JPH11510595A - On-line detection of desired solutes in fluids by fluorescence spectrophotometry - Google Patents

On-line detection of desired solutes in fluids by fluorescence spectrophotometry

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JPH11510595A
JPH11510595A JP9501822A JP50182297A JPH11510595A JP H11510595 A JPH11510595 A JP H11510595A JP 9501822 A JP9501822 A JP 9501822A JP 50182297 A JP50182297 A JP 50182297A JP H11510595 A JPH11510595 A JP H11510595A
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Abstract

(57)【要約】 ある溶出サンプル(15)について、所期の溶質の有無を分析する方法ならびに手段(11)であって、この溶出サンプル(15)を、大サンプル(27)と小サンプル(29)とに縦分割することによって行なう。ここに、大サンプルと小サンプルと(27、29)は、同じ相対濃度を持つ。次に、所期の溶質にたいする親和性で特徴づけられる蛍光剤であって、かつ、その蛍光強度が、溶質に結合するとさらに大きくなる、そのような蛍光剤を小サンプル(29)に投じて混合する。次に、この溶出小サンプル(29)の照射部分から発せられる蛍光強度を測定し、かつ、時間の関数としてグラフ的に描く。この情報は、大サンプルと小サンプル(27、29)の相互の相関が一旦確立されたならば、大サンプル(27)の特性を明らかにするのに用いることができる。 (57) [Summary] A method and means (11) for analyzing the presence or absence of a desired solute in a certain eluted sample (15). 29). Here, the large sample and the small sample (27, 29) have the same relative concentration. Next, a fluorescent agent characterized by an affinity for the desired solute, and whose fluorescent intensity increases even more when bound to the solute, is injected into a small sample (29) and mixed. I do. Next, the intensity of the fluorescence emitted from the irradiated portion of the eluted small sample (29) is measured and graphically drawn as a function of time. This information can be used to characterize the large sample (27) once the correlation between the large sample and the small sample (27, 29) has been established.

Description

【発明の詳細な説明】 蛍光分光光度計測による流体中の所期の溶質のオンライン検出 発明の分野 本発明は、一般に、溶液サンプルにおける所期の溶質を検出する方法に関わる 。さらに特定的には、微分移動分離法によって生成される溶出サンプルにおいて 、所期の溶質を検出するオンライン技術に関わる。 発明の背景 微分移動分離法は、生物学、および、化学分野ではよく知られており、通常、 ある液体サンプル中に存在する溶質混合物を分離するのに用いられる。微分移動 分離法の一例としては、クロマトグラフィーがある。クロマトは、通常、２ない し３相間での分配差分によって溶質を分離するもので、この相は、固相と液相で あることが多い。溶質分配は、標本中の各種溶質が、流体相の存在下に、個体粒 子から成る基質を貫通移動するその移動差分から生ずる。固相基質を通過する溶 質の移動は、通常、圧勾配によって駆動される。使用する固相基質の特定のタイ プによって、クロマトは、どのような数の特性に基づいても、溶質を分離するの に使用することができる。その特性とは、例えば、大きさ、電荷量、疎水性、親 水性、および・または、基質にたいする特定の親和性、すなわち、基質に結合す るリガンド、がある。 微分移動分離法のもう一つの例としては、電気泳動がある。電気泳動は、通常 、基質を通過する際の、電気泳動移動差分に基づいて、溶質を分離する。そのよ うな系における溶質の移動は、印加された電場による電圧勾配によって駆動され る。 すぐに分かるように、微分移動分離法は、各種溶質が、特定のタイプの 基質を通過して移動する速度の差を利用するものである。微分移動分離法の生産 物は、通常、基質から流れ出る連続流体であり、その中には、混合物中の各種溶 質が、互いに空間的に分離されている。この流出流体における、各種溶質、また は、ある所期の、特定の溶質の位置の決定は、この流出流体を、一連の、不連続 な分画として収集し、次に、当業者にとっては熟知の手段のいずれかを用いて、 この分画を採取し、その内容物を特定することによって達せられる。溶液中の各 種分析対象を検出するための当分野において既知の例としては、米国特許第 4,2 07,075 号、発明家 Liburdy、1980 年６月 10 日発行、米国特許第 3,998,943 号、発明家 Ullman、1976 年 12 月 21 日発行、ヨーロッパ特許申請第 290,269 号、1988 年 11 月９日出版、ヨーロッパ特許申請第 242,527 号、1987 年 10 月 28 日出版、Huang ら、"Direct and Homogeneous Immunoassay for IgG anal ysis,"(「IgG 分析のための直接および均質免疫定量法」)、"Biotechnology and B ioengineering," 40 巻、913−８ページ (1992),Haidukewych,"Therapeutic Dr ug Monitoring By Automated Fluorescence Polarization Immunoassay,"（「自 動式蛍光偏光免疫定量法による治療薬監視」）"Immunoassay Technology," ２巻 、71-103(1985)および、"Automated Fluorescence/Photometer System for Homo geneous Immunoassay,"(「均質免疫定量用自動式蛍光光度計装置」),Clinical Che mistry,29 巻、1628-34ページ(1983)。上記全てを本明細書中で参考として援用 する。 上記の溶質検出法の問題の一つは、通常、基質（またはその大部分）を活性化 した全流出体を、一連の収集サンプルの形で集め、次に、各収集サンプル（また は、その、相当の部分量）それぞれについて、溶質の有無を調べなければならな いことである。すぐに分かるように、このような試験法は、多くの場合、時間が かかり、単調で、かつ、高価である。さらに、上記の方法では、試験目的のため に、サンプルは、もはや流出サンプルと しては存在しえず、流出サンプルは、必ず、一連の不連続な収集サンプルに変更 されるということも了解されるであろう。さらに、各収集サンプルは、通常、基 質をかなりの長時間に渡って活性化してきた複数の溶質を含んでいるのであるか ら、上記の方法は、流出流体において、所期の溶質が正確にどのような分布をし ているかに関しては、限られた情報しか与えない。流出流体において所期の溶質 が正確にどのような分布をするのかに関して得られるこのような情報は、微分移 動分離法のどの変数が修飾されているのかを決めるのに有用な場合がしばしばあ る。 前述した種類の問題に対応するために取られた一つの方法が、米国特許第 5,2 34,586 号、発明家 Afeyan ら、1993 年８月 10 日発行に記載されており、ここ に引用することによって本明細書中に参考として援用する。前記 Afeyan らの特 許は、ある流出流体中における、あらかじめ定められた溶質ないし溶質群の存在 および位置を急速に特定するためのオンライン法に関わる。この方法では、先ず 、混合物を、その混合物の溶質を分離することのできる装置の中を通過させ、そ れによって、溶質が液相（流出流体）としてその装置を抜け出たとき、それら溶 質を、時間的にも空間的にも互いにある程度隔てるようにする。この第１の装置 は、液体クロマト、例えば、カラムや、電気泳動モヂュールのようなその他の溶 質分離手段でもよい。次に、この第１の溶質分離装置から得られた流出流体を、 紫外線(UV)吸収検出器中を通過させ、それによって、すべての UV 吸収性溶質( 例えば、蛋白質、核酸、その他)の溶出プロフィールを描く第１の出力を得る。 次に、これらたくさんの UV 吸収性溶質の中から、所期の、特定の UV 吸収性溶 質を特定するには、この流出流体の少なくとも一部を、この所期の溶質を、液相 から選択的に取り出すことのできる第２の装置の中を通過させて行なう。このた めには、できれば、免疫吸収剤、および、免疫親和性基質を用いることが好まし い。次に、この第２の装置を抜け出した流出 流体を、同じ、または、類似の UV 検出器中を通過させ、この第２の装置を抜け 出した、すべての UV 吸収性溶質の溶出プロフィールを描く第２の出力を得る。 この第２の装置は、所期の溶質を、流出流体中の他の溶質の時間的、および・ま たは、空間的配置を変更することなく、選択的に取り出すのであるから、第１と 第２の出力の差は、その流体流出中の所期の溶質の存在および位置を決定するの に用いることができる。 Afeyan らの特許に開示された、一つの実施態様によれば、IgG が所期の溶質 であり、第２の装置は、還流性タンパク Ａ 親和性基質を含む。 本発明者は、Afeyan らの方法について、いくつかの欠点を特定した。そのよ うな欠点の一つは、流出流体から所期の溶質を取り出すのに使用される第２の装 置が、所期の溶質によって速やかに飽和されるので、そのために、定期的に洗浄 したり、交換したりして、問題の溶質が、未検出のまま出て行くのを防止しなけ ればならないことである。Afeyan らの方法の第２の欠点は、第２の装置によっ て取り除かれる溶質の範囲が、基質の上に定着させることのできる親和性溶媒の 種類によって限定される可能性のあることである。さらに、親和性溶媒の定着が 実行可能な場合においてすら、定着用コストは高くなる可能性がある。特に、蛋 白 Ａ や蛋白 Ｇ のようなある種の親和性溶媒の場合はそうである。Afeyan ら の方法の第３の欠点は、第１と第２の出力差を特定することが困難なことがあり 得るということである。特に、１個以上の溶質が、問題の溶質と一緒にカラムか ら溶出するような場合はそうである。Afeyan らの方法の第４の欠点は、UV 吸収 は、約 0.1mg/ml 未満の生体分子の濃度を検出できない、さらに高濃度の場合で も、干渉性溶質の存在下では検出できない、ことである。Afeyan らの方法の第 ５の欠点は、ここに使用される親和性基質が、流出サンプル中の他の溶質と何ら かの相互作用を引き起こし、それによって、親和性基質を活性化する溶質の空間 分布を変化させ、それが、所期の溶質の特定を困難に させるかもしれない可能性を持つことである。 発明の大要 溶出サンプルにおいて所期の溶質を検出する新規の方法を提供するのが本発明 の目的である。 オンライン検出法である、前記方法を提供するのが本発明のもう一つの目的で ある。 既存の方法に関連して前述した問題の内の少なくともいくつかを解決する、前 記方法を提供するのが本発明のさらにもう一つの目的である。 本発明のその他の目的は、本発明の特質や利点と同様に、一部は、以下の詳細 な説明の中で、触れられ、一部は、詳細な説明から自ずから明らかにされようし 、また、一部は、本発明の実施を通じて習得することもできよう。本説明におい ては、本説明の一部を形成する付属の図を参照する。また、本説明においては、 例示として、本発明を実行する特定の実施態様が示される。これらの実施態様は 、当業者ならば、本発明を実施できるように十分詳細に書かれている。したがっ て、本発明の範囲から逸脱することなく、その他の実施態様を利用し得ること、 ならびに、変更を加え得ることを了解しなければならない。したがって、下記の 詳細な説明は、制限的な意味に取ってはならない。また、本発明の範囲は、付属 の請求の範囲にもっとも完全に定義されている。 本発明の一局面によれば、溶出サンプルにおける所期の溶質の有無を検出する 方法が提供される。前記方法は、次の諸工程から成る。すなわち、(a)できれば 、所期の溶質に結合することが好ましい蛍光剤であって、その蛍光が、その溶質 に結合した場合は、その溶質に結合しない場合と異なる、そのような蛍光剤を、 溶出サンプルに添加する工程、(b)溶出サンプルを活性化する工程てあって、そ れによって、流体の長さ全体を活性化する工程であって、それによって、蛍光剤 に、その溶質に結合しているか否かを、 その蛍光によって呈示させる工程、および、(c)溶出サンプルから発せられる蛍 光を検出する工程であって、それによって、蛍光剤か所期の溶質に結合したこと に基づく検出蛍光が、その溶出サンプル中における所期の溶質の存在を示す工程 。 上記方法に委ねられる溶出サンプルは、クロマトや電気泳導法のような微分移 動分離法によって生成されてもよい。溶出サンプルに添加される蛍光剤は、でき れば、所期の溶質に親和性を持つ半量体と、牛血清アルブミン（BSA）にたいし てあまり大きな陽性反応を与えない蛍光性半量体との複合体であることが好まし い。大抵の蛍光染料は、BSA にたいして取扱い可能な陽性反応を示すので、蛍光 半量体として好適である。さらに、蛍光剤にたいする BSA の陽性反応をさらに 低下させるために、蛍光剤と一緒に、遊離蛍光染料をサンプルに添加してもよい 。所期の溶質が、IgG のような免疫グロブリンの場合には、蛍光剤は、(I)蛍光 染料と蛋白 Ａ、(ii)蛍光染料と蛋白 Ｇ、または、(iii)それらの混合物、例え ば、1:1 混合物、の複合体であることが好ましい。所期の溶質が、アンチトロン ビン III である場合には、8-ヒドロキシピレン-1,3,6-トリスルフォン酸三ナト リウム塩(HPTS)をそれ自体蛍光剤として用いてもよいし、あるいは、ヘパリンと 結合させて、蛍光剤を形成してもよい。 本発明のもう一つの局面によれば、ある長さの流体における所期の溶質の分布 を決定する方法が提供される。この際、流体は、クロマトや電気泳動のような微 分移動分離法によって形成されることが好ましい。前記方法は、次の工程から成 る。すなわち、(a)できれば所期の溶質に結合することが好ましく、かつ、その 蛍光は、その溶質に結合した場合は、その溶質に結合しない場合と異なる、その ような蛍光剤を、流体の長さ全体に渡って添加する工程、(b)流体の長さ全体を 活性化する工程であって、それによって、蛍光剤に、その溶質に結合しているか 否かを、その蛍光によって呈示 させる工程、(c)流体の長さから発せられる蛍光を、流体の長さ内部の位置の関 数として検出する工程、および、(d)前記検出工程の結果を用いて、流体長さ内 部における所期の溶質の分布を確かめる工程。 本発明のさらにもう一つの局面によれば、流体内部における所期の溶質の存在 と位置を決定する方法が提供される。ここに、前記方法は、以下の工程から成る 。すなわち、(a)溶出サンプルを、第１流体と、第２流体に縦分割する工程であ って、ここに、第１と第２の流体は比例的化学組成を持つ。また、この溶出サン プルは、クロマトや電気泳動のような微分移動分離法によって生成されたもので あることが好ましい。(b)蛍光分光光度法によって第１の流体における所期の溶 質の存在と位置を決定する工程、(c)第１と第２の流体の時間相関を決定する工 程、および、(d)前記溶質の存在と位置を決定する工程、および、前記時間相関 を決定する工程の結果を用いて、第２の流体における所期の溶質の存在と位置を 決定する工程。 すぐに分かるように、第２の流体における所期の溶質の位置が一旦決定された ならば、第２の流体の、問題の溶質を含む部分だけを収集することもできる。 本発明のさらにもう一つの局面によれば、流体内部における所期の溶質の分布 を決定する方法が提供される。ここに、前記方法は、以下の工程から成る。すな わち、(a)溶出サンプルを、第１流体と、第２流体に縦分割する工程であって、 ここに、第１と第２の流体は比例的化学組成を持つ。また、この溶出サンプルは 、クロマトや電気泳動のような微分移動分離法によって生成されたものであるこ とが好ましい。(b)蛍光分光光度法によって第１の流体における所期の溶質の分 布を決定する工程、(c)第１と第２の流体の時間相関を決定する工程、および、( d)前記分布を決定する工程、および、前記時間相関を決定する工程の結果を用い て、第２の流体における所期の溶質の分布を決定する工程。 すぐに分かるように、第２の流体における所期の溶質の分布が一旦決定された ならば、第２の流体の、問題の溶質の最大高濃度を含む部分だけを収集すること もできる。さらに、溶出サンプルが、微分移動分離法の産物である場合には、第 ２の流体における溶質の分布は、用いた分離法の効率を表わす。したがって、前 記方法は、用いた分離法のどれかの変数が変更されたかどうかを手早く評価する ためのオンライン器具を与える。 本発明のさらにもう一つの局面によれば、流体内部のある位置における、所期 の溶質の濃度を決定する方法が提供される。ここに、前記方法は、以下の工程か ら成る。すなわち、(a)溶出サンプルを、第１流体と、第２流体に縦分割する工 程であって、ここに、第１と第２の流体は比例的化学組成を持つ。また、この溶 出サンプルは、クロマトや電気泳動のような微分移動分離法によって生成された ものであることが好ましい。(b)蛍光分光光度法によって第１の流体のある位置 における所期の溶質の濃度を決定する工程、(c)第１と第２の流体の時間相関を 決定する工程、(d)第１と第２の流体の容量相関を決定する工程、および、(e)前 記濃度を決定する工程、前記時間相関を決定する工程、および、前記容量相関を 決定する工程の結果を用いて、第２の流体の対応する位置における所期の溶質の 濃度を決定する工程。 本発明の別の一つの局面によれば、所期の溶質に関して、流体を監視する装置 が提供される。ここに、前記装置は、以下の手段から成る。すなわち、(a)溶出 サンプルを、第１流体と、第２流体に縦分割する手段であって、ここに、第１と 第２の流体は比例的化学組成を持つ。(b)できれば所期の溶質に結合することが 好ましく、かつ、その蛍光は、その溶質に結合した場合は、その溶質に結合しな い場合と異なる、そのような蛍光剤、(c)蛍光剤を第１の流体と混合する手段、( d)第１の流体について、蛍光剤の蛍光に基づいて、所期の溶質の有無を監視する 手段、および、(e)第１と第２の 流体の時間相関を取る手段であって、それによって第１の流体に関して得られた 結果を、第２の流体に当てはめることができる、そのような手段。 本発明の別のもう一つの局面によれば、溶質の混合物から、所期の溶質を精製 する方法が与えられる。ここに、前記方法は、以下の諸工程から成る。すなわち 、(a)溶質の混合物を適当な微分移動分離法にかける工程であって、これによっ て、所期の溶質が、残余の溶質とある程度分離された溶出サンプルが生成される 工程、(b)溶出サンプルを、第１流体と、第２流体に縦分割する工程であって、 ここに、第１と第２の流体は比例的化学組成を持つ。(c)蛍光分光光度法によっ て第１の流体における所期の溶質の濃度ピークの位置を決定する工程、(d)第１ と第２の流体の時間相関を決定する工程、(e)前記濃度ピークを決定する工程、 および、前記時間相関を決定する工程の結果を用いて、第２の流体における、所 期の溶質の対応する濃度ピークの位置を決定する工程、および、(f)所期の溶質 の濃度ピークに相当する、第２の流体の部分を収集する工程。 図面の簡単な説明 ここに収められ、本明細書の一部を形成する付属の図面は、本発明の好ましい 実施態様を例示するものであり、説明とあいまって、本発明の原理を明らかにす るのを助ける。この図においては、同様の参照番号は、同様部分を表わす。 第１図は、ある流体について、所期の溶質の有無を監視するための自動オンラ イン装置の一実施態様の模式図であり、ここに、前記オンライン装置は、本発明 の指示によって構成される。 第 2(a)および 2(b)図は、それぞれ、MES 無し蛋白 G-DTAF および MES 付き 蛋白 G-DTAF を用いて得られた、5μgHIgG,500μgBSA と 5μg HIgG の混合物、 および、500μg BSAにたいする蛍光信号強度のグラフ表示である。これは、実施 例５において実施した。 第 3(a)および 3(b)図は、それぞれ、蛋白 A-HCCS および蛋白 G-HCCS を用い て得られた、5μg HIgG，500μg BSA と 5μg HIgG の混合物、および、500μg BSA にたいする蛍光信号強度のグラフ表示である。これは、実施例６において実 施した。 第 4(a)および 4(b)図は、それぞれ、蛋白 A-MCCS および蛋白 G-MCCS を用い て得られた、5μg HIgG，500μg BSA と 5μg HIgG の混合物、および、500μg BSA にたいする蛍光信号強度のグラフ表示である。これは、実施例７において実 施した。 第５図は、流速 2ml/分の蛋白 A-CFSE および蛋白 G-CFSE の 1:1 混合物を用 いて得られた、HIgG，BSA，migG，RIgG，BIgG，ヤギ抗-mIgG および、ヤギ抗-RI gG にたいする蛍光信号強度のグラフ表示である。これは、実施例８において実 施した。 第６図は、流速 2ml/分の蛋白 A-FHSE および蛋白 G-FHSE の 1:1 混 合物を用いて得られた、HIgG，BSA，migG，RIgG，BIgG，ヤギ抗-mIgG および、 ヤギ抗-RIgG にたいする蛍光信号強度のグラフ表示である。これは、実施例９に おいて実施した。 第７図は、76日保存蛋白 G-DTAF を用いで得られた、HIgG，BSA，migG，RIgG ，BIgG，ヤギ抗-mIgG および、ヤギ抗-RIgG にたいする蛍光信号強度のグラフ表 示である。これは、実施例 10 において実施した。 第８図は、RIgG-CFSE を用いて得られた、ヤギ抗ウサギ IgG、ヤギ抗-mIgG、 および、HIgG にたいする蛍光信号強度のグラフ表示である。これは、実施例 11 において実施した。 第９図は、HIgG-CFSE 複合体を用いて得られた、ヤギ抗-HIgG、および、BSA にたいする蛍光信号強度のグラフ表示である。これは、実施例 12 において実施 した。 第 10 図は、HIgG-FITC 複合体を用いて得られた、抗-HIgG、蛋白Ａ、および 、BSA にたいする蛍光信号強度のグラフ表示である。これは、実施例 13 におい て実施した。 第 11 図は、HIgG-DATF 複合体を用いて得られた、抗-HIgG、蛋白 Ａ、および 、蛋白 Ｃ にたいする蛍光信号強度のグラフ表示である。これは、実施例 14 に おいて実施した。 第 12(a)および 12(b)図は、それぞれ、PBS 濃度 0.0002 mg/ml と0.0008 mg/ ml の抗 HIgG-DATF 複合体による HIgG にたいする蛍光信号強度のグラフ表示で ある。これは、実施例 16 において実施した。 第 13 図は、蛋白 A-CFSE と RIgG を用いて得られた、ヤギ抗-RIgG、および 、HIgG にたいする蛍光信号強度のグラフ表示である。これは、実施例 17 にお いて実施した。 第 14 図は、蛋白 G-CFSE と RIgG の複合体を用いて得られた、ヤギ抗-RIgG 、および、HIgG にたいする蛍光信号強度のグラフ表示である。こ れは、実施例 18 において実施した。 第 15 図は、蛋白 G-DTAF とヤギ抗-RIgG の複合体を用いて得られた、RIgG、 HIgG，BIgG，mIgG，および、BSA にたいする蛍光信号強度のグラフ表示である。 これは、実施例 19 において実施した。 第 16 図は、蛋白 G-FHSE とヤギ抗-RIgG の複合体を用いて得られた、RIgG、 および、HIgG にたいする蛍光信号強度のグラフ表示である。これは、実施例 20 において実施した。 第 17 図は、カッパ・ロック-DTAF 複合体を用いて得られた、RIgG、HIgG，mI gG，および、BSA にたいする蛍光信号強度のグラフ表示である。これは、実施例 21 において実施した。 第 18 図は、カッパ・ロック-DTAF とヤギ抗RIgG 複合体を用いて得られた、R IgG、HIgG，mIgG，および、BSA にたいする蛍光信号強度のグラフ表示である。 これは、実施例 22 において実施した。 第 19 図は、カッパ・ロック-FHSE を用いて得られた、RIgG、HIgG，mIgG，BI gG，ヤギ抗-mIgG、ヤギ抗-RIgG、および、BSA にたいする蛍光信号強度のグラフ 表示である。これは、実施例 23 において実施した。 第 20 図は、コンアルブミン-CFSE 複合体によるコンカナバリン Ａ にたいす る蛍光信号強度のグラフ表示である。これは、実施例 24 において実施した。 第 21 図は、実施例 25 で得られた結果のグラフ表示である。 第 22 図は、実施例 26 で得られた結果のグラフ表示である。 第 23 図は、実施例 27 で得られた結果のグラフ表示である。 好ましい実施態様の詳細な説明 第１図を参照すると、溶出サンプルについて、所期の溶質の有無を監視するた めの自動オンライン装置の１つの実施態様の模式図図が示される。前記装置は、 本発明の指示によって構成され、一般に、参照番号 11 によって示される。 第１図に例示したように、装置 11 の考えられる用法の一つとして、溶質の混 合物を含む液体サンプル 15 を、微分移動分離装置 17 を通過させることによっ て得られる溶出サンプル 13 を監視する工程がある。ここに、この分離装置は、 所期の溶質を、混合物の中の残余の溶質から物理的に分離することが可能である 。装置17は、例えば、クロマトのカラム、電気泳動ゲル、または、同様のもので あってもよい。 装置 11 は、UV 吸収検出装置 21 を含む。この装置は、サンプルに UV 光を 照射する手段（図示せず）とサンプルによって吸収された UV 光を測定する手段 (図示せず)を含む。溶出サンプル 13 は、装置 21 を通過させられ、それによっ て、サンプル 13 中に存在する、すべての UV 吸収性溶質(例えば、蛋白質、核 酸など)の空間的分布に一致する連続出力を生成する。このような溶質の空間分 布は、グラフとして表わすと、通常、一連のピークとなる。ここに、各ピークは 、サンプル 13 の特定の位置における、１個以上の溶質の高濃度を表わす。 装置 11 は、さらに、装置 21 の下流側に流体縦分割バルブ 25 を含む。バル ブ 25 は、溶出サンプル 13 を、大流体 27 と、小流体 29 に縦分割する。ここ に、小流 29 は、大流 27 と同じ相対的化学組成を持つが、流体 27 に比べると はるかに低い容量を持つことが好ましい。例えば、流体 29 対流体 27 の容量比 は、それぞれ、1:10 の範囲にあってもよい。 装置 11 は、さらに、バルブ 25 の下流側に、小流 29 の流路にそってミ キサー 31 を含む。ミキサー 31 は、小流 29 がミキサー 31 を貫通するさいに 、分析液 33（以下この名前で呼ぶ）を、小流 29 に投じて混合するためのもの である。ミキサー 31 は、分析液 33 と小流 29 とをμl 容量で、できれば、約 5μl の小容量で混合できるマイクロ・ミキサーであってもよい。また、別法と して、ミキサー 31 は、分析液 33 と小流 29 とを ml 容量で、通常は約 1ml で混合できるダイナミック・ミキサーであってもよい。装置 11 において、ダイ ナミック・ミキサーに比べて、マイクロ・ミキサーを使用することによる利点の 一つは、ダイナミック・ミキサーを使用した場合よりも、所期の溶質の区間的分 布をはるかに高精度で検出することができることである。その理由は、マイクロ ミキサーの方が比較的小容量であり、そのため、ダイナミック・ミキサーに比べ で、それ以前の工程で空間的に分離された溶質を、溶出サンプル内で大容量で掻 き回す恐れが少ないからである。すぐに分かるように、マイクロ・ミキサーに特 有のこの利点は、流速が比較的速い場合、極めて大きいものになる。マイクロ・ ミキサーにたいして、ダイナミック・ミキサーを使用することの利点の一つは、 ダイナミック・ミキサーは、その設計上、マイクロ・ミキサーよりも、分析液 3 3 と小流 29 をより徹底的に混合することができることである。しかしながら、 すぐ分かるように、マイクロ・ミキサーと、ダイナミック・ミキサーの両者の効 率差は、比較する特定の実施態様に依存する。 装置 11 は、さらに、分析液 33 を、ミキサーに駆動するポンプ 35、できれ ば、約 1から 8ml／分の速度をもつポンプを含む。 分析液 33 は、蛍光剤であって、できれば所期の溶質に結合し、その蛍光が、 １個以上の点(例えば、強度、減衰時間、極性、など)で、所期の溶質に結合した 場合が、所期の溶質に結合しない場合とは異なる蛍光剤を含む。蛍光剤の一つの タイプは、蛍光染料と、所期の溶質にたいして親和性を持つ半量体との複合体で ある。溶質混合物が、牛血清アルブミン（BSA）を 含む、あるいは、含む可能性が高く、かつ、BSA 以外の溶質が所期の溶質である 場合には、前記蛍光染料としては、通常蛍光染料が好ましい。なぜなら、蛍光染 料は、通常、牛血清アルブミン（BSA）にたいして、例えあったとしても、ごく 僅かな、適当に処理できる陽性反応しか示さないからである（さらに、BSA にた いする前記陽性反応にしても、分析液 33 に、少量の加水分解された遊離蛍光染 料を、例えば、約 10-7 mg/ml から約10-9 mg/ml となるようにさらに添加する ことによって、その反応を効果的に打ち消すことができる）。本発明に使用して 好適な蛍光染料の例としては、蛍光イソチオシアネート(FITC)，5-ブロモメチル フルオレサン(BMF)、5-(と 6-)-ヨードアセタミドフルオレサン(IAF)、5-(4,6- ジクロロトリアジニル)アミノフルオレサン (DATF)、5-(と 6-)-カルボキシフル オレサン・サクシニミヂル・エステル(CFSE)、および、6-(フルオレサン-5-(と- 6)-カルボキサミド）ヘキサノイン酸サクシニミヂル・エステル）（FHSE）があ る。前記の蛍光染料の中では、CFSE と FHSE が好ましい。なぜなら、これらは 、BSA にたいして全く陽性反応を示さないからてある。それ以外の蛍光染料とし ては、1-アルキロキシーピレン-3,6,8-トリスルフォン酸ナトリウム塩（キャスケ ード・ブルー）、および、5,7-ジメチル-4,4-ジフロロ-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s- インダシン（BODIPY FL）がある。小さく、親水性を持ち、アミノ基を持たない 蛍光染料ならば、BSA が所期の溶質でないか、溶質混合物に含まれる恐れがない 場合なら、他のものでも、蛍光染料として好適である。 蛋白 Ａ と蛋白 Ｇ はそれぞれ、多くの動物種の、広範な免疫グロブリン（例 えば、IgG，IgA，IgD，IgM など）に結合する。もっとも著明な例外は、ニワト リ IgG とヒト IgD である。したがって、ニワトリ IgG および・または、ヒト IgD 以外の免疫グロブリンが所期の溶質である場合には、適当な蛍光剤は、(I) 蛍光染料と蛋白 Ａ の複合体、(ii)蛍光染料と蛋白 Ｇ の 複合体、または、(iii)蛍光染料／蛋白 Ａ、および、蛍光染料／蛋白 Ｇ 複合体 のの混合物である。所期の溶質が、免疫グロブリンの様々な集合体である場合に は、蛋白 Ａ と蛋白 Ｇ 複合体同士の混合物が特に好ましい。なぜなら、蛋白 Ａ と蛋白 Ｇ の親和性は、多くの免疫グロブリンにたいして相補的だからであ る。（例えば、蛋 Ｇ は、蛋白 Ａ よりも強力に牛 IgG に結合する）。蛍光染 料と、蛋白 Ａ または蛋白 Ｇ の複合体の合成は、実質的には、Bioconjugate C hem.,３巻、2-13 ページ(1992)のM.Brinkley によって開示された方法で実行す ることができる。本文献を、ここに引用することによって本明細書中で参考とし て援用する。分析液 33 における蛋白Ａ（または Ｇ）／蛍光染料複合体の実効 濃度は 0.0001 から 0.1mg/ml の範囲にある。 所期の溶質がアンチトンビンIII である場合、蛍光剤は、(I)8-ヒドロキシピ レン-1,3,6-トリスルフォン酸三ナトリウム塩（HPTS）でも、(ii)ヘパリンと HP TS の複合体、のいずれを用いてもよい。驚くべきことに、本発明者は、HPTS 自 身がアンチロンビン III に親和性を持つこと、したがって、親和性半量体に複 合させる必要のないことを発見した。 本発明の蛍光剤は、また、蛍光染料／蛋白 Ａ（または Ｇ）複合体と、蛋白 Ａ（または蛋白 Ｇ）と所期の溶質の両方にたいして親和性を持つ半量体との間 の錯体の形を取ってもよい。 分析液 33 はさらに、蛍光剤が溶解されるバッファー液を含んでいる。バッフ ァー系の機能は、蛍光剤を、相当程度定常な pH に維持することである。これは 、蛍光染料の蛍光強度が、pH とともに増加する傾向があるからである。すぐに 分かるように、本発明における定常な pH の維持は、分析液 33 が、小流 29 と 混合されることによって複雑化する。なぜなら、小流自体もまた通常バッファー を含むからであり（例えば、サンプル・バッファー、または、溶出バッファー） 、それも、溶液 33 のバッファーの同じ pH である場合もあるし、ない場合もある。にも拘わらず、強いバッファー、例えば 、リン酸ナトリウム・バッファー（できれば、0.05-0.2M，pH 7-8.9）を用いる ことによって、および・または、サンプル・バッファーの pH を、溶出バッファ ーよりもやや低い範囲、溶出バッファーよりも 2pH 単位上に維持することによ って、および・または、好適なマイクロ・ミキサー 31 を使用することによって 、先に示唆した種類の問題は最小に留めることができると考えられる。また、注 目すべきこととして、抗原は、塩濃度が 0.5M よりも高いと、同程度には結合し ない。 装置 11 はさらに、小流 29 の流路にそって、ミキサー 31 の下流に位置する 蛍光検出装置 41 を含む。蛍光検出装置 41 は、小流 29 に添加された蛍光剤を 活性化する手段（図示せす）を含む。その活性化により、蛍光剤は、それが、所 期の溶質に結合しているか否かにしたがって、蛍光を発する、そのような手段で ある。また、小流の興奮部位から発せられる蛍光を測定する手段（図示せず）を 含む。本実施態様においては、この測定手段は、蛍光強度を測定するが、測定手 段は、また別法として、減衰時間、極性、または、その他の、どのような識別性 の蛍光特性を測定するものであってもよい。小流 29 を装置 41 中を通過させる ことによって、小流 29 中の所期の溶質の空間的分布に一致する連続出力が得ら れる。所期の溶質の空間分布は、グラフとして表わすと、通常、一つのピークを 含む。このピークは、流れ 29 内部の特定位置において、その溶質が高濃度であ ることを表わす。すぐ分かるように、ピークの形は、装置 17 によって実行され る分離の有効性に関してある情報を与える。すなわち、広いピークは一般に、鋭 いピークよりも分離の悪いことを示す。 装置 11 はさらに、コンピュータ 51 を含む。コンピュータ 51 は、UV 吸収 検出装置 21 と蛍光検出装置 41 に電気的に結合され、かつ、それらの装置から それぞれの出力を受け取る。コンピュータ 51 は、これらの出力を処 理し、それらをディスプレー 53 にグラフ的に表示する。さらに、コンピュータ 51 は、装置 21 と 41 からの出力を、装置の流速（0.1 から 30ml／分の範囲 にあってもよい）に関してコンピュータに入力されたデータと一緒に用いて、大 流 27 における、所期の溶質のピーク濃度の位置を求める。次に、コンピュータ 51 は、この情報を用いて、大流 27 の流路にあるバルブ 55 を制御することに よって、所期の溶質のピーク濃度を含む、大流 27 の部分のみを選択的に収集す る。 ここに示した実施態様においては、コンピュータ 51 はさらに、電気的にバル ブ 25 に接続される。これは、それによって、UV 吸収性溶質が、装置 21 によ って検出されて始めて、サンプル 13 が縦分割されるようにするためである。さ らに、コンピュータ 51 は、ミキサー 31 に電気的に接続される。これは、それ によって、ミキサー 31 が、バルブ 25 が、サンプル 13 を大流 27 と小流 29 のに縦分割して始めて活性化されるようにするためである。 すぐ分かるように、コンピュータ 51 に、蛍光強度と濃度を関係づける適当な 標準を与えることによって、装置 11 は、、サンプル 13 における所期の溶質の 濃度を求めるのに用いることができる。 完全に UV 依存性のオンライン検出装置に比べた場合の、装置 11 の利点の一 つは、装置 11 は、0.01 mg/ml もの低濃度の所期の溶質を検出することができ ることである。一方、前記 UV 装置の検出限界は、0.1mg/ml である。さらに、 装置 11 は、500μg の BSA 存在下に 5μg もの少量の IgG を検出することが てきるのにたいし、UV 依存性の装置ではできない。 下記の実施例は、本発明の多様な局面のほんの例示的なものであり、いかなる 意味でも、本発明の範囲を限定するものではない。 実施例１ 蛋白 A-FITC 複合体を下記に従って合成した。20 mg/mlの蛋白 Ａ 0.2ml を、 0.2M の炭酸水素ナトリウム・バッファー 0.5ml と pH９で混合した。1mg の FI TC を渦流によって 0.1ml の DMSO に溶解した。次に、この FITC 溶液を蛋白 Ａ 溶液に加え、得られた混合液を、10分間の渦流の後、室温で７時間振とう器 の上で攪拌した。得られた蛋白 A-FITC 複合体を、0.02％ アジ化ナトリウムを 含む PBS を負荷バッファー、および、溶出バッファーとして用い、ゲル浸透ク ロマト（Ultrogel AcA 44,BioSepra,Marlborough，MA）で精製した。第１バンド (10ml)を複合体として収集した。複合体の濃度は、約 0.4mg/ml であり、次にこ れを PBS で 0.001mg/ml に希釈した。 実施例２ 蛋白 G-FITC 複合体を、蛋白 A-FITC について実施例１で記載されているのと 同じやり方で、合成した。 実施例３ 蛋白 A-DTAF 複合体と蛋白 G-DTAF 複合体を、蛋白 A-FITC について実施例１ で記載されているのと同じやり方で、合成した。ただし、この場合、反応時間を 2.5 時間とした。 実施例４ 蛋白 A-FITC、蛋白 A-DTAF、および、蛋白 G-DTAF を、装置 11 と同様のオン ライン検出装置に用い、5μg の HIgG と 500μg の BSA を含む混合物における ヒト IgG（HIgG）を検出した。三つすべての複合体が、BSA にたいして比較的小 さなピークを、HIgG にたいしては比較的大きなピークを示した。しかしながら 、この小さな BSA ピークは、複合体の 0.001mg/ml 溶液 200ml に、遊離した加水分解 FITC の 0.1 mg/ml 溶液約 2μl を加えることによってノイズ・レベルまで下げることができた。ここに、遊離 FITC の最終濃度は、約 10-6 mg/ml であった。この遊離 FITC は、BSA にたい しては陰性作用を呈するのにたいし、IgG にたいしては陽性作用を呈することが 判明した。このようにして、遊離 FITC による陰性 BSA ピークは、HIgG ピーク には悪影響を与えることなく、複合体による陽性 BSA ピークを相殺した。 蛋白 A-FITC と蛋白 G-DTAF をさらに、装置 11 と同様のオンライン検出装置 に用いて、それぞれ、5μg の マウスIgG(mIgG)、ウシ IgG(BIgG)、および、ウ サギ IgG(RIgG)を検出した。複合体は両方とも、三つすべての免疫グロブリンに たいして、容易に検出可能なピークを示した。ウサギ IgG にたいする陽性ピー クは、5μg のウサギ IgG と 500μg の BSA を含む混合物にたいして、蛋白 G- DTAF を用いたときに見られた。また、マウス IgG にたいする陽性ピークは、5 μg のマウス IgG と 500μg の BSA を含む混合物にたいして、蛋白 A-FTIC を 用いたときに見られた。しかしながら、ウシ IgG を検出するのに蛋白 A-FITC を用いた場合、HIgG，mIgG，および、RIgG を検出するのに蛋白 A-FITC を使用 した場合に観察されたものよりも弱いピークが見られた。本発明者は、いかなる 理論にも制限されることを望まないので、この弱いピークは、蛋白 Ａ の BIgG にたいする結合力がいく分弱いという事実から生ずるのであろうと考える。BIgG にたいする反応を改善したいという気持ちから、また、蛋白 Ａ よりも蛋白 Ｇ の方が BIgG に強く結合するという事実に基づいて、次に、蛋白 A-FITC と蛋 白 G-DTAF の混合物を用いて、BIgG の検出を行なった。ピークの増加が見られ た。 実施例５ pH9 の 0.2M 炭酸水素ナトリウム 0.7ml 中の蛋白 G(4mg)を、0.1ml の DMSO と室温で 2.5 時間複合体反応させた後、1M MES（2−メルカプトエタン・スルフ ォン酸ナトリウム塩）0.1ml を添加して反応を停止させ、さらに、BSA ピークを 下げるために、蛋白 G-DTAF に陰性電荷を負荷した。得られた混合物を、室温で 、２時間攪拌した。この蛋白 G-DTAF 複合体を、GPC（Ultrogel AcA 44）と、PB S を溶出液として用い、分離した。MES は、既に蛋白 Ｇ に付着した DTAF の残 余のクロロ基と反応させることによって、複合体に付着させることができた。第 2(a)，2(b)図から分かるように、ある程度の MES 基（したがって、より陰性電 荷を持つ）を含む蛋白 G-DTAF 複合体は、MES を持たない蛋白 G-DTAF よりも、 BSA にたいする反応がいく分低い。にも拘わらず、BSA ピークは完全には除去さ れてはいない。MES を含むと否とに拘わらず、蛋白 A-DTAF は同じように振る舞 った。 実施例６ 蛋白 A-HCCS(7-ヒドロキシクマリン-3-カルボキシル酸、サクシニミヂル・エ ステル)複合体は下記のように合成した。pH 8.3 の 0.2M 炭酸水素ナトリウムに 溶解した 20mg／ml の蛋白 Ａ 溶液 0.2ml を、0.1ml DMSO に溶解した 2mg の HCCS と、室温で ３ 時間反応させた。この反応を、1M NH2OH の 0.1ml を添加 して停止させ、次に、得られた混合液を室温で１時間攪拌した。得られた蛋白 A -HCCS 複合体を、GPC と、溶質バッファーとして PBS を用いて分離した。蛋白 G-HCCS 複合体は、同様の方法によって調製した。 第 3(a)，3(b)図から分かるように、蛋白 A-HCCS，蛋白 G-HCCS 複合体のいず れもが、HIgG ピークばかりでなく、かなり強い BSA ピークを与えた。本発明者 は、いかなる理論にも制限されることを望まないので、 この強い BSA ピークは、クマリン半量体に十分な親和性が不足しているためで あろうと考える。 実施例７ 蛋白 A-MCCS(7-メトキシクマリン-3-カルボキシル酸、サクシニミヂル・エス テル)、および、蛋白 G-MCCS は、実施例６において、それぞれ、蛋白 A-HCCS， 蛋白 G-HCCS について記載されていたものと同様にして合成した。第 4(a)，4(b )図から分かるように、蛋白 A-MCCS と蛋白 G-MCCS は、BSA にたいして、それ ぞれ、蛋白 A-HCCS、蛋白 G-MCCS よりも大きなピークを与えた。さらに、蛋白 A-MCCS と蛋白 G-MCCS は、HIgG にたいして反応しなかった。 実施例８ 蛋白 A-CFSE （カルボキシルフルオレセン・サクシニミヂル・エステル）、 蛋白 G-CFSE、蛋白 A-FHSE （6-(フルオレセン-5-(と-6-)-カルボキサミド)ヘ キサノイン酸・サクシニミヂル・エステル）、および、蛋白 G-FSE 複合体は、 実施例６に記載されているものと一致するやり方で合成した。第５図から分かる ように、2ml／分の流速で移動する蛋白 A-CFSE(0.0003mg／ml)と蛋白 G-CFSE(0. 0003mg／ml)の 1：1 混合物は、BSA にたいしては全くピークを示さなかったが 、HIgG、mIgG、RIgG、および、BIgG にたいしては十分な信号を生じ、ヤギ抗-mI gG、および、ヤギ抗-RIgG にたいしても検出可能なピークを与えた。 実施例９ 第６図を参照すると、蛋白 A-FHSE と蛋白 G-FHSE の 1:1 混合物は、BSA に たいして何の反応も示さなかったが、IgG 類にたいしては、実施例 ８で述べた蛋白 A-CFSE と蛋白 G-CFSE の混合物の与えたものと同様の反応を与 えた。ただし、BIgG、ヤギ抗-mIgG、およびヤギ抗-RIgG にたいする信号は、実 施例８の場合よりも弱かった。 実施例10 冷蔵庫に 76 日間保存しておいた蛋白 G-DTAF を、希釈（0.0003mg/ml）PBS 溶液に溶解して、ピーク検出剤として用いた。第７図から分かるように、蛋白 G -DTAF は、HIgG、RIgG、mIgG、ヤギ抗-RIgG、ヤギ抗-HIgG、および、ヤギ抗-mIg G にたいして、依然として有効にピークを与えた。BSA にたいする小ピークも検 出された。 実施例11 ウサギ IgG（RIgG）6.3mgを、実施例８に記載のものと同様にして、2.1mg の CFSE と複合させた。第８図から分かるように、この RIgG-CFSE 複合体（0.0005 mg／ml PBS 溶液）は、ヤギ抗−ウサギ IgG、および、mIgG にたいして弱い信号 を生じたが、HIgG にたいしてはピークを生じなかった。 実施例12 10mg の HIgG を、実施例 11 に記載のものと同様にして、1mg の CFSE と複 合させた。第９図から分かるように、この HIgG−CFSE 複合体(0.0005mg／ml PB S 溶液)は、ヤギ抗-H1gG にたいしては陰性信号を生じたが、BSA にたいしては 信号を生じなかった。 実施例13 HIgG−FITC 複合体は、Jackson Immune Research,West Grove,PA か ら購入した。この複合体の希釈溶液（0.0005mg／ml PBS 溶液）を用いて、ヤギ 抗−HIgG のピーク検出に用いた。第 10 図から分かるように、この複合体は、 ヤギ抗−HIgG にたいしてきわめで弱い陰性ピーク、蛋白 Ａ にたいしてはきわ めて弱い陽性ピークを生じたか、BSA にたいしてはピークを生じなかった。 実施例14 15mg の HIgG を 2.3mg の DTAF と、実施例３に記載と同様のやり方で、複合 させた。第 11 図から分かるように、HIgG−DTAF 複合体(0.0005mg／ml PBS 溶 液)は、ヤギ抗−HIgG にたいしては信号を生ぜず、蛋白 Ａ にたいしては陽性信 号、蛋白 Ｇ にたいしては陰性信号を生じた。 実施例15 pH8.3 の 0.2M の炭酸水素ナトリウム 0.5ml に溶解したヤギ抗−RIgG(1ml、2 .4mg／ml)を、0.1ml の DMSO に溶解した 1mg の CFSE と室温で３時間反応させ た。反応を、1M NH2OH 0.1ml を添加して停止させた。反応混合液を室温で １ 時間攪拌した。得られたヤギ抗 RIgG - CFSE を、GPC を用いて分離した。この 複合体（0.0005mg／ml PBS溶液）は、RIgG や、HIgG にたいして反応を生じなか った。 実施例16 ヤギ抗 HIgG−DTAF 複合体は、Pierce,Rockford,Illinois から購入し、HIgG のピーク検出に用いた。第 12(a)図から分かるように、この複合体(0.0002mg／m l PBS 溶液)は、HIgG にたいしては検出可能な陽性ピークを示したが、BSA にた いしてはピークを示さなかった。この複合体の濃度を 0.0008mg/ml に増やすと 、HIgG にたいする強度は改善された（第 12 （ｂ）図参照）。 実施例17 蛋白 A-CFSE 複合体(0.1ml、0.3mg／ml)を、2.3mg／ml の RIgG 0.1ml と混合 した。RIgG は蛋白 A-CFSE とよく結合する。得られた混合物は、室温で 10 分 間放置し、次に、100ml の PBS に移した。次に、得られた溶液を、ヤギ抗−RIg G と HIgG のピーク検出に用いた。第 13 図から分かるように、ヤギ抗−RIgG にたいするピークは得られなかった。さらに、HIgG にたいするピークも得られ なかった。これは、遊離の蛋白 A-CFSE がないことを示す。なぜなら、蛋白 A-C FSE は、過剰にあった RIgG に全て結合したはずだからである。 実施例18 実施例 17 の実験を繰り返した。ただし、この場合、蛋白 A-CFSE の代わりに 、蛋白 G-CFSE を用いた。第 14 図から分かるように、何のピークも検出されな かった。 実施例19 蛋白 G-DTAF(0.1ml、0.3mg／ml)を、0.5mlの PBS に溶解した 0.5mg のヤギ抗 −RIgG と、室温で 10 分間インキュベートした。次に、このインキュベートし た溶液を 100ml の PBS に加え、RIgG、HIgG、BIgG、mIgG、および、BSA を検出 するのに用いた。第 15 図から分かるように、RIgG、HIgG、BIgG、および、BSA にたいしては、何のピークも検出されなかった。しかしながら、mIgG にたいし てはピークが検出された。このピークは、mIgG が蛋白 G-DTAF にたいして、過 剰の RIgG と競合できるほどに強く結合する結果によるものと考えられる。 実施例20 蛋白 G-FHSE(0.1ml、0.3mg／ml)を、0.5ml の PBS に溶解した 1mg のヤギ抗 −RIgG と、室温で 10 分間インキュベートした。得られた液を、100ml の PBS に加え、RIgG、および、HIgG のピーク検出に用いた。第 16 図から分かるよう に、RIgG にたいして広い、陰性のピークが検出された。HIgG にたいしてはピー クは検出されなかった。 実施例21 pH9 の0.2M 炭酸水素ナトリウム 0.7ml に溶解した、4.3mg のカッパ・ロック （Aaton，Natick，MA）−これは、IgG の Fab 域に結合できる軽鎖 Fab である −を、0.1ml の DMSO に溶解した 2.1mg の DTAF と室温で ３ 時間反応させた 。この反応を、1M NH2OH 0.1ml を添加して停止させた。カッパ・ロック−DTAF 複合体を、PBS 溶液において、GPC により分離した。この複合体を、PBSに 0.00 03mg／ml となるように希釈し、RIgG、mIgG、および、BSA を検出するのに用い た。第 17 図から分かるように、この複合体は、RIgG、HIgG、および、BSA にた いしては弱いピークを生じたが、mIgG にたいしては強いピークを生じた。 実施例22 カッパ・ロック−DTAF とヤギ抗−RIgG 間のサンドイッチ（すなわち、錯体） を、0.3mg／ml カッパ・ロック−DTAF の 0.1ml を、2.3mg／ml ヤギ抗−RIgG の 0.5ml と混合し、室温で 10 分間インキュベートして形成した。えられたサ ンドイッチを、100ml の PBS に移し、RIgG、HIgG、mIgG、および、BSA を検出 するための作業液（0.0003mg／ml）として用いた。第 18 図から分かるように、 このサンドイッチは、カッパ・ロック− DTAF を用いて得られたものと同じピークを生じた。実際は、サンドイッチによ るピーク強度は、カッパ・ロック−DTAF を用いて得たものよりもいく分悪かっ た。 実施例23 カッパ・ロック-FHSE 複合体を、実施例 21 で使用したものと同じ方法を用い て調製した。ただし、pH8.3 の 0.2M 炭酸水素ナトリウムの 0.7ml に溶解した 、4.2mg のカッパ・ロックを、0.1ml の DMSO に溶解した 2mg の FHSE と、室 温で ３ 時間反応させた。次に、この複合体を、RIgG,HIgG、mIgG、BIgG、BSA、 ヤギ抗−mIgG、および、ヤギ抗−RIgG を検出するのに用いた。第 19 図に見ら れるように、カッパ・ロック−FHSE は、mIgG を除いては、大抵の IgG類にたい して十分な反応を呈しなかった。 実施例24 p H 8.3 の 0.2M の炭酸水素ナトリウム 0.7ml に溶解した 2.3mg のコンカナ バリン Ａ を、0.1ml の DMSO に溶解した 1mg の CFSE と、室温で ３ 時間反 応させた。この反応を、1M NH2OH 0.1ml を添加して停止させた。この混合液を 、さらに １ 時間室温で攪拌し、次に、GPC と、PBS を溶出液として精製した。 コナカバリン−CFSE を同様にして調製した。ただし、4.3mg のコナルブミンと 2.2mg の CFSE を用いた。コンカナバリン A-CFSE 複合体（0.001 mg／ml PBS溶 液）は、コナルブミンにたいしては何の信号も呈しなかったが、コナルブミン− CFSE（0.001mg／ml PBS 溶液）は、コンカナバリン Ａ にたいしてごく弱いピー クを示した（第 20 図参照）。 実施例25 カラムを用いずに、20m M トリスと 150Mm NaCl の混合液 pH 7.45 に溶解し た、0.05mg／ml AT3（Miles）100μl の標本を、流速 2ml／分で流れる 70％ PB S と 30％の水の混合液流体の中にポンプで注ぎ込み、静水ミキサーに導いた。 このミキサーにおいて、、流速 2ml／分でこのミキサーにポンプされた、PBS に 溶解した 0.0001mg／ml HPTS 流体と混合した。得られた混合液は、蛍光検出器 に流れこんだ。検出器は、第 21 図に示すように、ブランク(20Mm と 150mM NaC l)にまさる、AT3 による蛍光強度の増加を示した。これは、蛋白 Ａ や、蛋白 Ｇ のような抗原を用いずに、蛍光染料のみによって、非−IgG蛋白を蛍光検出し た一例である。 実施例26 pH 5.1 の0.2M NaOAc に溶解した5mg／ml BSA、および、0.05mg／ml HIgG 100 μl を、S-HyperD（商標）溶媒中に通過させた。ここに、孔にハイドロゲルを満 たした多孔性酸化ケイソ／ポリスチレン組成支持体（BioSepra，Marlborough，M A によって市販されており、かつ、米国特許第 5,268,097 号に開示されている 。この文献をここに引用することによって本請求書中に参考として援用する）は 、ザルフォプロピル・イオン交換特性を持つ。さらに、pH 5.1、0.2M NaOAc と 、1M 食塩勾配を用いて分離した。クロマト溶媒を活性化する溶出サンプルを、 装置 11 と同様の装置を用いて監視した。ここに、分析液は、p H8.9 0.2M Na2H PO4 に溶解した蛋白 A-CFSE と蛋白 G-CFSE の混合物を含む。第 22 図から分か るように、BSA に相当する第１のピークは蛍光監視には何の反応も与えないが、 一方、HIgG に相当する第２の広い UV ピークは、十分な蛍光ピークを生じた。 実施例27 pH ６ の 0.2M トリスに溶解した 5mg／ml BSA、および、0.05mg／ml HIgG を 含む 100μl サンプルを、Q-HyperD（商標）溶媒中に通過させた。ここに、孔に ハイドロゲルを満たした多孔性酸化ケイソ／ポリスチレン組成支持体（これもBi oSepra,Marlborough,MA によって市販されている）は、４級アミン・イオン交換 特性を持つ。さらに、pH 5.5、0.2M トリスと、1M NaCl 勾配を用いて分離した 。クロマト溶媒を活性化する溶出サンプルを、装置 11 と同様の装置を用いて監 視した。ここに、分析液は、pH8.40.2M トリスに溶解した蛋白 A-FHSE を含む。 第 23 図から分かるように、第 １ のピーク（HIgG）は十分な蛍光ピークをあた えるか、第２のピーク(BSA)は、蛍光信号を生じなかった。ここに、食塩勾配溶 出の間、蛍光の基線は低下したことは注目すべきである。 前述の本発明の実施態様は、単に例示的なものを意図したものであって、当業 者ならば、本発明の精神を逸脱するこどなしに、本発明にたくさんの変更や修正 を加えることが可能であろう。例えば、UV 吸収試験部 21 は、大流 27 の流路 にそって、バルブ 25 のの後に置くことも可能であろう。このような変更や修正 はすべて、付属の請求項に定義するように本発明の範囲内にあるとするものであ る。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION        On-line detection of desired solutes in fluids by fluorescence spectrophotometry                                Field of the invention   The present invention generally relates to a method for detecting an intended solute in a solution sample. . More specifically, in eluted samples generated by differential transfer separation Involved in online technology for detecting expected solutes.                                Background of the Invention   Differential transfer separation is well known in the fields of biology and chemistry. Used to separate a solute mixture present in a liquid sample. Differential movement An example of a separation method is chromatography. Chromatography is usually 2 The solute is separated by the difference in distribution among the three phases. This phase consists of a solid phase and a liquid phase. There are many. Solute partitioning means that various solutes in a sample Resulting from its differential movement through the substrate consisting of the daughters. Dissolution through solid phase substrate The movement of quality is usually driven by a pressure gradient. The specific type of solid phase substrate used Depending on the number of properties, chromatography can separate solutes Can be used for The properties include, for example, size, charge, hydrophobicity, Aqueous and / or specific affinity for the substrate, i.e. Ligand.   Another example of the differential transfer separation method is electrophoresis. Electrophoresis is usually Separate the solute based on the difference in electrophoretic migration as it passes through the substrate. That's it Solute transport in such systems is driven by a voltage gradient due to the applied electric field. You.   As can be seen, differential transfer separation is a method in which various solutes are It utilizes the difference in the speed of movement through a substrate. Production of differential transfer separation method An object is usually a continuous fluid that flows out of a substrate, and contains various solvents in the mixture. The qualities are spatially separated from each other. Various solutes in this effluent, The determination of the location of a particular solute at a given time requires that Fractions, and then, using any of the means familiar to those skilled in the art, This is achieved by collecting this fraction and identifying its contents. Each in solution Examples known in the art for detecting species analytes include U.S. Pat. No. 07,075, Inventor Liburdy, issued June 10, 1980, U.S. Pat.No. 3,998,943 Issue, Inventor Ullman, issued December 21, 1976, European Patent Application No. 290,269  Published November 9, 1988, European Patent Application No. 242,527, October 1987 Published by Huang et al., "Direct and Homogeneous Immunoassay for IgG anal" ysis, "(" Direct and homogeneous immunoassays for IgG analysis ")," Biotechnology and B ioengineering, "Volume 40, pages 913-8 (1992), Haidukewych," Therapeutic Dr ug Monitoring By Automated Fluorescence Polarization Immunoassay, "(" Therapeutic Drug Monitoring by Dynamic Fluorescence Polarization Immunoassay ")" Immunoassay Technology, "Volume 2 , 71-103 (1985) and "Automated Fluorescence / Photometer System for Homo geneous Immunoassay, "(" Automatic Fluorometer for Homogeneous Immunoassay "), Clinical Che mistry, Vol. 29, pp. 1628-34 (1983). All of the above are incorporated herein by reference. I do.   One of the problems with the above solute detection methods is that they usually activate the substrate (or most of it). Of all collected effluents in the form of a series of collected samples, and then each collected sample (and Must be examined for the presence of solutes That is. As will be readily apparent, such tests are often time consuming. Costly, tedious, and expensive. In addition, the above method is used for testing purposes. The sample is no longer Effluent samples must be changed to a series of discrete collections It will also be appreciated that In addition, each collected sample is usually Does it contain multiple solutes that have activated the quality for quite some time? Furthermore, the method described above determines exactly how the desired solute is distributed in the effluent. Gives only limited information about Expected solute in effluent Such information, which can be obtained about exactly how It is often useful to determine which variables in a dynamic separation method have been modified. You.   One approach that has been taken to address problems of the type described above is U.S. Pat. No. 34,586, published by the inventor Afeyan et al. On August 10, 1993, And incorporated herein by reference. The features of Afeyan et al. The existence of a predetermined solute or group of solutes in a certain effluent is And online methods for rapid location. In this method, first The mixture is passed through a device capable of separating solutes of the mixture, As a result, when solutes exit the device as a liquid phase (outflow fluid), they The quality is separated from each other to some extent both temporally and spatially. This first device Is compatible with liquid chromatography, for example, columns and other solvents such as electrophoresis modules. Quality separation means may be used. Next, the effluent obtained from the first solute separation device is Pass through an ultraviolet (UV) absorption detector, thereby allowing all UV absorbing solutes ( Obtain a first output that describes the elution profile of, for example, proteins, nucleic acids, etc.). Next, among these many UV-absorbing solutes, the intended, specific UV-absorbing solute To determine the quality, at least a portion of this effluent, the intended solute By passing through a second device which can be selectively removed from the second device. others If possible, it is preferable to use immunosorbents and immunoaffinity substrates. No. Next, the spill out of this second device The fluid is passed through the same or similar UV detector and exits this second device. A second output is obtained that describes the elution profile of all the UV absorbing solutes issued. This second device converts the desired solute over time and / or other solutes in the effluent. Or, because it is selectively extracted without changing the spatial arrangement, The difference in the second output determines the presence and location of the desired solute in the fluid effluent. Can be used.   According to one embodiment disclosed in the Afeyan et al. Patent, IgG is And the second device comprises a refluxable protein A affinity substrate.   The present inventors have identified some drawbacks with the Afeyan et al. Method. That's it One such drawback is the second device used to remove the desired solute from the effluent. The system is quickly saturated with the desired solutes, so Or exchange to prevent the solute in question from leaving undetected. That is what we have to do. A second drawback of the Afeyan et al. Method is that it requires a second device. The range of solutes to be removed is determined by the affinity solvent that can settle on the substrate. It may be limited by type. Furthermore, the fixation of the affinity solvent Even where feasible, fusing costs can be high. In particular, This is the case for certain affinity solvents such as white A and protein G. Afeyan et al. A third disadvantage of the method is that it may be difficult to determine the difference between the first and second outputs. Is to gain. In particular, if one or more solutes are This is the case when elution occurs. The fourth disadvantage of Afeyan et al. Is that UV absorption Is not detectable at concentrations of biomolecules below about 0.1 mg / ml, Is not detectable in the presence of interfering solutes. Afeyan et al. The drawback of 5 is that the affinity substrate used here is unlike any other solute in the effluent sample. Solute space that triggers some interaction, thereby activating the affinity substrate Changing distribution, which makes it difficult to identify the desired solute Is to have the potential to make it happen.                                Summary of the Invention   The present invention provides a novel method for detecting desired solutes in eluted samples Is the purpose.   It is another object of the present invention to provide said method, which is an online detection method is there.   Solve at least some of the problems described above in relation to existing methods, It is yet another object of the present invention to provide such a method.   Other objects of the invention, as well as the features and advantages of the invention, are, in part, in the following details. In the detailed description, some were touched on and some were apparent from the detailed description. , And in part, could be learned through the practice of the present invention. In this description Reference is now made to the accompanying figures that form a part of this description. Also, in this description, By way of illustration, specific embodiments implementing the invention are shown. These embodiments are It has been described in sufficient detail to enable those skilled in the art to practice the invention. Accordingly That other embodiments may be utilized without departing from the scope of the invention. And understand that changes can be made. Therefore, The detailed description should not be taken in a limiting sense. Also, the scope of the present invention is Is most completely defined in the following claims:   According to one aspect of the present invention, the presence or absence of a desired solute in an eluted sample is detected. A method is provided. The method comprises the following steps. That is, (a) if possible A fluorescent agent that preferably binds to the desired solute, the fluorescence of which is When bound to a different fluorescent agent than when not bound to the solute, There is a step of adding to the eluted sample, and (b) a step of activating the eluted sample. Thereby activating the entire length of the fluid, whereby the fluorescent agent Whether or not it is bound to the solute The step of presenting by the fluorescence, and (c) the fluorescence emitted from the eluted sample. The step of detecting light, thereby binding to the fluorescent agent or desired solute Detection fluorescence based on the presence of the desired solute in the eluted sample .   The eluted sample subjected to the above method is subjected to differential transfer such as chromatography or electrophoresis. It may be generated by a dynamic separation method. The fluorescent agent added to the eluted sample can be The half-mer with affinity for the desired solute and bovine serum albumin (BSA) And a complex with a fluorescent halfmer that does not give too much positive reaction. No. Most fluorescent dyes show a positive reaction to BSA that can It is suitable as a halfmer. In addition, a positive reaction of BSA for fluorescent Free fluorescent dye may be added to the sample along with the fluorescent agent to reduce . If the desired solute is an immunoglobulin such as IgG, the fluorescent agent may be (I) fluorescent Dye and protein A, (ii) fluorescent dye and protein G, or (iii) mixtures thereof, such as For example, a composite of a 1: 1 mixture is preferable. The intended solute is antitron If it is bottle III, trihydroxy 8-pyrene-1,3,6-trisulfonate Lithium salt (HPTS) may itself be used as a fluorescent agent, or It may be combined to form a fluorescent agent.   According to another aspect of the invention, the desired solute distribution in a length of fluid Is provided. At this time, the fluid is fine, such as chromatograph and It is preferably formed by a transfer-separation method. The method comprises the following steps: You. That is, it is preferable that (a) bind to the desired solute if possible, and Fluorescence is different when bound to the solute than when it is not bound to the solute. Adding such a fluorescent agent over the entire length of the fluid, (b) adding the entire length of the fluid An activation step whereby the fluorescent agent is bound to the solute Whether or not is indicated by the fluorescence (C) the fluorescence emitted from the length of the fluid is related to the position inside the length of the fluid. Detecting as a number, and (d) using the result of the detecting step, within the fluid length The process of confirming the expected solute distribution in the part.   According to yet another aspect of the invention, the presence of the desired solute within the fluid And a method for determining the position is provided. Here, the method comprises the following steps: . That is, (a) a step of vertically dividing an eluted sample into a first fluid and a second fluid. Thus, here, the first and second fluids have proportional chemical compositions. In addition, this eluted sun Pulls are generated by differential transfer separation methods such as chromatography and electrophoresis. Preferably, there is. (b) the expected dissolution in the first fluid by fluorescence spectroscopy Determining the presence and location of the quality, (c) determining the time correlation of the first and second fluids; And (d) determining the presence and location of the solute, and the time correlation Using the results of the step of determining the presence and location of the desired solute in the second fluid. The step of determining.   As can be seen, the location of the desired solute in the second fluid has been determined once Then, only the portion of the second fluid containing the solute in question can be collected.   According to yet another aspect of the invention, the desired solute distribution within the fluid Is provided. Here, the method includes the following steps. sand That is, (a) a step of vertically dividing the eluted sample into a first fluid and a second fluid, Here, the first and second fluids have a proportional chemical composition. Also, this eluted sample Must have been generated by differential transfer separation methods such as chromatography or electrophoresis. Is preferred. (b) the fraction of the desired solute in the first fluid by fluorescence spectroscopy Determining a cloth; (c) determining a time correlation of the first and second fluids; and d) determining the distribution, and using the result of the step of determining the time correlation Determining the desired solute distribution in the second fluid.   As can be seen, the desired solute distribution in the second fluid has been determined once. If so, collect only the portion of the second fluid that contains the highest concentration of the solute in question Can also. In addition, if the eluted sample is a product of differential transfer separation, The solute distribution in the two fluids reflects the efficiency of the separation method used. Therefore, before The method quickly assesses whether any variables of the separation method used have changed. Give online equipment for.   According to yet another aspect of the present invention, at a location inside the fluid, A method is provided for determining the concentration of a solute of Here, the method comprises the following steps: Consisting of That is, (a) a process of vertically dividing an eluted sample into a first fluid and a second fluid. Wherein the first and second fluids have proportional chemical compositions. Also, this solution Outgoing samples were generated by differential transfer separation methods such as chromatography and electrophoresis. Preferably, it is (b) A position of the first fluid by fluorescence spectrophotometry Determining the desired solute concentration in step (c), determining the time correlation of the first and second fluids. Determining; (d) determining a volume correlation between the first and second fluids; and (e) Determining the concentration, determining the time correlation, and determining the volume correlation. Using the result of the determining step, the desired solute at the corresponding location of the second fluid is Determining the concentration.   According to another aspect of the present invention, an apparatus for monitoring a fluid for a desired solute Is provided. Here, the device comprises the following means. That is, (a) elution Means for vertically dividing the sample into a first fluid and a second fluid, wherein the first and the second fluids are divided into The second fluid has a proportional chemical composition. (b) If possible, bind to the desired solute Preferably, and if the fluorescence binds to the solute, it does not bind to the solute. (C) means for mixing the fluorescent agent with the first fluid, d) For the first fluid, monitor for the presence of the expected solute based on the fluorescence of the fluorescent agent. Means, and (e) first and second Means for time correlating the fluid, thereby obtaining for the first fluid Such a means by which the result can be applied to a second fluid.   According to another aspect of the present invention, a desired solute is purified from a mixture of solutes. A way to do is given. Here, the method includes the following steps. Ie (A) subjecting the mixture of solutes to an appropriate differential transfer separation method, Eluted sample is generated in which the desired solute is separated to some extent from the remaining solute (B) vertically dividing the eluted sample into a first fluid and a second fluid, Here, the first and second fluids have a proportional chemical composition. (c) Fluorescence spectrophotometry (D) determining the location of the desired solute concentration peak in the first fluid, And determining the time correlation of the second fluid, (e) determining the concentration peak, And using the result of the step of determining the time correlation to determine a location in the second fluid. Determining the location of the corresponding concentration peak of the desired solute; and (f) the desired solute Collecting a portion of the second fluid corresponding to the concentration peak of                             BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES   The accompanying drawings, which are incorporated in and form a part of this specification, illustrate preferred embodiments of the present invention. FIG. 3 illustrates an embodiment, and together with the description, clarifies the principles of the invention. Help you. In this figure, like reference numerals represent like parts.   FIG. 1 shows an automatic online monitoring system for monitoring the presence or absence of a desired solute in a fluid. FIG. 1 is a schematic view of an embodiment of an in-device, wherein the on-line device is a device according to the present invention. It is configured by the instructions of   Figures 2 (a) and 2 (b) show the protein without MES and G-DTAF and MES, respectively. A mixture of 5 μg HIgG, 500 μg BSA and 5 μg HIgG, obtained using the protein G-DTAF, And a graphical representation of the fluorescence signal intensity for 500 μg BSA. This is implemented Performed in Example 5.   Figures 3 (a) and 3 (b) show the results using protein A-HCCS and protein G-HCCS, respectively. 5μg HIgG, 500μg mixture of BSA and 5μg HIgG, and 500μg 6 is a graphical representation of the fluorescence signal intensity for BSA. This is the case in Example 6. gave.   Figures 4 (a) and 4 (b) show the results using protein A-MCCS and protein G-MCCS, respectively. 5μg HIgG, 500μg mixture of BSA and 5μg HIgG, and 500μg 6 is a graphical representation of the fluorescence signal intensity for BSA. This is the case in Example 7. gave.   Fig. 5 shows the results obtained using a 1: 1 mixture of protein A-CFSE and protein G-CFSE at a flow rate of 2 ml / min. , BSA, migG, RIgG, BIgG, goat anti-mIgG and goat anti-RI 6 is a graphical representation of the fluorescence signal intensity for gG. This is the case in Example 8. gave.   Figure 6 shows a 1: 1 mixture of protein A-FHSE and protein G-FHSE at a flow rate of 2 ml / min. HIgG, BSA, migG, RIgG, BIgG, goat anti-mIgG obtained using the compound, FIG. 4 is a graphical representation of the fluorescence signal intensity for goat anti-RIgG. This is in Example 9. Was carried out.   FIG. 7 shows HIgG, BSA, migG, and RIgG obtained using the 76-day storage protein G-DTAF. Graph of fluorescence signal intensity for, BIgG, goat anti-mIgG and goat anti-RIgG It is shown. This was performed in Example 10.   FIG. 8 shows goat anti-rabbit IgG, goat anti-mIgG, obtained using RIgG-CFSE. 5 is a graphical representation of the fluorescence signal intensity for HIgG. This is similar to Example 11  Was carried out.   FIG. 9 shows goat anti-HIgG and BSA obtained using the HIgG-CFSE complex. 5 is a graph showing the fluorescence signal intensity of the graph of FIG. This was done in Example 12. did.   FIG. 10 shows that anti-HIgG, protein A, and 7 is a graphical representation of the fluorescence signal intensity for BSA. This is the smell in Example 13. It was carried out.   FIG. 11 shows that anti-HIgG, protein A, and 7 is a graphical representation of the fluorescence signal intensity for protein C. This is described in Example 14. Was carried out.   Figures 12 (a) and 12 (b) show the PBS concentrations of 0.0002 mg / ml and 0.0008 mg / ml, respectively. graphical representation of the fluorescence signal intensity for HIgG by ml of anti-HIgG-DATF complex. is there. This was performed in Example 16.   FIG. 13 shows goat anti-RIgG obtained using protein A-CFSE and RIgG, and 7 is a graphical representation of the fluorescence signal intensity for HIgG. This is described in Example 17. It was carried out.   Fig. 14 shows goat anti-RIgG obtained using the complex of protein G-CFSE and RIgG. 7 is a graphical representation of the fluorescence signal intensity for HIgG. This This was performed in Example 18.   FIG. 15 shows the results obtained using a complex of protein G-DTAF and goat anti-RIgG, It is a graphical representation of the fluorescence signal intensity for HIgG, BIgG, mIgG, and BSA. This was performed in Example 19.   FIG. 16 shows the results obtained using a complex of protein G-FHSE and goat anti-RIgG, 5 is a graphical representation of the fluorescence signal intensity for HIgG. This is similar to Example 20  Was carried out.   Fig. 17 shows the results of RIgG, HIgG, mI obtained using the kappa lock-DTAF complex. It is a graphical representation of the fluorescence signal intensity for gG and BSA. This is an example  21.   FIG. 18 shows the results obtained by using kappa lock-DTAF and a goat anti-RIgG complex. It is a graphical representation of the fluorescence signal intensity for IgG, HIgG, mIgG, and BSA. This was performed in Example 22.   Fig. 19 shows RIgg, HIgG, mIgG and BI obtained using Kappa lock-FHSE. Graph of fluorescence signal intensity for gG, goat anti-mIgG, goat anti-RIgG, and BSA It is a display. This was performed in Example 23.   Fig. 20 shows the effect of concanavalin A on conalbumin-CFSE complex. 7 is a graphical representation of the intensity of the fluorescent signal. This was performed in Example 24.   FIG. 21 is a graphical representation of the results obtained in Example 25.   FIG. 22 is a graphical representation of the results obtained in Example 26.   FIG. 23 is a graphical representation of the results obtained in Example 27.                       Detailed Description of the Preferred Embodiment   Referring to FIG. 1, the elution sample was monitored for the presence of the expected solute. A schematic diagram of one embodiment of an automatic online device for the present invention is shown. The device comprises: Consists of the teachings of the present invention and is generally designated by the reference numeral 11.   As illustrated in FIG. 1, one possible use of device 11 is to mix solutes. The liquid sample 15 containing the compound is passed through the differential moving separation device 17 There is a process to monitor the eluted sample 13 obtained by Here, this separation device Expected solutes can be physically separated from the remaining solutes in the mixture . Apparatus 17 may be, for example, a chromatographic column, an electrophoresis gel, or the like. There may be.   The device 11 includes a UV absorption detection device 21. This instrument applies UV light to the sample Means for irradiating (not shown) and means for measuring UV light absorbed by the sample (Not shown). The eluted sample 13 is passed through device 21 and thereby All UV-absorbing solutes (e.g., proteins, nuclei) Produces a continuous output that matches the spatial distribution of the Such a solute space component Cloth, when represented graphically, is usually a series of peaks. Where each peak is , Representing a high concentration of one or more solutes at a particular location in sample 13.   Apparatus 11 further includes a fluid split valve 25 downstream of apparatus 21. Bal The block 25 vertically divides the eluted sample 13 into a large fluid 27 and a small fluid 29. here In contrast, stream 29 has the same relative chemical composition as stream 27, but compared to stream 27 It is preferable to have a much lower capacity. For example, the volume ratio of fluid 29 to fluid 27 May each be in the range 1:10.   Apparatus 11 is further downstream of valve 25 along a stream of small stream 29. Includes Ksar 31. Mixer 31 is used when stream 29 penetrates mixer 31. , To mix the analysis solution 33 (hereinafter called this name) into the stream 29 It is. The mixer 31 mixes the analysis solution 33 and the small stream 29 in a volume of μl, preferably about  A micro-mixer that can mix in a small volume of 5 μl may be used. Also, with another law Then, the mixer 31 mixes the analysis solution 33 and the small stream 29 in a ml volume, usually about 1 ml. May be a dynamic mixer that can be mixed by the above method. In device 11, the die The advantages of using a micro-mixer over a natural mixer One is that the desired solutes are more segmented than when using a dynamic mixer. The ability to detect cloth with much higher accuracy. The reason is micro Mixers have relatively small capacities and, therefore, Solutes that have been spatially separated in previous steps This is because there is little fear of turning. As you can see immediately, the special This advantage is significant when the flow rate is relatively high. micro· One of the advantages of using a dynamic mixer over a mixer is that Dynamic mixers are, by design, more efficient than micromixers. 3 and stream 29 can be mixed more thoroughly. However, As you can see, the effects of both micro and dynamic mixers The rate difference depends on the particular embodiment being compared.   Apparatus 11 also includes a pump 35, which drives the analyte 33 to a mixer. For example, include a pump having a rate of about 1 to 8 ml / min.   The analysis solution 33 is a fluorescent agent, and preferably binds to a desired solute, and its fluorescence is Bound to the desired solute at one or more points (eg, strength, decay time, polarity, etc.) The case contains a different fluorescer than when it does not bind to the desired solute. One of the fluorescent agents The type is a complex of a fluorescent dye and a halfmer that has an affinity for the desired solute. is there. The solute mixture converts bovine serum albumin (BSA) Contains, or is likely to contain, and the solute other than BSA is the desired solute In such a case, the fluorescent dye is usually preferably a fluorescent dye. Because the fluorescent dye The charge is usually very small, if at all, for bovine serum albumin (BSA). It shows only a few positive reactions that can be adequately processed (furthermore, In the case of any of the above positive reactions, a small amount of hydrolyzed free fluorescent Fee, for example, about 10-7 mg / ml to about 10-9 Add more to become mg / ml This can effectively counteract the reaction). Use in the present invention Examples of suitable fluorescent dyes include fluorescent isothiocyanate (FITC), 5-bromomethyl Fluoresan (BMF), 5- (and 6-)-iodoacetamidofluoresan (IAF), 5- (4,6- Dichlorotriazinyl) aminofluoresan (DATF), 5- (and 6-)-carboxyfur Olesan succinimidyl ester (CFSE) and 6- (fluorescein-5- (and- 6) -Carboxamide) succinimidyl hexanoate (FHSE) You. Among the above fluorescent dyes, CFSE and FHSE are preferred. Because these are Because it shows no positive response to BSA. Other fluorescent dyes 1-alkyloxypyrene-3,6,8-trisulfonic acid sodium salt (Cascade Blue) and 5,7-dimethyl-4,4-difluoro-4-bora-3a, 4a-diaza-s- There is Indacin (BODIPY FL). Small, hydrophilic, no amino groups With fluorescent dyes, BSA is not the desired solute or is not likely to be included in the solute mixture In such cases, other materials are suitable as fluorescent dyes.   Protein A and Protein G each represent a wide range of immunoglobulins (eg, (Eg, IgG, IgA, IgD, IgM). The most notable exception is the elder IgG and human IgD. Therefore, chicken IgG and / or human If an immunoglobulin other than IgD is the desired solute, a suitable fluorescent agent is (I) Complex of fluorescent dye and protein A; (ii) complex of fluorescent dye and protein G Complex or (iii) fluorescent dye / protein A and fluorescent dye / protein G complex Is a mixture of When the desired solute is a different aggregate of immunoglobulins Is particularly preferably a mixture of protein A and protein G complexes. Because protein The affinity between A and protein G is complementary to many immunoglobulins. You. (For example, protein G binds to bovine IgG more strongly than protein A). Fluorescent dye The synthesis of the complex of protein A and protein G is essentially the same as that of Bioconjugate C. hem., vol. 3, page 2-13 (1992). Can be This document is hereby incorporated by reference herein. Invite. Effectiveness of protein A (or G) / fluorescent dye complex in assay solution 33 Concentrations range from 0.0001 to 0.1 mg / ml.   If the desired solute is Antithombin III, the fluorescent agent may be (I) 8-hydroxy Len-1,3,6-trisulfonic acid trisodium salt (HPTS) also (ii) heparin and HP Any of the complexes of TS may be used. Surprisingly, the inventors have found that HPTS Body has an affinity for antithrombin III and therefore has an affinity half-mer. Found that there was no need to match.   The fluorescent agent of the present invention also comprises a fluorescent dye / protein A (or G) complex, Between the A (or protein G) and the half-mer that has affinity for both the desired solute May take the form of a complex of   The analysis solution 33 further contains a buffer solution in which the fluorescent agent is dissolved. Buff The function of the key system is to maintain the fluorescent agent at a fairly steady pH. this is This is because the fluorescence intensity of the fluorescent dye tends to increase with pH. Soon As can be seen, the maintenance of a constant pH in the present invention is based on the fact that the analysis solution 33 It is complicated by being mixed. Because the stream itself is also usually a buffer (Eg, sample buffer or elution buffer) The same pH of the buffer in solution 33 May or may not. Nevertheless, strong buffers, for example Use sodium phosphate buffer (preferably 0.05-0.2M, pH 7-8.9) And / or adjust the pH of the sample buffer Slightly lower than the pH of the elution buffer and 2 pH units above the elution buffer. And / or by using a suitable micromixer 31 It is believed that the types of problems suggested above can be minimized. Also note It should be noted that antigen binds to the same extent at salt concentrations above 0.5M. Absent.   Apparatus 11 is further located downstream of mixer 31 along the flow path of stream 29 Includes fluorescence detector 41. The fluorescence detector 41 detects the fluorescent agent added to the stream 29. Activating means (not shown) is included. Upon activation, the fluorescent agent will Fluoresce, depending on whether it is bound to is there. Also, a means (not shown) for measuring the fluorescence emitted from the excitement site of the small stream is provided. Including. In this embodiment, this measuring means measures the fluorescence intensity. The steps may also, or alternatively, be of any distinctive nature, such as decay time, polarity, or other May be used to measure the fluorescence characteristics of Pass stream 29 through device 41 This gives a continuous output consistent with the desired spatial distribution of solutes in stream 29. It is. The desired spatial distribution of solutes, when represented as a graph, usually has one peak. Including. This peak occurs at a specific location within stream 29 where the solute is highly concentrated. Indicates that As can be seen, the shape of the peak is performed by instrument 17 Provide some information about the effectiveness of the separation. That is, broad peaks are generally sharper. This indicates that the separation is worse than that of the peak.   Apparatus 11 further includes a computer 51. Computer 51 UV Absorption Detector 21 and fluorescence detector 41 are electrically coupled to and Receive each output. Computer 51 processes these outputs. And display them graphically on the display 53. In addition, computers  51 uses the output from devices 21 and 41 at the flow rate of the device (range 0.1 to 30 ml / min). Together with data entered into the computer for Find the location of the desired solute peak concentration in stream 27. Next, the computer  51 uses this information to control valve 55 in the flow of large stream 27. Therefore, only the part of the large stream 27 containing the expected solute peak concentration is selectively collected. You.   In the embodiment shown, the computer 51 further comprises an electronically Connected to node 25. This allows UV absorbing solutes to be This is done so that the sample 13 is vertically divided only after it is detected. Sa Further, the computer 51 is electrically connected to the mixer 31. This is it Mixer 31, valve 25, and sample 13 flow 27 This is for the purpose of being activated only after the vertical division.   As can be readily seen, the computer 51 has an appropriate link between fluorescence intensity and concentration. By providing a standard, device 11 can be used to determine the expected solute in sample 13. Can be used to determine concentration.   One of the advantages of instrument 11 when compared to a fully UV-dependent online detector First, instrument 11 can detect the expected solute at concentrations as low as 0.01 mg / ml. Is Rukoto. On the other hand, the detection limit of the UV device is 0.1 mg / ml. further, Device 11 can detect as little as 5 μg of IgG in the presence of 500 μg of BSA. It cannot be done with UV-dependent equipment.   The following examples are merely illustrative of various aspects of the present invention, and In no sense, it does not limit the scope of the present invention.                                 Example 1   The protein A-FITC conjugate was synthesized as follows. 0.2 mg of 20 mg / ml protein A It was mixed with 0.5 ml of 0.2 M sodium bicarbonate buffer at pH 9. 1mg FI TC was dissolved in 0.1 ml of DMSO by vortex. Next, this FITC solution was A. Add the mixture to the solution and vortex for 10 minutes, then shake for 7 hours at room temperature. With stirring. The protein A-FITC complex obtained was treated with 0.02% sodium azide. Using PBS as loading buffer and elution buffer. Purified by chromatography (Ultrogel AcA 44, BioSepra, Marlborough, MA). 1st band (10 ml) was collected as a complex. The concentration of the complex is about 0.4 mg / ml, then This was diluted to 0.001 mg / ml with PBS.                                 Example 2   The protein G-FITC complex was compared to that described in Example 1 for protein A-FITC. Synthesized in the same way.                                 Example 3   A protein A-DTAF complex and a protein G-DTAF complex were combined with protein A-FITC in Example 1. Synthesized in the same manner as described in. However, in this case, the reaction time  2.5 hours.                                 Example 4   Protein A-FITC, protein A-DTAF, and protein G-DTAF were turned on in the same manner as in device 11. For a line detector, a mixture containing 5 μg HIgG and 500 μg BSA Human IgG (HIgG) was detected. All three complexes are relatively small relative to BSA The smaller peak showed a relatively large peak for HIgG. However , This small BSA peak Approximately 2 μl of a 0.1 mg / ml solution of the released hydrolyzed FITC in 200 ml of a 0.001 mg / ml solution  To the noise level. Here, free The final concentration of FITC is about 10-6 mg / ml. This free FITC is Can have a negative effect, but can have a positive effect on IgG. found. In this way, the negative BSA peak due to free FITC The positive BSA peak due to the conjugate was canceled without adversely affecting the BSA.   Protein A-FITC and protein G-DTAF were added to the on-line detection system 5 μg of mouse IgG (mIgG), bovine IgG (BIgG) and Egret IgG (RIgG) was detected. Both complexes are associated with all three immunoglobulins In contrast, it showed easily detectable peaks. Positive peak for rabbit IgG In a mixture containing 5 μg of rabbit IgG and 500 μg of BSA, protein G- Found when using DTAF. In addition, the positive peak for mouse IgG was 5 Protein A-FTIC was added to a mixture containing μg mouse IgG and 500 μg BSA. Seen when used. However, to detect bovine IgG, protein A-FITC Uses protein A-FITC to detect HIgG, mIgG, and RIgG when used A weaker peak was observed than observed. The present inventor Without wishing to be bound by theory, this weak peak is due to the BIgG It is thought to be caused by the fact that the binding force on BIgG  Wanting to improve the response to protein G and protein G rather than protein A  Next, based on the fact that BIGG binds better to BIgG, BIgG was detected using a mixture of white G-DTAF. There is an increase in the peak Was.                                 Example 5   Protein G (4 mg) in 0.7 ml of 0.2 M sodium bicarbonate, pH 9, was added to 0.1 ml of DMSO And a complex reaction at room temperature for 2.5 hours, followed by 1M MES (2-mercaptoethane sulfonate). The reaction was stopped by adding 0.1 ml of sodium sulfonate), and the BSA peak was To reduce, the protein G-DTAF was loaded with a negative charge. The resulting mixture is allowed to stand at room temperature And stirred for 2 hours. This protein G-DTAF complex is combined with GPC (Ultrogel AcA 44) and PB Separation was performed using S as the eluate. MES shows that the residual DTAF already attached to protein G By reacting with the remaining chloro group, it was possible to attach to the complex. No.  As can be seen from FIGS. 2 (a) and 2 (b), some MES groups (and thus more negative The G-DTAF complex, which contains a GES-containing protein, has a higher Response to BSA is somewhat low. Nevertheless, the BSA peak was completely removed. Not. Protein A-DTAF behaves the same whether or not it contains MES Was.                                 Example 6   Protein A-HCCS (7-hydroxycoumarin-3-carboxylic acid, succinimidyl ether The stell) complex was synthesized as follows. 0.2M sodium bicarbonate at pH 8.3 0.2 ml of the dissolved 20 mg / ml protein A solution was added to 2 mg of the dissolved protein A in 0.1 ml DMSO. It was reacted with HCCS at room temperature for 3 hours. This reaction is performed with 1M NHTwoAdd 0.1 ml of OH And then the resulting mixture was stirred at room temperature for 1 hour. The obtained protein A The -HCCS complex was separated from GPC using PBS as a solute buffer. Protein The G-HCCS complex was prepared by a similar method.   As can be seen from Figs. 3 (a) and 3 (b), either of the protein A-HCCS or protein G-HCCS complex All gave not only the HIgG peak but also a rather strong BSA peak. The inventor Does not want to be limited to any theory, This strong BSA peak is due to a lack of sufficient affinity for coumarin half-mers. I think it is.                                 Example 7   Protein A-MCCS (7-methoxycoumarin-3-carboxylic acid, succinimidyl S Ter) and protein G-MCCS were identified in Example 6 as protein A-HCCS and The protein was synthesized in the same manner as described for G-HCCS. 4 (a), 4 (b As can be seen from the figure, protein A-MCCS and protein G-MCCS The peaks were larger than those of protein A-HCCS and protein G-MCCS, respectively. In addition, protein A-MCCS and protein G-MCCS did not react with HIgG.                                 Example 8   Protein A-CFSE (Carboxyfluorescein succinimidyl ester), Protein G-CFSE, Protein A-FHSE (6- (fluorescein-5- (and-6-)-carboxamide) Xanoic acid / succinimidyl ester) and protein G-FSE complex Synthesized in a manner consistent with that described in Example 6. Fig. 5 shows Thus, protein A-CFSE (0.0003 mg / ml) and protein G-CFSE (0. 0003 mg / ml) did not show any peak for BSA, , HIgG, mIgG, RIgG, and BIgG produce sufficient signal and goat anti-mI gG and goat anti-RIgG also gave detectable peaks.                                 Example 9   Referring to FIG. 6, a 1: 1 mixture of protein A-FHSE and protein G-FHSE is converted to BSA. The reaction did not show much reaction. A reaction similar to that given for the mixture of protein A-CFSE and protein G-CFSE described in 8 was given. I got it. However, the signals for BIgG, goat anti-mIgG, and goat anti-RIgG are It was weaker than in the case of Example 8.                                 Example 10   Protein G-DTAF stored in the refrigerator for 76 days is diluted (0.0003mg / ml) with PBS. It was dissolved in a solution and used as a peak detector. As can be seen from FIG. 7, protein G -DTAF for HIgG, RIgG, mIgG, goat anti-RIgG, goat anti-HIgG, and goat anti-mIg G still effectively peaked. Detect small peaks for BSA Was issued.                                 Example 11   6.3 mg of rabbit IgG (RIgG) was prepared in the same manner as described in Example 8 to obtain 2.1 mg of rabbit IgG (RIgG). Combined with CFSE. As can be seen from FIG. 8, this RIgG-CFSE complex (0.0005 mg / ml PBS solution), the signal was weak for goat anti-rabbit IgG and mIgG. But did not produce a peak for HIgG.                                 Example 12   10 mg of HIgG was combined with 1 mg of CFSE in the same manner as described in Example 11. Combined. As can be seen from FIG. 9, this HIgG-CFSE complex (0.0005 mg / ml PB S solution) produced a negative signal for goat anti-H1gG, but no signal for BSA. No signal was generated.                                 Example 13   The HIgG-FITC complex is available from Jackson Immune Research, West Grove, PA. Purchased. Using a diluted solution of this complex (0.0005 mg / ml in PBS), Used for peak detection of anti-HIgG. As can be seen in FIG. 10, this complex is A very weak negative peak for goat anti-HIgG, a pronounced negative for protein A Produced only a weakly positive peak or no peak for BSA.                                 Example 14   Combine 15 mg of HIgG with 2.3 mg of DTAF in a similar manner as described in Example 3. I let it. As can be seen from FIG. 11, the HIgG-DTAF complex (0.0005 mg / ml in PBS Liquid) does not produce a signal for goat anti-HIgG and a positive signal for protein A. No, a negative signal was generated for protein G.                                 Example 15   Goat anti-RIgG (1 ml, 2 ml) dissolved in 0.5 ml of 0.2 M sodium bicarbonate pH 8.3 .4 mg / ml) was reacted with 1 mg of CFSE dissolved in 0.1 ml of DMSO at room temperature for 3 hours. Was. Reaction was performed with 1M NHTwoThe reaction was stopped by adding 0.1 ml of OH. Bring the reaction mixture to room temperature Stirred for hours. The resulting goat anti-RIgG-CFSE was separated using GPC. this Complex (0.0005mg / ml in PBS) does not react to RIgG or HIgG Was.                                 Example 16   Goat anti-HIgG-DTAF conjugate was purchased from Pierce, Rockford, Illinois, and Was used for peak detection. As can be seen from FIG. 12 (a), this complex (0.0002 mg / m l PBS solution) showed a detectable positive peak for HIgG, but a No peak was shown. Increasing the concentration of this complex to 0.0008 mg / ml And the intensity against HIgG was improved (No. 12). (B) See FIG.).                                 Example 17   Mix protein A-CFSE complex (0.1 ml, 0.3 mg / ml) with 0.1 ml of 2.3 mg / ml RIgG did. RIgG binds well to protein A-CFSE. The resulting mixture is allowed to stand at room temperature for 10 minutes. And then transferred to 100 ml of PBS. Next, the resulting solution was transformed with goat anti-RIg. Used for peak detection of G and HIgG. As can be seen from FIG. 13, goat anti-RIgG No peak was obtained. In addition, peaks for HIgG were also obtained. Did not. This indicates that there is no free protein A-CFSE. Because protein A-C FSE must have bound to any excess RIgG.                                 Example 18   The experiment of Example 17 was repeated. However, in this case, instead of protein A-CFSE, The protein G-CFSE was used. As can be seen from Fig. 14, no peak was detected. won.                                 Example 19   Protein G-DTAF (0.1 ml, 0.3 mg / ml) was dissolved in 0.5 ml of PBS and 0.5 mg of goat anti- -Incubated with RIgG for 10 minutes at room temperature. Then this incubation Add the solution to 100 ml of PBS to detect RIgG, HIgG, BIgG, mIgG, and BSA Used to do. As can be seen from Fig. 15, RIgG, HIgG, BIgG, and BSA No peak was detected. However, for mIgG And a peak was detected. This peak is too high for mIgG relative to protein G-DTAF. This may be due to the binding of the excess RIgG so strong that it can compete.                                 Example 20   Protein G-FHSE (0.1 ml, 0.3 mg / ml) dissolved in 0.5 ml of PBS and 1 mg of goat anti- -Incubated with RIgG for 10 minutes at room temperature. The obtained liquid is added to 100 ml of PBS. In addition, it was used for peak detection of RIgG and HIgG. As can be seen from Fig. 16 In addition, a broad negative peak was detected for RIgG. Pea for HIgG No cracks were detected.                                 Example 21   4.3 mg of kappa lock dissolved in 0.7 ml of 0.2 M sodium bicarbonate at pH 9 (Aaton, Natick, MA)-This is a light chain Fab that can bind to the Fab region of IgG. Was reacted with 2.1 mg of DTAF dissolved in 0.1 ml of DMSO for 3 hours at room temperature. . This reaction is performed with 1M NHTwoThe reaction was stopped by adding 0.1 ml of OH. Kappa Lock-DTAF The complex was separated by GPC in a PBS solution. Add this complex to PBS at 0.00 Dilute to 03mg / ml and use to detect RIgG, mIgG and BSA Was. As can be seen from FIG. 17, this complex is associated with RIgG, HIgG, and BSA. In contrast, a weak peak was produced, but a strong peak was produced for mIgG.                                 Example 22   Sandwich (ie, complex) between kappa rock-DTAF and goat anti-RIgG With 0.1 ml of 0.3 mg / ml kappa lock-DTAF and 2.3 mg / ml goat anti-RIgG. And formed by incubating at room temperature for 10 minutes. Obtained sa Transfer the sandwich to 100 ml of PBS to detect RIgG, HIgG, mIgG and BSA (0.0003 mg / ml). As can be seen from Fig. 18, This sandwich is kappa rock- The same peak was obtained as obtained with DTAF. In fact, the sandwich Peak intensities are somewhat worse than those obtained with kappa rock-DTAF. Was.                                 Example 23   The Kappa-Lock-FHSE complex was used using the same method as used in Example 21. Prepared. However, it was dissolved in 0.7 ml of 0.2 M sodium bicarbonate at pH 8.3. , 4.2 mg of kappa lock, 2 mg of FHSE in 0.1 ml of DMSO, and The reaction was performed for 3 hours at room temperature. Next, this complex was converted into RIgG, HIgG, mIgG, BIgG, BSA, It was used to detect goat anti-mIgG and goat anti-RIgG. See Figure 19 As shown, Kappa Rock-FHSE is found on most IgGs, except for mIgG. Did not respond sufficiently.                                 Example 24   2.3 mg of concana dissolved in 0.7 ml of 0.2 M sodium bicarbonate at pH 8.3 Valine A was reacted with 1 mg of CFSE dissolved in 0.1 ml of DMSO for 3 hours at room temperature. I responded. This reaction is performed with 1M NHTwoThe reaction was stopped by adding 0.1 ml of OH. This mixture The mixture was further stirred at room temperature for 1 hour, and then purified using GPC and PBS as eluents. Conacabalin-CFSE was prepared in a similar manner. However, 4.3mg of conalbumin and 2.2 mg of CFSE was used. Concanavalin A-CFSE complex (0.001 mg / ml in PBS) Liquid) did not give any signal to conalbumin, but conalbumin- CFSE (0.001 mg / ml in PBS) is a very weak peak against Concanavalin A. (See Figure 20).                                 Example 25   Dissolve in a mixture of 20 mM Tris and 150 mM NaCl pH 7.45 without using a column. A sample of 0.05 mg / ml AT3 (Miles) (100 μl) was run at a flow rate of 2 ml / min. It was pumped into a mixture fluid of S and 30% water and led to a hydrostatic mixer. In this mixer, PBS was pumped into the mixer at a flow rate of 2 ml / min. It was mixed with the dissolved 0.0001 mg / ml HPTS fluid. The resulting mixture is used as a fluorescence detector Flowed into As shown in Fig. 21, the detector was blank (20 mM and 150 mM NaC). It showed an increase in the fluorescence intensity due to AT3 over l). This is protein A and protein Fluorescence detection of non-IgG protein using only a fluorescent dye without using an antigen such as G This is just one example.                                 Example 26   5 mg / ml BSA dissolved in 0.2 M NaOAc, pH 5.1, and 0.05 mg / ml HIgG 100 μl was passed into S-HyperD ™ solvent. Here, fill the hole with hydrogel A porous porous oxide / polystyrene composition support (BioSepra, Marlborough, M A and are disclosed in U.S. Pat.No. 5,268,097. . This document is hereby incorporated by reference herein by reference) Has zalfopropyl ion exchange properties. In addition, pH 5.1, 0.2M NaOAc , Using a 1M saline gradient. The elution sample that activates the chromatographic solvent is Monitoring was performed using the same device as device 11. Here, the analysis solution is pH 8.9 0.2M Na2H Contains a mixture of protein A-CFSE and protein G-CFSE dissolved in PO4. Figure 22 As such, the first peak, corresponding to BSA, has no effect on fluorescence monitoring, On the other hand, the second broad UV peak, corresponding to HIgG, produced a sufficient fluorescent peak.                                 Example 27   5 mg / ml BSA and 0.05 mg / ml HIgG dissolved in 0.2 M Tris pH 6 The containing 100 μl sample was passed through Q-HyperD ™ solvent. Here in the hole Hydrogel filled porous oxide / polystyrene composition support (also Bi oSepra, marketed by Marlborough, MA) is a quaternary amine ion exchange Has characteristics. Separated using a pH 5.5, 0.2 M Tris and 1 M NaCl gradient. . The eluted sample that activates the chromatographic solvent is monitored using a device similar to device 11. I watched. Here, the analysis solution contains protein A-FHSE dissolved in pH 8.40.2M Tris. As can be seen from FIG. 23, the first peak (HIgG) has a sufficient fluorescent peak. Rather, the second peak (BSA) did not produce a fluorescent signal. Here, salt gradient solution It should be noted that the fluorescence baseline dropped during the outing.   The foregoing embodiments of the present invention are intended to be illustrative only and Person may make numerous changes and modifications to the invention without departing from the spirit of the invention. Could be added. For example, the UV absorption test section 21 It would be possible to place it after valve 25, according to Such changes or corrections Are all intended to be within the scope of the invention as defined in the appended claims. You.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｎ 33/533 33/533 27/26 ３０１Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｌ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code FI G01N 33/53 G01N 33/53 N 33/533 33/533 27/26 301A (81) Designated country EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (KE, LS, MW, SD, SZ, UG), UA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GE, HU, IL, IS, JP, KE, KG KP, KR, KZ, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI , SK, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, UZ, VN

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １. 溶出サンプルにおいて所期の溶質の存在を検出する方法であって、前記方 法は、次の諸工程を含む、すなわち、 (a) 蛍光剤であって、所期の溶質に結合することが好ましく、かつ、その蛍光 が、溶質に結合している場合は、溶質に結合していない場合とは異なる、そのよ うな蛍光剤を、溶出サンプルに添加する工程、 (b) 溶出サンプルを活性化するが、それによって、蛍光剤を、蛍光剤がその溶 質に結合しているか否かに応じて蛍光を発せしめるように活性化する工程、 (c) 溶出液から発せられる蛍光を検出する工程であって、それによって、蛍光 剤が所期の溶質に結合していることに合致する検出蛍光は、溶出サンプルに所期 の溶質の存在することを示す。 ２. 請求項１に請求される方法であって、ここに、溶出サンプルが、微分移動 分離法によって生成されるものである。 ３. 請求項２に請求される方法であって、ここに、溶出サンプルが、クロマト グラフィーによって生成されるものである。 ４. 請求項２に請求される方法であって、ここに、溶出サンプルが、電気泳動 法によって生成されるものである。 ５. 請求項１に請求される方法であって、ここに、所期の溶質が免疫グロブリ ン類である。 ６. 請求項５に請求される方法であって、ここに、所期の溶質が IgG である。 ７. 請求項１に請求される方法であって、ここに、蛍光剤が、蛍光染料と、所 期の溶質にたいして親和性を持つ半量体との複合体である。 ８. 請求項７に請求される方法であって、ここに、蛍光染料は、フルオレセン ・イソチオシアネート、5-ブロモメチルフルオレセン、5-(と 6-)-ヨードアセタ ミドフルオレセン、5-(4,6-ジクロロトリアジニル)アミノフルオレセン、5-(と 6-)-カルボキシフルオレセン・サクシニミヂル・エステル、および、6-(フルオ レセン-5-(と-6)-カルボキサミド)ヘキサノイン酸・サクシニミヂル・エステル から成るグループから選ばれる。 ９. 請求項８に請求される方法であって、ここに、所期の溶質が、免疫グロブ リン類であって、またここに、蛍光染料が、5-(と 6-)-カルボキシフルオレセン ・サクシニミヂル・エステル、および、6-(フルオレセン-5-(と -6)-カルボキサ ミド)ヘキサノイン酸・サクシニミヂル・エステルから成るグループから選ばれ る。 10. 請求項９に請求される方法であって、ここに、所期の溶質にたいして親和 性を持つ半量体が、蛋白 Ａ、蛋白 Ｇ およびその混合物から成るグループから 選ばれる。 11. 請求項１に請求される方法であって、ここに、所期の溶質が免疫グロブリ ン類であり、またここに、蛍光剤が、蛍光染料−蛋白 Ａ 複合体、蛍光染料−蛋 白 Ｇ 複合体、および、その混合物から成るグループから 選ばれる。 12. 請求項 11 に請求される方法であって、ここに、蛍光剤が、蛍光染料−蛋 白 Ａ 複合体、および、蛍光染料−蛋白 Ｇ 複合体の 1:1 混合物である。 13. 請求項 11 に請求される方法であって、ここに、所期の溶質が IgG である 。 14. 請求項１に請求される方法であって、ここに、所期の溶質がアンチトロン ビン III であり、またここに、蛍光剤が蛍光染料である。 15. 請求項 14 に請求される方法であって、ここに、蛍光剤が、8-ヒドロキシ ピレン-1,3,6-トリスルフォン酸三ナトリウム塩である。 16. 請求項１に請求される方法であって、ここに、所期の溶質がアンチトロン ビン III であって、またここに、蛍光剤が、ヘパリンと 8-ヒドロキシピレン-1 ,3,6-トリスルフォン酸三ナトリウム塩の複合体である。 17. 請求項１に請求される方法であって、ここに、蛍光剤が蛍光染料を含み、 またここに、前記検出工程が、溶出サンプルから発せられる蛍光強度を測定する ことを含む。 18. 請求項１に請求される方法であって、ここに、蛍光剤が、蛍光染料−蛋白 Ａ、蛍光染料−蛋白 Ｇ、および、その混合物から成るグループから選ばれた複 合体と、所期の溶質にたいする親和性と、前記複合体にた いする親和性とをあわせ持つ半量体との間の錯体である。 19. 請求項１に請求される方法であって、ここに、前記添加工程が、溶出サン プルを、ミキサーに通過させ、かつ、蛍光剤を、前記ミキサーを用いて、溶出サ ンプルに添加することを含む。 20. 請求項１に請求される方法であって、ここに、前記活性化工程が、溶出サ ンプルを、適当な波長の放射ビームの中を通過させることを含み、またここに、 前記検出工程が、この活性化された溶出サンプルを、蛍光検出器中を通過させる ことを含む。 21. ある長さの流体内部の所期の溶質の分布を決定する方法であって、前記方 法は、下記の諸工程から成る、すなわち、 (a) 蛍光剤であって、所期の溶質に結合することが好ましく、かつ、その蛍光 が、溶質に結合している場合は、溶質に結合していない場合とは異なる、そのよ うな蛍光剤を、流体の長さ全体に渡って添加する工程、 (b) 溶出サンプルを活性化するが、それによって、蛍光剤を、蛍光剤がその溶 質に結合しているか否かに応じて蛍光を発せしめるように活性化する工程、 (c) 流体の長さから発せられる蛍光を、その流体の長さ内部の位置の関数とし て検出する工程、および (d) 前記検出工程の結果を用いて、流体の長さ内部における所期の溶質の分布 を確かめる工程。 22. 請求項 21 に請求される方法であって、ここに、流体が、微分移動分離法 によって生成される。 23. 請求項 21 に請求される方法であって、ここに、前記活性化工程と検出工 程が、流体の長さのある一部においで実行され、次に、同流体の残余について、 流体の長さの連続部分で繰り返される。 24. 請求項 21 に請求される方法であって、ここに、蛍光剤が、蛍光染料と、 所期の溶質に親和性を持つ半量体との複合体である。 25. 請求項 24 に請求される方法であって、ここに、所期の溶質が免疫グロブ リン類である。 26. 請求項 25 に請求される方法であって、ここに、所期の溶質が IgG である 。 27. 請求項 25 に請求される方法であって、ここに、蛍光剤が、蛍光染料と蛋 白 Ａ の複合体、蛍光染料と蛋白 Ｇ の複合体、および、その混合物から成るグ ループから選ばれる。 28. 請求項 27 に請求される方法であって、ここに、前記添加工程が、さらに 、流体の長さ全体に渡って遊離の蛍光染料を添加することを含む。 29. 請求項 24 に請求される方法であって、ここに、前記染料は、フルオレセ ン・イソチオシアネート、5-ブロモメチルフルオレセン、5-(と 6-)-ヨードアセ タミドフルオレセン、5-(4,6-ジクロロトリアジニル)アミノフルオレセン、5-( と 6-)-カルボキシフルオレセン・サクシニミヂル・エステル、および、6-(フル オレセン-5-(と-6)-カルボキサミド)ヘキサ ノイン酸・サクシニミヂル・エステルから成るグループから選ばれる。 30. ある流体内部において所期の溶質の存在と位置を決定する方法であって、 前記方法は、下記の諸工程から成る、すなわち、 (a) 溶出サンプルを第１の流体と第２の流体に縦分割する工程であって、ここ に、前記第１と第２の流体は、比例的な化学組成を持つ、 (b) 前記第１の流体内部において、蛍光分光光度法を用いて、所期の溶質の存 在と位置を決める工程、 (c) 第１と第２の流体間の時間相関を決定する工程、 (d) 前記の溶質存在・位置決定工程と、前記時間相関決定工程の結果を用いて 、第２の流体内部において所期の溶質の存在と位置を決定する工程。 31. 請求項 30 に請求される方法であって、さらに、所期の溶質を含むと決定 された、第２の流体の一部を収集する工程を含む。 32. 請求項 30 に請求される方法であって、ここに、前記溶質の存在と位置を 決定する工程が、下記の諸工程から成る、すなわち、 蛍光剤であって、所期の溶質に結合することが好ましく、かつ、その蛍光 が、溶質に結合している場合は、溶質に結合していない場合とは異なる、そのよ うな蛍光剤を、第１の流体に添加する工程、 第１流体を活性化するが、それによって、蛍光剤を、蛍光剤がその溶質に 結合しているか否かに応じて蛍光を発せしめるように活性化する工程、 第１流体から発せられる蛍光を検出する工程であって、それによって、蛍 光剤が所期の溶質に結合していることに合致する、第１流体内部の位置から発せ られる検出蛍光は、溶出サンプルに所期の溶質の存在するこ とを示す。 33. 請求項 30 に請求される方法であって、ここに、溶出サンプルが、微分移 動分離法によって生成される。 34. 請求項 32 に請求される方法であって、ここに、前記添加工程が、混合位 置において、第１の流体中に蛍光剤を混合することを含み、ここに、前記活性化 工程が、その蛍光剤を含む第１の流体を、適当な興奮性波長の放射ビームの中を 通過させることを含み、またここに、前記検出工程が、第１の流体の活性化部分 から発せられる蛍光を検出することを含む。 35. 請求項 32 に請求される方法であって、ここに、蛍光剤が、蛍光染料と、 所期の溶質に親和性を持つ半量体との複合体である。 36. 請求項 35 に請求される方法であって、ここに、所期の溶質が免疫グロブ リン類である。 37. 請求項 36 に請求される方法であって、ここに、所期の溶質が IgG である 。 38. 請求項 36 に請求される方法であって、ここに、蛍光剤が、蛍光染料と蛋 白 Ａ の複合体、蛍光染料と蛋白 Ｇ 複合体、および、その混合物から成るグル ープから選ばれる。 39. 請求項 38 に請求される方法であって、ここに、前記添加工程がさらに遊 離蛍光染料を第１の流体に添加することを含む。 40. 請求項 39 に請求される方法であって、ここに、前記蛍光染料は、フルオ レセン・イソチオシアネート、5-ブロモメチルフルオレセン、5-(と 6-)-ヨード アセタミドフルオレセン、5-(4,6-ジクロロトリアジニル)アミノフルオレセン、 5-(と 6-)-カルボキシフルオレセン・サクシニミヂル・エステル、および、6-( フルオレセン-5-(と-6)-カルボキサミド)ヘキサノイン酸・サクシニミヂル・エ ステルから成るグループから選ばれる。 41. ある流体において所期の溶質の分布を決定する方法であって、前記方法は 、下記の諸工程から成る、すなわち、 (a) 溶出サンプルを第１の流体と第２の流体に縦分割する工程であって、ここ に、前記第１と第２の流体は、比例的化学組成を持つ、 (b) 蛍光分光光度法を用いて、第１の流体内部における所期の溶質の分布を決 める工程、 (c) 第１と第２の流体間の時間相関を決定する工程、 (d) 前記の分布決定工程と、前記時間相関決定工程の結果を用いて、第２の流 体における所期の溶質の分布を決定する工程。 42. 請求項 41 に請求される方法であって、さらに、所期の溶質を含むと決定 された、第２の流体の一部を収集する工程を含む。 43. 請求項 41 に請求される方法であって、ここに、前記分布決定工程が、下 記の諸工程から成る、すなわち、 蛍光剤であって、所期の溶質に結合することが好ましく、かつ、その蛍光が、 溶質に結合している場合は、溶質に結合していない場合とは異なる、 そのような蛍光剤を、第１の流体に添加する工程、 第１流体を活性化するが、それによって、蛍光剤を、蛍光剤がその溶質に結合 しているか否かに応じて蛍光を発せしめるように活性化する工程、 第１流体から発せられる蛍光を、第１の流体の位置の関数として検出する工程 。 44. 請求項 41 に請求される方法であって、ここに、溶出サンプルが、微分移 動分離法によって生成される。 45. 請求項 43 に請求される方法であって、ここに、前記添加工程が、混合位 置において、第１の流体中に蛍光剤を混合することを含み、ここに、前記活性化 工程が、その蛍光剤を含む第１の流体を、適当な興奮性波長の放射ビームの中を 通過させることを含み、またここに、前記検出工程が、第１の流体の照射部分か ら発せられる蛍光を検出することを含む。 46. 請求項 43 に請求される方法であって、ここに、蛍光剤が、蛍光染料と、 所期の溶質に親和性を持つ半量体との複合体である。 47. 請求項 41 に請求される方法であって、ここに、所期の溶質が免疫グロブ リン類である。 48. 請求項 47 に請求される方法であって、ここに、所期の溶質が IgG である 。 49. 請求項 48 に請求される方法であって、ここに、蛍光剤が、蛍光染料と蛋 白 Ａ の複合体、蛍光染料と蛋白 Ｇ 複合体、および、その混合物 から成るグループから選ばれる。 50. 請求項 46 に請求される方法であって、ここに、前記添加工程がさらに遊 離蛍光染料を第１の流体に添加することを含む。 51. ある流体内部において所期の溶質の濃度を決定する方法であって、前記方 法は、下記の諸工程から成る、すなわち、 (a) 溶出サンプルを第１の流体と第２の流体に縦分割する工程であって、ここ に、前記第１と第２の流体は、比例的な化学組成を持つ、 (b) 蛍光分光光度法を用いて、第１の流体内部における所期の溶質の濃度を決 定する工程、 (c) 第１と第２の流体間の時間相関を決定する工程、 (c) 第１と第２の流体間の容量相関を決定する工程、 (d) 前記の濃度決定工程、前記時間相関決定工程、および、前記容量相関決定 工程の結果を用いて、第２の流体の対応位置における所期の溶質の濃度を決定す る工程。 52. 所期の溶質の有無について、流体を監視する装置であって、前記装置は下 記の手段から成る、すなわち、 (a) 溶出サンプルを、第１の流体と第２の流体に縦分割する手段であって、こ こに、前記第１と第２の流体は、比例的な化学組成を持つ、 (b) 蛍光剤であって、所期の溶質に結合することが好ましく、かつ、その蛍光 が、溶質に結合している場合は、溶質に結合していない場合とは異なる、そのよ うな蛍光剤、 (c) 蛍光剤を、第１の流体に混合する手段、 (c) 蛍光剤の蛍光に基づき、第１の流体において、所期の溶質の有無を監 視する手段、および、 (d) 第１と第２の流体の時間相関を取る手段であって、それによって、第１の 流体について得られた結果を、第２の流体に適用する。 53. 請求項 52 に請求される方法であって、ここに、蛍光剤が、蛍光染料と、 所期の溶質に親和性を持つ半量体との複合体である。 54. 溶質の混合物から所期の溶質を精製する方法であって、前記方法は下記の 諸工程から成る、すなわち、 (a) 溶質混合物を、適当な微分移動分離法にかける工程であって、これによっ て、所期の溶質が、残余の溶質からある程度分離された溶出サンプルを得る、 (b) 溶出サンプルを、第１の流体と第２の流体に縦分割する手段であって、こ こに、前記第１と第２の流体は、比例的な化学組成を持つ、 (c) 蛍光分光光度法を用いて、第１の流体内部における、所期の溶質の濃度ピ ークの位置を決める工程、 (d) 第１と第２の流体間の時間相関を決定する工程、 (e) 前記濃度ピーク決定工程と時間相関決定工程を用いて、第２流体内部にお いて、所期の溶質の、対応する濃度ピークの位置を決定する工程、および、 (f) 所期の溶質の濃度ピークに対応する、第２の流体部分を収集する工程。[Claims] 1. A method for detecting the presence of a desired solute in an eluted sample, the method comprising: The law involves the following steps: (a) a fluorescent agent, which preferably binds to the desired solute and However, if it is bound to the solute, it is different than if it is not bound to the solute. Adding such a fluorescent agent to the eluted sample, (b) Activate the eluted sample, thereby causing the fluorescer to dissolve Activating to fluoresce depending on whether it is bound to a substance, (c) detecting the fluorescence emitted from the eluate, whereby the fluorescence Detected fluorescence consistent with the binding of the agent to the desired solute Is present. 2. The method of claim 1, wherein the eluted sample is differentially shifted. It is produced by a separation method. 3. The method as claimed in claim 2, wherein the eluted sample is chromatographed. It is generated by photography. 4. The method as claimed in claim 2, wherein the eluted sample is electrophoresed. It is generated by the law. 5. The method as claimed in claim 1, wherein the desired solute is an immunoglobulin. It is a kind. 6. The method as claimed in claim 5, wherein the desired solute is IgG. 7. The method of claim 1, wherein the fluorescent agent comprises a fluorescent dye, Complex with a half-mer that has an affinity for the solute of interest. 8. The method as claimed in claim 7, wherein the fluorescent dye is fluorescein. ・ Isothiocyanate, 5-bromomethylfluorescein, 5- (and 6-)-iodoaceta Midfluorescein, 5- (4,6-dichlorotriazinyl) aminofluorescein, 5- (and 6-)-Carboxyfluorescein succinimidyl ester and 6- (fluoro Recene-5- (and-6) -carboxamide) hexanoic acid ・ succinimidyl ester Selected from the group consisting of 9. The method as claimed in claim 8, wherein the desired solute is an immunoglobulin. Phosphorus, wherein the fluorescent dye is 5- (and 6-)-carboxyfluorescein ・ Succinimidyl ester and 6- (fluorescein-5- (and -6) -carboxa (Mido) selected from the group consisting of hexanoic acid, succinimidyl ester You. 10. A method as claimed in claim 9 wherein the affinity for the desired solute is Half-mers from the group consisting of protein A, protein G and mixtures thereof To be elected. 11. The method of claim 1, wherein the desired solute is an immunoglobulin. Wherein the fluorescent agent is a fluorescent dye-protein A complex, a fluorescent dye-protein From the group consisting of the white G complex and its mixtures To be elected. 12. The method of claim 11, wherein the fluorescent agent is a fluorescent dye-protein. It is a 1: 1 mixture of the white A complex and the fluorescent dye-protein G complex. 13. The method of claim 11, wherein the desired solute is IgG. . 14. A method as claimed in claim 1 wherein the desired solute is antitron Bin III, wherein the fluorescent agent is a fluorescent dye. 15. The method as claimed in claim 14, wherein the fluorescent agent is 8-hydroxy. Pyrene-1,3,6-trisulfonic acid trisodium salt. 16. The method as claimed in claim 1, wherein the desired solute is antitron. Bottle III, wherein the fluorescent agent is heparin and 8-hydroxypyrene-1 , 3,6-Trisulfonic acid trisodium salt complex. 17. The method of claim 1, wherein the fluorescent agent comprises a fluorescent dye, Here, the detection step measures the intensity of fluorescence emitted from the eluted sample. Including. 18. The method of claim 1, wherein the fluorescent agent is a fluorescent dye-protein. A, a fluorescent dye-protein G, and a mixture selected from the group consisting of mixtures thereof. Coalescence, affinity for the desired solute, and It is a complex between a half-mer and an affinity. 19. The method according to claim 1, wherein said adding step comprises: The pull is passed through a mixer, and the fluorescent agent is eluted using the mixer. To the sample. 20. The method of claim 1, wherein said activating step comprises the step of eluting Passing the sample through a beam of radiation of the appropriate wavelength, and The detecting step passes the activated eluted sample through a fluorescence detector Including. 21. A method for determining an intended solute distribution within a length of fluid, the method comprising: The law consists of the following steps: (a) a fluorescent agent, which preferably binds to the desired solute and However, if it is bound to the solute, it is different than if it is not bound to the solute. Adding such a fluorescent agent over the entire length of the fluid, (b) Activate the eluted sample, thereby causing the fluorescer to dissolve Activating to fluoresce depending on whether it is bound to a substance, (c) Fluorescence emitted from the length of the fluid as a function of position inside the length of the fluid. And detecting, and (d) using the results of the detection step, the desired solute distribution within the length of the fluid The process of confirming. 22. A method as claimed in claim 21 wherein the fluid is a differential transfer separation method. Generated by 23. The method as claimed in claim 21, wherein the activation step and the detection step are performed. Is performed on some portion of the length of the fluid, and then for the remainder of the fluid, Repeated in successive parts of the length of the fluid. 24. The method as claimed in claim 21, wherein the fluorescent agent comprises a fluorescent dye, It is a complex with a halfmer that has an affinity for the desired solute. 25. The method as claimed in claim 24, wherein the desired solute is an immunoglobulin. Phosphorus. 26. The method as claimed in claim 25, wherein the desired solute is IgG. . 27. The method as claimed in claim 25, wherein the fluorescent agent comprises a fluorescent dye and a protein. A complex consisting of a complex of white A, a complex of a fluorescent dye and protein G, and a mixture thereof. Selected from the loop. 28. The method as claimed in claim 27, wherein the adding step further comprises: , Adding free fluorescent dye throughout the length of the fluid. 29. The method as claimed in claim 24, wherein the dye is fluorescein. Isothiocyanate, 5-bromomethylfluorescein, 5- (and 6-)-iodoacetate Tamidofluorescein, 5- (4,6-dichlorotriazinyl) aminofluorescein, 5- ( And 6-)-carboxyfluorescein succinimidyl ester and 6- ( Olesen-5- (and-6) -carboxamide) hexa It is selected from the group consisting of noic acid, succinimidyl ester. 30. A method for determining the presence and location of a desired solute within a fluid, The method comprises the following steps: (a) vertically dividing an eluted sample into a first fluid and a second fluid, Wherein said first and second fluids have a proportional chemical composition; (b) the presence of the desired solute within the first fluid using fluorescence spectrophotometry; The process of determining location and position, (c) determining a time correlation between the first and second fluids; (d) using the result of the solute presence / position determination step and the time correlation determination step Determining the presence and location of the desired solute within the second fluid. 31. The method claimed in claim 30, further comprising a desired solute Collecting a portion of the done second fluid. 32. The method as claimed in claim 30, wherein the presence and location of the solute are determined. The step of determining consists of the following steps:      A fluorescent agent which preferably binds to the desired solute and However, if it is bound to the solute, it is different than if it is not bound to the solute. Adding such a fluorescent agent to the first fluid,      Activates the first fluid, thereby causing the fluorescer to bind to its solute Activating to emit fluorescence depending on whether it is bound or not,      Detecting fluorescent light emitted from the first fluid, thereby detecting the fluorescent light. Emitting from a location within the first fluid, consistent with the binding of the photoagent to the desired solute Detection fluorescence indicates that the expected solute is present in the eluted sample. And 33. The method of claim 30, wherein the eluted sample is differentially transferred. Generated by the dynamic separation method. 34. The method as claimed in claim 32, wherein the adding step comprises mixing Mixing the fluorescent agent in the first fluid, wherein the activation is performed. A step includes passing the first fluid containing the fluorescent agent into a beam of radiation of an appropriate excitatory wavelength. And wherein the detecting step comprises the step of activating the first fluid. Detecting the fluorescent light emitted from the. 35. The method as claimed in claim 32, wherein the fluorescent agent comprises a fluorescent dye, It is a complex with a halfmer that has an affinity for the desired solute. 36. The method as claimed in claim 35, wherein the desired solute is an immunoglobulin. Phosphorus. 37. The method as claimed in claim 36, wherein the desired solute is IgG. . 38. The method as claimed in claim 36, wherein the fluorescent agent comprises a fluorescent dye and a protein. A glue consisting of a complex of white A, a fluorescent dye and a protein G complex, and a mixture thereof Selected from the group. 39. The method as claimed in claim 38, wherein the adding step further comprises Adding a fluorescent dye to the first fluid. 40. The method as claimed in claim 39, wherein the fluorescent dye is a fluorochrome. Resene isothiocyanate, 5-bromomethylfluorescein, 5- (and 6-)-iodo Acetamide fluorescein, 5- (4,6-dichlorotriazinyl) aminofluorescein, 5- (and 6-)-carboxyfluorescein succinimidyl ester and 6- ( Fluorescein-5- (and-6) -carboxamide) hexanoic acid / succinimidyl / d Selected from the group consisting of steles. 41. A method for determining a desired solute distribution in a fluid, the method comprising: , Consisting of the following steps: (a) vertically dividing an eluted sample into a first fluid and a second fluid, Wherein said first and second fluids have a proportional chemical composition; (b) Determine the expected solute distribution inside the first fluid using fluorescence spectroscopy. Process (c) determining a time correlation between the first and second fluids; (d) using the results of the distribution determining step and the time correlation determining step, Determining the desired distribution of solutes in the body. 42. The method claimed in claim 41, further comprising determining a desired solute. Collecting a portion of the done second fluid. 43. The method as claimed in claim 41, wherein the step of determining a distribution comprises: Consisting of the following steps:   A fluorescent agent, which preferably binds to the desired solute, and whose fluorescence is If bound to solute, it is different from not bound to solute,   Adding such a fluorescent agent to the first fluid;   Activates the first fluid, thereby binding the fluorescent agent to the solute Activating to emit fluorescence depending on whether or not   Detecting the fluorescence emitted from the first fluid as a function of the position of the first fluid . 44. The method of claim 41, wherein the eluted sample is differentially transferred. Generated by the dynamic separation method. 45. The method as claimed in claim 43, wherein the adding step comprises mixing Mixing the fluorescent agent in the first fluid, wherein the activation is performed. A step includes passing the first fluid containing the fluorescent agent into a beam of radiation of an appropriate excitatory wavelength. And wherein the detecting is performed on an illuminated portion of the first fluid. Detecting the emitted fluorescence. 46. The method as claimed in claim 43, wherein the fluorescent agent comprises a fluorescent dye, It is a complex with a halfmer that has an affinity for the desired solute. 47. The method of claim 41, wherein the desired solute is an immunoglobulin. Phosphorus. 48. The method as claimed in claim 47, wherein the desired solute is IgG. . 49. The method as claimed in claim 48, wherein the fluorescent agent comprises a fluorescent dye and a protein. Complex of white A, fluorescent dye and protein G complex, and mixture thereof Selected from the group consisting of 50. The method as claimed in claim 46, wherein the adding step further comprises Adding a fluorescent dye to the first fluid. 51. A method for determining a desired solute concentration within a fluid, comprising: The law consists of the following steps: (a) vertically dividing an eluted sample into a first fluid and a second fluid, Wherein said first and second fluids have a proportional chemical composition; (b) Using fluorescence spectrophotometry to determine the desired solute concentration inside the first fluid. The process of determining (c) determining a time correlation between the first and second fluids; (c) determining a volume correlation between the first and second fluids; (d) the concentration determination step, the time correlation determination step, and the capacity correlation determination The results of the process are used to determine a desired solute concentration at a corresponding location of the second fluid. Process. 52. A device for monitoring a fluid for the presence or absence of an intended solute, said device comprising: Said means, ie (a) means for vertically dividing an eluted sample into a first fluid and a second fluid, Wherein the first and second fluids have a proportional chemical composition, (b) a fluorescent agent, which preferably binds to the desired solute, and However, if it is bound to the solute, it is different than if it is not bound to the solute. Una fluorescent agent, (c) means for mixing the fluorescent agent with the first fluid; (c) Monitor the presence or absence of the expected solute in the first fluid based on the fluorescence of the fluorescent agent. Means for viewing, and (d) means for time correlating the first and second fluids, whereby the first The result obtained for the fluid is applied to a second fluid. 53. The method as claimed in claim 52, wherein the fluorescent agent comprises a fluorescent dye, It is a complex with a halfmer that has an affinity for the desired solute. 54. A method for purifying a desired solute from a mixture of solutes, the method comprising: Consisting of several steps, (a) subjecting the solute mixture to a suitable differential transfer separation method, To obtain an eluted sample in which the desired solute is separated to some extent from the remaining solute, (b) means for vertically dividing the eluted sample into a first fluid and a second fluid, Wherein the first and second fluids have a proportional chemical composition, (c) Using fluorescence spectrophotometry, the concentration of the desired solute concentration inside the first fluid. The process of determining the position of the (d) determining a time correlation between the first and second fluids; (e) using the concentration peak determination step and the time correlation determination step, Determining the location of the corresponding concentration peak of the desired solute; and (f) collecting a second fluid portion corresponding to a desired solute concentration peak;
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