【発明の詳細な説明】
再構成皮膚
本発明は、移植用再構成皮膚複合物の開発方法に関する。その方法は、皮膚全
層欠損の代替品として働くことができる無傷の生物学的無細胞性真皮マトリック
スと表皮細胞からなる再構成皮膚を作製するものである。
現在の皮膚全層損傷の標準植皮術は、自家分層皮膚移植片（ＳＴＳＧ）の使用
を必要としている。これは人命救助法であることが示されてきたが、供給部位の
外傷及び元の創傷の美容及び機能の最終成果についてなお改善が求められている
。皮膚全層損傷では、ＳＴＳＧは創傷ＶＥＧＦの真皮と表皮の両成分を供給しな
ければならない。自家供給部位が制限される場合、ＳＴＳＧは全創傷範囲をカバ
ーするように網状植皮及び増殖植皮されなければならない。この網状植皮の形状
は真皮と表皮の双方でカバーされない創傷範囲が残る。移植した表皮の上皮細胞
は、最後にはこの網目の間隙に移動しこれをカバーして創傷の閉鎖を促進する。
しかしながら、真皮は再生組織ではないので、一部には十分な真皮がないために
移植片が収縮する場合に瘢痕及び拘縮による問題が後に生じる。
ＳＴＳＧ供給部位が制限される場合の他の方法は、健康な新鮮皮膚の生検物か
らの上皮細胞を培養する方法である。その細胞は、培養内で増殖されて元の生検
部位よりかなり大きな範囲をカバーすることができる。試験管内でケラチン細胞
を増殖させるのに必要な条件を調べる研究が１９６０年代後期から１９７０年代
初期に明らかになり始めた。この研究は、試験管内で長時間非形質転換ケラチン
細胞を増殖させるのに必要な培養条件を定義することを目的とした。この領域で
の開拓的研究は、Rheinwald & Green によってなされた。その初期の研究におい
て最も重要な知見の１つは、マウス線維芽細胞３Ｔ３支持細胞層及び表皮増殖因
子（ＥＧＦ）で補足した培養液の使用であった。ＥＧＦはケラチン細胞増殖の強
力なマイトジェンであることがわかりその細胞を試験管内で数代増殖させること
ができた。それ以来、コレラ毒素、インスリン、及びインスリン様増殖因子、ウ
シ下垂体エキス、ヒドロコルチゾン及びウシ胎児血清等を含む数種の添加剤がケ
ラチン細胞培養の重要な添加剤であることがわかった。この研究は、Boyce & Ha
m によって開発された無血清完全合成培養液（ＭＣＤＢ−１５３）の開発をもた
らした。これらの知見は、研究者らにケラチン細胞を試験管内で１０＋代増殖さ
せることを可能にした。
皮膚生検物からの上皮細胞の培養物は、表皮を真皮から分離することを必要と
する。これは、皮膚の２種類の異なる層を分離するために次の酵素及び化学薬品
：ディスパーゼ、サーモリシン、トリプシン又はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤ
ＴＡ）の１種又は組合わせを用いて達成される。次に、分離した表皮をトリプシ
ン＋ＥＤＴＡ中でインキュベートして表皮を細胞浮遊液に解離させる。また、毛
嚢の微小切断に続いてトリプシン／ＥＤＴＡインキュベートするとケラチン細胞
の集団の増殖がもたらされることもわかった。次に、解離した細胞を増殖因子、
血清の有無、及び照射又はマイトマイシン処理マウス線維芽細胞を組合わせて培
養液に入れる。細胞が培養内に残っているか又は過度の集密のままである場合に
は、ケラチン細胞の無傷シートを形成する。次に、このシートは、細胞の基質へ
の付着を破壊させるが細胞−細胞接触を妨害しないディスパーゼのような酵素で
処理することにより培養容器から脱離される。
これらの無傷シートの自家ケラチン細胞（培養上皮自家移植片又はＣＥＡと呼
ばれる）は、患者から得られた小さな生検物から作製される。しかしながら、こ
れらのシートの作製は数週間の培養時間を必要とする。ＣＥＡ技術の最初の関心
及び使用は高かったが、長期の結果が得られるようになるにつれて真皮置換のな
いことが低い全体生着率、瘢痕、及び表皮の脆弱性をまねく未熟基底膜形成を含
むこの方法に著しい制限を与えることは明らかであった。
更に、広範囲火傷創をカバーする代替的方法は、マイクロメッシュ状植皮術又
はマイクロスキン植皮術である。自家供給部位が制限される場合、利用可能なＳ
ＴＳＧが組織を異なる方向に複数回標準メッシャーに通過させることにより網状
植皮及び幅広く増殖（通常４：１以上）植皮されるか又は細切植皮される。研究
から幅広い網状自家移植片が最後には大きな皮膚全層の創傷を閉鎖することがで
きることがわかったが、これらの移植片はａ）網状移植片の間隙を再上皮化する
のに長時間かかる、ｂ）移植部位に“敷石状外観”を生じる及びｃ）しばしば瘢
痕及び拘縮の衰弱を生じる。ＣＥＡ植皮の場合のように、これらの方法に真皮代
替品がないことは美容及び機能の最終成果に著しい制限がある。無細胞性真皮マ
トリックスと無傷基底膜複合体との使用はその手法と共に創傷部位の美容及び機
能の良好な成果を可能にする。
無細胞真皮の基底膜にマイクロスキン片から移動する上皮細胞は、最後にはマ
イクロスキン片の下に移動してそれらを表面から剥がす。これは、敷石状外観の
ない滑らかな移植表面を生じる。無細胞性真皮マトリックスの存在は、移植部位
の瘢痕及び拘縮を減少させる。
十分に効果的であるように、全層火傷創の移植片は次の特性をもたなければな
らない。ａ）欠損した真皮と表皮の双方を置換する、ｂ）移植片をつくるために
広範囲な試験管内細胞培養を必要としない、ｃ）手術は１回だけで患者の罹患率
及び死亡率を低下させかつ入院期間が短くなる結果として費用が低減する。
この特許の発明は、これらの要求を満たす複合皮膚を再構成するための無傷無
細胞性真皮マトリックスと上皮細胞との使用を包含する。
真皮マトリックス及び試験管内再構成皮膚：再構成皮膚を作製する手法は、脱
表皮化真皮（ＤＥＤ）を用いることを含み、最初に Prunierasらによって研究さ
れた。この真皮マトリックスは、通常、リン酸塩緩衝食塩水中でヒト皮膚を長時
間インキュベートすること又は真皮及び表皮の細胞の全部を死滅させる皮膚の冷
凍及び解凍を繰り返すことにより作製される。この手法による結果は可変であっ
た。ヒト試験は、この基質を用いる皮膚創傷の生着率が不十分であることを示し
た。
Krejciらは、試験管内で無傷基底膜複合体の存在又は不在下で無細胞性と細胞
性ヒト真皮基質の比較を試験した。線維芽細胞がないが無傷基底膜を維持する乳
頭真皮、及び皮膚線維芽細胞で占められた網状真皮は共にケラチン細胞増殖の良
好な基質であることがわかった。これらの結果から、試験管内皮膚の作製に基底
膜及び/ 又は皮膚線維芽細胞が重要であることが示された。
上述のように、完全に分化した真皮を支持する線維芽細胞の必要を示す多数の
研究がある。現在まで、真皮基質の大部分はヒト線維芽細胞がケラチン細胞培養
前に播種する動物コラーゲンゲルから構成されてきた。線維芽細胞の添加時に、
コラーゲンマトリックスは元のサイズの約２／３まで収縮する。これらの相互作
用に関してKrejciらによる報告が特に興味深い。無傷基底膜を有する無細胞性真
皮基質は、表皮の再構成を支持するのに線維芽細胞で占められた網状真皮ほど有
効であることが証明された。基底膜は、線維芽細胞及びケラチン細胞によって分
泌される増殖因子、カルシウム及び他のまだ同定されていない物質のシンクとし
て作用することが論議される。このようにして、最適に保存された無細胞性真皮
と無傷基底膜は、ある期間ケラチン細胞増殖を支持することができる。これらの
貯蔵物が使われた後、増殖因子を再構成し表皮を維持するために線維芽細胞が必
要となる。Higounencらによる報告はこの仮説と一致している。ＤＥＤで再構成
された表皮は、生体内皮膚に極めて類似した形態学的及び生化学的特性を示しつ
つ動物に移植後まで完全に標準化しないことがわかった。
Bellらによって報告されたように生合成複合皮膚を作製することが試みられた
。この複合物は、ケラチン細胞で被せる前に収縮するウシコラーゲンの格子に播
種した線維芽細胞から構成された。これらの実験から、多層表皮の作製及び２週
間以内に基底膜成分の生成が報告された。この研究は、GraftskinTM（Organogen
esis，マサチューセッツ州カントン）作製の基礎であった。Graftskinは、現在
慢性潰瘍治療に使用するための臨床試験における再構成複合皮膚である。
１９８８年に Boyceらは、Bellによって開発されたものと同様の合成の生物学
的真皮基質を導入した。この基質は、成分コラーゲン−グリコサミノグリカンマ
トリックス中のヒト線維芽細胞から構成された。この基質にケラチン細胞を播種
した後、ラミニン及びＩＶ型コラーゲンの試験管内産生増加、及び細胞層の増加
した厚い表皮が認められた。次に、この複合物をヌードマウスの全層創傷をカバ
ーする培養した上皮自家シート（ＣＥＡ）と比較した。複合移植片は、ＣＥＡよ
り表皮網隆線形成の増加、良好な密着及び長時間の維持を示した。しかしながら
、このマトリックスのヒト臨床応用の報告はない。
Hansbroughらは、前述のものより改良された複合移植片として記載されたもの
について報告した。その皮膚代替品は、合成ポリグラクチンメッシュに培養した
ヒト線維芽細胞から構成された。複合物は、更に、Advanced Tissue Sciences，
カリフォルニア州ラホーヤで開発され、今ではDermagraftTMと呼ばれている。こ
の基質の報告された利点は、タンパク質分解より加水分解によって吸収されるこ
とであった。しかしながら、ヌードマウスでの結果は前述のものより高い治癒特
性を示さなかった。更に、臨床応用にもかかわらず全層火傷外傷における真皮と
表皮双方の満足すべき再構成の報告はない。
無細胞性真皮：発明者らは、以前に、ヒト又はブタ起原の無傷無細胞性真皮マト
された。
処理及び保存法は、次の基準を特に満たす移植可能な生物学的組織移植片を生
じるように設計された。
（ａ）宿主によって再造形及び修復される細胞外タンパク質及びコラーゲンマト
リックスを供給する、
（ｂ）生存できる内皮細胞又は上皮細胞の安全な付着の無傷基底膜を供給する、
（ｃ）宿主による特定の免疫応答を誘発しない、
（ｄ）石灰化しない、及び
（ｅ）周囲温度で容易に貯蔵及び輸送される。
この方法で処理した真皮マトリックスは、コラーゲンＩＶ型及びＶＩＩ型及びラ
ミニンを含む基底膜複合体の主成分の全てをもっていることがわかった。更に、
そのマトリックスは、欠損真皮を取り替え、宿主線維芽細胞と内皮細胞の直接浸
潤を可能にし、薄い自家分層皮膚移植片(ＳＴＳＧ)[ケラチン細胞の供給源とし
て]の使用を可能にし、供給部位に対する外傷を少なくすることにより、重症の
火傷創の移植片として有効であることがわかった。
表皮：表皮は、主としてケラチン細胞から構成される絶えず新しくなる組織であ
る。そのようなものとして表皮には少なくとも３種類の機能的に異なる種類のケ
ラチン細胞がある。１．幹細胞（前駆細胞）、２．一過性増幅細胞（急速な分裂
増殖を限られた時間のみ示す）、及び３．分裂終了細胞（成熟分化した）。この
形では、幹細胞は遂には表皮における全ケラチン細胞置換に関与し、器官の長期
維持に不可欠である。従って、表皮幹細胞は、移植上皮の長期持続に必要である
。
ケラチン細胞研究に関する現在の文献は、表皮幹細胞に対するいくつかの文献
を含んでいる（下記に詳述される）。残念ながら、造血系と異なり、推定表皮幹
細胞に特異的なマーカーはまだ同定されていない。しかしながら、表皮幹細胞は
、表皮の他のケラチン細胞と区別する数種の異なる物理的及び機能的特性と関連
がある。これらの性質としては、長い細胞周期；インテグリン又は特定のサイト
ケラチンを含む他のマーカー；他のケラチン細胞に相対する小さな細胞サイズ；
及び基底膜成分への急速な付着が含まれる。これらの性質は、無傷無細胞性真皮
マトリックスと組合わせて複合皮膚を作製する表皮幹細胞の単離及び強化のプロ
トコールを開発するために用いられる。表皮幹細胞の単離は、物理的性質は既知
であるがタンパク質の配列は得られないタンパク質精製に用いられる方法と同様
である。従って、分子量、電荷、溶解度又は選択的吸着（タンパク質精製に用い
られる）による分離及び単離の代わりに、細胞周期、細胞サイズ、インテグリン
又はサイトケラチン発現及び付着基準の差を利用することにより表皮幹細胞を選
択的に強化することができる。表皮幹細胞は、緩慢な周期を利用することにより
選択的に標識され、続いてサイズ、マーカー発現及び／又は異なる基質に対する
選択的付着の差によって標識細胞が選択的に単離される。推定表皮幹細胞による
物理的及び機能的性質を利用することにより、これらの細胞を強化し、複合移植
片における新表皮の形成を高めることができる。付着による幹細胞強化
：基底膜成分に最も急速に付着する表皮ケラチン細胞は、
最大コロニー形成率をもっていることがわかった。特に、Jonesらにより報告さ
れた研究から、わずか５分でコラーゲンＩＶ型被覆皿に付着するケラチン細胞が
付着に長くかかるものよりコロニー形成率が高いことがわかった。表皮前駆細胞
は、ＩＶ型コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン又はこれらの被覆剤で被覆
した培養容器を用いるパンニング法を行うことにより単離される。また、パンニ
ング法は、正しい３次元配置でのラミニン及びコラーゲンＩＶ型及びＶＩＩ型を
含む無傷基底膜を有する無細胞性真皮マトリックスを用いて行われる。また、無
細胞性真皮マトリックスに存在する基底膜複合体の部分的分解は、創傷場面に似
せてマトリックス上のケラチン細胞増殖を活性化することが必要である。基底膜
は、ディスパースＩＩ又はサーモリシンによる酵素処理で部分的に分解される。
完全な状態の真皮がこれらの酵素処理中に妥協されないことを行わせるために真
皮に存在するコラーゲンに厳密に注意しなければならない。次に、ケラチン細胞
が処理真皮マトリックスの範囲に播種される。細胞サイズによる表皮幹細胞の選択的単離
：表皮幹細胞のその性質を利用するた
めに、ケラチン細胞は密度勾配遠心分離、単位重力沈降を用いてサイズで分離さ
れるか或いは細胞選別機を用いてサイズで選別される。
密度勾配遠心分離は、ケラチン細胞で連続コロイドシリカ(Percoll)密度勾配
を用いて達成される。この手法を用いてケラチン細胞の３画分が単離されること
が報告される。これは、表皮に存在する３種類の提唱されたケラチン細胞（幹細
胞、一過性増幅細胞及び最終分化細胞）と十分に対応する。また、単位重力沈降
も行われる。この方法は、ケラチン細胞の増殖的及び最終分化亜集団を分離する
ために異なる実験室で用いられた。新たに単離したケラチン細胞を改変した沈降
チャンバに入れ、細胞の分割量を取り除き、局在実験でわかった標識保持を試験
する。細胞について、幹細胞単離の指数としてコロニー形成率分析（ＣＦＥ）及
び軟寒天内増殖によって前駆細胞表現型が評価される。それらの手法による潜在
的問題点としては、ａ）単細胞浮遊液に対する分散は異なる速度で沈降する細胞
凝集塊を避けるために十分に有効でなければならないこと、及びｂ）幹細胞と一
過性増幅細胞間のサイズ微分は１〜２マイクロメートル程度であり有効な分離を
非常に困難にすることが含まれる。表皮が単細胞に効率よく分散されない場合に
は、細胞の凝集塊は滅菌木綿又はナイロンメッシュでろ過される。異なるケラチ
ン細胞亜集団はサイズが極めて密接しているが、それらの手法は非選択集団より
強化される。抗増殖による幹細胞強化
：他の細胞選択法は、急速分裂細胞の選択的死滅を含む
（負の選択法）。５−フルオロウラシル抗代謝剤は、急速分裂又は代謝的に活性
な細胞を死滅させるために他の系で用いられた。本系では、５−ＦＵは、長い細
胞周期を有する表皮幹細胞を回避しつつ短い細胞周期を有する一過性増幅（急速
分裂）細胞を選択的に死滅させる試験管内培養条件で用いられる。これは、急速
増殖ケラチン細胞の培養で５−ＦＵをパルス投与することにより達成される。こ
れらの条件は、１×１０-7M レチノイン酸の存在下２４時間の培養に続いて１×
１０-5M イソプロテレノールの２４時間添加が含まれる。
皮膚（又は培養内ケラチン細胞）の高熱処理は、ＵＶＢ（２９０〜３２０nm）
曝露により細胞死を減少させることがわかった。高熱法は、マウス骨髄細胞に効
果的であることがわかった。Wierengaらは、最初の骨髄幹細胞が分化した細胞と
比べた場合に非常に耐熱性であることを報告している。急性（0.5〜１時間）熱
曝露（４０〜４４℃）は、急速に分裂するケラチン細胞集団を除去するために用
いられる。また、他の環境的操作も表皮幹細胞に選択圧を与えることができる。
特に、かかる変化に対する耐性として冷却法及び酸素圧低下は、生体内幹細胞を
維持するという決定的重要性と一致している。選別法による幹細胞強化
：ケラチン細胞の異なる集団を単離するために現在用い
られている最も精巧な方法はおそらく細胞選別法を必要とする。これらの手法を
用いて、最大レベルのα２β１インテグリンを発現するケラチン細胞が最大コロ
ニー形成率をもつことが報告された。蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）は、ユ
ニークなマーカーを発現する細胞集団を単離するために多くの異なる系で用いら
れた。ＦＡＣＳは、単離される特定の細胞を標識するフルオレセイン結合マーカ
ー又は抗体に依存する。上述のように、特定のマーカーは表皮幹細胞についてま
だ同定されていない。しかしながら、最近の科学雑誌の論文にサイトケラチンＫ
１９を発現するケラチン細胞の集団が記載された。それらの細胞は、表皮幹細胞
による表現型特性をもっている。サイトケラチンＫ１９に対する抗体は、市販さ
れており、ケラチン細胞の集団のＦＡＣＳに用いられる。
一部には表皮幹細胞の精製の手法が現在ないために及び一部には培養に入れた
場合に分化するケラチン細胞の種類のために、上皮幹細胞の生体外増殖はまだ記
載されていない。しかしながら、この問題は造血系では克服された。造血幹細胞
の増殖に関して数種の異なる増殖因子がもつ効果を調べることにより、研究者ら
は最初の未分化状態でその幹細胞を維持する培養条件を定義することができた。
それらの増殖因子としては、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、顆粒球マクロフ
ァージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及び種々のインターロイキンが含まれ
る。表皮幹細胞の単離に続いて増殖
：表皮前駆細胞の単離に続いて真皮マトリックス
に被覆する前にそれらの細胞が制限増殖される。その目的は、細胞を分裂するよ
うに誘導して無細胞性真皮マトリックスに播種するのに有効な前駆細胞数を増加
させるためである。
最終分化の始動状態に入るようにケラチン細胞を誘導する明確なスイッチ機構
について現在ほとんど知られていない。しかしながら、その現象に洞察を与える
ことができる造血系における例がある。ＰＤＧＦ、ＧＭ−ＣＳＦ及び種々のイン
ターロイキンを含む造血幹細胞培養物を維持するのに特定の増殖因子が必要であ
ることがわかった。それらの因子の組合わせは、培養内で造血幹細胞を増殖する
ために用いられた。
表皮は、身体の最も活性な分泌組織の１つとして認識されるようになった。ケ
ラチン細胞は、インターロイキン−１、−３、−６、−７、−８及び−１０、コ
ロニー刺激因子の顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロ
ニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）及びＧＭ−ＣＳＦ、アラキドン酸代謝生成物、ビタ
ミンＤ3の代謝生成物、副甲状腺ホルモン関連タンパク質、コラーゲナーゼ、金
属プロテイナーゼの組織インヒビター及び組織プラスミノーゲンアクチベーター
、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ−α）、ＴＧＦ−β、腫瘍壊死因子
α（ＴＮＦ−α）、ＰＤＧＦ及び細胞内接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）を分泌す
ることがわかった。これは部分的リストにすぎず、表皮における増殖調節の複雑
さが強調される。
一次ケラチン細胞は、試験管内で有限寿命を示す。表皮幹細胞を保持するのに
最適な培養条件は、理論的にそれらの細胞の無制限培養及び増殖を可能にする。
臨床使用の実用的な意味では、できる限り速やかに無細胞性真皮マトリックスに
ケラチン細胞を播種することが有益である。これを促進するために、幹細胞を１
回又は２回分裂するように誘導する刺激シグナルは最終増殖比率に対して劇的な
効果がある。
単離した表皮幹細胞は、ケラチン細胞増殖を促進することがわかった次の増殖
因子の１種以上を含む培養液で培養される：血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、
顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(ＧＭ−ＣＳＦ)(共に造血幹細胞増殖
に必要であることがわかった)、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、トランスフォ
ーミング増殖因子α(ＴＧＦ−α)(共にケラチン細胞増殖の強力な促進剤)及び
ケラチン細胞増殖因子（ＫＧＦ）。表皮においてごく最近わかった増殖因子の１
種ＫＧＦは、線維芽細胞増殖因子ファミリーの新規な１種であり、ケラチン細胞
増殖に対して促進作用があることがわかった。これらの培養条件としては、３Ｔ
３線維芽細胞支持層上での細胞の増殖が含まれる。
実施例１
解離したケラチン細胞を無傷無細胞性真皮マトリックスと共に用いる
再構成複合皮膚の作製
本発明の好適実施態様においては、新鮮ヒト皮膚の生検物から単離したケラチ
ン細胞を無傷無細胞性真皮マトリックスに直接適用し、皮膚欠損部に移植する。
新鮮皮膚の生検物は１０％ウシ胎児血清、ペニシリン及びストレプトマイシン
を含有する細胞培養液中で輸送される。組織は４℃に保持され、２４時間以内に
処理される。組織を滅菌器具で処理し、切開して付着した脂肪を取り除き、幅が
４mmをより大きくない切片に切断する。皮膚は、トリプシン、ディスパーゼ、サ
ーモリシン又はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む種々の酵素物質で脱
表皮化される。最適方法は、ディスパーゼＩＩ（2.４単位／ml）中３７℃で1.5
〜２時間周期的な旋回混合しながらインキュベートし、続いて0.25％トリプシン
＋１mMＥＤＴＡ中３７℃でインキュベートすることを含む。次に上清をピペット
で別々のバイアルに取り、遠心して細胞を沈降させ、増殖培養液に再懸濁する。
この培養液は１０％ウシ胎児血清、５g/mlインスリン、0.5g/mlヒドロコルチゾ
ン、１０ ng/ml表皮増殖因子、１０ ng/mlコレラ毒素及び0.15mMＣａ++で補足し
たＤＭＥＭ： HamのＦ−１２の３：１混合物から構成される。次に、細胞は無細
胞性真皮マトリックスに播種され、患者に移植される。
次の操作を含む、表皮細胞の単離、試験管内培養及び無細胞性真皮マトリック
スの播種を含む数種の組合わせが達成される。
Ｉ 表皮細胞の播種の以前の日に無細胞性真皮マトリックスを患者に移植する。
これにより、真皮マトリックス時間が表皮細胞を適用する前に血管新生すること
を可能にする。
II 皮膚生検物は好適実施態様に記載されたように処理され、続いて細胞数が増
加する間に試験管内培養して移植前に無細胞性真皮マトリックスの大きな範囲を
播種することを可能にする。
III 無細胞性真皮マトリックスを、上記IIのように増殖した表皮細胞を播種する
以前の日に患者に移植する。
IV 単離した上皮細胞を無細胞性真皮マトリックスに直接播種し、続いて移植前
に無細胞性真皮マトリックス上で培養及び増殖する。これは、ハンクス平衡塩類
溶液（ＨＢＳＳ）で３回洗浄して真皮マトリックスを水和し、マトリックスを培
養フラスコ又は皿に表を上にする基底膜と共に入れる。次に、単離したヒトケラ
チン細胞を真皮マトリックス上に播種し（約５×１０4細胞／cm2真皮マトリック
ス）、細胞培養インキュベーター内で培養液を変える前の２４〜４８時間静置し
た。この時間後、培養液を１０-7M 全トランスレチノイン酸を含有する新鮮培養
液に変える。１６〜２４時間後に培養液を１０-5M ＋／−イソプロテレノールを
添加して変える。２４時間曝露した後に真皮マトリックスを横切るケラチン細胞
の集密層がある。この時点で複合移植片が移植される。
Ｖ 複合移植片が生体外培養で続けられ、上げた培養面（金属スクリーンのよう
な）の使用により空気−液体界面まで上げ、培養液は下からだけ複合物に達する
ことができる。この移植片の上面曝露は、ケラチン細胞を分化プログラムを開始
するように誘導し、重層表皮の形成をもたらす。空気−液体培養での培養液は、
上皮培養内で重層を誘導することがわかった他の化学薬品又は試薬で補足される
。これらの試薬は、塩化カルシウム又は酪酸ナトリウムが含まれるがこれらに限
定されない。得られた複合移植片は完全な重層表皮を含む。この時点で複合物は
移植される。
VI また、上皮細胞は真皮マトリックスに被覆する前にＣＥＡシートを作製する
ために培養される。本方法は、集密まで又は集密を超える単離ケラチン細胞の培
養を含み、そのときにケラチン細胞の無傷シートを形成する。次に、このシート
は、細胞の基質への付着を破壊するが細胞−細胞接触を妨害しないディスパーゼ
のような酵素で処理することにより培養容器から脱離する。ＣＥＡシートはワセ
リンガーゼのような担体を用いて無細胞性真皮マトリックスに移され、続いて移
植される。
VII 無細胞性皮膚マトリックスは、上記VIのように作製されたＣＥＡシートを被
覆する前に患者日に移植される。
実施例２
無細胞性真皮マトリックスと組合わせたマイクロスキン植皮術
本発明の好適実施態様においては、自家分層新鮮ヒト皮膚の小片を連続切断ブ
レードホイールを備えたスキンメッシャーに通過毎に９０°で２回通過させる。
また、皮膚は鋭い小刀を用いて約１〜1.5nm2の小片に切断される。これらのマイ
クロスキン片を、開始皮膚片の元の範囲の約１０〜５０倍である無細胞性真皮マ
トリックスの基底膜表面の範囲を横切って一様に広げる。次に、複合移植片を創
傷表面に移植し、凍結保存ヒト同種移植皮膚のシート移植片で被覆する。
次の操作を含む、無細胞性真皮マトリックスと組合わせたマイクロスキン植皮
術の数種の組合わせが達成される。
Ｉ マイクロスキンを、以前の日に患者に移植した無細胞性真皮マトリックスに
移す。
II 好適実施態様の複合物を、移植前に実施例１に記載されたように空気−液体
界面で生体外培養内で増殖する。
III 好適実施態様の複合物は同種間皮膚生検物から得られたマイクロスキン片か
ら構成される。
IV 同種間マイクロスキンを、以前の日に患者に移植した無細胞性真皮マトリッ
クスに移す。
Ｖ III の複合物を、移植する前に実施例１に記載されたように空気−液体界面
で生体外培養内で増殖する。
VI 好適実施態様の複合物及びＩ〜Ｖに記載されたものを合成ポリマー膜で被覆
し、次に、凍結保存ヒト同種皮膚で移植時に上に被せる。
実施例３
上皮前駆細胞又は幹細胞の特性を示す上皮細胞の選択
本発明の好適実施態様においては、表皮幹細胞はパンニング基質として無細胞
性真皮マトリックスを用いて単離される。これは、ＩＶ型コラーゲンに急速に付
着する推定表皮幹細胞の前述の特性を利用する。無細胞性真皮マトリックスの基
底膜は、主としてＩＶ型コラーゲンから構成される。全上皮細胞浮遊液を真皮マ
トリックス上で３０分間インキュベートする。次に、マトリックスを培養液の弱
い流れで洗浄して付着しない細胞を洗い流し、患者に移植する。
幹細胞単離、増殖、無細胞性真皮マトリックスの播種及び移植を含む本植皮術
場面の数種の形がある。それらの手法は次の操作が含まれる。
Ｉ 好適実施態様に記載された無細胞性真皮マトリックスによるパンニングに続
いてトリプシンを用いて付着した細胞を真皮マトリックスから脱離し、以前の日
に患者に移植した無細胞性真皮マトリックスに播種する。
II 細胞サイズの差に基づいて分離する手法によって表皮前駆細胞を単離し、続
いて選択した細胞を無細胞性真皮マトリックスに播種し移植する。
III 種々の真皮マトリックス成分（例えば、フィブロネクチン、Ｉ型コラーゲン
、ビトロネクチン又は種々のグリコサミノグリカン）で被覆した培養皿への選択
的付着に基づいて分離する手法によって表皮前駆細胞を単離し、続いてトリプシ
ンを用いて細胞を培養皿から脱離し、真皮マトリックスに播種し、移植する。
IV 抗増殖剤を用いて急速分裂細胞の選択的死滅に基づいて分離する手法によっ
て表皮前駆細胞を単離し、続いて選択した細胞を無細胞性真皮マトリックスに播
種し、移植する。
Ｖ 特定のマーカーを発現する細胞の選択的選別に基づいて分離する手法によっ
て表皮前駆細胞を単離し、続いて無細胞性真皮マトリックスを播種し、移植する
。
VI II〜VIに記載された手法のいずれかを用いて細胞を単離し、続いて以前の日
に患者に移植された無細胞性真皮マトリックスを播種する。
VII II〜Ｖに示された手法のいずれかを用いて細胞を単離し、続いて無細胞性真
皮マトリックスの播種前に細胞を生体外増殖し、移植する。
VIII VIIに記載されたように細胞を単離及び増殖し、続いて以前の日に患者に移
植された無細胞性真皮マトリックスに播種する。
IX VIIに記載された手法を用いて細胞を単離し、無細胞性真皮マトリックスに
播種し、移植前に真皮マトリックス上で増殖させる。The present invention relates to a method for developing a reconstructed skin composite for transplantation. The method creates a reconstructed skin consisting of an intact biological acellular dermal matrix and epidermal cells that can serve as a replacement for full thickness skin defects. Current standard skin grafting for full-thickness skin injury requires the use of autologous skin grafts (STSG). Although this has been shown to be a lifesaving law, there is still a need for improvements in the cosmetic and functional end-products of trauma at the supply site and the original wound. In full skin injury, STSG must supply both the dermal and epidermal components of wound VEGF. If the autologous site is restricted, the STSG must be reticulated and prosthetic to cover the entire wound area. This reticulated skin shape leaves a wound area that is not covered by both the dermis and epidermis. The transplanted epidermal epithelial cells eventually migrate to and cover the interstices of the meshwork to facilitate wound closure. However, because the dermis is not a regenerative tissue, scarring and contracture problems later arise when the graft contracts because some do not have enough dermis. Another method where the STSG supply site is restricted is to culture epithelial cells from a healthy fresh skin biopsy. The cells can be grown in culture to cover a much larger area than the original biopsy site. Studies examining the conditions necessary to grow keratinocytes in vitro began to emerge in the late 1960s and early 1970s. This study aimed to define the culture conditions needed to grow untransformed keratinocytes for extended periods of time in vitro. Pioneering research in this area was done by Rheinwald & Green. One of the most important findings in that early work was the use of a culture supplemented with mouse fibroblast 3T3 feeder layer and epidermal growth factor (EGF). EGF was found to be a potent mitogen for keratinocyte proliferation, and the cells were able to grow for several generations in vitro. Since then, several additives, including cholera toxin, insulin, and insulin-like growth factor, bovine pituitary extract, hydrocortisone, and fetal calf serum, have been found to be important additives for keratinocyte culture. This study resulted in the development of a serum-free complete synthetic culture (MCDB-153) developed by Boyce & Ham. These findings have allowed researchers to grow keratinocytes in vitro for 10+ passages. Culture of epithelial cells from skin biopsies requires that the epidermis be separated from the dermis. This is achieved using one or a combination of the following enzymes and chemicals: dispase, thermolysin, trypsin or ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) to separate the two different layers of the skin. Next, the separated epidermis is incubated in trypsin + EDTA to dissociate the epidermis into a cell suspension. It was also found that trypsin / EDTA incubation following microcutting of hair follicles resulted in proliferation of a population of keratinocytes. Next, the dissociated cells are combined with a growth factor, the presence or absence of serum, and irradiated or mitomycin-treated mouse fibroblasts in combination with a culture solution. If cells remain in culture or remain excessively confluent, form an intact sheet of keratinocytes. The sheet is then detached from the culture vessel by treatment with an enzyme such as dispase, which disrupts the attachment of the cells to the substrate but does not interfere with cell-cell contact. Autologous keratinocytes of these intact sheets (called cultured epithelial autografts or CEAs) are made from small biopsies obtained from patients. However, the production of these sheets requires several weeks of culture time. Initial interest and use of the CEA technique was high, but lack of dermal replacement as the long-term results were obtained includes low overall survival, scarring, and immature basement membrane formation leading to epidermal fragility It was clear that this method had significant limitations. Further, alternative methods of covering extensive burn wounds are micromeshed or microskin grafts. If the self-feeding site is limited, the available STSGs can be reticulated and spread (typically 4: 1 or more) or cut and minced by passing the tissue through a standard mesher multiple times in different directions. You. Studies have shown that a wide range of reticular autografts can eventually close large full-thickness wounds, but these grafts a) take a long time to re-epithelialize the reticular graft gap B) produces a "pabble-like appearance" at the site of implantation and c) often results in weakening of scars and contractures. As in the case of CEA skin grafts, the lack of a dermis replacement in these methods has significant limitations on the cosmetic and functional end products. The use of an acellular dermal matrix and an intact basement membrane complex together with the technique allows for good cosmetic and functional performance of the wound site. Epithelial cells migrating from the microskin pieces to the basement membrane of the acellular dermis eventually migrate below the microskin pieces and detach them from the surface. This results in a smooth implant surface without a cobblestone appearance. The presence of the acellular dermal matrix reduces scarring and contracture at the implantation site. To be fully effective, a full thickness burn wound implant must have the following characteristics: a) replaces both defective dermis and epidermis; b) does not require extensive in vitro cell culture to create implants; c) reduces surgery morbidity and mortality in a single operation In addition, costs are reduced as a result of shorter hospital stays. The invention of this patent encompasses the use of an intact acellular dermal matrix and epithelial cells to reconstitute a composite skin that meets these needs. Dermal Matrix and In Vitro Reconstructed Skin: An approach to making reconstructed skin involves using de-epidermal dermis (DED) and was first studied by Prunieras et al. This dermal matrix is usually made by incubating human skin for a long time in phosphate buffered saline or by repeatedly freezing and thawing the skin to kill all dermal and epidermal cells. The results from this approach were variable. Human studies have shown that the viability of skin wounds using this substrate is poor. Examined the comparison of acellular and cellular human dermal matrix in the presence or absence of an intact basement membrane complex in vitro. The papillary dermis, which lacks fibroblasts but maintains the intact basement membrane, and the reticular dermis occupied by dermal fibroblasts were both found to be good substrates for keratinocyte proliferation. These results indicated that basement membrane and / or dermal fibroblasts are important for the preparation of in vitro skin. As noted above, there are numerous studies showing the need for fibroblasts to support fully differentiated dermis. To date, the majority of the dermal matrix has been composed of animal collagen gels that human fibroblasts seed before keratinocyte culture. Upon the addition of fibroblasts, the collagen matrix shrinks to about 2/3 of its original size. Of particular interest is the report by Krejci et al. On these interactions. Acellular dermal matrix with an intact basement membrane has proven to be more effective in supporting epidermal remodeling than the reticular dermis occupied by fibroblasts. It is discussed that the basement membrane acts as a sink for growth factors, calcium and other unidentified substances secreted by fibroblasts and keratinocytes. In this way, the optimally preserved acellular dermis and intact basement membrane can support keratinocyte proliferation for a period of time. After these stores are used, fibroblasts are needed to reconstitute the growth factors and maintain the epidermis. The report by Higounenc et al. Is consistent with this hypothesis. The epidermis reconstituted with DED was found not to be fully standardized until after implantation in animals, exhibiting morphological and biochemical properties very similar to in vivo skin. Attempts have been made to produce biosynthetic composite skin as reported by Bell et al. This composite consisted of fibroblasts seeded on a grid of bovine collagen that contracted before overlaying with keratinocytes. These experiments reported the production of a multi-layer epidermis and the formation of basement membrane components within two weeks. This study is Graftskin TM (Organogenesis, Canton, MA). Graftskin is a reconstructed complex skin in clinical trials currently for use in treating chronic ulcers. In 1988, Boyce et al. Introduced a synthetic biological dermal substrate similar to that developed by Bell. This matrix was composed of human fibroblasts in the component collagen-glycosaminoglycan matrix. After seeding keratinocytes on this substrate, increased in vitro production of laminin and type IV collagen and a thicker epidermis with an increased cell layer were observed. The composite was then compared to a cultured autologous epithelial sheet (CEA) covering the full thickness wound of nude mice. The composite graft showed increased epidermal ridge formation, better adherence, and longer maintenance than CEA. However, there is no report on human clinical application of this matrix. Hansbrough et al. Reported on what was described as a composite graft that was an improvement over the previous one. The skin substitute consisted of human fibroblasts cultured on a synthetic polyglactin mesh. The conjugate was further developed at Advanced Tissue Sciences, La Jolla, California and is now Dermagraft TM It is called. The reported benefit of this substrate was that it was absorbed by hydrolysis rather than proteolysis. However, the results in nude mice did not show higher healing properties than those described above. Furthermore, there are no reports of satisfactory reconstitution of both dermis and epidermis in full thickness burn injuries despite clinical application. Acellular dermis: The inventors have previously described intact acellular dermal matrices of human or porcine origin. Was done. The processing and storage methods were designed to produce implantable biological tissue grafts that specifically meet the following criteria: (A) providing extracellular proteins and collagen matrices that are remodeled and repaired by the host; (b) providing an intact basement membrane for safe attachment of viable endothelial or epithelial cells; (c) specific by the host Does not elicit an immune response, (d) does not calcify, and (e) is easily stored and transported at ambient temperature. The dermal matrix treated in this manner was found to have all of the major components of the basement membrane complex including collagen types IV and VII and laminin. Further, the matrix replaces defective dermis, allows direct infiltration of host fibroblasts and endothelial cells, and allows the use of thin autologous skin grafts (STSG) [as a source of keratinocytes]. By reducing trauma to the site, it was found to be effective as a graft for severe burn wounds. Epidermis: The epidermis is a constantly renewed tissue composed primarily of keratinocytes. As such, there are at least three functionally different types of keratinocytes in the epidermis. 1. 1. stem cells (progenitor cells); 2. transiently expanded cells (showing rapid mitotic proliferation for a limited time only); Post-mitotic cells (mature differentiated). In this form, stem cells are ultimately involved in total keratinocyte replacement in the epidermis and are essential for long-term maintenance of the organ. Thus, epidermal stem cells are required for long-term persistence of the transplanted epithelium. The current literature on keratinocyte research includes some literature on epidermal stem cells (detailed below). Unfortunately, unlike the hematopoietic system, a marker specific for putative epidermal stem cells has not yet been identified. However, epidermal stem cells are associated with several different physical and functional properties that distinguish them from other keratinocytes of the epidermis. These properties include a long cell cycle; other markers, including integrins or specific cytokeratins; small cell size relative to other keratinocytes; and rapid attachment to basement membrane components. These properties are used to develop a protocol for the isolation and enrichment of epidermal stem cells that combine with an intact acellular dermal matrix to make composite skin. Isolation of epidermal stem cells is similar to the method used for protein purification where the physical properties are known but the protein sequence is not available. Thus, instead of separation and isolation by molecular weight, charge, solubility or selective adsorption (used for protein purification), epidermal stem cells can be exploited by taking advantage of differences in cell cycle, cell size, integrin or cytokeratin expression and attachment criteria. Can be selectively enhanced. Epidermal stem cells are selectively labeled by utilizing a slow cycle, followed by selective isolation of labeled cells by differences in size, marker expression and / or selective attachment to different substrates. By exploiting the physical and functional properties of putative epidermal stem cells, these cells can be strengthened and enhanced neo-epidermal formation in composite grafts. Stem cell enhancement by adhesion : It was found that the epidermal keratinocytes that adhered most rapidly to the basement membrane component had the highest colony formation rate. In particular, studies reported by Jones et al. Showed that keratinocytes attached to collagen type IV coated dishes in only 5 minutes had a higher colony formation rate than those that took longer to attach. Epidermal progenitor cells are isolated by performing a panning method using a culture vessel coated with type IV collagen, fibronectin, laminin, or a coating agent thereof. The panning procedure is also performed using an acellular dermal matrix with an intact basement membrane containing laminin and collagen types IV and VII in the correct three-dimensional configuration. Also, partial degradation of the basement membrane complex present in the acellular dermal matrix is necessary to activate keratinocyte proliferation on the matrix to mimic the wound scene. The basement membrane is partially degraded by enzymatic treatment with Disperse II or thermolysin. Strict attention must be paid to the collagen present in the dermis to make sure that the intact dermis is not compromised during these enzyme treatments. Next, keratinocytes are seeded in the area of the treated dermal matrix. Selective isolation of epidermal stem cells by cell size : To take advantage of its properties of epidermal stem cells, keratinocytes are separated in size using density gradient centrifugation, unit gravity sedimentation, or sorted in size using a cell sorter. Density gradient centrifugation is achieved on keratinocytes using a continuous colloidal silica (Percoll) density gradient. It is reported that three fractions of keratinocytes are isolated using this technique. This corresponds well to the three proposed keratinocytes present in the epidermis (stem cells, transiently expanded cells and terminally differentiated cells). In addition, unit gravity settling is also performed. This method was used in different laboratories to separate proliferating and terminally differentiated subpopulations of keratinocytes. Freshly isolated keratinocytes are placed in a modified sedimentation chamber, the aliquots of the cells are removed, and the label retention determined by localization experiments is tested. Cells are assessed for progenitor phenotype by colony formation analysis (CFE) and growth in soft agar as an index of stem cell isolation. Potential problems with these approaches include: a) that the dispersion in a single cell suspension must be sufficiently effective to avoid cell clumps that settle at different rates; and b) stem cells and transiently expanded cells. The size differential between them is on the order of 1-2 micrometers, which involves making effective separation very difficult. If the epidermis is not efficiently dispersed into single cells, cell clumps are filtered through sterile cotton or nylon mesh. Although different keratinocyte subpopulations are very close in size, their approach is enhanced over unselected populations. Stem cell enhancement by anti-proliferation : Other cell selection methods include the selective killing of rapidly dividing cells (negative selection method). 5-Fluorouracil antimetabolites have been used in other systems to kill rapidly dividing or metabolically active cells. In this system, 5-FU is used in in vitro culture conditions to selectively kill transiently expanded (rapidly dividing) cells having a short cell cycle while avoiding epidermal stem cells having a long cell cycle. This is achieved by pulsing 5-FU in a culture of rapidly growing keratinocytes. These conditions are 1 × 10 -7 Following culture for 24 hours in the presence of M retinoic acid, 1 × 10 -Five Includes a 24 hour addition of M isoproterenol. High heat treatment of skin (or keratinocytes in culture) was found to reduce cell death upon UVB (290-320 nm) exposure. The hyperthermia method was found to be effective on mouse bone marrow cells. Wierenga et al. Report that the initial bone marrow stem cells are very thermostable when compared to differentiated cells. Acute (0.5-1 hour) heat exposure (40-44 ° C.) is used to remove rapidly dividing keratinocyte populations. Other environmental manipulations can also exert selective pressure on epidermal stem cells. In particular, the cooling method and hypoxia as resistance to such changes are consistent with the critical importance of maintaining stem cells in vivo. Stem cell enhancement by selection method : The most sophisticated methods currently used to isolate different populations of keratinocytes probably require cell sorting. Using these approaches, keratinocytes expressing the highest levels of α2β1 integrin were reported to have the highest colony formation rates. Fluorescence activated cell sorting (FACS) has been used in many different systems to isolate cell populations expressing unique markers. FACS relies on a fluorescein binding marker or antibody that labels the particular cell being isolated. As mentioned above, certain markers have not yet been identified for epidermal stem cells. However, a recent scientific journal article described a population of keratinocytes expressing cytokeratin K19. These cells have the phenotypic characteristics of epidermal stem cells. Antibodies to cytokeratin K19 are commercially available and are used for FACS of keratinocyte populations. In vitro proliferation of epithelial stem cells has not yet been described, in part because there is currently no technique for purifying epidermal stem cells and in part because of the type of keratinocytes that differentiate when placed in culture. However, this problem has been overcome in the hematopoietic system. By examining the effects of several different growth factors on the growth of hematopoietic stem cells, researchers were able to define the culture conditions that maintain the stem cells in an initially undifferentiated state. These growth factors include platelet-derived growth factor (PDGF), granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and various interleukins. Proliferation following isolation of epidermal stem cells : Following the isolation of epidermal progenitor cells, they are restrictedly expanded before coating on the dermal matrix. The purpose is to increase the number of progenitor cells available to induce the cells to divide and to seed the acellular dermal matrix. Little is currently known about the well-defined switch mechanism that induces keratinocytes to enter the terminal state of terminal differentiation. However, there are examples in the hematopoietic system that can provide insight into the phenomenon. Certain growth factors were found to be required to maintain hematopoietic stem cell cultures containing PDGF, GM-CSF and various interleukins. A combination of these factors was used to expand hematopoietic stem cells in culture. The epidermis has become recognized as one of the most active secretory tissues of the body. The keratinocytes are interleukin-1, -3, -6, -7, -8 and -10, the colony stimulating factors granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), macrophage colony stimulating factor (M-CSF) and GM -CSF, arachidonic acid metabolite, vitamin D Three Metabolites, parathyroid hormone-related proteins, collagenases, tissue inhibitors of metalloproteinases and tissue plasminogen activators, transforming growth factor α (TGF-α), TGF-β, tumor necrosis factor α (TNF-α) ), Secreted PDGF and intracellular adhesion molecule-1 (ICAM-1). This is only a partial list, highlighting the complexity of growth regulation in the epidermis. Primary keratinocytes exhibit a finite life span in vitro. Optimal culture conditions for retaining epidermal stem cells theoretically allow unrestricted culture and expansion of those cells. In the practical sense of clinical use, it is beneficial to seed the acellular dermal matrix with keratinocytes as soon as possible. To facilitate this, stimulation signals that induce stem cells to divide once or twice have a dramatic effect on the final growth rate. Isolated epidermal stem cells are cultured in a culture containing one or more of the following growth factors that have been found to promote keratinocyte proliferation: platelet-derived growth factor (PDGF), granulocyte-macrophage colony stimulating factor ( GM-CSF) (both were found to be necessary for hematopoietic stem cell proliferation), tumor necrosis factor α (TNF-α), transforming growth factor α (TGF-α) (both are potent promoters of keratinocyte proliferation) And keratinocyte growth factor (KGF). KGF, one of the growth factors recently discovered in the epidermis, is a novel member of the fibroblast growth factor family and has been shown to have a stimulatory effect on keratinocyte proliferation. These culture conditions include the growth of cells on a 3T3 fibroblast support layer. Example 1 Using Dissociated Keratinocytes with an Intact Acellular Dermal Matrix Preparation of Reconstructed Composite Skin In a preferred embodiment of the present invention, keratinocytes isolated from a biopsy of fresh human skin are directly transferred to an intact acellular dermal matrix. Apply and implant into skin defect. Fresh skin biopsies are transported in a cell culture containing 10% fetal calf serum, penicillin and streptomycin. The tissue is kept at 4 ° C and processed within 24 hours. The tissue is processed with a sterile instrument, dissected to remove any attached fat, and cut into sections no larger than 4 mm in width. Skin is de-epidermalized with various enzyme substances including trypsin, dispase, thermolysin or ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA). The optimal method involves incubating in Dispase II (2.4 units / ml) at 37 ° C with periodic swirling for 1.5-2 hours, followed by incubation in 0.25% trypsin + 1 mM EDTA at 37 ° C. The supernatant is then pipetted into separate vials, centrifuged to pellet the cells, and resuspended in growth medium. The culture was made up of 10% fetal calf serum, 5 g / ml insulin, 0.5 g / ml hydrocortisone, 10 ng / ml epidermal growth factor, 10 ng / ml cholera toxin and 0.15 mM Ca ++ Consists of a 3: 1 mixture of DMEM: Ham's F-12 supplemented with The cells are then seeded in an acellular dermal matrix and transplanted into a patient. Several combinations are achieved, including epidermal cell isolation, in vitro culture and seeding of acellular dermal matrix, including the following operations. I The acellular dermal matrix is implanted in the patient the day before seeding of the epidermal cells. This allows the dermal matrix time to vascularize before applying the epidermal cells. II Skin biopsies are processed as described in the preferred embodiment, and subsequently cultured in vitro while cell numbers are increasing to allow a large area of acellular dermal matrix to be seeded prior to transplantation I do. III The acellular dermal matrix is implanted into the patient the day before seeding the epidermal cells grown as in II above. IV The isolated epithelial cells are seeded directly into the acellular dermal matrix, and subsequently cultured and expanded on the acellular dermal matrix before transplantation. This involves washing three times with Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) to hydrate the dermal matrix and placing the matrix in a culture flask or dish with a basement membrane facing up. Next, the isolated human keratinocytes were seeded on a dermal matrix (about 5 × 10 Four Cells / cm Two (Dermis matrix), and allowed to stand in a cell culture incubator for 24-48 hours before changing the culture medium. After this time, the culture was -7 M Change to a fresh culture containing all-trans retinoic acid. After 16 to 24 hours, the culture solution is -Five Change by adding M +/- isoproterenol. There is a confluent layer of keratinocytes across the dermal matrix after 24 hours of exposure. At this point, the composite implant is implanted. V The composite graft is continued in vitro culture and raised to the air-liquid interface by use of a raised culture surface (such as a metal screen), and the culture can reach the composite only from below. Exposure of the implant to the top induces keratinocytes to initiate a differentiation program, resulting in the formation of stratified epidermis. Cultures in air-liquid cultures are supplemented with other chemicals or reagents that have been found to induce stratification in epithelial cultures. These reagents include but are not limited to calcium chloride or sodium butyrate. The resulting composite implant contains the complete stratified epidermis. At this point, the composite is implanted. VI Also, epithelial cells are cultured to make CEA sheets before coating on the dermal matrix. The method involves culturing isolated keratinocytes to or beyond confluence, whereupon an intact sheet of keratinocytes is formed. The sheet is then detached from the culture vessel by treatment with an enzyme such as dispase, which disrupts cell attachment to the substrate but does not interfere with cell-cell contact. The CEA sheet is transferred to an acellular dermal matrix using a carrier such as petrolatum gauze and subsequently implanted. The VII acellular skin matrix is implanted on the patient's day before coating the CEA sheet made as in VI above. Example 2 Microskin grafting in combination with an acellular dermal matrix In a preferred embodiment of the invention, a small piece of autogenous stratum fresh human skin is passed twice through a skin mesher equipped with a continuous cutting blade wheel at 90 ° twice. Let it. The skin is about 1-1.5 nm using a sharp knife. Two Cut into small pieces. These microskin pieces are spread evenly across the basement membrane surface of the acellular dermal matrix, which is about 10-50 times the original area of the starting skin piece. The composite graft is then implanted on the wound surface and covered with a sheet graft of cryopreserved human allograft skin. Several combinations of microskin grafting in combination with an acellular dermal matrix are achieved, including the following operations. I Transfer microskin to acellular dermal matrix implanted in patient the previous day. II The conjugate of the preferred embodiment is grown in vitro culture at the air-liquid interface as described in Example 1 prior to implantation. III The composite of the preferred embodiment comprises a microskin strip obtained from an allogeneic skin biopsy. IV Allogeneic microskin is transferred to an acellular dermal matrix implanted in a patient the previous day. VIII complexes are grown in vitro culture at the air-liquid interface as described in Example 1 prior to implantation. VI The composites of the preferred embodiment and those described in IV are coated with a synthetic polymer membrane and then overlaid with cryopreserved human allogeneic skin at the time of implantation. Example 3 Selection of epithelial cells exhibiting epithelial progenitor or stem cell properties In a preferred embodiment of the present invention, epidermal stem cells are isolated using a cell-free dermal matrix as a panning substrate. This takes advantage of the aforementioned properties of putative epidermal stem cells that attach rapidly to type IV collagen. The basement membrane of the acellular dermal matrix is composed primarily of type IV collagen. The whole epithelial cell suspension is incubated for 30 minutes on the dermal matrix. The matrix is then washed with a weak stream of culture fluid to wash away non-adherent cells and implanted in a patient. There are several forms of this skin graft scene, including stem cell isolation, expansion, seeding and transplantation of acellular dermal matrix. These techniques include the following operations. I Following the panning with the acellular dermal matrix described in the preferred embodiment, the attached cells are detached from the dermal matrix using trypsin and seeded on the acellular dermal matrix implanted in the patient the previous day. II Epidermal progenitor cells are isolated by a technique that separates based on differences in cell size, followed by seeding and transplanting the selected cells into an acellular dermal matrix. III. Isolation of epidermal progenitor cells by a separation technique based on selective attachment to culture dishes coated with various dermal matrix components (eg, fibronectin, type I collagen, vitronectin or various glycosaminoglycans), The cells are detached from the culture dish using trypsin, seeded on a dermal matrix, and transplanted. Epidermal progenitor cells are isolated by a technique that separates based on the selective killing of rapidly dividing cells using an IV antiproliferative agent, and the selected cells are then seeded and transplanted into an acellular dermal matrix. V Epidermal progenitor cells are isolated by a technique that separates based on the selective sorting of cells that express a particular marker, followed by seeding and transplanting an acellular dermal matrix. Cells are isolated using any of the techniques described in VI II-VI, followed by seeding the patient with the transplanted acellular dermal matrix the previous day. Cells are isolated using any of the techniques set forth in VII II-V, followed by ex vivo expansion and transplantation of the cells prior to seeding of the acellular dermal matrix. Cells are isolated and expanded as described in VIII VII, and then seeded on the acellular dermal matrix implanted in the patient the previous day. Cells are isolated using the techniques described in IX VII, seeded in a cell-free dermal matrix, and grown on the dermal matrix before transplantation.
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(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ
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Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ
，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ
(72)発明者 グリフィー エドワード エス
アメリカ合衆国 テキサス州 77381 ザ
ウッドランズ ガネット ハロウ プレイ
ス ５────────────────────────────────────────────────── ───
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(81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE,
DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, L
U, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF)
, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE,
SN, TD, TG), AP (KE, LS, MW, SD, S
Z, UG), UA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD
, RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ
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CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GE, H
U, IL, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ
, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG,
MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, R
O, RU, SD, SE, SG, SI, SK, TJ, TM
, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN
(72) Inventor Griffey Edward S
United States Texas 77381 The
Woodlands Ganette Hollow Play
S 5