JPH11507834A - Immortalized epithelial tumor cells - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】 本発明は、転移能を有する上皮腫瘍細胞であって、そのゲノムまたはその他の複製関連遺伝要素内に、該腫瘍細胞で発現する少なくとも１つの外部導入不死化誘導性癌遺伝子および任意に免疫刺激因子をコードする少なくとも１つの遺伝子を組み込んだ上皮腫瘍細胞に関する。本発明はさらに、本発明の上皮腫瘍細胞を特異的に認識する抗体、該腫瘍細胞の製造方法ならびにそれぞれ該腫瘍細胞および抗体からなる医薬組成物および診断用組成物に関する。最後に、本発明は、癌および／または癌の転移の予防および／または治療用腫瘍ワクチンおよび薬品の調製のための本発明の上皮腫瘍細胞および／または抗体の使用に関する。 (57) [Summary] The present invention relates to an epithelial tumor cell capable of metastasis, comprising in its genome or other replication-related genetic element at least one exogenously introduced immortalization-inducing oncogene and optionally an immunostimulatory factor expressed in said tumor cell. Epithelial tumor cells incorporating at least one gene encoding The present invention further relates to an antibody that specifically recognizes the epithelial tumor cell of the present invention, a method for producing the tumor cell, and a pharmaceutical composition and a diagnostic composition comprising the tumor cell and the antibody, respectively. Finally, the invention relates to the use of the epithelial tumor cells and / or antibodies of the invention for the preparation of tumor vaccines and medicaments for the prevention and / or treatment of cancer and / or metastasis of cancer.
Description
【発明の詳細な説明】 不死化上皮腫瘍細胞 本発明は、転移能を有する上皮腫瘍細胞であって、そのゲノムまたはその他の 複製関連遺伝要素内に少なくとも１つの外部導入不死化誘導性癌遺伝子を組み込 んでおり、該腫瘍細胞内で発現される免疫刺激因子をコードする少なくとも１つ の遺伝子を組み込んでいてもよい上皮腫瘍細胞に関する。本発明はさらに、本発 明の上皮腫瘍細胞を特異的に認識する抗体、該腫瘍細胞の製造方法、ならびにそ れぞれ該腫瘍細胞および抗体からなる医薬組成物および診断用組成物に関する。 最後に、本発明は、癌および／または癌の転移の予防および／または治療用腫瘍 ワクチンおよび医薬の調製のための本発明の上皮腫瘍細胞および／または抗体の 使用に関する。 上皮組織の悪性腫瘍は、ドイツなどの西欧先進工業国における全新規癌症例お よび癌死亡例の大多数を占めている。近年、癌の早期診断の進歩により、手術可 能な原発腫瘍を有する患者の比率が上昇し続けている。その結果、腫瘍細胞の散 在が顕在化していない時期の癌の早期原発診断によって癌死亡率が決定されるこ とが多くなっている［早期乳癌治験担当者共同グループ（Early breast cancer trialists' collaborative group）、The Lancet 339:1，1992；フロストとレビ ン（Frost and Levin ）、The Lancet 339:1458，1992 ］。これまで、高分解能 画像診断法や従来の病理組織学的検査のいずれによっても組織中の単独の散在性 腫瘍細胞の存在が証明できていないため［シュリモクら（Schlimok et al．）、 Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:8672．1987］、患者の治療法決定に際して考慮 される予後因子は、予後の統計的指標だけで決まる。転移性再発の二次的予防の ための原発腫瘍の外科的切除後に適用される全身アジュバント療法は、重篤な毒 性副作用を伴うことが多い［ヒルナーとスミス（Hillner and Smith ）、New En gl．J．Med．324:160，1991 ；早期乳癌治験担当者共同グループ（Early breast cancer trialists' collaborative group）、前掲］。 したがって、腫瘍発現の段階で転移の核となる傾向がある上皮腫瘍細胞をでき るだけ早期に同定することが当該分野において求められている。また、原発腫瘍 からの散在および二次的組織への浸潤後の上記腫瘍細胞の同定に適した実験系を 提供することができれば非常に有利である。そうなれば、該腫瘍細胞の同定を利 用して、該細胞の検出手段ならびに転移の予防または治療に使用することができ る医薬組成物を開発することが可能になる。 これまで、所望の方法および腫瘍細胞の開発は、それぞれ様々な要素によって 好結果を得ることができていない。該要素の１つとして、転移能を有する上皮腫 瘍細胞を特異的に認識する好適な抗体の開発がある。転移形成前では、これらの 腫瘍細胞は骨髄などの浸潤組織内の存在比率が非常に低く、１０-5ないし１０-6 の範囲にとどまるという問題もある。これらの細胞は浸潤組織内では分裂しない で休止状態にあるため、細胞増殖に依存する従来の腫瘍療法はこれらの細胞を除 去できない。さらに、原発腫瘍細胞と比べて表面マーカーの発現が異なるため、 抗体を利用する診断法や療法から一般に転移能を有する上皮腫瘍細胞をすり抜け させてしまう。 近年、主に微小転移性腫瘍細胞凝集体の存在を証明する上で有用であることが 判明している従来の病理組織学的方法が進歩した［ブルクハルトら（Burkhardt et al.）、Bull．Cancer 67:2，1980 ；グルノウとグロエトヒェン（Grunow and Groetchen）、Pathologe 12:210，1991］。しかしながら、これらの方法は転移 能を有する単独の上皮腫瘍細胞を検出することができていない。 転移能を有する上皮腫瘍細胞の検出のためのもう１つのアプローチとして、分 子生物学的手法の利用がある。すなわち、ＰＣＲ増幅とその後の増幅産物の制限 酵素消化を組み合わせたカーンら［（Kahn et al．）、Oncogene 6:1079，1991 ］が開発した系を用いて、微小転移性細胞のＫｉ−ｒａｓ癌遺伝子のコドン１２ の突然変異を検出することができる。しかしながら、このようなプロセスは比較 的時間がかかる上に、さらなる研究、または診断用組成物もしくは医薬組成物の 調製または抗体の作製に有用な細胞培養法の開発のための生細胞材料を提供しな い。 上記のように概要を示した問題のもう１つの解決策としては、所望細胞を形質 転換させて連続増殖細胞株を作製することが考えられるが、レトロウイルス遺伝 子移入などの方法は、原発腫瘍内ならびに浸潤組織内のこれらの細胞の数が少な いために、理論的価値しか持たない。ＥＰ−Ｂ１０ ２５６ ５１２号明細書記 載の方法は、この問題に適用した場合、培養細胞の非特異的形質転換が起きるこ と、すなわち実際のターゲット細胞のみならず多数のその他の細胞も同様に不死 化されてしまうという欠点がある。さらに、由来が明確でない形質転換ＤＮＡを 使用すると、医薬品目的の不死化細胞の使用が制限される。 最後に、ＤＥ−ＰＳ ４４ ２２ ５７０号明細書は、複製欠損ＳＶ４０ウイ ルスによる間質細胞の形質転換方法を開示している。ＳＶ４０の形質転換原理を 成すラージＴ抗原は腫瘍抑制遺伝子ｐ５３に対して相互作用（および不活化また は阻害作用）を示し、この遺伝子がＧ０からＧ１の細胞サイクル相への移行をコ ントロールすることが知られているので、該方法の結果は予想されたものであっ たかもしれないが、当該分野に熟練せる者であっても、腫瘍細胞の場合の対応結 果は予想されなかった［レビンら（Levine et al．）、Brit．J．Cancer，69:40 9，1994 ；スッシら（Sussi et al.）、In．J．Cancer，57:1，1994 ］。これは 、ｐ５３タンパク質は上皮腫瘍細胞中に欠損している、すなわち含まれていない ことが多いことが知られているためであり［ハリスとホルステイン（Harris and Hollstein）、N．Engl．J．Med．329:1318，1993 ］、これらの細胞は正常付着 細胞よりも培養時の増殖が悪い。したがって、あらゆる合理的説明に従えば、Ｓ Ｖ４０ラージＴ抗原の相互作用は不死化腫瘍細胞の増殖応答を招かないであろう 。 前述の問題に鑑み、本発明が解決すべき技術的課題は、診断上および治療上の 価値を有する化合物または組成物の研究および開発に使用することができる転移 能を有する上皮腫瘍細胞を提供することであった。 該技術的課題は、請求の範囲において特徴を示した態様を提供することによっ て解決される。 すなわち、本発明は、転移能を有する上皮腫瘍細胞であって、そのゲノムまた はその他の複製関連要素内に、該細胞で発現する外部導入不死化誘導性癌遺伝子 を組み込んだ上皮腫瘍細胞に関する。 本発明の腫瘍細胞は、最も早期の転移性細胞に由来する細胞であって、患者体 内に存在する残留腫瘍細胞の表現型を明確に保存している細胞を大量に作製する 目的に使用することができる。そのような細胞が入手できれば、癌の微小転移の 詳細な分子的解析への新規な道が開かれ、たとえば自己腫瘍細胞ワクチンの新規 ソースなどとして有用性を示す可能性がある。このソースの大きな利点は、腫瘍 負荷が最低であって免疫系がまだインタクトの状態にある最小残留癌の重要な段 階において適用可能であるということである。 「転移能」という用語は、該上皮腫瘍細胞が転移形成の核となりうる能力をい う。腫瘍細胞の形成は複雑かつ多段階のプロセスであることが知られている。第 １段階は、原発腫瘍内で細胞変異体が生成し、続いてこれらの変異体が腫瘍細胞 群体から脱離し、間質組織への浸潤と貫入を経て、リンパ系または血管系に入る というものである［ハートとサイミ（Hart and Saimi）、The Lancet 339:1453 ，1992 ］。この分野における初期の研究から知られているように、細胞クロー ンはすでに腫瘍の早期増殖相で出現しており、転移挙動が有意差を示す。その後 の腫瘍進行の段階で新規変異体の生成が見られ得る。分子解析で、細胞表面マー カー発現の変化も腫瘍細胞の転移能と相関していることが認められている。その ようなマーカーの例としては、ＩＣＡＭ−１およびある種のＣＤ４４変異体が挙 げられる［たとえばマイアーら（Mayer et al.）、The Lancet 342:1019，1993 ］。さらに、Ｅ−カドヘリンやプラコグロビンなどのデスモソーム接着分子の発 現 のダウンレギュレーションが、細胞群体由来の転移能を有する腫瘍細胞の脱離に 関与していることも判明している［たとえばビルヒメイヤーら（Birchmeier et al．）、in "Contrib．Oncol."，ラベスら（Rabes et al.）編、Karcher，Basel 1992，95 ］。続いて、運動性因子（たとえば散乱因子、形質転換成長因子）の 発現およびプロテアーゼ（カテプシンＤ）メタロプロテイナーゼ、プラスミノー ゲン活性化因子）の分泌が、原発器官の基底膜および周囲の間質を通過する脱離 腫瘍細胞の浸潤を促進する［詳細は、ビルヒメイヤーとビルヒメイヤー（Birchm eier and Birchmeier ）、Annu．Rev．Cell Bioil．9:511，1993を参照］。二次 器官内の散在した腫瘍細胞の生存は、それら自体または周囲の間質細胞によって 産生される成長因子に応答して免疫監視をすり抜けて増殖し、血管形成を誘導す る能力によって影響を受ける。 前述のプロセスはいずれも、本発明の上皮腫瘍細胞の転移能に寄与するもので あり、したがって本用語に包含される。 「不死化誘導性癌遺伝子」という用語は、本発明の上皮腫瘍細胞が連続的に細 胞培養状態に維持されうるような該腫瘍細胞を不死化させる能力を有する癌遺伝 子に関する。したがって、「不死化誘導性」という用語は、正常細胞から分裂性 または非分裂性腫瘍細胞への移行を促進する形質転換原理の能力を意味する「形 質転換性」という用語とは、本発明の内容に関するかぎり、異なるものである。 形質転換された細胞は、接着性に依存する増殖の喪失または低下、接触阻害の喪 失、および血清または成長因子からの独立を特徴とするものである。 該不死化誘導性癌遺伝子は、染色体や該上皮腫瘍細胞内の安定ミニ染色体など その他の複製関与遺伝要素に組み込まれると発現される。ＥＢＶやパピローマウ イルスの場合、ウイルスＤＮＡがエピソームとして細胞内に認められる。該癌遺 伝子は通常、不死化細胞の発現機構を利用するのに対して、該癌遺伝子の発現を 引き起こす調節配列は細胞内由来のものと細胞外由来のもののどちらでもよい。 本発明の好ましい態様においては、該上皮腫瘍細胞は散在性腫瘍細胞である。 「散在性腫瘍細胞」という用語は、腫瘍細胞がすでに細胞群体から脱離してい ることをいう。このものは、たとえば血流内またはリンパ系内に存在するもので あってもよいし、骨髄などその移動の終点となる組織内にとどまっていてもよい 。 さらに好ましい態様においては、本発明の腫瘍細胞は自己腫瘍細胞である。 本発明の内容においては、「自己」という用語は、腫瘍細胞が、通常は遺伝子 操作またはその他の操作後に、たとえば治療目的のために再導入される先と同一 の生物に由来することを意味する。あるいは、該用語は、本発明の上皮腫瘍細胞 が、同一生物に由来する細胞とともに細胞培養状態で維持または試験される場合 をいう。 さらに好ましい態様においては、本発明の上皮腫瘍細胞はヒト腫瘍細胞である 。 本発明のさらに好ましい態様においては、該転移能を有する上皮腫瘍細胞は骨 髄に由来するものである。 本明細書で使用する場合、「骨髄に由来する」という用語は、腫瘍細胞がすで に骨髄に浸潤し、その中で検出されるか、それから単離される可能性があること を意味する。該用語は、該腫瘍細胞が形質転換前に正常骨髄細胞であったことを 意味するのではないものとする。 転移能を有する上皮腫瘍細胞のソースとして骨髄を使用することが好ましいが 、これは骨髄コンパートメントが比較的入手しやすいことに基づくものである。 さらに、いくつかの上皮腫瘍が骨格系に選択的に侵入する［ゼッター（Zetter） 、New Engl．J．Med．332:605，1990 ］。これは、転移発現に到るカスケードの 最後の３つの段階、すなわちいわゆる休止、血管外遊出、および被侵入組織内へ の増殖は、組織特異的因子に強く依存し、明らかに骨髄中で促進されるという知 見によって説明することができる。 本発明のさらに好ましい態様は、不死化誘導性癌遺伝子がＳＶ４０ＤＮＡの初 期領域をコードするＤＮＡ、好ましくは、複製欠損ＳＶ４０ウイルスのラージＴ 抗原をコードするＤＮＡである上記特徴を有する上皮腫瘍細胞に関する。 「ＳＶ４０ＤＮＡの初期領域をコードするＤＮＡ」という用語は、ラージＴ抗 原、スモールｔ抗原および／または１７Ｋ Ｔ抗原、またはそれらの切断型をコ ードする実際の核酸配列に関わらず、あらゆるＤＮＡ分子を意味するものとし、 該Ｔ（ｔ）抗原またはそれらの切断型は宿主細胞を不死化させる能力を有するも のとする。原則的に、ラージＴ抗原、スモールｔ抗原、および／または１７Ｋ Ｔ抗原をコードするＤＮＡは、完全または部分ＳＶ４０ゲノムの一部として腫瘍 細胞に導入される。正しい発現には、ＳＶ４０配列の５’末端にＳＶ４０エンハ ンサーが存在し、３’末端（ｂｐ２６０３）にポリＡシグナル（ＡＡＴＡＡＡ） が存在する必要がある。 「複製欠損ＳＶ４０ウイルス］という用語は、ＳＶ４０ＤＮＡの複製開始部位 が複製される能力すなわち巻きほどかれる能力を有さないという事実に関する。 この複製欠損は、複製開始部位の突然変異によって引き起こすことができる。あ るいは、ＳＶ４０初期コード領域の突然変異が複製欠陥を引き起こしうる。 本発明によれば、複製欠陥は、ＳＶ４０ゲノムのいわゆる「複製開始部位」（ ＯＲＩ）における１つまたは複数個の点変異、１つまたは複数個の欠失、１つま たは複数個の挿入などの１つまたは複数個の欠陥によって引き起こされることが 最も好ましい。 本発明のもう１つの最も好ましい態様においては、該複製欠陥は、抗原コード 領域における１つ以上の突然変異、挿入、欠失などによって引き起こされる。（ 欠陥）複製開始部位からなるものであってもよいし、そうでないものであっても よい本態様においては、たとえばラージＴコード領域における欠陥は、たとえば ＤＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼ活性またはその他のＳＶ４０ラージＴ抗原にお ける複製に必要な性質の欠陥ゆえに、宿主細胞の不死化は起きるが、ウイルスＤ ＮＡ複製は起きない作用を示す。 本発明の実施には不要であるが系全体の安全性には寄与するＳＶ４０ＤＮＡに おける複製欠陥は、最終的にウイルスＤＮＡの無秩序な複製につながり、結果的 に宿主腫瘍細胞を不死化させるのではなく破壊してしまう可能性があるウイルス ゲノムの複製を防止する目的にかなうものである。 本発明の上皮腫瘍細胞のさらに別の最も好ましい態様においては、該ＳＶ４０ ウイルスは非感染性のものである。 この最も好ましい態様は、本発明の腫瘍細胞からなる医薬組成物または腫瘍ワ クチンの開発にとくに好適である。この態様は、ＳＶ４０ウイルスが非感染性で あることが所望または想定されるあらゆる科学的または医学的目的にとくに好適 である。 ＳＶ４０ウイルスの非感染性を実現するために、ＶＰ１およびＶＰ２をコード するＤＮＡ内の５４６ｂｐ断片の欠失によるなどして、ウイルスのコアタンパク 質を不活化させてもよいが、これについては実施例でさらに詳細に説明する。 本発明のさらに好ましい態様においては、少なくとも１つの別の癌遺伝子を上 皮腫瘍細胞のゲノムに取り込ませる。 前記別の癌遺伝子は、外部導入不死化癌遺伝子が組み込まれると不死化される 腫瘍細胞の比率を高めることがある。 本発明の最も好ましい態様においては、前記別の癌遺伝子は、ｒａｓ、変異体 ＷＴ１（ウイルムス腫瘍）、ｂｃ１−２、ｐ５３ｍｕｔ、ｍｙｃ、ＨＥＲ ２／ ｎｅｕ、ＨＰＶ１６癌遺伝子、ＨＰＶ１８癌遺伝子、またはＥ１Ａである。宿主 細胞によって、別の癌遺伝子がＳＶ４０ Ｔ（ｔ）抗原および関連タンパク質の 作用を増強または補足しうる。 本発明のさらに好ましい態様は、免疫刺激因子をコードする少なくとも１つの 外部導入遺伝子をゲノムまたはその他の複製関連遺伝要素内にさらに組み込んだ 腫瘍細胞に関する。 サイトカイン（たとえばＩＬ−２、ＩＬ４、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ）をコー ドするｃＤＮＡを遺伝子工学的に導入した腫瘍細胞を使用することによって免疫 応答を調節したところ、動物における腫瘍応答を実質的に向上させることが可能 であることが示され、場合によっては、転移性疾患の長期緩解が達成された［ブ ランケンステインとロウレイ（Blankenstein T，Rowley DA ）；シュライベル（ Schreiber H ）、1991．サイトカインと癌（Cytokines and Cancer）：実験系（ Experimental systems）． Curr．Opin．Immunol．3:694 において検討済み］。 さらに最近、ほとんどの腫瘍細胞は、効果的な細胞免疫応答を誘導するために必 要なＢ７遺伝子によってコードされるタンパク質などの重要な共刺激因子（co-s timulatory factors）を欠いていることが示された［グイナン、グリッベン、ボ ウスシオティス、フリーマン、ナドラー（Guinan EC，Gribben JG，Boussiotis VA，Freeman GJ，Nadler LM ）、Ｂ７の中枢的役割（Pivotal role of the B7） ：移植耐性および腫瘍免疫におけるＣＤ２８経路(CD28 pathway in transplanta tion tolerance and tumor immunity)． Blood 84:3261-3282，1994 において検 討済み］。腫瘍細胞内にこれらの遺伝子を導入したところ、動物実験における顕 著な抗腫瘍免疫応答が生じた。サイトカインおよび共刺激因子のイン・ビボの役 目に関する知見が拡大しつつあるため、ヒトの癌の治療における細胞とサイトカ インを併用する最適な療法が可能になるであろう。 最も好ましい態様においては、該免疫刺激因子は、Ｂ７またはたとえばＩＬ− ２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＦＮ−α、またはＩＦＮ−γなどのサイトカインで ある。 本発明はさらに、本発明の上皮腫瘍細胞を特異的に認識する抗体もしくはその 断片または該抗体の誘導体もしくはその断片に関する。 「本発明の上皮腫瘍細胞を特異的に認識する」という用語は、抗体が、転移能 を有する腫瘍細胞の由来元である正常上皮細胞と、一方では原発上皮腫瘍細胞と 、他方では本発明の転移能を有する不死化上皮腫瘍細胞とを区別する能力を有す ることをいう。 該区別は、本明細書ですでに述べ下記実施例９で示したように、表面マーカー の分化発現によって引き起こされるのが普通である。 本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、合 成抗体、または半合成抗体であってよい。免疫原のデザイン、免疫化方法、なら びに抗体の単離など前記抗体の作製は、たとえばハーロウとレーン（Harlow and Lane）、Antibodies，A Laboratory Manual，CSH Press，Cold Spring Harbor 1988 に記載の十分に確立されたプロトコルに従うことができる。 抗体の「断片」という用語は、本発明の腫瘍細胞と結合する能力を有するあら ゆる断片に関する。該抗体断片の具体例としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）2、また はＦｖ断片などが挙げられる。 「該抗体の誘導体またはその断片」という用語は、本発明の修飾抗体または断 片をいう。この修飾は、たとえば遺伝子工学的または化学的手段によって実施さ れてもよい。たとえば、遺伝子工学的に作製した抗体またはその断片は、融合タ ンパク質または単鎖（ＶＬまたはＶＨ）誘導体からなるものである。化学修飾抗 体またはその断片は、双特異性抗体などの化学的コンジュゲートも包含する。 本発明の最も好ましい態様においては、該抗体はモノクローナル抗体である。 本発明はさらに、少なくとも１つの不死化誘導性癌遺伝子をコードするＤＮＡ からなるＤＮＡであって、免疫刺激因子をコードする少なくとも１つの遺伝子を 任意に含んでいてもよいＤＮＡを、転移能を有する非不死化上皮腫瘍細胞に組み 込ませる工程を含む本発明の腫瘍細胞のイン・ビトロ製造方法に関する。 本発明の製造方法は、転移能を有する上皮由来腫瘍細胞の特異的かつ無制限の 増殖を初めて可能にするものである。原理的には、本発明は、まれな細胞の一定 の亜集団の選択的増殖が所望されるあらゆる場合に適用することができる。その ような適用の具体例としては、先天異常の遺伝子診断の目的のための母体血液由 来の胎児赤芽球の増殖、およびイン・ビトロにおける幹細胞の増殖を強化する目 的（たとえば高用量化学療法を受けている癌患者の自己幹細胞移植用）にフィー ダー細胞として使用することができる造血幹細胞クラスターに近接する造血支援 骨髄間質細胞の増殖などが挙げられる。組み込みの工程は、適当な組み込み法で あればいかなるものでもよい。本発明の方法の好ましい態様においては、該組み 込みは、ターゲット細胞にマイクロインジェクションまたはＤＮＡ被覆微小胞と ともに衝撃投与（bombardement）することからなる。細胞のマイクロインジェク ションは１９８０年代に当該分野において十分に確立されており、本明細書でさ らに説明する必要はない。マイクロインジェクション工程は、細胞を不死化する 能力を有する少なくとも１つの癌遺伝子をコードするＤＮＡの特異的導入を可能 にするものであり、たとえば骨髄組織に包埋させるか、集積後に細胞培養状態に 維持された所望腫瘍細胞にＳＶ４０のラージＴ抗原を導入することが好ましい。 同定を容易にするために、該細胞に標識抗体を付着させてもよい。 組み込み工程後、該細胞を培養および増殖させて、本発明の特徴を有する細胞 株を樹立させてもよい。 本発明の製造方法の好ましい態様においては、該製造方法は、組み込み工程に 先立ち該非不死化上皮腫瘍細胞の初代増殖を実施する工程をさらに含む。 この態様は、マイクロインジェクションに先立つ非不死化腫瘍細胞の集積と選 択的増殖を可能にするため、本発明の製造方法の実施にとくに好適である。該増 殖は、所望の細胞の同定を容易にするとともに、たとえばマイクロインジェクシ ョンプロセスなどの組み込みを有意に促進する。 増殖は、下記条件下で実施することが最も便利である。すなわち、標準培地（ ＲＰＭＩ１６４０）に、１０％ウシ胎児血清、１０μｇ／ｍｌトランスフェリン 、５μｇ／ｍｌインスリン、および２ｍＭグルタミンなどの標準成分を添加する 。付着細胞培養の一般原則に従い、培地を毎週１回ないし２回交換し、新鮮成長 因子（下記のもの）を培養物に加える。コンフルエンシーに達したら、標準法（ トリプシン／ＥＤＴＡとともにインキュベーション）により付着細胞（上皮腫瘍 細胞を含む）を取り、新しい培養フラスコに継代する。 本発明の製造方法のとくに好ましい態様においては、該初代増殖は、非不死化 上皮腫瘍細胞からなる組織または体液を、該腫瘍細胞の増殖を促進するのに適し た培地中で培養する工程からなる。 最も好ましい態様においては、該体液は骨髄、血液、腹水、または胸膜滲出液 である。 本発明の製造方法のさらにとくに好ましい態様においては、腫瘍細胞の増殖を 促進する培地は、組換えヒト（ｒｈ）ＥＧＦ（上皮成長因子）および／またはｒ ｈ ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞成長因子）からなるものである。 さらにとくに好ましい態様においては、本発明の方法に含まれる培養工程は、 細胞外マトリックス（ＥＣＭ）被覆組織フラスコ内および／または５〜１０％の 低酸素濃度にて実施される。ＥＣＭは、アポトーシスを阻害し、上皮腫瘍細胞の 増殖を維持する重要なシグナルを提供する。 本発明はさらに、本発明の上皮腫瘍細胞および／または本発明の抗体、その誘 導体またはそれらの断片からなる医薬組成物であって、適当な医薬品担体と任意 に組み合わせてもよい医薬組成物に関する。 本発明の医薬組成物は、癌の予防に使用してもよい。本発明の医薬組成物はさ らに、癌および／または癌の転移の治療に使用してもよい。 本発明の上皮腫瘍細胞を含む医薬組成物は、免疫刺激分子および／またはサイ トカインのトランスフェクションなどの細胞の適当な処方および／または遺伝子 修飾によって製造される自己または同種異系腫瘍細胞ワクチンの基礎をなすもの であってよい。 本発明のさらに好ましい態様においては、免疫刺激分子および／またはサイト カインのトランスフェクションによって製造された上皮腫瘍細胞またはその遺伝 子修飾物を用いて、白血球搬出や磁性ビーズによる単離などの公知の方法によっ て単離された患者の免疫細胞をエクス・ビボで刺激してもよい。このような刺激 細胞の再輸液を行なうことで、患者の腫瘍に対する有効免疫応答を引き起こして もよい。 さらに好ましい態様においては、本発明の抗体、その誘導体またはそれらの断 片は、腫瘍再発を予防するために、原発腫瘍の外科的切除後の患者に投与しても よい。 各患者の腫瘍再発のリスクを正確に評価する必要があるが、このリスクは骨髄 内に微小転移細胞が存在すると変動する［シュリモクら（Schlimok et al．）、 Proc．Natl．Acad．Sci．84:8672，1987；シュリモクら（Schlimok et al．）、 Eur．J．Cancer 27:1461，1991；コテら（Cote et al．）、J．Clin．Oncol．9: 1749，1991；ディエルら（Diel et al．）、J．Clin．Oncol．10:1534，1992 ； マンシら（Mansi et al.）、Br．J．Cancer 27:1552，1991 ；ハルベックら（Ha rbeck et al.）、Br．J．Cancer 69:566，1994；リンデマンら（Lindemann et a l.）、Lancet 340:685，1992；パンテルら（Pantel et al．）、Cancer Res．53 :1027，1993 ］。特異的免疫化アプローチのためのターゲットとして最小残留疾 患段階を採用することの明確な利点は、エフェクターになりうる細胞が結合して いる間葉コンパートメント内に存在することが多い早期散在性細胞へのアクセス が容易であることである［リースミュラーとジョンソン（Riethmuller and John son ）、Curr．Op．Immunol．4:647，1992；パンテルとリースミュラー（Pantel and Riethmuller）、Oncology Today 11:4，1994 ］。 また、本発明は、本発明の上皮腫瘍細胞および／または本発明の抗体からなる 診断用組成物に関する。 本発明の診断用組成物は、血液や骨髄など適当な組織に含まれる転移能を有す る上皮腫瘍細胞の検出に使用してもよい。 さらに、本発明は、癌および／または癌の転移の予防用および／または治療用 の医薬の調製を目的とする本発明の上皮腫瘍細胞の使用に関する。 本発明はまた、癌および／または癌の転移の予防用および／または治療用の医 薬の調製を目的とする本発明の抗体もしくはその誘導体またはそれらの断片の使 用に関する。 最後に、本発明は、腫瘍ワクチンの調製を目的とする本発明の上皮腫瘍細胞ま たは本発明の抗体もしくはその誘導体またはそれらの断片の使用に関する。 以下、図面について説明する。 図１：形質転換ベクターの構築 ｐＵＣ１２は、いくつかの共通の特徴を有するベクターのファミリーに属する 。これらのものは、ｌａｃＺ遺伝子にマルチクローニングサイトを含むとともに 、アンピシリン耐性遺伝子を保持している［ビエイラとメッシング（Vieira，J ．and Messing，J.）、Gene，19:259，1982；ヤニッシュ−ペロンら（Yanish-Pe rron，C.，et al．）、Gene，33:103，1985］。複製開始部位を含む４６９７塩 基対のＳＶ４０ゲノム断片ＢａｍＨＩ（ｂｐ２５３３）−複製開始部位−Ｐｓｔ Ｉ（ｂｐ１９８８）をｐＵＣ１２のリンカーに導入することによって、ｐＵＣＩ ｎ ｗｔをクローニングした。ＳＶ４０の後期領域内の５４６ｂｐ断片を欠失さ せた。プラスミドｐＵＣＩｎ１は７３５９ｂｐを含んでいる。 図２：ＳＶ４０初期遺伝子ＤＮＡのマイクロインジェクションの原理 腫瘍細胞をペトリ皿（直径３．５ｃｍ、Costar社、ドイツ）上で１日間平板培 養した後、倒立ＩＭ３５顕微鏡（Carl Zeiss社、Oberkochen、ドイツ）に取付け たマイクロインジェクター モデル５１７１（Eppendorf 社、Hamburg 、ドイツ ）で注入した。プレート１枚あたり２００ないし３００個の細胞をインジェクシ ョンした後、細胞を別のＴ２５培養フラスコに移し替え、上記のようにして培養 した。経験者であれば、２００ないし３００個の上皮細胞の注入に約３０分間を 要する。非注入細胞は通常、培養４〜８週後に死滅するため、培養中の持続的増 殖の有無によって、ＳＶ４０を導入した細胞を選択する。 図３：気管支癌腫患者の骨髄培養物由来のマイクロインジェクション上皮細胞に おけるＳＶ４０ラージＴ抗原の発現（倍率ｘ１２５） 図４：微小転移性癌細胞の初代イン・ビトロ増殖と不死化 （Ａ〜Ｃ）従来の腫瘍ステージ判定法によって明白な転移がないと判定された 前立腺癌患者３名の骨髄の初代培養。図に示した時点において、培養細胞をトリ プシン処理し、ＣＫ陽性腫瘍細胞を検出する免疫細胞化学的スクリーニングを実 施した。（Ｄ、Ｅ）ＳＶ４０ラージＴ ＤＮＡで誘導された微小転移性腫瘍細胞 の培養中長期増殖。非小細胞肺癌（Ｄ）または前立腺癌（Ｅ）の患者から樹立さ れた初代骨髄培養物に、ＳＶ４０ラージＴ抗原ＤＮＡをマイクロインジェクショ びラージＴ抗原（◆）の発現を検出する免疫染色を行なった。 図５：初代上皮腫瘍細胞上および転移能を有する不死化上皮腫瘍細胞上の表面マ ーカーの識別発現の検出。さらに詳細な説明は、実施例９を参照されたい。 以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。 実施例１ ＳＶ４０ラージＴ抗原をコードする形質転換ベクターの構築とその発現 ｐＳＶＩｎ１［コーエンら（Cohen et al.）、J．Virol 51:91，1984］由来の ＳＶ４０ゲノム断片ＰｓｔＩ／ＢｓｔＸＩ（２４７１ｂｐ）およびＢｓｔＸＩ／ ＢａｍＨＩ（２２２６ｂｐ）をｐＵＣ１２に組み込むことによって、Ｉｎ ｗｔ （図１）をクローニングした。そのｐＳＶＩｎ１由来の断片は、２７ｂｐのパリ ンドロームの中心に１ｂｐを挿入することによってＢｇｌＩ部位を壊して作製し た破壊された開始部位を含んでいる。 実施例２ 患者の選択と骨髄吸引液の単離 インフォームドコンセント取得後、前立腺、腎臓、肺、乳房、および大腸の原 発癌腫を有する１２８名の患者の骨髄吸引液を調べた（表１）。また、上皮の悪 性新生物の所見がない１７名の患者を対照群として用いた。この群は、良性腫瘍 および炎症性疾患を有する患者を含んでいた。 骨髄吸引液は、吸引針を通して上部腸骨稜の両側から採取した。全吸引液の容 量は２ないし１０ｍｌ（平均４ｍｌ）の範囲であり、１０6ないし６ｘ１０7個（ 平均２ｘ１０7個）の単核細胞が得られた。フィコール−ハイパーク密度勾配（P harmacia 社、ドイツ；密度１．０７７ｇ／ｍｏｌ）で９００ｇ、３０分間の遠 心分離を行なった後、スライドガラス上でインターフェース細胞を１５０ｇで５ 分間細胞遠心分離した（スライドガラス１枚あたり細胞８ｘ１０4個）。一晩空 気乾燥させた後、スライドガラスをただちに染色するか、−８０℃で保存した後 使用するとともに、少なくとも２年間にわたり上皮抗原を保存した。各吸引液に つき、４ｘ１０5個の有核細胞を含む５枚のスライドガラスを調べ（患者１名あ たり細胞８ｘ１０5個）、別の１枚のスライドガラスをＩｇイソタイプ対照とし た。 実施例３ 免疫細胞化学的検査 ２つの抗サイトケラチン（ＣＫ）ｍＡｂ（ＣＫ２およびＡ４５−Ｂ／Ｂ３）を 用いて、骨髄細胞遠心分離物における腫瘍細胞検出を行なった［デビュスら（De bus et al.）、EMBO J．1:1982；カルステンら（Karsten et al.）、Eur．J．Ca ncer Clin．Oncol．21:733，1985；シュリモクら（Schlimok et al．）、Proc． Natl．Acad．Sci．USA 84:8672，1987；パンテルら（Pantel et al．）、J．Hem atother．3:165，1994］。（１）サイトケラチンポリペプチドＮｏ．１８（ＣＫ １８）［デビュスら（Debus et al.）、Am．J．Pathol.，1984；デビュスら（De bus et al.）、Am．J．Pathol．114:121，1982］に対するＣＫ２（ＩｇＧ１；オ スボーン（M．Osborn ）博士、Max-Planck-Institut Gottingen および後にボー デンミュラー（H．Bodenmuller）博士、Boehringer Mannheim 社、Tutzing 、ド イツから恵与されたもの）。ＣＫ２は、単純上皮のすべての「正常」（非悪性） 細胞およびそれらに由来する腫瘍、ならびに遷移性細胞癌腫および扁平細胞肺癌 腫の主要画分を染色する［パンテルら（Pantel et al．）、Cancer Res．53:102 7，1993 ；デビュスら（Debus et al.）、Am．J．Pathol．114:121，1984；デビ ュスら（Debus et al.）、EMBO．J．1:1641，1982 ；ヒジャジら（Hijazi et al ．）、J．Urol．141:522，1989］。（２）ＣＫ８，１８、および１９［カルステ ンら（Karsten et al.）、Eur．J．Cancer Clin．Oncol．21:733，1985；コンラ ッドら（Conrad et al．）、Biomed．Biochim．Acta 47:697，1988］をはじめと する様々なサイトケラチン成分の共通エピトープを検出するｍＡｂ Ａ４５−Ｂ ／Ｂ３（ＩｇＧ１；カルステン（N．Karsten）博士、Max-Delbruck Zentrum、Be rlin、ドイツから恵与されたもの）。そのｍＡｂは、２．５〜４ｍｇ／ｍｌの範 囲の最適濃度で用いた。無関係のマウス骨髄腫タンパク質を適当に希釈したもの をＩｇＧ１イソタイプ対照とした（Sigma 社製ＭＯＰＣ２１、Deisenhofen 、ド イツ）。 抗体反応は、アルカリホスファターゼ抗アルカリホスファターゼ（ＡＰＡＡＰ ）法と抗体結合を可視化するノイフクシン法（Neufuchsin-method ）［コーデル ら（Cordell et al.）、J．Hichem．Cytochem．32:219，1984 ］を併用すること によって発色させた。簡単に述べると、一次抗体とのインキュベーション後、多 価ウサギ抗マウスＩｇ抗血清（Ｚ２５９、Dako社、Hamburg 、ドイツ）およびあ らかじめ形成させておいたアルカリホスファターゼとモノクローナル抗アルカリ ホスファターゼ抗体（Ｄ６５１、Dako社、Hamburg 、ドイツ）を、製造元（Dako patts 社、Hamburg 、ドイツ）が推奨する希釈率にて使用した。スライドガラス 上のｍＡｂ陽性細胞を検出する高速スクリーニングを可能にするために、対比染 色は行なわなかった。 本実施例は２つの特異的抗サイトケラチン抗体を使用しているが、当該分野に 熟練せる者にとっては、同じ目的にかなうモノクローナル抗体の入手方法が公知 である。同じことは、下記実施例で説明する抗体と同じ目的にかなうその他の特 異性を有する抗体の作製にもあてはまる。 二重染色のために、散在性腫瘍細胞上の組織発生マーカーおよび増殖関連マー カーの検出に適用されて好成績を挙げている免疫金／酵素併用法を用いた［リー センベルグら（Riesenberg et al．）、Histochemistry 99:61，1993］。簡単に 述べると、まず細胞を、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）（ＩｇＧ１、Dakopatts 社 、Hamburg 、ドイツ）に対するｍＡｂ ＥＲ−ＰＲ８［ガルリーら（Gallee et al．）、Prostate 9:33，1986 ］とともに４５分間保温した。リン酸緩衝食塩水 でよく洗った後、金コンジュゲート化ヤギ抗マウス免疫グロブリンを４５分間イ ンキュベートした。続いて、スライドガラスを洗い、リン酸緩衝食塩水で希釈し た２％グルタールアルデヒドに５分間曝露した。以下の免疫酵素工程は、あらか じめ形成させておいたストレプトアビジンとアルカリホスファターゼの複合体を 用いて作製したビオチニル化ｍＡｂ ＣＫ２を使用する以外は上記単一標識法と 同様であった。蒸留水中で少なくとも１５分間すすいだ後、新鮮調製銀造影混合 物（Amersham社、Braunschweig、ドイツ）を約２０分間塗布し、スライドガラス を顕微鏡下に置くことによって、反応を５分ごとにモニターした。造影反応を停 止させるために、スライドガラスを蒸留水ですすいだ。すべてのスライドガラス は、２名の観察者が二重盲検的に調べた。 実施例４ 上皮腫瘍細胞の細胞培養 １ないし６ｘ１０7個のＭＮＣを細胞外マトリックス被覆培養フラスコ（Paese l & Lorei社、Frankfurt 、ドイツ）上に平板接種し、５〜１０％酸素濃度でイ ンキュベートした（Heraeus incubator B 5061 EK/02、Munchen 、ドイツ）。培 地は、１０％ウシ胎児血清、１０ｍｇ／ｍｌトランスフェリン、５ｍｇ／ｍｌイ ンスリン、２ｍＭグルタミン、１０ｎｇ／ｍｌ組換えヒト上皮成長因子（Boerhi nger Mannheim 社、Mannheim、ドイツ）、および１０ｎｇ／ｍｌ組換えヒト塩基 性線維芽細胞成長因子（PBH 社、Hannover、ドイツ）を添加したＲＰＭＩ１６４ ０培地を含むものであった。 上皮癌細胞のイン・ビトロ増殖の第１段階において、３〜５ｍｌの骨髄吸引液 接種物を、細胞外マトリックスタンパク質で被覆した組織培養フラスコ内の上皮 細胞コロニーの成長（outgrowth ）を促進する培養条件下でインキュベートした 。試行錯誤により、等量の塩基性線維芽細胞成長因子と上皮成長因子、ならびに その他の上記成分を含む最適培地組成が判明した。表１に示したように、骨髄培 養は、乳房、大腸、肺、腎臓、および前立腺の小型原発癌の切除を受けた１２８ 名の患者から開始した（実施例２参照）。これらの患者中４２名は、骨髄細胞８ ｘ１０5個あたりの細胞数が１ないし１０個の平均頻度で新鮮骨髄吸引液中にＣ Ｋ＋細胞を含んでいたのに対して、１０個以上のＣＫ＋細胞を持っていた患者は ８名に過ぎなかった（表１）。 上記培養条件下では、２週間以内に最初の上皮細胞のクラスターが出現した（ 図１Ｂ）。有意数のＣＫ＋細胞（＞１０3個）が培養４ないし６週間後に５５例 （４３．０％）で認められた（表２）。原発腫瘍のタイプにより、ＣＫ＋細胞の 絶対数はこの時期に２ないし４対数（細胞分裂＞１３回）だけ増加するのが普通 であった。倍化時間の中央値は２ないし１３日の変動幅があった。ｍＡｂ Ｔ９ ／３３［トロウブリッジ（Trowbridge）、J．Exp．Med．148:313，1978］を用い て通常の白血球抗原ＣＤ４５を検出する連続染色で証明されたように、造血骨髄 細胞か消失死滅したため、ＣＫ＋細胞の濃度が経時的に上昇した。イン・ビトロ で見られた増殖率は必ずしもイン・ビボの増殖パターンを反映していない。前立 腺、肺、および乳房の癌の様な骨転移性腫瘍（bone-seeking tumors ）では、骨 髄の培養が上皮細胞の成長につながる頻度は、明らかな骨格転移がまれである大 腸癌の場合より高くなかった（表２）［ワイス、グルンドマン、ソールホウルス トら（Weiss L.，Grundmann E.，Thorhourst J．et al.）、Haematogenous meta static patterns in colonic carcinoma: an analysis of 1541 necropsies．J ．Pathol 150:195-203，1986 ］。 特定の骨髄サンプルで検出されたＣＫ＋腫瘍細胞の数は、その後の培養で得ら れた増殖率と密接な相関を示さなかったことは注目に値する。有意増殖（１培養 あたりＣＫ＋細胞＞１０3個）が起きた５５サンプル中２０個は、分析した８ｘ １０5個のＭＮＣのなかに検出可能な腫瘍細胞を含んでいなかった。１培養あた りの平板培養ＭＮＣの総数（１〜６ｘ１０7個）に関しては、これらの培養のほ とんどが、限界希釈条件下で存在する上皮腫瘍細胞を用いて実施されたものと考 えられる。一方、５０個のＣＫ＋骨髄サンプル中１５個で検出されたＣＫ＋細胞 はイン・ビトロで増殖できなかったことから、これらの細胞の平板培養効率が低 下していることが示された。これらの患者の微小転移性細胞の成長を強化するた めには、より大量の骨髄細胞が必要かもしれない。以上を総合すると、微小転移 性癌細胞は散在能力を基準にイン・ビボで選択されるであろうが、これらの細胞 のイン・ビトロ増殖能力は不均一なままである。 ＣＫ染色によって同定される上皮細胞は、悪性上皮腫瘍の所見を有さない１７ 名の患者の骨髄培養物中には検出されなかった（表２）。また、これらの患者の 骨髄の一次吸引液はＣＫ＋細胞に対して陰性であった。したがって、本明細書で 説明する特異的培養条件によってサイトケラチンの異所性発現［トラウィークら （TraweeK et al.）、Am J．Pathol 142:1111，1993 ；ガルミッヒェら（Galmic he et al．）、Blood 82:66，1993 ］が誘導される可能性は低いものと思われる 。培養状態のＣＫ＋細胞が上皮に由来するものであるということは、前立腺癌患 者（図１Ｆ）の場合におけるＰＳＡの発現、ならびに骨髄間質細胞のマーカーで あるＣＤ４５白血球共通抗原および間葉中間フィラメントビメンチン［ガルミッ ヒェら（Galmiche et al．）、Blood 82:66，1993 ］が存在しないことによって さらに裏付けられた。増殖上皮細胞が腫瘍由来のものであることを示すさらに別 の証拠として、５名のＣＫ＋細胞を有する患者の骨髄内に突然変異誘発（コドン １２）Ｋｉ−ｒａｓ癌遺伝子が存在することがＰＣＲ［カーンら（Kahn et al． ）、Oncogene 6:1079，1991 ］で裏付けられる。また、腎細胞癌患者から分析さ れた６つの培養物すべてに腎細胞癌関連Ｇ２５０抗原［オオステルウイジクら（ Oosterwijk et al．）、Int．J．Cancer 38，489，1986］が認められている。 実施例５ 上皮腫瘍細胞のマイクロインジェクション 上皮腫瘍細胞の増殖によって、培養中のこれらのＣＫ＋細胞の寿命が制限され ていることが明確に示された。最も長寿命の細胞は２００日以上生存したが（図 ２Ａ）、細胞が急速に死滅し始めた約４０日後には培養物の９０％以上でＣＫ＋ 細胞の増殖が停止した（図２Ｂ、Ｃ）。増殖細胞を救済するために、由来が明確 な癌遺伝子によるそれらの不死化を試みた。形質転換性を有することが明らかに なっている様々な候補中、ＳＶ４０ラージＴ抗原が、様々な器官の正常上皮細胞 を不死化させるか、寿命を延長する能力を有することが証明されているため［バ ルテクら（Bartek et al．）、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:3520，1991；ベ ルソンら（Berthon et al.）、Int．J．Cancer，1992；クッセノットら（Cussen ot et al．）、J．Urol．146:881，1991；バルテクら（Bartek et al．）、Int ．J．Cancer 45:1105，1990；ファウスら（Fauth et al.）、Renal Physiol．Bi ochem．14:128，1991］、このものが最適であると思われた。本発明の目的のた めには、ＳＶ４０ラージＴ抗原を導入した細胞がオリジナルの細胞の分化した表 現型を保持していたという知見はとくに興味深いものである［バルテクら（Bart ek et al．）、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:3520，1991；ベルソンら（Bert hon et al.）、Int．J．Cancer 52:92，1992；クッセノットら（Cussenot et al ．）、J．Urol．146:881，1991］。 樹立初代骨髄培養物における上皮腫瘍細胞の選択的導入を可能にする効率的な 遺伝子移入経路としてマイクロインジェクションを選んだ［バルテクら（Bartek et al．）、Int．J．Cancer 45:1105，1990；ファウスら（Fauth et al.）、Re nal Physiol．Biochem．14:128，1991］。 腫瘍細胞をペトリ皿（直径３．５ｃｍ、Costar社、ドイツ）上で１日間平板培 養した後、倒立ＩＭ３５顕微鏡（Carl Zeiss社、Oberkochen、ドイツ）に取付け たマイクロインジェクター モデル５１７１（Eppendorf 社、Hamburg 、ドイツ ）で注入した。プレート１枚あたり細胞２００ないし３００個を注入した後、細 胞を別のＴ２５培養フラスコに移し替え、上記のようにして培養した。 異なる時点において、トリプシン−ＥＤＴＡ処理により付着細胞をはずし、Ａ ＰＡＡＰ法を用いて免疫染色した。組織発生マーカーの発現は、抗ＣＫ ｍＡｂ であるＣＫ２およびＡ４５−Ｂ／Ｂ３ならびに抗ＰＳＡ ｍＡｂであるＥＲ−Ｐ Ｒ８、腎細胞癌腫特異的抗原に対するｍＡｂ Ｇ２５０［オステルウイジクら（ Osterwijk et al.）、Int．J．Cancer 38:489，1986 ］、１７−１Ａ抗原に対す るＣＯ１７−１Ａ［ゴットリンゲルら（Gottlinger et al．）、Int．J．Cancer 38:47，1986］、およびルイス６血液型前駆体抗原に対するＢＲ５５−２［ブラ スゾザイク（Blaszczyk ）、1987］による染色によって評価した。ＳＶ４０ラー ジＴ抗原の発現は、ｍＡｂである２２０、４１９、および４１６［ハーロウら（ Harlow et al．）、J．Virol．39:861，1981］による標識によって証明した。表 ３に示したとおり、該１培養あたり２００ないし３００個の上皮腫瘍細胞に直鎖 化ＳＶ４０ラージＴ抗原ＤＮＡをマイクロインジェクションしたところ、７５名 の癌患者中３７名の培養物において上皮細胞の連続増殖が誘導された。すべての サンプルにおける増殖動態を調査し、２つの代表的実験を図３に示した。Ｔ抗原 陽性細胞の指数関数的増加後に、ＣＫ＋細胞の数が急増した。導入された細胞は マイクロインジェクション後３ないし５週間以内にコンフルエンシーに達した（ 図１Ｄ）。培養中に１５０日以上経過後にＴ抗原発現が見られたことから、注入 ＤＮＡが安定的に組み込まれたことが示唆される（図１Ｅおよび図３）。 実施例６ マイクロインジェクションした上皮腫瘍細胞のＳＣＩＤマウスへの移植 不死化微小転移性肺癌細胞株の１つを免疫不全ＳＣＩＤマウスに皮下移植した ところ、１０-4の頻度で局所的腫瘍増殖と微小転移性骨髄浸潤が起きた。このよ うな最小の骨髄浸潤は、別の不死化前立腺癌細胞株の場合にも皮下腫瘍が検出で きない時点で見られた（データは示さない）。この知見から、骨髄吸引液から増 殖させた微小転移性細胞はＳＣＩＤマウスにおいて特定の器官特異的ホーミング 親和性（homing affinity ）を依然として遺伝していることが示唆される。した がって、自己免疫エフェクター細胞でこれらのマウスを再構成すると、最小残留 癌に対するイン・ビボ免疫応答を詳細に研究することができる可能性がある。そ のような動物モデルの開発は、遺伝子工学的手法により製造される最小残留癌に 対する腫瘍細胞ワクチンの前臨床試験の目的に極めて重要である。 実施例７ 不死化腫瘍細胞に含まれる上皮分化抗原の表現型分析 増殖ＣＫ＋細胞に含まれる上皮分化抗原の詳細な表現型分析について表３にま とめた。前立腺特異的抗原などの個々の腫瘍分化マーカーの起源に応じて（図１ Ｆ）、腸特異的アネキシン、プロラクチン誘導性タンパク質、およびＧ２５０が ＳＶ４０のＴ抗原不死化ＣＫ＋細胞中に認められた。実験の詳細は次のとおりで ある。 ｍＲＮＡレベルにおける組織発生マーカーの発現を、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ −ＰＣＲ）分析によって測定した。各評価済み培養物の細胞約１０6個分の全Ｒ ＮＡをグアニジンチオシアネート法で精製した。腸特異的アネキシン（ＡＣＴＡ ＴＧＣＧＡＡＴＣＡＡＣＧＴＣ）、前立腺特異的抗原（ＴＧＡＣＧＴＧＡＴＡＣ ＣＴＴＧＡＡＧＣＡ）、および肉眼的嚢胞性疾患−体液−タンパク質−１５／プ ロラクチン誘導性タンパク質（ＧＴＧＴＧＧＣＡＡＡＣＡＧＡＣＡＧＧ）［シュ ルツら（Schulz et al．）、Nucleic Acids．Res．16:6226，1988 ；ワイセとゴ ードン（Wice and Gordon ）、J．Cell Biol．116:405，1992 ；マーフィーら（ Murphy et al．）、J．Biol．Chem．262:15236，1987］に対する特異的プライマ ーを用いて、２ｍｌの全ＲＮＡをｃＤＮＡ中に逆転写した。下記ＰＣＲプライマ ーを用いてマーカー特異的ｃＤＮＡの増幅を行なった。 増幅産物の特異性は、制限酵素分析によって証明した。 分析結果および上記知見から、ＳＶ４０のＤＮＡの取り込みとラージＴ抗原の 発現は、調べた分化マーカーの発現パターンを実質的に変化させなかったことが 示唆される。 最近行なわれたいくつかのＴ抗原変異体の分析で、Ｔ抗原の特異的ＤＮＡ結合 特性は不死化に不可欠ではないことが明確に示されている［ファンニングとクニ ッパース（Fanning and Knippers）、Annu．Rev．Biochem．61:55，1992 ；ドッ ベルステインら（Dobbelstein et al.）、Oncogene 7:837，1992］。しかしなが ら、ＳＶ４０ラージＴ抗原は２つの公知の腫瘍抑制遺伝子産物、ｐ３００、また は関連機能［ヤシウクら（Yaciuk et al．）、Mol．Cell．Biol．11:2116，1991 ］、および網膜芽細胞腫感受性（ＲＢ）遺伝子、およびｐ５３遺伝子に対して特 異的に相互作用を示すことで、両方のタンパク質の増殖停止特性を中和させる［ ファンニングとクニッパース（Fanning and Knippers）、Annu．Rev．Biochem． 61:55，1992 ；ドッベルステインら（Dobbelstein et al.）、Oncogene 7:837， 1992］。本実施例では、免疫細胞化学的検査によって検出可能なｐ５３タンパク 質のレベルが不死化微小転移性細胞において上昇していたことから、ｐ５３タン パク質がこれらの細胞内でＴ抗原と相互作用を示した結果、ｐ５３の半減期を延 長させたことが示唆される。ｐ５３タンパク質は転移性上皮腫瘍細胞において欠 損している、すなわち存在しないことが多いため、この相互作用が微小転移性癌 腫細胞の上記不死化の獲得に必要であることは驚くべきである。しかしながら、 不死化腫瘍細胞およびペアレント腫瘍細胞の詳細な比較評価およびＴ抗原変異体 を用いた研究を実施して、認められた不死化の分子基盤を解明する必要がある。 ＳＶ４０のＴ抗原を導入した細胞がワクチンとして有用であることは、Ｔ抗原を 発現する微小転移性細胞のゲノム内ではＭＨＣクラス１抗原やＩＣＡＭ−１など の効率的免疫応答関連分子の発現がダウンレギュレーションを受けない（データ は示さない）という知見によって裏付けられるが、この知見は、その他様々なタ イプのヒトおよびげっ歯類細胞に関する過去の研究の結果と一致するものである ［ガリーら（Galy et al．）、Thymus 22:13，1993；ビダルら（Vidal et al.） 、J．Immunol．Methods 166:63,1993；タナカら（Tanaka et al.）、Eur．J．Im munol．23:2614，1993］。本実施例で確立された方法は、最も早期の転移性細胞 に由来する細胞であって、患者体内に存在する残留腫瘍細胞の表現型を明確に保 存している細胞を大量に作製する手段として実現可能であると思われる。そのよ うな細胞の入手が可能になれば、癌の微小転移の詳細な分子的解析への道が開か れ、たとえば自己腫瘍細胞ワクチンの新規ソースなどとして有用性を示す可能性 がある。このソースの大きな利点は、腫瘍負荷が最低であって免疫系がまだイン タクトの状態にある最小残留癌の重要な段階において適用可能であるということ である［リエスムラーとジョンソン（Riethmuller，G．and Johnson J.P.）、Cu rrent Opinion in Immunology 4（1992），647-655 ］。 実施例８ 骨髄から増殖させた微小転移性癌腫細胞に対する自己Ｔ細胞応答のイン・ビトロ 誘導 最小残留癌に対する特異的免疫化の目的には、微小転移性癌細胞そのものが理 想的なターゲット候補である。しかしながら、出現頻度が極端に低いために（た とえば骨髄中では１０-5〜１０-6）、これらの腫瘍細胞に対する免疫応答の評価 は困難である。本実施例では、骨髄内に存在する早期散在性上皮腫瘍細胞の１０ ，０００倍以上の一過性増殖を可能にする培養条件を確立した。ＳＶ４０ラージ 腫瘍抗原ＤＮＡの選択的マイクロインジェクションによって、上皮抗原の発現パ ターンを総体的に変化させることなく、増殖細胞を不死化させた。明白な遠隔転 移を伴わない前立腺癌患者（ステージＭ0）の骨髄から樹立した細胞株の１つ（ ＰＣ−ＭＭ−１）において、共刺激分子Ｂ７をコードする遺伝子をレトロウイル スベクターに導入した。これらの細胞を免疫染色したところ、下記の表現型が認 められた。すなわち、ＨＬＡ−Ａ２+／Ａ３+、ＨＬＡ−Ｂｗ４-／Ｂｗ６+、およ びＩＣＡＭ１+である。１０Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−γとともに７２時間インキュベ ートしたところ、Ｂｗ４以外の分子の発現が増大した。１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２ と４０Ｕ／ｍｌのＩＬ−４を加えた培地において、Ｂ７をトランスフェクトさせ た腫瘍細胞の照射単層上で自己ＰＢＬをイン・ビトロ刺激した。３日間培養した 後、腫瘍細胞単層をＰＢＬ類で完全に死滅させた。毎週１回、照射ターゲット単 層を交換することによって、再刺激を行なった。刺激を４ラウンド繰り返した後 のＰＢＬポピュレーションは７５％〜８５％のＣＤ３+ＣＤ８+Ｔ細胞で構成され ていた。エフェクター対ターゲット比５０：１での51Ｃｒ放出測定において、Ｂ ７をトランスフェクトさせたＰＣ−ＭＭ−１の１５％ないし２０％に溶菌を認め た。ＩＦＮ−γで前処理したＬＮＣａｐ前立腺癌細胞も同様の比率で溶菌された という知見から、認められたＴ細胞応答は前立腺と関連があることが示唆される 。以上より、微小転移性腫瘍細胞内へのＢ７遺伝子の導入は、これらの細胞に対 する細胞性免疫応答を強化するとともに、末梢血試料から大量の特異的細胞傷害 性エフェクター細胞を得るための効率的な手段となるものと結論付けられる。 実施例９ 原発上皮腫瘍細胞上および転移能を有する不死化上皮腫瘍細胞上における表面マ ーカーの分化発現の検出 本実施例で使用した実験手順はすべて常法によるものである。腫瘍細胞（ＲＣ Ｃ）および骨髄由来のＣＫ＋細胞からｍＲＮＡを調製し、オリゴ−ｄＴ−プライ ミングを用いてｃＤＮＡに逆転写させた。ランダムプライマーおよびオリゴ−ｄ Ｔ−プライマーを用いて、「ホット」ＰＣＲ、すなわち放射線標識物質を用いた ＰＣＲを実施した。該ＰＣＲ産物を、尿素−ポリアクリルアミド電気泳動法を用 いて分析した。図５は、上記実験のうちの２つの結果を示したものである。図５ ａでは腫瘍特異的バンド、図５ｂではＣＫ＋細胞特異的バンドが明瞭に見られる 。次に、分画的に増幅されたバンドを単離し、クローニングし、配列を決定した 。上記細胞から得た従来のＤＮＡライブラリーを用いて、全長ｃＤＮＡを得た。 全長ｃＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉにクローニングした後、Ｅ．ｃｏｌｉ内で組換えタ ンパク質発現を行なった。組換えタンパク質を用いて、ウサギ体内で特異的ポリ クローナル抗血清を作製した。微小転移能を有する血清腫瘍細胞の特異性は、ネ イティブ腫瘍プローブを用いて確認した。最後に、特異的タンパク質に対するモ ノクローナル抗体を作製した。 表 ＊上部腸骨稜および／または胸骨の骨髄吸引液から密度勾配遠心分離により単離 した８×１０5個のＭＮＣの分析に基づく。 ＃ 抗−ＣＫ ｍＡｂのＣＫ２およびＡ４５−Ｂ／Ｂ３を用いる連続免疫染色に より定義されたように、初代培養前後に行なった。 ＊ 良性腫瘍と炎症性疾患を有する患者。 各患者の２００〜３００個の腫瘍細胞を、前記本明細書に記載のように初代イン ・ビトロ増殖後マイクロインジェクションした。抗ＣＫ ｍＡｂであるＣＫ２お よびＡ４５−Ｂ／Ｂ３、ＰＳＡに対するＥＲ−ＰＲ８、腎細胞癌腫特異的抗原に 対するＧ２５０ならびに１７−１Ａ／ＢＲ５５−２抗原に対する１７−１Ａ／Ｓ ＤＺ ＡＢＬ３６４を用いる免疫細胞化学法により蛋白質の発現を評価し、ＰＳ Ａ、プロラクチン誘導性蛋白質および腸特異的アネキシンのｍＲＮＡ発現をＲＴ −ＰＣＲ法により測定した。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Immortalized epithelial tumor cells The present invention relates to metastatic epithelial tumor cells, the genome or other Incorporating at least one externally introduced immortalization-inducing oncogene within a replication-related genetic element At least one encoding an immunostimulatory factor expressed in said tumor cells The present invention relates to an epithelial tumor cell which may incorporate the gene of The present invention further provides Antibody specifically recognizing clear epithelial tumor cells, method for producing the tumor cells, and The present invention relates to a pharmaceutical composition and a diagnostic composition comprising the tumor cell and the antibody, respectively. Finally, the present invention relates to a tumor for preventing and / or treating cancer and / or metastasis of cancer. Epithelial tumor cells and / or antibodies of the invention for the preparation of vaccines and medicaments About use. Epithelial malignancies are all new cancer cases and cases in western industrialized countries such as Germany. And the majority of cancer deaths. In recent years, surgery has become possible due to advances in early diagnosis of cancer. The proportion of patients with active primary tumors continues to rise. As a result, the spread of tumor cells Early mortality of cancer at a time when its presence is not apparent can determine cancer mortality [Early breast cancer investigator joint group (Early breast cancer trialists' collaborative group), The Lancet 339: 1, 1992; Frost and Levi (Frost and Levin), The Lancet 339: 1458, 1992]. Until now, high resolution Single sporadicity in tissue by both diagnostic imaging and conventional histopathological examination Because the presence of tumor cells has not been proven [Schlimok et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 8672. 1987], considered in deciding how to treat patients. The prognostic factor to be determined depends solely on the prognostic statistical index. Of secondary prevention of metastatic recurrence Systemic adjuvant therapy applied after surgical resection of the primary tumor for severe poisoning Often accompanied by sexual side effects [Hillner and Smith, New En gl. J. Med. 324: 160, 1991; Early Breast Cancer Investigator Joint Group (Early breast cancer trialists' collaborative group), supra]. Thus, epithelial tumor cells that tend to become nuclei for metastasis at the stage of tumor development can be generated. There is a need in the art to identify as early as possible. Also, primary tumor An experimental system suitable for the identification of the above-mentioned tumor cells after dissemination and invasion into secondary tissues It would be very advantageous if it could be provided. If so, the identification of the tumor cells would be useful. Can be used for detecting the cells and for preventing or treating metastasis. Pharmaceutical compositions can be developed. Until now, the desired method and the development of tumor cells depend on various factors, respectively. No good results have been obtained. One of the elements is metastatic epithelioma There is the development of suitable antibodies that specifically recognize tumor cells. Before metastasis, these Tumor cells have a very low abundance in infiltrating tissues such as bone marrow.-FiveOr 10-6 There is also a problem that stays within the range. These cells do not divide in invading tissue Conventional tumor therapies that rely on cell proliferation remove these cells I can't leave. Furthermore, due to the different expression of surface markers compared to primary tumor cells, Surviving metastatic potential epithelial tumor cells from antibody-based diagnostics and therapies Let me do it. Recently, it has been useful mainly for demonstrating the existence of micrometastatic tumor cell aggregates. Advances in known histopathological methods have evolved [Burkhardt et al. et al.), Bull. Cancer 67: 2, 1980; Grunow and Groetchen Groetchen), Pathologe 12: 210, 1991]. However, these methods are not A single epithelial tumor cell having the ability could not be detected. Another approach to detecting metastatic epithelial tumor cells is There is the use of offspring biological techniques. That is, PCR amplification and subsequent restriction of amplification products [Kahn et al., Oncogene 6: 1079, 1991 combining enzyme digestion] Using the system developed by Ki-ras oncogene of micrometastatic cells. Can be detected. However, such processes are comparative Time-consuming, further study, or diagnostic or pharmaceutical composition Provide live cell material for the preparation or development of cell culture methods useful for the production of antibodies. No. Another solution to the problems outlined above is to transform the desired cells. Can be transformed to produce a continuous growth cell line, Methods such as transfer of the offspring can reduce the number of these cells in the primary tumor as well as in the invading tissue. It has only theoretical value. EP-B10 256 512 specification The techniques described above may result in non-specific transformation of cultured cells when applied to this problem. I.e. not only the actual target cells but also many other cells are immortal as well There is a drawback that it is converted. In addition, transforming DNA of unknown origin Its use limits the use of immortalized cells for pharmaceutical purposes. Finally, DE-PS 44 22 570 describes a replication-defective SV40 window. A method for transforming stromal cells with Rus is disclosed. The transformation principle of SV40 The formed large T antigen interacts (and inactivates or reacts with) the tumor suppressor gene p53. Indicates the inhibitory action), and this gene controls the transition from G0 to G1 to the cell cycle phase. Control results, the results of the method are as expected. Perhaps, even those skilled in the art can respond in the case of tumor cells. The results were unexpected [Levine et al., Brit. J. Cancer, 69:40 9, 1994; Sussi et al., In. J. Cancer, 57: 1, 1994]. this is , P53 protein is deficient, ie not included, in epithelial tumor cells [Harris and Holstein (Harris and Hollstein), N.W. Engl. J. Med. 329: 1318, 1993], these cells adhere normally Proliferates worse in culture than cells. Thus, according to any reasonable explanation, S V40 large T antigen interaction will not result in a proliferative response of immortalized tumor cells . In view of the above problems, the technical problems to be solved by the present invention are diagnostic and therapeutic. Transfers that can be used for research and development of valuable compounds or compositions It was to provide an epithelial tumor cell having a function. The technical problem is solved by providing the embodiments characterized in the claims. Is resolved. That is, the present invention relates to an epithelial tumor cell having metastatic potential, Is an externally introduced immortalization-inducing oncogene expressed in the cell in other replication-related elements And epithelial tumor cells incorporating the same. The tumor cells of the present invention are cells derived from the earliest metastatic cells, Generate large numbers of cells that clearly preserve the phenotype of residual tumor cells present in Can be used for purpose. If such cells are available, cancer micrometastases New avenues for in-depth molecular analysis have been opened, such as new autologous tumor cell vaccines May be useful as a source. The great advantage of this source is that tumors Critical stage of minimal residual cancer with minimal burden and immune system still intact It is applicable at the floor. The term "metastasis" refers to the ability of the epithelial tumor cells to be at the core of metastasis formation. U. Tumor cell formation is known to be a complex and multi-step process. No. One step is to generate cell variants in the primary tumor, which are then Detaches from the colony and enters the lymphatic or vascular system through infiltration and penetration of interstitial tissue [Hart and Saimi, The Lancet 339: 1453 , 1992]. As is known from earlier work in this area, cell clones Have already appeared in the early growth phase of the tumor and show significant differences in metastatic behavior. afterwards The formation of a novel mutant can be seen at the stage of tumor progression. Cell surface marker by molecular analysis Changes in Kerr expression have also been found to correlate with the metastatic potential of tumor cells. That Examples of such markers include ICAM-1 and certain CD44 variants. [For example, Mayer et al., The Lancet 342: 1019, 1993. ]. In addition, the development of desmosome adhesion molecules such as E-cadherin and plakoglobin Present Down-regulation leads to detachment of metastatic tumor cells from cell populations Have been found to be involved [see, for example, Birchmeier et al. al. ), In "Contrib. Oncol.", Edited by Rabes et al., Karcher, Basel. 1992, 95]. Subsequently, motility factors (eg, scattering factors, transforming growth factors) Expression and Protease (Cathepsin D) Metalloproteinase, Plasminnow Secretion of gen activator) through the basement membrane of the primary organ and surrounding stroma Promotes invasion of tumor cells [See Bilchmeier and Birchm eier and Birchmeier), Annu. Rev. Cell Bioil. 9: 511, 1993]. secondary Survival of scattered tumor cells in an organ depends on themselves or surrounding stromal cells. Proliferate through immune surveillance in response to produced growth factors and induce angiogenesis Affected by the ability to All of the above processes contribute to the metastatic potential of the epithelial tumor cells of the present invention. And therefore are encompassed by the term. The term "immortalization-inducing oncogene" refers to a cell line of the present invention in which the epithelial tumor cells are Oncogenes capable of immortalizing the tumor cells such that they can be maintained in a cell culture state About the child. Thus, the term "immortalizing" refers to dividing from normal cells Or "shape," which refers to the ability of the transformation principle to promote transition to non-mitotic tumor cells. The term "transformability" is different as far as the subject matter of the present invention is concerned. Transformed cells may have lost or reduced adhesion-dependent growth or lost contact inhibition. Loss and independence from serum or growth factors. The immortalization-inducing oncogene may be a chromosome or a stable minichromosome in the epithelial tumor cell. Expressed when integrated into other replication-related genetic elements. EBV and Papillomau In the case of ils, viral DNA is found intracellularly as episomes. The cancer remains Genes usually utilize the expression mechanism of immortalized cells, while the expression of the oncogene is The regulatory sequences that cause it may be of either intracellular or extracellular origin. In a preferred embodiment of the invention, the epithelial tumor cells are sporadic tumor cells. The term “scattered tumor cells” refers to tumor cells that have already detached from the cell mass. Means It exists, for example, in the bloodstream or lymphatic system. May be present, or may remain in the tissue, such as the bone marrow, where the movement ends. . In a further preferred embodiment, the tumor cells of the present invention are autologous tumor cells. In the context of the present invention, the term "self" means that the tumor cells Same as where it is reintroduced after an operation or other operation, for example for therapeutic purposes From the organism. Alternatively, the term is an epithelial tumor cell of the invention Is maintained or tested in cell culture with cells from the same organism Say. In a further preferred embodiment, the epithelial tumor cells of the invention are human tumor cells . In a further preferred embodiment of the present invention, the metastatic potential epithelial tumor cells are bone It is derived from the pith. As used herein, the term "derived from the bone marrow" refers to a tumor cell that has already May invade the bone marrow and be detected or isolated therefrom Means The term indicates that the tumor cells were normal bone marrow cells prior to transformation. It does not mean. Although it is preferred to use bone marrow as a source of metastatic epithelial tumor cells, This is based on the relative availability of the bone marrow compartment. In addition, some epithelial tumors selectively penetrate the skeletal system [Zetter] , New Engl. J. Med. 332: 605, 1990]. This is a cascade leading to the onset of metastasis. The last three phases, so-called rest, extravasation, and into the invaded tissue Growth is strongly dependent on tissue-specific factors and is clearly promoted in the bone marrow. It can be explained by looking. In a further preferred embodiment of the present invention, the immortalization-inducing oncogene is an SV40 DNA Encoding the replication region, preferably the large T of the replication defective SV40 virus The present invention relates to an epithelial tumor cell having the above characteristics, which is DNA encoding an antigen. The term "DNA encoding the early region of SV40 DNA" refers to the large T antibody Original, small t antigen and / or 17KT antigen or their truncated forms Shall mean any DNA molecule, regardless of the actual nucleic acid sequence The T (t) antigens or truncated forms thereof have the ability to immortalize host cells. And In principle, large T antigen, small t antigen, and / or 17K The DNA encoding the T antigen can be used as part of the complete or partial SV40 genome as a tumor. Introduced into cells. For correct expression, the SV40 enhancer is added at the 5 'end of the SV40 sequence. And a poly A signal (AATAAA) at the 3 'end (bp 2603). Must be present. The term "replication-defective SV40 virus" refers to the replication initiation site of SV40 DNA. Relates to the fact that has no ability to be replicated, ie unwound. This replication defect can be caused by mutations in the replication start site. Ah Alternatively, mutations in the SV40 early coding region can cause replication defects. According to the present invention, a replication defect is defined as the so-called “replication initiation site” of the SV40 genome ( ORI), one or more point mutations, one or more deletions, Or one or more defects, such as multiple insertions Most preferred. In another most preferred embodiment of the present invention, the replication defect comprises Caused by one or more mutations, insertions, deletions, etc. in the region. ( Defect) may be composed of the replication start site or not. In a good embodiment, for example, the defect in the large T code region is, for example, DNA binding domain, helicase activity or other SV40 large T antigen Immortalization of host cells occurs due to a defect in the properties required for replication in NA replication shows an effect that does not occur. SV40 DNA, which is not necessary for the practice of the present invention but contributes to the safety of the entire system, Replication defects ultimately lead to unregulated replication of viral DNA and consequently Virus can destroy host tumor cells instead of immortalizing them This serves the purpose of preventing genome replication. In yet another most preferred embodiment of the epithelial tumor cell of the invention, the SV40 The virus is non-infectious. This most preferred embodiment is a pharmaceutical composition or tumor cell comprising the tumor cells of the present invention. Especially suitable for the development of Kuching. In this embodiment, the SV40 virus is non-infectious Particularly suitable for any scientific or medical purpose where it is desired or assumed It is. Encode VP1 and VP2 to achieve non-infectivity of SV40 virus The core protein of the virus, such as by deletion of a 546 bp fragment in the DNA The quality may be inactivated, which is described in more detail in the examples. In a further preferred embodiment of the invention, at least one other oncogene is Incorporated into the genome of skin tumor cells. The another oncogene is immortalized when the externally introduced immortalized oncogene is integrated May increase the proportion of tumor cells. In a most preferred embodiment of the present invention, the other oncogene is ras, a mutant WT1 (Wilms tumor), bc1-2, p53mut, myc, HER2 / neu, HPV16 oncogene, HPV18 oncogene, or E1A. Host Depending on the cell, another oncogene may be associated with the SV40 T (t) antigen and related proteins. It may enhance or supplement the effect. A further preferred embodiment of the present invention provides that at least one Externally introduced gene has been further integrated into the genome or other replication-related genetic elements For tumor cells. Cytokines (eg, IL-2, IL4, IFN-α, IFN-γ) Immunization by using tumor cells into which cDNA to be loaded has been genetically engineered Modulated response can substantially improve tumor response in animals And, in some cases, long-term remission of metastatic disease was achieved. Lankenstein and Rowley (Blankenstein T, Rowley DA); Schleiber ( Schreiber H), 1991. Cytokines and Cancer: Experimental system ( Experimental systems). Curr. Opin. Immunol. Examined at 3: 694]. More recently, most tumor cells have been required to elicit an effective cellular immune response. Important co-stimulatory factors (co-s timulatory factors] [Guinan, Gribben, Bo Ussiotis, Freeman, Nadler (Guinan EC, Gribben JG, Boussiotis VA, Freeman GJ, Nadler LM), Pivotal role of the B7 : CD28 pathway in transplanta in transplantation resistance and tumor immunity tion tolerance and tumor immunity). Blood 84: 3261-3282, detected in 1994 Defeated]. When these genes were introduced into tumor cells, they became apparent in animal experiments. A significant anti-tumor immune response has been generated. The role of cytokines and costimulators in vivo With increasing eye knowledge, cells and cytokines in the treatment of human cancer Optimal therapy with ins will be possible. In a most preferred embodiment, the immunostimulatory factor is B7 or, for example, IL- 2, with cytokines such as IL-4, IL-7, IFN-α, or IFN-γ is there. The present invention further provides an antibody or an antibody thereof specifically recognizing the epithelial tumor cell of the present invention. A fragment or a derivative of the antibody or a fragment thereof. The term "specifically recognizes the epithelial tumor cells of the present invention" means that the antibody Normal epithelial cells, from which tumor cells are derived, and primary epithelial tumor cells And, on the other hand, have the ability to differentiate from the immortalized epithelial tumor cells with metastatic potential of the present invention Means The distinction was made by the surface marker, as described previously herein and shown in Example 9 below. It is usually caused by the differential expression of The antibodies of the present invention include polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, chimeric antibodies, It may be a synthetic or semi-synthetic antibody. Immunogen design, immunization method, if For example, Harlow and Lane (Harlow and Lane) Lane), Antibodies, A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor A well-established protocol described in 1988 can be followed. The term "fragment" of an antibody refers to any antibody capable of binding to a tumor cell of the invention. Regarding loose fragments. Specific examples of the antibody fragment include Fab, F (ab)Two,Also Include Fv fragments. The term "a derivative of the antibody or a fragment thereof" refers to the modified antibody or fragment of the present invention. A piece. This modification can be performed, for example, by genetic engineering or chemical means. It may be. For example, a genetically engineered antibody or fragment thereof It consists of a protein or a single chain (VL or VH) derivative. Chemically modified anti The body or a fragment thereof also includes a chemical conjugate such as a bispecific antibody. In a most preferred embodiment of the present invention, the antibodies are monoclonal antibodies. The present invention further provides a DNA encoding at least one immortalization-inducing oncogene. DNA comprising at least one gene encoding an immunostimulatory factor DNA that may optionally be incorporated into non-immortalized epithelial tumor cells capable of metastasis The present invention relates to a method for producing tumor cells in vitro of the present invention, which comprises a step of injecting tumor cells. The production method of the present invention is a method for specific and unlimited epithelial-derived tumor cells having metastatic potential. It is the first to enable growth. In principle, the present invention Can be applied wherever selective growth of a subpopulation of is desired. That Specific examples of such applications include maternal blood for genetic diagnosis of birth defects. Eyes to enhance the growth of native fetal erythroblasts and the proliferation of stem cells in vitro (Eg, for autologous stem cell transplantation in cancer patients receiving high-dose chemotherapy) Hematopoietic support in close proximity to hematopoietic stem cell clusters that can be used as donor cells And proliferation of bone marrow stromal cells. The integration process should be performed using a suitable integration method. Anything is acceptable. In a preferred embodiment of the method of the present invention, the combination Injection involves microinjection or DNA-coated microvesicles Both consist of bombardement. Cell microinjection Has been well established in the field in the 1980's and is described herein. No further explanation is needed. Microinjection process immortalizes cells Enables specific transfer of DNA encoding at least one oncogene having the ability For example, by embedding in bone marrow tissue or by cell culture after accumulation. Preferably, the large T antigen of SV40 is introduced into the desired tumor cells that have been maintained. A labeled antibody may be attached to the cells to facilitate identification. After the integration step, the cells are cultured and expanded to obtain cells having the characteristics of the present invention. A strain may be established. In a preferred embodiment of the production method of the present invention, the production method includes Performing a primary expansion of said non-immortalized epithelial tumor cells prior to the method. This embodiment provides for the accumulation and selection of non-immortalized tumor cells prior to microinjection. Since it enables selective growth, it is particularly suitable for carrying out the production method of the present invention. Increase Incubation facilitates identification of the desired cells and, for example, microinjection. Significantly promote the integration of the installation process. The growth is most conveniently performed under the following conditions. That is, the standard medium ( RPMI1640), 10% fetal bovine serum, 10 μg / ml transferrin Add standard components such as 5 μg / ml insulin and 2 mM glutamine . Change the medium once or twice weekly according to the general principles of adherent cell culture, Add factors (described below) to the culture. Once confluency is reached, standard methods ( Adherent cells (epithelial tumors) by incubation with trypsin / EDTA) (Including cells) and passage to new culture flasks. In a particularly preferred embodiment of the production method of the present invention, the primary growth is non-immortalized. A tissue or body fluid comprising epithelial tumor cells suitable for promoting the growth of said tumor cells Culturing in a cultured medium. In a most preferred embodiment, the bodily fluid is bone marrow, blood, ascites, or pleural effusion It is. In a particularly preferred embodiment of the production method of the present invention, the growth of tumor cells is The enhancing medium may be recombinant human (rh) EGF (epidermal growth factor) and / or r h bFGF (basic fibroblast growth factor). In a particularly preferred embodiment, the culturing step included in the method of the present invention comprises: In extracellular matrix (ECM) coated tissue flasks and / or 5-10% It is performed at low oxygen concentration. ECM inhibits apoptosis and reduces epithelial tumor cell Provides an important signal to maintain growth. The present invention further provides an epithelial tumor cell of the present invention and / or an antibody of the present invention, A pharmaceutical composition consisting of a conductor or a fragment thereof, optionally with a suitable pharmaceutical carrier. To a pharmaceutical composition which may be combined with The pharmaceutical composition of the present invention may be used for preventing cancer. The pharmaceutical composition of the present invention is In addition, it may be used in the treatment of cancer and / or metastasis of cancer. Pharmaceutical compositions comprising the epithelial tumor cells of the present invention may comprise immunostimulatory molecules and / or Proper cell formulation and / or gene, such as transfection of tocaine Underlying autologous or allogeneic tumor cell vaccines produced by modification It may be. In a further preferred embodiment of the invention, the immunostimulatory molecules and / or sites Epithelial tumor cells produced by transfection of Cain or its inheritance Using the modified product, a known method such as leukocyte export or isolation using magnetic beads can be used. The isolated immune cells of the patient may be stimulated ex vivo. Such a stimulus Reinfusion of cells can trigger an effective immune response against the patient's tumor Is also good. In a further preferred embodiment, the antibody of the present invention, a derivative thereof or a fragment thereof is used. Can be administered to patients after surgical resection of the primary tumor to prevent tumor recurrence Good. Each patient's risk of tumor recurrence must be accurately assessed, but this risk is Fluctuates when micrometastase cells are present in the cell [Schlimok et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 8672, 1987; Schlimok et al., Eur. J. Cancer 27: 1461, 1991; Cote et al. Clin. Oncol. 9: 1749, 1991; Diel et al. Clin. Oncol. 10: 1534, 1992; Mansi et al., Br. J. Cancer 27: 1552, 1991; Halbek et al. (Ha rbeck et al.), Br. J. Cancer 69: 566, 1994; Lindemann et al. l.), Lancet 340: 685, 1992; Pantel et al., Cancer Res. 53 1027, 1993]. Minimal residual disease as a target for a specific immunization approach A distinct advantage of employing the disease stage is that cells that can be effectors Access to early scattered cells that are often present in the mesenchymal compartment Is easy [Riethmuller and John son), Curr. Op. Immunol. 4: 647, 1992; Pantel and Riesmuller and Riethmuller), Oncology Today 11: 4, 1994]. Further, the present invention comprises the epithelial tumor cell of the present invention and / or the antibody of the present invention. It relates to a diagnostic composition. The diagnostic composition of the present invention has metastatic potential contained in appropriate tissues such as blood and bone marrow. May be used to detect epithelial tumor cells. Furthermore, the present invention is for the prevention and / or treatment of cancer and / or metastasis of cancer. Use of the epithelial tumor cell of the present invention for the preparation of a medicament. The present invention also provides a physician for the prevention and / or treatment of cancer and / or metastasis of cancer. Use of the antibody of the present invention or a derivative thereof or a fragment thereof for the preparation of a medicament About. Finally, the present invention relates to the preparation of an epithelial tumor cell of the invention for the preparation of a tumor vaccine. Or a use of the antibody of the present invention or a derivative thereof or a fragment thereof. Hereinafter, the drawings will be described. Figure 1: Construction of transformation vector pUC12 belongs to a family of vectors with several common features . These include a multiple cloning site in the lacZ gene and Carries the ampicillin resistance gene [Vieira and Meshing (Vieira, J . and Messing, J.), Gene, 19: 259, 1982; Yanish-Peron et al. rron, C., et al. ), Gene, 33: 103, 1985]. 4697 salt containing replication initiation site SV40 genomic fragment of base pair BamHI (bp2533) -Replication initiation site-Pst By introducing I (bp1988) into the linker of pUC12, pUCI n wt was cloned. The 546 bp fragment in the late region of SV40 was deleted. I let you. Plasmid pUCIn1 contains 7359 bp. Figure 2: Principle of microinjection of SV40 early gene DNA Tumor cells were plated on Petri dishes (3.5 cm diameter, Costar, Germany) for 1 day After mounting, mount on inverted IM35 microscope (Carl Zeiss, Oberkochen, Germany) Microinjector model 5171 (Eppendorf, Hamburg, Germany) ). Inject 200 to 300 cells per plate After the incubation, transfer the cells to another T25 culture flask and culture as described above. did. If you are an experienced person, it takes about 30 minutes to inject 200 to 300 epithelial cells. It costs. Non-injected cells usually die after 4-8 weeks of culture, resulting in a continuous increase in culture. Cells into which SV40 has been introduced are selected depending on the presence or absence of propagation. Figure 3: Microinjected epithelial cells from bone marrow cultures of bronchial carcinoma patients Of SV40 large T antigen (magnification x125) Figure 4: Primary in vitro proliferation and immortalization of micrometastatic cancer cells (AC) It was determined that there was no obvious metastasis by the conventional tumor stage determination method Primary culture of bone marrow from three prostate cancer patients. At the time indicated, the cultured cells were Performed immunocytochemical screening to detect CK-positive tumor cells gave. (D, E) Micrometastatic tumor cells induced by SV40 large T DNA Long-term growth in culture. Established from patients with non-small cell lung cancer (D) or prostate cancer (E) SV40 large T antigen DNA was microinjected into the isolated primary bone marrow culture. And large T antigen (◆) were subjected to immunostaining to detect expression. Figure 5: Surface matrix on primary and metastatic immortalized epithelial tumor cells. Detection of differential expression of the protein. See Example 9 for a more detailed description. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. Example 1 Construction of Transformation Vector Encoding SV40 Large T Antigen and Its Expression pSVIn1 [Cohen et al., J. Am. Virol 51:91, 1984] SV40 genomic fragments PstI / BstXI (2471 bp) and BstXI / By incorporating BamHI (2226 bp) into pUC12, In wt (FIG. 1) was cloned. The fragment from pSVIn1 is a 27 bp Paris By disrupting the BglI site by inserting 1 bp into the center of the Including the destroyed start site. Example 2 Patient selection and bone marrow aspirate isolation After obtaining informed consent, prostate, kidney, lung, breast, and colon Bone marrow aspirates from 128 patients with carcinoma were examined (Table 1). Also, epithelium Seventeen patients with no evidence of sexual neoplasm were used as a control group. This group includes benign tumors And patients with inflammatory disease. Bone marrow aspirate was collected from both sides of the upper iliac crest through a suction needle. Volume of all suction liquid The volume ranges from 2 to 10 ml (average 4 ml),6Or 6x107Individual( Average 2x107) Mononuclear cells were obtained. Ficoll-Hyperk density gradient (P harmacia, Germany; 900 g at a density of 1.077 g / mol) for 30 minutes After centrifugation, the interface cells were placed on a glass slide at 150 g for 5 g. Centrifuged for 8 minutes (8 x 10 cells per slide)FourIndividual). Overnight sky After air drying, stain the slides immediately or store at -80 ° C. With use, epithelial antigens were stored for at least two years. For each suction liquid 4x10FiveExamine five slides containing nucleated cells (one patient Cell 8x10Five) And another slide glass as an Ig isotype control Was. Example 3 Immunocytochemical test Two anti-cytokeratin (CK) mAbs (CK2 and A45-B / B3) Was used to detect tumor cells in bone marrow cell centrifuges [Debus et al. bus et al.), EMBO J. et al. 1: 1982; Karsten et al., Eur. J. Ca ncer Clin. Oncol. 21: 733, 1985; Schlimok et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 8672, 1987; Pantel et al. Hem atother. 3: 165, 1994]. (1) Cytokeratin polypeptide No. 18 (CK 18) [Debus et al., Am. J. Pathol., 1984; bus et al.), Am. J. Pathol. 114: 121, 1982] against CK2 (IgG1; Dr. M. Osborn, Max-Planck-Institut Gottingen and later Bo Dr. H. Bodenmuller, Boehringer Mannheim, Tutzing, DE (Gift from Japan) CK2 is all "normal" (non-malignant) in simple epithelium Cells and tumors derived therefrom, as well as transitional cell carcinoma and squamous cell lung cancer Stain the major fraction of the tumor [Pantel et al., Cancer Res. 53: 102 7, 1993; Debus et al., Am. J. Pathol. 114: 121, 1984; Devi Debus et al., EMBO. J. 1: 1641, 1982; Hijazi et al. . ). Urol. 141: 522, 1989]. (2) CK8, 18, and 19 (Karsten et al.), Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 21: 733, 1985; stove Conrad et al., Biomed. Biochim. Acta 47: 697, 1988] MAb A45-B detecting common epitopes of various cytokeratin components / B3 (IgG1; Dr. N. Karsten, Max-Delbruck Zentrum, Be rlin, a gift from Germany). Its mAb is in the range of 2.5-4 mg / ml. Used at optimal concentration in box. Appropriate dilution of unrelated mouse myeloma protein Was used as an IgG1 isotype control (Sigma MOPC21, Deisenhofen, Germany). It's). The antibody reaction was performed using an alkaline phosphatase anti-alkaline phosphatase (APAAP). ) Method and Neufuchsin-method for visualizing antibody binding [Cordell (Cordell et al.), J. et al. Hichem. Cytochem. 32: 219, 1984] Color. Briefly, after incubation with the primary antibody, -Valent rabbit anti-mouse Ig antiserum (Z259, Dako, Hamburg, Germany) and Alkaline phosphatase preformed and monoclonal anti-alkali. A phosphatase antibody (D651, Dako, Hamburg, Germany) was purchased from the manufacturer (Dako patts, Hamburg, Germany). Slide glass Counter-staining to enable rapid screening to detect the above mAb-positive cells No color was done. Although this example uses two specific anti-cytokeratin antibodies, Experts know how to obtain monoclonal antibodies for the same purpose It is. The same is true for other features that serve the same purpose as the antibodies described in the Examples below. The same applies to the production of antibodies having the opposite sex. For double staining, tissue development markers and proliferation-related markers on scattered tumor cells The immuno-gold / enzyme combination method, which has been successfully applied to car detection, was used. Riesenberg et al., Histochemistry 99:61, 1993]. simply Specifically, cells were first converted to prostate specific antigen (PSA) (IgG1, Dakopatts, Inc.). ER-PR8 [Gallee et al., Hamburg, Germany]. al. ), Prostate 9:33, 1986] for 45 minutes. Phosphate buffered saline Wash well, then add gold-conjugated goat anti-mouse immunoglobulin for 45 minutes. Incubated. Subsequently, slides are washed and diluted with phosphate buffered saline. 5% glutaraldehyde for 5 minutes. The following immunoenzymatic steps Preformed complex of streptavidin and alkaline phosphatase Except that the biotinylated mAb CK2 prepared using It was similar. Rinse in distilled water for at least 15 minutes, then mix freshly prepared silver contrast (Amersham, Braunschweig, Germany) for about 20 minutes and slide glass The reaction was monitored every 5 minutes by placing under a microscope. Stop imaging reaction The slides were rinsed with distilled water to stop. All glass slides Was double blinded by two observers. Example 4 Cell culture of epithelial tumor cells 1 to 6x107MNCs in extracellular matrix-coated culture flasks (Paese l & Lorei, Frankfurt, Germany) and plated at 5-10% oxygen concentration. Incubated (Heraeus incubator B 5061 EK / 02, Munchen, Germany). Culture The ground was 10% fetal bovine serum, 10 mg / ml transferrin, 5 mg / ml Insulin, 2 mM glutamine, 10 ng / ml recombinant human epidermal growth factor (Boerhi nger Mannheim, Mannheim, Germany) and 10 ng / ml recombinant human base 164 supplemented with inflammatory fibroblast growth factor (PBH, Hannover, Germany) 0 medium. In the first stage of in vitro growth of epithelial cancer cells, 3-5 ml of bone marrow aspirate Epithelial cells in tissue culture flasks coated with extracellular matrix protein Incubated under culture conditions to promote outgrowth of cell colonies . By trial and error, equal amounts of basic fibroblast growth factor and epidermal growth factor, and The optimum medium composition containing the other components described above was found. As shown in Table 1, bone marrow culture Nutrition received resection of small primary carcinomas of the breast, colon, lung, kidney, and prostate 128 Started with two patients (see Example 2). 42 of these patients had bone marrow cells 8 x10FiveC in fresh bone marrow aspirate with an average frequency of 1 to 10 cells per cell Patients who had more than 10 CK + cells while containing K + cells There were only eight (Table 1). Under the above culture conditions, the first cluster of epithelial cells appeared within 2 weeks ( (FIG. 1B). Significant number of CK + cells (> 10Three55 cases after 4 to 6 weeks of culture (43.0%) (Table 2). Depending on the type of primary tumor, CK + cells Absolute numbers usually increase by 2 to 4 logarithms (cell division> 13) at this time Met. The median doubling time varied from 2 to 13 days. mAb T9 / 33 [Trowbridge, J .; Exp. Med. 148: 313, 1978] Hematopoietic bone marrow as demonstrated by serial staining to detect the normal leukocyte antigen CD45 Since the cells disappeared and died, the concentration of CK + cells increased over time. In vitro The growth rates seen in do not necessarily reflect the in vivo growth pattern. Promenade In bone-seeking tumors such as glandular, lung, and breast cancer, bone-seeking tumors The frequency of bone marrow cultures leading to epithelial cell growth was very large, with apparent skeletal metastases rare Not higher than in intestinal cancer (Table 2) (Weiss L., Grundmann E., Thorhourst J. et al.), Haematogenous meta static patterns in colonic carcinoma: an analysis of 1541 necropsies. J . Pathol 150: 195-203, 1986]. The number of CK + tumor cells detected in a particular bone marrow sample was obtained from subsequent cultures. It is noteworthy that it did not show a close correlation with the growth rate obtained. Significant growth (1 culture CK + cells per 10>ThreeOut of the 55 samples in which 10FiveNo MNC contained detectable tumor cells. One culture Total number of plate-cultured MNCs (1-6 × 107) Of these cultures Most were performed using epithelial tumor cells that existed under limiting dilution conditions. available. On the other hand, CK + cells detected in 15 out of 50 CK + bone marrow samples Did not grow in vitro, resulting in poor plating efficiency of these cells. It was shown that it was down. To enhance the growth of micrometastatic cells in these patients May require a greater amount of bone marrow cells. Summarizing the above, the micrometastasis Sex cancer cells will be selected in vivo on the basis of their dispersal capacity, but these cells In vitro growth capacity remains heterogeneous. Epithelial cells identified by CK staining have no evidence of malignant epithelial tumors 17 It was not detected in bone marrow cultures of several patients (Table 2). In addition, these patients Primary bone marrow aspirate was negative for CK + cells. Therefore, in this specification Ectopic expression of cytokeratin depending on specific culture conditions described [Traweek et al. (TraweeK et al.), Am J. et al. Pathol 142: 1111, 1993; he et al. ), Blood 82:66, 1993] is unlikely to be induced . The fact that CK + cells in culture are derived from epithelium indicates that prostate cancer Of PSA in patients (FIG. 1F) and markers of bone marrow stromal cells A CD45 leukocyte common antigen and mesenchymal intermediate filament vimentin [Galmi Galmiche et al., Blood 82:66, 1993] It was further supported. Yet another indication that proliferating epithelial cells are of tumor origin As evidence of mutagenesis (codons) in the bone marrow of 5 patients with CK + cells 12) The presence of the Ki-ras oncogene was determined by PCR [Kahn et al. ), Oncogene 6: 1079, 1991]. Also analyzed from patients with renal cell carcinoma All six cultures were used for renal cell carcinoma-associated G250 antigen [Osterwijk et al. Oosterwijk et al. ), Int. J. Cancer 38, 489, 1986]. Example 5 Microinjection of epithelial tumor cells The growth of epithelial tumor cells limits the life span of these CK + cells in culture It was clearly shown. The longest-lived cells survived for more than 200 days (Fig. 2A) CK + in more than 90% of cultures about 40 days after cells began to die rapidly Cell growth stopped (FIGS. 2B, C). Clear source to save proliferating cells We attempted to immortalize them with various oncogenes. Clearly transformable Among various candidates, SV40 large T antigen is found to be normal epithelial cells of various organs. Has been proven to have the ability to immortalize or extend Bartek et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3520, 1991; Berthon et al., Int. J. Cancer, 1992; Kussenott et al. (Cussen ot et al. ). Urol. 146: 881, 1991; Bartek et al., Int. . J. Cancer 45: 1105, 1990; Fauth et al., Renal Physiol. Bi ochem. 14: 128, 1991], which seemed optimal. The purpose of the present invention To achieve this, cells into which the SV40 large T antigen was introduced were differentiated from the original cells. The finding that it retained its archetype is particularly interesting [Bartek et al. ek et al. ), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3520, 1991; Belson et al. (Bert hon et al.), Int. J. Cancer 52:92, 1992; Cussenot et al. . ). Urol. 146: 881, 1991]. Efficient enabling selective transfection of epithelial tumor cells in established primary bone marrow cultures We selected microinjection as a gene transfer pathway [Bartek et al. et al. ), Int. J. Cancer 45: 1105, 1990; Fauth et al., Re. nal Physiol. Biochem. 14: 128, 1991]. Tumor cells were plated on Petri dishes (3.5 cm diameter, Costar, Germany) for 1 day After mounting, mount on inverted IM35 microscope (Carl Zeiss, Oberkochen, Germany) Microinjector model 5171 (Eppendorf, Hamburg, Germany) ). After injecting 200 to 300 cells per plate, The cells were transferred to another T25 culture flask and cultured as described above. At different time points, adherent cells were removed by trypsin-EDTA treatment and A Immunostaining was performed using the PAAP method. Expression of a tissue development marker is determined by anti-CK mAb CK2 and A45-B / B3, and ER-P, an anti-PSA mAb R8, mAb G250 against renal cell carcinoma-specific antigen [Osterwijk et al. Osterwijk et al.), Int. J. Cancer 38: 489,1986], against the 17-1A antigen CO17-1A [Gottlinger et al., Int. J. Cancer 38:47, 1986], and BR55-2 [Bra against Lewis 6 blood group precursor antigen. Szozyk (1987)]. SV40 Larger Expression of the di-T antigen was determined by mAbs 220, 419, and 416 [Harrow et al. Harlow et al. ). Virol. 39: 861, 1981]. table As shown in FIG. 3, 200 to 300 epithelial tumor cells per culture Microinjection of the SV40 large T antigen DNA Continuous growth of epithelial cells was induced in cultures of 37 of the 37 cancer patients. All The growth kinetics in the samples were investigated and two representative experiments are shown in FIG. T antigen After an exponential increase in positive cells, the number of CK + cells spiked. The introduced cells Confluency is reached within 3 to 5 weeks after microinjection ( (FIG. 1D). T antigen expression was observed after 150 days or more during the culture. It is suggested that the DNA was stably integrated (FIGS. 1E and 3). Example 6 Transplantation of microinjected epithelial tumor cells into SCID mice One of the immortalized micrometastatic lung cancer cell lines was implanted subcutaneously in immunodeficient SCID mice However, 10-FourLocalized tumor growth and micrometastatic bone marrow infiltration occurred at a frequency of. This Minimal bone marrow infiltration can be detected in subcutaneous tumors even with another immortalized prostate cancer cell line. Not seen (data not shown). Based on this finding, it increased from bone marrow aspirate. Cultured micrometastatic cells are specific organ-specific homing in SCID mice It is suggested that the homing affinity is still inherited. did Thus, reconstitution of these mice with autoimmune effector cells resulted in minimal residual The in vivo immune response to cancer may be studied in detail. So The development of animal models such as It is extremely important for the purpose of preclinical testing of tumor cell vaccines. Example 7 Phenotypic analysis of epithelial differentiation antigens contained in immortalized tumor cells Table 3 shows a detailed phenotypic analysis of epithelial differentiation antigens contained in proliferating CK + cells. I stopped. Depending on the origin of individual tumor differentiation markers such as prostate specific antigen (Fig. 1 F), gut-specific annexin, prolactin-inducible protein, and G250 SV40 was found in T antigen immortalized CK + cells. The details of the experiment are as follows is there. Expression of tissue development markers at the mRNA level was determined by reverse transcriptase PCR (RT -PCR) analysis. About 10 cells from each evaluated culture6All R for individual NA was purified by the guanidine thiocyanate method. Intestinal specific annexin (ACTA TGCGAATCAACGTC), prostate specific antigen (TGACGTGATACC) CTTGAAGCA), and gross cystic disease-fluid-protein-15 / p Lolactin-inducible protein (GTGTGGCAAACAGACAGG) Schulz et al., Nucleic Acids. Res. 16: 6226, 1988; Weiss and Go -Won and Gordon, J.M. Cell Biol. 116: 405, 1992; Murphy et al. ( Murphy et al. ). Biol. Chem. 262: 15236, 1987]. 2 ml of total RNA was reverse transcribed into cDNA using The following PCR primers Was used to amplify the marker-specific cDNA. The specificity of the amplification product was verified by restriction analysis. From the analysis results and the above findings, the uptake of SV40 DNA and the Expression did not substantially alter the expression pattern of the examined differentiation markers. It is suggested. A recent analysis of several T antigen variants revealed specific DNA binding of T antigen. It is clearly shown that traits are not essential for immortalization [fanning and Pernings (Fanning and Knippers), Annu. Rev. Biochem. 61:55, 1992; Dobbelstein et al., Oncogene 7: 837, 1992]. But The SV40 large T antigen is two known tumor suppressor gene products, p300 and Are related functions [Yaciuk et al., Mol. Cell. Biol. 11: 2116, 1991 And retinoblastoma susceptibility (RB) gene, and p53 gene. Differential interactions neutralize the growth arrest properties of both proteins [ Fanning and Knippers, Annu. Rev. Biochem. 61:55, 1992; Dobbelstein et al., Oncogene 7: 837, 1992]. In this example, p53 protein detectable by immunocytochemical test was used. P53 protein levels were elevated in immortalized micrometastatic cells. Protein interacts with T antigen in these cells, resulting in an increase in p53 half-life. It is suggested that it was lengthened. p53 protein is absent in metastatic epithelial tumor cells This interaction, which is often impaired, or absent, is It is surprising that it is necessary for the tumor cells to achieve the above immortalization. However, Detailed comparative evaluation of immortalized and parental tumor cells and T antigen variants It is necessary to carry out studies using to elucidate the molecular basis of the observed immortalization. The usefulness of cells into which SV40 T antigen has been introduced as a vaccine is that T antigen MHC class 1 antigen, ICAM-1, etc. in the genome of expressed micrometastatic cells Expression of efficient immune response-related molecules is not down-regulated (data (Not shown), but this finding is Consistent with the results of previous studies on Ip human and rodent cells [Galy et al., Thymus 22:13, 1993; Vidal et al. J. Immunol. Methods 166: 63, 1993; Tanaka et al., Eur. J. Im munol. 23: 2614, 1993]. The method established in this example is the earliest metastatic cell Phenotype of residual tumor cells in the patient It seems to be feasible as a means of producing large numbers of existing cells. That's it Availability of such cells opens the door to detailed molecular analysis of cancer micrometastases May be useful, for example, as a new source of autologous tumor cell vaccines There is. The great advantage of this source is that the tumor load is minimal and the immune system is still Applicable at the critical stage of minimal residual cancer in tact state [Riethmuller, G. and Johnson J.P., Cu rrent Opinion in Immunology 4 (1992), 647-655]. Example 8 In vitro autologous T cell response to micrometastatic carcinoma cells grown from bone marrow Guidance For the purpose of specific immunization against minimal residual cancer, micrometastatic cancer cells themselves It is an imaginary target candidate. However, due to the extremely low frequency of appearance ( For example, 10 in the bone marrow-Five-10-6), Evaluation of the immune response against these tumor cells It is difficult. In this example, 10 of early sporadic epithelial tumor cells Culture conditions were established that allowed for transient growth of 2,000-fold or more. SV40 Large By selective microinjection of tumor antigen DNA, epithelial antigen expression Proliferating cells were immortalized without altering the turn overall. Express remote rotation Prostate cancer patients without metastasis (Stage M0) One of the cell lines established from bone marrow PC-MM-1), the gene encoding costimulatory molecule B7 was replaced with retrovirus Into the vector. Immunostaining of these cells revealed the following phenotypes: Was called. That is, HLA-A2+/ A3+, HLA-Bw4-/ Bw6+, And And ICAM1+It is. Incubate for 72 hours with 10 U / ml IFN-γ As a result, expression of molecules other than Bw4 was increased. 10 U / ml IL-2 And transfected B7 in a medium supplemented with 40 U / ml of IL-4. Autologous PBLs were stimulated in vitro on irradiated monolayers of tumor cells. Cultured for 3 days Later, the tumor cell monolayer was completely killed with PBLs. Once a week, irradiation target only Restimulation was performed by changing layers. After 4 rounds of stimulation PBL population is 75% -85% CD3+CD8+Composed of T cells I was With an effector to target ratio of 50: 151In the Cr release measurement, B Lysis was observed in 15% to 20% of PC-MM-1 transfected with No. 7. Was. LNCap prostate cancer cells pretreated with IFN-γ were also lysed at a similar ratio Suggests that the observed T cell response is related to the prostate . As described above, introduction of the B7 gene into micrometastatic tumor cells is A large amount of specific cytotoxicity from peripheral blood samples It is concluded that this is an efficient means to obtain sex effector cells. Example 9 Surface tumors on primary and metastatic immortalized epithelial tumor cells Detection of differentiation All the experimental procedures used in this example are according to a conventional method. Tumor cells (RC C) and mRNA was prepared from CK + cells derived from bone marrow and oligo-dT-ply CDNA was reverse transcribed using mining. Random primer and oligo-d "Hot" PCR using T-primers, i.e. using radiolabels PCR was performed. The PCR product was analyzed by urea-polyacrylamide electrophoresis. And analyzed. FIG. 5 shows the results of two of the above experiments. FIG. a clearly shows a tumor-specific band, and FIG. 5b clearly shows a CK + cell-specific band. . Next, the fractionally amplified band was isolated, cloned and sequenced. . Using a conventional DNA library obtained from the above cells, full-length cDNA was obtained. The full-length cDNA was obtained from E. coli. after cloning into E. coli. recombination within E. coli Protein expression was performed. Using recombinant proteins, specific poly A clonal antiserum was made. The specificity of serum tumor cells with micrometastasis Confirmation was performed using an active tumor probe. Finally, a model for specific proteins Noclonal antibodies were produced. table * Isolated by density gradient centrifugation from bone marrow aspirate of upper iliac crest and / or sternum 8 × 10FiveBased on analysis of MNCs. # For serial immunostaining with anti-CK mAbs CK2 and A45-B / B3 Performed before and after primary culture, as more defined. * Patients with benign tumors and inflammatory diseases. 200-300 tumor cells from each patient were transferred to primary in vivo cells as described herein above. -Microinjection was performed after in vitro propagation. CK2 and anti-CK mAbs And A45-B / B3, ER-PR8 against PSA, renal cell carcinoma-specific antigen Against G250 and 17-1A / S against 17-1A / BR55-2 antigen Protein expression was evaluated by immunocytochemistry using DZ ABL364 and PS A, RT expression of prolactin-inducible protein and gut-specific annexin mRNA -Measured by the PCR method.
【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９７年８月１８日 【補正内容】 請求の範囲 １．不死化上皮腫瘍細胞で発現する外部導入不死化誘導性癌遺伝子を、ゲノムま たはその他の複製関連遺伝要素内に組み込んでなる転移能を有する不死化上皮腫 瘍細胞。 ２．散在性腫瘍細胞である、請求項１記載の上皮腫瘍細胞。 ３．自己腫瘍細胞である、請求項１または２記載の上皮腫瘍細胞。 ４．ヒト腫瘍細胞である、請求項１〜３いずれか記載の上皮腫瘍細胞。 ５．骨髄由来である、請求項１〜４いずれか記載の上皮腫瘍細胞。 ６．該不死化誘導性癌遺伝子がＳＶ４０ＤＮＡの初期領域をコードするＤＮＡ、 好ましくは、複製欠損ＳＶ４０ウイルスのラージＴ抗原をコードするＤＮＡであ る、請求項１〜５いずれか記載の上皮腫瘍細胞。 ７．該複製欠損が、複製開始部位における１つまたは複数個の欠陥および／また は抗原コーディング領域における１つまたは複数個の欠陥によって引き起こされ るものである請求項６記載の上皮腫瘍細胞。 ８．該ＳＶ４０ウイルスが非感染性である、請求項６または７記載の上皮腫瘍細 胞。 ９．少なくとも１つの追加の癌遺伝子をゲノムに組み込んでなる請求項１〜８い ずれか記載の上皮腫瘍細胞。 １０．該追加の癌遺伝子がｒａｓ、変異体ＷＴ１、ｂｃ１−２、ｐ５３ｍｕｔ、 ｍｙｃ、ＨＥＲ ２／ｎｅｕ、ＨＰＶ１６癌遺伝子、ＨＰＶ１８癌遺伝子または Ｅ１Ａである請求項９記載の上皮腫瘍細胞。 １１．免疫刺激因子をコードする少なくとも１つの外部導入遺伝子を、ゲノムま たはその他の複製関連遺伝要素内にさらに組み込んでなる請求項１〜１０いずれ か記載の上皮腫瘍細胞。 １２．該免疫剌激因子がＢ７またはサイトカイン、好ましくはＩＬ−２、ＩＬ− ４、ＩＬ−７、ＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−γである、請求項１１記載の上皮腫瘍 細胞。 １３．請求項１〜１２いずれか記載の腫瘍細胞を特異的に認識する抗体もしくは その断片または該抗体の誘導体もしくはその断片。 １４．モノクローナル抗体またはその断片である請求項１３記載の抗体またはそ の断片。 １５．融合蛋白質または化学的コンジュゲート、好ましくは双特異性抗体である 請求項１３記載の誘導体または断片。 １６．少なくとも１つの不死化誘導性癌遺伝子をコードするＤＮＡおよび、任意 に免疫刺激因子をコードする少なくとも１つの遺伝子を含むＤＮＡを、転移能を 有する非不死化上皮腫瘍細胞に組み込む工程を含む、請求項１〜１２いずれか記 載の腫瘍細胞のイン・ビトロ製造方法。 １７．該ＤＮＡを組み込む工程が、マイクロインジェクションまたはＤＮＡ被覆 微粒子を衝撃投与（bombardement）することを含む請求項１６記載の製造方法。 １８．マイクロインジェクションまたは衝撃投与工程の前に、該非不死化上皮腫 瘍細胞の初代増殖を行なう工程をさらに含む、請求項１６または１７記載の製造 方法。 １９．該初代増殖が、非不死化上皮腫瘍細胞からなる組織または体液を、該腫瘍 細胞の増殖を促進するのに適した培地中で培養する工程を含む、請求項１８記載 の製造方法。 ２０．該体液が骨髄、血液、腹水または胸膜滲出液である請求項１９記載の製造 方法。 ２１．該培地がＥＧＦおよび／またはｂＦＧＦ、好ましくはｒｈ ＥＧＦおよび ｒｈ ｂＦＧＦを含む、請求項１９または２０記載の製造方法。 ２２．該培養工程が、ＥＣＭ被覆組織フラスコ内および／または５〜１０％の低 酸素濃度にて行なわれる、請求項１９〜２１いずれか記載の製造方法。 ２３．請求項１〜１２いずれか記載の上皮腫瘍細胞および／または請求項１３〜 １５いずれか記載の抗体もしくはその誘導体またはそれらの断片からなる医薬組 成物であって、適当な医薬品担体と任意に組み合わせてもよい医薬組成物。 ２４．請求項１〜１２いずれか記載の上皮腫瘍細胞および／または請求項１３〜 １５いずれか記載の抗体もしくはその誘導体またはそれらの断片を含有してなる 診断用組成物。 ２５．癌および／または癌転移の予防および／または治療のための医薬調製用の 請求項１〜１２いずれか記載の上皮腫瘍細胞の使用。 ２６．癌および／または癌転移の予防および／または治療のための医薬調製用の 請求項１３〜１５いずれか記載の抗体もしくはその誘導体またはそれらの断片の 使用。 ２７．腫瘍ワクチン調製のための請求項１〜１２いずれか記載の上皮腫瘍細胞ま たは請求項１３〜１５いずれか記載の抗体もしくはその誘導体またはそれらの断 片の使用。 ２８．患者の免疫細胞のエクス・ビボでの剌激のための請求項１〜１２いずれか 記載の上皮腫瘍細胞の使用。[Procedure for Amendment] Article 184-8, Paragraph 1 of the Patent Act [Date of Submission] August 18, 1997 [Content of Amendment] Claims 1. An immortalized epithelial tumor cell capable of metastasis, wherein an externally introduced immortalization-inducing oncogene expressed in the immortalized epithelial tumor cell is integrated into the genome or other replication-related genetic elements. 2. The epithelial tumor cell according to claim 1, which is a diffuse tumor cell. 3. 3. The epithelial tumor cell according to claim 1, which is an autologous tumor cell. 4. The epithelial tumor cell according to any one of claims 1 to 3, which is a human tumor cell. 5. The epithelial tumor cell according to any one of claims 1 to 4, which is derived from bone marrow. 6. The epithelial tumor cell according to any one of claims 1 to 5, wherein the immortalization-inducing oncogene is a DNA encoding an early region of SV40 DNA, preferably a DNA encoding a large T antigen of a replication-defective SV40 virus. 7. The epithelial tumor cell according to claim 6, wherein the replication defect is caused by one or more defects in the replication initiation site and / or one or more defects in the antigen coding region. 8. The epithelial tumor cell according to claim 6 or 7, wherein the SV40 virus is non-infectious. 9. An epithelial tumor cell according to any of the preceding claims, wherein at least one additional oncogene has been integrated into the genome. 10. The epithelial tumor cell according to claim 9, wherein the additional oncogene is ras, mutant WT1, bc1-2, p53mut, myc, HER2 / neu, HPV16 oncogene, HPV18 oncogene or E1A. 11. The epithelial tumor cell according to any one of claims 1 to 10, further comprising at least one external transgene encoding an immunostimulatory factor incorporated into a genome or other replication-related genetic elements. 12. Epithelial tumor cell according to claim 11, wherein said immune stimulating factor is B7 or a cytokine, preferably IL-2, IL-4, IL-7, IFN-α or IFN-γ. 13. An antibody or a fragment thereof specifically recognizing the tumor cell according to any one of claims 1 to 12, or a derivative of the antibody or a fragment thereof. 14． 14. The antibody or fragment thereof according to claim 13, which is a monoclonal antibody or a fragment thereof. 15. The derivative or fragment according to claim 13, which is a fusion protein or a chemical conjugate, preferably a bispecific antibody. 16. Claims: A method comprising incorporating DNA encoding at least one immortalization-inducing oncogene and optionally DNA encoding at least one gene encoding an immunostimulatory factor into metastatic non-immortalized epithelial tumor cells. 13. The in vitro production method of a tumor cell according to any one of 1 to 12. 17． 17. The method of claim 16, wherein the step of incorporating the DNA comprises microinjection or bombardement of the DNA-coated microparticles. 18. 18. The production method according to claim 16 or 17, further comprising a step of performing primary growth of the non-immortalized epithelial tumor cell before the microinjection or impact administration step. 19. 19. The method according to claim 18, wherein said primary growth comprises culturing a tissue or body fluid comprising non-immortalized epithelial tumor cells in a medium suitable for promoting the growth of said tumor cells. 20. 20. The method according to claim 19, wherein the body fluid is bone marrow, blood, ascites, or pleural effusion. 21. The method according to claim 19 or 20, wherein the medium contains EGF and / or bFGF, preferably rhEGF and rhbFGF. 22. The method according to any one of claims 19 to 21, wherein the culturing step is performed in an ECM-coated tissue flask and / or at a low oxygen concentration of 5 to 10%. 23. A pharmaceutical composition comprising an epithelial tumor cell according to any one of claims 1 to 12 and / or an antibody or a derivative thereof or a fragment thereof according to any one of claims 13 to 15, optionally in combination with a suitable pharmaceutical carrier. A good pharmaceutical composition. 24. A diagnostic composition comprising the epithelial tumor cell according to any one of claims 1 to 12 and / or the antibody according to any one of claims 13 to 15, or a derivative thereof, or a fragment thereof. 25. Use of the epithelial tumor cell according to any one of claims 1 to 12 for preparing a medicament for preventing and / or treating cancer and / or cancer metastasis. 26. Use of the antibody or its derivative or a fragment thereof according to any one of claims 13 to 15 for preparing a medicament for preventing and / or treating cancer and / or cancer metastasis. 27. Use of an epithelial tumor cell according to any one of claims 1 to 12 or an antibody or a derivative thereof or a fragment thereof according to any one of claims 13 to 15 for preparing a tumor vaccine. 28. Use of an epithelial tumor cell according to any of claims 1 to 12 for the ex vivo stimulation of immune cells of a patient.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 16/30 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/574 Ｄ 15/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/08 15/00 Ｃ Ｇ０１Ｎ 33/574 Ａ６１Ｋ 37/02 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:92） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ， ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ， ＳＤ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ファニング，エレン アメリカ合衆国 テネシー 37235 ナッ シュビル，ピー．オー．ボックス 1820 エスティーエイ ビー，デパートメント オブ モレキュラー バイオロジー，バン ダービルト ユニバーシティー (72)発明者 パンテル，クラウス ドイツ連邦共和国 エシンク デー− 85386 ヘルデルシュトラッセ 22 (72)発明者 リースミュラー，ゲルハルト ドイツ連邦共和国 ミュンヘン デー− 80805 ヘルマン−フォーゲル−シュトラ ッセ 34──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code FI C07K 16/30 C12P 21/08 C12N 5/10 G01N 33/574 D 15/02 C12N 5/00 B C12P 21/08 15/00 C G01N 33/574 A61K 37/02 // (C12N 15/09 ZNA C12R 1:92) (81) Designated country EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE , IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (KE, LS, MW, SD, SZ, UG), UA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AU, AZ, BB, BG, BR, BY, CA CN, CZ, EE, GE, HU, IL, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LK, LR, LS, LT, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO , NZ, PL, RO, RU, SD, SG, SI, SK, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN (72) Inventor Fanning, Ellen United States Tennessee 37235 Nashville, P . Oh. Box 1820 Estee AB, Department of Molecular Biology, Vanderbilt University (72) Inventor Pantel, Klaus Esink Day, Germany 85386 Herderstrasse 22 (72) Inventor Riesmüller, Gerhard Munich, Germany − 80805 Hermann-Vogel-Strasse 34
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