JPH11507215A - C5a receptor antagonist having substantially no agonist activity and production method - Google Patents

C5a receptor antagonist having substantially no agonist activity and production method

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JPH11507215A
JPH11507215A JP9500138A JP50013897A JPH11507215A JP H11507215 A JPH11507215 A JP H11507215A JP 9500138 A JP9500138 A JP 9500138A JP 50013897 A JP50013897 A JP 50013897A JP H11507215 A JPH11507215 A JP H11507215A
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フアン・ヘーケ，ジノ
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ノバルティス・アクチエンゲゼルシャフト
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Abstract

(57)【要約】 実質的にはアナフィラトキシンまたはアゴニスト活性を呈しないＣ５ａ受容体アンタゴニストであるヒトＣ５ａのポリペプチド類似体または誘導体、類似体の誘導体、および類似体または誘導体の二量体形態が開示されている。ポリペプチドをコード化するＤＮＡ分子および類似体の製造方法も提供される。Ｃ５ａ類似体または誘導体を含む医薬製剤は、哺乳類におけるＣ５ａ仲介疾患および炎症状態の処置において治療的に、および炎症を誘発または既存の炎症状態を悪化させる事象により誘発される炎症を阻止または低減化するため予防的に、それぞれ使用される。さらに、ヒトＣ５ａとの交差反応性を実質的には呈しないＣ５ａ類似体、その誘導体および類似体および誘導体の二量体に特異的な抗体が開示されている。抗体は、循環しているＣ５ａ類似体または誘導体を検出または定量、並びにインビボでＣ５ａ受容体アンタゴニストの活性を修飾、すなわち中和するのに使用される。 SUMMARY OF THE INVENTION A polypeptide analog or derivative, analog derivative, and dimeric form of an analog or derivative of human C5a, which is a C5a receptor antagonist that does not substantially exhibit anaphylatoxin or agonist activity, It has been disclosed. Also provided are methods of producing DNA molecules and analogs encoding the polypeptides. Pharmaceutical formulations containing C5a analogs or derivatives therapeutically in the treatment of C5a-mediated diseases and inflammatory conditions in mammals, and prevent or reduce inflammation induced by events that induce inflammation or exacerbate an existing inflammatory condition Used prophylactically, respectively. In addition, antibodies specific for C5a analogs, derivatives thereof and dimers of analogs and derivatives that do not substantially exhibit cross-reactivity with human C5a are disclosed. Antibodies are used to detect or quantify circulating C5a analogs or derivatives, as well as to modify, ie, neutralize, the activity of C5a receptor antagonists in vivo.

Description

【発明の詳細な説明】 アゴニスト活性を実質的にもたないＣ５ａ受容体アンタゴニストおよび製造方法 発明の分野 この発明は、免疫学分野、より具体的には哺乳類における補体仲介疾患および 炎症状態の処置に関するものである。 発明の背景 炎症は傷害により誘導される局在的な防御的事象であり、傷害源および損傷組 織の両方を破壊、減殺または壁防止する働きがある。炎症は、動脈、毛細管およ び小静脈の拡張を含み、導管透過性を高め、血流を増加させ、体液および血漿タ ンパク質を滲出させる一連の複雑な事象を伴う。これらのプロセスの後、多くの 場合急速に白血球が血管内皮に接着し、それに続いて細胞から周囲組織への流入 が起こる。 補体系、すなわち異物に対する主要免疫防御機構は、炎症反応を含む因子の各 々に影響を及ぼすことが示された。一般に、補体は、組織および血液から微生物 および他の抗原を排除すべく働く一組のタンパク質を含む。この働きは、補体成 分単独または抗体もしくは補体受容体を発現する細胞と協同することにより達成 される。さらに具体的には、この系は約３０の血漿タンパク質から成り、それら は細胞受容体および数種の膜調節タンパク質に相当する。キノシタ、「イミュノ ロジー・トゥデー」、１２：２９１−３００(1991)。例えば抗原−抗体複合体ま たは細菌表面構造による補体系の活性化が、補体成分のタンパク質分解的開裂お よびタンパク質会合事象の増幅カスケードを誘発することにより、最終的には異 物は破壊され、最後には排出される。ムラー-エーベルハルト、「アニュアル・ レビュー・オブ・バイオケミストリー」５７：３２１−３４７(1988)。 数種の生物活性ペプチドは、補体系の活性化により生成される。７４アミノ酸 を含み、約１１０００の分子量を有する糖蛋白質Ｃ５ａは、Ｃ５転換酵素により 補体の第５成分、Ｃ５のＮ−終止末端のタンパク質分解的開裂により生成される 。ニルッソンら、「ジャーナル・オブ・イミュノロジー」１１４：８１５−８２ ２(1975)。Ｃ５ａの生物学的特性は、急性および慢性の両炎症プロセスに関与し た多数の細胞および組織全体に波及する。ハグリ、「CRC Crit.Rev.Immunol.」 １：３２１−３６６(1981)。これらの特性の多くは免疫学的に有益である。Ｃ５ ａは、様々な病的状態に応じて宿主防御機構を伝達することが見いだされた。Ｃ ５ａは、炎症応答に普通伴う広く多様な特異的生物機能、例えば平滑筋収縮、血 管透過性の増加、ヒト皮膚への注入時における膨疹紅斑応答、マスト細胞からの ヒスタミン放出、および多形核白血球（ＰＭＮＬｓ）からの酸化的バーストおよ びリソソーム酵素放出の誘導に関与する。Ｃ５ａは、好塩基性細胞、好酸球、単 核細胞および好中球を含むあらゆる循環性白血球細胞からの測定可能な応答を刺 激する。ハグリ、前出、バウチュら、「イミュノバイオロジー」１８５：４１− ５２(1992)。Ｃ５ａはさらに強力な化学誘引物質であることが見いだされた。フ ェルナンデスら、「ジャーナル・オブ・イミュノロジー」１２０：１０９−１１ ５(1978)。このタンパク質は、炎症部位へのＰＭＮＬｓ、例えば食細胞の誘引に 対する中枢刺激因子である。 適当な標的、例えば侵入性微生物または腫瘍細胞に対して指向する場合、補体 は有益であるが、不適当に活性化されると、明かな病原潜在性を有することにな る。例えば、アナフィラトキシン、例えばＣ５ａは、数種の炎症疾患、例えば成 人呼吸窮迫症候群およびリウマチ様関節炎の発病において原因または増悪因子と して関与しでいる。バウチュら、「バイオケミカル・ジャーナル」２８８：２６ １−２６６(1992)、ハスレットら、「ジャーナル・オブ・イミュノロジー」１４ ２：３５１０−３５１７(1989)。特に、組織におけるＣ５ａの迷入的存在は、こ れまでにリウマチ様関節炎、骨関節症、乾癬および非心臓性肺浮腫の患者から検 出されている。ハマーシュミット、「ジャーナル・オブ・アメリカン・メディカ ル・アソシエーション」２４４：１９９−(1980)。Ｃ５ａは、炎症性白血球のリ クルートおよび刺激および抗体産生の増大を含む追加的活性による補体活性化に より生成される主たる炎症伝達物質であることが見いだされた。モリソンら、「 プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシス・オブ ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ」８６：２９２−２９６(1989) 参照。 炎症のインビボまたは薬理的制御は、化学走性の調整に依存的であると推定さ れる。阻害が行われ得る３つのレベルは既に認識されている。これらは、（１） 走化性刺激物質に対する白血球応答の抑制、（２）ケモタキシン生成の阻害、お よび（３）ケモタキシンの不活化である。さらに、Ｃ５ａは数種のヒト細胞、例 えば好中球、好酸球および単核球誘導細胞の膜から見いだされる特異的Ｃ５ａ受 容体に結合することによりその様々な機能を発揮するため、Ｃ５ａ伝達化学走性 の阻害、および特にＣ５ａ受容体アンタゴニストの設計については、かなりの注 意を惹いてきている。 クリアリーらによるＵＳ４７７２５８４は、Ｃ５ａのＣ−末端から６アミノ酸 ペプチドを開裂することによりＰＭＮＬｓへのＣ５ａの結合を阻害するストレプ トコッカスＡ群から単離されたポリペプチドについて開示している。ハーンによ るＵＳ４６９２５１１は、Ｃ５ａ遮断活性を示す必須コアテトラペプチドTyr-As p-Gly-Ala（配列番号１）またはAsp-Gly-Ala-Tyr（配列番号２）、またはコアト リペプチドAsp-Gly-Alaを含むＣ５ａに対するポリペプチド受容体アンタゴニス トについて開示している。 アボット・ラボラトリーズによるＵＳ５１９０９２２、ＷＯ９０／０９１６２ および９２／１１８５８は、Ｃ５ａ受容体に結合し、主張によるとアナフィラト キシン活性を調整する様々なオリゴペプチドを開示している。しかしながら、こ れらの分子の幾つかは，重大なアゴニスト活性を保持していることが示された。 モリソンら、「プログレス・イン・インフラメーション・リサーチ・アンド・セ ラピー」中「好中球受容体相互作用に関するＣ５ａ構造必要条件」、ビルクハウ ゼル・フェルラーク、バーゼル(1991)１７−２１頁、カワイら、「ジャーナル・ オブ・メディシナル・ケミストリー」３５：２２０−２２３(1992)、カワイら、 「ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー」３４：２０６８−２０７１ (1991)、およびオルら、「ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー」３ ５：４０２−４０６(1992)参照。 アゴニスト活性を実質的に無効にできる強力で治療上有効なＣ５ａ受容体アン タゴニストが依然として強く要望されている。さらに、かかるＣ５ａ受容体アン タゴニストの有効な製造方法も依然として強く要望されている。 発明の要約 本発明のー態様は、Ｃ５ａ受容体アンタゴニストであり、実質的にアナフィラ トキシンまたはアゴニスト活性を呈しないヒトＣ５ａのポリペプチド類似体また はポリペプチド誘導体、並びに類似体または誘導体の２量体形態に関するもので ある。 本発明の別の態様は、上記ポリペプチド類似体またはポリペプチド誘導体を含 む融合タンパク質に関するものである。 ポリペプチド類（すなわち、類似体またはその誘導体）または融合タンパク質 をコード化するＤＮＡ分子、プラスミド、ベクターおよびＤＮＡ分子により形質 転換された宿主細胞、並びにＣ５ａ類似体、誘導体または融合タンパク質の製造 方法もまた提供される。 Ｃ５ａ類似体、その誘導体または２量体を含む医薬製剤は、哺乳類におけるＣ ５ａ仲介炎症状態および疾患の処置方法で、および上記炎症を阻止するための予 防薬として有利に使用される。 本発明の別の態様は、実質的にヒトＣ５ａとの交差反応性を呈しない、Ｃ５ａ 類似体またはポリペプチド誘導体に特異的な抗体に関するものである。これらの 抗体は、循環性Ｃ５ａ類似体または誘導体を（以前にこれを投与された）対象か ら検出または定量し、およびインビボでＣ５ａ類似体および誘導体の活性を修飾 、例えば中和するのに使用される。 図面の簡単な記載 図１は、オリゴヌクレオチドカップリングによるヒトＣ５ａをコード化する合 成遺伝子の合成を説明する流れ図である。 図２は、ｐＢ−６／Ｃ５ａのプラスミド地図である。 好ましい態様の記載 本発明のヒトＣ５ａのＣ５ａポリペプチド類似体またはポリペプチド誘導体は 、実質的にアゴニスト活性をもたないＣ５ａ受容体アンタゴニストである。「Ｃ ５ａ受容体」の語は、Ｃ５ａ、その分解産物Ｃ５ａ−desＡｒｇおよび上記アン タゴニストが結合するヒト血液細胞、例えばＰＭＮＬｓおよび単核細胞の表面に ある部位を指すものとして当業界では理解されている。例えば、ＵＳ５１７７１ ９０およびオッパーマンら、「ジャーナル・オブ・イミュノロジー」１５１（７ ）：３７８５−３７９４(1993)参照。Ｃ５ａは、カルボキシペプチダーゼＢ様酵 素によりヒト血清中でＣ５ａ−desＡｒｇに酵素的に変換される、ヒトにおける 主要生理学的最終産物である。チェノウェスら、「モレキュラー・イミュノロジ ー」１７：１５１−１６１(1980)。 「アンタゴニスト」の語は、上記ポリペプチドがＣ５ａの阻害物質であること を意味する。すなわち、それらはＣ５ａとＣ５ａ受容体の結合を妨害する。特別 な理論で束縛する意図はないが、本出願者らは、ヒトＣ５ａのＣ５ａ類似体また はポリペプチド誘導体が、Ｃ５ａ受容体への結合をめぐってＣ５ａと競争する点 でＣ５ａの競争的阻害物質であると考えている。 ヒトＣ５ａの上記Ｃ５ａ類似体またはポリペプチド誘導体の拮抗作用は、実施 例７で詳述されている、セリグマンら、「エージェンツ・アンド・アクションズ 」２１：３７５−３７８(1987)に開示されたカルシウム増加検定でＩＣ50として 定量され得る。ＩＣ50は、１００ピコモルのヒトＣ５ａを含む対抗量投与後、Ｃ ５ａ受容体を担持するＰＭＮＬｓによるカルシウムイオンの細胞内動態化の５０ ％を阻止するヒトＣ５ａのＣ５ａ類似体またはポリペプチド誘導体の濃度として 定義される。本発明のＣ５ａ受容体アンタゴニストは、セリグマンら、前出の文 献で開示されたカルシウム増加検定において約２.０×１０-6モルを越えないＩ Ｃ50を呈する。 「実質的にアナフィラトキシン活性をもたない」または「実質的にアゴニスト 活性をもたない」の語は、受容体へヒトＣ５ａのＣ５ａ類似体またはポリペプチ ド誘導体（以後、Ｃ５ａ受容体アンタゴニストと互換的に使用する）が結合して も、最終的にＣ５ａとその受容体の結合により誘発されるアナフィラトキシン誘 導炎症を通常伴う生理学的応答、例えば食細胞の活性化、平滑筋収縮、血管透過 性の増加、および炎症伝達物質、例えばヒスタミン類、プロスタグランジン類、 トロンボキサン類、ロイコトリエン類、インターロイキン（ＩＬ）−１、ＩＬ− ６およびＩＬ−８の過剰生産をもたらす内在性シグナル変換事象は誘導されない ことを意味する。ハグリら、ＣＲＣ Ｃrit.Ｒev.Ｉmmunol.１：３２１−３２６( 1981)およびＰＣＴ ＷＯ９２／１０２０５参照。この特性の定量的尺度はまた、 セリグマンら、前出文献に開示され、実施例７にも記載されているカルシウム増 加検定を用いて得られる。ＥＣ50は、アゴニスト活性の尺度である。本発明の目 的の場合、ＥＣ50値は、ヒトＣ５ａのＣ５ａ類似体またはポリペプチド誘導体に よりそれぞれ誘発される最大応答の５０％をもたらすヒトＣ５ａの同Ｃ５ａ類似 体またはポリペプチド誘導体の濃度である。本出願人らは、同カルシウム増加検 定において少なくとも約８.０×１０-7モル、好ましくは少なくとも約３.０×１ ０-6モル以下の濃度でヒトＣ５ａの上記Ｃ５ａ類似体またはポリペプチド誘導体 のアゴニスト活性を検出したことはない。本発明のヒトＣ５ａのＣ５ａ類似体ま たはポリペプチド誘導体は、ＥＣ50が、セリグマンのカルシウム増加検定で応答 が全く検出され得ないことから、この検定において少なくとも約８.０×１０-7 モル、好ましくは少なくとも約３.０×１０-6モルのＣ５ａ類似体またはポリペ プチド誘導体濃度以下で測定され得ない場合のものである。 Ｃ５ａは７４−アミノ酸ポリペプチドであり、その配列はフェルナンデスら、 「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー」２５３：６９５５−６９ ６４（１９７８）に開示されている。誘導されたヌクレオチド配列に基づいて構 築された合成遺伝子は、マンデッキら、「プロシーディング・オブ・ナショナル ・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・ ア メリカ」８２：３５４３−３５４７（１９８５）およびデヴィドウらのＵＳ４９ ３７１８９に開示されている。フェルナンデスにより開示されたＣ５ａのアミノ 酸配列およびデヴィドウらにより開示された対応する合成ヌクレオチド配列は、 下記表１に示されている。 本出願人らは、予想外にもそして驚くべきことに、ヒトＣ５ａ（以後、「Ｃ５ ａ（１-７４）」と互換的に使用する）のＣ−末端領域、すなわちアミノ酸６４ −７４をコード化する合成Ｃ５ａ遺伝子部分に突然変異を誘発させることにより 生成されたヒトＣ５ａのある種の類似体またはポリペプチド誘導体が、Ｃ５ａと は劇的に異なる特性を有することを発見した。すなわち、それらは秀でたアンタ ゴニスト特性を呈し、実質的にアゴニスト活性をもたない。ヒトＣ５ａの上記類 似体またはそのポリペプチド誘導体のＮ−末端アミノ酸残基は、いずれかのアミ ノ酸残基、例えばヒトＣ５ａのようにThr残基、またはＭet残基であり得る。特 に、ヒトＣ５ａの上記ポリペプチド誘導体は、Ｎ−末端としてグリシン残基を有 する。 すなわち、本出願の一態様では、ヒトＣ５ａのポリペプチド誘導体であって、 実質的にアゴニスト活性を呈しないＣ５ａ受容体アンタゴニストであり、Ｎ−末 端としてグリシン残基を有する誘導体が提供される。 好ましくは、Ｎ−末端グリシン残基は付加物形態（Ｎ−末端付加残基）で有り 得、または、同じく好ましくは、上記グリシン残基は、ヒトＣ５ａのＮ−アミノ 酸トレオニンに対する置換基である（置換Ｔｈｒ１Ｇｌｙ）。 特に、本発明によるヒトＣ５ａのポリペプチド誘導体は、例えばヒトＣ５ａト レオニン〜グリシンのＮ−末端アミノ酸残基に突然変異を誘発させ、さらにヒト Ｃ５ａ（以後、「Ｃ５ａ（１-７４）」と互換的に使用する）のＣ−末端領域、 すなわちアミノ酸６４-７４をコード化する合成Ｃ５ａ遺伝子部分に突然変異を 誘発させることにより生成され得る。 具体的には、本発明のヒトＣ５ａのＣ５ａ類似体またはポリペプチド誘導体は 、Ｃ５ａ（１-７４）のＣ−末端領域、 （Ｃ５ａ（１-７４）のアミノ酸６４−７４）に対する２つの修飾または突然変 異のうちの少なくとも１つまたは好ましくは両方に関して定義される。第一に、 少なくともＬｅｕ（７２）まで、すなわちＧｌｙ（７３）およびＡｒｇ（７４） 残基を除去することにより先端切除されている。第二に、最も好ましい態様にお いて、ポリペプチドのＣ−末端アミノ酸（すなわち、Ｃ−末端）がシステインで ある場合、およびＣ−末端システインのチオール（ＳＨ）基が還元形態である（ すなわち、遊離チオール基を有する）か、または遊離チオール基に自発変換し得 るかまたは容易に変換され得る形態である場合、少なくとも１個のシステインが この領域で置換されている。別の好ましい態様では、システイン残基は付加物形 態（Ｃ−末端付加残基）である。 すなわち、一実施態様では、上記ポリペプチド誘導体は、それがシステイン残 基を有し、そのＣ−末端が少なくとも２個のアミノ酸残基により先端切除されて いるという点でヒトＣ５ａの対応するＣ−末端領域とは異なるＣ−末端領域を含 む。 好ましい態様では、ほとんどのＣ−末端アミノ酸の２〜６個は、Ｃ５ａ（１- ７４）から先端切除されている。従って、本発明の好ましいポリペプチド誘導体 は、長さが６４〜７２アミノ酸、好ましくは６８〜７２アミノ酸、さらに好まし くは７０〜７２アミノ酸、および最も好ましくは７１アミノ酸である。 すなわち、Ｎ−末端６３アミノ酸領域が無傷で保たれ、唯一システインが置換 されている場合、それぞれの対応する例または態様は、例えば次のように示され 得る。すなわち、Ｃ５ａ（１-７２、Ｌｅｕ７２Ｃｙｓ）、Ｃ５ａ（１-７２、Ｔ ｈｒ１Ｍｅｔ、Ｌｅｕ７２Ｃｙｓ）、好ましくはＣ５ａ（１-７２、Ｔｈｒ１Ｇ ｌｙ，Ｌｅｕ７２Ｃｙｓ）、Ｃ５ａ（１-７１、Ｇｌｎ７１Ｃｙｓ）、Ｃ５ａ（ １-７１、Ｔｈｒ１Ｍｅｔ、Ｇｌｎ７１Ｃｙｓ）、好ましくはＣ５ａ（１-７１、 Ｔ ｈｒ１Ｇｌｙ、Ｇｌｎ７１Ｃｙｓ）、Ｃ５ａ（１-７０、Ｍｅｔ７０Ｃｙｓ）、 Ｃ５ａ（１-７０、Ｔｈｒ１Ｍｅｔ、Ｍｅｔ７０Ｃｙｓ）、好ましくはＣ５ａ（ １-７０、Ｔｈｒ１Ｇｌｙ、Ｍｅｔ７０Ｃｙｓ）、Ｃ５ａ（１-６９、Ａｓｐ６９ Ｃｙｓ）、Ｃ５ａ（１-６９、Ｔｈｒ１Ｍｅｔ、Ａｓｐ６９Ｃｙｓ）、好ましく はＣ５ａ（１-６９、Ｔｈｒ１Ｇｌｙ、Ａｓｐ６９Ｃｙｓ）、およびＣ５ａ（１- ６８、Ｌｙｓ６８Ｃｙｓ）、Ｃ５ａ（１-６８、Ｔｈｒ１Ｍｅｔ、Ｌｙｓ６８Ｃ ｙｓ）、好ましくはＣ５ａ（１-６８、Ｔｈｒ１Ｇｌｙ、Ｌｙｓ６８Ｃｙｓ）。 さらに好ましい態様において、Ｃ−末端領域は、Ｍｅｔ７０、Ｇｌｎ７１または Ｌｅｕ７２まで（これらを含む）先端切除されており、それらは先に示された態 様に相当する。 さらにＣ−末端領域はＮ−末端がＡｓｎ６４まで先端切除され得、それらは代 表的な上記の例または態様Ｃ５ａ（１-６７、Ｈｉｓ６７Ｃｙｓ）、Ｃ５ａ（１- ６７、Ｔｈｒ１Ｍｅｔ、Ｈｉｓ６７Ｃｙｓ）、好ましくはＣ５ａ（１-６７、Ｔ ｈｒ１Ｇｌｙ、Ｈｉｓ６７Ｃｙｓ）、Ｃ５ａ（１-６６、Ｓｅｒ６６Ｃｙｓ）、 Ｃ５ａ（１-６６、Ｔｈｒ１Ｍｅｔ、Ｓｅｒ６６Ｃｙｓ）、好ましくはＣ５ａ（ １-６６、Ｔｈｒ１Ｇｌｙ、Ｓｅｒ６６Ｃｙｓ）、Ｃ５ａ（１-６５、Ｉｌｅ６５ Ｃｙｓ）、Ｃ５ａ（１-６５、Ｔｈｒ１Ｍｅｔ、Ｉｌｅ６５Ｃｙｓ）、好ましく はＣ５ａ（１-６５、Ｔｈｒ１Ｇｌｙ、Ｉｌｅ６５Ｃｙｓ）、およびＣ５ａ（１- ６４、Ａｓｎ６４Ｃｙｓ）、Ｃ５ａ（１-６４、Ｔｈｒ１Ｍｅｔ、Ａｓｎ６４Ｃ ｙｓ）、好ましくはＣ５ａ（１-６４、Ｔｈｒ１Ｇｌｙ、Ａｓｎ６４Ｃｙｓ）に 対応するが、ただし生成されたヒトＣ５ａのＣ５ａ類似体またはポリペプチドは 、前述の必須アンタゴニスト特性（ＩＣ50は約２.０×１０-6モルを越えない） を呈し、実質的にアナフィラトキシンまたはアゴニスト活性（Ｃ５ａ類似体また はポリペプチド誘導体濃度が少なくとも３.０×１０-6モル以下である測定不能 なＥＣ50）をもたないものとする。当業界の熟練者であれば、ヒトＣ５ａの「類 似体」または「ポリペプチド誘導体」が、Ｃ５ａまたはＣ５ａ受容体の部位に特 異的な抗体を含まないことは理解できるはずである。 ここに記載されているヒトＣ５ａのさらに別の誘導体も、本発明の範囲内に含 まれる。これらは、Ｎ−末端６３アミノ酸領域（Ｃ５ａ（１-７４）のアミノ酸 １-６３）における修飾、例えば点突然変異、置換、付加および欠失、カーネイ ら、「プロテイン・サイエンス」２：1391−1399(1993)、およびこうして突然変 異が誘発されたＣ−末端領域におけるさらに別のアミノ酸置換を包含する。上記 と同様、生成される誘導体がＣ５ａ受容体アンタゴニストを保持し、かつ実質的 にアゴニスト活性をもたなければ、修飾のタイプおよび範囲は総じて重要ではな い。例えば、Ｃ５ａ（１-７４）のＮ−末端領域にあるＣｙｓ２７残基が例えば セリン残基に変換されることにより、再生中の折り重なりが最小限になり得る。 すなわち、Ｃ５ａ類似体誘導体は、例えばＣ５ａ（１-７１、Ｃｙｓ２７Ｓｅｒ 、Ｇｌｎ７１Ｃｙｓ）またはＣ５ａ（１-７１、Ｔｈｒ１Ｍｅｔ、Ｃｙｓ２７Ｓ ｅｒ、Ｇｌｎ７１Ｃｙｓ）、または好ましい態様では、Ｃ５ａ（１-７１、Ｔｈ ｒ１Ｇｌｙ、Ｃｙｓ２７Ｓｅｒ、Ｇｌｎ７１Ｃｙｓ）で示され得る。また、Ｎ− 末端は、置換または付加によりメチオニン残基に変えられ、様々な宿主細胞、例 えばエシェリヒア・コリにおいてＣ５ａ類似体またはポリペプチド誘導体の発現 が行われ得る。実施例１で説明され、表３で示されているところによると（実施 例３、下記）、エシェリヒア・コリで直接産生された上述のＣ５ａ類似体はその Ｎ−末端としてＭｅｔ残基を有する。さらに、Ｎ−末端としてＭｅｔ残基を有す るＣ５ａ類似体またはポリペプチド誘導体は、融合タンパク質形態で生成され、 それに続いて融合部分が開裂され得る。 Ｎ−末端置換はまた、本発明のヒトＣ５ａ類似体またはポリペプチド誘導体を 融合タンパク質として様々な宿主細胞、例えばエシェリヒア・コリで発現させ、 次いで融合タンパク質を好都合な部位で開裂することにより単離する場合に行わ れ得る。例えば、ヒドロキシルアミン結合により結合されたその融合タンパク質 相手物質からヒトＣ５ａのポリペプチド誘導体を開裂することにより、天然ヒト Ｃ５ａトレオニン（Ｔｈｒ）Ｎ−末端に対するグリシン（Ｇｌｙ）残基の置換が 行われる。置換を有するポリペプチド誘導体Ｃ５ａ（Ｔｈ１Ｇｌｙ）の好ましい 態様についでは上述されている。これらのうち、最も好ましい態様は、Ｃ５ａ（ １-７１、Ｔｈｒ１Ｇｌｙ、Ｇｌｎ７１Ｃｙｓ）またはＣ５ａ（１-７１、Ｔｈｒ １Ｇｌｙ、Ｃｙｓ２７Ｓｅｒ、Ｇｌｎ７１Ｃｙｓ）である。 Ｃ−末端領域のさらに別の修飾の一例は、Ｃ５ａ（１-７４）の６７位にある 天然ヒスチジンに対するフェニルアラニン残基の置換である。一例として、Ｃ５ ａ類似体誘導体は、Ｃ５ａ（１-７１、Ｔｈｒ１Ｍｅｔ、Ｃｙｓ２７Ｓｅｒ、Ｈ ｉｓ６７Ｐｈｅ、Ｇｌｎ７１Ｃｙｓ）と称される。すなわち、別の好ましい具体 例では、ヒトＣ５ａのポリペプチド誘導体は上述のものであり、置換Ｃ５ａ（Ｈ ｉｓ６７Ｐｈｅ）を含む。好ましいのは、Ｃ５ａ（１-７１、Ｔｈｒ１Ｇｌｙ、 Ｃｙｓ２７Ｓｅｒ、Ｈｉｓ６７Ｐｈｅ、Ｇｌｎ７１Ｃｙｓ）と称されるヒトＣ５ ａのポリペプチド誘導体である。 本発明のヒトＣ５ａのＣ５ａ類似体またはポリペプチド誘導体は、当業界では 標準的な多くの方法により製造され得る。例えば、それらは直接化学合成により 製造され得る。それらはまた、適当な宿主細胞においてポリペプチドをコード化 するＤＮＡ分子、すなわち合成遺伝子の発現により製造され得る。 すなわち、本発明のさらに別の態様によると、ヒトＣ５ａのポリペプチド誘導 体をコード化するＤＮＡ分子であって、前記誘導体が実質的にアゴニスト活性を 呈しないＣ５ａ受容体アンタゴニストであり、Ｎ−末端としてグリシン残基を有 する誘導体である、ＤＮＡ分子が提供される。その好ましい態様は、ここで述べ られている本発明のヒトＣ５ａのポリペプチド誘導体をコード化するＤＮＡ分子 である。これらの中で、好ましいのは、本発明のヒトＣ５ａのポリペプチド誘導 体をコード化するＤＮＡ分子であり、長さは６４〜７２個、好ましくは７１個の アミノ酸残基である。さらにいっそう好ましいのは、Ｃ５ａ（１-７１、Ｔｈｒ １Ｇｌｙ、Ｃｙｓ２７Ｓｅｒ、Ｇｌｎ７１Ｃｙｓ）またはＣ５ａ（１-７１、Ｔ ｈｒ１Ｇｌｙ、Ｃｙｓ２７Ｓｅｒ、Ｈｉｓ６７Ｐｈｅ、Ｇｌｎ７１Ｃｙｓ）と称 されるポリペプチド誘導体をコード化するＤＮＡ分子である。 これらのＤＮＡ分子は、ヒトＣ５ａの類似体またはポリペプチド誘導体のアミ ノ酸配列から誘導可能であり、公知技術によっても製造され得る。ＤＮＡは、ナ ラング、「テトラヘドロン」３９：３−２２(1983)およびＥＰＡ１４６７８５、 マンデッキら、「プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ イエンス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ」８２：３５４ ３−３５４７(1985)（Ｃ５ａをコード化する遺伝子の化学合成を開示している） に開示されている要領で化学的に合成され得る。ＤＮＡ分子のフラグメントは、 化学的に製造され得、次いで酵素的に結合される。「カレント・プロトコルズ・ イン・モレキュラー・バイオロジー」の第１巻、第８章、アウスベルら（編集） 、ウィリー、ニューヨーク(1990)参照。 本発明のヒトＣ５ａのＣ５ａ類似体またはポリペプチド誘導体をコード化する ＤＮＡはまた、Ｃ５ａをコード化する公知合成または天然遺伝子、例えばフェル ナンデス、マンデッキおよびデヴィッドソンにより開示されたものの突然変異誘 発により製造され得る。アウスベルら、前出、マニアチスら、「モレキュラー・ クローニング、ア・ラボラトリー・マニュアル」の第II巻、１５章、コールド・ スプリング・ハーバー、ニューヨーク(1989)、およびモリソンら、「プロシーデ ィング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイ テッド・ステーツ・オブ・アメリカ」８６：２９２−２９６(1989)参照。さらに 、ＤＮＡはＰＣＲ技術により製造され得る。ＰＣＲプロトコルズ、イニスら（編 集）、アカデミック・プレス、サンディエゴ、カリフォルニア(1990)。 本発明のＣ５ａ類似体またはポリペプチド誘導体をコード化するＤＮＡ分子は 、当業界公認の技術に従い、既知調節配列、例えばプロモーター、エンハンサー 、３'−非翻訳配列および５'翻訳配列、例えばシグナルおよび先導配列に機能し 得るように結合され、次に遺伝子を発現し得る宿主細胞へ形質転換される。次い で、形質転換された宿主細胞を、アンタゴニストコード化遺伝子の発現に適した 条件下で培養する。代表的な宿主細胞には、原核生物、例えばエシェリヒア・コ リおよびバシラス、例えばバシラス・サチリス、および真核生物、例えば糸状菌 、例えばアスペルギルス・ニガー、酵母、例えばサッカロミセス・セレヴィシエ 、ピ キア・パストリスおよびヤロヴィア・リポリティカ、バキュロウイルス／昆虫細 胞培養物（サマーズら、「ア・マニュアル・オブ・メソッズ・フォー・バキュロ ヴィールス・ベクターズ・アンド・インセクト・セル・カルチャー・プロシージ ャーズ」、テキサス・アグリカルチュラル・エクスペリメント・ステーション(1 987)）、哺乳類セルライン、および植物（バンデケルクホーヴェら、「バイオ／ テクノロジー」７：９２９−９３２(1989)）がある。 一般に、ユシェリヒア・コリにおけるＣ５ａの発現方法は、Ｃ５ａ類似体また はヒトＣ５ａのポリペプチド誘導体の遺伝子発現に適用され得る。マンデッキ、 「プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ」８２：３５４３−３５４７(1 985)、モリソンら、「プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ」８６：２ ９２−２９６(1989)、およびバウチュら、「イミュノバイオロジー」１８５：４ １−５２(1992)参照。適当な調節配列、例えばプロモーター（例、Ｔ７ポリメラ ーゼ、ＵＶ５−Ｄ、ｔｒｐまたはｌａｃ）、リボソーム結合部位、および転写停 止部位を含む適当なプラスミドベクター、例えばｐＫＫ２２３−２の選択は、当 業界熟練者のレベルの範囲内に含まれる。エシェリヒア・コリにおける発現を最 適化するためには、グオイら、「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ」１０：７ ０５５−７０７４(1982)に開示されたエシェリヒア・コリに好適なコドンを用い てＤＮＡ分子を合成すべきであり、幾つかの制限エンドヌクレアーゼ部位を考慮 すれば、合成されたＤＮＡの特性確認および恐らくはＤＮＡ配列の突然変異誘発 が容易になる。この方法を用いて、ポリペプチドの第一アミノ酸をコードするト リプレットのすぐ上流に直接タンパク質合成用のＡＴＧ開始コドンを導入するこ とにより、本発明のＣ５ａ類似体またはポリペプチド誘導体の直接発現が可能と なる。さらに、エシェリヒア・コリ株、例えばイオン(Ion)は、野生型細胞に存 在する幾つかのプロテアーゼの一つを欠いているため、タンパク質の収率を高め るという利点を呈する。フランケら、「メソッズ・イン・エンザイモロジー」１ ６ ２：６５３−６５８(1988)。 すなわち、本発明のさらに別の態様は、本発明のヒトＣ５ａのＣ５ａ類似体ま たはポリペプチド誘導体をコード化するＤＮＡ分子に機能し得るように結合され た所定の宿主において機能し得るプロモーターを含む組換えＤＮＡ−分子に関す るものである。さらに、本発明は、本発明のヒトＣ５ａのＣ５ａ類似体またはポ リペプチド誘導体をコード化する上述の組換えＤＮＡ分子を含む、所定の宿主と 適合し得る組換えプラスミドに関するものである。より広い意味で、ある態様は 、本発明のヒトＣ５ａのＣ５ａ類似体またはポリペプチド誘導体をコード化する 上述の組換えＤＮＡ分子を含む、所定の宿主と適合し得る組換えベクターに関す るものである。 また、例えばエシェリヒア・コリのような宿主におけるＣ５ａ類似体遺伝子の 発現性は、融合タンパク質形態で遺伝子を発現させることにより高められ得る。 本発明のさらに別の態様である上記融合タンパク質は、一般にＮ−末端〜Ｃ−末 端、融合相手、開裂可能なリンカー、およびそれに融合した状態で、ヒトＣ５ａ のポリペプチド誘導体という順序で構成され、この場合、上記ポリペプチド誘導 体は、実質的にアゴニスト活性を呈しないＣ５ａ受容体アンタゴニストである。 本発明の範囲内において、上記融合タンパク質のヒトＣ５ａ形成部分のポリペプ チド誘導体は、上述されている本発明の特定類似体またはポリペプチド誘導体に 制限されるわけではないが、それらは好ましい態様を形成している。反対に、こ ういった類似体または誘導体は、その類似体または誘導体が、実質的にアゴニス ト活性を呈しないヒトＣ５ａから誘導されたＣ５ａ受容体アンタゴニストであれ ば、ヒトＣ５ａの他のいかなるＣ５ａ類似体またはポリペプチド誘導体であって もよい。特に、上記融合タンパク質のさらに別の好ましい類似体または誘導体形 成部分は、本発明の類似体または誘導体にヒトＣ５ａのＮ−末端置換、例えば置 換Ｔｈｒ１ＧｌｙまたはＴｈｒ１Ｍｅｔを導入することにより誘導される。同様 に、ヒトＣ５ａのＮ−末端（Ｔｈｒ１）に置換を伴わないヒトＣ５ａの類似体ま たはポリペプチド誘導体も融合タンパク質に使用され得る。別の方法では、ヒト Ｃ５ａの上記類似体またはポリペプチド誘導体のＮ−末端に他のアミノ酸が付加 され得、付加物が得られる。好ましいのは、ヒトＣ５ａのかかる類似体またはポ リペプチド誘導体がさらに、上記で述べられているように、システイン残基を有 し、少なくとも２個のアミノ酸残基によりそのＣ−末端が先端切除されている点 が、ヒトＣ５ａの対応するＣ−末端領域とは異なるＣ−末端領域を含む融合タン パク質である。さらに好ましくは、融合タンパク質は、付加物としてまたはさら に好ましくは置換基として、Ｃ−末端としてシステイン残基を有するヒトＣ５ａ のかかる類似体またはポリペプチド誘導体を含む。 化学的および酵素的開裂連鎖を用いる上記融合タンパク質の製造方法は、当業 界では公知である。例えば、スミス、「メソッズ・イン・モレキュラー・バイオ ロジー」中、第３巻、「ニュー・プロテイン・テクニクス」、５７−７０および ７１−８８頁(1984)、およびファン・ヘーケら、「プロテイン・エクスプレッシ ョン・アンド・ピュリフィケーション」４：２６５−７４(1993)参照。一般に、 融合相手は、宿主、例えばエシェリヒア・コリにおいて高度発現される遺伝子（ またはそのフラグメント）である。エシェリヒア・コリの場合、適当な融合相手 には、内在性エシェリヒア・コリ遺伝子および合成遺伝子、例えばエシェリヒア ・コリ好適コドンを含むものがある。さらに、当業界では公知の他の融合相手、 例えばヒトカルボニックアンヒドラーゼII（詳細については実施例１６参照）も 使用され得る。原則として、融合相手のサイズが小さいとき、ヒトＣ５ａのＣ５ ａ類似体またはポリペプチド誘導体の収率が高くなる。 本発明の非常に好ましい態様では、Ｎ−末端〜Ｃ−末端、融合相手、開裂可能 なリンカーおよびそれに融合した状態でヒトＣ５ａのポリペプチド誘導体といっ た順序で構成される融合タンパク質であって、上記ポリペプチド誘導体が実質的 にアゴニスト活性を呈しないＣ５ａ受容体アンタゴニストであり、上記融合相手 が細胞、好ましくはエシェリヒア・コリ細胞において封入体の形成を指令し得る ポリペプチドである、融合タンパク質が提供される。 本出願人らは、予想外かつ驚くべきことに、本発明による融合タンパク質によ り、特に上記開裂可能なリンカーと共存する上記融合相手がヒトＣ５ａの上記ポ リペプチド誘導体のほぼアミノ酸長（または分子量）またはそれ未満のポリペプ チドである場合、特にエシェリヒア・コリにおいて封入体形成を指令し得ること を発見した。すなわち、本発明の一実施態様は、上記融合タンパク質であって、 融合相手が細胞、特にエシェリヒア・コリ細胞において封入体の形成を指令し得 るポリペプチドである、融合タンパク質に関するものである。好ましいのは、上 記開裂可能なリンカーと共存する上記融合相手がヒトＣ５ａの上記ポリペプチド 誘導体のほぼアミノ酸長（または分子量）またはそれ未満のポリペプチドである 、融合タンパク質である。すなわち、例えば上述のヒトＣ５ａの好ましいポリペ プチド誘導体が６４〜７２アミノ酸長を有する場合、上記リンカーと共存する上 記融合相手は好ましくはほぼ同じ長さ、好ましくは前記長さ未満、好ましくは４ ２〜６１アミノ酸またはそれ未満の長さを有する。上記融合相手自体は好ましく は４０〜５３アミノ酸長またはそれ未満の長さを有する。好ましくは、融合相手 は、ヒトインターロイキン−１β（ＩＬ−１βまたはＩＬ−ＩＢとも称する）の Ｎ−末端フラグメントまたはその突然変異体を含む。熟練者が認めるところによ ると、点突然変異、例えばヒトＩＬ−１β（Ｃｙｓ９Ｓｅｒ）のような単一点突 然変異は、ヒト１Ｌ−１βのＮ−末端フラグメントにおいて誘発され得、その結 果、封入体形成を指令し得るさらに好ましい融合相手が生成される。例えば、上 記融合相手は、上記で述べたところによると、ヒトＩＬ−１β（ディナレロ、「 ブラッド」７７：１６２７−５２(1991)）またはその突然変異体のアミノ酸残基 １〜４７を含む。所望によりさらに、上記融合相手は、例えばヒトＩＬ−１βの 上記Ｎ−末端フラグメントに対しＣ−末端に位置する３〜６個のアミノ酸長（デ ィナレロ、前出）を有するヒトインターロイキン１受容体アンタゴニスト（ＩＬ −１ＲＡとも示す）の短いフラグメントを含む。当業界の熟練者であれば、標準 的技術（例、融合相手のサイズ（長さ）を系統的に変えることによりＣ５ａ類似 体融合タンパク質の発現力価を測定することによる）に従い融合相手の適当なサ イズを決定することができる。 エシェリヒア・コリにおける発現に関して好ましい態様では、融合相手は、ハ イブリッドタンパク質ヒトインターロイキン１ベータおよびインターロイキン１ 受容体アンタゴニストの５３アミノ酸フラグメントをコード化する１５９−ヌク レオチドＤＮＡによりコード化され、（ディナレロ、「ブラッド」７７：１６２ ７−５２(1991)）、そのＤＮＡはエシェリヒア・コリ好適コドンを含む。かかる 融合相手は、例えばＮ−末端〜Ｃ−末端、上述されているヒトＩＬ−１βまたは その突然変異体のアミノ酸残基１〜４７およびヒトインターロイキン１受容体ア ンタゴニスト（ディナレロ、上記参照）のアミノ酸残基５２〜５７という順序で 構成される。また、エシェリヒア・コリにおける発現に融合相手として好ましい のは、ヒトインターロイキン１ベータおよびインターロイキン１受容体アンタゴ ニストのハイブリッドタンパク質から成る５０アミノ酸フラグメント（エシェリ ヒア・コリ好適コドンを含む１５０ヌクレオチドＤＮＡによりコード化される） である。かかる融合相手は例えば、Ｎ−末端〜Ｃ−末端、上述のヒトＩＬ−１β またはその突然変異体のアミノ酸残基１〜４７およびヒトインターロイキン１受 容体アンタゴニスト（ディナレロ、上記参照）のアミノ酸５２〜５４という順序 で構成される。 好ましい態様において、本発明の融合タンパク質の開裂可能なリンカーは、ヒ ドロキシルアミン感受性部位（Ａｓｎ−Ｇｌｙ）（ヒドロキシルアミン開裂部位 とも呼ばれる）（例、キャレイ、Ｅ.、クレイトン、Ｔ.Ｅ．（編）：「プロテイ ン・ストラクチャー、ア・プラクティカル・アプローチ」中、ＩＲプレス、オク スフォード、イギリス国(1989)）を含む。所望によりさらに、かかるリンカーは 、上記ヒドロキシルアミン開裂部位に対してＮ−末端に位置する、当技術分野（ 例、ファン・ヘーケら、「プロテイン・エクスプレッション・アンド・ピュリフ ィケーション」４：２６５−２７４(1993)）で公知の、アミノ酸配列-Val-Asp-A sp-Asp-Asp-Lys-（配列番号６８）のエンテロキナーゼプロテアーゼ開裂部位を 含み得、この場合上記リンカーは２４ヌクレオチドＤＮＡフラグメントによりコ ード化される。エシェリヒア・コリで発現させる場合、上記リンカーは、エシェ リヒ ア・コリ好適コドンを含むＤＮＡ分子によりコード化される。熟練者であれば気 付くように、上記リンカーと共存する上記融合相手の全長（または分子量）が生 成されるヒトＣ５ａのポリペプチド誘導体の長さ（または分子量）とほぼ同じま たはそれ未満である場合、上述の開裂部位（複数も可）を含むリンカーに追加の アミノ酸残基（複数も可）を含ませることにより、開裂が容易になり得る。例え ば融合相手および上記開裂部位（複数も可）のいずれかの間に位置する追加的な １、２または３またはそれ以上のアミノ酸残基（複数も可）が存在し得る。別法 として、複数の開裂部位が存在する場合、追加のアミノ酸残基（複数も可）は上 記開裂部位の各２個間に存在し得る。 すなわち、好ましい態様において、本発明による融合タンパク質は、Ｎ−末端 〜Ｃ−末端、上述のヒトＩＬ−１βまたはその突然変異体のアミノ酸残基１〜４ ７、およびヒトＩＬ−１ＲＡのアミノ酸残基５２〜５４、アミノ酸残基-Val-Asp -Asp-Asp-Asp-Lys-Asn-Gly-（配列番号６９）を含む開裂可能なリンカー配列、 および上記ヒトＣ５ａのポリペプチド誘導体という順序で構成され、ここで上記 開裂可能リンカーのＣ−末端アミノ酸残基Ｇｌｙは上記ポリペプチド誘導体にお けるヒトＣ５ａのＮ−末端アミノ酸残基Ｔｈｒに対する置換基である。この明細 書において、好ましいポリペプチド誘導体は、上記のもの、例えばアミノ酸残基 の長さが６４〜７２、好ましくは７１である本発明のポリペプチド誘導体である 。上記誘導体の好ましい例は、Ｃ５ａ（１-７１、Ｔｈｒ１ＧｌｙＮＣｙｓ２７ Ｓｅｒ、Ｇｌｎ７１Ｃｙｓ）またはＣ５ａ（１-７１、Ｔｈｒ１Ｇｌｙ、Ｃｙｓ ２７Ｓｅｒ、Ｈｕｓ６７Ｐｈｅ、Ｇｌｎ７１Ｃｙｓ）である。 本発明のさらに別の態様は、好ましい態様として上述した融合タンパク質をコ ード化するＤＮＡ分子に関するものである。例えば、好ましいのは、上述の融合 タンパク質をコード化するＤＮＡ分子であり、この場合、上記融合相手は上述の ヒトＩＬ−１βまたはその突然変異体のアミノ酸残基１〜４７、およびヒトＩＬ −１ＲＡのアミノ酸残基５２〜５７により構成されるか、または上記融合相手は 上述のヒトＩＬ−１βまたはその突然変異体のアミノ酸残基１〜４７、およびヒ トＩＬ−１ＲＡのアミノ酸残基５２〜５４により構成される。特に好ましい例は 、Ｎ−末端〜Ｃ−末端、上述されたヒトＩＬ−１βまたはその突然変異体のアミ ノ酸残基１〜４７、ヒトＩＬ−１ＲＡのアミノ酸残基５２〜５４、アミノ酸配列 -Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Asn-Gly-を含む開裂可能なリンカー、および請求項 １記載のポリペプチド誘導体という順序で構成される、融合タンパク質をコード 化するＤＮＡ分子であり、ここで上記リンカーのＣ−末端残基Ｇｌｙは上記ポリ ペプチド誘導体におけるヒトＣ５ａのＮ−末端アミノ酸残基Ｔｈｒに対する置換 基である。 本発明の別の態様は、上記の本発明による融合タンパク質をコード化するＤＮ Ａ分子に機能し得るように結合された所定の宿主において機能し得るプロモータ ーを含む、組換えＤＮＡ分子に関するものである。別の態様は、組換えプラスミ ドまたは、より広い意味で組換えベクターに関するものであり、それぞれ所定の 宿主と適合し得、上記の組換えＤＮＡ分子を含む。上記組換えＤＮＡ分子、プラ スミドまたはベクターそれぞれの好ましい具体例は、上記ＤＮＡ分子および／ま たは上記融合タンパク質に関連して上記で記載されたものである。 上記ＤＮＡ分子、組換えＤＮＡ、プラスミドまたはベクターのそれぞれの製造 方法は、上記方法と同様である。 一般に、Ｃ５ａ類似体コード化またはポリペプチド誘導体コード化合成遺伝子 は、公知方法に従うことにより酵母において発現され得る。例えば、ロマノスら 、「イースト」８：４２３−４８８(1992)、ゲーデル（編）、「メソッズ・イン ・エンザイモロジー」６節、１８５：２３１−４８４(1990)、デヴィドウら、前 出、 およびＵＳ４７７５６２２参照。酵母での発現を最適化するため、特に内在性Ｋ ＥＸ２プロテアーゼに関する標的であるＡｒｇ−Ａｒｇ対合を回避するために、 ＤＮＡ分子は酵母好適コドンを用いて製造されるべきである。Ｎ−末端として、 メチオニンとは対立するものとしてグルタミンを使用すると、シグナル配列、例 えばアルファ因子シグナル配列からのタンパク質分解的開裂が容易になる。さら に好ましくは、本Ｃ５ａ受容体アンタゴニストの様々な態様の潜在的グリコシル 化部位、例えば６４位のアスパラギンを排除する。 哺乳類細胞における本発明のＣ５ａ類似体-またはポリペプチド誘導体-コード 化遺伝子の発現は、公知方法に従い遂行され得る。マニアティスら、前述の「哺 乳類細胞におけるクローン化遺伝子の発現」、第１６章参照。ヒト細胞における 代表的発現方法は、ベルグら、「バイオ・テクニクス」１４（６）：９７２−９ ７８（１９９３）に開示されている。適当なヒト細胞には、公的に入手できるセ ルライン、例えばＨｅＬＡ Ｓ３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２.２）およびＨＥＫ２９３ （ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５７３）がある。ＣＨＯ細胞における発現は、例えばアッ セルバーグスら、「フィブリノリシス」７：１−１４(1993)に開示されている。 適当なハムスターセルラインには、ＣＨＯ-Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１）、ＢＨ Ｋ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ６２８１）、ＢＨＫ-２１（ＡＴＣＣ６２８１、ＣＣＬ１０ およびＣＲＬ８５４４）がある。代表的なサル細胞は、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ Ｃ ＣＬ７０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５０）およびＶＥＲＯ細胞（Ａ ＴＣＣ ＣＣＬ８１）である。適当なマウスセルラインは、Ｃ１２７（ＡＴＣＣ １８０４）である。好ましいセルラインは、ウリアウブら、「プロシーディング ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステ ーツ・オブ・アメリカ」７７：４２１６−４２２０(1980)に開示されたＤＨＦＲ −マイナスＣＨＯラインである。血清依存性セルラインの方がさらに好ましい。 クラノら、「バイオ／テクノロジー」１６：２４５−２５８(1990)参照。哺乳類宿 主では、Ｃ５ａ類似体のグリコシル化または非グリコシル化形態が製造され得る 。 すなわち、本発明のさらに別の態様は、全て上記に記載された、ヒトＣ５ａの Ｃ５ａ類似体またはポリペプチド誘導体をコード化するかまたは融合タンパク質 をコード化するＤＮＡ分子を含む、組換えＤＮＡ分子により安定して形質転換さ れた組換え宿主に関するものである。好ましくは、上記組換え宿主は、細菌、真 菌、昆虫、哺乳類および植物細胞から成る群から選択され、それらは熟練者の知 るところである。いずれの場合でも組換え宿主として特に好ましいのはエシェリ ヒア・コリである。 好ましくは好都合な１段階方法を用いることにより、形質転換エシェリヒア・ コリ細胞から単離されたヒトＣ５ａのＣ５ａ類似体またはポリペプチド誘導体が 復元され、Ｃ−末端システインが還元形態である、すなわち遊離チオール基を含 む場合の生物活性を呈する。本出願人らは、予想外にも、還元剤対酸化剤のモル 比が少なくとも約１００：１〜約５００：１である酸化還元対で変性の起こった Ｃ５ａ類似体を処理することにより、還元形態のＣ−末端システインを有する生 物活性Ｃ５ａ類似体が得られることを発見した。この割合は、既知割合よりも約 １０倍〜約５０倍大きい（１０：１という還元スルフヒドリル対酸化スルフヒド リル化合物の好ましい割合は、ビルダーら、ＵＳ４６２０９４８の１７欄４３− ４５行で開示されている）。この方法に従い、形質転換エシェリヒア・コリ細胞 を、Ｃ５ａ類似体の生成を誘発するのに十分な条件下で培養後、変性および可溶 化剤、例えば６ＭグアニジンＨＣ１と混合すると、変性Ｃ５ａ類似体が生成され 、所望により公知技術、例えば音波処理、フレンチ・プレスまたはダイノミルに よりさらに粉砕してもよい。次いで、変性を起こしたＣ５ａ類似体を含む上記要 領で混合または粉砕された細胞を、適当な条件下で還元剤／酸化剤の重量による モル比が少なくとも約１００：１〜約５００：１の酸化還元対と混合すると、復 元された生物活性Ｃ５ａ類似体が生成される。すなわち、本発明の別の好ましい 態様は、ヒトＣ５ａの生物活性ポリペプチド誘導体の製造方法であって、上記誘 導体が実質的にアゴニスト活性を呈しないＣ５ａ受容体アンタゴニストであり、 上記誘導体がＮ−末端としてグリシン残基を有するものであり、 （１）ＤＮＡ分子の発現誘発に適した条件下で上記ポリペプチド誘導体をコード 化するＤＮＡ分子により安定して形質転換されたエシェリヒア・コリ細胞を培養 し、 （２）上記要領で培養された細胞を変性および可溶化剤と接触させることにより 変性形態の上記ポリペプチド誘導体を製造し、そして （３）上記要領で変性を起こしたポリペプチド誘導体を、適当な条件下で還元剤 対酸化剤のモル比が重量にして少なくとも約１００：１である還元剤および酸化 剤を含む溶液と混合することにより、生物活性形態のポリペプチド誘導体を製造 する という段階を含む方法に関するものである。 適当な酸化還元対には、システイン／シスチンおよび還元グルタチオン／酸化 グルタチオンが含まれる。当業界の他の熟練者であっても、他の酸化還元対を使 用し得ることは認めるところである。グルタチオン酸化還元対が好ましい。適当 な条件には、６.５〜７.５、好ましくは７.４のｐＨが含まれる。タンパク質の 収率を最大にするのに十分な時間混合物を室温で放置する。好ましい時間は、約 １／２時間〜約４時間である。すなわち、この方法により、細菌細胞から屈折力 のある封入体（すなわち、発現されたタンパク質の不溶性塊）を分離し、次いで Ｃ−末端システインのチオール基を還元する必要が排除される。 融合タンパク質としてヒトＣ５ａのＣ５ａ類似体またはポリペプチド誘導体を 発現するのが望ましいことであり得るため、この発明のさらに別の態様は、上述 の方法であって、上記ＤＮＡ分子が融合タンパク質形態でポリペプチド誘導体を コード化する方法に関するものである。好ましくは、上記方法は、さらに上記混 合段階の前に、発現された融合タンパク質を開裂する段階を含む。このため、ヒ トＣ５ａの生物活性Ｃ５ａ類似体またはポリペプチド誘導体の製造方法であって 、上記類似体が実質的にアゴニスト活性を呈しないＣ５ａ受容体アンタゴニスト であり、 （１）上記ポリペプチド誘導体Ｃ５ａ類似体の融合タンパク質形態をコード化す る組換えＤＮＡ分子により安定して形質転換された宿主細胞を培養し、ただし上 記培養は上記融合タンパク質の発現誘発に適した条件下で行われるものとし、 （２）上記要領で培養された宿主細胞から融合タンパク質を分離し、 （３）上記要領で分離された融合タンパク質を開裂することにより、ヒトＣ５ａ のＣ５ａ類似体またはポリペプチド誘導体が得られる という段階を含む方法が提供される。 融合タンバク質および上記融合タンパク質に含まれるヒトＣ５ａのポリペプチ ド誘導体の好ましい態様は、それぞれ上記の融合タンパク質またはポリペプチド 誘導体である。好ましいポリペプチド誘導体は、アミノ酸残基の長さが６４〜７ ２であり、例えばＣ５ａ（１-７１、Ｔｈｒ１Ｇｌｙ、Ｃｙｓ２７Ｓｅｒ、Ｇｌ ｎ７１Ｃｙｓ）またはＣ５ａ（１-７１、Ｔｈｒ１Ｇｌｙ、Ｃｙｓ２７Ｓｅｒ、 Ｈｉｓ６７Ｐｈｅ、Ｇｌｎ７１Ｃｙｓ）である。上記方法のさらに別の反応条件 は、上記の通りである。 Ｃ５ａ類似体またはそのポリペプチド誘導体が封入体として融合タンパク質形 態で発現される態様は、ヒトＣ５ａの生物活性ポリペプチド誘導体の製造方法で あって、上記誘導体が実質的にアゴニスト活性を呈しないＣ５ａ受容体アンタゴ ニストであり、 （１）上記ポリペプチド誘導体Ｃ５ａ類似体を融合タンパク質形態でコード化す る組換えＤＮＡ分子により安定して形質転換された宿主細胞を培養し、ただし上 記培養は封入体形態での上記融合タンパク質の発現誘発に適した条件下で行われ るものとし、 （２）上記要領で培養された宿主細胞から融合タンパク質を含む封入体を分離し 、 （３）上記要領で分離された封入体を変性および可溶化剤と接触させて、変性形 態の融合タンパク質を生成し、 （４）上記要領で分離された融合タンパク質を開裂することにより、ヒトＣ５ａ のポリペプチド誘導体が得られ、そして （５）上記要領で開裂された融合タンパク質を、適当な条件下、還元剤対酸化剤 のモル重量比が少なくとも約１００：１である還元剤および酸化剤を含む溶液と 混合することにより、生物活性形態のポリペプチド誘導体が生成される という段階から成る方法（ただし、段階３および４は同時または連続して行われ る）に関するものである。 一般に、ＤＮＡ分子、融合タンパク質、ポリペプチド誘導体および宿主細胞の 好ましい具体例は、上述のものである。すなわち、好ましくは上記宿主細胞は、 エシェリヒア・コリ細胞である。好ましい具体例において、上記組換えＤＮＡ分 子は、Ｎ−末端〜Ｃ−末端、融合相手、開裂可能なリンカーおよび、それに融合 して、ヒトＣ５ａのポリペプチド誘導体という順序で構成され、上記ポリペプチ ド誘導体が実質的にはアゴニスト活性を呈しないＣ５ａ受容体アンタゴニストで ある、融合タンパク質をコード化する。上記で述べたところによると、上記誘導 体は好ましくは、システイン残基を有し、Ｃ−末端が少なくとも２個のアミノ酸 残基により先端切除されている点で、ヒトＣ５ａの対応するＣ−末端領域とは異 なるＣ−末端領域を含む。特に、上記誘導体はＣ−末端としてシステイン残基を 有する。非常に好ましい具体例では、上記誘導体はＮ−末端としてグリシン残基 を有する。 この方法を効果的に遂行させるために、上記開裂可能リンカーと共存する上記 融合相手は、好ましくはヒトＣ５ａの上記ポリペプチド誘導体とほぼ同じアミノ 酸長（または分子量）のポリペプチドである。特に、上記融合相手は、上述のと おりヒトＩＬ−１βのＮ−末端フラグメントを含む。例えば、上記融合相手は、 上述のヒトＩＬ−１βまたはその突然変異体のアミノ酸残基１〜４７、およびヒ トＩＬ−１ＲＡのアミノ酸残基５２〜５７により構成されるか、または上記融合 相手は、上述のヒトＩＬ−１βまたはその突然変異体のアミノ酸残基１〜４７、 およびヒトＩＬ−１ＲＡのアミノ酸残基５２〜５４により構成される。好ましい 具体例では、上記リンカーはヒドロキシルアミン開裂部位を含む。さらに具体的 には、上記リンカーは、Ｎ−末端〜Ｃ−末端、エンテロキナーゼプロテアーゼ開 裂部位およびヒドロキシルアミン開裂部位という順序で構成される。 このため、かかる融合タンパク質は好ましくは、Ｎ−末端〜Ｃ−末端、上述の ヒトＩＬ−１βまたはその突然変異体のアミノ酸残基１〜４７、ヒトＩＬ−１Ｒ Ａのアミノ酸残基５２〜５４、アミノ酸配列-Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Asn-Gly -（配列番号６９）を含む開裂可能なリンカー、および請求項１記載のポリペプ チド誘導体という順序で構成され、ここで上記リンカーのＣ−末端残基Ｇｌｙは 、上記ポリペプチド誘導体におけるヒトＣ５ａのＮ−末端アミノ酸残基Ｔｈｒに 対する置換基である。この誘導体は６４〜７２アミノ酸残基長であり得るか、ま たは上述の別の好ましい長さを有し得る。この明細書における好ましいポリペプ チド誘導体に関する例は、Ｃ５ａ（１-７１、Ｔｈｒ１Ｇｌｙ、Ｃｙｓ２７Ｓｅ ｒ、Ｇｌｎ７１Ｃｙｓ）またはＣ５ａ（１-７１、Ｔｈｒ１Ｇｌｙ、Ｃｙｓ２７ Ｓｅｒ、Ｈｉｓ６７Ｐｈｅ、Ｇｌｎ７１Ｃｙｓ）である。 特に、生成した融合タンパク質を含む封入体は、低速遠心分離（例、約３００ ０ｘｇ）を用いる細胞溶解後定量的に採取され得るため、比較的高濃度のフラク ションが得られ、次いでこれは適当に可溶化され得る。この方法は、発酵槽から 採取された細胞の単位重量当たりの体積が２０倍減少したものを用いるという利 点を呈する。 その好ましい態様において、上記混合は上記要領で行われ、特にｐＨは約６. ５〜約７.５である。好ましくは、上記混合は約１／２時間〜約４時間の期間行 われる。酸化還元対は好ましくは、上記の通り、還元グルタチオン／酸化グルタ チオンである。 別法として、ヒトＣ５ａのＣ５ａ類似体またはポリペプチド誘導体は、例えば 、標準的再生および精製計画、例えばビルダーら、ＵＳ４６２０９４８に開示さ れたものに従って復元され得る。これらの方法に従うと、Ｃ−末端システインは 付加物形態、例えばｃｙｓ−ｃｙｓまたはｃｙｓ−グルタチオンとなる。従って 、遊離チオール基を得るためには付加物をさらに還元しなければならない。本出 願人らは、ヒトＣ５ａの開示されたＣ５ａ類似体またはポリペプチド誘導体の付 加物が、ここに記載されているとおり実質的にはアゴニスト活性を呈しないＣ５ ａ受容体アンタゴニストとしても機能すること、そのため本発明の範囲内に含ま れ ることを発見した。しかしながら、これらの標準復元技術を使用する場合、好ま しい具体例を生成させるためには、さらに還元することが必要である。 復元後、ヒトＣ５ａのＣ５ａ類似体またはポリペプチド誘導体は、所望の程度 に精製され得る。代表的精製案には、限外濾過、ダイアフィルトレーション、ゲ ル電気泳動、クロマトグラフィー方法、例えばイオン交換クロマトグラフィー、 サイズ排除クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、セファデックスによ る処理、透析、アフィニティー・クロマトグラフィーなどがある。当業界の熟練 者であれば、精製案の組み合わせが使用され得ることは認めるはずである。 Ｃ−末端システイン残基を有する本発明のヒトＣ５ａのＣ５ａ類似体またはポ リペプチド誘導体は、標準的技術に従い酸化され二量体を形成し得る。すなわち 、さらに別の態様は、ヒトＣ５ａの第一および第二ポリペプチド誘導体を含む二 量体であって、上記誘導体の各々が実質的にはアゴニスト活性を呈しないＣ５ａ 受容体アンタゴニストであり、Ｃ−末端システイン残基を有し、上記第一および 第二誘導体のシステイン残基がジスルフィド結合を介して結合されており、ヒト Ｃ５ａの上記第一および第二ポリペプチド誘導体が同一または異なり得、さらに ヒトＣ５ａの上記第一および第二ポリペプチド誘導体の少なくとも一方が上記の 、すなわちＮ−末端としてグリシン残基を有するヒトＣ５ａのポリペプチド誘導 体である、二量体に関するものである。好ましくは、かかる二量体では、上記第 一および上記第二誘導体の各々のＣ−末端領域は、少なくとも２個のアミノ酸残 基により先端が切除されている点で、ヒトＣ５ａの対応するＣ−末端領域とは異 なる。かかる二量体における好ましい具体例では、上記第一および第二誘導体の 各々がヒトＣ５ａ誘導体Ｃ５ａ（１-７１、Ｔｈｒ１Ｇｌｙ、Ｃｙｓ２７Ｓｅｒ 、Ｇｌｎ７１Ｃｙｓ）である。二量体を製造するため、各単量体（類似体）のＣ −末端システインのチオール（−ＳＨ）基を酸化すると、ジスルフィド結合が生 成される。ホモニ量体およびヘテロニ量体は「二量体」の語に包含される。 本発明の別の態様は、ヒトを含む哺乳類の治療または予防処置で使用される上 記の本発明のヒトＣ５ａのポリペプチド誘導体またはその二量体に関するもので ある。さらに別の態様は、ヒトを含む哺乳類におけるＣ５ａ仲介疾患または炎症 状態を処置するための医薬組成物の製造を目的とする上記の本発明のヒトＣ５ａ のポリペプチド誘導体またはその二量体の使用に関するものである。 別の態様は、上記本発明のヒトＣ５ａのポリペプチド誘導体またはその二量体 の治療有効量および所望により医薬的に許容し得る担体を含む、ヒトを含む哺乳 類におけるＣ５ａ仲介疾患または炎症状態の処置に有用な医薬組成物に関するも のである。この明細書では、好ましいポリペプチド誘導体または二量体は、本発 明による好ましい化合物として上述されているもの（上記参照）である。例えば 、医薬組成物は、好ましくはヒトＣ５ａのポリペプチド誘導体、すなわちＣ５ａ （１-７１、Ｔｈｒ１Ｇｌｙ、Ｃｙｓ２７Ｓｅｒ、Ｇｌｎ７１Ｃｙｓ）または上 記誘導体を含むその二量体を含む。 さらに別の態様は、哺乳類におけるＣ５ａ仲介疾患または炎症状態の処置方法 であって、処置を必要とするヒトを含む哺乳類に上述の医薬組成物を投与する段 階を含む方法に関するものである。さらに別の態様は、ヒトを含む哺乳類におい てＣ５ａ仲介炎症を低減化させる方法であって、炎症の低減化に十分な程度補体 活性化−誘発または悪化事象に対して一度に上記哺乳類に上述した医薬組成物を 投与する段階を含む方法に関するものである。 特に、本発明のヒトＣ５ａのＣ５ａ類似体またはポリペプチド誘導体およびそ の二量体は、補体系、より具体的にはＣ５ａおよびアナフィラトキシンが関与す る有害な状態または疾患の処置および／または予防に有用である。それらは、Ｃ ５ａ伝達組織破壊および死の危険に瀕している哺乳類患者、特にヒトに投与され ると治療上非常に有効である。一般に、これらの状態または疾患は、例えばＣ５ ａがタンパク質分解的に血清で生成される炎症疾患である。ヒトＣ５ａのＣ５ａ 類似体またはポリペプチド誘導体またはその二量体に反応する代表的な病状には 、肺炎、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、特発性肺繊維症、肺炎症または傷害 、慢性進行性肺膿疱異常性(discystic)繊維症、綿肺症、石綿誘発性炎症、心筋 梗塞、心筋梗塞後炎症、虚血性心損傷、肝硬変、原発性胆汁性肝硬変炎症、慢性 肝 炎、膵炎、出血性膵炎、炎症性腸疾患、大腸炎、虚血性脳損傷、脳炎、髄膜炎に おける脳神経損傷、髄膜炎、ブドウ膜炎、パーチャー網膜症、免疫複合体仲介糸 球体腎炎、腎皮質壊死、痛風、脈管炎、血清病、血管浮腫、重症筋無力症、全身 性エリテマトーデス、リウマチ様関節炎、水疱性皮膚疾患、過敏症、乾癬、エン ドトキシンショック、敗血症、重度外傷および火傷がある。それらはまた、移植 拒絶に苦しむ患者、免疫抑制療法または大量輸血を受けている患者、医療装置に 曝されている患者、血液透析およびロイコフェレシス(leukopheresis)後に肺機 能不全を経験している患者を処置するため治療的に使用され得る。 さらにこれらの類似体、ポリペプチド誘導体およびその二量体は、特に再潅流 、例えば虚血後の再潅流、および医療装置との循環的接触により誘発される状態 における予防薬として、並びに移植拒絶を阻止するための治療用途を有する。こ の場合、Ｃ５ａ類似体または誘導体は、好適には炎症を誘発または既存の炎症状 態を悪化させることが知られている事象の前または実質的に同時に投与される。 本発明のＣ５ａ類似体、ポリペプチド誘導体およびその二量体は、所望に応じ て慣用的非毒性の医薬的に許容し得る担体、アジュバントおよび賦形剤を含む単 位用量製剤で、タンパク質性医薬にとって治療上有効な経路、例えば非経口、鼻 腔内、直腸または口内経路により投与され得る。「非経口」の語は、例えば皮下 、静脈内、筋肉内、胸骨内、動脈内注射および注入技術といったデリバリー方法 を包含する。 本発明のＣ５ａ類似体またはポリペプチド誘導体（および二量体）の用量は、 個々の患者にとって望ましい治療応答が得られるように変えられ得る。例えば、 これは、特定アンタゴニストの活性、投与方法、処置される病状の重篤度、およ び患者の健康状態により異なる。所定の状態および患者に対する治療有効用量の 決定は、当業界の熟練者レベルの範囲内である。一般に、１日に体重１キログラ ム当たり約１μｇ〜１００ｍｇの用量レベルが哺乳類宿主に投与される。好まし い用量レベルは、１日に体重１ｋg当たり約０.１ｍｇ〜約２０ｍｇの範囲である 。Ｃ５ａ類似体は、長期間にわたり１回連続用量として患者に投与される。し かしながら、総有効用量は、所望ならば、多用量、例えば１日に２〜４回の個別 用量に分割され得る。 本発明のＣ５ａ類似体またはポリペプチド誘導体（および二量体）は、公知の 医薬的に許容し得る成分および製造方法の両方を用いて組成物に製剤化され得る 。例えば、レミントンら、「ファーマシューティカル・サイエンシーズ」第１５ 版、マック・パブ．（イーストン、ペンシルバニア）(1975)参照。非経口投与に 適した組成物は、医薬的に許容し得る滅菌水性または非水性溶液、分散液、懸濁 液またはエマルジョン、並びに使用直前に滅菌注射可能溶液または分散液に再構 成される滅菌粉末を含む。適当な水性および非水性担体、希釈剤、溶媒または賦 形剤の代表的な例としては、水、エタノール、ポリオール類、例えばグリセリン 、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、およびそれらの適当な混合 物、植物油、例えばオリーブ油、および注射可能有機エステル類、例えばエチル オレエートがある。流動性は、コーティング材料、例えばレシチンの使用、要求 される粒子サイズの維持（分散液の場合）、および界面活性剤を含む様々な手段 により維持され得る。 これらの組成物はまた、補助薬剤、例えば保存剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、 抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールおよび ソルビン酸、等張剤、例えば糖類、塩化ナトリウム、または吸収遅延剤、例えば モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含み得る。Ｃ５ａ受容体アンタ ゴニストは、遅効または持続放出または標的デリバリー系、例えばポリマーマト リックス、リポソームおよび微小球に組み込まれ得る。 注射可能製剤は、保菌性フィルターに通す濾過を含む多数の手段により、また は使用直前に滅菌水または他の無菌注射可能媒質に溶解または分散され得る滅菌 固体組成物形態で滅菌剤を混入することにより消毒され得る。 懸濁液は、Ｃ５ａ類似体、ポリペプチド誘導体またはその二量体および他の有 効成分（あれば）に加えて、懸濁剤、例えばエトキシル化イソステアリルアルコ ール類、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル類、微晶性 セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天-寒天、トラガカン トゴムおよびそれらの混合物を含み得る。 直腸または膣投与用組成物は、通常本発明のポリペプチドを適当な非刺激性賦 形剤または担体、例えばココア脂、ポリエチレングリコールまたは坐薬鑞など室 温では固体であるが体温では液体であるため、直腸または膣腔で溶けて受容体ア ンタゴニストを放出するものと混合することにより製造され得る坐薬形態である 。 眼病用製剤、眼用軟膏、散剤および溶液もまた、ここに開示された発明の範囲 内に含まれる。 本発明のさらに別の態様は、本発明のポリペプチド誘導体または二量体に特異 的な抗体であって、実質的にはヒトＣ５ａとの交差反応性を呈しない抗体に関す るものである。この抗体はポリクローナルまたはモノクローナルであり得る。好 ましい抗体は、上述されている本発明のヒトＣ５ａの好ましいポリペプチド誘導 体または二量体に特異的なものである。例えば、本発明の好ましい抗体は、ヒト Ｃ５ａのポリペプチド誘導体、すなわちＣ５ａ（１-７１、Ｔｈｒ１Ｇｌｙ、Ｃ ｙｓ２７Ｓｅｒ、Ｇｌｎ７１Ｃｙｓ）に特異的である。別の好ましい抗体は、本 発明の二量体に特異的であり、上記の第一および第二誘導体の各々はヒトＣ５ａ 誘導体Ｃ５ａ（１-７１、Ｔｈｒ１Ｇｌｙ、Ｃｙｓ２７Ｓｅｒ、Ｇｌｎ７１Ｃｙ ｓ）である。 本発明のヒトＣ５ａのＣ５ａ類似体またはポリペプチド誘導体および二量体に 特異的なポリクローナルおよびモノクローナル抗体は、標準技術に従い製造され 得る。ポリクローナル抗体は、例えば、動物、例えばウサギ、ヤギ、ヒツジまた はウマにＣ５ａ類似体-またはポリペプチド誘導体-または二量体-担体タンパク 質コンジュゲートを注射することにより産生され、それぞれ抗Ｃ５ａ類似体また は抗ポリペプチド誘導体または抗二量体抗体が産生される。例えばＡ．ジョーン ストーンおよびＲ．ソーペ、「イミュノケミストリー・イン・プラクティス」、 ブラックウェル・サイエンティフィック・パブリケーションズ、オクスフォード (1982)参照。本発明のＣ５ａ類似体、ポリペプチド誘導体または二量体に特異的 なモノクローナル抗体は、コーラーおよびミルスタイン、「ネイチャー」２５６ ：４９５−９７(1975)に開示された技術に従い製造され得る。またピーターズ、 Ｊ.Ｈ.、(編)「モノクローナル・アンティボディーズ」、スプリンガー・フェル ラーク・ベルリン、ハイデルベルグ、ドイツ国(1992)参照。Ｃ５ａ類似体、ポリ ペプチド誘導体または二量体に特異的なポリクローナルおよびモノクローナル抗 体は、実質的にはヒトＣ５ａとの交差反応性を呈しない。「実質的には交差反応 性(を呈しない)」という語は、抗Ｃ５ａ類似体、抗ポリペプチド誘導体または抗 二量体抗体が呈するヒトＣ５ａとの交差反応性が非常に低い(極僅かである)ため 、生物試料における本発明Ｃ５ａ類似体またはポリペプチド誘導体または二量体 に関する検定で内生Ｃ５ａによる干渉が全く検出され得ないことを意味する。 本発明のＣ５ａ類似体−特異的、ポリペプチド誘導体−特異的または二量体− 特異的抗体は、以前にＣ５ａ類似体、ポリペプチド誘導体または二量体をそれぞ れ投与された対象における、循環している同物質の検出および定量、並びに循環 しているＣ５ａ類似体の活性の調節、例えば中和に特に有用である。すなわち、 本発明の別の態様は、活性調節を必要とする対象において本発明のヒトＣ５ａの ポリペプチド誘導体または二量体の活性を調節する方法であって、対象に本発明 の抗体を好ましくは医薬組成物形態（下記参照）で投与する段階を含む方法に関 するものである。本発明のさらに別の態様は、活性中和を必要とする対象におい て本発明のヒトＣ５ａのポリペプチド誘導体または二量体の活性を中和する方法 であって、対象に本発明の抗体を好ましくは医薬組成物形態（下記参照）で投与 する段階を含む方法に関するものである。 本発明のヒトＣ５ａの循環しているＣ５ａ類似体またはポリペプチド誘導体ま たは二量体は、抗体を利用する標準免疫学的技術に従い検出され得る。一般に、 流体または組織試料を対象から採取し、次いで類似体および抗体間に検出可能な 免疫複合体を形成させ得るのに適した条件下、対象に投与されたＣ５ａ類似体に 特異的な抗体と反応させる。かかる免疫複合体の形成は、試料中における類似体 の存在の指標である。上記検定では、血漿または血清試料を用いるのが好ましい 。しかしながら、組織、例えばある種の血液細胞、例えばＰＭＮＬもまた使用さ れ得る。反応の存在および／または程度は、当業界で公知の様々な方法、例えば 放射線免疫検定法、酵素免疫検定法、蛍光免疫検定法、蛍光顕微鏡法などで測定 され得る。適当な定性および定量的免疫学的検定方法は、Ｊ.バトラー、「イミ ュノケミストリー・オブ・ソリッド-フェーズ・イミュノアッセイ」、ＣＲＣプ レス(1991)に開示されている。 一般的には循環しているＣ５ａ類似体を検出する検定法を用いて、処置中の類 似体のレベルをモニターする。すなわち、本発明のさらに別の態様は、対象にお ける本発明のヒトＣ５ａのポリペプチド誘導体または二量体の測定に関する定性 的または定量的検定法であって、 （１）対象から組織または液体試料を採取し、そして （２）抗体および誘導体間に検出可能な免疫複合体を形成（ここで、複合体の形 成は対象における誘導体の存在の指標である）させ得るのに十分な条件下で本発 明の抗体と試料を接触させる という段階を含む方法に関するものである。さらにかかる検定法は、対象におけ るポリペプチド誘導体または二量体を定量する段階を含み得る。 さらに、本発明の抗体は、循環しているＣ５ａ類似体の活性を調節または中和 するために医薬組成物において有利に使用され得る。このため、さらに別の態様 は、本発明のヒトＣ５ａのポリペプチド誘導体または二量体のインビボ活性の調 節に有用な医薬組成物であって、誘導体の活性を調節するのに有効な量の本発明 の抗体、および所望により医薬的に許容し得る担体を含む医薬組成物に関するも のである。好ましいのは、上記抗体の量が上記誘導体または二量体のインビボ活 性を実質的に中和するのに有効なものである上記医薬組成物である。 使用される抗体の量は、投与される類似体の量のモル当量である。組成物は対 象に非経口投与され得る。静脈内注射は緊急事態では特に好ましい。抗体は、医 薬的に許容し得る賦形剤、例えば食塩水またはリンガー溶液と組み合わせて単位 用量注射可能形態で製剤化される。 以下、詳細な実施例により、本発明についてさらに説明する。当業界の熟練者 が認めるところによると、実施例に記載された各製造または試験方法は、原則と してポリペプチド誘導体、二量体、融合タンパク質、ＤＮＡ分子、プラスミド、 ベクター、形質転換された宿主および抗体をそれぞれ製造または試験するのに適 したものである。これらの実施例は、説明を目的としているのに過ぎず、特記し ていなければ限定を意図したものではないものとする。 実施例１ ヒトＣ５ａコード化遺伝子の合成 ヒトＣ５ａ遺伝子は、オリゴヌクレオチドのカップリングにより合成される。 この合成遺伝子のコドンの用い方は、エシェリヒア・コリでの最適な発現を目的 として設計されている。合成方法は図１で説明されている。その方法は、ＡＵＧ コドンの与える翻訳開始頻度が他のコドンの場合よりもかなり高いためＴｈｒか らＭｅｔに変えられたＮ−末端残基をもつ５フラグメントの縮合を含む。フラグ メント１は、シャインーデルガーノ配列および合成遺伝子のＡＴＧ開始コドンを コード化する。フラグメント２−５はＣ５ａ遺伝子をコード化する。 オリゴヌクレオチド合成： オリゴヌクレオチドは、固相ホスファーアミダイト方法によりジーン・アセン ブラー（ファーマシア）で合成される。完全合成されたオリゴヌクレオチドは、 固体支持体から開裂され、５５℃で１６時間濃ＮＨ4ＯＨとのインキュベーショ ンにより脱保護される。次いで、オリゴヌクレオチドをプレパラティブゲル電気 泳動により精製する。使用されるアクリルアミド濃度は、長さが７０塩基対より も大きいオリゴヌクレオチドの場合の１０％から４０塩基対より小さい場合の２ ０％に変化した。電気泳動後、オリゴヌクレオチドをＵＶシャドウィングにより 明視化し、主要高分子量フラグメントをゲルから削り取る。ゲル薄片をガラス棒 により試験管中で微粉化し、３７℃で１６時間３.０ｍｌの０.１モル重炭酸トリ エチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）緩衝液（ｐＨ７.５）中でのインキュベーショ ンによりＤＮＡを抽出する。 ゲル残存物を遠心分離により除去し、セップ・パックＣ−１８カラム（ウォー ターズ・アソーシエイツ）でのクロマトグラフィーによりオリゴヌクレオチドを 単離する。１０ｍｌのアセトニトリル、５０ミリモルＴＥＡＢ中３０％アセトニ トリル５ｍｌおよび１０ｍｌの２５ミリモルＴＥＡＢで連続洗浄することにより 、カラムを予め平衡状態にする。オリゴヌクレオチドを適用し、１０ｍｌの２５ ミリモルＴＥＡＢで洗浄し、３５.５ミリモルＴＥＡＢ中５０％アセトニトリル ５ｍｌによりカラムから溶離する。フラクションを集め、２６０ｎｍでの吸光度 により測定されるオリゴヌクレオチドを含むものをスピードヴァック（セイヴァ ント）で乾燥する。 オリゴヌクレオチドのアニーリングおよびカップリング： アニーリング前、各オリゴヌクレオチドを５'末端でリン酸化する。キナーゼ 反応混合物は、１２ミリモルのＭｇＣｌ2、１ミリモルのＤＴＴ（ジチオトレイ トール）および２ミリモルのＡＴＰを含む、ｐＨ７.５で７７ミリモルのトリス ４０μｌの総体積中１μｇのオリゴヌクレオチドを含む。１０単位のＴ４ポリヌ クレオチドギナーゼを加えることにより反応を開始させ、３７℃で４０分間続行 させる。１０μｌの滅菌水を各キナーゼ反応物に加え、４８μｌの相補オリゴヌ クレオチドを加え、混合し、７８℃の加熱ブロックに置く。加熱ブロックを消し 、混合物を３０℃に放冷する。次いで、試料を６８℃で１０分間第二の加熱ブロ ックに置き、再びブロックを消し、混合物を２６℃に放冷する。アニーリングさ れた遺伝子フラグメントを用いて、ファージＭ１３ｍｐ１８（ニューイングラン ド・バイオラブズ）において遺伝子を組み立てる。Ｍ１３ｍｐ１８においてＣ５ ａコード化遺伝子を組み立てる方法は、３回のライゲーション反応を必要とする 。 適当な遺伝子フラグメントをＭ１３ｍｐ１８へ各ライゲーション反応させた後 、エシェリヒア・コリＪＭ１０１をライゲーションされたＭ１３ＤＮＡにより形 質転換する。組換えクローンからＭ１３ファージを単離した後、構築物の配列分 析をする。最終Ｃ５ａ遺伝子をＭ１３ｍｐ１８へクローン化すると、Ｍ１３ｍｐ １ ８／Ｃ５ａ（Ｔｈｒ１Ｍｅｔ、１-７４）が得られる。Ｃ５ａ（１-７４）遺伝子 を、プラスミドｐＴＺ１９ＲおよびｐＫＫ２２３-３（両方ともファーマシアか ら誘導された）から誘導されたｐＢ−６ベクターへサブクローン化すると、ｐＢ −６／Ｃ５ａ（Ｔｈｒ１Ｍｅｔ、１−７４）が得られる。図２参照。 実施例２ Ｃ５ａ遺伝子の位置指定突然変異導入法 オリゴヌクレオチド指定インビトロ突然変異導入システムバージョン２（アマ ーシャム）、Ｃ５ａ含有ベクターＭ１３ｍｐ１８／Ｃ５ａ（１-７４）からの１ 本鎖ＤＮＡおよび突然変異原性オリゴヌクレオチドを用いることにより、位置指 定突然変異導入が遂行される。Ｃ５ａにおける突然変異Ｃｙｓ２７Ｓｅｒは、製 造業者により与えられた手順に従い、突然変異原性オリゴヌクレオチド、ACGGTG CTTCTGTTAACA（配列番号６）を用いて行われる。正確なＣｙｓ２７Ｓｅｒ突然変 異に対するジデオキシＤＮＡ配列決定法により、４プラークを分析する。正確な 突然変異体クローンのーつから２本鎖ＤＮＡを単離し、ＰｓｔＩおよびＢａｍＨ Ｉで制限する。突然変異を含む２３０ｂｐフラグメントをｐＢ−６ベクターにサ ブクローン化する。生成したプラスミド、ｐＢ−６／Ｃ５ａ（１-７４、Ｔ１Ｍ 、Ｃ２７Ｓ）についても、ジデオキシ方法により配列決定し、突然変異を確認す る。 実施例３ Ｃ５ａ遺伝子のカセット突然変異誘発 プラスミドｐＢ−６／Ｃ５ａ（１−７４、Ｔ１Ｍ、Ｃ２７Ｓ）またはｐＢ−６ ／Ｃ５ａ（１-７４、Ｔ１Ｍ）を、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIIIで制限し、同様 に同酵素により制限されたベクターｐＷＣＢにおいてサブクローン化すると、Ｃ ５ａ（１-７４、Ｔ１Ｍ、Ｃ２７Ｓ）をコード化する遺伝子を含むプラスミドｐ ＷＣＢ１１２、およびＣ５ａ（１-７４、Ｔ１Ｍ）をコード化する遺伝子を含む ｐＷＣＢ１００がそれぞれ生成される。次いで、プラスミドをカセット突然変異 誘発で使用すると、一連の新規遺伝子が製造される。カセット突然変異誘発で使 用されるオリゴヌクレオチドは、アプライド・バイオシステムズ３８１Ａ ＤＮ Ａ合成装置により、製造業者の使用説明書に従い固相ホスファーアミダイト化学 作用を用いで製造される。 約６０μｇのｐＷＣＢ１１２を含む１０μｌのＴＥを、６０ＵのＰＶＵIIを含 む６μｌおよび６０ＵのＨｉｎｄIII（ニューイングランド・バイオラブズ）を 含む３μｌおよび１０×高塩緩衝液（１モルのＮａＣｌ、０.５モルのトリス／ ＨＣｌ、ｐＨ７.５、０.１モルのＭｇＣ12、１０ミリモルのＤＴＴ）１０μｌお よび７１μｌのｄｄＨ2Ｏと混合し、総体積１００μｌとする。この溶液を３７ ℃で１６時間インキュベーションする。こうして線形にされた約４.５Ｋｂのベ クターを、１％アガロースゲルを用いるプレパラティブ電気泳動により精製し、 次いで削り取られたアガロースゲル薄片からＤＮＡフラグメントを電気溶出する 。回収されたＤＮＡフラグメントをエッペンドルフ管に移し、１ｍｌの無水エタ ノールを加え、管をエッペンドルフ遠心機中１４０００ｒｐｍで１０分間遠心分 離にかける。ＤＮＡペレットを真空乾燥し、それに続いて４５μｌのＴＥ緩衝液 （１０ミリモルのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７.４、１ミリモルのＥＤＴＡ含有）に 溶かすと、ｐＷＣＢ１１２／Ａが得られる。 １本鎖オリゴヌクレオチドの３５ｂｐ−配列 5'CTGCGTGCTAACATCTCTCACAAAGAC ATGTGCTA3'（配列番号７）および３９ｂｐ−配列 5'AGCTTAGCACATGTCTTTGTGAGAG ATGTTAGTTAGCACGCAG3'（配列番号８）を、８％ポリアクリルアミドゲルでのプレ パラティブ電気泳動により精製する。電気泳動後、オリゴヌクレオチドをＵＶシ ャドウイングにより明視化し、適当なフラグメントをゲルから削り取る。ゲル薄 片を試験管中でガラス棒により微粉化し、３７℃で１６時間ｐＨ７.５の０.１モ ルＴＥＡＢ緩衝液３.０ｍｌ中でインキュベーションすることにより、ＤＮＡを 抽出する。ゲル残存物を遠心分離により除去し、セップ・パックＣ−１８カラム （ウォーターズ・アソーシエイツ）でのクロマトグラフィーによりオリゴヌクレ オチドを単離する。１０ｍｌのアセトニトリル、５０ミリモルＴＥＡＢ中３０％ アセトニトリル５ｍｌおよび１０ｍｌの２５ミリモルＴＥＡＢで連続洗浄するこ とに より、カラムを予め平衡状態にする。オリゴヌクレオチドを適用し、１０ｍｌの ２５ミリモルＴＥＡＢで洗浄し、３５.５ミリモルＴＥＡＢ中５０％アセトニト リル５ｍｌによりカラムから溶離する。 フラクションを集め、２６０ｎｍでの吸光度により測定されるオリゴヌクレオ チドを含むものをスピードヴァック（セイヴァント）で乾燥する。３５および３ ９ｂｐのオリゴヌクレオチドのアニーリングは、等量の各オリゴヌクレオチドを 、０.０１モルＭｇＣｌ2含有０.０５モルのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７.６を含むク レノウ緩衝液と混合し、試料を１０分間９５℃に加熱し、それに続いて２時間か けて室温に冷却することにより行われ、その結果２本鎖ＤＮＡが形成され、制限 ベクターｐＷＣＢ１１２／Ａへのライゲーションが行われる。２本鎖ＤＮＡは、 １μｌ、２ＵのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ＢＲＬ）と共にベクターに対し３倍過剰 の挿入体を用いて、制限ベクターｐＷＣＢ１１２にライゲーションされる。この 反応は、４℃で１７時間行われる。 本質的に同じ技術を用いて、単に異なるオリゴヌクレオチドおよびｐＷＣＢ１ ００またはｐＷＣＢ１１２を用いることにより、若干の分子が製造される。それ らは下記表２に示されている。 類似体番号１０−２０はアゴニストであり、本発明の範囲外である。それらは 比較目的で記載されている。類似体番号８の二量体形態の製造は、下記実施例５ ｃに記載されている。それは類似体番号２２と命名されている。 Ｃ５ａ類似体番号２１をコード化するポリヌクレオチドの完全なヌクレオチド 配列は、下記表３に示されている。 しかしながら、当業界の熟練者であれば、遺伝子コードの縮重故に、同一Ｃ５ａ 類似体をコード化する多くのポリヌクレオチドが製造され得ることは認めるはず である。例えばワトソンら、「リコンビナントＤＮＡ」、第２版、フリーマン、 ニューヨーク(1993)参照。 実施例４ エシェリヒア・コリにおけるＣ５ａおよびＣ５ａ類似体の発現 発現を達成するため、表１に示されたＣ５ａ類似体に対する合成遺伝子を、ｐ ＷＣＢベクター、ＢａｍＨ１部位が欠失し、ＰｖｕII部位がＰｖｕＩ部位に変え られ、イソプロピルーチオーベータ−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）−誘導性ｔ ａｃ−プロモーターおよびアンピシリン耐性遺伝子を含む修飾発現ベクターｐＫ Ｋ２２３−３（ファーマシア）においてサブクローン化する。エシェリヒア・コ リ株ＬＣＩＱは、ゴフら、「プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー ・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ」８ １：６６４７−６６５１（１９８４）に開示された株ＬＣ１３７（ｉｏｎ、ｈｔ ｐＲ）の誘導体である。それは、株ＤＨ５アルファＦ’ＩＱ（ＢＲＬラボラトリ ーズ）からのｌａｃＩＱをコード化するＦプライム因子を含み、発現プラスミド に対する宿主である。ＯＤ550が１に達するまで、適当な発現プラスミドを含む エシェリヒア・コリＬＣＩＱをＬＢ肉汁中３０℃で生長させる。培養物を３時間 ２.５ミリモル最終濃度でＩＰＴＧにより誘導する。細胞を遠心分離により採取 し、使用時まで−８０℃で貯蔵する。 実施例５ａ Ｃ５ａおよびＣ５ａ類似体の再生および精製 組換えタンパク質は、実施例４からの冷凍エシェリヒア・コリ細胞ペーストア リコートから、６モルのグアニジニウム塩酸塩を含む緩衝液中で解凍（５：１ｖ ：ｗ、緩衝液：細胞ペースト）後に単離される。次いで、細胞を音波処理により 破壊し、生成物を、１ミリモルのシステインおよび１ミリモルのシスチンまたは １ミリモルの還元／酸化グルタチオンを含む５０ミリモルのトリス／ＨＣｌ緩衝 液（ｐＨ８.０）に対して一夜透析し、復元を促進する。次いで、６ＮのＨＣｌ を加えることにより、透析物をｐＨ３に酸性化する。沈澱物を遠心分離により除 去し、３０分にわたって０.１％ＴＦＡの存在下水中２５％〜３５％のアセトニ トリルの直線勾配を用いてデルタ・パックＣ１８、１００オングストローム、１ ５ミクロンの逆相ＨＰＬＣカラム（ウォーターズ）で上清を精製する。約２８％ アセトニトリルでカラムから溶離する主要ピークを集め、凍結乾燥する。このフ ラクションは、Ｃ５ａ類似体のグルタチオン-付加物（表１における類似体５、 ７、８、９および２１の付加物）またはＣ５ａ類似体のシステイン-付加物（類 似体番号８の付加物、表１）を含んでいた。 Ｃ５ａ類似体遺伝子産物のシステイン付加物約０.００２ミリモルを、０.１モ ルのトリス緩衝液(ｐＨ７.４)５０ｍｌに溶かす。０.０２ミリモルのＤＴＴを加 える。４時間後、Ｃ−末端ｃｙｓ−ｃｙｓ連鎖の約８０％は遊離システインに変 換され、生成物を、３０分間０.１％ＴＦＡの存在下水中２５％〜３５％のアセ トニトリルの直線勾配を用いて、Ｃ４、１５ミクロン、３００オングストローム の逆相カラム（オールテック）で精製する。約２９％アセトニトリルで溶離する 生成物を含むフラクションを凍結乾燥し、次いで４℃で貯蔵し、真空乾燥する。 実施例５ｂ Ｃ５ａおよびＣ５ａ類似体の再生および精製 組換えタンパク質は、実施例４からの冷凍細胞エシェリヒア・コリペーストの アリコートから、６モルのグアニジニウム塩酸塩を含む緩衝液中で解凍（５：１ ｖ：ｗ、緩衝液：細胞ペースト）後に単離される。次いで、細胞を音波処理によ り破壊し、生成物を、１ミリモルの還元／０.０１ミリモルの酸化グルタチオ ンを含む１００ミリモルのトリス／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７.４）により２０倍に 希釈する。４時間後、６ＮのＨＣｌを加えることにより、溶液をｐＨ３に酸性化 する。生成した沈澱物を遠心分離により除去し、３０分にわたって０.１％ＴＦ Ａの存在下２５％〜３５％のアセトニトリルの直線勾配を用いてデルタ・パック Ｃ１８、１００オングストローム、１５ミクロンの逆相ＨＰＬＣカラム（ウォー ターズ）で上清を精製する。約３０％アセトニトリルでカラムから溶離する主要 ピークを集め、凍結乾燥する。こうして単離されたＣ５ａ類似体は、還元チオー ル基を有するＣ−末端システインを有する。 実施例５ｃ Ｃ５ａ類似体二量体の形成 Ｃ−末端領域に遊離チオール基を有するＣ５ａ類似体は、単量体形態（実施例 ５ｂ記載の再生後）から二量体形態に変換される。 組換えタンバク質は、実施例４からの冷凍エシェリヒア・コリペーストアリコ ートから、１００ミリモルのトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７.４）中１ミリモルの還元 ／０.０１ミリモルの酸化グルタチオン混合物を用いて実施例５ｂによる再生後 に単離される。４時間後、６ＮのＨＣｌを加えることにより、溶液をｐＨ３に酸 性化する。生成した沈澱物を遠心分離により除去し、２５ミリモル緩衝液（ｐＨ ７.０）で平衡状態にしたＳＰ−スフェロデックス／イオン交換カラムに上清を 吸着させる。２５ミリモルのトリス（ｐＨ７.０）でカラムを洗浄後、Ｃ５ａ類 似体は、０.７５モルのＮａＣｌを含む２５ミリモルのトリス（ｐＨ７.０）によ りカラムから溶離される。部分精製Ｃ５ａ類似体を蟻酸によりｐＨ３.０にし、 蒸留水で希釈すると、約４５ｍＳ／ｃｍの伝導性を有するタンパク質溶液が得ら れ、０.６モルのＮａＣｌを含む、ｐＨ３.５で５０ミリモル蟻酸中平衡状態に達 したＳＰ−高性能／イオン交換カラムに吸着させる。Ｃ５ａ類似体は、ｐＨ３. ５で５０ミリモル蟻酸緩衝液中０.６−１.０モルＮａＣｌの直線勾配を用いてカ ラムから溶離される。 約０.７２５モルのＮａＣｌでカラムから溶離する主要ピークを集める。そう して単離されたＣ５ａ類似体は、還元チオール基を有するＣ−末端システインを 有する。２５％アンモニア水溶液でｐＨ７.０に調節し、溶液を貯蔵すると、分 子はその二量体形態に変換される。ｐＨ７.０および約０.３−０.６ｍｇ／ｍｌ のタンパク質濃度および４−８℃での貯蔵では、変換は２日で少なくとも８０％ 完了する。Ｃ５ａ類似体の二量体形態は、最終的に３０分かけて０.１％ＴＦＡ の存在下２５％〜４０％アセトニトリルの直線勾配を用いるデルタ・パックＣ１ ８、１００オングストローム、１５ミクロン、逆相ＨＰＬＣカラム（ウォーター ズ）で精製される。約３３％アセトニトリルでカラムから溶離する主要ピークを 集め、凍結乾燥する。こうして単離された分子は、エシェリヒア・コリ発現系に より産生されたＣ５ａ類似体の二量体である。 実施例６ 受容体結合検定法 Ｃ５ａおよびＣ５ａ受容体アンタゴニストを、Ｃ５ａ受容体に対するそれらの 親和力について試験する。ＰＭＮＬ膜に対する、ハリスら、「ジャーナル・オブ ・レセプター・リサーチ」１１：１１５−１２８(1991)に記載された要領で製造 された［１２５］ＢＨ−標識Ｃ５ａの結合性を、ロリンスら、「ジャーナル・オ ブ・バイオロジカル・ケミストリー」、２６３：５２０−５２６(1988)に記載さ れた要領に従い、ただしブラウンウォルダーら、「モレキュラー・イムノロジー 」２９（１１）：１３１９−１３２４(1992)に記載された修正を加えて測定する 。ＰＭＮＬを、Ｃａ++およびＭｇ++不含有で、１０ミリモルのＨＥＰＥＳ（ｐＨ ７.３）、２.５ミリモルのＭｇＣｌ2、１００単位／ｍｌのデオキシリボヌクレ アーゼＩ、０.１ミリモルのＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍｌのアプロチニンおよび１ ０μｇ／ｍｌのロイペプチンを含むハンクス平衡塩溶液に再懸濁する。次いで、 それらを窒素キャビテーションボンベ中４００ｐｓｉで２０分間４℃で平衡状態 にする。２５ミリモルＥＤＴＡおよび上記列挙のプロテアーゼ阻害剤を含む３倍 容量の０.５モルのＫＨＣＯ3中へ排出後、ゼラチン質物質をピンセットで除去し 、混合物を４００×ｇで１０分間４℃で遠心分離にかける。生成した上清を、４ ℃で ６０分間５００００×ｇで遠心分離にかける。２００×１０6細胞を示すアリコ ートからのペレットを−７０℃で貯蔵する。結合試験するため、これらの膜を、 ２０×１０6細胞／ｍｌの当量で１ミリモルのＣａＣｌ2、５ミリモルのＭｇＣｌ2 、０.１ミリモルのＰＭＳＦ、０.１％のバシトラシンおよび０.５％のＢＳＡを 含む５０ミリモルＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.３）に再懸濁する。同緩衝液でさらに１ ：７５に希釈後、５０μｌの［１２５］ＢＨ−Ｃ５ａ（比活性２２００Ｃｉ／ミ リモル、最終濃度４.０ピコモル）および５０μｌの緩衝液または試験されるＣ ５ａ類似体を阻害剤特性に対して様々な濃度で含むデュプリケート管に、この懸 濁液４００μｌを加える。 １０ナノモル非標識Ｃ５ａの存在下で非特異的結合を測定する。ＰＭＮＬ膜を 加えることにより結合反応を開始させ、４℃で１２０分間続行する。細胞採取装 置（ブランデル、ガイザーズバーグ、メリーランド）を用いて０.０５％ＰＥＩ （ポリエチレンイミン）により９０分間前処理したＧＦ／Ｃガラス繊維フィルタ ー（ホワットマン）による真空濾過により、結合および遊離放射能を分離する。 ３×５ｍｌの氷冷５ミリモルのトリス緩衝液（ｐＨ７.４）でフィルターを洗浄 し、マルチウェルのガンマカウンター（ジーンシス）で計数する。非線形回帰分 析プログラム、ＲＳ／１（ボルト、ベラネックおよびニューマン、ボストン）を 用いてデータを分析し、ＩＣ50値として表す。結果は、チェング-プレソフ等式 を用いＫｉ値として下記表４に示されている。ブラウンウォルダーら、前出参照 。 これらの結果は、本発明のＣ５ａ類似体が、ナノモル単位のＫｉをもつ野生型 Ｃ５ａと競合的に置き換わることを示している。本発明のＣ５ａ類似体が有する 、ブラウンウォルダーら、前出（放射性リガンド、［１２５Ｉ］ボルトン−ハン ター標識Ｃ５ａ使用）で開示された競合的置換検定においてＫｉとして測定され るＣ５ａ受容体に対する親和力は、約１.０×１０-8モル未満、好ましくは約２. ０×１０-9モル未満、およびさらに好ましくは約１.０×１０-10モル未満である 。 実施例７ Ｃ５ａ誘導Ｃａ++増加 組換えヒトＣ５ａを、０.０１％トウィーン−２０を含むハンクス緩衝液に溶 かし、Ｃ５ａの全貯蔵希釈液をこの緩衝液で製造する。フラ−２（フラ２ＡＭ、 モレキュラー・プローブス）のアセトキシメチルエステルをＤＭＳＯに溶かす。 ６％ヘタスターチ（ヘスパン、デュポン、ワウケーガン、イリノイ）における沈 降、次いでチャプマン-キルクランドら、「ジャーナル・オブ・イミュノロジカ ル・メソッズ」１４２：９５−１０４(1991)に記載された向流水簸により好中球 をヒト末梢血から精製する。精製された細胞（２×１０6／ｍｌ）を、０.２マイ クロモルのフラ−２ＡＭと混合し、カルシウムまたはマグネシウム不含有のＨＥ ＰＥＳ緩衝ハンクス溶液中３７℃で３０分間インキュベーションする。検定の１ ５分前、撹拌棒を含むキュベット(curvette)に細胞懸濁液を移し、カルシウムを 加えて１ミリモルとする。細胞懸濁液を３７℃で撹拌しながらインキュベーショ ンする。５時間の細胞精製時間内に検定は終結され、細胞応答が実験の時間中変 化していないことを確実にするため、標準対照応答を定期的に得る。ＳＬＭ８０ ００分光蛍光計（ＳＬＭ−アミンコ・インスツルメンツ、ウルバナ、イリノイ） を用いて、蛍光量を測定する。キュベットを蛍光計中に置き、１０秒間基準線を 得た後、アンタゴニスト特性について試験されるＣ５ａ受容体アンタゴニストを 加え、３４０ｎｍ／３８０ｎｍの蛍光励起割合（５１０ｎｍの放出）における変 化があればそれを測定する。類似体を加えた４０秒後、対抗量のＣ５ａを加えて １００ピコモルの最終濃度とし、生じた励起割合における変化を測定する。 ＩＣ50値をアンタゴニスト効力の尺度として使用する。これらの値は、１００ ピコモルＣ５ａ対抗量のカルシウム増加応答を５０％減らすのに必要とされるＣ ５ａ類似体濃度として定義される。ＥＣ50値は、アゴニスト効力の尺度として使 用される。ＥＣ50は、類似体によりもたらされる最大カルシウム増加応答の５０ ％を誘導するＣ５ａ類似体の濃度として定義される。結果を下記表５に示す。 Ｃａ５類似体番号７は、１.０×１０6モルの濃度以下で試験される。Ｃ５ａ類 似体番号８は３.０×１０-6モルの濃度以下で試験され、類似体番号９は１.５× １０6モルの濃度以下で試験され、類似体番号２１は８.０×１０-7モルの濃度以 下で試験される。アゴニスト活性は、どの場合にも検出されない。これらの結果 と、上記表２に示された結果とを集合的に分析すると、本発明の類似体は、Ｃ５ ａの競合的阻害剤として機能することが示唆されている。それらは、最高の効力 を獲得するためには、類似体のＣ−末端が、非複合体形成システインまたはジス ルフィド結合により本発明の別のＣ５ａ類似体と複合体を形成するシステイン残 基であるべきことを示している。 実施例８ 炎症のウサギ皮膚モデル 実験は全て、体重２.５−３.０ｋｇの雄のニュージーランド白ウサギにおいて 遂行される。ウサギの背中を剃り、４０−５０の皮膚部位に色の異なるマーカー で印をつける。様々な刺激物質（すなわち、Ｃ５ａ、Ｃ５ａ類似体、Ｃ５ａ＋Ｃ ５ａ類似体、賦形剤対照など）を、無菌で使い捨ての２６ゲージ、０.５インチ 針および１.０ｃｃツベルクリン注射器を用いて、０.１ｍｌ／部位の割合で皮内 注射する。安楽死させるほぼ４５分前に、６反復実験において皮内注射を投与す る。Ｃ５ａ単独を５０ｎｇ／部位の用量で注射し、同用量のＣ５ａと共にＣ５ａ 受容体アンタゴニストを様々な濃度で同時注射する。安楽死の２０分前に、１. ０ｍｌの生理食塩水中１８−３６μＣｉの［１２５１］−標識牛血清アルブミン を、末端耳静脈から全身循環系へ導入する。４５分後、ウサギを静脈内過剰量の ペントバルビタールナトリウムにより安楽死させる。末梢血の５.０ｍｌ試料を 、 心臓穿剌により入手し、２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離にかけ、１.０ｍｌ の血漿を集め、血漿中の［１２５Ｉ］の量を測定するための対照標準として使用 する。死後、背部の皮膚を摘出し、木製解剖台にピンで留める。皮膚の主要脈管 構造の血液を周辺に向かって手で絞り出す。この操作により、皮膚部位間の変動 が減り、バックグラウンド放射能も減少する。次いで、１５ｍｍコルク穿孔器お よび小槌の補助器具により外部皮膚から炎症病変部に穴をあけ、１２×７５ｍｍ ポリスチレン管中に入れる。次いで、注射部位を、ガンマカウンター（ジーンシ ス）を用いてそれらの放射能含有量について分析する。血管から滲出した、炎症 部位に局在する［１２５Ｉ］−標識牛血清アルブミン（ＢＳＡ）の量は、血管透 過性の強化度合いに直接比例することが見いだされた。Ｃ５ａ類似体のＩＤ50値 は、同じ部位での５０ｎｇのＣ５ａ同時注射によりもたらされる放射能の５０％ 減少を誘発するＣ５ａ類似体の用量である。 Ｃ５ａ類似体番号８（表１で）は、７０ｎｇ／部位のＩＤ50を有することが見 いだされ、１７５ｎｇ／部位の用量では前炎症反応を誘発しない。この結果は、 類似体がインビボアンタゴニストであり、インビボでアゴニスト特性を呈しない ことを示している。 実施例９ ウサギにおけるＣ５ａ−誘導ニュートロペニア(neutropenia) 実験は全て、体重２.５−３.０ｋｇの雄のニュージーランド白ウサギにおいて 遂行される。１.０ｍｇ／ｋｇキシラジンおよび５０ｍｇ／ｋｇケタミンを組み 合わせて筋肉内投与することにより、ウサギに麻酔をかける。２５ゲージのバタ フライカテーテルを外側耳静脈に挿入して、注入に使用する。各血液試料（０. ２ｍｌ）を中央耳動脈から２５ゲージ、５／８インチ針を取り付けたプラスチッ ク注射器中に集め、抗凝血物質として７.５％ＥＤＴＡで満たす。即座に血液を １０マイクロリットルの７.５％ＥＤＴＡを含む微細遠心管中に絞り出す。初期 動脈血試料（＃１）を入手し、その直後に賦形剤または実施例８のＣ５ａ類似体 を静脈内注入（ボーラス注射）する。２０秒後、第二の血液試料（＃２）を入手 し、 その２０秒後に０.２ｍｌ中１００ｎｇのＣ５ａを静脈内注入（ボーラス注射） する。２０秒後、第三血液（＃３）試料を採取する。３０分後、第２回の血液試 料（＃４）--２０秒--Ｃ５ａ注入--２０秒--血液試料（＃５）を行う。ウサギ血 液に特異的なソフトウェアを用いる自動血液分析法（テクニコンＨ＊１）により 、血液試料を評価する。Ｃ５ａにより誘導される好中球数（１ミリリットル当た りの数）の減少（Ｃ５ａ誘導ニュートロペニア、血液試料＃３〜＃２および＃５ 〜＃４を比較することにより測定）を、賦形剤処置およびＣ５ａ類似体処置動物 間で比較する。Ｃ５ａ類似体が、正常動物からの基準線の好中球数を改変するこ とはない、すなわち、Ｃ５ａ類似体はアゴニスト的（Ｃ５ａ様）特性を呈しない 。Ｃ５ａ類似体処置ウサギにおけるＣ５ａ誘導ニュートロペニアは、４０秒およ び３０分Ｃ５ａ攻撃間隔でそれぞれ６７％および４１％と賦形剤処置ウサギの場 合と比べて顕著に（Ｐ＞０.０５）阻害される。これらの結果は、Ｃ５ａ類似体 の全身投与による効果を立証している。 実施例１０ Ｃ５ａ類似体とデカペプチド H-Ile-Ser-Phe-Lys-Asp-Met-Gln-Leu-Gly-Arg-OH（配列番号５２） の受容体結合およびＣ５ａ誘導カルシウム増加比較。 ５種のＣ５ａ類似体（表２における番号５、７、８、９および１０）を製造し 、Ｃ５ａ受容体結合およびＣ５ａ受容体カルシウム増加検定にかけ、オルら、「 ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー」３５：４０２−４０６（１９ ９２）における表１（１４番）に開示された合成デカペプチドと比較する。この 実験の結果を下記表６に示す。 これらの結果は、試験されたＣ５ａ類似体が、受容体に対してデカペプチドよ りも１４０００−１００００倍大きい結合親和力を有することを示している。上 記データはまた、記載されたＣ５ａ類似体が、実質的にはアゴニスト活性を呈し ないＣ５ａ受容体アンタゴニスト分子であるが、デカペプチドは顕著なアゴニス ト活性を呈することを示している。 実施例１１ Ｃ５ａ（１-７１、Ｔ１Ｍ、Ｃ２７Ｓ、Ｑ７１Ｃ）に特異的なポリクローナル 抗体の製造 抗原製造 製造業者の説明書に従い、ピアス・ケミカル・カンパニー（ロックフォード、 イリノイ、アメリカ合衆国）製のイムジェクト／イムノゲンＥＤＣコンジュゲー ションキット・を用いて、１ｍｇのＣ５ａ（１-７１、Ｔ１Ｍ、Ｃ２７Ｓ、Ｑ７ １Ｃ）を、２ｍｇのキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）にコンジュゲ ートする。３５００ｃｐｍの125Ｉ−Ｃ５ａ（ニューイングランド・ヌクリアー 、ボストン、マサチューセッツ）を加えることにより、コンジュゲーション効率 を追跡する。コンジュゲートの最終体積は、０.３４ｍｇのＣ５ａ（１-７１、Ｔ １Ｍ、Ｃ２７Ｓ、Ｑ７１Ｃ）（０.１５ｍｇ／ｍｌ）および推定０.９ｍｇ／ｍｌ のＫＬＨを含む２.２５ｍｌである。 抗Ｃ５ａ（１-７１、Ｔ１Ｍ、Ｃ２７Ｓ、Ｑ７１Ｃ）抗血清の製造 Ｃ５ａ（１-７１、Ｔ１Ｍ、Ｃ２７Ｓ、Ｑ７１Ｃ）コンジュゲート（０.５ｍｌ ）を、０.５ｍｌのフロイント完全アジュバント（シグマ・ケミカル・カンパニ ー、セントルイス、ミズーリ）によりホモジネートする。雌のニュージーランド 白ウサギをミルブロック・ファームズ（アムハースト、マサチューセッツ）から 購入し、肩甲骨領域の２部位に皮下注射（１部位当たり０.２ｍｌホモジネート ）する。２１日後、この操作を反復する。フロイント不完全アジュバント（シグ マ）を用いてさらに注射を行う。合計５５日後、第３の注射を行い、１２６日目 に第４の注射を行う。各注射後３週間から５週間の間ウサギから血液（約３０ｍ ｌ）を採取し、凝固させ、血清を除去する。 抗体吸着用のペプチド固定化 上記と同様、ピアス・ケミカル・カンパニー製のイムジェクト／イムノゲンＥ ＤＣコンジュゲーションキットを用いて、Ｃ５ａ（１-７１、Ｔ１Ｍ、Ｃ２７Ｓ 、Ｑ７１Ｃ）またはＣ５ａ（１ｍｇ）を、２ｍｇの牛血清アルブミン（ＢＳＡ） に コンジュゲートし、125Ｉ−Ｃ５ａを加えて効率を追跡する。Ｃ５ａ（１-７１、 Ｔ１Ｍ、Ｃ２７Ｓ、Ｑ７１Ｃ）／ＢＳＡの最終体積は、０.２５ｍｇ／ｍｌ Ｃ５ ａ（１-７１、Ｔ１Ｍ、Ｃ２７Ｓ、Ｑ７１Ｃ）で２.２５ｍｌであり、Ｃ５ａ／Ｂ ＳＡの場合、最終体積は、０.３２ｍｇ／ｍｌ Ｃ５ａで２.２５ｍｌである。両 コンジュゲートとも、推定０.９ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含んでいた。 ２つのペプチドコンジュゲートを、炭酸ナトリウムでｐＨ８.６の緩衝液にし た０.２モル炭酸水素ナトリウムに対して透析する。各コンジュゲートについて 、同緩衝液中で予備洗浄された２ｍｌのＡＨ（アミノヘキシル）−アガロースゲ ル（シグマ・ケミカル・カンパニー、セントルイス、ミズーリ）を、グルタルア ルデヒドを加えて１％ｖ／ｖの最終濃度とし、２０℃で１５分間インキュベーシ ョンすることにより活性化する。ゲルを緩衝液中で十分洗浄することにより、グ ルタルアルデヒドを除去し、次いでコンジュゲート溶液を加え、２０℃で１時間 インキュベーションする。非結合タンパク質をゲルから洗い落とし、残存してい る結合部位を０.２モルのグリシルグリシン２０ｍｌと４℃で一夜インキュベー ションすることにより遮断する。ゲルを０.５ｃｍ×１０ｃｍガラスカラム中に 詰め入れ、０.１％アジ化ナトリウム含有ダルベッコのリン酸緩衝食塩水、ｐＨ ７.２（ＰＢＳ−Ａ）で十分洗浄する。 アフィニティー・クロマトグラフィー Ｃ５ａ（１-７１、Ｔ１Ｍ、Ｃ２７Ｓ、Ｑ７１Ｃ）により免疫化したウサギか ら採取した血清を、２ｍｌ／時でＣ５ａ／ＢＳＡカラムに通す。カラムから出現 する吸着した抗血清を集める。カラムを、０.０５モルのリン酸ナトリウムでｐ Ｈ７.２の緩衝液にした０.１％アジ化ナトリウム含有０.５モルＮａＣｌで十分 洗浄する。結合抗体を３モルのチオシアン酸アンモニウムにより除去する。溶離 している抗体は、２８０ｎｍで読み取り０.２ＯＤ最大偏差で設定されたインラ インＵＶモニターを用いて検出される。血清を最初２回通した後、溶離している 抗体を集め、即座にＰＢＳ−Ａに対して透析し、次いで限外濾過により１ｍｇ／ ｍｌ前後に濃縮する。このプロセスを各血清バッチに対して数回反復する。Ｃ５ ａカラムから溶離しているタンパク質がそれ以上検出されなくなると、血清は吸 着されたと考えられる。 次いで、吸着された抗血清を、Ｃ５ａ（１-７１、Ｔ１Ｍ、Ｃ２７Ｓ、Ｑ７１ Ｃ）免疫吸着カラムに通す。結合抗体を３モルのチオシアン酸アンモニウムで溶 離し、即座にＰＢＳ−Ａに対して透析し、次いで約１ｍｇ／ｍｌに濃縮する。 実施例１２ａ 結合したＣ５ａ（１-７１、Ｔ１Ｍ、Ｃ２７Ｓ、Ｑ７１Ｃ）を検出するための 標識抗体の製造 Ｃ５ａカラムから溶離した抗Ｃ５ａ（１-７１、Ｔ１Ｍ、Ｃ２７Ｓ、Ｑ７１Ｃ ）抗体（すなわち、Ｃ５ａと交差反応しない抗体）を、アルカリ性ホスファター ゼにコンジュゲートする。１ｍｌのＰＢＳ中１.４ｍｇの抗体を、５ｍｇ（５０ ００単位）のアルカリ性ホスファターゼ（タイプVII−Ｔ、シグマ・ケミカル・ カンパニー）に加える。グルタルアルデヒドを加えて０.２％ｖ／ｖの最終濃度 とする。混合物を２０℃で９０分間インキュベーションし、次いで４℃でＰＢＳ −Ａに対して一夜透析する。緩衝液を、１ミリモル塩化マグネシウムを含む０. ０５モルのトリス緩衝液、ｐＨ８.０に変え、４℃で一夜透析する。 実施例１２ｂ ＥＬＩＳＡによる結合Ｃ５ａ(１-７１、Ｔ１Ｍ、Ｃ２７Ｓ、Ｑ７１Ｃ)の検出 ０.５７ｍｇ／ｍｌでの特別精製ウサギ抗Ｃ５ａ（１-７１、Ｔ１Ｍ、Ｃ２７Ｓ 、Ｑ７１Ｃ）を、０.１モルのほう酸ナトリウム／ほう酸、ｐＨ８.６中で１：５ ００に希釈する。ＥＬＩＳＡプレート（マキシソープ＼、ヌンク、ネイパービル 、イリノイ）を、２０℃で４時間１００μｌ／ウェルのこの溶液によりコーティ ングする。プレートを３回洗浄することにより、非結合物質が除去される。Ｃ５ ａ（１-７１、Ｔ１Ｍ、Ｃ２７Ｓ、Ｑ７１Ｃ）含有試料またはＣ５ａ（１-７１、 Ｔ１Ｍ、Ｃ２７Ｓ、Ｑ７１Ｃ）の標準製剤を、好適にはＰＢＳ−Ａ＋１％ＢＳＡ （ＰＢＳ／ＢＳＡ）で希釈したものを、１００μｌ中２０℃で４時間ウェルに加 える。標識抗体を１００μｌのＰＢＳ／ＢＳＡ中１：３０００の割合で加え、４ ℃で一 夜インキュベーションする。プレートを洗浄し、次いで酵素基質（アルカリ性ホ スファターゼの場合、ｐ−ニトロフェニルホスフェート（シグマ・ケミカル・カ ンパニー）、１０％ｖ／ｖジエチルアミン、ｐＨ９.８中１ｍｇ／ｍｌ）を加え る。約５時間暗所中２０℃で現像を進行させる。バイオメック１０００（ベック マン・インスツルメンツ、カリフォルニア、アメリカ合衆国）を用いてプレート を４０５ｎｍで読み取る。 上記と同じ条件を用いて、Ｃ５ａ（１-７１、Ｔ１Ｍ、Ｃ２７Ｓ、Ｑ７１Ｃ） の標準曲線を作製する（データは示さず）。 実施例１２ｃ アフィニティー精製特異的抗Ｃ５ａ（１-７１、Ｔ１Ｍ、Ｃ２７Ｓ、Ｑ７１Ｃ ）の特異性 Ｃ５ａ（１-７１、Ｔ１Ｍ、Ｃ２７Ｓ、Ｑ７１Ｃ）またはＣ５ａを用いて、２ ０℃で４時間１００μｌコーティング緩衝液中１μｇ／ウェルでマイクロタイタ ープレートを被覆する。プレートを洗浄し、Ｃ５ａ吸着後Ｃ５ａ（１-７１、Ｔ １Ｍ、Ｃ２７Ｓ、Ｑ７１Ｃ）から溶離された抗体の系列希釈を、１００μｌのＰ ＢＳ／ＢＳＡ中プレートウェルで行う。２０℃で４時間インキュベーション後、 プレートを再洗浄する。ウサギ抗体の結合は、ＰＢＳ／ＢＳＡ中１：１０００、 １００μｌ／ウェルでヤギ抗ウサギ／西洋わさびペルオキシダーゼ（ピアス・ケ ミカル・カンパニー）により検出される。２０℃で４時間第二抗体とインキュベ ーション後、プレートを洗浄し、２,２'-アジノビス（３−エチルベンゾチアゾ リン）−６スルホン酸ジアンモニウム塩ＡＢＴＳ基質（ピアス・ケミカル・カン パニー）により西洋わさびペルオキシダーゼ活性が立証される。３０分現像後、 ４０５ｎｍで色を読み取る。 実施例１３ ウサギ血漿試料におけるＣ５ａ(１-７１、Ｔ１Ｍ、Ｃ２７Ｓ、Ｑ７１Ｃ)の測 定 麻酔した２匹のウサギ（＃１および＃２）からの血液試料を、ヘパリン被覆管 へ採取後、Ｃ５ａ（１-７１、Ｔ１Ｍ、Ｃ２７Ｓ、Ｑ７１Ｃ）を静脈内注射する 。さらに３０分間隔をおいて血液を集める。次いで、さらにＣ５ａ（１-７１、 Ｔ１Ｍ、Ｃ２７Ｓ、Ｑ７１Ｃ）の注射を行い、血液を３０分後に再び集める。こ れをさらに４回反復する。試料を遠心分離にかけて血液細胞を除去し、血漿を除 去し、ＥＬＩＳＡで使用するまで−２０℃で貯蔵する。 試料をＰＢＳ／ＢＳＡ中で希釈し、実施例１１で作製された標準曲線に対して ＥＬＩＳＡで定量する。次いで、循環しているＣ５ａ（１-７１、Ｔ１Ｍ、Ｃ２ ７Ｓ、Ｑ７１Ｃ）の経時的増加を測定する。Ｃ５ａ（１-７１、Ｔ１Ｍ、Ｃ２７ Ｓ、Ｑ７１Ｃ）の注射前の２ウサギから採取した試料からは、活性は全く検出さ れ得なく、抗体の特異性を示している。これらの結果はまた、抗体がウサギＣ５ ａとの交差反応性を全く呈しないこと、およびＣ５ａ（１-７１、Ｔ１Ｍ、Ｃ２ ７Ｓ、Ｑ７１Ｃ）がウサギには本来存在しない物質であることを示している。 実施例１４ ウサギ循環系におけるＣ５ａ(１-７１、Ｔ１Ｍ、Ｃ２７Ｓ、Ｑ７１Ｃ)と標準 Ｃ５ａ(１-７１、Ｔ１Ｍ、Ｃ２７Ｓ、Ｑ７１Ｃ)の比較：Ｃ５ａ(１-７１、Ｔ１ Ｍ、Ｃ２７Ｓ、Ｑ７１Ｃ)に対する解毒薬としての特異的抗Ｃ５ａ(１-７１、Ｔ １Ｍ、Ｃ２７Ｓ、Ｑ７１Ｃ)抗体の使用 ウサギ＃２（実施例１３から）の最終時点から得られた血漿試料に対し、系列 二重希釈を行い、得られた曲線の傾きを標準曲線の傾きと比較する。２つの傾き は平行していることから、ウサギにおいて循環していたＣ５ａ（１-７１、Ｔ１ Ｍ、Ｃ２７Ｓ、Ｑ７１Ｃ）がまだその抗原特性を保持しており、標準Ｃ５ａ（１ -７１、Ｔ１Ｍ、Ｃ２７Ｓ、Ｑ７１Ｃ）の場合と同様にＥＬＩＳＡにおいて認め られることがわかる。この結果はまた、循環系からのＣ５ａ（１-７１、Ｔ１Ｍ 、Ｃ２７Ｓ、Ｑ７１Ｃ）の除去が必要となる場合、類似体が抗体により中和され ることを示している。 実施例１５ モノクローナル抗Ｃ５ａ(１-７１、Ｔ１Ｍ、Ｃ２７Ｓ、Ｑ７１Ｃ)の製造 コーラーおよびミルスタイン、「ネイチャー」２５６：４９５−４９７（１９ ７５）により開発された標準的方法を用い、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてモノク ローナル抗体の製造を行う。Ｃ５ａ（１-７１、Ｔ１Ｍ、Ｃ２７Ｓ、Ｑ７１Ｃ） 抗原の同製品（ＫＬＨに結合）を用いてマウスを免疫化する。免疫化マウスから の脾臓細胞をハイブリドーマラインＰ３／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１（ＡＴＣＣＴ ＩＢ１８）と融合することにより製造されたモノクローナルセルラインのスクリ ーニングは、Ｃ５ａ（１-７１、Ｔ１Ｍ、Ｃ２７Ｓ、Ｑ７１Ｃ）／ＢＳＡおよび Ｃ５ａ／ＢＳＡを用いて行われる。ポリクローナルウサギ抗血清により行われた 操作と直接平行して、Ｃ５ａとではなくＣ５ａ（１-７１、Ｔ１Ｍ、Ｃ２７Ｓ、 Ｑ７１Ｃ）とのみ反応する抗体を、特異的モノクローナル抗Ｃ５ａ（１-７１、 Ｔ１Ｍ、Ｃ２７Ｓ、Ｑ７１Ｃ）抗体として使用する。両方を認識するものを検出 抗体として使用し、アルカリ性ホスファターゼで標識する。 実施例１６ ヒトカルボニックアンヒドラーゼII（ｈＣＡII）遺伝子およびＣ５ａ受容体ア ンタゴニスト遺伝子間の遺伝子融合体の構築 プラスミドｐＷＣＢ４０１は、Ｃ５ａ受容体アンタゴニストをコードするＤＮ Ａ配列を含む（Ｃ５ａ(１-７１、Ｔｈｒ１Ｍｅｔ、Ｃｙｓ２７Ｓｅｒ、Ｇｌｎ７ １Ｃｙｓ)）。このプラスミドは、実施例３記載のカセット突然変異誘発方法に おいて配列番号２３を用いて製造される。次いで、このプラスミドは、標準ライ ゲーションプロトコル（マニアチスら）を用いて、ｐＷＣＢ４０１の唯一のＨｉ ｎｄIII制限部位における２本鎖合成オリゴヌクレオチド（ＯＬ１／ＯＬ２、OL1 -5'-AGC TGG GAT CCG ATA TCC-3'（配列番号５３）、OL2 5'-A GCT GGA TAT CGG ATC CC-3'(配列番号５４)）の挿入により修飾され、プラスミドｐＷＣＢ４０１ ＢＥが製造される。この挿入により、停止コドンのすぐ下流にＢａｍＨＩおよび ＥｃｏＲＶ制限部位が加えられ、ＨｉｎｄIII部位が削除される。次いで、標準 的方法（マニアチスら、1989）により、さらに２つのオリゴヌクレオチド（OL3/ OL4; OL3-5'-A GCT TTC GTT GAC GAC GAC GAT AAA AAC GGT CTG CA-3'（配列番 号 ５５）、OL4-5'G ACC GTT TTT ATC GTC GTC GTC AAC GAA-3'(配列番号５６)）を 合成し、リン酸化し、アニーリングする。この合成されたオリゴヌクレオチドは 、Ｃ５ａ受容体アンタゴニストに関する遺伝子をｈＣＡII遺伝子に結合し、エン テロキナーゼプロテアーゼーおよびヒドロキシルアミン化学的開裂部位をコード 化する。 ２２２ｂｐＰｓｔＩ-ＥｃｏＲＶフラグメントをｐＷＣＢ４０１ＢＥから回収 し、３方向ライゲーション実験でアニーリングした２本鎖オリゴヌクレオチドＯ Ｌ３／ＯＬ４およびＨｉｎｄIIIおよびＥｃｏＲＩ消化ｐＢ０３０４ΔＲＶにラ イゲーションする。ｐＢ０３０４ΔＲＶは、ｐＢ０３０４の誘導体であり（ファ ン・ヘーケら、「プロテイン・エクスプレッション・アンド・ピュリフィケーシ ョン」４：２６５−２７４（１９９３））、テトラサイクリン耐性遺伝子におけ るＥｃｏＲＶ制限部位を削除することにより得られる。３方向ライゲーションの 生成物はプラスミド２９Ａ−１と命名され、合成オリゴヌクレオチドを含むクロ ーニング接合点周囲のＤＮＡ配列は、標準ＤＮＡ配列決定方法（マニアチスら） により証明される。エシェリヒア・コリ株ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳお よびＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（両方ともノヴァゲン製、マディソン、ワイ オミング）を、プラスミド２９Ａ−１により形質転換し、テトラサイクリンを補 ったルリア肉汁寒天プレートにおいてコロニーを分離する（マニアチスら）。 実施例１７Ａ Ｃ５ａ融合タンパク質の構築、エシェリヒア・コリにおける発現力価の測定 オーバーラップ外延ＰＣＲによりヒトインターロイキン−１β遺伝子のフラグ メント（エシェリヒア・コリ好適コドンにより修飾、ブリティッシュ・バイオテ クノロジー・リミテッドから入手、イギリス国）と、ヒトインターロイキン−１ 受容体アンタゴニスト（ｈＩＬ１−ＲＡ）のペプチドフラグメントをコードする フラグメントとの交換を試みる実験が進むにつれて、７２位のアミノ酸に対する コドンの後にアーチファクト翻訳停止コドンが得られる。後にＢａｍＨＩ開裂部 位（ＧＧＡＴＣＣ）を停止コドン部位に導入することにより、融合タンパク質の 構築が容易になる。上記要領で得られた合成遺伝子は次の通りである： ＮｃｏＩおよびＧａｍＨＩ制限部位が両端に隣接するＩＬ７２のＤＮＡ配列 この合成遺伝子は、両端にＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ部位が隣接しており、ヒ トインターロイキン−１β（ｈＩＬ−１β）およびヒトインターロイキン−１受 容体アンタゴニスト（ｈＩＬ１−ＲＡ）の配列により構成されるハイブリッドタ ンパク質をコードする。 次いで、この合成遺伝子をＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとしてプラスミ ドｐＰＬＭｕにクローニングすると、プラスミドｐＰＬＭｕＩＬ７２が得られる 。プラスミドｐＰＬＭｕは、ＮｃｏＩ−ＨｉｎｄIIIフラグメントが下記に示さ れた多重クローニング部位により置き換えられたプラスミドｐＰＬｍｕＳＭＣｏ ｒｉ（ブエル,Ｇ.ら、「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ」（１９８５）１３ ：１０２３−１０３８）である。 リボソーム結合部位および多重クローニング部位を含むｐＰＬｍｕＳＭＣｏｒ ｉにおけるＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIIIフラグメントの配列 コード化されたハイブリッドタンパク質は、そのＮ−末端メチオニンから数え て、ｈＩＬ−１βのアミノ酸１−４７、次いでｈＩＬ１−ＲＡのアミノ酸５２− ５７、次いでｈＩＬ−１βのアミノ酸６０−７１、次いでアミノ酸配列Cys Val Leu Lys Ala Ala Ser(配列番号５９)および翻訳停止コドンにより構成される。 次に、エシェリヒア・コリ株ＬＣ１３７（ゴフ、Ｓ.Ａ.ら、Nat'l Proc．Acad ．Sci.，USA ８１：６６４７−６６５１(1984)）を、熱不安定性ファージλＣＩ8 57 リプレッサーをコード化する和合性プラスミドｐｃｌ857を担うプラスミドｐ ＰＬｍｕＩＬ７２により形質転換する。熱誘導エシェリヒア・コリ細胞（ブエル ら、前出）のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析されたところによると、熱誘導により ハイブリッドタンパク質の高度発現がもたらされた。プラスミドｐＰＬＭｕＩＬ ７２によりコード化されるハイブリッドタンパク質は、３'プライマーとしてプ ライマーＣ、ＤおよびＥ： ＰＣＲプライマー プライマーＣ プライマーＤ プライマーＥ およびプライマーＦ を５'プライマーとして用いるＰＣＲによりさらに短くされ、それぞれプラスミ ドｐＰＬＭｕＩＬ３３、ｐＰＬＭｕＩＬ５３およびｐＰＬＭｕＩＬ６３が製造さ れる。ＢａｍＨＩ部位のこれらの全構築物における配列ＧＡＴ（Ａｓｐ）は、ハ イブリッドタンパク質をコードするＤＮＡ配列との適切な読み枠内にある。Ｂａ ｍＨＩ開裂によりこの部位へクローン化された暗号化領域には、ＢａｍＨＩ開裂 配列に一部含まれる配列GATCCXによりコード化される酸不安定アミノ酸配列Asp- Proが先行する。これらの融合タンパク質の酸による開裂は、酸不安定性Asp-Pro 部位における開裂を通じて融合相手を遊離させる。ｐＰＬＭｕＩＬ６３およびｐ ＰＬＭｕＩＬ５３における構築物は、もとのｐＰＬＭｕＩＬ７２と同量のハイブ リッドタンパク質発現を示した。ｐＰＬＭｕＩＬ３３からは発現は全く観察され ない。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシー(商標)（ＩＣＩ、リミテッド）ブリリ アントブルー染色後に発現レベルを測定する。 次いで、ｐＰＬＭｕＩＬ３３およびｐＰＬＭｕＩＬ５３を用いて、ヒトＣ５ａ との融合タンパク質を構築する。次のｈＣ５ａ遺伝子との適切な読み枠内にある アスパラギン（ＧＡＴ）をコードするＢａｍＨＩ部位は、プライマー指定ＰＣＲ 突然変異誘発法により導入される。ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII切断Ｃ５ａフラグ メントを、ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII切断プラスミドｐＰＬＭｕＩＬ３３および ｐＰＬＭｕＩＬ５３にライゲーションすると、それぞれプラスミドｐＰＬＭｕＩ Ｌ３３−Ｃ５ａおよびｐＰＬＭｕＩＬ５３−Ｃ５ａが製造される。 両端にＮｃｏｌおよびＨｉｎｄIII部位が隣接するＩＬ３３−Ｃ５ａの配列 両端にＮｃｏｌおよびＨｉｎｄIII部位が隣接するＩＬ５３−Ｃ５ａ配列 ｐＰＬＭｕＩＬ３３−Ｃ５ａおよびｐＰＬＭｕＩＬ５３−Ｃ５ａを担うエシェ リヒア・コリＫ１２ＬＣ１３７の熱誘導により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗ｈＣ ５ａポリクローナル抗体によるウエスタン分析により判断されたところによると 、融合タンパク質の高度発現がもたらされる。 実施例１７ｂ ヒトインターロイキン１β／ヒトインターロイキン１受容体アンタゴニストの フラグメントおよびＣ５ａ類似体またはヒトＣ５ａのポリペプチド誘導体間の遺 伝子融合の構築 コドン１−５０を含むプラスミドｐＰＬＭｕＩＬ５３−Ｃ５ａの５'領域を回 収し、Ｃ５ａＲＡまたはヒトＣ５ａのポリペプチド誘導体との融合タンパク質発 現を目的としてＰＣＲを用いて最適化する。簡単に述べると、５'末端を適合さ せると、ｐＥＴ系列細菌発現ベクターへのクローニングが容易になる。９位にあ るシステインコドンをセリンコドンと置き換え、フラグメントの３'末端を修飾 すると、Ｃ５ａＲＡまたはヒトＣ５ａのポリペプチド誘導体および開裂リンカー との融合が行われ得る。下記の実験が行われる： ＩＬ−１β／ＩＬ１ＲＡフラグメントをコード化する遺伝子を回収し、標準Ｄ ＮＡ増幅条件（マニアチスら、１９８９）およびプライマーとしてＧ８３および Ｇ８４と称するオリゴヌクレオチド（Ｇ８３：5'-C GCA AGC TTG AGG CTC AAT G AA GCT CAT-3'(配列番号６６)）（Ｇ８４:5'-GGA GAT ATA CAT ATG GCA CCG GTT AGA TCT CTG AAC AGC ACC CTT CGC-3'(配列番号６７)）を用いるＰＣＲにより プラスミドｐＰＬＭｕＩＬ５３−Ｃ５ａから適合化する。増幅されたフラグメン トを、制限エンドヌクレアーゼＮｄｅ１およびHｉｎｄIIIにより消化し、アガロ ースゲルから回収する（フラグメント１）。プラスミド２９Ａ−１をＨｉｎｄII IおよびＢａｍＨＩにより消化し、Ｃ５ａＲＡまたはポリペプチド誘導体遺伝子 を含むフラグメントを回収する（フラグメント２）。ｐＥＴ９ｃ（ｐＥＴシステ ム・マニュアル、第３版、１９９３、ノヴァゲン）をＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ で消化し、フラグメント１および２による３方向ライゲーション実験で使用する ことにより、プラスミド５８Ａ−１が構築される。この構築物では、Ｃ５ａＲＡ またはポリペプチド誘導体をコードする遺伝子を、エンテロキナーゼおよびヒド ロキシルアミン開裂部位をコードするリンカー配列によりハイブリッドＩＬ１遺 伝子フラグメントの修飾フラグメントに結合する。エシェリヒア・コリ株ＢＬ２ １（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳおよびＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを、ｐ５８Ａ −１により形質転換し、カナマイシンおよびクロラムフェニコールを補ったルリ ア肉汁寒天プレートにおいてコロニーを単離する(マニアチスら、１９８９)。 実施例１８ エシェリヒア・コリにおけるヒトＣ５ａ融合タンパク質のＣ５ａ類似体または ポリペプチド誘導体の発現 発現実験は、スタディアら、「メソッズ・イン・エンザイモロジー」１８５： ６０−８９(1990)およびファン・ヘーケら、「プロテイン・エクスプレッション ・アンド・ピュリフィケーション」４：２６５−２７４(1993)に記載されたＴ７ ／ｐＥＴ発現系に関する標準的方法を用いて行われる。簡単に述べると、発現プ ラスミドを含む単一エシェリヒア・コリコロニーを、光学密度（５５０ｎｍで測 定）が約０.６に達するまで選択に適した抗生物質を補ったルリア肉汁中で生長 させる。この時点で、ＩＰＴＧおよびＺｎ++を加えて、それぞれ０.４ミリモル および１２.５マイクロモルの最終濃度とする。細胞のインキュベーションを２ １、３０または３７℃でさらに２−４時間続行する。細胞を遠心分離により採取 し、使用時まで−８０℃で貯蔵する。 実施例１９ Ｃ５ａ類似体またはポリペプチド誘導体融合タンパク質のヒドロキシルアミン 開裂 組換え融合タンパク質を、実施例１８からの冷凍したエシェリヒア・コリペー ストアリコートから、ｐＨ８.０で１ミリモルのＥＤＴＡを含む５０ミリモルの トリス／ＨＣｌ緩衝液（５：１ｖ：ｗ、緩衝液：細胞ペースト）中で解凍後に単 離する。次いで、細胞を音波処理により破壊し、粗抽出物を３０００×ｇで２０ 分間遠心分離にかける。融合タンパク質含有ペレットを、０.２モルのＣＡＰＳ Ｏ、２モルのＮＨ2ＯＨ.ＨＣＬ、６モルのグアニジニウム塩酸塩を含む溶液に可 溶化し、ＬｉＯＨによりｐＨ９.３に調節する（７：１ｖ：ｗ、緩衝液：細胞ペ レット）。 溶液を３７℃で７時間インキュベーションして、ヒドロキシルアミンによる融 合タンパク質開裂を促し、それが８０％を越えると、４モルＨＣｌによりｐＨを ８.０に調節する。８０％を越える割合でヒドロキシルアミン開裂融合タンパク 質を含む溶液を、２５ミリモルのトリス.ＨＣｌ（ｐＨ７.３）に対して一夜透析 する。次いで、透析物を３００００×ｇで２０分間遠心分離し、Ｃ５ａＲＡ−（ またはポリペブチド誘導体）含有沈澱物を集める。沈澱物を６モルグアニジニウ ム塩酸塩（５：ｌｖ／ｗ、緩衝液：沈澱物）で可溶化し、実施例５ｂに記載され た１ミリモル還元／０.０１ミリモル酸化グルタチオンを含む１００ミリモルの トリス／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７.４）で２０倍に希釈する。 次いで、上記方法に従い精製および二量体化が行われる。 この明細書で述べられた出版物および特許出願は全て、この発明に関係がある 当業界の熟練者の技術レベルを示すものである。各出版物または特許出願を具体 的に個々に示して説明の一部している場合と同じ範囲までこれら全ての出版物お よび特許出願を引用して説明の一部としている。 ここに記載された発明の様々な修正は、当業界の熟練者であれば明白に理解で きるものである。それらの修正も後記請求の範囲内に含まれるものとする。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION C5a receptor antagonist having substantially no agonist activity and production method   Field of the invention   This invention relates to the field of immunology, more specifically complement mediated diseases and It concerns treatment of inflammatory conditions.   Background of the Invention   Inflammation is a localized protective event induced by injury, It acts to destroy, reduce or prevent walls of both weaves. Inflammation can affect arteries, capillaries and And dilatation of venules, increasing conduit permeability, increasing blood flow, and It involves a series of complex events that exude protein. After these processes, many Leukocytes adhere to the vascular endothelium rapidly, followed by influx of cells into surrounding tissue Happens.   The complement system, the primary immune defense mechanism against foreign bodies, depends on each of the factors, including the inflammatory response. It has been shown to affect each. In general, complement is derived from tissues and blood And a set of proteins that work to eliminate other antigens. This function is complement formation Achieved alone or in conjunction with cells expressing antibodies or complement receptors Is done. More specifically, the system consists of about 30 plasma proteins, Corresponds to the cell receptor and several membrane regulatory proteins. Kinoshita, "Immuno Rosie Today, 12: 291-300 (1991). For example, an antigen-antibody complex Or the activation of the complement system by bacterial surface structure may lead to proteolytic cleavage of complement components and And triggering the amplification cascade of protein association events, ultimately Things are destroyed and eventually ejected. Mueller-Eberhardt, "Annual Review of Biochemistry, 57: 321-347 (1988).   Some bioactive peptides are produced by activating the complement system. 74 amino acids And a glycoprotein C5a having a molecular weight of about 11,000 is converted by C5 convertase Produced by proteolytic cleavage of the N-terminal end of the fifth component of complement, C5 . Nilusson et al., Journal of Immunology, 114: 815-82. 2 (1975). The biological properties of C5a are involved in both acute and chronic inflammatory processes Spread throughout many cells and tissues. Haguri, `` CRC Crit.Rev.Immunol. '' 1: 321-366 (1981). Many of these properties are immunologically beneficial. C5 a has been found to transmit host defense mechanisms in response to various pathological conditions. C 5a shows a wide variety of specific biological functions normally associated with the inflammatory response, such as smooth muscle contraction, blood Increased ductal permeability, erythematous erythema response upon injection into human skin, Histamine release, and oxidative bursts and polymorphonuclear leukocytes (PMNLs) And induction of lysosomal enzyme release. C5a is used for basophils, eosinophils, Stimulates measurable responses from all circulating leukocytes, including nuclei and neutrophils. Intense. Hagri, supra, Bauch et al., "Immunobiology" 185: 41- 52 (1992). C5a was found to be a more potent chemoattractant. H Hernandez et al., Journal of Immunology, 120: 109-11. 5 (1978). This protein is used to attract PMNLs, such as phagocytic cells, to sites of inflammation. It is a central stimulator.   Complement when directed against a suitable target, such as an invading microorganism or tumor cell Are beneficial, but have inappropriate pathogenic potential when activated inappropriately. You. For example, anaphylatoxins, such as C5a, are useful in several inflammatory diseases, such as adulthood. Causative or exacerbating factors in the onset of human respiratory distress syndrome and rheumatoid arthritis Be involved. Bauch et al., “Biochemical Journal” 288: 26 1-266 (1992), Haslett et al., "Journal of Immunology" 14 2: 3510-3517 (1989). In particular, the stray presence of C5a in tissues Up to now, patients with rheumatoid arthritis, osteoarthritis, psoriasis and noncardiac pulmonary edema have been Has been issued. Hammerschmidt, "Journal of American Medica Le Association, 244: 199- (1980). C5a is an inflammatory leukocyte For complement activation by additional activities including clute and stimulation and increased antibody production It has been found to be the main inflammatory mediator produced. Morrison et al. Proceeding of National Academy of Sciences of ・ The United States of America ”86: 292-296 (1989) reference.   In vivo or pharmacological control of inflammation is presumed to be dependent on the regulation of chemotaxis It is. The three levels at which inhibition can take place are already recognized. These are (1) Suppression of leukocyte response to chemotactic stimulants, (2) inhibition of chemotaxin production, and And (3) inactivation of chemotaxin. In addition, C5a has several human cells, e.g. For example, the specific C5a receptor found on the membrane of neutrophils, eosinophils and monocyte-derived cells In order to exert its various functions by binding to the body, C5a-mediated chemotaxis Significant attention has been paid to the inhibition of ATP, and particularly to the design of C5a receptor antagonists. I am attracted.   US Pat. No. 4,772,584 by Cleary et al. Comprises 6 amino acids from the C-terminus of C5a. Strep inhibiting C5a binding to PMNLs by cleaving peptides Disclosed are polypeptides isolated from Tococcus group A. By Hahn No. 4,692,511 discloses an essential core tetrapeptide Tyr-As showing C5a blocking activity. p-Gly-Ala (SEQ ID NO: 1) or Asp-Gly-Ala-Tyr (SEQ ID NO: 2), or Polypeptide receptor antagonis for C5a containing the repeptide Asp-Gly-Ala Is disclosed.   US5190922, WO90 / 09162 by Abbott Laboratories And 92/11858 bind to the C5a receptor and are alleged to be anaphylat Various oligopeptides that modulate the toxin activity are disclosed. However, this Some of these molecules have been shown to retain significant agonist activity. Morrison et al., "Progress in Infrastructure Research and "Rapy", "C5a Structural Requirements for Neutrophil Receptor Interaction", Birkhow Seel Verlag, Basel (1991) pp. 17-21, Kawai et al. Of Medicinal Chemistry "35: 220-223 (1992), Kawai et al. "Journal of Medicinal Chemistry" 34: 2068-2071 (1991), and Ol et al., "Journal of Medicinal Chemistry" 3 5: 402-406 (1992).   Potent and therapeutically effective C5a receptor antagonist capable of substantially abolishing agonist activity Tagonists are still in great demand. Furthermore, such C5a receptor ant There is still a strong need for an effective method of manufacturing tagonists.   Summary of the Invention   One aspect of the present invention is a C5a receptor antagonist, wherein A polypeptide analog of human C5a that does not exhibit toxin or agonist activity or Relates to polypeptide derivatives and dimeric forms of analogs or derivatives is there.   Another aspect of the invention includes the above polypeptide analogs or polypeptide derivatives. The fusion protein.   Polypeptides (ie, analogs or derivatives thereof) or fusion proteins Characterized by DNA molecules, plasmids, vectors and DNA molecules encoding Production of transformed host cells and C5a analogs, derivatives or fusion proteins A method is also provided.   Pharmaceutical formulations containing C5a analogs, derivatives or dimers thereof, are useful in mammals for C5a 5a-mediated methods of treating inflammatory conditions and diseases, and methods for inhibiting said inflammation It is advantageously used as a chemical.   Another aspect of the invention is directed to C5a, which exhibits substantially no cross-reactivity with human C5a. An antibody specific for an analog or polypeptide derivative. these Antibodies can be administered to circulating C5a analogs or derivatives (to which they have been previously administered). Detect or quantify and modify the activity of C5a analogs and derivatives in vivo Used, for example, to neutralize.   Brief description of drawings   FIG. 1 shows the synthesis of human C5a by oligonucleotide coupling. It is a flowchart explaining the synthesis | combination of a synthetic gene.   FIG. 2 is a plasmid map of pB-6 / C5a.   Description of the preferred embodiment   A C5a polypeptide analog or polypeptide derivative of human C5a of the invention is Is a C5a receptor antagonist having substantially no agonist activity. "C The term "5a receptor" refers to C5a, its degradation product C5a-desArg and On the surface of human blood cells, such as PMNLs and mononuclear cells, to which the agonists bind It is understood in the art to refer to a site. For example, US51771 90 and Operaman et al., Journal of Immunology, 151 (7 ): 3785-3794 (1993). C5a is a carboxypeptidase B-like enzyme Is enzymatically converted to C5a-desArg in human serum by It is a major physiological end product. Chenoweth et al., "Molecular Immunology -"17: 151-161 (1980).   The term "antagonist" means that the polypeptide is an inhibitor of C5a Means That is, they interfere with the binding of C5a to the C5a receptor. special Without intending to be bound by any theory, Applicants believe that C5a analogs of human C5a or Shows that polypeptide derivatives compete with C5a for binding to the C5a receptor Are considered to be competitive inhibitors of C5a.   The antagonism of the above C5a analogs or polypeptide derivatives of human C5a may be See Seligman et al., "Agents and Actions", detailed in Example 7. 21: 375-378 (1987).50As It can be quantified. IC50After administration of a counter-dose containing 100 picomoles of human C5a, C PMNLs Carrying Intracellular Kinetics of Calcium Ions by PMNLs Carrying 5a Receptors % Of the C5a analog or polypeptide derivative of human C5a that inhibits Defined. The C5a receptor antagonists of the present invention are described in Seligman et al., Supra. About 2.0 x 10 in the calcium increase assay disclosed in-6I not exceeding the mole C50Present.   "Substantially no anaphylatoxin activity" or "Substantially agonist "No activity" refers to a receptor that is a C5a analog of human C5a or a polypeptide. Derivative (hereinafter used interchangeably with C5a receptor antagonist) binds Also induce anaphylatoxin induction, which is ultimately triggered by the binding of C5a to its receptor Physiological responses usually associated with inflammation, such as phagocyte activation, smooth muscle contraction, vascular penetration Increased sex and inflammatory mediators such as histamines, prostaglandins, Thromboxanes, leukotrienes, interleukin (IL) -1, IL- Endogenous signal transduction events leading to overproduction of IL-6 and IL-8 are not induced Means that. Hagri et al., CRC Crit. Rev. Immunol. 1: 321-326 ( 1981) and PCT WO 92/10205. The quantitative measure of this property is also Seligman et al., Calcium Enhancement Disclosed in the above-cited reference and also described in Example 7. Obtained using additive tests. EC50Is a measure of agonist activity. Eye of the invention If the target, EC50Values are for C5a analogs or polypeptide derivatives of human C5a. C5a analogs of human C5a resulting in 50% of the maximal response elicited more respectively The concentration of the body or polypeptide derivative. Applicants have determined that calcium increase At least about 8.0 × 10-7Moles, preferably at least about 3.0 × 1 0-6The above C5a analog or polypeptide derivative of human C5a at sub-molar concentrations Has never been detected. C5a analogs of human C5a of the present invention Or the polypeptide derivative is EC50Responds with Seligman's calcium increase test At least about 8.0 x 10 in this assay because no-7 Moles, preferably at least about 3.0 x 10-6Molar C5a analog or polypeptide This is a case where measurement cannot be performed at a peptide derivative concentration or less.   C5a is a 74-amino acid polypeptide whose sequence is described by Fernandez et al. "Journal of Biological Chemistry" 253: 6955-69 64 (1978). Based on the derived nucleotide sequence The synthetic gene that was constructed is described in Mandeck et al., The Proceedings of National. ・ Academy of Science of the United States of A Merica, 82: 3543-3547 (1985) and Davidow et al., US 49. 37189. Amino of C5a disclosed by Fernandez The acid sequence and the corresponding synthetic nucleotide sequence disclosed by Davidow et al. It is shown in Table 1 below.   Applicants unexpectedly and surprisingly found that human C5a (hereinafter “C5 a (1-74) "), the C-terminal region of amino acid 64 By mutagenizing a portion of the synthetic C5a gene encoding -74 Certain analogs or polypeptide derivatives of human C5a that have been generated are C5a and Have found dramatically different properties. That is, they are excellent It exhibits gonist properties and has substantially no agonist activity. The above class of human C5a The N-terminal amino acid residue of the analog or its polypeptide derivative may be any amino acid. For example, the amino acid residue may be a Thr residue as in human C5a, or a Met residue. Special In particular, the polypeptide derivative of human C5a has a glycine residue at the N-terminus. I do.   That is, in one aspect of the present application, a polypeptide derivative of human C5a, A C5a receptor antagonist that does not substantially exhibit agonist activity; Derivatives having a glycine residue at the end are provided.   Preferably, the N-terminal glycine residue is in adduct form (N-terminal added residue) Obtained or, preferably, the glycine residue is the N-amino acid of human C5a. Substituent for acid threonine (substituted Thr1Gly).   In particular, a polypeptide derivative of human C5a according to the present invention may be, for example, human C5a Mutagenesis in the N-terminal amino acid residues of leonine to glycine, and C-terminal region of C5a (hereinafter, used interchangeably with "C5a (1-74)"), That is, a mutation was made in the portion of the synthetic C5a gene encoding amino acids 64-74. It can be created by triggering.   Specifically, a C5a analog or polypeptide derivative of human C5a of the present invention is The C-terminal region of C5a (1-74), Two modifications or mutations to (amino acids 64-74 of C5a (1-74)) It is defined in terms of at least one or preferably both. Primarily, At least up to Leu (72), ie Gly (73) and Arg (74) The truncation has been performed by removing residues. Second, the most preferred embodiment Wherein the C-terminal amino acid (ie, C-terminal) of the polypeptide is cysteine. In some cases, and the thiol (SH) group of the C-terminal cysteine is in reduced form ( That is, it has a free thiol group) or can spontaneously convert to a free thiol group. Or in a form that can be easily converted, at least one cysteine is This region has been replaced. In another preferred embodiment, the cysteine residue is in adduct form (Addition residue at C-terminal).   That is, in one embodiment, the polypeptide derivative has a cysteine residue. Group, the C-terminus of which is truncated by at least two amino acid residues Contains a C-terminal region that differs from the corresponding C-terminal region of human C5a. No.   In a preferred embodiment, two to six of the most C-terminal amino acids are C5a (1- 74). Accordingly, preferred polypeptide derivatives of the present invention Has a length of 64 to 72 amino acids, preferably 68 to 72 amino acids, more preferably Or 70 to 72 amino acids, and most preferably 71 amino acids.   That is, the N-terminal 63 amino acid region is kept intact and only cysteine is replaced. If so, each corresponding example or aspect is indicated, for example, as follows: obtain. That is, C5a (1-72, Leu72Cys), C5a (1-72, T hr1Met, Leu72Cys), preferably C5a (1-72, Thr1G ly, Leu72Cys), C5a (1-71, Gln71Cys), C5a ( 1-71, Thr1Met, Gln71Cys), preferably C5a (1-71, T hr1Gly, Gln71Cys), C5a (1-70, Met70Cys), C5a (1-70, Thr1Met, Met70Cys), preferably C5a ( 1-70, Thr1Gly, Met70Cys), C5a (1-69, Asp69 Cys), C5a (1-69, Thr1Met, Asp69Cys), preferably Are C5a (1-69, Thr1Gly, Asp69Cys), and C5a (1-69 68, Lys68Cys), C5a (1-68, Thr1Met, Lys68C ys), preferably C5a (1-68, Thr1Gly, Lys68Cys). In a further preferred embodiment, the C-terminal region is Met70, Gln71 or The extremities (including these) have been resected up to and including Leu72, which are as previously indicated. Equivalent.   In addition, the C-terminal region can be truncated at the N-terminus to Asn64, The above examples or embodiments C5a (1-67, His67Cys), C5a (1- 67, Thr1Met, His67Cys), preferably C5a (1-67, T hr1Gly, His67Cys), C5a (1-66, Ser66Cys), C5a (1-66, Thr1Met, Ser66Cys), preferably C5a ( 1-66, Thr1Gly, Ser66Cys), C5a (1-65, Ile65) Cys), C5a (1-65, Thr1Met, Ile65Cys), preferably Are C5a (1-65, Thr1Gly, Ile65Cys), and C5a (1-65 64, Asn64Cys), C5a (1-64, Thr1Met, Asn64C ys), preferably C5a (1-64, Thr1Gly, Asn64Cys) Corresponding, except that the C5a analog or polypeptide of human C5a produced is , The aforementioned essential antagonist properties (IC50Is about 2.0 × 10-6Does not exceed mole) With substantially anaphylatoxin or agonist activity (C5a analog or Means that the polypeptide derivative concentration is at least 3.0 × 10-6Not measurable below mole Na EC50). For those skilled in the art, human C5a An “analog” or “polypeptide derivative” is specific for a C5a or C5a receptor site. It should be understood that it does not include foreign antibodies.   Still other derivatives of human C5a described herein are within the scope of the invention. I will. These are the amino acids of the N-terminal 63 amino acid region (C5a (1-74) 1-63), such as point mutations, substitutions, additions and deletions, Et al., Protein Science 2: 1391-1399 (1993), and thus sudden changes. Include yet another amino acid substitution in the C-terminal region where the difference has been induced. the above Similarly, the derivative produced retains the C5a receptor antagonist and is substantially If the agonist does not have agonist activity, the type and extent of modification is generally not important. No. For example, the Cys27 residue in the N-terminal region of C5a (1-74) Conversion to a serine residue may minimize folding during regeneration. That is, the C5a analog derivative is, for example, C5a (1-71, Cys27Ser , Gln71Cys) or C5a (1-71, Thr1Met, Cys27S) er, Gln71Cys), or in a preferred embodiment, C5a (1-71, Th r1Gly, Cys27Ser, Gln71Cys). Also, N- The termini can be changed to methionine residues by substitution or addition and can be used in various host cells, e.g. Expression of C5a analogs or polypeptide derivatives in Escherichia coli Can be performed. As described in Example 1 and shown in Table 3, Example 3, below), the above-described C5a analog produced directly in Escherichia coli It has a Met residue as the N-terminus. In addition, it has a Met residue as the N-terminus C5a analogs or polypeptide derivatives are produced in the form of a fusion protein, Subsequently, the fusion moiety can be cleaved.   The N-terminal substitution may also result in a human C5a analog or polypeptide derivative of the invention. Expressed in various host cells, for example, Escherichia coli as a fusion protein, This is then done when isolating the fusion protein by cleavage at a convenient site. Can be For example, the fusion protein linked by a hydroxylamine bond By cleaving the polypeptide derivative of human C5a from the partner substance, natural human Substitution of a glycine (Gly) residue for the C5a threonine (Thr) N-terminus Done. Preferred Polypeptide Derivative C5a (Th1Gly) Having Substitution Aspects have been described above. Of these, the most preferred embodiment is C5a ( 1-71, Thr1Gly, Gln71Cys) or C5a (1-71, Thr 1Gly, Cys27Ser, Gln71Cys).   An example of yet another modification of the C-terminal region is at position 67 of C5a (1-74) Substitution of a phenylalanine residue for natural histidine. As an example, C5 a analog derivatives include C5a (1-71, Thr1Met, Cys27Ser, H is67Phe, Gln71Cys). That is, another preferred specific In the example, the polypeptide derivative of human C5a is as described above and the substituted C5a (H is67Phe). Preferred is C5a (1-71, Thr1Gly, Human C5 called Cys27Ser, His67Phe, Gln71Cys) a polypeptide derivative of a.   The C5a analogs or polypeptide derivatives of human C5a of the present invention are known in the art. It can be manufactured by many standard methods. For example, they are produced by direct chemical synthesis. Can be manufactured. They also encode the polypeptide in a suitable host cell DNA molecules, ie, by the expression of synthetic genes.   That is, according to yet another aspect of the present invention, polypeptide induction of human C5a A DNA molecule encoding a body, wherein said derivative substantially has agonist activity. C5a receptor antagonist that does not present and has a glycine residue as the N-terminus A DNA molecule is provided that is a derivative. The preferred embodiment is described here. DNA molecule encoding the polypeptide derivative of human C5a of the present invention It is. Among these, preferred is the polypeptide induction of human C5a of the present invention. A DNA molecule that encodes a body and is 64 to 72, preferably 71, in length. It is an amino acid residue. Even more preferred is C5a (1-71, Thr 1Gly, Cys27Ser, Gln71Cys) or C5a (1-71, T hr1Gly, Cys27Ser, His67Phe, Gln71Cys) Is a DNA molecule that encodes the polypeptide derivative to be produced.   These DNA molecules are analogs of human C5a or amino acids of polypeptide derivatives. It can be derived from the amino acid sequence and can also be produced by known techniques. DNA is Lang, "Tetrahedron" 39: 3-22 (1983) and EPA 146785, Mandeck et al., "Proceedings of National Academy of Jens of the United States of America 82: 354 3-3547 (1985) (discloses the chemical synthesis of the gene encoding C5a). Can be chemically synthesized as described in US Pat. A fragment of a DNA molecule is It can be produced chemically and then enzymatically linked. "Current Protocols In Molecular Biology, Volume 1, Chapter 8, Ausberg et al. (Edit) See Willie, New York (1990).   Encodes a C5a analog or polypeptide derivative of human C5a of the invention DNA can also be a known synthetic or natural gene encoding C5a, such as Mutagenesis of those disclosed by Nandes, Mandeck and Davidson It can be manufactured by heat. Ausberg et al., Supra, Maniacis et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Volume II, Chapter 15, Cold Spring Harbor, New York (1989), and Morrison et al. Of the National Academy of Sciences of the United Ted States of America, 86: 292-296 (1989). further , DNA can be produced by PCR technology. PCR Protocols, Innis et al. (Eds.) Vol.), Academic Press, San Diego, California (1990).   A DNA molecule encoding a C5a analog or polypeptide derivative of the present invention is According to art-recognized techniques, known regulatory sequences such as promoters, enhancers Functions on 3′-untranslated and 5 ′ translated sequences, such as signal and leader sequences And then transformed into a host cell capable of expressing the gene. Next And transforming the transformed host cells into a suitable expression vector for the antagonist-encoding gene. Culture under conditions. Representative host cells include prokaryotes, for example, Escherichia coli. And Bacillus, such as Bacillus subtilis, and eukaryotes, such as filamentous fungi Eg, Aspergillus niger, yeast, eg, Saccharomyces cerevisiae , Kia pastoris and Jarovia lipolytica, baculovirus / insect cell Cell Culture (Summers et al., "A Manual of Methods for Baculo" Virus Vectors and Insect Cell Culture Procedure The Texas Agricultural Experiment Station (1 987)), mammalian cell lines, and plants (Bandekerkkhove et al., Bio / Technology, 7: 929-932 (1989)).   Generally, the method of expressing C5a in Yuscherichia coli is based on C5a analogs or May be applied to gene expression of polypeptide derivatives of human C5a. Mandeck, "Proceedings of National Academy of Science of ・ The United States of America ”82: 3543-3547 (1 985), Morrison et al., `` Proceedings of National Academy of ・ Science of the United States of America ”86: 2 92-296 (1989), and Bauch et al., "Immunobiology" 185: 4. 1-52 (1992). Appropriate regulatory sequences, such as a promoter (eg, T7 polymerase) , UV5-D, trp or lac), ribosome binding site, and transcription termination Selection of a suitable plasmid vector containing a stop site, for example, pKK223-2, is Included within the level of industry expertise. Expression in Escherichia coli To optimize, Guoi et al., Nucleic Acids Research, 10: 7 055-7074 (1982) using codons suitable for Escherichia coli. DNA molecules should be synthesized using several restriction endonuclease sites The characterization of the synthesized DNA and possibly the mutagenesis of the DNA sequence Becomes easier. Using this method, a polypeptide encoding the first amino acid of a polypeptide can be used. Introduce an ATG start codon for protein synthesis directly upstream of the replet This allows direct expression of the C5a analog or polypeptide derivative of the present invention. Become. In addition, Escherichia coli strains such as Ion are present in wild-type cells. Lacks one of several existing proteases to increase protein yield Presents the advantage of Franke et al., “Methods in Enzymology” 1 6 2: 653-658 (1988).   That is, yet another aspect of the present invention relates to a C5a analog of human C5a of the present invention. Or operably linked to a DNA molecule encoding a polypeptide derivative. A recombinant DNA molecule containing a promoter operable in a given host. Things. In addition, the present invention provides a C5a analog or polymorph of human C5a of the present invention. A predetermined host comprising the above-described recombinant DNA molecule encoding a polypeptide derivative; It relates to compatible recombinant plasmids. In a broader sense, certain aspects are Encodes a C5a analog or polypeptide derivative of human C5a of the invention A recombinant vector compatible with a given host, comprising the above-described recombinant DNA molecule. Things.   Also, for example, the expression of a C5a analog gene in a host such as Escherichia coli Expression can be enhanced by expressing the gene in a fusion protein form. The fusion protein according to still another aspect of the present invention generally comprises an N-terminal to a C-terminal. At the end, fusion partner, cleavable linker, and fused thereto, human C5a In this case, the polypeptide derivative The body is a C5a receptor antagonist that exhibits substantially no agonist activity. Within the scope of the present invention, the polypep of the human C5a forming part of the fusion protein Tide derivatives are specific analogs or polypeptide derivatives of the invention described above. Without limitation, they form a preferred embodiment. Conversely, Such analogs or derivatives are substantially similar to the agonis A C5a receptor antagonist derived from human C5a that does not exhibit Any other C5a analog or polypeptide derivative of human C5a Is also good. In particular, yet another preferred analog or derivative form of the fusion protein The moiety may be substituted for the analog or derivative of the invention by an N-terminal substitution of human C5a, e. Induced by introducing a replacement Thr1Gly or Thr1Met. As well In addition, analogs of human C5a without substitution at the N-terminus (Thr1) of human C5a, Alternatively, polypeptide derivatives can also be used for the fusion protein. Alternatively, human Other amino acids added to the N-terminal of the analog or polypeptide derivative of C5a And an adduct is obtained. Preferred are such analogs or polymorphs of human C5a. The polypeptide derivative further comprises a cysteine residue, as described above. And the C-terminal is truncated by at least two amino acid residues. Contains a C-terminal region different from the corresponding C-terminal region of human C5a It is a park. More preferably, the fusion protein is as an adduct or even Human C5a having a cysteine residue at the C-terminus, preferably as a substituent Such analogs or polypeptide derivatives.   Methods for producing such fusion proteins using chemical and enzymatic cleavage sequences are described in the art. Known in the art. For example, Smith, "Methods in Molecular Bio , Vol. 3, "New Protein Technics", 57-70 and 71-88 (1984), and Van Heke et al., Protein Expressi. And Purification, 4: 265-74 (1993). In general, The fusion partner may be a gene (eg, a gene that is highly expressed in a host, for example, Escherichia coli). Or a fragment thereof). In the case of Escherichia coli, a suitable fusion partner Include endogenous Escherichia coli genes and synthetic genes, such as Escherichia -Some contain E. coli preferred codons. In addition, other fusion partners known in the art, For example, human carbonic anhydrase II (see Example 16 for details) Can be used. In principle, when the size of the fusion partner is small, C5 of human C5a a Higher yield of analog or polypeptide derivative.   In a very preferred embodiment of the invention, the N-terminus to C-terminus, fusion partner, cleavable Linker and a polypeptide derivative of human C5a in a state fused thereto. Wherein the polypeptide derivative is substantially A C5a receptor antagonist that does not exhibit agonist activity on the fusion partner Can direct the formation of inclusion bodies in cells, preferably Escherichia coli cells A fusion protein, which is a polypeptide, is provided.   Applicants unexpectedly and surprisingly found that fusion proteins according to the invention In particular, the fusion partner coexisting with the cleavable linker is human P5a Polypeptides that are approximately the amino acid length (or molecular weight) of the polypeptide derivative or less If it is a tide, it can direct inclusion body formation, especially in Escherichia coli Was found. That is, one embodiment of the present invention is the above fusion protein, The fusion partner can direct the formation of inclusion bodies in cells, especially Escherichia coli cells And fusion proteins. Preferred is the top The above-mentioned fusion partner coexisting with the cleavable linker is the above-mentioned polypeptide of human C5a A polypeptide that is approximately the amino acid length (or molecular weight) of the derivative or less , A fusion protein. That is, for example, the preferred polypeptide of human C5a described above. When the peptide derivative has a length of 64 to 72 amino acids, it may coexist with the linker. The fusion partner is preferably about the same length, preferably less than said length, preferably 4 It has a length of 2 to 61 amino acids or less. The fusion partner itself is preferable Has a length of 40-53 amino acids or less. Preferably, the fusion partner Is the human interleukin-1β (also referred to as IL-1β or IL-IB) Includes N-terminal fragment or mutant thereof. Where the expert admits Then, a point mutation, for example, a single point collision like human IL-1β (Cys9Ser) Mutations can be induced in the N-terminal fragment of human 1L-1β, The result is a more favorable fusion partner that can direct inclusion body formation. For example, on According to the description above, the fusion partner is human IL-1β (Dinalero, “ Blood 77: 1627-52 (1991)) or a mutant thereof. 1 to 47. Optionally, the fusion partner is, for example, human IL-1β. The N-terminal fragment is 3 to 6 amino acids long (de Human interleukin 1 receptor antagonist (IL) -1RA). Standard for those skilled in the art Technology (eg, similar to C5a by systematically changing the size (length) of the fusion partner By measuring the expression titer of the fusion protein). Size can be determined.   In a preferred embodiment for expression in Escherichia coli, the fusion partner is Hybrid protein human interleukin 1 beta and interleukin 1 159-nucleotide encoding a 53 amino acid fragment of a receptor antagonist Encoded by leotide DNA (Dinalello, "Blood" 77: 162) 7-52 (1991)), the DNA of which contains Escherichia coli preferred codons. Take The fusion partner can be, for example, N-terminal to C-terminal, human IL-1β as described above or Amino acid residues 1-47 of the mutant and human interleukin 1 receptor In the order of amino acid residues 52-57 of the antagonist (Dinalero, see above) Be composed. Also preferred as a fusion partner for expression in Escherichia coli Of human interleukin 1 beta and interleukin 1 receptor antago 50 amino acid fragment (Eschery) consisting of Nist hybrid protein (Encoded by a 150 nucleotide DNA containing a preferred E. coli codon) It is. Such fusion partners include, for example, N-terminal to C-terminal, human IL-1β as described above. Or amino acid residues 1-47 of the mutant and human interleukin 1 The order of amino acids 52-54 of the receptor antagonist (Dinalello, see above) It consists of.   In a preferred embodiment, the cleavable linker of the fusion protein of the invention is Droxylamine-sensitive site (Asn-Gly) (hydroxylamine cleavage site (Also known as Caray, E. , Clayton, T. E. FIG. (Edit): "Protein Structure, A Practical Approach ", IR Press, Ok Sford, United Kingdom (1989)). Optionally, further, such a linker is In the art, located N-terminal to the hydroxylamine cleavage site described above ( For example, van Heke et al., "Protein Expression and Purif Application: 4: 265-274 (1993)), the amino acid sequence -Val-Asp-A Enter-kinase protease cleavage site of sp-Asp-Asp-Lys- (SEQ ID NO: 68) In this case, the linker is ligated by a 24-nucleotide DNA fragment. Is converted to a password. When expressed in Escherichia coli, the linker is Rich It is encoded by a DNA molecule that contains an E. coli preferred codon. If you are an expert As can be seen, the full length (or molecular weight) of the fusion partner coexisting with the linker is generated. The length (or molecular weight) of the polypeptide derivative of human C5a Or less, additional linkers containing the cleavage site (s) described above. Inclusion of the amino acid residue (s) may facilitate cleavage. example Additional cleavage site between the fusion partner and any of the cleavage site (s) There may be one, two or three or more amino acid residue (s). Alternative If multiple cleavage sites are present, the additional amino acid residue (s) It may be between each two of the cleavage sites.   That is, in a preferred embodiment, the fusion protein according to the present invention has an N-terminal -C-terminus, amino acid residues 1-4 of human IL-1β or a mutant thereof as described above. 7, and amino acid residues 52-54 of human IL-1RA, amino acid residue -Val-Asp A cleavable linker sequence comprising -Asp-Asp-Asp-Lys-Asn-Gly- (SEQ ID NO: 69), And the above-mentioned human C5a polypeptide derivative. The C-terminal amino acid residue Gly of the cleavable linker is added to the polypeptide derivative. Substituent for the N-terminal amino acid residue Thr of human C5a. This statement In the present invention, preferred polypeptide derivatives are those described above, for example, amino acid residues Is a polypeptide derivative of the present invention having a length of 64 to 72, preferably 71. . Preferred examples of the above derivative include C5a (1-71, Thr1GlyNCys27 Ser, Gln71Cys) or C5a (1-71, Thr1Gly, Cys) 27Ser, Hus67Phe, Gln71Cys).   Yet another embodiment of the present invention relates to the fusion protein This is related to a DNA molecule to be converted into a peptide. For example, preferred is the fusion described above. A DNA molecule encoding a protein, wherein the fusion partner is Amino acid residues 1-47 of human IL-1β or a mutant thereof, and human IL-1β The amino acid residues 52-57 of -1RA or the fusion partner is Amino acid residues 1-47 of human IL-1β or a mutant thereof described above, and human The IL-1RA amino acid residues 52-54. A particularly preferred example is , N-terminus to C-terminus, human IL-1β or a mutant thereof as described above. No acid residues 1-47, amino acid residues 52-54 of human IL-1RA, amino acid sequence Cleavable linker comprising -Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Asn-Gly-, and claims A fusion protein composed of the polypeptide derivative according to 1 in the order Wherein the C-terminal residue Gly of the linker is Substitution of human C5a for N-terminal amino acid residue Thr in peptide derivatives Group.   Another aspect of the invention relates to a DN encoding a fusion protein according to the invention as described above. A promoter operable in a given host operably linked to an A molecule , Including recombinant DNA molecules. Another embodiment is a recombinant plasmid. Or, in a broader sense, a recombinant vector, each Compatible with the host and includes the recombinant DNA molecule described above. The above recombinant DNA molecule, plastic Preferred embodiments of each of the sumid or vector are the DNA molecules and / or Or as described above in relation to the fusion protein.   Production of each of the above DNA molecules, recombinant DNAs, plasmids or vectors The method is the same as the above method.   Generally, synthetic genes encoding C5a analogs or polypeptide derivatives Can be expressed in yeast by following known methods. For example, Romanos et al. "East" 8: 423-488 (1992), Gödel (eds.), "Methods in Enzymology, verse 6, 185: 231-484 (1990), Davidou et al., Before Out, And US4775622. In order to optimize expression in yeast, especially for endogenous K To avoid Arg-Arg pairing, which is the target for the EX2 protease, DNA molecules should be produced using yeast preferred codons. As the N-terminus The use of glutamine as opposed to methionine gives a signal sequence, e.g. For example, proteolytic cleavage from the alpha factor signal sequence is facilitated. Further Preferably, the potential glycosyl of various aspects of the present C5a receptor antagonists Site, for example asparagine at position 64, is eliminated.   C5a analogs or polypeptide derivatives-codes of the invention in mammalian cells Expression of the mutated gene can be performed according to a known method. Maniatis et al., Mentioned above, Expression of Cloned Genes in Mammary Cells ", Chapter 16. In human cells A representative expression method is described in Berg et al., "Biotechnics" 14 (6): 972-9. 78 (1993). Suitable human cells include publicly available cells. For example, HeLa S3 (ATCC CCL2. 2) and HEK293 (ATCC CRL 1573). Expression in CHO cells, for example, Selbergs et al., "Fibrinolysis", 7: 1-14 (1993). Suitable hamster cell lines include CHO-K1 (ATCC CCL61), BH K (ATCC CRL6281), BHK-21 (ATCC6281 and CCL10) And CRL8544). A typical monkey cell is CV-1 (ATCC C CL70), COS-7 (ATCC CRL1650) and VERO cells (A TCC CCL81). A suitable mouse cell line is C127 (ATCC 1804). A preferred cell line is Uriaub et al., "Proceedings. ・ National Academy of Science of the United Station DHFR disclosed in "Arts of America" 77: 4216-4220 (1980). -Minus CHO line. Serum dependent cell lines are more preferred. See Kurano et al., "Bio / Technology," 16: 245-258 (1990). Mammal accommodation Primarily, glycosylated or unglycosylated forms of the C5a analog can be produced. .   That is, yet another aspect of the present invention relates to human C5a, all of which are described above. Coding or fusion proteins encoding C5a analogs or polypeptide derivatives Transformed with a recombinant DNA molecule, including a DNA molecule encoding To a modified recombinant host. Preferably, the recombinant host is a bacterium, a true host. Selected from the group consisting of fungi, insects, mammalian and plant cells, which are Where it is. In any case, Escherichia is particularly preferred as a recombinant host. Here's Here Kori.   Preferably, by using a convenient one-step method, the transformed Escherichia A C5a analog or polypeptide derivative of human C5a isolated from E. coli cells Restored, the C-terminal cysteine is in reduced form, i.e., containing a free thiol group. The biological activity of Applicants unexpectedly found that the molar ratio of reducing agent to oxidizing agent Denaturation occurred with a redox couple having a ratio of at least about 100: 1 to about 500: 1. By treating the C5a analog, a product having a reduced form of the C-terminal cysteine is obtained. It was discovered that a bioactive C5a analog could be obtained. This percentage is about 10-fold to about 50-fold greater (10: 1 reduced sulfhydryl to oxidized sulfhydride The preferred ratio of the ril compound is determined by Builder et al., US Pat. No. 4,620,948, column 17, 43-. Disclosed at line 45). According to this method, transformed Escherichia coli cells Is denatured and soluble after culturing under conditions sufficient to induce the production of C5a analogs. When mixed with an agent such as 6M guanidine HC1, a modified C5a analog is produced. If desired by known techniques such as sonication, French Press or Dynomill It may be further crushed. Subsequently, the above-described element containing the denatured C5a analog is Mixed or ground cells under appropriate conditions by weight of reducing agent / oxidizing agent When mixed with a redox couple having a molar ratio of at least about 100: 1 to about 500: 1, A reduced biologically active C5a analog is produced. That is, another preferred of the present invention An embodiment is a method for producing a biologically active polypeptide derivative of human C5a, A C5a receptor antagonist wherein the conductor exhibits substantially no agonist activity; The above derivative has a glycine residue as an N-terminal, (1) Encoding the above polypeptide derivative under conditions suitable for inducing expression of a DNA molecule Culturing Escherichia coli cells stably transformed with transforming DNA molecules And (2) by contacting the cells cultured as described above with a denaturing and solubilizing agent; Producing a modified form of said polypeptide derivative; and (3) The polypeptide derivative denatured as described above is converted into a reducing agent under appropriate conditions. A reducing agent and an oxidizing agent wherein the molar ratio of the oxidizing agent to the oxidizing agent is at least about 100: 1 by weight; Preparation of biologically active forms of polypeptide derivatives by mixing with solutions containing agents Do And a method including the step of:   Suitable redox couples include cysteine / cystine and reduced glutathione / oxidation Contains glutathione. Other experts in the industry can use other redox couples. I admit that it can be used. Glutathione redox couples are preferred. suitable Conditions include 6. 5-7. 5, preferably 7. A pH of 4 is included. Protein The mixture is left at room temperature for a time sufficient to maximize the yield. The preferred time is about 1/2 hour to about 4 hours. That is, by this method, the refractive power is Isolated inclusion bodies (ie, an insoluble mass of expressed protein) The need to reduce the thiol group of the C-terminal cysteine is eliminated.   As a fusion protein, a C5a analog or polypeptide derivative of human C5a Since expression may be desirable, yet another aspect of the invention is described above. Wherein the DNA molecule comprises a polypeptide derivative in the form of a fusion protein. It relates to the encoding method. Preferably, the method further comprises the mixing Prior to the combining step, a step of cleaving the expressed fusion protein is included. For this reason, A method for producing a biologically active C5a analog or polypeptide derivative of C5a, comprising: C5a receptor antagonist wherein said analog does not substantially exhibit agonist activity And (1) Encoding a fusion protein form of the polypeptide derivative C5a analog Culturing a host cell stably transformed with the recombinant DNA molecule, The culturing is performed under conditions suitable for inducing the expression of the fusion protein, (2) isolating the fusion protein from the host cells cultured as described above, (3) By cleaving the fusion protein separated as described above, human C5a To obtain a C5a analog or polypeptide derivative of Is provided.   Fusion protein and human C5a polypeptide contained in the fusion protein Preferred embodiments of the derivative are the fusion proteins or polypeptides described above, respectively. It is a derivative. Preferred polypeptide derivatives have an amino acid residue length of 64-7. 2, for example, C5a (1-71, Thr1Gly, Cys27Ser, Gl n71Cys) or C5a (1-71, Thr1Gly, Cys27Ser, His67Phe, Gln71Cys). Further reaction conditions of the above method Is as described above.   C5a analog or polypeptide derivative thereof as an inclusion body in a fusion protein form An embodiment of the present invention relates to a method for producing a biologically active polypeptide derivative of human C5a. A C5a receptor antago wherein the derivative does not substantially exhibit agonist activity Is a ninth, (1) Encoding the polypeptide derivative C5a analog in the form of a fusion protein Culturing a host cell stably transformed with the recombinant DNA molecule, The culture is performed under conditions suitable for inducing the expression of the fusion protein in the form of inclusion bodies. Shall be (2) Separating the inclusion body containing the fusion protein from the host cells cultured as described above , (3) The inclusion body separated in the above manner is brought into contact with a denaturing and solubilizing agent to form a denatured form. Form a fusion protein, (4) By cleaving the fusion protein separated as described above, human C5a And a polypeptide derivative of (5) The fusion protein cleaved in the manner described above is reduced under appropriate conditions with a reducing agent versus an oxidizing agent A solution comprising a reducing agent and an oxidizing agent having a molar weight ratio of at least about 100: 1. Mixing produces a biologically active form of the polypeptide derivative (However, steps 3 and 4 are performed simultaneously or consecutively) ).   Generally, DNA molecules, fusion proteins, polypeptide derivatives and host cells Preferred embodiments are described above. That is, preferably the host cell is Escherichia coli cells. In a preferred embodiment, the recombinant DNA Are N-terminal to C-terminal, fusion partners, cleavable linkers and fusions And a polypeptide derivative of human C5a. Derivative is a C5a receptor antagonist that does not substantially exhibit agonist activity Encode a fusion protein. According to the statement above, the induction The body preferably has a cysteine residue and has at least two amino acids C-terminal. Differs from the corresponding C-terminal region of human C5a in that it is truncated by residues. C-terminal region. In particular, the above derivatives have a cysteine residue as C-terminal. Have. In a very preferred embodiment, the derivative is a glycine residue at the N-terminus. Having.   In order for this method to be performed effectively, the above The fusion partner is preferably the same amino acid as the above polypeptide derivative of human C5a. It is a polypeptide of acid length (or molecular weight). In particular, the fusion partner is And contains the N-terminal fragment of human IL-1β. For example, the fusion partner is Amino acid residues 1-47 of human IL-1β or a mutant thereof described above, and human The amino acid residues 52-57 of IL-1RA or the fusion The partner is amino acid residues 1-47 of the above-mentioned human IL-1β or a mutant thereof, And amino acid residues 52 to 54 of human IL-1RA. preferable In a specific example, the linker comprises a hydroxylamine cleavage site. More specific The linker is N-terminal to C-terminal, enterokinase protease It is composed of a cleavage site and a hydroxylamine cleavage site in this order.   For this reason, such fusion proteins are preferably N-terminal to C-terminal, as described above. Amino acid residues 1-47 of human IL-1β or a mutant thereof, human IL-1R Amino acid residues 52 to 54 of A, amino acid sequence -Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Asn-Gly A cleavable linker comprising-(SEQ ID NO: 69), and the polypep of claim 1. Where the C-terminal residue Gly of the linker is At the N-terminal amino acid residue Thr of human C5a in the polypeptide derivative Is a substituent. This derivative can be 64-72 amino acid residues long, or Or it may have another preferred length as described above. Preferred polypep in this specification Examples of tide derivatives include C5a (1-71, Thr1Gly, Cys27Se r, Gln71Cys) or C5a (1-71, Thr1Gly, Cys27 Ser, His67Phe, Gln71Cys).   In particular, inclusion bodies containing the produced fusion proteins are subjected to low speed centrifugation (eg, about 300 0xg) can be quantitatively collected after cell lysis using Is obtained, which can then be solubilized appropriately. This method uses a fermenter The advantage of using a 20-fold reduction in the volume per unit weight of the collected cells is used. Present a point.   In a preferred embodiment, the mixing is carried out as described above, especially at a pH of about 6. 5 to about 7. 5 Preferably, the mixing is for a period of about 1/2 hour to about 4 hours. Will be The redox couple is preferably reduced glutathione / oxidized gluta, as described above. It is Zion.   Alternatively, a C5a analog or polypeptide derivative of human C5a can be, for example, Standard regeneration and purification schemes, such as those disclosed in Builder et al., US Pat. No. 4,620,948. Can be restored according to what was restored. According to these methods, the C-terminal cysteine is It will be in adduct form, for example, cys-cys or cys-glutathione. Therefore In order to obtain free thiol groups, the adduct must be further reduced. Book Applicants have added a disclosed C5a analog or polypeptide derivative of human C5a. The additive does not substantially exhibit agonist activity as described herein. a also functions as a receptor antagonist, and thus is included within the scope of the present invention. Re I discovered that. However, when using these standard restoration techniques, Further reduction is required to generate new embodiments.   After reconstitution, the C5a analog or polypeptide derivative of human C5a will have the desired degree. Can be purified. Representative purification schemes include ultrafiltration, diafiltration, and gel filtration. Electrophoresis, chromatography methods, such as ion exchange chromatography, Size exclusion chromatography, HPLC, reverse phase HPLC, Sephadex Treatment, dialysis, affinity chromatography, etc. Industry skill Those of ordinary skill will recognize that combinations of purification schemes can be used.   A C5a analog or polymorph of human C5a of the invention having a C-terminal cysteine residue. Lipeptide derivatives can be oxidized to form dimers according to standard techniques. Ie Yet another embodiment is a method comprising a first and second polypeptide derivative of human C5a. C5a wherein each of the above derivatives exhibits substantially no agonist activity A receptor antagonist having a C-terminal cysteine residue; A cysteine residue of the second derivative is connected via a disulfide bond; The first and second polypeptide derivatives of C5a can be the same or different, At least one of the first and second polypeptide derivatives of human C5a Ie, polypeptide derivation of human C5a with a glycine residue as the N-terminus It is about the body, the dimer. Preferably, in such a dimer, The C-terminal region of each of the first and second derivatives has at least two amino acid residues. Differs from the corresponding C-terminal region of human C5a in that the Become. In a preferred embodiment of such a dimer, the first and second derivatives Each is a human C5a derivative C5a (1-71, Thr1Gly, Cys27Ser , Gln71Cys). To produce the dimer, the C of each monomer (analog) -Oxidation of the terminal cysteine thiol (-SH) group creates a disulfide bond. Is done. Homo dimers and hetero dimers are encompassed by the term "dimer".   Another aspect of the invention is a method of treating or preventing mammals, including humans. The present invention relates to the polypeptide derivative of human C5a of the present invention or a dimer thereof. is there. Yet another aspect is a C5a-mediated disease or inflammation in a mammal, including a human. The human C5a of the present invention as described above for the manufacture of a pharmaceutical composition for treating a condition. Or a dimer thereof.   In another aspect, the above-mentioned polypeptide derivative of human C5a of the present invention or a dimer thereof Mammals, including humans, comprising a therapeutically effective amount of Pharmaceutical compositions useful for treating C5a-mediated diseases or inflammatory conditions in primates It is. As used herein, preferred polypeptide derivatives or dimers are those of the present invention. Preferred compounds according to the above are those mentioned above (see above). For example The pharmaceutical composition is preferably a polypeptide derivative of human C5a, ie C5a (1-71, Thr1Gly, Cys27Ser, Gln71Cys) or above And its dimers including the derivatives.   Yet another aspect is a method of treating a C5a-mediated disease or inflammatory condition in a mammal. Administering a pharmaceutical composition as described above to a mammal, including a human, in need of treatment. The method involves floors. Yet another embodiment is directed to mammals, including humans. For reducing C5a-mediated inflammation, the complement being sufficient to reduce inflammation The above-described pharmaceutical composition is administered to the mammal at one time for an activation-induced or exacerbating event. A method comprising the step of administering.   In particular, C5a analogs or polypeptide derivatives of human C5a of the present invention and their derivatives. Are involved in the complement system, more specifically C5a and anaphylatoxin Useful for the treatment and / or prevention of any adverse condition or disease. They are C 5a administered to a mammalian patient, particularly a human, at risk of transmitting tissue destruction and death It is very effective in treatment. Generally, these conditions or diseases include, for example, C5 a is an inflammatory disease produced proteolytically in serum. C5a of human C5a Representative medical conditions that respond to analogs or polypeptide derivatives or dimers thereof include , Pneumonia, adult respiratory distress syndrome (ARDS), idiopathic pulmonary fibrosis, lung inflammation or injury , Chronic progressive pulmonary pustular abnormalities (discystic) fibrosis, cotton lung disease, asbestos-induced inflammation, myocardium Infarction, post-myocardial infarction inflammation, ischemic heart injury, cirrhosis, primary biliary cirrhosis, chronic liver For inflammation, pancreatitis, hemorrhagic pancreatitis, inflammatory bowel disease, colitis, ischemic brain injury, encephalitis, meningitis Cranial nerve injury, meningitis, uveitis, Percher's retinopathy, immune complex-mediated thread Spherical nephritis, renal cortical necrosis, gout, vasculitis, serum disease, angioedema, myasthenia gravis, whole body Lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, bullous skin disease, irritability, psoriasis, There is dotoxin shock, sepsis, severe trauma and burns. They are also transplanted For patients suffering from rejection, patients receiving immunosuppressive therapy or mass transfusion, medical devices Exposed patient, hemodialysis and lung machine after leukopheresis It can be used therapeutically to treat patients experiencing dysfunction.   In addition, these analogs, polypeptide derivatives and dimers thereof, especially in reperfusion Conditions induced by, for example, reperfusion after ischemia and cyclic contact with medical devices As therapeutic agents, as well as for the prevention of transplant rejection. This Wherein the C5a analog or derivative preferably induces inflammation or an existing inflammatory condition. It is administered prior to or substantially simultaneously with an event known to worsen the condition.   The C5a analogs, polypeptide derivatives and dimers thereof of the present invention may be optionally Containing conventional and non-toxic pharmaceutically acceptable carriers, adjuvants and excipients. In dosage form formulations, therapeutically effective routes for proteinaceous drugs, e.g. parenteral, nasal It may be administered by the buccal, rectal or buccal route. The term “parenteral” refers, for example, to subcutaneous Delivery methods such as injection, intravenous, intramuscular, intrasternal, intraarterial injection and infusion techniques Is included.   The dose of a C5a analog or polypeptide derivative (and dimer) of the invention may be: It can be varied to obtain the desired therapeutic response for an individual patient. For example, This includes the activity of the particular antagonist, the mode of administration, the severity of the condition being treated, and And the health of the patient. For a given condition and patient Decisions are within the level of skill in the art. Generally, one kilogram of body weight per day Dose levels of about 1 μg to 100 mg per mouse are administered to a mammalian host. Preferred A low dose level is about 0.2 mg / kg body weight per day. Ranges from 1 mg to about 20 mg . The C5a analog is administered to the patient as a single continuous dose over an extended period. I However, the total effective dose may, if desired, be multiple doses, e.g. It can be divided into doses.   The C5a analogs or polypeptide derivatives (and dimers) of the present invention are known Can be formulated into a composition using both pharmaceutically acceptable ingredients and methods of manufacture . For example, Remington et al., “Pharmaceutical Sciences,” No. 15 Edition, Mac Pub. (Easton, PA) (1975). For parenteral administration Suitable compositions include sterile pharmaceutically acceptable aqueous or non-aqueous solutions, dispersions, suspensions Liquid or emulsion, as well as a sterile injectable solution or dispersion immediately before use. Contains the sterile powder to be made. Suitable aqueous and non-aqueous carriers, diluents, solvents or excipients Representative examples of excipients include water, ethanol, polyols such as glycerin , Propylene glycol, polyethylene glycol, and their suitable mixtures Foods, vegetable oils such as olive oil, and injectable organic esters such as ethyl There is oleate. Flowability depends on the use of coating materials, e.g. lecithin, Various means including the maintenance of the particle size (in the case of dispersions) and surfactants Can be maintained by   These compositions may also contain adjuvants such as preserving, wetting, emulsifying, dispersing, Antibacterial and antifungal agents such as parabens, chlorobutanol, phenol and Sorbic acid, isotonic agents such as sugars, sodium chloride, or absorption delaying agents such as It may include aluminum monostearate and gelatin. C5a receptor anta Gonists may be slow or sustained release or targeted delivery systems, such as polymer matrices. It can be incorporated into elixirs, liposomes and microspheres.   Injectable preparations can be prepared by a number of means, including filtration through sterile filters, and Is sterile, which can be dissolved or dispersed in sterile water or other sterile injectable medium immediately before use It can be sterilized by incorporating a sterilant in the form of a solid composition.   Suspensions include C5a analogs, polypeptide derivatives or dimers thereof and other active ingredients. In addition to the active ingredient, if any, suspending agents such as ethoxylated isostearyl alcohol , Polyoxyethylene sorbitol and sorbitan esters, microcrystalline Cellulose, meta aluminum hydroxide, bentonite, agar-agar, tragacan It may include gum rubber and mixtures thereof.   Compositions for rectal or vaginal administration usually contain the polypeptide of the invention in a suitable non-irritant fashion. Excipients or carriers, such as cocoa butter, polyethylene glycol or suppository wax It is a solid at temperature but a liquid at body temperature, so it dissolves in the rectum or vaginal cavity and A suppository form that can be manufactured by mixing with a substance that releases an antagonist .   Ophthalmic formulations, eye ointments, powders and solutions are also within the scope of the invention disclosed herein. Contained within.   Yet another aspect of the present invention is directed to a polypeptide derivative or dimer of the present invention. Antibodies that do not substantially exhibit cross-reactivity with human C5a Things. The antibodies can be polyclonal or monoclonal. Good Preferred antibodies are those derived from the preferred polypeptides of human C5a of the invention described above. It is specific for the body or dimer. For example, a preferred antibody of the invention is human A polypeptide derivative of C5a, ie, C5a (1-71, Thr1Gly, C5a ys27Ser, Gln71Cys). Another preferred antibody is the book Specific for the dimer of the invention, wherein each of the above first and second derivatives is human C5a Derivative C5a (1-71, Thr1Gly, Cys27Ser, Gln71Cy s).   C5a analogs or polypeptide derivatives and dimers of human C5a of the present invention Specific polyclonal and monoclonal antibodies are manufactured according to standard techniques. obtain. Polyclonal antibodies include, for example, animals, such as rabbits, goats, sheep or Represents a C5a analog- or polypeptide derivative- or dimer-carrier protein in horses Produced by injecting the conjugate, the anti-C5a analog or Produces an anti-polypeptide derivative or an anti-dimeric antibody. For example, A. Joan Stone and R.S. Sope, "Immunochemistry in Practice", Blackwell Scientific Publications, Oxford (1982). Specific for a C5a analog, polypeptide derivative or dimer of the invention Monoclonal antibodies are available from Kohler and Milstein, Nature 256 : 495-97 (1975). Also Peters, J. H. , (Ed.) "Monoclonal Antibodies", Springer Fell See Lark Berlin, Heidelberg, Germany (1992). C5a analog, poly Polyclonal and monoclonal antibodies specific for peptide derivatives or dimers The body exhibits virtually no cross-reactivity with human C5a. "Essentially cross-reactive The term “sex” does not refer to an anti-C5a analog, anti-polypeptide derivative or anti-C5a analog. Cross-reactivity with human C5a exhibited by the dimeric antibody is very low (very low) C5a analogs or polypeptide derivatives or dimers of the invention in biological samples Means that no interference by endogenous C5a can be detected in the assay for.   C5a analogs of the invention—specific, polypeptide derivatives—specific or dimeric— A specific antibody was previously identified as a C5a analog, polypeptide derivative or dimer. Detection and quantification of circulating substances and circulating in administered and administered subjects It is particularly useful for modulating the activity of C5a analogs, such as neutralizing. That is, Another aspect of the present invention relates to the use of the human C5a of the present invention in a subject in need of activity modulation. A method for regulating the activity of a polypeptide derivative or dimer, comprising: Administering an antibody, preferably in the form of a pharmaceutical composition (see below). Is what you do. Yet another aspect of the present invention is a method for treating a subject in need of activity neutralization. For neutralizing the activity of the human C5a polypeptide derivative or dimer of the present invention Wherein the subject is administered an antibody of the invention, preferably in the form of a pharmaceutical composition (see below) A method comprising the steps of:   Circulating C5a analogs or polypeptide derivatives of human C5a of the invention. Or dimers can be detected according to standard immunological techniques utilizing antibodies. In general, A fluid or tissue sample is taken from the subject and then detected between the analog and the antibody The C5a analog administered to the subject under conditions suitable to allow formation of an immune complex React with specific antibodies. The formation of such an immune complex is dependent on the analog in the sample. Is an indicator of the existence of In the above assay, it is preferable to use a plasma or serum sample . However, tissues, such as certain blood cells, such as PMNL, are also used. Can be The presence and / or extent of the reaction can be determined by various methods known in the art, for example, Measured by radioimmunoassay, enzyme immunoassay, fluorescence immunoassay, fluorescence microscopy, etc. Can be done. Suitable qualitative and quantitative immunoassays are described in Butler, "Imi Nuclear Chemistry of Solid-Phase Immunoassay ”, CRC Res (1991).   In general, assays during treatment are performed using assays that detect circulating C5a analogs. Monitor analog levels. That is, still another aspect of the present invention relates to a subject For the measurement of the polypeptide derivative or dimer of human C5a of the present invention A quantitative or quantitative assay, (1) collecting a tissue or liquid sample from the subject; (2) forming a detectable immune complex between the antibody and the derivative (where the complex Is an indicator of the presence of the derivative in the subject). Contact sample with light antibody And a method including the step of: In addition, such assays are subject to Quantifying the polypeptide derivative or dimer.   In addition, the antibodies of the invention modulate or neutralize the activity of circulating C5a analogs. Can be advantageously used in pharmaceutical compositions to For this reason, yet another aspect Regulates the in vivo activity of the polypeptide derivative or dimer of human C5a of the present invention. A pharmaceutical composition useful in a node, the amount of the invention being an amount effective to modulate the activity of the derivative And a pharmaceutical composition comprising, if desired, a pharmaceutically acceptable carrier. It is. Preferably, the amount of the antibody is in vivo activity of the derivative or dimer. Such a pharmaceutical composition, which is effective for substantially neutralizing the properties.   The amount of antibody used is a molar equivalent of the amount of analog administered. The composition is It can be administered parenterally to elephants. Intravenous injection is particularly preferred in emergency situations. Antibodies Units in combination with pharmaceutically acceptable excipients, such as saline or Ringer's solution It is formulated in a dosage injectable form.   Hereinafter, the present invention will be further described with reference to detailed examples. Experts in the industry Acknowledges that each production or test method described in the examples Polypeptide derivatives, dimers, fusion proteins, DNA molecules, plasmids, Suitable for producing or testing vectors, transformed hosts and antibodies, respectively. It was done. These examples are for illustrative purposes only and should be noted. If not, it is not intended to be limiting.   Example 1   Synthesis of human C5a encoding gene   The human C5a gene is synthesized by coupling of oligonucleotides. The use of codons in this synthetic gene is aimed at optimal expression in Escherichia coli. Is designed as The synthesis method is described in FIG. The method is AUG Since the frequency of translation initiation given by codons is much higher than that of other codons, Thr Includes the condensation of 5 fragments with the N-terminal residue changed to Met et al. flag Mention 1 contains the Shine-Dergano sequence and the ATG start codon of the synthetic gene. Code it. Fragment 2-5 encodes the C5a gene.   Oligonucleotide synthesis:   Oligonucleotides were synthesized by the solid phase phosphoramidite method. Synthesized by Blur (Pharmacia). The fully synthesized oligonucleotide is Cleavage from solid support, concentrated NH at 55 ° C. for 16 hoursFourIncubation with OH Deprotected by Then, the oligonucleotide was prepared by preparative gel electrophoresis. Purify by electrophoresis. The acrylamide concentration used should be greater than 70 base pairs in length. From 10% for oligonucleotides larger than 2 to 40 base pairs It changed to 0%. After electrophoresis, oligonucleotides are subjected to UV shadowing. Visualize and scrape major high molecular weight fragments from gel. Gel slice on glass stick In a test tube with 3.0 ml of 0.1 molar tricarbonate at 37 ° C. for 16 hours. Incubation in ethyl ammonium (TEAB) buffer (pH 7.5) DNA is extracted by using   The gel residue was removed by centrifugation, and the column was separated with a Sepp C-18 column (War). Oligonucleotides by chromatography on Tars Associates) Isolate. 10 ml of acetonitrile, 30% acetonitrile in 50 mmol TEAB By successive washing with 5 ml and 10 ml of 25 mmol TEAB Pre-equilibrate the column. Apply oligonucleotide and add 10 ml of 25 Wash with mmol TEAB, 35.5 mmol 50% acetonitrile in TEAB Elute from the column with 5 ml. Collect fractions and absorbance at 260 nm Those containing oligonucleotides measured by the Dry).   Oligonucleotide annealing and coupling:   Prior to annealing, each oligonucleotide is phosphorylated at the 5 'end. Kinase The reaction mixture contains 12 mmol of MgClTwo1 mmol DTT (dithiotray 77 mM Tris at pH 7.5, containing 2 mM ATP and 2 mM ATP Contains 1 μg of oligonucleotide in a total volume of 40 μl. 10 units of T4 polynu Initiate the reaction by adding nucleotideginase and continue at 37 ° C for 40 minutes Let it. Add 10 μl of sterile water to each kinase reaction and add 48 μl of the complementary oligonucleotide. Add the nucleotides, mix and place in a heating block at 78 ° C. Turn off the heating block The mixture is allowed to cool to 30 ° C. The sample is then heated at 68 ° C. for 10 minutes with a second heating block. And remove the block again and allow the mixture to cool to 26 ° C. Annealed Phage M13mp18 (New England) De Biolabs) to assemble the genes. C5 in M13mp18 The method of assembling the a-encoding gene requires three ligation reactions .   After each ligation reaction of the appropriate gene fragment to M13mp18 Escherichia coli JM101 was ligated with ligated M13 DNA. Change quality. After isolation of the M13 phage from the recombinant clone, the sequence Analyze. Cloning the final C5a gene into M13mp18, 1 8 / C5a (Thr1Met, 1-74) is obtained. C5a (1-74) gene With plasmids pTZ19R and pKK223-3 (both from Pharmacia Subclone into a pB-6 vector derived from -6 / C5a (Thr1Met, 1-74) is obtained. See FIG.   Example 2   Method for site-directed mutagenesis of C5a gene   Oligonucleotide Designated In Vitro Mutagenesis System Version 2 (Ama Sham), the C5a-containing vector M13mp18 / C5a (1-74) By using single-stranded DNA and mutagenic oligonucleotides, Constant mutagenesis is performed. Mutation Cys27Ser in C5a was Following the procedure provided by the manufacturer, the mutagenic oligonucleotide, ACGGTG This is performed using CTTCTGTTAACA (SEQ ID NO: 6). Exact Cys27Ser sudden change Four plaques are analyzed by dideoxy DNA sequencing for differences. Accurate Double stranded DNA was isolated from one of the mutant clones, PstI and BamH Limit with I. The 230 bp fragment containing the mutation was added to the pB-6 vector. Be cloned. The resulting plasmid, pB-6 / C5a (1-74, T1M , C27S) were also sequenced by the dideoxy method to confirm the mutation. You.   Example 3   Cassette mutagenesis of the C5a gene   Plasmid pB-6 / C5a (1-74, T1M, C27S) or pB-6 / C5a (1-74, T1M) was restricted with EcoRI and HindIII, and When subcloned in the vector pWCB restricted by the same enzyme, Plasmid p containing the gene encoding 5a (1-74, T1M, C27S) Includes genes encoding WCB112, and C5a (1-74, T1M) pWCB100 is generated respectively. The plasmid is then cassette mutated. When used in induction, a series of new genes are produced. Used in cassette mutagenesis Oligonucleotides used are Applied Biosystems 381A DN Solid phase phosphoramidite chemistry according to the manufacturer's instructions on the A synthesizer Manufactured using action.   10 μl TE containing about 60 μg pWCB112 and 60 U PVUII. 6 μl and 60 U of HindIII (New England Biolabs) Containing 3 μl and 10 × high salt buffer (1 M NaCl, 0.5 M Tris / HCl, pH 7.5, 0.1 mol MgC1210 mM DTT) And 71 μl of ddHTwoMix with O to make a total volume of 100 μl. 37 Incubate at 16 ° C for 16 hours. In this way, the linearized approximately 4.5 Kb Purified by preparative electrophoresis on a 1% agarose gel, The DNA fragments are then electroeluted from the scraped agarose gel slices . Transfer the recovered DNA fragment to an Eppendorf tube and add 1 ml of absolute ethanol. The tube was centrifuged at 14000 rpm for 10 minutes in an Eppendorf centrifuge. Separate. The DNA pellet is dried under vacuum, followed by 45 μl of TE buffer (10 mM Tris / HCl, pH 7.4, containing 1 mM EDTA) Upon melting, pWCB112 / A is obtained.   35 bp sequence of single-stranded oligonucleotide 5'CTGCGTGCTAACATCTCTCACAAAGAC ATGTGCTA 3 '(SEQ ID NO: 7) and 39 bp-sequence 5'AGCTTAGCACATGTCTTTGTGAGAG ATGTTAGTTAGCACGCAG3 '(SEQ ID NO: 8) was purified on an 8% polyacrylamide gel. Purify by parametric electrophoresis. After electrophoresis, remove the oligonucleotide Visualize by shadowing and scrape the appropriate fragments from the gel. Gel thin The coupons are micronized in a test tube with a glass rod and the pH is 7.5 for 16 hours at 37 ° C. By incubating in 3.0 ml of TEAB buffer, the DNA was Extract. The gel residue was removed by centrifugation, and the column was separated with a Sepp C-18 column. (Waters Associates) by chromatography Isolate otide. 10 ml of acetonitrile, 30% in 50 mmol TEAB Wash continuously with 5 ml of acetonitrile and 10 ml of 25 mmol TEAB. And to The column is pre-equilibrated. Apply oligonucleotide and add 10 ml Wash with 25 mmol TEAB, 50% acetonitrile in 35.5 mmol TEAB Elute from the column with 5 ml of ril.   Fractions collected and oligonucleotides measured by absorbance at 260 nm Dry the material containing the tide in a Speedvac (Savant). 35 and 3 Annealing of the 9 bp oligonucleotide requires equal amounts of each oligonucleotide. , 0.01 mol MgClTwoContaining 0.05 mol of Tris / HCl, pH 7.6 Mix with Lenow buffer and heat the sample to 95 ° C. for 10 minutes, followed by 2 hours And cooling to room temperature, resulting in the formation of double-stranded DNA, Ligation to the vector pWCB112 / A is performed. Double-stranded DNA is 3-fold excess over vector with 1 μl, 2 U of T4 DNA ligase (BRL) Is ligated into the restriction vector pWCB112. this The reaction is performed at 4 ° C. for 17 hours.   Using essentially the same technique, simply use different oligonucleotides and pWCB1 By using 00 or pWCB112, some molecules are produced. It Are shown in Table 2 below.   Analogue numbers 10-20 are agonists and are outside the scope of the invention. They are Listed for comparison purposes. The preparation of the dimeric form of analog number 8 is described in Example 5 below. c. It has been designated analog number 22.   Complete nucleotides of the polynucleotide encoding C5a analog No. 21 The sequence is shown in Table 3 below. However, those skilled in the art will recognize that the same C5a It should be appreciated that many polynucleotides encoding analogs can be produced It is. For example, Watson et al., "Recombinant DNA", 2nd edition, Freeman, See New York (1993).   Example 4   Expression of C5a and C5a analogs in Escherichia coli   To achieve expression, the synthetic gene for the C5a analog shown in Table 1 was replaced with p WCB vector, BamH1 site deleted, PvuII site changed to PvuI site Isopropyl-thio-beta-D-galactoside (IPTG) -inducible t Modified expression vector pK containing ac-promoter and ampicillin resistance gene Subclone in K223-3 (Pharmacia). Escherichia Ko Goff et al., “Licensing LCIQ,” Proceding of National Academy Of Science of the United States of America "8 Strain LC137 (ion, ht) disclosed in 1: 6647-6651 (1984). pR). It is the strain DH5alpha F'IQ (BRL Laboratory Expression plasmid containing F prime factor encoding lacIQ from Host. OD550Include the appropriate expression plasmid until reaches 1 Escherichia coli LCIQ is grown in LB broth at 30 ° C. Culture for 3 hours Induction by IPTG at a final concentration of 2.5 mM. Harvest cells by centrifugation And store at -80 ° C until use.   Example 5a   Regeneration and purification of C5a and C5a analogs   The recombinant protein was the frozen Escherichia coli cell paste from Example 4. From the recoat, thaw in a buffer containing 6 moles of guanidinium hydrochloride (5: 1 v : W, buffer: cell paste). The cells are then sonicated Break down and convert the product to 1 mmol cysteine and 1 mmol cystine or 50 mM Tris / HCl buffer containing 1 mM reduced / oxidized glutathione Dialyze against liquid (pH 8.0) overnight to promote reconstitution. Then, 6N HCl Is added to acidify the dialysate to pH3. The precipitate is removed by centrifugation And 25% to 35% acetonitrile in water in the presence of 0.1% TFA for 30 minutes Delta Pak C18, 100 Angstroms, 1 using Trill's linear gradient Purify the supernatant on a 5 micron reverse phase HPLC column (Waters). About 28% The major peak eluting from the column with acetonitrile is collected and lyophilized. This file The fraction is a glutathione-adduct of the C5a analog (analog 5, 7, 8, 9 and 21 adducts) or cysteine-adducts of C5a analogs (classes) An adduct of analog no. 8, Table 1) was included.   About 0.002 mmol of the cysteine adduct of the C5a analog gene product was In 50 ml of Tris buffer (pH 7.4). Add 0.02 mmol of DTT I can. After 4 hours, about 80% of the C-terminal cys-cys linkage has been converted to free cysteine. The product is converted to 25% to 35% acetone in water in the presence of 0.1% TFA for 30 minutes. C4, 15 microns, 300 angstroms using a linear gradient of tonitrile Purify on a reverse phase column (Alltec). Eluting with about 29% acetonitrile The fractions containing the product are lyophilized, then stored at 4 ° C. and vacuum dried.   Example 5b   Regeneration and purification of C5a and C5a analogs   The recombinant protein was obtained from the frozen cell Escherichia coli paste from Example 4. From an aliquot, thaw (5: 1) in a buffer containing 6 molar guanidinium hydrochloride. v: w, buffer: cell paste). The cells are then sonicated. And the product is reduced to 1 mmol reduction / 0.01 mmol oxidized glutathione. 20 times with 100 mM Tris / HCl buffer (pH 7.4) containing Dilute. After 4 hours, acidify the solution to pH 3 by adding 6N HCl I do. The precipitate formed was removed by centrifugation and 0.1% TF for 30 minutes. Delta Pak using a linear gradient of 25% to 35% acetonitrile in the presence of A C18, 100 Å, 15 micron reverse phase HPLC column (War And purify the supernatant. Primary eluting from column with about 30% acetonitrile Collect the peaks and lyophilize. The C5a analog isolated in this way can be reduced thio- A C-terminal cysteine with a thiol group.   Example 5c   Formation of C5a analog dimer   C5a analogs having a free thiol group in the C-terminal region are available in monomeric form (Example 5b) is converted to the dimeric form.   The recombinant protein was the frozen Escherichia coli paste aliquot from Example 4. 1 mM reduction in 100 mM Tris / HCl (pH 7.4) After regeneration according to Example 5b with a mixture of /0.01 mmol of oxidized glutathione Isolated. After 4 hours, the solution was acidified to pH 3 by adding 6N HCl. Sexualize. The precipitate formed was removed by centrifugation and the solution was dissolved in 25 mM buffer (pH The supernatant was applied to the SP-spherodex / ion exchange column equilibrated in 7.0). Adsorb. After washing the column with 25 mM Tris (pH 7.0), C5a The analog was prepared with 25 mmole of Tris (pH 7.0) containing 0.75 mol of NaCl. Eluted from the column. Bringing the partially purified C5a analog to pH 3.0 with formic acid, When diluted with distilled water, a protein solution having a conductivity of about 45 mS / cm was obtained. And reached equilibrium in 50 mM formic acid at pH 3.5 with 0.6 M NaCl. Adsorbed onto the SP-high performance / ion exchange column. The C5a analog has a pH of 3. 5 using a linear gradient of 0.6-1.0 M NaCl in 50 mM formate buffer. Eluted from the ram.   The major peak eluting from the column at about 0.725 mole NaCl is collected. so The C5a analog isolated by the method described above has a C-terminal cysteine having a reduced thiol group. Have. The pH is adjusted to 7.0 with a 25% aqueous ammonia solution, and the solution is stored. The offspring are converted to their dimeric form. pH 7.0 and about 0.3-0.6 mg / ml At a protein concentration of 4 and storage at 4-8 ° C, the conversion is at least 80% in 2 days. Complete. The dimeric form of the C5a analog eventually yielded 0.1% TFA over 30 minutes. Pak C1 with a linear gradient of 25% to 40% acetonitrile in the presence of 8,100 Å, 15 micron, reversed phase HPLC column (water ). The major peak eluting from the column at about 33% acetonitrile Collect and lyophilize. The isolated molecule is used in an Escherichia coli expression system. It is a dimer of a C5a analog produced from the above.   Example 6   Receptor binding assay   C5a and C5a receptor antagonists have been disclosed for their C5a receptor Test for affinity. Harris et al., Journal of PMNL Films. ・ Receptor research ”11: 115-128 (1991) The binding of the [125] BH-labeled C5a was determined by Rollins et al., Journal O. B Biological Chemistry ", 263: 520-526 (1988). But according to Brown Walder et al., Molecular Immunology. 29 (11): 1319-1324 (1992). . PMNL is replaced by Ca++And Mg++Free, 10 mM HEPES (pH 7.3) 2.5 mmol MgClTwo, 100 units / ml of deoxyribonucleic acid Case I, 0.1 mmol PMSF, 10 μg / ml aprotinin and 1 Resuspend in Hanks Balanced Salt Solution containing 0 μg / ml leupeptin. Then Equilibrate them in a nitrogen cavitation cylinder at 400 psi for 20 minutes at 4 ° C. To 3x with 25 mmol EDTA and protease inhibitors listed above 0.5 mole of KHCO by volumeThreeAfter draining, remove the gelatinous substance with tweezers. Centrifuge the mixture at 400 × g for 10 minutes at 4 ° C. The resulting supernatant is added to 4 In ° C Centrifuge at 50,000 xg for 60 minutes. 200 × 106Alico showing cells Store the pellet from the sheet at -70 ° C. These membranes were tested for binding 20 × 1061 mM CaCl at equivalent of cells / mlTwo5 mmol MgClTwo , 0.1 mmol PMSF, 0.1% bacitracin and 0.5% BSA Resuspend in 50 mM HEPES, pH 7.3. 1 more with the same buffer : After dilution to 75, 50 μl of [125] BH-C5a (specific activity 2200 Ci / Lmol, final concentration 4.0 pmol) and 50 μl of buffer or C to be tested. Duplicate tubes containing the 5a analog at various concentrations for inhibitor properties were added to the suspension. Add 400 μl of suspension.   Nonspecific binding is measured in the presence of 10 nanomolar unlabeled C5a. PMNL film The conjugation reaction is started by the addition and continued at 4 ° C. for 120 minutes. Cell collection equipment 0.05% PEI using a device (Brandel, Geysersburg, MD) GF / C glass fiber filter pretreated with (polyethyleneimine) for 90 minutes The bound and free radioactivity is separated by vacuum filtration through a (Whatman). Wash the filter with 3 x 5 ml of ice-cold 5 mM Tris buffer (pH 7.4) Then, the cells are counted using a multiwell gamma counter (Genesis). Nonlinear regression Analysis program, RS / 1 (Bolt, Bellaneck and Newman, Boston) Analyze the data using50Expressed as a value. The result is the Chang-Plesov equation Are shown in Table 4 below as Ki values. See Brown Walder et al., Supra. .   These results indicate that the C5a analogs of the present invention have the wild type with nanomolar Ki. This indicates that it is competitively replaced with C5a. The C5a analog of the present invention has Brown Wolder et al., Supra (radioligand, [125I] Bolton-Han. Measured as Ki in the competitive displacement assay disclosed in US Pat. Affinity for the C5a receptor is about 1.0 × 10-8Less than a mole, preferably about 2. 0x10-9Less than about 10 moles, and more preferably about 1.0 × 10-TenLess than a mole .   Example 7   C5a-induced Ca ++ increase   Recombinant human C5a was dissolved in Hank's buffer containing 0.01% Tween-20. However, a total stock dilution of C5a is made in this buffer. Hula-2 (Hula2AM, Dissolve the acetoxymethyl ester of Molecular Probes) in DMSO. 6% Hetastarch (Hespan, Dupont, Waukegan, Illinois) Descending, followed by Chapman-Kirkland et al., "The Journal of Immunology Neutrophils by countercurrent elutriation as described in Le Methods, 142: 95-104 (1991). Is purified from human peripheral blood. Purified cells (2 × 106/ Ml) to 0.2 my HE mixed with chromol Hula-2AM and free of calcium or magnesium Incubate for 30 minutes at 37 ° C. in PES buffered Hanks solution. Test 1 Five minutes ago, transfer the cell suspension to a cuvette containing a stir bar and remove calcium. In addition, it is 1 mmol. Incubate the cell suspension at 37 ° C with stirring. On. The assay is terminated within 5 hours of cell purification and the cellular response changes during the experiment. Standard control responses are obtained periodically to ensure that they have not been activated. SLM80 00 spectrofluorometer (SLM-Aminco Instruments, Urbana, Illinois) Is used to measure the amount of fluorescence. Place the cuvette in the fluorimeter and place a reference line for 10 seconds. Once obtained, the C5a receptor antagonist to be tested for antagonist properties is In addition, the change in the fluorescence excitation ratio of 340 nm / 380 nm (emission of 510 nm) If possible, measure it. 40 seconds after the addition of the analog, an opposing amount of C5a was added A final concentration of 100 pmol is measured and the change in excitation rate that occurs is measured.   IC50The value is used as a measure of antagonist potency. These values are 100 C required to reduce the calcium-increasing response to picomolar C5a by 50% Defined as 5a analog concentration. EC50Values are used as a measure of agonist potency. Used. EC50Is 50% of the maximal calcium-increasing response provided by the analog. % Is defined as the concentration of the C5a analog that induces the%. The results are shown in Table 5 below.   Ca5 analog number 7 is 1.0 × 106Tested below molar concentration. C5a Analog number 8 is 3.0 × 10-6Tested at submolar concentrations, analog number 9 is 1.5 × 106Tested below molar concentration, analog number 21 was 8.0 × 10-7Less than molar concentration Tested below. No agonist activity is detected in any case. These results And the results shown in Table 2 above, the analogs of the present invention show that C5 It has been suggested to function as a competitive inhibitor of a. They have the highest potency In order to obtain an analog, the C-terminus of the analog is uncomplexed cysteine or A cysteine residue that forms a complex with another C5a analog of the present invention via a sulfide bond Indicates that it should be a group.   Example 8   Rabbit skin model of inflammation   All experiments were performed on male New Zealand white rabbits weighing 2.5-3.0 kg. Will be performed. Rabbit's back is shaved and different colored markers on 40-50 skin sites Mark with. Various stimulants (ie, C5a, C5a analog, C5a + C 5a analog, excipient control, etc.) in sterile, disposable 26 gauge, 0.5 inch Using a needle and a 1.0 cc tuberculin syringe intradermally at a rate of 0.1 ml / site Inject. Administer intradermal injections in six replicates, approximately 45 minutes before euthanasia You. C5a alone was injected at a dose of 50 ng / site and C5a with the same dose of C5a The receptor antagonist is co-injected at various concentrations. Twenty minutes before euthanasia, 1. 18-36 μCi [1251] -labeled bovine serum albumin in 0 ml saline Is introduced into the systemic circulation through the terminal ear vein. 45 minutes later, the rabbits are Euthanize with sodium pentobarbital. 5.0 ml sample of peripheral blood , Obtained by heart puncture, centrifuged at 2000 rpm for 10 minutes, 1.0 ml Of plasma collected and used as a control to determine the amount of [125I] in plasma I do. After death, the skin on the back is removed and pinned to a wooden dissection table. Major vessels of the skin The blood of the structure is squeezed out by hand towards the periphery. Due to this operation, variation between skin parts And background radioactivity is also reduced. Next, a 15mm cork punch Drill a hole in the inflammatory lesion from the external skin with the aid of a gavel and a gavel, 12 x 75 mm Place in polystyrene tube. Then, the injection site was placed in a gamma counter (gene ) Are analyzed for their radioactivity content. Inflammation exuded from blood vessels The amount of [125I] -labeled bovine serum albumin (BSA) localized at the site It was found that it was directly proportional to the degree of transient enhancement. ID of C5a analog50value Is 50% of the radioactivity produced by co-injection of 50 ng C5a at the same site The dose of the C5a analog that elicits a decrease.   C5a analog number 8 (in Table 1) is 70 ng / site ID50Look to have In fact, doses of 175 ng / site do not elicit a pro-inflammatory response. The result is Analogs are in vivo antagonists and do not exhibit agonist properties in vivo It is shown that.   Example 9   C5a-induced neutropenia in rabbits   All experiments were performed on male New Zealand white rabbits weighing 2.5-3.0 kg. Will be performed. Combination of 1.0 mg / kg xylazine and 50 mg / kg ketamine Rabbits are anesthetized by combined intramuscular administration. 25 gauge flutter A fly catheter is inserted into the lateral ear vein and used for injection. Each blood sample (0. 2 ml) from the central ear artery using a plastic with a 25 gauge, 5/8 inch needle. Collect in a syringe and fill with 7.5% EDTA as an anticoagulant. Blood immediately Squeeze into a microcentrifuge tube containing 10 microliters of 7.5% EDTA. initial An arterial blood sample (# 1) was obtained and immediately followed by excipients or the C5a analog of Example 8. Is injected intravenously (bolus injection). 20 seconds later, get a second blood sample (# 2) And Twenty seconds later, 100 ng of C5a in 0.2 ml was injected intravenously (bolus injection). I do. Twenty seconds later, a third blood (# 3) sample is taken. 30 minutes later, the second blood test Sample (# 4) —20 seconds—Inject C5a—20 seconds—do blood sample (# 5). Rabbit blood Automatic blood analysis (Technicon H * 1) using liquid-specific software , Evaluate blood samples. Neutrophil count induced by C5a (per milliliter (C5a-induced neutropenia, blood samples # 3- # 2 and # 5) ~ By comparing # 4), vehicle treated and C5a analog treated animals Compare between. C5a analogs alter baseline neutrophil counts from normal animals No, ie C5a analogs do not exhibit agonistic (C5a-like) properties . C5a-induced neutropenia in C5a analog-treated rabbits took 40 seconds and And 67% and 41%, respectively, at 30 min C5a challenge interval with vehicle treated rabbits. It is significantly (P> 0.05) inhibited as compared with the case. These results indicate that the C5a analog The effect of systemic administration of is demonstrated.   Example 10   C5a analogs and decapeptides H-Ile-Ser-Phe-Lys-Asp-Met-Gln-Leu-Gly-Arg-OH (SEQ ID NO: 52) Comparison of receptor binding and C5a-induced increase in calcium.   Five C5a analogs (numbers 5, 7, 8, 9, and 10 in Table 2) were prepared. , C5a receptor binding and C5a receptor calcium increase assays, Ol et al., " Journal of Medicinal Chemistry "35: 402-406 (19 92) compared to the synthetic decapeptide disclosed in Table 1 (No. 14). this The results of the experiment are shown in Table 6 below.   These results indicate that the tested C5a analog was not a decapeptide to the receptor. 14,000 to 10,000 times greater binding affinity. Up The data also indicate that the described C5a analogs exhibited substantially agonist activity. Not a C5a receptor antagonist molecule, but the decapeptide is a significant agonist This indicates that the compound exhibits an activity.   Example 11   Polyclonal specific for C5a (1-71, T1M, C27S, Q71C) Production of antibodies   Antigen production   According to the manufacturer's instructions, Pierce Chemical Company (Rockford, Illinois, USA) Imjectect / Immunogen EDC conjugation 1 mg of C5a (1-71, T1M, C27S, Q7 1C) was conjugated to 2 mg of keyhole limpet hemocyanin (KLH). To 3500 cpm125I-C5a (New England Nuclear) , Boston, Mass.) Conjugation efficiency To track. The final volume of the conjugate was 0.34 mg of C5a (1-71, T 1M, C27S, Q71C) (0.15 mg / ml) and estimated 0.9 mg / ml. 2.25 ml containing KLH.   Production of anti-C5a (1-71, T1M, C27S, Q71C) antiserum   C5a (1-71, T1M, C27S, Q71C) conjugate (0.5 ml) ) With 0.5 ml of Freund's complete adjuvant (Sigma Chemical Company) , St. Louis, Mo.). Female New Zealand White Rabbits from Millblock Farms (Amherst, MA) Purchased and injected subcutaneously into two sites in the scapula area (0.2 ml homogenate per site) ). After 21 days, the operation is repeated. Freund's Incomplete Adjuvant (SIG Perform further injections using A total of 55 days later, a third injection was given, day 126 A fourth injection is made. Rabbit blood (about 30m) for 3 to 5 weeks after each injection l) is collected, allowed to clot and the serum is removed.   Peptide immobilization for antibody adsorption   Similar to the above, Imjetect / Immunogen E manufactured by Pierce Chemical Company Using a DC conjugation kit, C5a (1-71, T1M, C27S , Q71C) or C5a (1 mg) with 2 mg of bovine serum albumin (BSA) To Conjugate and125Add IC-C5a to track efficiency. C5a (1-71, T1M, C27S, Q71C) / BSA final volume 0.25 mg / ml C5 a (1-71, T1M, C27S, Q71C) 2.25 ml, C5a / B For SA, the final volume is 2.25 ml with 0.32 mg / ml C5a. Both Both conjugates contained an estimated 0.9 mg / ml BSA.   The two peptide conjugates were buffered with sodium carbonate to pH 8.6. Dialysis against 0.2 M sodium bicarbonate. About each conjugate AH (aminohexyl) -agarose gel pre-washed in the same buffer (Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo.) Add aldehyde to a final concentration of 1% v / v and incubate at 20 ° C for 15 minutes. Activate by activating. By washing the gel thoroughly in buffer, Remove the rutaraldehyde, then add the conjugate solution and at 20 ° C. for 1 hour Incubate. Wash off unbound proteins from the gel and remove any remaining The binding site is incubated with 20 ml of 0.2 mol glycylglycine at 4 ° C overnight. Block by shutting down. Gel in 0.5cm x 10cm glass column Packed, Dulbecco's phosphate buffered saline containing 0.1% sodium azide, pH Wash thoroughly with 7.2 (PBS-A).   Affinity chromatography   Rabbits immunized with C5a (1-71, T1M, C27S, Q71C) The serum collected from the sample is passed through a C5a / BSA column at 2 ml / hour. Emerge from column Collect the adsorbed antiserum. The column is p-poured with 0.05 molar sodium phosphate. 0.5 M NaCl containing 0.1% sodium azide in H7.2 buffer is sufficient Wash. Bound antibodies are removed with 3 molar ammonium thiocyanate. Elution The reading antibody is read at 280 nm and the inline set at 0.2 OD maximum deviation. Detected using an in-UV monitor. Serum eluted after first 2 passes Antibodies were collected, dialyzed immediately against PBS-A, then 1 mg / Concentrate to around ml. This process is repeated several times for each serum batch. C5 If no more protein is eluted from column a, serum is absorbed. It is considered worn.   Subsequently, the adsorbed antiserum was used for C5a (1-71, T1M, C27S, Q71a). C) Pass through an immunoadsorption column. Dissolve bound antibody with 3M ammonium thiocyanate Release, dialyze immediately against PBS-A, then concentrate to about 1 mg / ml.   Example 12a   For detecting bound C5a (1-71, T1M, C27S, Q71C) Production of labeled antibodies   Anti-C5a eluted from C5a column (1-71, T1M, C27S, Q71C 2.) converting the antibody (ie, an antibody that does not cross-react with C5a) with an alkaline phosphate Conjugate to Ze. 1.4 mg antibody in 1 ml PBS was added to 5 mg (50 00 units) of alkaline phosphatase (type VII-T, Sigma Chemical Co.) Company). Add glutaraldehyde to a final concentration of 0.2% v / v And The mixture is incubated at 20 ° C for 90 minutes, then at 4 ° C in PBS -Dialyze against A overnight. The buffer was adjusted to 0.1 mM with 1 mM magnesium chloride. Change to 05 molar Tris buffer, pH 8.0 and dialyze overnight at 4 ° C.   Example 12b   Detection of bound C5a (1-71, T1M, C27S, Q71C) by ELISA   Specially purified rabbit anti-C5a at 0.57 mg / ml (1-71, T1M, C27S , Q71C) in a molar ratio of 1: 5 in 0.1 mol sodium borate / boric acid, pH 8.6. Dilute to 00. ELISA plate (Maxi Soap II, Nunc, Naperville , Illinois) was coated with 100 μl / well of this solution at 20 ° C. for 4 hours. To run. Unbound material is removed by washing the plate three times. C5 a (1-71, T1M, C27S, Q71C) -containing sample or C5a (1-71, T1M, C27S, Q71C), preferably PBS-A + 1% BSA (PBS / BSA) was added to the wells for 4 hours at 20 ° C. in 100 μl. I can. The labeled antibody was added at a ratio of 1: 3000 in 100 μl of PBS / BSA, and At ℃ Incubate at night. The plate is washed and then the enzyme substrate (alkaline plate) In the case of phosphatase, p-nitrophenyl phosphate (Sigma Chemical Co., Ltd.) (1 mg / ml in 10% v / v diethylamine, pH 9.8) You. Develop at 20 ° C. in the dark for about 5 hours. Biomec 1000 (Beck Plate using Man Instruments, California, USA Is read at 405 nm.   Using the same conditions as above, C5a (1-71, T1M, C27S, Q71C) A standard curve is generated (data not shown).   Example 12c   Affinity purification specific anti-C5a (1-71, T1M, C27S, Q71C ) Specificity   Using C5a (1-71, T1M, C27S, Q71C) or C5a, Microtiter at 1 μg / well in 100 μl coating buffer for 4 hours at 0 ° C. Cover the plate. The plate was washed, and after adsorption of C5a, C5a (1-71, T 1M, C27S, Q71C) were diluted serially with 100 μl of P Perform in plate wells in BS / BSA. After 4 hours incubation at 20 ° C, Re-wash plate. Rabbit antibody binding was 1: 1000 in PBS / BSA, 100 μl / well of goat anti-rabbit / horseradish peroxidase (Pierce Mical Company). Incubate with second antibody at 20 ° C for 4 hours After washing, the plate is washed and 2,2'-azinobis (3-ethylbenzothiazo Phosphorus) -6 sulfonic acid diammonium salt ABTS substrate (Pierce Chemical Can Panney) demonstrates horseradish peroxidase activity. After 30 minutes development Read the color at 405 nm.   Example 13   Measurement of C5a (1-71, T1M, C27S, Q71C) in rabbit plasma samples Set   Blood samples from two anesthetized rabbits (# 1 and # 2) were placed in heparin-coated tubes. After collection, C5a (1-71, T1M, C27S, Q71C) is injected intravenously . Blood is collected at 30 minute intervals. Next, C5a (1-71, T1M, C27S, Q71C) are injected and blood is collected again after 30 minutes. This This is repeated four more times. Centrifuge the sample to remove blood cells and remove plasma. Remove and store at −20 ° C. until use in ELISA.   Samples were diluted in PBS / BSA and run against the standard curve generated in Example 11. Quantify by ELISA. Then, circulating C5a (1-71, T1M, C2 7S, Q71C) is measured over time. C5a (1-71, T1M, C27 S, Q71C), no activity was detected in samples taken from two rabbits before injection. No, indicating the specificity of the antibody. These results also indicate that the antibody was rabbit C5 no cross-reactivity with C5a (1-71, T1M, C2a 7S, Q71C) is a substance that does not originally exist in rabbits.   Example 14   C5a (1-71, T1M, C27S, Q71C) and standard in rabbit circulatory system Comparison of C5a (1-71, T1M, C27S, Q71C): C5a (1-71, T1 M, C27S, Q71C) specific anti-C5a as antidote (1-71, T Use of 1M, C27S, Q71C) antibodies   A series of plasma samples obtained from the last time point of rabbit # 2 (from Example 13) Perform a double dilution and compare the slope of the resulting curve with the slope of the standard curve. Two slopes Are parallel, so that C5a (1-71, T1 M, C27S, Q71C) still retain their antigenic properties, and the standard C5a (1 -71, T1M, C27S, Q71C) as in ELISA It is understood that it is possible. This result also indicates that C5a (1-71, T1M , C27S, Q71C), the analog is neutralized by the antibody Which indicates that.   Example 15   Production of monoclonal anti-C5a (1-71, T1M, C27S, Q71C)   Kohler and Milstein, Nature 26: 495-497 (19) 75) using standard methods developed by BALB / c mice. The production of lonal antibodies is performed. C5a (1-71, T1M, C27S, Q71C) Mice are immunized with the same antigen product (conjugated to KLH). From immunized mice Of the spleen cells of hybridoma line P3 / NSI / 1-Ag4-1 (ATCCT Screen of a monoclonal cell line produced by fusing with IB18) Cleaning is C5a (1-71, T1M, C27S, Q71C) / BSA and Performed using C5a / BSA. Performed with polyclonal rabbit antiserum Directly in parallel with the operation, instead of C5a, C5a (1-71, T1M, C27S, Q71C) was reacted with a specific monoclonal anti-C5a (1-71, T1M, C27S, Q71C) used as antibody. Detect what recognizes both Used as an antibody and labeled with alkaline phosphatase.   Example 16   Human carbonic anhydrase II (hCAII) gene and C5a receptor Construction of gene fusion between antagonist genes   Plasmid pWCB401 contains DN5 encoding a C5a receptor antagonist. A sequence (C5a (1-71, Thr1Met, Cys27Ser, Gln7 1Cys)). This plasmid was used in the cassette mutagenesis method described in Example 3. And is manufactured using SEQ ID NO: 23. This plasmid was then transferred to a standard Using the gating protocol (Maniatis et al.), The only Hi of pWCB401 Double-stranded synthetic oligonucleotides at the ndIII restriction site (OL1 / OL2, OL1 -5'-AGC TGG GAT CCG ATA TCC-3 '(SEQ ID NO: 53), OL2 5'-A GCT GGA TAT CGG  ATC CC-3 '(SEQ ID NO: 54)), modified by the insertion of plasmid pWCB401. BE is manufactured. This insertion allows BamHI and BamHI immediately downstream of the stop codon. An EcoRV restriction site is added and a HindIII site is deleted. Then the standard Method (Maniatis et al., 1989) yielded two more oligonucleotides (OL3 / OL4; OL3-5'-A GCT TTC GTT GAC GAC GAC GAT AAA AAC GGT CTG CA-3 '(sequence number issue 55), OL4-5'G ACC GTT TTT ATC GTC GTC GTC AAC GAA-3 '(SEQ ID NO: 56)) Synthesize, phosphorylate and anneal. This synthesized oligonucleotide is Binds the gene for the C5a receptor antagonist to the hCAII gene, Encodes telokinase protease and hydroxylamine chemical cleavage sites Become   Recover 222 bp PstI-EcoRV fragment from pWCB401BE And the double-stranded oligonucleotide O annealed in the three-way ligation experiment L3 / OL4 and HindIII and EcoRI digested pB0304ΔRV Ignore. pB0304RV is a derivative of pB0304 (file Heke et al., "Protein Expression and Purification 4: 265-274 (1993)), in the tetracycline resistance gene. Obtained by deleting the EcoRV restriction site. Three-way ligation The product was named plasmid 29A-1 and contains a synthetic oligonucleotide. The DNA sequence around the splicing junction is determined by standard DNA sequencing (Maniatis et al.) Proven by Escherichia coli strain HMS174 (DE3) pLysS And BL21 (DE3) pLysS (both Novagen, Madison, Y Oming) was transformed with plasmid 29A-1 and supplemented with tetracycline. Colonies are isolated on a prepared Luria broth agar plate (Maniatis et al.).   Example 17A   Construction of C5a fusion protein, measurement of expression titer in Escherichia coli   Flag of human interleukin-1β gene by overlap extension PCR Mention (modified with Escherichia coli preferred codons, British Biote Obtained from Knology Limited, United Kingdom) and human interleukin-1 Encodes a peptide fragment of a receptor antagonist (hIL1-RA) As experiments attempting to exchange for fragments proceed, After the codon, an artifact translation stop codon is obtained. Later BamHI cleavage site By introducing a position (GGATCC) at the stop codon site, the fusion protein Construction is easy. The synthetic genes obtained as described above are as follows:   DNA sequence of IL72 flanked at both ends by NcoI and GamHI restriction sites   This synthetic gene is flanked by NcoI and BamHI sites on both ends, Interleukin-1β (hIL-1β) and human interleukin-1 Hybrid receptor comprising sequence of receptor antagonist (hIL1-RA) Encode protein.   The synthetic gene was then used as an NcoI-BamHI fragment in plasmid. When cloned into pPLMu, the plasmid pPLMuIL72 is obtained. . Plasmid pPLMu has the NcoI-HindIII fragment shown below. Plasmid pPLmuSMCo replaced by a multiple cloning site ri (Buell, G. et al., "Nucleic Acids Research" (1985) 13 : 1023-1038).   PPLmuSMCor containing ribosome binding site and multiple cloning site Sequence of EcoRI-HindIII fragment in i   The encoded hybrid protein is counted from its N-terminal methionine. Thus, amino acids 1-47 of hIL-1β followed by amino acids 52- of hIL1-RA 57, then amino acids 60-71 of hIL-1β, then the amino acid sequence Cys Val It is composed of Leu Lys Ala Ala Ser (SEQ ID NO: 59) and a translation stop codon.   Next, Escherichia coli strain LC137 (Goff, SA et al., Nat'l Proc. Acad . Sci., USA 81: 6647-6651 (1984)).8 57 Compatible plasmid pcl encoding repressor857Plasmid p Transform with PLmuIL72. Heat-induced Escherichia coli cells (Buell According to the analysis by SDS-PAGE, supra), heat induction High expression of the hybrid protein resulted. Plasmid pPLMuIL The hybrid protein encoded by 72 is a primer as a 3 'primer. Limers C, D and E: PCR primer Primer C Primer D Primer E And primer F Are further shortened by PCR using PPLMuIL33, pPLMuIL53 and pPLMuIL63 were manufactured. It is. The sequence GAT (Asp) in all these constructs at the BamHI site is It is in proper reading frame with the DNA sequence encoding the hybrid protein. Ba The coding region cloned into this site by mHI cleavage contains BamHI cleavage. Acid-labile amino acid sequence Asp- encoded by the sequence GATCCX partially contained in the sequence Pro takes precedence. Cleavage of these fusion proteins by acid is acid-labile Asp-Pro The fusion partner is released through cleavage at the site. pPLMuIL63 and p The construct in PLMuIL53 has the same amount of hive as the original pPLMuIL72. Lid protein expression was indicated. No expression was observed from pPLMuIL33. Absent. SDS-PAGE and Coomassie ™ (ICI, Limited) Brilliance The expression level is measured after Ant Blue staining.   Then, using pPLMuIL33 and pPLMuIL53, human C5a To construct a fusion protein. In proper reading frame with the following hC5a gene The BamHI site encoding asparagine (GAT) was identified by primer-specified PCR. Introduced by mutagenesis. BamHI-HindIII cut C5a flag The BamHI-HindIII cleavage plasmid pPLMuIL33 and When ligated into pPLMuIL53, the respective plasmids pPLMuI L33-C5a and pPLMuIL53-C5a are produced.   Sequence of IL33-C5a flanked by Ncol and HindIII sites at both ends   IL53-C5a sequence flanked by Ncol and HindIII sites on both ends   Eche carrying pPLMuIL33-C5a and pPLMuIL53-C5a SDS-PAGE and anti-hC by heat induction of R. coli K12LC137. As determined by Western analysis with 5a polyclonal antibody , Resulting in high expression of the fusion protein.   Example 17b   Human interleukin-1β / human interleukin-1 receptor antagonist Fragment between a fragment and a C5a analog or polypeptide derivative of human C5a Construction of gene fusion   The 5 'region of plasmid pPLMuIL53-C5a containing codons 1-50 is And generating a fusion protein with C5aRA or a polypeptide derivative of human C5a. Optimize using PCR for current purposes. Briefly, the 5 'end is compatible This facilitates cloning into a pET-series bacterial expression vector. 9th place Replace the cysteine codon with a serine codon and modify the 3 'end of the fragment Then, a polypeptide derivative of C5aRA or human C5a and a cleavage linker Can be performed. The following experiments are performed:   The gene encoding the IL-1β / IL1RA fragment was recovered and standard D NA amplification conditions (Maniatis et al., 1989) and G83 and An oligonucleotide called G84 (G83: 5'-C GCA AGC TTG AGG CTC AAT G AA GCT CAT-3 '(SEQ ID NO: 66)) (G84: 5'-GGA GAT ATA CAT ATG GCA CCG GTT  PCR using AGA TCT CTG AAC AGC ACC CTT CGC-3 '(SEQ ID NO: 67)) Adapted from plasmid pPLMuIL53-C5a. Amplified fragment Digested with the restriction endonucleases Nde1 and HindIII, Recover from the gel (fragment 1). Plasmid 29A-1 was replaced with HindII. Digested with I and BamHI to generate a C5aRA or polypeptide derivative gene Is recovered (fragment 2). pET9c (pET system Manual, Third Edition, 1993, Novagen) with NdeI and BamHI And used in three-way ligation experiments with fragments 1 and 2 Thereby, plasmid 58A-1 is constructed. In this construct, C5aRA Alternatively, a gene encoding a polypeptide derivative can be The linker sequence encoding the roxylamine cleavage site results in a hybrid IL1 fragment. Binds to the modified fragment of the gene fragment. Escherichia coli strain BL2 1 (DE3) pLysS and HMS174 (DE3) pLysS were converted to p58A 1 supplemented with kanamycin and chloramphenicol Colonies are isolated on a gravy agar plate (Maniatis et al., 1989).   Example 18   A C5a analog of the human C5a fusion protein in Escherichia coli or Expression of polypeptide derivatives   Expression experiments are described in Stadia et al., Methods in Enzymology, 185: 60-89 (1990) and Van Heke et al., "Protein Expression And Purification "4: 265-274 (1993). This is done using standard methods for the / pET expression system. Briefly, expression programs A single Escherichia coli colony containing rasmid was measured for optical density (measured at 550 nm). Growth in Luria broth supplemented with antibiotics suitable for selection until the value reaches about 0.6 Let it. At this point, IPTG and Zn ++ were added and 0.4 mmol each. And a final concentration of 12.5 micromolar. Incubate cells for 2 Continue at 1, 30 or 37 ° C. for another 2-4 hours. Harvest cells by centrifugation And store at -80 ° C until use.   Example 19   Hydroxylamine of C5a analog or polypeptide derivative fusion protein cleavage   The recombinant fusion protein was isolated from the frozen Escherichia colipe from Example 18. From Store Recoat, 50 mmol of 1 mM EDTA at pH 8.0 After thawing in Tris / HCl buffer (5: 1 v: w, buffer: cell paste) Let go. The cells were then disrupted by sonication, and the crude extract was Centrifuge for minutes. The fusion protein-containing pellet was mixed with 0.2 M CAPS O, 2 mole NHTwoOH.HCL, applicable to solutions containing 6 mol guanidinium hydrochloride And adjusted to pH 9.3 with LiOH (7: 1 v: w, buffer: cell buffer). Let).   The solution was incubated at 37 ° C. for 7 hours and melted with hydroxylamine. Promotes protein cleavage, and when it exceeds 80%, the pH is increased with 4M HCl. Adjust to 8.0. More than 80% of hydroxylamine-cleavable fusion protein The dialysate containing solution is dialyzed against 25 mM Tris.HCl (pH 7.3) overnight. I do. Subsequently, the dialysate was centrifuged at 30,000 × g for 20 minutes, and C5aRA- ( Or the precipitate containing the polypeptide derivative) is collected. 6 mol guanidinium precipitate Sol. 100 mmol containing 1 mmol reduced / 0.01 mmol glutathione oxide Dilute 20-fold with Tris / HCl buffer (pH 7.4).   Next, purification and dimerization are performed according to the above-mentioned method.   All publications and patent applications mentioned in this specification are related to this invention. It shows the technical level of those skilled in the art. Specific publications or patent applications All of these publications and publications to the same extent And cited patent applications as part of the description.   Various modifications of the invention described herein will be apparent to those skilled in the art. It can be. Such modifications are also intended to fall within the scope of the following claims.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 7/06 Ｃ０７Ｋ 14/47 14/47 16/18 16/18 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｋ 15/02 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/566 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 15/00 Ｃ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＥ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (31)優先権主張番号 ０８／４６３，３７７ (32)優先日 1995年６月５日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ， ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，Ｍ Ｋ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 シュミッツ，アルベルト スイス、ツェーハー−4056バーゼル、ガス シュトラーセ53番──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. 6 Identification symbol FI C07K 7/06 C07K 14/47 14/47 16/18 16/18 C12N 1/21 C12N 1/21 C12P 21/02 C 5 / 10 K 15/02 21/08 C12P 21/02 G01N 33/53 D 33/566 21/08 C12N 5/00 B G01N 33/53 15/00 C 33/566 A61K 37/02 ABE // (C12N 15 / 09 ZNA C12R 1:91) (C12N 1/21 C12R 1:19) (31) Priority claim number 08 / 463,377 (32) Priority date June 5, 1995 (33) Priority claim country United States (US (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR NE, SN, TD, TG), AP (KE, LS, MW, SD, SZ, UG), UA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AU, BB, BG, BR, CA, CN, CZ, EE, GE, HU, IL, IS, JP, KP, KR, LK, LR, LT, LV, MG, MK, MN, MX, NO, NZ, PL , RO, SG, SI, SK, TR, TT, UA, US, UZ, VN (72) Inventors Schmitz, Albert Switzerland, Zeher-4056 Basel, Gas Strasse No. 53

Claims (1)

【特許請求の範囲】 （１）ヒトＣ５ａのポリペプチド誘導体であって、実質的にはアゴニスト活性 を呈しないＣ５ａ受容体アンタゴニストであり、Ｎ−末端としてグリシン残基を 有する誘導体。 （２）グリシン残基が付加物形態である、請求項１記載の誘導体。 （３）グリシン残基がヒトＣ５ａのＮ−末端アミノ酸残基Ｔｈｒに対する置換 基である、請求項１記載の誘導体。 （４）システイン残基を有し、少なくとも２個のアミノ酸残基によりＣ−末端 が先端切除されている点で、ヒトＣ５ａの対応するＣ−末端領域とは異なるＣ− 末端領域を含む、請求項１記載の誘導体。 （５）Ｃ−末端としてシステイン残基を有する、請求項４記載の誘導体。 （６）システイン残基が付加物形態である、請求項４記載の誘導体。 （７）６４〜７２アミノ酸長である、請求項４記載の誘導体。 （８）６８〜７２アミノ酸長である、請求項７記載の誘導体。 （９）７０〜７２アミノ酸長である、請求項８記載の誘導体。 （１０）７１アミノ酸長である、請求項９記載の誘導体。 （１１）Ｃ５ａ（１-７１、Ｔｈｒ１Ｇｌｙ，Ｃｙｓ２７Ｓｅｒ，Ｇｌｎ７１ Ｃｙｓ）である、請求項１０記載の誘導体。 （１２）Ｃ５ａ（１-７１、Ｔｈｒ１Ｇｌy，Ｃｙｓ２７Ｓｅｒ，Ｈｉｓ６７Ｐ ｈｅ、Ｇｌｎ７１Ｃｙｓ）である、請求項１０記載の誘導体。 （１３）ヒトＣ５ａの第一および第二ポリペプチド誘導体を含む二量体であっ て、誘導体の各々が、実質的にはアゴニスト活性を呈しないＣ５ａ受容体アンタ ゴニストであって、Ｃ−末端システイン残基を有し、第一および第二誘導体のシ ステイン残基がジスルフィド結合により結合されており、ヒトＣ５ａの第一およ び第二ポリペプチド誘導体は同一または異なり得、さらにヒトＣ５ａの第一およ び第二ポリペプチド誘導体の少なくとも一方が請求項１記載のヒトＣ５ａのポリ ペプチド誘導体である、二量体。 （１４）第一および第二誘導体の各々のＣ−末端領域が、少なくとも２個のア ミノ酸残基により先端切除されている点でヒトＣ５ａの対応するＣ−末端領域と は異なる、請求項１３記載の二量体。 （１５）第一および第二誘導体の各々がヒトＣ５ａ誘導体Ｃ５ａ（１-７１、 Ｔｈｒ１Ｇｌｙ、Ｃｙｓ２７Ｓｅｒ、Ｇｌｎ７１Ｃｙｓ）である、請求項１４記 載の二量体。 （１６）Ｎ−末端〜Ｃ−末端、融合相手、開裂可能なリンカーおよびそれに融 合して、ヒトＣ５ａのポリペプチド誘導体といった順序で構成される融合タンパ ク質であっで、ポリペプチド誘導体が実質的にはアゴニスト活性を呈しないＣ５ ａ受容体アンタゴニストである、融合タンパク質。 （１７）誘導体が、システイン残基を有し、少なくとも２個のアミノ酸残基に よりＣ−末端が先端切除されている点でヒトＣ５ａの対応するＣ−末端領域とは 異なるＣ−末端領域を含む、請求項１６記載の融合タンパク質。 （１８）誘導体がＣ−末端としてシステイン残基を有する、請求項１７記載の 融合タンパク質。 （１９）誘導体がＮ−末端としてグリシン残基を有する、請求項１７記載の融 合タンパク質。 （２０）融合相手が、細胞における封入体の形成を指令し得るポリペプチドで ある、請求項１６記載の融合タンパク質。 （２１）細胞がエシェリヒア・コリ細胞である、請求項２０記載の融合タンパ ク質。 （２２）開裂可能なリンカーと共存する融合相手が、ヒトＣ５ａのポリペプチ ド誘導体のアミノ酸長とほぼ同じのポリペプチドである、請求項２０記載の融合 タンパク質。 （２３）融合相手がヒトＩＬ−１βまたはその突然変異体のＮ−末端フラグメ ントを含む、請求項２２記載の融合タンパク質。 （２４）融合相手が、ヒトＩＬ−１βまたはその突然変異体のアミノ酸残基１ 〜４７およびヒトＩＬ−１ＲＡのアミノ酸残基５２〜５７により構成される、請 求項２３記載の融合タンパク質。 （２５）融合相手が、ヒトＩＬ−１βまたはその突然変異体のアミノ酸残基１ 〜４７およびヒトＩＬ−１ＲＡのアミノ酸残基５２〜５４により構成される、請 求項２３記載の融合タンパク質。 （２６）リンカーがヒドロキシルアミン開裂部位を含む、請求項１６記載の融 合タンパク質。 （２７）リンカーが、Ｎ−末端〜Ｃ−末端、エンテロキナーゼプロテアーゼ開 裂部位およびヒドロキシルアミン開裂部位といった順序で構成される、請求項２ ６記載の融合タンパク質。 （２８）Ｎ−末端〜Ｃ−末端、ヒトＩＬ−１βまたはその突然変異体のアミノ 酸残基１〜４７、ヒトＩＬ−１ＲＡのアミノ酸残基５２〜５４、アミノ酸配列-V al-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Asn-Gly-を含む開裂可能なリンカー、および請求項１ 記載のポリペプチド誘導体といった順序で構成され、上記リンカーのＣ−末端残 基Ｇｌｙがボリペプチド誘導体におけるヒトＣ５ａのＮ−末端アミノ酸残基Ｔｈ ｒに対する置換基である、請求項１６記載の融合タンパク質。 （２９）ポリペプチド誘導体が請求項７記載のものである、請求項２８記載の 融合タンパク質。 （３０）ポリペプチド誘導体が請求項１１記載のものである、請求項２９記載 の融合タンパク質。 （３１）ポリペプチド誘導体が請求項１２記載のものである、請求項２９記載 の融合タンパク質。 （３２）請求項１記載のヒトＣ５ａのポリペプチド誘導体をコード化するＤＮ Ａ分子。 （３３）誘導体が請求項７記載のものである、請求項３２記載のＤＮＡ分子。 （３４）誘導体が請求項１１記載のものである、請求項３３記載のＤＮＡ分子 。 （３５）誘導体が請求項１２記載のものである、請求項３３記載のＤＮＡ分子 。 （３６）請求項１６記載の融合タンパク質をコード化するＤＮＡ分子。 （３７）融合タンパク質が請求項１９記載のものである、請求項３６記載のＤ ＮＡ分子。 （３８）融合タンパク質が請求項２４記載のものである、請求項３７記載のＤ ＮＡ分子。 （３９）融合タンパク質が請求項２５記載のものである、請求項３７記載のＤ ＮＡ分子。 （４０）融合タンパク質が請求項２８記載のものである、請求項３７記載のＤ ＮＡ分子。 （４１）請求項３２記載のＤＮＡ分子に機能し得るように結合された所定の宿 主において機能し得るプロモーターを含む、組換えＤＮＡ分子。 （４２）請求項３６記載のＤＮＡ分子に機能し得るように結合された所定の宿 主において機能し得るプロモーターを含む、組換えＤＮＡ分子。 （４３）請求項３２記載の組換えＤＮＡ分子を含む、所定の宿主と適合し得る 組換えプラスミド。 （４４）請求項３６記載の組換えＤＮＡ分子を含む、所定の宿主と適合し得る 組換えプラスミド。 （４５）請求項３２記載の組換えＤＮＡ分子を含む、所定の宿主と適合し得る 組換えベクター。 （４６）請求項３６記載の組換えＤＮＡ分子を含む、所定の宿主と適合し得る 組換えベクター。 （４７）請求項３２記載の組換えＤＮＡ分子により安定して形質転換された組 換え宿主。 （４８）細菌、酵母、真菌、昆虫、哺乳類および植物細胞から成る群から選択 される、請求項４７記載の組換え宿主。 （４９）エシェリヒア・コリである、請求項４８記載の組換え宿主。 （５０）請求項３６記載の組換えＤＮＡ分子により安定して形質転換された組 換え宿主。 （５１）細菌、酵母、真菌、昆虫、哺乳類および植物細胞から成る群から選択 される、請求項５０記載の組換え宿主。 （５２）エシェリヒア・コリである、請求項５１記載の組換え宿主。 （５３）請求項１記載のヒトＣ５ａの生物活性ポリペプチド誘導体の製造方法 であって、 (1) ＤＮＡ分子の発現誘発に適した条件下ポリペプチド誘導体をコード化する ＤＮＡ分子により安定して形質転換されたエシェリヒア・コリ細胞を培養し、 (2) 上記要領で培養された細胞を変性および可溶化剤と接触させて、上記ポリ ペプチド誘導体の変性形態を製造し、そして (3) 上記要領で変性したポリペプチド誘導体を、適当な条件下で少なくとも約 １００：１の還元剤対酸化剤モル重量比で還元剤および酸化剤を含む溶液と混合 することにより、ポリペプチド誘導体の生物活性形態を製造する という段階を含む方法。 （５４）ＤＮＡ分子がポリペプチド誘導体の融合タンパク質形態をコード化す る、請求項５３記載の方法。 （５５）さらに混合段階前に上記要領で発現された融合タンパク質を開裂する 段階を含む、請求項５４記載の方法。 （５６）ＤＮＡ分子がヒトＣ５ａのポリペプチド誘導体をコード化し、それが ６４〜７２アミノ酸残基長である、請求項５４記載の方法。 （５７）ポリペプチド誘導体がＣ５ａ（１-７１、Ｔｈｒ１Ｇｌｙ、Ｃｙｓ２ ７Ｓｅｒ、Ｇｌｎ７１Ｃｙｓ）である、請求項５６記載の方法。 （５８）ポリペプチド誘導体がＣ５ａ（１-７１、Ｔｈｒ１Ｇｌｙ、Ｃｙｓ２ ７Ｓｅｒ、Ｈｉｓ６７Ｐｈｅ、Ｇｌｎ７１Ｃｙｓ）である、請求項５８記載の方 法。 （５９）ヒトＣ５ａの生物活性ポリペプチド誘導体の製造方法であって、誘導 体が実質的にはアゴニスト活性を呈しないＣ５ａ受容体アンタゴニストであり、 (1) 融合タンパク質形態のポリペプチド誘導体をコード化する組換えＤＮＡ分 子により安定して形質転換された宿主細胞を培養し、ただし、この培養は、封入 体形態の融合タンパク質の発現誘発に適した条件下で行われるものとし、 (2) 上記要領で培養された宿主細胞からの融合タンパク質を含む封入体を単離 し、 (3) 上記要領で単離された封入体を変性および可溶化剤と接触させて、融合タ ンパク質の変性形態を製造し、 (4) 上記要領で単離された融合タンパク質を開裂することにより、ヒトＣ５ａ のポリペプチド誘導体が得られ、そして (5) 上記要領で開裂された融合タンパク質を、適当な条件下還元剤対酸化剤の モル比が重量にして少なくとも約１００：１である還元剤および酸化剤を含む溶 液と混合することにより、ポリペプチド誘導体の生物活性形態が製造されるとい う段階（ただし、段階３および４は同時または連続して行われる）を含む方法。 （６０）混合が約６.５〜約７.５のｐＨで行われる、請求項５９記載の方法。 （６１）混合が約１／２時間〜約４時間の期間行われる、請求項５９記載の方 法。 （６２）酸化還元対が還元グルタチオン／酸化グルタチオンである、請求項５ ９記載の方法。 （６３）宿主細胞がエシェリヒア・コリである、請求項５９記載の方法。 （６４）組換えＤＮＡ分子が請求項１６記載の融合タンパク質をコード化する 、 請求項５９記載の方法。 （６５）組換えＤＮＡ分子が請求項１９記載の融合タンパク質をコード化する 、請求項６４記載の方法。 （６６）組換えＤＮＡ分子が請求項２２記載の融合タンパク質をコード化する 、請求項６５記載の方法。 （６７）組換えＤＮＡ分子が請求項２３記載の融合タンパク質をコード化する 、請求項６６記載の方法。 （６８）組換えＤＮＡ分子が請求項２４記載の融合タンパク質をコード化する 、請求項６７記載の方法。 （６９）組換えＤＮＡ分子が請求項２５記載の融合タンパク質をコード化する 、請求項６７記載の方法。 （７０）組換えＤＮＡ分子が請求項２８記載の融合タンパク質をコード化する 、請求項５９記載の方法。 （７１）組換えＤＮＡ分子が請求項２９記載の融合タンパク質をコード化する 、請求項７０記載の方法。 （７２）組換えＤＮＡ分子が請求項３０記載の融合タンパク質をコード化する 、請求項７１記載の方法。 （７３）組換えＤＮＡ分子が請求項３１記載の融合タンパク質をコード化する 、請求項７１載の方法。 （７４）請求項１記載のポリペプチド誘導体または請求項１３記載の二量体に 特異的な抗体であって、実質的にヒトＣ５ａとの交差反応性を呈しない抗体。 （７５）抗体がポリクローナルである、請求項７４記載の抗体。 （７６）抗体がモノクローナルである、請求項７４記載の抗体。 （７７）請求項１１記載の誘導体に特異的である、請求項７４記載の抗体。 （７８）請求項１４記載の二量体に特異的である、請求項７４記載の抗体。 （７９）請求項１５記載の二量体に特異的である、請求項７８記載の抗体。 （８０）ヒトを含む哺乳類におけるＣ５ａ仲介疾患または炎症状態の処置に有 用な医薬組成物であって、請求項１記載のヒトＣ５ａのポリペプチド誘導体また は請求項１３記載の二量体の治療有効量、および所望により医薬的に許容し得る 担体を含む医薬組成物。 （８１）誘導体が請求項１１記載のものであるか、または二量体が請求項１５ 記載のものである、請求項８０記載の医薬組成物。 （８２）請求項１記載のヒトＣ５ａのポリペプチド誘導体のインビボ活性を調 節するのに有用な医薬組成物であって、誘導体の活性を調節するのに有効な量の 請求項７４記載の抗体、および所望により医薬的に許容し得る担体を含む医薬組 成物。 （８３）抗体の量が誘導体のインビボ活性を実質的に中和するのに有効なもの である、請求項８２記載の医薬組成物。 （８４）哺乳類におけるＣ５ａ仲介疾患または炎症状態の処置方法であって、 処置を必要とするヒトを含む哺乳類に請求項８０記載の医薬組成物を投与する段 階を含む方法。 （８５）ヒトを含む哺乳類におけるＣ５ａ伝達性炎症を低減化する方法であっ て、炎症の低減化に十分な補体活性化−誘発または悪化事象に対し一度に上記哺 乳類に請求項８０記載の医薬組成物を投与する段階を含む方法。 （８６）調節を必要とする対象において、請求項１記載のポリペプチド誘導体 または請求項１３記載の二量体の活性を調節する方法であって、請求項８２記載 の医薬組成物を対象に投与する段階を含む方法。 （８７）中和を必要とする対象において、請求項１記載のポリペプチド誘導体 または請求項１３記載の二量体の活性を中和する方法であって、請求項８３記載 の医薬組成物を対象に投与する段階を含む方法。 （８８）対象における請求項１記載のポリペプチド誘導体の測定に関する定性 的または定量的検定法であって、 (1) 対象から組織または液体試料を採取し、そして (2) 抗体および誘導体間に検出可能な免疫複合体を形成（ただし、免疫複合体 の形成は対象における誘導体の存在の指標である）させるのに十分な条件下で試 料を請求項７４記載の抗体と接触させる、 という段階を含む検定法。 （８９）さらに対象において誘導体を定量する段階を含む、請求項８８記載の 検定法。 （９０）ヒトを含む哺乳類の治療的処置で使用される請求項１記載のポリペプ チド誘導体または請求項１３記載の二量体。 （９１）ヒトを含む哺乳類におけるＣ５ａ仲介疾患または炎症状態処置用の医 薬組成物を製造するための請求項１記載のポリペプチド誘導体または請求項１３ 記載の二量体の用途。[Claims]   (1) A polypeptide derivative of human C5a, which has substantially an agonist activity Is a C5a receptor antagonist that does not exhibit a glycine residue as the N-terminus. Derivatives.   (2) The derivative according to claim 1, wherein the glycine residue is in an adduct form.   (3) Substitution of glycine residue for N-terminal amino acid residue Thr of human C5a 2. The derivative according to claim 1, which is a group.   (4) It has a cysteine residue and is C-terminal by at least two amino acid residues. Differs from the corresponding C-terminal region of human C5a in that 2. The derivative according to claim 1, comprising a terminal region.   (5) The derivative according to claim 4, which has a cysteine residue as a C-terminal.   (6) The derivative according to (4), wherein the cysteine residue is in an adduct form.   (7) The derivative according to claim 4, which is 64 to 72 amino acids in length.   (8) The derivative according to claim 7, which is 68 to 72 amino acids in length.   (9) The derivative according to (8), which is 70 to 72 amino acids in length.   (10) The derivative according to claim 9, which is 71 amino acids in length.   (11) C5a (1-71, Thr1Gly, Cys27Ser, Gln71 The derivative according to claim 10, which is Cys).   (12) C5a (1-71, Thr1Gly, Cys27Ser, His67P he, Gln71Cys).   (13) A dimer containing first and second polypeptide derivatives of human C5a. And wherein each of the derivatives has substantially no agonist activity. A gonist having a C-terminal cysteine residue and a system of first and second derivatives. Stain residues are linked by disulfide bonds, and are the primary and And the second polypeptide derivative can be the same or different, and furthermore, the first and second polypeptides of human C5a. 2. The human C5a polypeptide according to claim 1, wherein at least one of the second polypeptide derivative and the second polypeptide derivative is A dimer, which is a peptide derivative.   (14) The C-terminal region of each of the first and second derivatives has at least two With the corresponding C-terminal region of human C5a in that it has been truncated by amino acid residues 14. The dimer of claim 13, wherein the dimers are different.   (15) each of the first and second derivatives is a human C5a derivative C5a (1-71, (Thr1Gly, Cys27Ser, Gln71Cys). Dimer.   (16) N-terminal to C-terminal, fusion partner, cleavable linker and fusion A fusion protein composed of human C5a polypeptide derivative in that order. C5 in which the polypeptide derivative does not substantially exhibit agonist activity a fusion protein, which is a receptor antagonist.   (17) The derivative has a cysteine residue and has at least two amino acid residues. What is the corresponding C-terminal region of human C5a in that the C-terminal is more truncated? 17. The fusion protein of claim 16, comprising a different C-terminal region.   (18) The derivative according to claim 17, wherein the derivative has a cysteine residue as a C-terminus. Fusion protein.   (19) The fusion according to claim 17, wherein the derivative has a glycine residue as an N-terminus. Synthetic protein.   (20) The fusion partner is a polypeptide capable of directing the formation of inclusion bodies in cells. 17. The fusion protein of claim 16, which is present.   (21) The fusion tamper according to claim 20, wherein the cell is an Escherichia coli cell. Quality.   (22) A fusion partner coexisting with a cleavable linker is a human C5a polypeptide 21. The fusion according to claim 20, wherein the fusion is a polypeptide having substantially the same amino acid length as the amino acid derivative. protein.   (23) The fusion partner is the N-terminal fragment of human IL-1β or a mutant thereof. 23. The fusion protein of claim 22, which comprises a fusion protein.   (24) The fusion partner is amino acid residue 1 of human IL-1β or a mutant thereof. -47 and amino acid residues 52-57 of human IL-1RA. 24. The fusion protein according to claim 23.   (25) The fusion partner is amino acid residue 1 of human IL-1β or a mutant thereof -47 and amino acid residues 52-54 of human IL-1RA. 24. The fusion protein according to claim 23.   (26) The fusion of claim 16, wherein the linker comprises a hydroxylamine cleavage site. Synthetic protein.   (27) Linker is N-terminal to C-terminal, enterokinase protease opened 3. The composition of claim 2, wherein the cleavage site and the hydroxylamine cleavage site are arranged in this order. 7. The fusion protein according to 6.   (28) N-terminal to C-terminal, amino of human IL-1β or a mutant thereof Acid residues 1-47, amino acid residues 52-54 of human IL-1RA, amino acid sequence -V A cleavable linker comprising al-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Asn-Gly-, and claim 1. And the C-terminal residue of the linker. The group Gly is the N-terminal amino acid residue Th of human C5a in a polypeptide derivative 17. The fusion protein of claim 16, which is a substituent for r.   (29) The method according to claim 28, wherein the polypeptide derivative is the one according to claim 7. Fusion protein.   (30) The polypeptide derivative according to (11), wherein the polypeptide derivative is the one according to (11). Fusion protein.   (31) The method according to the above (29), wherein the polypeptide derivative is the one according to the (12). Fusion protein.   (32) DN encoding the polypeptide derivative of human C5a according to claim 1. A molecule.   (33) The DNA molecule according to claim 32, wherein the derivative is the one according to claim 7.   (34) The DNA molecule according to claim 33, wherein the derivative is the one according to claim 11. .   (35) The DNA molecule according to claim 33, wherein the derivative is one according to claim 12. .   (36) A DNA molecule encoding the fusion protein of claim 16.   (37) The D according to claim 36, wherein the fusion protein is the one according to claim 19. NA molecule.   (38) The D according to claim 37, wherein the fusion protein is the one according to claim 24. NA molecule.   (39) The D according to claim 37, wherein the fusion protein is the one according to claim 25. NA molecule.   (40) The D according to claim 37, wherein the fusion protein is the one according to claim 28. NA molecule.   (41) A predetermined hotel operably linked to the DNA molecule according to claim 32. A recombinant DNA molecule comprising a promoter that can function primarily.   (42) A predetermined accommodation operably linked to the DNA molecule according to claim 36. A recombinant DNA molecule comprising a promoter that can function primarily.   (43) Compatible with a predetermined host, comprising the recombinant DNA molecule according to claim 32. Recombinant plasmid.   (44) Compatible with a predetermined host, comprising the recombinant DNA molecule according to claim 36. Recombinant plasmid.   (45) Compatible with a predetermined host, comprising the recombinant DNA molecule according to claim 32. Recombinant vector.   (46) Compatible with a predetermined host containing the recombinant DNA molecule according to claim 36. Recombinant vector.   (47) A set stably transformed with the recombinant DNA molecule according to claim 32. A replacement host.   (48) selected from the group consisting of bacteria, yeast, fungi, insects, mammals and plant cells 50. The recombinant host of claim 47, wherein   (49) The recombinant host according to claim 48, which is Escherichia coli.   (50) A set stably transformed with the recombinant DNA molecule according to claim 36. A replacement host.   (51) selected from the group consisting of bacteria, yeast, fungi, insects, mammals and plant cells 51. The recombinant host of claim 50, wherein   (52) The recombinant host according to claim 51, which is Escherichia coli.   (53) A method for producing the biologically active polypeptide derivative of human C5a according to claim 1. And   (1) encoding a polypeptide derivative under conditions suitable for inducing expression of a DNA molecule Culturing Escherichia coli cells stably transformed with the DNA molecule,   (2) Contact the cells cultured as described above with a denaturing and solubilizing agent to Producing a modified form of the peptide derivative; and   (3) The polypeptide derivative modified in the manner described above is converted into at least about Mixed with a solution containing reducing agent and oxidizing agent in a molar ratio of reducing agent to oxidizing agent of 100: 1 To produce a biologically active form of the polypeptide derivative A method including the step of:   (54) The DNA molecule encodes a fusion protein form of the polypeptide derivative 54. The method of claim 53, wherein   (55) Further cleave the fusion protein expressed as above before the mixing step 55. The method of claim 54, comprising steps.   (56) the DNA molecule encodes a polypeptide derivative of human C5a, 55. The method of claim 54, wherein the method is 64 to 72 amino acid residues long.   (57) The polypeptide derivative is C5a (1-71, Thr1Gly, Cys2 57. The method of claim 56, wherein the method is 7Ser, Gln71Cys).   (58) The polypeptide derivative is C5a (1-71, Thr1Gly, Cys2 57Ser, His67Phe, Gln71Cys). Law.   (59) A method for producing a biologically active polypeptide derivative of human C5a, comprising the step of: A C5a receptor antagonist, wherein the body exhibits substantially no agonist activity;   (1) a recombinant DNA fragment encoding a polypeptide derivative in the form of a fusion protein Culturing host cells that have been stably transformed by the offspring, provided that It should be performed under conditions suitable for inducing the expression of the body form of the fusion protein,   (2) Isolating inclusion bodies containing fusion proteins from host cells cultured as described above And   (3) The inclusion body isolated as described above is contacted with a denaturing and solubilizing agent to Producing a denatured form of protein,   (4) By cleaving the fusion protein isolated as described above, human C5a And a polypeptide derivative of   (5) The fusion protein cleaved in the manner described above is treated under appropriate conditions with a reducing agent versus an oxidizing agent. A solution comprising a reducing agent and an oxidizing agent in a molar ratio of at least about 100: 1 by weight. Liquids produce a biologically active form of the polypeptide derivative. (Wherein steps 3 and 4 are performed simultaneously or sequentially).   60. The method according to claim 59, wherein the mixing is performed at a pH of about 6.5 to about 7.5.   (61) The method of claim 59, wherein the mixing is performed for a period of about 1/2 hour to about 4 hours. Law.   (62) The redox couple is reduced glutathione / oxidized glutathione. 9. The method according to 9.   (63) The method according to claim 59, wherein the host cell is Escherichia coli.   (64) a recombinant DNA molecule encoding the fusion protein of claim 16; , 60. The method of claim 59.   (65) a recombinant DNA molecule encoding the fusion protein of claim 19; 65. The method of claim 64.   (66) a recombinant DNA molecule encoding the fusion protein of claim 22; 66. The method of claim 65.   (67) the recombinant DNA molecule encodes the fusion protein of claim 23; 67. The method of claim 66.   (68) a recombinant DNA molecule encoding the fusion protein of claim 24; 68. The method of claim 67.   (69) the recombinant DNA molecule encodes the fusion protein of claim 25; 68. The method of claim 67.   (70) a recombinant DNA molecule encoding the fusion protein of claim 28; 60. The method of claim 59.   (71) a recombinant DNA molecule encoding the fusion protein of claim 29; 71. The method of claim 70.   (72) a recombinant DNA molecule encoding the fusion protein of claim 30; 72. The method of claim 71.   (73) the recombinant DNA molecule encodes the fusion protein of claim 31; 72. The method of claim 71.   (74) The polypeptide derivative according to claim 1 or the dimer according to claim 13 A specific antibody that does not substantially exhibit cross-reactivity with human C5a.   (75) The antibody of claim 74, wherein the antibody is polyclonal.   (76) The antibody of claim 74, wherein the antibody is monoclonal.   (77) The antibody of claim 74, which is specific for the derivative of claim 11.   (78) The antibody of claim 74, which is specific for the dimer of claim 14.   (79) The antibody of claim 78, which is specific for the dimer of claim 15.   (80) For the treatment of C5a-mediated diseases or inflammatory conditions in mammals, including humans A pharmaceutical composition, comprising the polypeptide derivative of human C5a according to claim 1 or Is a therapeutically effective amount of the dimer according to claim 13, and optionally pharmaceutically acceptable A pharmaceutical composition comprising a carrier.   (81) The derivative is as defined in claim 11, or the dimer is as defined in claim 15. 81. The pharmaceutical composition of claim 80, wherein the composition is as described.   (82) adjusting the in vivo activity of the polypeptide derivative of human C5a according to claim 1; A pharmaceutical composition useful for moderating, comprising an amount of an effective amount to modulate the activity of the derivative. 75. A pharmaceutical set comprising the antibody of claim 74, and optionally a pharmaceutically acceptable carrier. Adult.   (83) The amount of the antibody is effective to substantially neutralize the in vivo activity of the derivative 83. The pharmaceutical composition according to claim 82, wherein   (84) A method for treating a C5a-mediated disease or inflammatory condition in a mammal, comprising: 81. The step of administering a pharmaceutical composition according to claim 80 to a mammal, including a human, in need of treatment. Method involving floors.   (85) A method for reducing C5a mediated inflammation in mammals including humans. In addition, the complement activation-induced or exacerbated event at a time is sufficient to reduce inflammation. 81. A method comprising administering the pharmaceutical composition of claim 80 to a milk.   (86) The polypeptide derivative according to claim 1, in a subject requiring regulation. Or a method for regulating the activity of a dimer according to claim 13, wherein the method is for regulating dimer activity. Administering to a subject a pharmaceutical composition of   (87) The polypeptide derivative according to claim 1, in a subject requiring neutralization. Or a method for neutralizing the activity of the dimer according to claim 13, wherein the method is for neutralizing the activity of the dimer according to claim 13. Administering to a subject a pharmaceutical composition of   (88) Qualitative determination of the polypeptide derivative according to claim 1 in a subject A quantitative or quantitative assay,   (1) taking a tissue or fluid sample from the subject, and   (2) Form a detectable immune complex between the antibody and the derivative (but not Formation is an indicator of the presence of the derivative in the subject). Contacting the antibody with the antibody of claim 74. An assay method that includes a step.   (89) The method of claim 88, further comprising the step of quantifying the derivative in the subject. Assay.   (90) The polypep according to claim 1, which is used for therapeutic treatment of mammals including humans. 14. A tide derivative or a dimer according to claim 13.   (91) A physician for treating a C5a-mediated disease or inflammatory condition in a mammal, including a human. 14. The polypeptide derivative according to claim 1 or 13 for producing a pharmaceutical composition. Use of the described dimer.
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