多くの方法で準備される。しかしながら、試料核酸が固体支持体に共有的に結合しているのが非常に好ましい。これは、以下の方法を用いて行われる。該方法は、患者から得られた核酸の試料（「初期核酸」）を用いて始められるであろう。固体支持体は、まず、該支持体に５'末端により共有的に結合されたオリゴヌクレオチドを用いて準備されるであろう。これらのオリゴヌクレオチドは、初期核酸の鎖における配列に相補的であろう。一本鎖形態の鎖を準備することにより、該支持体上のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされ、これにより、初期核酸の鎖を捕獲してもよい。洗浄して未ハイブリダイズ物質を除去した後、伸長反応を行って、鋳型として捕獲された初期核酸を用いてオリゴヌクレオチドを伸長させる。次いで、初期核酸を変性し、支持体を洗浄して、本発明方法を行う試料核酸としてその固定化された一本鎖コピーを離脱させる。もちろん、この場合、試料核酸は、初期核酸に相補的であると認識されるであろう。したがって、初期核酸における特定位置に特定塩基があるか否かを判定するためには、該塩基の相補体が試料核酸における対応する位置に存在するかを判定することが必要である。初期核酸の量が比較的少ない場合、WO-A-93/13220（Tepnel）およびWO-A-95/3 3073（Tepnel）に開示されている方法を用い、これにより、支持体に共有的に結合された試料核酸の多数の鎖を生産して、できる限り、本発明方法で用いるための試料核酸の増加した量を生産する。別法としては、固体支持体に、まず、３'末端により固体支持体へ共有的に結合されたオリゴヌクレオチドを提供することが可能である。この場合、初期核酸は、再度オリゴヌクレオチド上に捕獲されるが、この場合、それ自体、試料核酸として用いられる。好ましくは、固体支持体は、５０〜２００(より好ましくは、１００〜２００) のサイズを有する粒子からなる。核酸が共有的に結合される粒子および方法の特に好ましい例は、WO-A-93/13220に開示されている。粒子は、例えばWO-A-93/13220に開示されているような、試薬が容易に導入され排出されるフロースルーカラム（flow-through column）中に準備されるのが好ましい。本発明の展開において、該方法は、数種類のヌクレオチドが試料核酸の特定位置に存在するか否かを判定するために用いられる。本発明は、さらに、単に添付図面を参照して、一例により説明されるであろう。図１は、本発明の方法による分析のための試料核酸の調製を示す。図２は、本発明による方法の第１の具体例を示す。図３は、本発明による第２の具体例を示す。図４〜７は、実施例の方法および結果を示す。図１は、図２および３を参照して以下にさらに詳細に説明するような本発明方法において用いるための一本鎖核酸（試料核酸）を取り込んでいる固体支持体系の製造を示す。図１の方法は、（ａ）支持体に５'末端により共有的に結合される複数の固定化オリゴヌクレオチド２（１つだけ示す）を有する複数の特定支持体１（１つだけ示す）、ならびに（ｂ）特定の突然変異が存在するか否かを判定するために研究されるべきである一本鎖核酸３（ここで、該核酸３は、固定化オリゴヌクレオチド２に相補的な領域を有する）で始まる。図１の第一工程（工程（ａ））において、標準的な試薬および方法を用いて鎖３をオリゴヌクレオチド２にハイブリダイズする。洗浄して試薬および未ハイブリダイズ物質を除去した後、ポリメラーゼ酵素ならびにｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰの混合物を用いてオリゴヌクレオチド２を伸長する。伸長鎖（鎖３に相補的である）を４と記す。次いで、初期鎖３を変性させ、支持体から洗浄して、試料核酸鎖として固定化鎖４を離脱させる。今、鎖３が、例えば（例えば正常な配列における塩基と比較して）点突然変異として特定位置で塩基Ａを取り込んだかを判定することが必要であると仮定する。したがって、塩基ＴまたはＧが鎖４における対応する位置に取り込まれるかを判定することが必要であり、この方法は、以下に概略記載する。今、「野生型」鎖３から誘導された鎖４が配列^3' ＴＧＣＴＡＧ^5'を取り込んであり、突然変異鎖３において、鎖４における対応する配列が^3' ＣＧＣＴＡＧ^5'であると仮定する。したがって、下線を引いた塩基がＴまたはＣであるかを判定することが必要である。これは、図２に示した方法により行われる。図２に示すように、プライマーの３'末端が塩基を判定しようとする鎖４におけるその位置（＋で印を付けた）とすぐ隣接するようにプライマー５を鎖４にハイブリダイズする。すなわち、プライマー５は、可能性のある突然変異点「＋」から塩基１個下流（すなわち、３'側）にある領域について相同である。次いで、支持体を洗浄して、試薬および未ハイブリダイズ物質を除去する。今、ポリメラーゼ酵素と一緒に標識ｄＡＴＰ（^*ｄＡＴＰ）を固体支持体系に添加する。該標識は、好ましくは、酵素標識である。伸長反応を行った後、固体支持体系を洗浄する（鎖４にハイブリダイズしたプライマー５を離脱させる）。図２のスキームでは、プライマー５が標識Ａ（すなわち、^*Ａ）により伸長されるように、配列４において「＋」を付した位置の塩基が実際にはＴであったと仮定する。次いで、検出方法を行って、標識ｄＴＴＰがプライマー５に取り込まれたかを判定する。図２に示す方法について、結果は、陽性である。検出工程が陰性を呈する場合、ポリメラーゼ酵素と一緒に標識ｄＧＴＰを支持体系に添加し、固定化プライマーを用いて伸長反応を再度行う。系を洗浄した後、検出工程を繰り返して、標識ｄＧＴＰが該プライマーに捕り込まれ、初期鎖３が突然変異体であったことを確認する。図２に引用記載した方法により、制御手段で単一点突然変異について検査することが可能になる。ゲル電気泳動法、ブロッティングまたは他の労働の激しい繊細な方法を必要としない。さらに、コピー４は、安定であり、繰り返し検査することができる。該方法の展開は、図３に示され、１個以上の突然変異の存在（または不在）を同時に判定するために用いられる。この場合、特定の突然変異が特定位置に存在するかを判定するために、４個までのプライマーを同時に鎖４にハイブリダイズする。一連のプライマーは、点突然変異またはフレームシフト変異の群に隣接する領域に相補的である。それらは、また、挿入変異と相補的でもある。図３の方法は、遺伝子配列の固定化された相補的コピーに対して行われる。説明のために、図３に詳細に示される配列１０−１３のうちの１つの５'末端にある４つまでの点突然変異の可能性のある存在を研究するためであると仮定する。再度、説明のために、４つの突然変異がｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰを組み合わせて使用して検出されると仮定する。該方法の最初の工程（工程（ａ））では、プライマー１４−１７を関心のある各配列にハイブリダイズさせる。各プライマーは、可能性のある点突然変異から塩基１個下流（すなわち、３'側）にある領域について相同性である。次いで、支持体を洗浄して、未ハイブリダイズプライマーおよび他の試薬を除去する。ここで、突然変異の１つが存在する場合に対応するプライマーが^*ｄＡＴＰにより伸長されるような伸長条件下で標識ｄＡＴＰ（すなわち、^*ｄＡＴＰ）をポリメラーゼ酵素と一緒に支持体に添加する。次いで、該支持体を洗浄し、^*ｄＣＴＰ、^*ｄＧＴＰおよび^*ｄＴＴＰを用いて、該方法を逐次的に繰り返した。注目すべき重要な点は、該ヌクレオチドの各々の標識がお互いに区別されていることである。この方法の最後に、いずれのヌクレオチドが取り込まれたかを判定するために支持体について検出工程を行う。該ヌクレオチドが別々に標識されていたので、如何なる場合もいずれのヌクレオチドが取り込まれたかを判定するが可能である。異なる標識は、例えば、異なる波長で吸着するフルオロフォアである。４つの標識ヌクレオチド全てが取り込まれた場合（図３に示すように）、これは、４つの点突然変異が存在することを示す。３つ以下の突然変異が存在する場合、異なる標識化のために、４つの標識ヌクレオチドのいずれが取り込まれたかを判定することができる。したがって、突然変異のいずれが存在するかを言うことができる。図３は、４つの突然変異が各々別のヌクレオチドに対応するという理想化されたケースを示す。２つ以上の突然変異が同一ヌクレオチドであった場合、該ヌクレオチドに対応する突然変異がどの程度多く配列中に存在したかを、いずれか１つのヌクレオチドについて得られた検出シグナルの強度から判定することができるであろう。実施例１該実験は、捕獲された２５７ｂｐＰＣＲフラグメント、２５７Ｏの伸長コピーにハイブリダイズしたプローブ（ＤＯＬ０２４）にビオチニル化ヌクレオチドを添加することを示す。捕獲および伸長は、２４量体オリゴヌクレオチドＤＯＬ００６を担持している固体支持体上で行った。該フラグメントをこの支持体に捕獲し、この伸長コピーを、Ａmpli Ｔaqポリメラーゼ（パーキン・エルマー（Ｐerkin Ｅlmer））および4つのデオキシリボヌクレオチドの混合物を用いて支持体結合オリゴヌクレオチドの伸長を開始することにより作成した。該伸長産生物を用いて、オリゴヌクレオチドＤＯＬ０２４（以下に示す）を捕獲した。ＤＯＬ００６−5'AGCGGATAACAATTTCACACAGGA ＤＯＬ０２４Ｂ−5'(ビオチン)-CGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTT 該実験は、図４に示したハイブリッドが形成されるように、プローブが固相伸長産生物の遠位（３'）末端に位置するように設計された。ＤＯＬ０２４プライマーの配列は、ヌクレオチドｄＧが最初の５'塩基で取り込まれるようなものである。ビオチニル化ジデオキシＧＴＰを用いて、好結果の取り込みについて試験し、一方、ビオチニル化デオキシＵＴＰを用いて、取り込みの特異性をチェックした。方法支持体（２mg）に２５７Ｏフラグメント（５００fmol）を導入し、フロースルーカラムに配置した。該混合物を変性させた（９５℃、５分）後、捕獲した（３７℃、１０分）。洗浄して、取り込まれていないフラグメントを除去した後、１ ×ＰＣＲ緩衝液（ポリメラーゼ酵素を供給した）中のＡmpli Ｔaq ＤＮＡポリメラーゼ（２.５Ｕ／μＬ）および４つのデオキシリボヌクレオチド（各々０.２pm ol／ μＬ）の混合物を含有する伸長混合物を導入することにより、伸長を開始した。伸長は、インキュベーション工程（７２℃、５分）の間に進み、その後、「メルティング」および洗浄（３×９５℃、５分、次いで、８０μＬで洗浄）に付して、支持体に結合した伸長コピーを離脱させることにより、捕獲フラグメントを除去した(図４を参照)。該伸長コピーを、支持体上にＤＯＬ０２４(５００fmol)を吸引し、捕獲する（３７℃、５分）ことによりプローブする。洗浄して未結合物質を除去した後、１×ＰＣＲ緩衝液中でＡmpli Ｔaq ＤＮＡポリメラーゼ（２. ５Ｕ／μＬ）と一緒に研究下のヌクレオチド（２５pmol）を添加した。７２℃で５分間のインキュベーションの間にヌクレオチドの取り込みを行った。広範囲に洗浄して、取り込まれていない標識を除去した後、取り込まれた物質を、ストレプトアビジンアルカリホスファターゼコンジュゲートの結合、次いで、ＡＭＰＡＫアッセイを用いて分光光度検出法により検出した。対照は、第二プローブの捕獲のレベルを判定するために、ヌクレオチドを添加しないＤＯＬ０２４Ｏと同一レベルのビオチニル化捕獲プローブ（ＰＯＬ０２４Ｂ）の使用を含む。結果を図５に示す。該図では、２５７Ｏの不在下または捕獲フラグメントの伸長の不在下で、ＤＯＬ０２４Ｂによりシグナルがあまりまたは全く生じない。２５７Ｏの伸長は、ＤＯＬ０２４Ｂの有意な捕獲を可能にする。ｄｄＧＴＰの非標識ＤＯＬ０２４Ｏへの取り込みは、ＤＯＬ０２４Ｂ捕獲により生じたシグナルのほぼ半分のシグナルを生じる。「間違った」標識オリゴヌクレオチド（ｄＵＴＰ）の添加は、ｄｄＧＴＰ添加により生じたシグナルの半分未満のシグナルを生じる。前記観察結果により導かれる検討結果は、鋳型として捕獲２５７Ｏフラグメントを用いて、捕獲（支持体結合）オリゴヌクレオチドが伸長したということおよび第二プローブがこれに結合することができるということである。さらに、５' ヌクレオチドのプローブへの取り込みは、配列特異的である。実施例２この実施例は、一本鎖核酸上の２つのプライマーの捕獲の可能性を示す。２４量体オリゴヌクレオチドＤＯＬ００６（以下を参照）を、粒子固体支持体上でその５'により共有的に固定化した。２５７ｂｐＰＣＲフラグメント２５７Ｏをこの支持体上に捕獲し、Ａmpli Ｔ aqポリメラーゼ（パーキン・エルマー（Ｐerkin Ｅlmer)）および４つのデオキシリボヌクレオチドの混合物を用いて、支持体結合オリゴヌクレオチドの伸長を開始することにより、この伸長コピーを作成した。ビオチニル化オリゴヌクレオチドＤＯＬ０２４ＢおよびＤＯＬ０３０Ｂ（以下に示す）ＤＯＬ００６−5'AGCGGATAACAATTTCACACAGGA ＤＯＬ０３０Ｂ−5'（ビオチン）-GGCGTAATCATGGTCATAGCTGTT ＤＯＬ０２４Ｂ−5'（ビオチン）-CGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTT を用いて、該伸長産生物を多様にプローブした。該オリゴヌクレオチドは、２つの検出プローブが固相伸長産生物のいずれかの末端にあるように設計して、形成されるべき図６に示された多様にプライムされたハイブリッドを可能にする。方法２５７Ｏフラグメント（５００pmol）を支持体（２mg）に導入し、これを、フロースルーカラムに配置した。該混合物を変性した（９５℃、５分）後、捕獲した（３７℃、１０分）。洗浄して、取り込まれていないフラグメントを除去した後、１×ＰＣＲ緩衝液（ポリメラーゼ酵素を供給した）中のＡmpli Ｔaq ＤＮＡポリメラーゼ（２.５Ｕ／μＬ）および４つのデオキシリボヌクレオチド（各々０.２pmol／μＬ）の混合物を含有する伸長混合物の導入により、伸長を開始した。インキュベーション工程（７２℃、５分）の間に伸長が進行し、その後、「メルティング」および洗浄（３×９５℃、５分、次いで、８０μＬでの洗浄）に付して、支持体に結合した伸長コピーを離脱させることにより、捕獲フラグメントを除去した。支持体上に検出プローブ５００pmool を吸引させ、捕獲する（３７℃、５分）ことにより、伸長コピーをプローブした。洗浄して、未結合物質を除去した後、必要な場合には、第二プローブを同様の方法で厳密に捕獲した。次いで、該カラムを完全に洗浄し、未結合プローブを、ストレプトアビジンアルカリホスファターゼコンジュゲートの結合、次いで、ＡＭＰＡＫアッセイを用いる分光光度検出法により検出した。結果は、支持体結合オリゴヌクレオチドの伸長の不在下で両方の検出プローブの添加により生じたシグナルがバックグラウンドと類似していることを示す図７に示す。伸長を行った支持体結合オリゴヌクレオチドへの各検出プローブの添加は、有意なシグナルを生じる。両方の検出プローブの添加は、同時に、個々の検出オリゴヌクレオチドの添加により別々に生じたシグナルを超えるシグナルを生じる。前記観察結果から導かれた検討結果は、鋳型として捕獲２５７Ｏフラグメントを用いて捕獲（支持体結合）オリゴヌクレオチドが伸長したことおよび検出オリゴヌクレオチドがお互いに無関係にこの伸長産生物に結合することである。The present invention relates to the identification of a base in a nucleic acid sequence. More specifically, the present invention relates to a method for determining whether a specific base is present at a specific position in a nucleic acid sequence. A particular use of the present invention is in determining whether a mutation is present in a gene. It is now well established that many medical conditions result from at least one mutation made in a patient's gene. The mutation is, for example, a deletion that results in the formation of a truncated mRNA, followed by the formation of a protein with incorrect amino acids, such that the protein has incorrect or no function. Alternatively, the mutation is a large insertion (eg, the introduction of a viral sequence) or a small insertion by evolution or the introduction of a single or multiple nucleotides as a result of DNA polymerase misreading. Another example of a mutation is a point mutation that is the result of a base change at a particular site in the genetic code. Examples of pathologies caused by gene mutations include Gaucher, cystic fibrosis and α and β thalassemia. Many of the mutations that cause such diseases are known, and thus, a patient becomes susceptible to a particular medical condition by examining the DNA from the patient to determine whether the pathogenic mutation is present in the DNA. Or to be susceptible to morbidity. This involves determining whether a specific base is present at a particular position in a gene sequence. An example of such a test method is disclosed in WO-A-9009455 (Geneco), in which a primer is hybridized to the gene sequence 3 ′ of the base to be studied, said primer being Incorporate elements or separation elements. An extension reaction is then performed, and if a particular base is present, the primer is extended (only) to the specific base of the sequence under study. The bases of the extended primer that are complementary to the specific bases of the sequence under study incorporate a detection element and / or a separation element, such that the extended primer incorporates both the detection element and the separation element as a whole. The primer is then denatured from the initial sequence by the presence of the extended primer separation element, and is exposed to a solid support having a portion that has affinity for the separation element. The support is then treated to determine the presence (or absence) of the labeled primer immobilized on the support. If the label is detected (only), this is confirmation that a specific base was present at a particular position in the sequence under study. The need for affinity separation of the primers is a drawback of the technology disclosed in the Geneco specification, as this introduces an additional step into the process and consequently limits the potential for automation. The need for automation of both single and multiple mutations will at the same time greatly increase the versatility of the technology. This is not easily done with the above method. It is therefore an object of the present invention to obviate or mitigate said disadvantages. According to the present invention, there is provided a method for determining whether a specific base is present at a specific position of a nucleic acid, comprising the following steps: (a) to be studied in a form immobilized on a solid support; Preparing a single-stranded sample of the sequence ("sample sequence"); (b) hybridizing a primer to the sample sequence, and adding the primer to the base of the sample immediately adjacent to a specific position on the 3 'side. (C) when a specific base is present at the position, a labeling portion capable of providing an extension unit of the primer at a position corresponding to the specific position in the sample sequence; Treating the primer below (where the extension conditions are such that the extension of the primer does not continue beyond a particular position in the sample sequence except by another extension by the labeled moiety); Wash body and unreacted label It was separated and removed other reagents, then provided the determination method characterized in that it consists of testing for incorporation of the labeled moiety in (e) primers. Thus, the method of the present invention is used to determine whether a specific base is present at a specific position of a sample nucleic acid. If the base is at that position, the label is incorporated into the primer extension product produced as a result of step (c). The presence of the label confirms that the particular base was present at the position under study, as detected by step (e). The detection is performed using a primer hybridized to the sample sequence or after its denaturation. In each case, interference by unreacted labeled moieties is avoided by the washing step (d), which ensures that all such unreacted labeled moieties (or other reagents) are removed prior to the detection step. The method of the present invention avoids the incorporation of the separation element into the extension primer and the subsequent need for an affinity step to immobilize the extension primer on the support. Thus, the invention itself is easily automated. The labeling portion is, for example, a dideoxynucleotide incorporating a base complementary to a base at a specific position in the sample sequence. Only if a particular base is present at a particular position in the sample sequence will the extension of the primer occur in its own right, and the extension will not continue any further because the dideoxynucleotide stops the extension reaction. Next, the presence of the specific base at the specific position is clearly confirmed by the presence of the labeling species in the primer. Instead of using dideoxynucleotides (or other species that stop the extension reaction), it is possible to use labeled nucleotides that incorporate a base complementary to the base being determined. As a result, when the same base is present (on the 5 ′ side), the primer is extended beyond the base at the specific position. However, in this case, the label will be incorporated into the primer extension product if the particular base is at a particular position, and the presence of the extra label in the extension primer will not interfere with the process. The label may be biotin, a fluorophore, an enzyme, a chemiluminescent label or a similar group that introduces a second label. Sample nucleic acids are prepared in a number of ways. However, it is highly preferred that the sample nucleic acid is covalently bound to the solid support. This is performed using the following method. The method will begin with a sample of nucleic acid obtained from a patient ("initial nucleic acid"). A solid support will first be prepared using an oligonucleotide covalently linked to the support by a 5 'end. These oligonucleotides will be complementary to sequences in the strand of the initial nucleic acid. By providing a single stranded form of the strand, it may be hybridized to the oligonucleotide on the support, thereby capturing the strand of the initial nucleic acid. After washing to remove unhybridized material, an extension reaction is performed to extend the oligonucleotide using the captured initial nucleic acid as a template. Next, the initial nucleic acid is denatured, the support is washed, and the immobilized single-stranded copy is released as a sample nucleic acid to be subjected to the method of the present invention. Of course, in this case, the sample nucleic acid will be recognized as being complementary to the initial nucleic acid. Therefore, in order to determine whether or not a specific base is present at a specific position in the initial nucleic acid, it is necessary to determine whether the complement of the base exists at the corresponding position in the sample nucleic acid. If the amount of the initial nucleic acid is relatively small, the method disclosed in WO-A-93 / 13220 (Tepnel) and WO-A-95 / 3 3073 (Tepnel) is used, whereby the covalent Multiple strands of the bound sample nucleic acid are produced to produce, as much as possible, an increased amount of sample nucleic acid for use in the method of the invention. Alternatively, it is possible to provide the solid support first with an oligonucleotide covalently linked to the solid support by a 3 'end. In this case, the initial nucleic acid is again captured on the oligonucleotide, but in this case is itself used as the sample nucleic acid. Preferably, the solid support consists of particles having a size between 50 and 200 (more preferably between 100 and 200). Particularly preferred examples of particles and methods to which nucleic acids are covalently attached are disclosed in WO-A-93 / 13220. The particles are preferably provided in a flow-through column into which reagents are easily introduced and discharged, as disclosed, for example, in WO-A-93 / 13220. In a development of the invention, the method is used to determine whether or not several nucleotides are present at specific positions in a sample nucleic acid. The present invention will now be further described, by way of example only, with reference to the accompanying drawings. FIG. 1 shows the preparation of a sample nucleic acid for analysis by the method of the present invention. FIG. 2 shows a first embodiment of the method according to the invention. FIG. 3 shows a second embodiment according to the present invention. 4 to 7 show the methods and results of the examples. FIG. 1 shows the production of a solid support system incorporating a single-stranded nucleic acid (sample nucleic acid) for use in the method of the invention as described in more detail below with reference to FIGS. The method of FIG. 1 comprises: (a) a plurality of specific supports 1 (only one shown) having a plurality of immobilized oligonucleotides 2 (only one shown) covalently linked to the support by a 5 ′ end; And (b) a single-stranded nucleic acid 3 that is to be studied to determine whether a particular mutation is present, wherein the nucleic acid 3 has a region complementary to the immobilized oligonucleotide 2 Has). In the first step (step (a)) of FIG. 1, strand 3 is hybridized to oligonucleotide 2 using standard reagents and methods. After washing to remove reagents and unhybridized material, oligonucleotide 2 is extended using a polymerase enzyme and a mixture of dATP, dTTP, dCTP and dGTP. The extended strand (complementary to strand 3) is designated as 4. Next, the initial strand 3 is denatured and washed from the support to release the immobilized strand 4 as a sample nucleic acid strand. Suppose now that it is necessary to determine whether strand 3 has incorporated base A at a particular position, for example as a point mutation (eg, as compared to a base in a normal sequence). It is therefore necessary to determine whether a base T or G is incorporated at the corresponding position in strand 4, and this method is outlined below. It is now assumed that chain 4 derived from “wild-type” chain 3 has incorporated the sequence ^{3 ′} T GCTAG ^{5 ′} , and in mutant chain 3 the corresponding sequence in chain 4 is ^{3 ′} C GCTAG ^{5 ′.} I do. Therefore, it is necessary to determine whether the underlined base is T or C. This is performed by the method shown in FIG. As shown in FIG. 2, primer 5 is hybridized to strand 4 such that the 3 'end of the primer is immediately adjacent to that position (marked with a +) in strand 4 where the base is to be determined. That is, primer 5 is homologous in the region one base downstream (ie, 3 ′) from the potential mutation point “+”. The support is then washed to remove reagents and unhybridized material. Now, add labeled dATP ( ^* dATP) along with the polymerase enzyme to the solid support system. The label is preferably an enzyme label. After performing the extension reaction, the solid support system is washed (the primer 5 hybridized to the strand 4 is released). In the scheme of FIG. 2, it is assumed that the base at the position marked “+” in sequence 4 was actually T, such that primer 5 was extended by label A (ie, ^* A). Next, a detection method is performed to determine whether or not the labeled dTTP has been incorporated into the primer 5. For the method shown in FIG. 2, the result is positive. If the detection step shows negative, labeled dGTP is added to the support system together with the polymerase enzyme, and the extension reaction is performed again using the immobilized primer. After washing the system, the detection step is repeated to confirm that the labeled dGTP has been captured by the primer and that the early strand 3 was a mutant. The method cited in FIG. 2 allows the control means to check for single point mutations. It does not require gel electrophoresis, blotting or other labor-intensive and delicate methods. Furthermore, copy 4 is stable and can be inspected repeatedly. An extension of the method is shown in FIG. 3 and is used to simultaneously determine the presence (or absence) of one or more mutations. In this case, up to four primers are simultaneously hybridized to strand 4 to determine if a particular mutation is at a particular location. The set of primers is complementary to the region flanking the group of point or frameshift mutations. They are also complementary to insertion mutations. The method of FIG. 3 is performed on an immobilized complementary copy of the gene sequence. For purposes of illustration, assume that it is to study the possible presence of up to four point mutations at the 5 'end of one of the sequences 10-13 detailed in FIG. Again, for purposes of illustration, assume that four mutations are detected using a combination of dATP, dTTP, dCTP, and dGTP. In the first step (step (a)) of the method, primers 14-17 are hybridized to each sequence of interest. Each primer is homologous for a region one base downstream (ie, 3 ') from the potential point mutation. The support is then washed to remove unhybridized primer and other reagents. Here, labeled dATP (ie, ^* dATP) is added to the support along with the polymerase enzyme under extension conditions such that the corresponding primer is extended by ^* dATP when one of the mutations is present. Then, washing the support, ^* dC TP, with ^* dGTP and ^* dTTP, repeated process of sequentially. It is important to note that the labels of each of the nucleotides are distinct from each other. At the end of the method, a detection step is performed on the support to determine which nucleotides have been incorporated. Since the nucleotides were separately labeled, it was possible to determine which nucleotide was incorporated in any case. The different labels are, for example, fluorophores that adsorb at different wavelengths. If all four labeled nucleotides have been incorporated (as shown in FIG. 3), this indicates that four point mutations are present. If no more than three mutations are present, it can be determined which of the four labeled nucleotides has been incorporated for different labeling. Thus, one can say which of the mutations is present. FIG. 3 shows the idealized case where each of the four mutations corresponds to a different nucleotide. When two or more mutations are the same nucleotide, how many mutations corresponding to the nucleotides were present in the sequence is determined from the intensity of the detection signal obtained for any one nucleotide. Will be able to. Example 1 The experiment shows the addition of a biotinylated nucleotide to a probe (DOL024) that hybridized to a captured 257 bp PCR fragment, an extended copy of 257O. Capture and elongation were performed on a solid support carrying the 24-mer oligonucleotide DOL 006. The fragment is captured on the support and the extended copy is made by initiating extension of the support-bound oligonucleotide using Ampli Taq polymerase (Perkin Elmer) and a mixture of four deoxyribonucleotides. did. The extension product was used to capture oligonucleotide DOL024 (shown below). DOL006-5'AGCGGATAACAATTTCACACAGGA DOL024B-5 '(biotin) -CGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTT The experiment was performed so that the probe was located at the distal (3') end of the solid phase extension product so that the hybrid shown in FIG. 4 was formed. Designed to. The sequence of the DOL024 primer is such that nucleotide dG is incorporated at the first 5 'base. Successful uptake was tested using biotinylated dideoxy GTP, while the specificity of uptake was checked using biotinylated deoxy UTP. Method The 257O fragment (500 fmol) was introduced into a support (2 mg) and placed on a flow-through column. The mixture was denatured (95 ° C, 5 minutes) and then captured (37 ° C, 10 minutes). After washing to remove unincorporated fragments, Ampli Taq DNA polymerase (2.5 U / μL) and 4 deoxyribonucleotides (0.2 pmol each) in 1 × PCR buffer (supplied with polymerase enzyme). / ΜL) of the mixture was introduced to introduce the extension mixture. The extension proceeded during the incubation step (72 ° C., 5 minutes), followed by “melting” and washing (3 × 95 ° C., 5 minutes, then washing with 80 μL) to attach to the support. The capture fragment was removed by releasing the extended copy (see FIG. 4). The extended copy is probed by aspirating DOL024 (500 fmol) onto the support and capturing (37 ° C., 5 minutes). After washing to remove unbound material, the nucleotide under study (25 pmol) was added along with Ampli Taq DNA polymerase (2.5 U / μL) in 1 × PCR buffer. Nucleotide incorporation was performed during a 5 minute incubation at 72 ° C. After extensive washing to remove unincorporated label, the incorporated material was detected by binding of streptavidin alkaline phosphatase conjugate followed by spectrophotometric detection using the AMPAK assay. Controls include the use of the same level of biotinylated capture probe (POL024B) as DOL024O without added nucleotides to determine the level of capture of the second probe. FIG. 5 shows the results. In the figure, little or no signal is produced by DOL024B in the absence of 257O or in the absence of capture fragment extension. Extension of 257O allows significant capture of DOL024B. Incorporation of ddGTP into unlabeled DOL024O results in approximately half the signal generated by DOL024B capture. Addition of the "wrong" labeled oligonucleotide (dUTP) results in less than half the signal generated by the addition of ddGTP. The observations derived from the above observations are that the capture (support-bound) oligonucleotide was extended using the capture 257O fragment as a template and that a second probe could bind to it. In addition, incorporation of 5 'nucleotides into the probe is sequence specific. Example 2 This example demonstrates the possibility of capturing two primers on a single-stranded nucleic acid. The 24-mer oligonucleotide DOL006 (see below) was covalently immobilized by its 5 'on a particulate solid support. By capturing the 257 bp PCR fragment 257O on this support and initiating the extension of the support-bound oligonucleotide with Ampli Taq polymerase (Perkin Elmer) and a mixture of four deoxyribonucleotides, This extended copy was made. Biotinylated oligonucleotides DOL024B and DOL030B (shown below) DOL006-5'AGCGGATAACAATTTCACACAGGA DOL030B-5 '(biotin) -GGCGTAATCATGGTCATAGCTGTT DOL024B-5' (biotin) -CGCCATTCGTGCTGCGACT The oligonucleotides are designed so that the two detection probes are at either end of the solid phase extension product, allowing for the diversely primed hybrid shown in FIG. 6 to be formed. Method 257O fragment (500 pmol) was introduced onto a support (2 mg) which was placed on a flow-through column. The mixture was denatured (95 ° C, 5 minutes) and then captured (37 ° C, 10 minutes). After washing to remove unincorporated fragments, Ampli Taq DNA polymerase (2.5 U / μL) and 4 deoxyribonucleotides (0.2 pmol / each) in 1 × PCR buffer (supplied with polymerase enzyme). Extension was initiated by the introduction of an extension mixture containing (μL) of the mixture. Elongation proceeds during the incubation step (72 ° C., 5 minutes), followed by “melting” and washing (3 × 95 ° C., 5 minutes, then washing with 80 μL) to bind to the support The captured fragments were removed by releasing the extended copy. The extended copy was probed by aspirating 500 pmool of the detection probe onto the support and capturing (37 ° C., 5 minutes). After washing to remove unbound material, if necessary, the second probe was strictly captured in a similar manner. The column was then washed thoroughly and unbound probe was detected by binding of streptavidin alkaline phosphatase conjugate followed by spectrophotometric detection using the AMPAK assay. The results are shown in FIG. 7, which shows that the signal generated by the addition of both detection probes in the absence of support-bound oligonucleotide extension is similar to the background. Addition of each detection probe to the extended support-bound oligonucleotide results in a significant signal. The addition of both detection probes simultaneously results in a signal that exceeds the signal generated separately by the addition of the individual detection oligonucleotides. The considerations derived from the above observations are that the capture (support-bound) oligonucleotide was extended using the capture 257O fragment as a template and that the detection oligonucleotide bound to this extension product independently of each other. .

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, L U, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF) , CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (KE, LS, MW, SD, S Z, UG), UA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD , RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ , BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GE, H U, IL, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ , LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, P T, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, TJ , TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN

Claims

[Claims] 1. A method for determining whether a specific base is present at a specific position in a nucleic acid sequence, The following steps: (A) one of the sequences to be studied, in immobilized form on a solid support Prepare a chain sample ("sample sequence"), (B) A primer is hybridized to the sample sequence, and the primer is The base at the 3 'end of the primer is hybridized to the base of the sample immediately adjacent thereto. , (C) when a specific base is present at the position, a position corresponding to the specific position in the sample sequence; Under extension conditions using a labeled moiety that can provide an extension unit for the primer at The primer is treated (where the extension conditions are such that the extension of the primer is Under conditions that do not continue beyond a specific position in the sample sequence except by another extension is there), (D) washing the support to remove unreacted labeled portions and other reagents, Then (E) testing for incorporation of the labeled moiety in the primer A determination method characterized by comprising: 2. The labeled part incorporates a base complementary to the base at a specific position in the sample sequence The method according to claim 1, which is a dideoxynucleotide. 3. Labeled nucleic acid incorporating a base complementary to the base for which the labeled portion is determined The method according to claim 1, which is an otide. 4. The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the label is biotin. 5. 5. The method according to claim 1, wherein the sample sequence is covalently bound to a solid support. The method of claim 1. 6. The covalently linked sample sequence Prepare a nucleic acid sample ("initial nucleic acid") Solid with oligonucleotide covalently linked to the support by the 5 'end Prepare the support, Allowing the initial nucleic acid strand to hybridize to the oligonucleotide, Wash to remove unhybridized material, The oligonucleotide is extended using the hybridized initial nucleic acid as a template. , Then Denature the initial nucleic acid, wash from the support, and release the immobilized sample nucleic acid 6. The method according to claim 5, wherein the method is obtained. 7. Claims wherein the solid support comprises particles having a size of 50 to 200 microns. Item 7. The method according to any one of Items 1 to 6. 8. The particles are provided in a column from which reagents are easily introduced and discharged. The described method.