JPH11506320A - Abundant extracellular products and methods for producing and using them - Google Patents

Abundant extracellular products and methods for producing and using them

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JPH11506320A
JPH11506320A JP8535943A JP53594396A JPH11506320A JP H11506320 A JPH11506320 A JP H11506320A JP 8535943 A JP8535943 A JP 8535943A JP 53594396 A JP53594396 A JP 53594396A JP H11506320 A JPH11506320 A JP H11506320A
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tuberculosis
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エイ． ホーウィッツ，マーカス
ハース，グンダー
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THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
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    • C07K14/35—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Mycobacteriaceae (F)
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Abstract

(57)【要約】 主に豊富な、病原体の細胞外産物の、一つ以上組み合わせに基づくワクチン、ならびに、それらの使用および産生のための方法が提示されている。標的病原体の、最も大量にあるか、または、主に豊富な細胞外産物が、それらの絶対的な分子的免疫原生とは無関係に選択され、そして哺乳動物宿主での、標的病原体による引き続く感染に対する防御的な免疫応答を刺激するためのワクチンとして用いられる。主に豊富な細胞外産物は、それらのそれぞれのＮ末端アミノ酸、アミノ酸、またはDNA配列によって特徴づけられ、そして区別され得る。ワクチンが、細胞外産物、それらのサブユニット、または、それらをコードする核酸の異なる組合せを含み得るため、本発明によって、広い範囲に有効な免疫治療用組成物が提供される。他の感染因子に加えて、このように産生されたワクチンを用いて、細胞内の病原体、特に、ヒト結核菌（Mycobacterium tuberculosis）に対する効果的な免疫応答を刺激することができる。   (57) [Summary] Vaccines based on one or more combinations of mainly abundant extracellular products of pathogens and methods for their use and production have been presented. The most abundant or predominantly abundant extracellular products of the target pathogen are selected independently of their absolute molecular immunogenicity, and are resistant to subsequent infection by the target pathogen in a mammalian host Used as a vaccine to stimulate a protective immune response. Predominantly abundant extracellular products are characterized and distinguished by their respective N-terminal amino acids, amino acids, or DNA sequences. The present invention provides a broadly effective immunotherapeutic composition, as vaccines may contain different combinations of extracellular products, their subunits, or nucleic acids encoding them. In addition to other infectious agents, the vaccine so produced can be used to stimulate an effective immune response against intracellular pathogens, particularly Mycobacterium tuberculosis.

Description

【発明の詳細な説明】 豊富な細胞外産物、ならびにそれらを産生および使用するための方法政府との関連 本発明は、保険社会福祉省から交付された助成金番号AI-35275およびAI-31338 による、政府からの支援によって行われた。政府は、本発明において一定の権利 を有する。発明の分野 本発明は、一般的に、細菌、原生動物、ウイルス、および真菌のような病原性 生物に対する免疫治療剤、およびワクチンに関する。より詳細には、最大、また は最も特異的な分子的免疫原性を示す病原性サブユニット、または産物に基づい た、先行技術のワクチン、および免疫治療剤とは異なり、本発明は、哺乳動物宿 主における効果的な免疫応答を刺激するために、Mycobacterium tuberculosisの ような選択された病原体によって放出される、最も優勢であるか、または、主に 豊富にある免疫原性決定因子を用いる。したがって、本発明によって作製される 獲得免疫、および免疫治療活性は、投与された化合物の相対的、または絶対的な 免疫原性とは特に関係なく、病原体が感染する過程で、感染した宿主細胞上に最 も頻繁に提示される抗原マーカーに対して向けられる。発明の背景 寄生微生物は、動物に感染し、それにより、宿主の疾患、およびしばしばその 死をもたらす能力を有することが、長い間認識されている。病原性因子は、歴史 を通じて、死亡の主な原因であり、そして測り知れない苦しみを与え続けている 。この百年間で、多くの感染性疾患の予防および処置において、劇的な進歩が認 められたが、複雑な宿主−寄生体相互作用のため、未だ治療的測定法の普遍的な 有効性が限定されている。多くの病原性ベクターが示す精巧な侵入メカニズムを 阻止することの難しさは、結核のような種々の疾患の復活、ならびに細菌および ウ イルスの多数の薬物耐性株の出現により証明される。 疫学的な関心の主な対象であるこれらの病原性因子のうち、細胞内細菌は、治 療的測定法、または予防的測定法にもかかわらず、特に難治性であることが証明 されてきた。Mycobacterium属およびLegionella属を含む、細胞内細菌は、その 生活環の全部または一部を、細胞外よりもむしろ、感染した宿主生物の細胞内で 完了する。世界中で、細胞内細菌は、毎年の何百万人もの死亡、および数え切れ ない苦痛の原因となる。Mycobacterium tuberculosisによって生じる結核は、世 界的に、感染性疾患による死亡の主要な原因であり、毎年、一千万の新たな症例 、および290万人の死亡を伴う。さらに、細胞内細菌は、何百万ものハンセン病 の症例の原因となる。細胞内因子によって伝達される、他の消耗性の疾患には、 皮膚および内臓のリーシュマニア症、アメリカトリパノソーマ症（シャーガス病 ）、リステリア症、トキソプラスマ症、ヒストプラスマ症、トラコーマ、オウム 病、Ｑ熱、および、在郷軍人病を含むレジオネラ症が含まれる。今でも、これら の生物に曝露された感受性の個体における消耗性の感染を防ぐためにできること は比較的少ない。 集団を結核から効果的に保護できないこと、および結核による、固有のヒトの 病的状態および死のため、これは、人類が直面している最も重要な疾患の一つで ある。より詳細には、M．tuberculosisによって主に起こるヒトの肺結核は、発 展途上国における主要な死亡原因である。マクロファージおよび単球の中で生存 できるため、M．tuberculosisは、慢性的な細胞内感染を引き起こし得る。外来 因子を検出し、続いて免疫系を活性化する責任を主に果たす細胞の中にそれ自体 が隠れることにより、M．tuberculosisは、宿主生物の正常な防御の回避を比較 的上首尾にしている。これらの同一の病原特性が、結核菌感染に対する効果的な 免疫治療剤またはワクチンの開発をこれまで妨げてきた。同時に、結核菌（tube rcle bacilli）は、実験室の条件下での培養および観察が比較的容易である。従 って、M．tuberculosisは、本発明の原理および利点を実証するのに、特によく 適している。 当業者は、M．tuberculosisに関する、以下の例示的な議論が、決して、M．tu berculosisを処置するための本発明の範囲を限定することは意図しないことを理 解する。同様に、本明細書における教示は、決して、結核菌感染の処置に限定さ れない。反対に、本発明を用いて、細胞外産物を発現する任意の病原性因子の免 疫原性決定因子に対する、安全かつ効果的なワクチンおよび免疫治療剤を有利に 提供し、それによって、これらの生物の感染伝染を阻害し得る。 現在、世界の人口の約半分がM．tuberculosisに感染し、毎年何百万症例の肺 結核をもたらしていると考えられている。この疾患は、特に、ラテンアメリカ、 アフリカ、およびアジアの発展途上国における深刻な健康問題である一方、第一 世界においてもまた、より流行してきている。米国においては、特定の集団、特 に、都市の貧しい免疫無防備状態の個人、および高い疾患罹患率の地域からの移 民は危険性が増加している。主としてAIDSの流行により、先進国において結核の 発生率が、しばしば、多剤耐性M．tuberculosisの形態で増加している。 最近、米国の50の州のうち36の州で、１種以上の薬物に対して抵抗性の結核が 報告された。ニューヨーク市では、1991年に試験されたすべての症例のうちの３ 分の１が、１種類以上の主要な薬物に抵抗性であった。非抵抗性の結核は、長期 間の治療方針で抗生物質を用いて治癒され得るが、薬物抵抗性株に関する見通し は厳しい。２種類以上の主要な抗生物質に抵抗性の株に感染した患者は、ほぼ50 ％の致死率を有する。したがって、このような種々のM．tuberculosisに対する 安全かつ効果的なワクチンが非常に必要とされる。 M．tuberculosisの初期感染は、ほぼ常に、エアゾール化した粒子の吸入によ って起こる。なぜなら、この病原体は、湿った痰、または乾いた痰の中で、数週 間または数カ月間生存可能なままであり得るからである。一次的な感染部位は肺 の中にあるが、この生物はまた、骨、脾臓、髄膜、および皮膚の感染も引き起こ し得る。特定の株の毒性、および宿主の抵抗性に依存して、組織に対する感染お よび対応する損傷は小さい場合もあり、もしくは大きい場合もある。ヒトの場合 には、初期感染は、細菌の毒性株に曝露された、大多数の個人の中で制御される 。最初の抗原投与後の獲得免疫の発達により、細菌の増殖が減少し、それによっ て、病変は回復し、そして被験体は、主に無症候のままであるが、あるいは感染 性のままである。 M．tuberculosisが、感染した被験体によって制御されない場合、肺組織の広 範な退化がしばしば生じる。結核菌が、肺胞または肺のマクロファージの中で繁 殖する場合、感受性個体においては、通常、肺中で病変が形成される。この生物 は繁殖すると、リンパ系を介して遠位のリンパ節に広がり得、血流を介して、肺 の頂、骨髄、腎臓、および脳を囲む髄膜に広がり得る。主に、細胞媒介性の過敏 性反応の結果として、感染の重篤度に比例して、特徴的な肉芽腫性の病変、また は結節が生じる。これらの病変は、単球、リンパ球、および線維芽細胞に隣接し た類上皮細胞からなる。ほとんどの症例において、病変または結節は最終的に壊 死性になり、そして乾酪化をうける。 M．tuberculosisは、重要な病原体であるが、Mycobacterium属の別の種もまた 、ヒトを含む動物の疾患の原因となり、そして明らかに本発明の範囲内に含まれ る。例えば、M．bovisは、M．tuberculosisに密接に関連し、ウシ、ブタ、ヒツ ジ、ウマ、イヌ、およびネコのような家畜における結核菌感染の原因である。さ らに、M．bovisは、腸管を介して、代表的には、生のミルクの摂取から、ヒトに 感染し得る。局所的な腸感染は、最終的に気道に拡がり、続いてまもなく古典的 な結核の症状を引き起こす。Mycobacterium属の別の重要な病原性ベクターは、 古来からの疾患であるハンセン病の何百万の症例の原因となるM．lepraeである 。動物およびヒトにおいて疾患の原因となるこの属の別の種には、M．kansasii 、M．avium intracellulare、M．fortuitum、M．marinum、M．chelonei、M．afr icanum、M．ulcerans、M．microti、およびM．scrofulaceumが含まれる。病原性 のマイコバクテリウムの種は、しばしば、それらのそれぞれのDNAおよび対応す るタンパク質配列において高度の相同性を示し、そしてM．tuberculosisおよびM ．bovisのようないくつかの種は、高度に関連している。 明らかに実際的かつ倫理的な理由のため、このような苦痛をもたらすものに関 する実験的組成物の効力を決定するためのヒトにおける最初の研究は、実行不可 能である。したがって、任意の薬物またはワクチンの最初の開発において、安全 性および費用の理由から、適切な動物モデルを用いることが、標準的な手順であ る。免疫優性エピトープが、しばしば異なる宿主種において活性であるという理 解から、実験動物モデルの実行の成功が予測される。このように、一つの種（例 えば、齧歯類またはモルモット）における免疫原性決定因子は、一般的に、ヒト のような異なる種においても免疫反応性である。適切な動物モデルが十分に開発 された後にのみ、ヒトにおけるワクチンの安全性および効力をさらに実証するた めに、ヒトにおける臨床試験が行われる。 M．tuberculosisによる肺胞または肺の感染に関しては、モルモットモデルが 、多くの点で、この疾患のヒトの病理と密接に類似している。したがって、ヒト および他の哺乳動物に対するこの疾患のモルモットモデルを外挿するのが適切で あることが、当業者によく理解される。ヒトのように、モルモットは、低用量の エアゾール化したヒト病原体M．tuberculosisの結核菌感染に感受性である。初 期感染が通常制御されるヒトとは異なり、モルモットは、エアゾール化した病原 体に曝される際、散在性の疾患を一貫して発症し、その後の解析を容易にする。 さらに、モルモットとヒトとは両方、稠密な単核細胞の硬化、または皮膚の試験 部位の硬直した領域の発症によって特徴づけられる、皮膚性遅延型過敏性反応を 示す。最後に、ヒトおよびモルモットの特徴的な結核性病変は、ラングハンス型 巨細胞の存在を含む、類似の形態を示す。モルモットは、この疾患の初期感染お よび進行に対してヒトよりも感受性であるので、この動物モデルを用いる実験に おいて付与される任意の防御は、ヒトまたは他のより感受性の少ない哺乳動物に おいて、同じ防御免疫が生じ得るという強い示唆を提供する。従って、制限する 目的ではなく、説明する目的のためにのみ、本発明を、哺乳動物宿主としてのモ ルモットの例示的な文脈において、最初に実証する。本発明が、ヒト、および家 畜化された動物を含む、他の哺乳動物宿主を用いて実施され得ることは、当業者 に理解される。 病原性ベクター、および特に、細胞内生物に感染した動物またはヒトは、宿主 免疫系に困難な挑戦を与える。多くの感染性因子は、体液性応答および対応する 防御抗体の産生によって、効果的に制御され得るが、これらのメカニズムは、身 体の細胞外体液中に位置するこれらの病原体に対してのみ主に有効である。詳細 には、オプソニン作用を有する（opsonizing）抗体は、細胞外の外来因子に結合 し、それにより、それらを食作用およびその後の細胞内殺傷に対して感受性にす る。さらに、これは、他の病原体には当てはまらない。例えば、以前の研究では 、液性免疫応答が、M．tuberculosisのような細胞内細菌による感染に対して重 要 な防御的役割を果たさないようであることを示していた。しかし、本発明は、標 的病原体に対する有益な液性応答を生じさせ得、そしてそのこと自体、その有効 性は、刺激された免疫応答の任意の特定の構成成分に限定されない。 より詳細には、抗体に媒介される防御は、外見上、細胞内病原体の初期感染を 阻止せず、そして一旦、細菌が宿主細胞の中に隔離されると効力がなくなる。水 溶性タンパク質として、抗体は、細胞外の体液および血液に浸透し得るが、細胞 の脂質膜を通って移動することは困難である。さらに、細菌の表面構造に対して オプソニン作用を有する抗体の産生は、実際、細胞内病原体が宿主細胞に侵入す るのを補助し得る。したがって、Mycobacteriumのような細胞内因子に対する効 果的な予防測定法は、無防備な食細胞を活性化するか、または、細胞傷害的にそ れらを排除する、抗原特異的リンパ球の迅速な増殖をもたらす、攻撃的な細胞媒 介性免疫応答成分を取り込むべきである。しかし、以下に詳細に議論するように 、細胞媒介性免疫応答を誘導することは、防御免疫を誘導することと等しくはな い。細胞媒介性免疫は、防御免疫の前提となる先行条件であり得るが、本発明の 教示にしたがうワクチンの産生は、動物に基づいた抗原投与実験が必要である。 この細胞媒介性免疫応答は、一般的に２つの工程を含む。細胞が感染したとい うシグナルを送る第一の工程は、細胞の表面に病原体の断片を送達する特別な分 子（主要組織適合性分子、すなわちMHC分子）によって達成される。これらのMHC 分子は、感染細胞の中で分解された細菌タンパク質の小フラグメントに結合し、 そしてそれらを細胞表面に提示する。Ｔ細胞に対するこれらの提示は、宿主の免 疫系を刺激して、感染宿主細胞を除去するか、または、宿主細胞の中に存在して いる全ての細菌を根絶するように宿主細胞を誘導する。 ほとんどの感染性細菌とは異なり、M．tuberculosisを含むMycobacteriumは、 膜によって細胞の残りの部分から実質的に密封されている液胞の中で増殖する傾 向がある。食細胞はこれらの防御的な液胞を自然に形成し、このことは、このク ラスの病原体による感染に対して食細胞を特に感受性にする。このような液胞に おいて、細菌は、分解から効果的に保護され、免疫系が、感染した細胞の表面に 完全な細菌成分を提示するのを困難にする。しかし、感染細胞のMHC分子は、液 胞に移動し、そして遊離の（解離した）細菌産物を収集するか、または、細胞表 面における産物の正常な提示のために、外来の細胞外細菌産物が輸送された、宿 主細胞の他の部位に移動する。以前に示されたように、外来細菌産物の提示は、 宿主の免疫系による適正な応答を誘発する。 免疫系に対して提出された問題の細胞内病原体はまた、ワクチン開発に対する 特別な挑戦を構成する。これまで、ほとんどの研究者には、Mycobacterium感染 、および特に、M．tuberculosisに対する効果的なワクチンの産生を見出さなか った。現在、細胞内病原体に対して広範に利用可能なワクチンは、M．bovisの無 毒性株である、生菌弱毒化ワクチンのBCGのみであり、これは、結核菌に対する 予防測定法として用いられる。さらに、1988年には、インドの世界保健機構の広 範な研究によって、最良のBCGワクチンの効力は測定できないほど僅かであると 決定された。この問題となり得る効果にも関わらず、世界中の結核の高発生地域 で、BCGワクチンが広範に用いられてきた。問題をなおさらに複雑にしているの は、BCGでワクチン接種された個体が、しばしば、結核のスクリーニングおよび コントロールに関する最も一般的な皮膚試験の有効性を打ち消す、ツベルクリン に対する感受性を発生することである。 BCGのような生菌弱毒化ワクチンを用いることに関する別の深刻な問題は、免 疫無防備状態の患者が、生命を脅かす疾患を起こす可能性があることである。迅 速に増殖する誘導された感染と闘う能力が低下しているので、これらのワクチン は、細胞媒介性免疫が低下している人に特別の危険を与える。このような個体に は、栄養不良および劣悪な生活状態によって弱っている個体、器官移植のレシピ エント、ならびに、HIVに感染した人が含まれる。BCGワクチンの場合には、危険 性の高い個体には、気腫、慢性気管支炎、塵肺、珪肺、および以前の結核のよう な肺疾患を患っている人も含まれる。したがって、弱毒化ワクチンの使用は、ま さに、それらが最も高い潜在的有益性を有する集団に限られている。 生菌弱毒化ワクチンの使用はまた、他の望ましくない副作用をもたらし得る。 生ワクチンはレシピエント中で繁殖するので、非感染性ワクチンよりも広範な抗 体および方向性のより少ない細胞媒介性免疫応答を誘発する。このショットガン アプローチは、細胞性の防御に最も関与する分子構造に向けられた免疫応答を妨 害する傾向を有する。さらに、インタクトな膜を有する生ワクチンの使用は、効 果的な食作用のため外来の物体（body）を調製するオプソニン作用を有する抗体 を誘導し得る。したがって、宿主が標的生物の毒性株に曝される際、このような 抗体の存在により、弱毒化されていない病原体が生存し、そして増殖し得る宿主 細胞へのこれらの病原体の取り込みが実際に促進され得る。さらに、弱毒化ワク チンは、何千もの異なる分子種を含み、その結果、おそらく患者において毒性で あるか、または、有害な免疫応答を誘発し得る分子種を含む。生ワクチンが有す る他の問題には、毒性の復活、接触による自然の伝染、混入しているウイルス、 およびウイルス干渉、ならびに標準化に伴う困難が含まれる。 同様に、殺傷された生物、または強度に抗原性の膜結合構造に対する従来の第 ２世代サブユニットワクチン（second generation subunit vaccine）のような 非感染性ワクチンは、細胞内細菌の阻害に関して限定される。弱毒化ワクチンと 同様、死菌は、最も効果的な防御的決定因子を阻害し得る無差別の応答を誘発す る。さらに、死菌ワクチンは、なお、免疫系に対して、多数の潜在的に抗原性の 構造を提示し、それによって、免疫系による毒性反応、またはオプソニン化の可 能性を増加させる。膜結合構造を取り込む伝統的なサブユニットワクチンはまた 、合成されたものも、精製されたものもいずれも、細胞内病原体が繁殖する食細 胞中への細胞内病原体の侵入を促進する強いオプソニン効果を誘導し得る。細菌 の含有率を増加させることによって、細胞内表面抗原に対する死菌ワクチンは、 病原性因子の相対的な毒性を増加させ得る。したがって、強い抗原性の細菌表面 成分に対する従来の弱毒化または死菌ワクチンは、細胞内病原体の場合に禁忌を 示し得る。 伝統的なワクチンの使用に関連した問題を回避するために、特定の細胞内病原 体に対する防御免疫を刺激するために、細胞外タンパク質、またはそれらの免疫 原性アナログを用いて開発が行われてきた。例えば、本発明者らの1992年４月28 日発行の米国特許番号5,108,745は、Legionella pneumophila、およびM．tuberc ulosis、およびその他の細胞内病原体に対する防御免疫を生じるワクチンおよび 方法を開示する。これらの先行技術によるワクチンは、インビトロでは、病原性 細菌によってブロス培養液中に細胞外に放出され、そしてインビボでは、感染し た宿主細胞の中に細菌によって細胞外に放出される、タンパク質性化合物に本来 由来する細胞外産物に広く基づいている。その中で開示されているように、これ らのワクチンは、哺乳動物宿主の中で、標的病原体に対して強い免疫応答を刺激 する細胞外産物、またはそのアナログの同定に選択的に基づいている。 より詳細には、目的の病原体に対して免疫された哺乳動物において、強いリン パ球増殖応答、または皮膚性遅延型過敏性反応のいずれかを誘発する能力を決定 することによって、これらの先行技術による候補となる細胞外タンパク質をスク リーニングした。この開示された方法、および関連するワクチンは、伝統的なワ クチンの使用に固有の不利益の多くを回避するが、交差反応による矛盾する免疫 応答結果および宿主の変化によって、効果的な免疫化剤を選択するのを複雑にし 得る。したがって、分子的免疫原性は、効果的なワクチンの１つの指標であるが 、他の要素が、それをインビボでの効果的な免疫応答の誘導における使用を複雑 にし得る。 より重要なのは、驚くべきことに、特にM．tuberculosisに関して、効果的な 防御免疫を誘導するワクチンを同定するための従来の先行技術の方法は、厄介で ありかつ潜在的に効果的でないことが発見されたことである。例えば、最も免疫 原性のあるこれらの細胞外成分を同定することを目的とした、大量のM．tubercu losisの細胞外タンパク質のSDS-PAGE解析および続く従来のウエスタンブロット 技術は、矛盾した結果を生じた。反復試験は、どの細胞外産物が最も強い免疫原 性応答を生じ、そして先行技術の見解に一致し、それにより、最も効果的なワク チンとして機能するのかを同定できなかった。M．tuberculosisの細胞外産物の 多くは、当技術分野において周知であり、既に同定され、そしていくつかの場合 配列決定されている。さらに、任意の外来タンパク質と同様に、これらの公知の 化合物が、免疫応答を誘導することを示し得る。しかし、当該分野において、こ れらの公知の化合物のいずれかが、伝統的に同定されたような防御免疫を誘導す ることを直接的に示すものは何もない。 したがって、高度に特異的で、強い免疫原性の実施可能性に基づく伝統的なワ クチンの考察および選択技術に頼らない、感染性の細菌性病原体に対する効果的 な免疫応答の増加において、ワクチンまたは免疫治療剤、ならびにそれらを産生 および使用するための方法を提供することが本発明の主な目的である。 哺乳動物宿主において、M．tuberculosis、M．bovis、M．kansasii、M．avium -intracellulare、M．fortuitum、M．chelonei、M．marinum、M．scrofulaceum 、M．leprae、M．africanum、M．ulcerans、およびM．mlcrotiを含む、細胞内病 原体に対する獲得免疫性を付与するために、ワクチンまたは免疫治療剤を提供し 、そしてそれらを使用するための方法を提供することが、本発明の別の目的であ る。 死菌、または弱毒化ワクチンと比較して、弱い毒性を示す、容易に作製された ワクチンおよび免疫治療剤を提供することは、本発明のさらなる目的である。発明の要旨 本発明は、ワクチンおよび/または免疫療法剤として使用するための化合物、 ならびに哺乳動物宿主において病原体による感染に対して防御的または治療的免 疫反応を生じさせるために、それらを産生および使用するための方法を提供する ことによって、上記の目的および他の目的を達成する。広範な局面において、本 発明は、細胞外化合物を産生する感染性ベクターに対して、防御的または治療的 免疫応答を誘導するための手段を提供する。本発明の化合物は、病原性細菌に対 して特に効果的であるが、主に豊富な細胞外産物を産生するあらゆる病原体に対 する、防御的または治療的免疫応答を生じさせるために用いられ得る。 本発明の目的について、「主に豊富な」とは、目的の病原体によって、最も大 量に放出されるそれらの細胞外産物を同定する相対的な用語として理解されるべ きである。例えば、種々の培養条件下で、約0.5の最適密度まで増殖されたM．tu berculosisに関して、当業者は、主に豊富な細胞外産物が10μg/L以上のオーダ ーで得られると予想するべきである。従って、例示的な４mg/Lの全量（正常な条 件下またはヒートショック条件下で培養したM．tuberculosisの細胞外産物の全 産出量）のうち、100種類のまたは公知の細胞外産物の、約15〜20種類（単独ま たは組み合わせて）で、全量の約90％を構成する。これらは、本発明の範囲内で あることが意図される主に豊富な細胞外産物細胞外産物であり、およびSDS/PAGE ゲル中に現れる太いバンドとして容易に同定可能である。さらに、目的の細胞外 産物は、アミノ酸配列決定によってさらに特徴づけられ得、そして区別され得る 。残りの細胞外産物は少量である。当業者はまた、特異的な主要細胞外産物の相 対 的な定量的豊富さは、培養条件に依存して変化し得ることを正しく認識する。し かし、ほとんどの場合、個々の主に豊富な細胞外産物を同定は変化しない。 従って、本発明は、ウイルス病原体、細菌病原体、真菌病原体、または原生動 物病原体による感染に対して、哺乳動物宿主を防御するために用いられ得る。ウ イルス感染のような、いくつかの場合において、主に豊富な細胞外産物は、感染 した宿主細胞によって産生され得る。主に豊富な細胞外産物を放出するすべての 微生物に対して活性であるが、本発明のワクチンおよび方法は、Mycobacteria属 の種々の種および血清型を含む、細胞内病原体に対する防御免疫を生じさせるの に特に効果的である。本発明のワクチンは、また、既存する疾患状態を処置する ための免疫療法剤としても効果的である。 驚くべきことに、細菌病原体またはそれらの免疫原性アナログによって細胞外 に放出される、最もまたは主要に豊富な産物での免疫が、投与された化合物の絶 対的な免疫原性に関わらず、効果的な免疫応答を誘発し得ることが、本発明者ら により見出された。生物からのそれらの放出に起因して、従って抗原プロセシン グおよび抗原提示に関与する、宿主分子に対するそれらの利用可能性、および感 染の間の組織において、それらが天然で高濃度であることに起因して、病原性因 子の主に豊富な細胞外産物は、他の細菌性成分よりも頻繁にプロセスされ、そし て宿主の免疫系に提示される。細胞内病原体の場合、主に豊富な細胞外産物は、 感染した宿主細胞の表面に提示される主要な免疫原決定基であり、それゆえ、周 囲の環境中により高い出現を示す。従って、病原性生物の主に豊富な細胞外産物 に対して獲得される免疫性は、宿主の防御システムが、宿主細胞中に隔離された 病原体を速やかに検出して、それらを効率よく阻害することを可能にし得る。 より詳細には、病原性細菌によって放出される、主なまたは主要な豊富産物は 、食細胞および他の宿主免疫系のメカニズムによって、それらそれぞれの免疫原 性活性または特異性とは関係なく、優勢ではない病原性成分または膜結合した病 原体の成分よりも速い速度でプロセスされるようである。この免疫プロセシング の不均衡性は、病原性因子が正常な免疫活性から隔離される細胞内細菌である場 合、特に重要である。感染した宿主の免疫系に対して、豊富にかつ継続してそれ らが提示されるため、ほとんどの豊富な細菌の細胞外産物またはそれらの免疫原 性ア ナログは、個々の分子の免疫原性特徴とはほとんど無関係に、激しい免疫応答を 誘発する。 主に豊富な細胞外産物は、標的病原体によって、周囲の環境の中に放出される タンパク質およびその他の分子実体の主な構成成分である。最近の研究により、 単一の、主に豊富な細胞外産物は、微生物によって放出される産物の40重量％ま でを含み得ることが示された。より頻繁には、個々の主に豊富な細胞外産物は、 感染性病原体によって放出される全産物の約0.5％〜約25％の間を占める。さら に、上位５種または６種の主に豊富な細胞外産物が、微生物により放出される全 量の60％〜70％の間を含むことが見出され得る。もちろん、当業者は、細胞外産 物の相対的なレベルが、産物の絶対的なまたは相対的な量が放出され得るように 、経時的に変動し得ることを認識する。例えば、pH、酸化剤、浸透性、熱、およ び、生物に対する他のストレス条件、生活環の段階、生殖状態、および周囲の環 境の組成物は、放出される産物の組成および量を変化し得る。さらに、細胞外産 物の絶対的および相対的レベルは、種間ならびに種間でさえ菌株内で大きく異な り得る。 細胞内病原体の場合、細胞外産物は、生菌を含むマクロファージに対する抗菌 効果を検出および行使し得る、特異的免疫性のリンパ球の集団を拡張するようで ある。さらに、感染細胞の表面上でのそれらの反復提示により、主に豊富ななま たは主な細胞外産物は、効果的な抗原性マーカーとして機能する。従って、本発 明の教示により、病原性細菌の主に豊富な細胞外産物またはそれらの免疫原的に 等価な決定基に対して指向されるワクチン接種および防御免疫の誘導は、その後 標的病原体により感染をされる場合、宿主の免疫系が、強力な細胞媒介性成分と 、迅速で効果的な免疫応答とを備えるように促す。 個々にスクリーニングした病原体成分の、高度に特異的な分子抗原性に基づく ワクチンの産生および免疫応答の刺激に対して焦点が集められてきた先行技術の 免疫化作用とは正反対に、本発明はあまり優勢ではない細胞外産物よりも低い免 疫特異性を実際には示し得る化合物を用いて、防御免疫を確立または誘導するた めの細菌の細胞外産物またはそれらの免疫原性アナログの相対的な豊富さ（それ らの免疫原的な特異性ではない）を有利に活用する。本開示の目的のために、免 疫原性アナログは、標的病原体によって発現される、主に豊富な細胞外産物の少 なくとも１つに十分に類似する任意の分子もしくは化合物、またはその任意の画 分であり、標的病原体によるその後の感染の際に、ワクチン接種された哺乳動物 宿主における防御免疫応答を刺激する能力を有する。簡単には、主に豊富な細胞 外産物または特異的な病原体によって細胞外に放出される産物（または、実質的 に等価な免疫応答を刺激し得る分子アナログ）を選択し、そしてそれらを比較的 純粋な形態で分離した後、それらの合成的産生もしくは内因的産生を可能にする ために、それらの産生を担うDNAまたはRNAを配列決定することによって、本発明 のワクチンは同定または産生される。次いで、当該分野において周知の技術を用 いて、一つ以上の単離された免疫反応性産物またはコード遺伝子物質を処方し、 そして標的病原体による感染に先行して哺乳動物宿主を免疫することによって、 標的病原体に対する所望の予防免疫応答が誘導され得る。 本発明は、少なくとも１つ、２つ、または、潜在的に数個でさえある十分に規 定された免疫原性決定基からなる。結果として、本発明により比較的簡易で迅速 に、開発、試験、および投与され得る一貫した標準化ワクチンが産生される。さ らに、主に豊富な分泌性産物または細胞外産物に対応する、いくつかの十分に規 定された分子の使用により、従来のワクチンに関連する有害な副作用の危険が大 いに減少され、そして効果的な免疫原性マーカーの潜在的な閉塞（occlusion） を排除する。同様に、本発明は、弱毒化ワクチンでもなく死菌ワクチンでもない ので、製造、精製の間、または投与の際の感染の危険が効果的に排除される。従 って、本発明のワクチンは、無症候性の結核患者およびHIV感染者を含む、免疫 無防備状態の個体に安全に投与され得る。さらに、体液性免疫応答は、標的病原 体によって放出される産物に排他的に指向されるので、有害なオプソニン免疫成 分を生成する機会はほとんどない。従って、本発明は、抗体感受性領域からの標 的病原体の除去を補助する刺激された体液性応答を可能にする。 本発明の、別の有益な局面は、ワクチンの採集または産生、ならびにその後の 精製および配列決定が容易なことである。例えば、優性豊富細胞外産物は、ほと んど努力することなく、M．tuberculosis、またはM．bovisを含む標的病原体の 培養から得ることができる。増殖の間に、所望の化合物が培地の中に放出される ので、従来の技術を利用して、それらを容易に、標的病原体の菌内成分および膜 結合成分から分離し得る。より好ましくは、本発明のワクチンの所望の免疫反応 成分は、M．tuberculosis、M．bovis、M．leprae、または他の任意の目的の病原 体の、特異的な細胞外産物を発現する遺伝子がクローン化されている、遺伝子操 作された生物から産生および精製され得る。当該分野において知られているよう に、このように操作された生物は、選択された細胞外産物または改変された免疫 原性アナログを高いレベルで産生するように改変され得る。あるいは、免疫防御 産物、その一部分、またはそのアナログは、当該分野において周知の技術を用い て化学的に合成され得るか、またはそれをコードする裸の遺伝子を注入された宿 主細胞において直接発現され得る。どのような産生供給源が用いられても、優勢 豊富細胞外産物または主に豊富な細胞外産物の免疫原性成分は、分離され得、そ の後、分画、クロマトグラフィー、または他の精製方法論および従来の処方技術 のような一般的な生化学的手順を用いて、輸送可能なワクチンに処方され得るか 、または直接導入された、それをコードする遺伝子構築物を含む宿主細胞中で直 接発現され得る。 例えば、本発明の例示的な態様において、標的病原体は、M．tuberculosisで あり、そしてM．tuberculosisによって細胞外からブロス培養液中に放出される 主に豊富な産物は、他の細菌成分から分離され、そして哺乳動物宿主における免 疫応答を誘発するために用いられる。次いで、個々のタンパク質、またはタンパ ク質の群を、動物ベースの抗原投与実験において利用して、本発明の教示に従っ てワクチンとして用いるのに適するようにされる防御免疫を誘導するタンパク質 またはタンパク質の群を同定する。より詳細には、細菌の増殖および回収後、そ れらの物理的豊富さにより、遠心分離および濾過によって、細胞内成分および他 の成分から主な細胞外産物を分離する。所望である場合、次いで、得られた大量 の濾液から、硫酸アンモニウム沈澱およびその後の透析を用いる分画に供して、 一般的にEPと呼ばれる細胞外産物の混合液を得る。次いで、当該分野において既 知の、およびより充分に以下に記載されている適切なクロマトグラフィー技術を 用いて、透析された画分中の可溶化細胞外産物を実質的に均質になるまで精製す る。 これらの例示的な手段によって、110キロダルトン（KD）から12 KDの範囲の分 子量を有する、14個の個々のタンパク質性の、M．tuberculosisの主な細胞外産 物の産生がもたらされる。精製後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供される 場合、個々の主に豊富な細胞外産物はそれぞれの分子量に対応する一本のバンド を示し、これによって、主に豊富な細胞外産物に対応する個々の産物または産物 の群のそれぞれを、本発明の教示に従って、ワクチンとして用いるために、同定 および調製することが可能になる。精製された主に豊富な細胞外産物は、当該分 野において一般的な技術を用いて、それらのそれぞれのアミノ酸配列の全てまた は部分を決定することにより、特徴づけられ得、そして区別され得る。配列決定 はまた、主に豊富な細胞外産物間の、可能な構造的関連性に関する情報を提供し 得る。 続いて、時間経過にわたる、精製された細胞外産物の連続した皮下または皮内 注射を利用して、本発明の教示により、哺乳動物宿主系における免疫化および獲 得される免疫性の刺激が達成される。例えば、精製された主に豊富な細胞外産物 またはフロイント不完全アジュバント中の産物を用いて注射、約３週間後の同じ アジュバント中の二回目の注射を用い、その後の病原性病原体を用いる抗原投与 の際の防御応答を誘導し得る。本発明の範囲および教示の範囲内にある別の例示 的な免疫化プロトコルは、精製した細胞外産物またはSyntex Adjuvant Formulat ion（SAF）中の産物またはそのアナログの、期間にわたる３回または４回の連続 注射を包含し得る。連続注射が一般的により有効であることが証明され得、選択 された主に豊富な細胞外産物またはその免疫原性サブユニットもしくはアナログ の単回投与は、所望の免疫応答を付与し得、そして同様に本発明の範囲内にある ことが意図される。 このような例示的なプロトコルは、当該分野で受容されたモルモットのような 実験モデルを用いて示され得る。例えば、詳細に考察されるように、数匹のモル モットの免疫は、５つの主に豊富な細胞外産物（以前に記載のように、M．tuber culosisから精製された）の組み合わせを用いる、SAFアジュバント中の細菌性産 物の連続３回注射免疫化、および対応するコントロール動物の模擬免疫化を伴っ た。各タンパク質の例示的な投与量は、100μgから２μgの範囲であった。最後 のワクチン接種後、すべての動物を同時に、感染性があり、潜在的に致死的な用 量のエアゾール化M．tuberculosisに曝露して、そしてさらなる時間についてモ ニターした。M．tuberculosisの主に豊富な細胞外産物の組み合わせを用いて免 疫化した動物と比較すると、免疫化された動物はいずれも結核で死亡しなかった 。さらに、コントロール動物の半数がモニター期間中に死亡したが、コントロー ル動物は有意な体重の減少を示した。この実験の後の剖検により、非免疫化コン トロール動物は、防御された動物よりも肺および脾臓における有意に高いコロニ ー形成単位（CFU）および対応する損傷を有した。さらに精製された主に豊富な 細胞外産物の17個のさらなる組み合わせが試験された場合、免疫予防性を提供し た。これにより、本発明の範囲およびその教示に従って処方され得るワクチンの 広い範囲が示された。 しかし、本発明が、分泌性産物または細胞外産物の組み合わせに限定されない ことは強調されるべきである。例えば、いくつかの別の実験プロトコルにより、 １つの豊富細胞外産物が、本発明の教示に従って、哺乳動物の防御免疫を誘導す ることが示される。各実験において、モルモットは、本明細書中で詳述されるク ロマトグラフィープロトコルを用いてM．tuberculosis EPから精製された、単一 の主に豊富な細胞外産物で免疫化された。一つの実施例において、複数の実験で 、30 KDに対応する分子量を有する精製された豊富な分泌産物を含むアジュバン ト組成物を用いて、動物をワクチン接種した。本発明の別の実施例において、異 なるモルモットが、71 KDに対応する分子量を有し、M．tuberculosisから単離さ れた豊富細胞外産物を含むアジュバント組成物を用いてワクチン接種された。動 物および適当なコントロールの両方のセットのそれぞれの免疫化後、致死的用量 のエアゾール化M．tuberculosisに曝露して、ワクチンの有効性を決定した。 より詳細には、一つの実験において、６匹のモルモットを、６週間にわたる期 間中３回において、SAF中の100μgの30 KDタンパク質を用いて免疫化した。対応 する用量の、細胞外タンパク質（EP）の模擬調製物または緩衝液を用いて、コン トロール動物に同時にワクチン接種した。最後のワクチン接種の３週間後、致死 的な用量のエアゾール化M．tuberculosisを用いて抗原投与して、14週間モニタ ーした。30 KDで免疫化したモルモットおよび模擬細胞外調製物で免疫化したモ ルモットは、それぞれ、67％および50％の生存率を有した（主に豊富な細胞外産 物対EPの予想外の優れた能力を示している）が、模擬免疫化された動物は、僅か に17％の生存率であった。実験を終了する際に、動物を屠殺し、そして生存能力 のある結核菌について調べた。当然ながら、非免疫化動物は、肺および脾臓にお いて、顕著に高い濃度のM．tuberculosisを示した。 同様の実験を、71 KDタンパク質をワクチン接種した動物に対して行なった。 １つの実験において、３週間にわたって２回、100μgの精製された71 KDタンパ ク質を含むSAFアジュバント組成物を用いて、６匹のモルモットをワクチン接種 した。同様に、陽性コントロールとして使用するために未精製の細胞外タンパク 質またはEPの模擬調製物を用い、陰性コントロールとして使用するために緩衝液 を用いて、別の動物を免疫化した。致死用量のエアゾール化結核菌への曝露後、 モルモットの体重を６ヶ月間モニターした。ここでも、精製形態の豊富な細胞外 産物で免疫化した動物は、病原性のM．tuberculosisに関して、防御免疫を生じ た。この期間の終了時まで、緩衝液で免疫化された動物は、免疫化された動物と 比較する場合、有意な体重の減少を示した。さらに、陽性コントロールおよび71 KDで免疫化した動物は、それぞれ、63％と50％の生存率を有し、非免疫化動物 は、観察期間が終了する前に全て死亡した。 ワクチンの処方は、本発明に決定的でなく、そして投与を促進するために最適 化され得ることを留意することは重要である。病原体の主に豊富な細胞外産物に 由来する精製された免疫原性決定基の溶液は、防御的な免疫応答を生じるように 設計された任意の様式において、単独でまたは組み合わせて投与され得る。精製 タンパク質溶液は、単独で輸送され得るか、または投与される前にアジュバント と処方され得る。選択された免疫原性決定基の活性を増強するための、本発明で 用いられる特異的な例示的アジュバントは、SAF、モノホスホリルリピドＡ（Mon ophosphoryl Lipid A: MPL）を含むアジュバント、フロイント不完全アジュバン ト、死菌を含むフロイント完全アジュバント、γインターフェロン（Radfordら 、American Society of Hepatology 2008-2015，1991; Watanabeら、PNAS 86: 9 456-9460，1989; Gansbacherら、Cancer Research 50:7820-7825，1990; Maioら 、Can．Immunol．Immunother.30: 34-42，1989; 米国特許第4,762,791号、およ び 同第4,727,138号）、MF59、MF59プラスMTP、MF59プラスIL-12、MPLプラスTDM（ トレハロース（Dimycolate））、QS-21、QS-21プラスIL-12、IL-2（アメリカン タイプカルチャーコレクション第39405号、同第39452号、および同第39516号； 米国特許第4,518,584号）、IL-12、IL-15（Grabsteinら、Science 264: 965-968 ，1994）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ddA）、ddAプラスデキストラ ン、ミョウバン、Quil A、ISCOMS（免疫刺激性複合体）、リポソーム、脂肪キャ リア、タンパク質キャリア、およびマイクロカプセル化技術である。本発明にお いて有用であり得るさらなるアジュバントは、水中油乳化剤、無機塩（例えば、 ミョウバン）、核酸、ブロックポリマー界面活性剤、および微生物細胞壁（ペプ チドグリコリピド）である。本発明の範囲を制約しないが、アジュバントは、注 射部位からの抗原の遅延放出に起因して、免疫応答を強化し得ると考えられる。 あるいは、免疫原性決定基の内因性発現、およびその後の防御免疫を誘導する ために、主に豊富な細胞外産物に由来する１つ以上の免疫原性決定基の遺伝子を コードする遺伝物質は、真核生物プロモーターおよび/または分泌配列と結合さ れ得、そして哺乳動物宿主に直接注射され得る。 本発明の他の目的、特徴、および利点は、最初に簡単に説明される図面と合わ せて、その好ましい例示的な態様の以下の詳細な記載を考慮することにより、当 業者には明白である。図面の簡単な説明 図１は、クーマシーブルー染色した４枚のゲルの表示で、1a〜1dと分類されて おり、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）に よって同定された、M．tuberculosisの例示的な主に豊富な細胞外産物の精製を 示している。 図２は、M．tuberculosisの、14個（配列番号：１〜14）の例示的な主に豊富 な細胞外産物の５個のＮ末端アミノ酸を同定する表による表示である。 図３は、M．tuberculosisの、図２で示されたＮ末端アミノ酸により区別でき なかった、３個（配列番号：15〜17）の例示的な主に豊富な分泌産物の伸長され たＮ末端アミノ酸の表による表示である。 図４は、致死用量のエアゾール化M．tuberculosisへの曝露後の、例示的に精 製されたM．tuberculosisの30 KD主に豊富な分泌産物で免疫化したモルモットの 生存率と、細胞外タンパク質の先行技術の模擬調製物で免疫化したポジティブコ ントロールおよび非免疫化ネガティブコントロールの生存率との、グラフによる 比較である。 図５は、致死用量のエアゾール化M．tuberculosisへの曝露後の、精製した71 KDの主に豊富な細胞外産物および非免疫化ネガティブコントロールで免疫化した 動物のモルモット平均体重の、グラフによる比較である。 図６は、致死用量のエアゾール化M．tuberculosisへの曝露後の、M．tubercul osisの71 KD主に豊富な細胞外産物で免疫化した図５のモルモットの生存率と、 先行技術によるM．tuberculosisの細胞外タンパク質の全体調製物で免疫化した 陽性コントロールおよび非免疫化ネガティブコントロールの生存率との、グラフ による比較である。 図７は、第２の別個の実験において、致死用量のエアゾール化M．tuberculosi sへの曝露後の、例示的な精製した71 KDの主に豊富な細胞外産物で免疫化した動 物、M．tuberculosisからの細胞外タンパク質の先行技術の模擬調製物で免疫化 したポジティブコントロール、および非免疫化ネガティブコントロールの、モル モット平均体重の、グラフによる比較である。 図８ａおよび８ｂは、PPD+（M．tuberculosisによる感染の指標）およびPPD- ヒト被験体における、例示的な精製した71 KD主に豊富な細胞外産物に対するリ ンパ球増殖応答のグラフによる比較である。図８ａは、この抗原とリンパ球との インキュベーション後２日目に測定された値のグラフであり、一方、図８ｂはイ ンキュベーション後４日目に測定された値のグラフである。 図９は、致死用量のエアゾール化M．tuberculosisへの曝露後の、本発明の教 示に従って産生された細胞外産物の組み合わせを含むワクチンで免疫化された動 物、および非免疫化ネガティブコントロールで免疫化した動物のモルモット平均 体重の、グラフによる比較である。 図10は、致死用量のエアゾール化M．tuberculosisへの曝露後の、本発明の教 示に従って産生された細胞外産物の組合せを含むワクチンの３つの異なる投与量 で免疫された動物、および非免疫化ネガティブコントロールで免疫化した動物の モルモット平均体重の、グラフによる比較である。 図11は、致死用量のエアゾール化M．tuberculosisへの曝露後の、本発明の教 示に従って産生された細胞外産物の組み合わせを含むワクチンの６つの異なる投 与量で免疫された動物、および非免疫化ネガティブコントロールで免疫化した動 物のモルモット平均体重の、グラフによる比較である。 図12ａおよびｂは、M．tuberculosisの30 KDのタンパク質の免疫優性エピトー プのマッピングのグラフによる例示である。図12ａは、30 KDのタンパク質配列 全体を覆う重複ペプチド（15マー）に対して応答する30 KDのタンパク質で免疫 化した24匹のモルモットのパーセントを例示する。図12ｂは、19匹の模擬免疫化 したモルモットの群に関して、データの対応のセットを例示する。各群の動物の 、天然の30 KDタンパク質、精製タンパク質誘導体（PPD）、およびコンカナバリ ンＡ（con A）に対する応答を、各グラフの右側に示す。 図13は、組換え30 kDaタンパク質の発現のために用いられた構築物の模式的表 示を提供する。この図は、組換え30 kDaタンパク質の発現のために用いられたpE T22bを描く。このベクターは、それ自身のリーダー（30W-pET22b）、またはプラ スミドがコードするpelBリーダー（30M-pET22b）に融合された成熟30 kDaタンパ ク質を発現する。使用する略語：Ori、ColE1型複製起点；F1 ori、F1ファージの 複製起点；Amp、アンピシリン抵抗性遺伝子；30W/M、全長（30W）または成熟（3 0M）の30 kDaタンパク質；lacI、lacリプレッサー遺伝子；PT7、ファージT7のRN Aポリメラーゼ特異的プロモーター；NdeIおよびNcoI、ベクター/インサートが接 合部の制限酵素部位。 図14は、E．coli BL21(DE3)pLysSにおける全長30 kDaタンパク質および成熟30 KDaタンパク質の発現を確認する,電気泳動試験の結果およびウエスタンブロッ ト解析を示す。 図15は、30 kDaタンパク質を発現するために用いた別の構築系の模式図を示し す。 図16は、M．smegmatisにおける、M．tuberculosisの30 kDaタンパク質の発現 を確認する電気泳動試験の結果を示す。 図17は、M．smegmatisにおける、M．tuberculosisの30 kDaタンパク質の発現 を確認するウエスタンブロット解析の結果を示す。詳細な説明 本発明は、化合物およびその産生方法、ならびにワクチンおよび免疫療法剤と しての、病原性生物に対する使用に関する。より特異的には、本発明は、病原性 生物によって放出される主に豊富な細胞外産物、それらの免疫原性アナログ、ま たはワクチンもしくは免疫療法剤としてそれらをコードする関連した遺伝物質の 産生および使用に関し、ならびに哺乳動物宿主における、感染に対する防御免疫 を生じさせるための関連の方法に関する。これらの化合物は、簡便のために、本 出願を通じてワクチンと呼ばれる。 本発明の教示を説明する、例示的な態様において、M．tuberculosisの主に豊 富な細胞外産物は、分画され、そして続いて精製された。個々の産物の特異的な 分子免疫原性も決定を伴わないで、これらの主要優勢細胞外産物の精製形態を用 いて、モルモットを免疫化した。さらに、精製した細胞外産物を、単独でまたは 組み合わせて、そして種々の投与用量および投与経路を用いて、例示的な免疫を 行なった。当業者は、本発明の方法を実施するための、任意の病原性生物または 細菌を用いて前述の任意のさらなるストラテジーが利用され得、従って、本発明 は、M．tuberculosisに関するワクチンおよび方法に特定して限定されないこと を認識する。 これらの例示的な態様において、M．tuberculosisの主に豊富な細胞外産物は 、カラムクロマトグラフィーを用いて、分離および精製された。ポリアクリルア ミドゲル電気泳動を用いて、細胞外産物の相対的な豊富さ決定および精製が達成 された。ワクチン成分の精製後、主に豊富な細胞外産物を、単独または組み合わ せて、モルモットを免疫化し、そしてその後M．tuberculosisを用いて抗原投与 した。詳細に記載するように、免疫後、これらの細胞外産物に対して、予測され る測定可能な応答を生じさせたことに加えて、本発明のワクチンは、その後のエ アゾール化した致死量のM．tuberculosisに対する効果的な免疫性を、予想外に こ れらの実験動物に付与した。 これらの例示的な態様は、精製形態の細胞外産物を用いたが、当業者は、当該 分野において周知の技術を用いる組換え手段、または化学合成の別の形態によっ り産生される免疫原性アナログを用いて、本発明は容易に実施され得ることを認 識する。さらに、本発明の範囲および教示の範囲内で、天然に存在する産物の代 わりに、免疫原性アナログ、ホモログ、または主に豊富な細胞外産物の選択され たセグメントを用い得る。 本発明のさらなる理解は、ワクチンとして、主に豊富な細胞外産物を同定、単 離、産生、および（単独、および組み合わせて）使用するための例示的プロトコ ルを示す、以下の制限されない実施例から、当業者に提供される。 実施例 実施例１ Mycobacterium tuberculosisからのバルク細胞外タンパク質（EP）の 分離および生産 M．tuberculosis Erdman株（ATCC 35801）を、American Tissue Culture Coll ection（Rockville，Md.）から入手した。凍結乾燥細菌を、Middlebrook 7H9培 地（Difco Laboratories，Detroit，Mich.）で溶解し、Middlebrook 7H11寒天上 で維持した。7H11寒天を、Cohn（Cohn，M．l.，Am．Rev．Respir．Dis．98:295- 296）が以前記述し、本明細書中で参考として援用したように、Bacto Middlebro ok 7H10寒天（Difco）、OADC増菌培地（Difco）、0.1％カゼイン酵素水解物（Si gma）およびグリセロールを用いて調製した。高圧蒸気滅菌後、寒天を細菌用の ペトリ皿（100×15 mm）に分けて、放冷した。 次いでM．tuberculosisを、無菌法を用いてプレートし、５％CO2-95％空気、 湿度100％下で37℃で増殖した。7H11での7日間の培養後、コロニーをプレートか らかき取り、7H9ブロスに懸濁して108CFU／mlとし、1.8 ml Nuncクリオチューブ （Roskilde，Denmark）に等分した。本ブロスは１リットルにつき、Bacto Middl ebrook 7H9粉末4.7 gを蒸留水998 mlおよびグリセロール（Sigma Chemical Co., St．Louis，Mo.）２ mlで再水和して調製し、次いでこの混合物のpH値を6.75に 調整し、このブロスを121℃で15分間高圧滅菌した。次いで、等分した細胞を徐 々に凍結し、−70℃で保存した。これらの条件下で保存した細胞は無期限に生存 可能であったため、必要に応じて用いた。 バルク細胞外タンパク質（EP）調製物は、上述したように作製したMiddlebroo k 7H9ブロスにおいて増殖したM．tuberculosisの培養から得た。溶解後、ブロス の150 mlアリコートを121℃で15分間高圧滅菌し、通気孔付きCo-star 225 cm2組 織培養フラスコに分けた。前段落に記述したように−70℃で保存したM．tubercu losis細胞を解凍し、そして7H11寒天プレートに接種するために用いた。７日間 培養した後、コロニーをプレートからかき取り、7H9ブロス数mlに懸濁し、水浴 中で超音波処理して単細胞懸濁液を作製した。M．tuberculosis細胞を、Perkin- Elmer Juniorモデル35分光光度計（Norwalk，Conn）によって測定したように、 初期光学密度0.05において無菌150 mlアリコートに懸濁した。次いで、懸濁液が 光学密度0.4〜0.5を呈するまで、細胞を５％CO2-95％空気下で37℃で３週間イン キュベートした。これらの培養はまた、7H9ブロスでの後続培養のためのストッ クボトルとして用いた。ストックボトルを水浴中で超音波処理し、単細胞懸濁液 を作製した。次いで、M．tuberculosis細胞を、初期光学密度0.05まで7H9ブロス で希釈し、そして本懸濁液が光学密度0.4〜0.5を示すまで、細胞を５％CO2-95％ 空気下で37℃で２ 1/2から３週間インキュベートした。次いで、培養上清をデカ ントし、連続的に0.8μmおよび0.2μm低タンパク質結合フィルター（Gelman Sci ences Inc.，Ann Arbor，Mich.）に通して濾過滅菌した。次いで、濾液は10 KD カットオフを有するOmega膜を用いてFiltron Minisetteで約35倍まで濃縮し、そ して４℃で保存した。ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳 動（SDS-PAGE）によるバルク細胞外タンパク質調製物の分析により、複数のバン ドを有するタンパク質組成を明らかにした。バルク細胞外タンパク質混合物（EP ）を、培養濾液の40％〜95％硫酸アンモニウム画分を得ることによって調製した 。 実施例２ Mycobacterium tuberculosisの主に豊富な細胞外産物の精製 硫酸アンモニウム（グレードＩ、Sigma）を、０℃で10％〜95％の範囲の濃度 で実施例１の無菌培養濾液に添加し、タンパク質を分画するためにゆるやかに攪 拌した。次いで、懸濁液をプラスチック瓶に移し、そしてRC3B Sorvall Centrif ugeにおいてスイングローターで3,000 rpmで遠心分離し、得られた沈殿物をペレ ット状にした。上清をデカントし、そして目的の産物に依存して上清またはペレ ットをさらなる精製に供した。目的の生産物が上清液に含まれる場合、第２の硫 安アンモニウム画分を、塩濃度を第１の画分の濃度以上に増加することによって 達成した。おだやかな攪拌の期間後、次いで、溶液を、所望の生産物を沈殿させ るために前述したように遠心分離し、そして第２の上清をさらなる精製に供した 。 遠心分離後、沈殿したタンパク質は適切な冷緩衝液で再可溶化し、そして塩を 除去するために6,000〜8,000分子量カットオフのSpectrapor透析膜（Spectrum M edical Industries，Los Angeles，California）で広範に透析した。細胞外タン パク質濃度を、ビシンコニン酸タンパク質定量法（Pierce Chemical Co.，Rockf ord，Illinois）により測定し、そして分画成分をSDS-PAGEを用いて決定した。 次いで、画分をさらなる精製のためにクロマトグラフィーカラムにアプライした 。 直前に概説した一般的なスキームを用いて、実施例１に詳述したプロセスによ って得られたバルク細胞外タンパク質濾液から14種類の細胞外タンパク質を精製 した。分離した各細胞外生産物に関する正確な硫酸アンモニウム沈殿の手順およ びクロマトグラフィーのプロトコルを、以下に詳述する。 Ａ．110 KD 細胞外産物 １．50％〜100％硫安沈殿物を、上記で議論したように得た。 ２．再可溶化した沈殿物を透析し、そして10％ソルビトール、10 mMリン酸カ リウム（pH７）、５mM ２-メルカプトエタノール、および0.2 mM EDTAからなる カラム緩衝液を用いてDEAE Sepharose CL-6BまたはQAE Sepharoseイオン交換カ ラムにアプライし、そして塩化ナトリウム勾配で溶出した。110 KDタンパク質を 含む画分は、約550 mM塩で溶出し、回収した。 ３．回収した画分を、PBS（リン酸緩衝食塩水）緩衝液中、S200 Sepharoseサ イズ分画カラムにアプライした。タンパク質は均一な110 KDタンパク質として溶 出した。 Ｂ．80 KD 細胞外産物 １．0〜25％硫安画分（0℃で1時間）を廃棄し、25％〜60％硫安画分（0℃で一 晩）は上記で議論したように保持した。 ２．DEAE CL-6Bカラム（Pharmacia）を１M NaClを含む25 mMトリス（pH 8.7） を充填し、25 mMトリス（pH 8.7）、10 mM NaClで平衡化し、そしてタンパク質 サンプルを25 mMトリス（pH 8.7）、10 mM NaClに対して透析し、そしてカラム にアプライした。カラムを、同一の緩衝液で一晩洗浄した。25 mMトリス（pH 8. 7）中、10 mM〜200 mM NaClまでの最初の塩濃度勾配をカラムに流し、他のタン パク質を溶出した。第２の塩濃度勾配（200から300 mM NaCl）をカラムに流し、 そして80 KDタンパク質が、約275 mM NaClで溶出した。 ３．Q-Sepharose HPカラムを、25 mMトリス（pH 8.7）、１ M NaClで充填し、 そして25 mMトリス（pH 8.7）、10 mM NaClで再平衡化した。タンパク質サンプ ルを、25 mMトリス（pH 8.7）、10 mM NaClに対して透析し、そしてカラムにア プライした。カラムを同一の緩衝液で洗浄し、次いで25 mMトリス（pH 8.7）中 、200〜300 mM NaClで溶出した。 ４．80 KDタンパク質を含有する画分を回収し、25 mMトリス（pH 8.7）、10 m M NaClに対して透析し、次いでSpeed-Vac濃縮器で１〜２mlまで濃縮した。タン パク質サンプルを、Superdex 75カラムにアプライし、25 mMトリス（pH 8.7）、 150 mM NaClで溶出した。80 KDタンパク質は、均一タンパク質として溶出した。 Ｃ．71 KD 細胞外生産物 １．40％〜95％硫酸アンモニウム沈殿物を、71 KD産物を０％CO2下でpH 7.4の 7H9ブロスで培養し、そして週１回42℃で３時間ヒートショックした以外、上記 で議論した通りに得た。沈殿物は、Initial Buffer（20 mM HEPES、２mM MgAc、 25 mM KCl、10 mM（NH4）2SO4、0.8 mM DL-ジチオトレイトール（pH 7.0））に 対して透析した。 ２．再可溶化した沈殿物を、Initial Bufferで平衡化したしたATPアガロース カラムにアプライした。溶出物を回収し、ATPアガロースカラムに再アプライし た。71 KDタンパク質はカラムに結合した。 ３．その後、ATPアガロースカラムを、最初にInitlal Bufferで、次いで１M K Cl、次いでInitial Bufferで洗浄した。 ４．均一な71 KDタンパク質は10 mM APTを用いてカラムから溶出し、そしてリ ン酸緩衝液に対して透析した。 Ｄ．58 KD 細胞外産物 １．25％〜50％硫酸アンモニウム沈殿物を、上記で議論した通りに得た。 ２．再可溶化した沈殿物を透析し、そしてDEAE Sepharose CL-6BまたはQAE Se pharoseカラムにアプライし、そしてNaClで溶出した。回収した58 KDタンパク質 を含有する画分は、約400 mM NaClで溶出した。 ３．次いで、回収した画分を、Sepharose CL-6Bサイズ分画カラムにアプライ した。タンパク質は、約670〜700,000ダルトンで溶出した。 ４．溶出したタンパク質を、チオプロピル-セファロースカラムにアプライし た。均一な58 KDタンパク質は、約250〜350 mM 2-メルカプトエタノールで溶出 した。溶出したタンパク質を、SDS-PAGEを用いてモニターし、そして図1Aのカラ ム２に示した単一バンドを呈した。 Ｅ．45 KD 細胞外産物 １．ａ．0〜25％硫酸アンモニウム画分（０℃で１時間）を廃棄した。 ｂ．25％〜60％硫酸アンモニウム画分（0℃で一晩）を保持した。 ２．ａ．DEAE CL-6Bカラム（Pharmacia）を、１M NaClを含有する2.5 mMトリ ス（pH 8.7）で充填し、そして25 mMトリス、10 mM NaCl（pH 8.7）で平衡化し た。 ｂ．タンパク質サンプルを、25 mMトリス、10 mM NaCl（pH 8.7）に対し て透析し、そしてカラムにアプライした。次いで、カラムを同一の緩衝液で一晩 洗浄した。 ｃ．カラムを、25 mMトリス（pH 8.7）緩衝液中、塩濃度勾配（10 mM〜20 0 mM）で溶出した。45 KDタンパク質は、約40 mM NaClで溶出した。 ３．ａ．Q-Sepharose HPカラム（Pharmacia）を、１M NaClを含有する25 mMト リス（pH 8.7）で充填し、25 mMトリス、10 mM NaCl（pH 8.7）で再平衡化した 。 ｂ．タンパク質サンプルを、25 mMトリス、10 mM NaCl（pH 8.7）に対し て透析し、そしてカラムにアプライし、その後続いて同一の緩衝液で洗浄した。 ｃ．カラムを、25 mMトリス（pH 8.7）中、10〜150 mM NaClで溶出した。 ４．ａ．45 KD産物を含有する画分を回収し、プールし、そしてSpeed Vac濃縮 器で１mlまで濃縮し、その後25 mMトリス、10 mM NaCl（pH 8.7）に対して透析 した。 ｂ．濃縮物を、25 mMトリス、150 mM NaCl（pH 8.7）で平衡化したSuperd ex 75カラムにアプライした。産物は、均一タンパク質として溶出した。溶出し たタンパク質を、SDS-PAGEを用いてモニターし、そして図1Bのカラム２に示した 単一バンドを呈した。 Ｆ．32 KD 細胞外産物（Ａ） １．ａ．0〜25％硫酸アンモニウム画分（０℃で１時間）を廃棄した。 ｂ．25％〜60％硫酸アンモニウム画分（０℃で一晩）を保持した。 ２．ａ．DEAE CL-6Bカラム（Pharmacia）を、１M NaClを含有する25 mMトリス （pH 8.7）で充填し、25 mMトリス、10 mM NaCl（pH 8.7）で平衡化した。 ｂ．タンパク質サンプルを、25 mMトリス、10 mM NaCl（pH 8.7）に対し て透析し、そしてカラムにアプライし、その後続いて同一の緩衝液で一晩洗浄し た。 ｃ．カラムを、25 mMトリス（pH 8.7）での塩濃度勾配（10 mM〜200 mM） で溶出した。32 KDタンパク質は、約70 mM NaClで溶出した。 ３．ａ．32 KD産物を含有する画分を、回収し、プールし、そして25 mMトリス 、10 mM NaCl（pH 8.7）に対して透析し、Speed Vac濃縮器でタンパク質サンプ ル を１mlまで濃縮した。 ｂ．次いで、濃縮物を、25 mMトリス、150 mM NaCl（pH 8.7）で平衡化し たSuperdex 75カラムにアプライし、この緩衝液で溶出した。32 KD産物は均一な タンパク質として溶出した。 ４．ａ．Q-Sepharose HPカラム（Pharmacia）を、１M NaClを含む25 mMトリス （pH 8.7）を充填し、そして25 mMトリス、10 mM NaCl（pH 8.7）で再平衡化し た。 ｂ．タンパク質サンプルを、25 mMトリス、10 mM NaCl（pH 8.7）に対し て透析し、そしてカラムにアプライし、その後続いて同一の緩衝液で洗浄した。 ｃ．カラムを、100〜300 mM NaCl勾配で溶出した。均一タンパク質の標識 32Ａは約120 mM NaClで溶出し、図1Bのカラム４に単一バンドを示す。 Ｇ．32 KD 細胞外産物（Ｂ） １．ａ．0〜25％硫酸アンモニウム画分（０℃で１時間）を廃棄した。 ｂ．25％〜60％硫酸アンモニウム画分（０℃で一晩）を保持した。 ２．ａ．DEAE CL-6Bカラム（Pharmacia）を、１M NaClを含有する25 mMトリス （pH 8.7）で充填し、次いで25 mMトリス、10 mM NaCl（pH 8.7）で平衡化した 。 ｂ．タンパク質サンプルを、25 mMトリス、10 mM NaCl（pH 8.7）に対し て透析し、カラムにアプライし、その後続いて同一の緩衝液で一晩洗浄した。 ｃ．25 mMトリス（pH 8.7）中、10 mM〜200 mM NaClの予備の塩濃度勾配 を流し、種々のタンパク質を溶出した。カラム平衡化後、第２の塩濃度勾配（20 0〜300 mM NaCl）を流した。32 KDタンパク質は、約225 mM NaClで溶出した。 ３．ａ．Q-Sepharose HPカラム（Pharmacia）を、１M NaClを含有する25 mMト リス（pH 8.7）を充填し、そして25 mMトリス、10 mM NaCl（pH 8.7）で再平衡 化した。 ｂ．タンパク質サンプルを、25 mMトリス、10 mM NaCl（pH 8.7）に対し て透析し、カラムにアプライし、その後続いて同一の緩衝液で洗浄した。 ｃ．カラムを、同一の緩衝液中、200〜300 mM NaCl勾配で溶出した。 ４．ａ．32 KD産物を含有する画分を回収してプールし、25 mMトリス、10 mM NaCl（pH 8.7）に対して透析し、その後Speed Vac濃縮器でタンパク質サンプル を１mlまで濃縮した。 ｂ．次いで、濃縮物を、25 mMトリス、150 mM NaCl（pH 8.7）で平衡化し たSuperdex 75カラムにアプライし、そして同一の緩衝液で溶出した。プロトコ ルＨを用いて分離した32 KDタンパク質と32KD産物とを区別するために、標識し た32B生産物を、均一タンパク質として溶出し、そして図1Bのカラム３に単一バ ンドとして示す。 Ｈ．30 KD 細胞外産物 １．ａ．0〜25％硫酸アンモニウム画分（０℃で１時間）を廃棄した。 ｂ．25％〜60％硫酸アンモニウム画分（０℃で一晩）を保持した。 ２．ａ．DEAE CL-6Bカラム（Pharmacia）を、１M NaCl含有25 mMトリス（pH 8 .7）を充填し、次いで25 mMトリス、10 mM NaCl（pH 8.7）で平衡化した。 ｂ．タンパク質サンプルを、25 mMトリス、10 mM NaCl（pH 8.7）に対し て透析し、そしてカラムにアプライし、その後続いて同一の緩衝液で一晩洗浄し た。 ｃ．カラムを、25 mMトリス（pH 8.7）緩衝液中、塩濃度勾配（10 mM〜20 0 mM）で溶出した。30 KDタンパク質は、約140 mM NaClで溶出した。 ３．ａ．30 KD産物を含有する分画を回収してプールし、25 mMトリス、10 mM NaCl（pH 8.7）に対して透析し、その後Speed Vac濃縮器でタンパク質サンプル を１mlまで濃縮した。 ｂ．次いで、濃縮物を、25 mMトリス、150 mM NaCl（pH 8.7）で平衡化し たSuperdex 75カラムにアプライし、そしてこの緩衝液で溶出した。30 KD産物は 均一なタンパク質として溶出し、図IBのカラム５に単一バンドを示す。 Ｉ．24 KD 細胞外産物 １．ａ．0〜25％硫酸アンモニウム画分（０℃で１時間）を廃棄した。 ｂ．25％〜60％硫酸アンモニウム画分（0℃で一晩）を保持した。 ２．ａ．DEAE CL-6Bカラム（Pharmacia）を、１M NaClを含有する25 mMトリス （pH 8.7）で充填し、次いで25 mMトリス、10 mM NaCl（pH 8.7）で平衡化した 。 ｂ．タンパク質サンプルを、25 mMトリス、10 mM NaCl（pH 8.7）に対し て透析し、そしてカラムにアプライし、その後続いて同一の緩衝液で一晩洗浄し た。 ｃ．25 mMトリス（pH 8.7）中、10 mM〜200 mM NaClの予備の塩濃度勾配 を流し、種々のタンパク質を溶出した。カラム平衡化後、第２の塩濃度勾配（20 0〜300 mM NaCl）を流した。24 KDが、約250 mM NaClで溶出した。 ３．ａ．Q-Sepharose HPカラム（Pharmacia）を、１M NaClを含有する25 mMト リス（pH 8.7）で充填し、そして25 mMトリス、10 mM NaCl（pH 8.7）で再平衡 化した。 ｂ．タンパク質サンプルを、25 mMトリス、10 mM NaCl（pH 8.7）に対し て透析し、そしてカラムにアプライし、その後続いて同一の緩衝液で洗浄した。 ｃ．カラムを、同一の緩衝液中、200〜300 mM NaCl勾配で溶出した。 ４．ａ．24 KD産物を含有する分画を回収してプールし、そして25 mMトリス、 10 mM NaCl（pH 8.7）に対して透析し、その後Speed Vac濃縮器でタンパク質サ ンプルを１mlまで濃縮した。 ｂ．次いで、濃縮物を、25 mMトリス、150 mM NaCl（pH 8.7）で平衡化し たSuperdex 75カラムにアプライし、同一の緩衝液で溶出した。24 KD産物は、均 一なタンパク質として溶出し、図1Bのカラム７に単一バンドを示す。 Ｊ．23.5 KD 細胞外産物 １．ａ．0〜25％硫酸アンモニウム画分（０℃で１時間）を廃棄した。 ｂ．25％〜60％硫酸アンモニウム画分（０℃で一晩）を保持した。 ２．ａ．DEAE CL-6Bカラム（Pharmacia）には１M NaClを含有する25 mMトリス （pH 8.7）で充填し、次いで25 mMトリス、10 mM NaCl（pH 8.7）で平衡化した 。 ｂ．タンパク質サンプルは25 mMトリス、10 mM NaCl（pH 8.7）に対して 透析し、後続の同一の緩衝液による一晩洗浄の前にカラムにアプライした。 ｃ．カラムを、25 mMトリス（pH 8.7）緩衝液での塩濃度勾配（10 mM〜20 0 mM）で溶出した。23.5 KDタンパク質は、約80 mM NaClで溶出した。 ３．ａ．Q-Sepharose HPカラムを、１M NaClを含有する25 mMトリス（pH 8.7 ）で充填し、25 mMトリス、10 mM NaCl（pH 8.7）で再平衡化した。 ｂ．タンパク質サンプルを、25 mMトリス、10 mM NaCl（pH 8.7）に対し て透析し、そしてカラムにアプライし、その後続いて同一の緩衝液で洗浄した。 ｃ．カラムは、25 mMトリス（pH 8.7）中、100〜300 mM NaClで溶出した 。 ｄ．ステップ3a〜3cを繰返した。 ４．ａ．23.5 KD産物を含有する分画を回収してプールし、25 mMトリス、10 m M NaCl（pH 8.7）に対して透析し、その後そしてSpeed Vac濃縮器でタンパク質 サンプルを１mlまで濃縮した。 ｂ．次いで、濃縮物を、25 mMトリス、150 mM NaCl（pH 8.7）で平衡化し たSuperdex 75カラムにアプライし、そして同一の緩衝液で溶出した。23.5 KD産 物は均一なタンパク質として溶出した。溶出タンパク質を、SDS-PAGEを用いてモ ニターし、その結果として図IBのカラム６に示した単一バンドを生じた。 Ｋ．23 KD 細胞外産物 １．ａ．0〜25％（０℃で１時間）および25％〜60％（０℃で一晩）の硫酸ア ンモニウム画分を廃棄した。 ｂ．60％〜95％硫酸アンモニウム画分を保持した。 ２．ａ．DEAE CL-6Bカラム（Pharmacia）を、１M NaClを含有する50 mMビス- トリス（pH 7.0）で充填し、次いで50 mMビス-トリス、100 mM NaCl（pH 7.0） で平衡化した。 ｂ．タンパク質サンプルを、50 mMビス-トリス（pH 7.0）、100 mM NaCl 緩衝液に対して透析し、そして同一の緩衝液でカラムを一晩洗浄する前にカラム にアプライした。 ｃ．カラムを、50 mMビス-トリス（pH 7.0）中、100〜300 mM NaClの直線 勾配で溶出した。 ｄ．約100〜150 mM NaClで溶出した23 KDタンパク質を含有する分画を回 収した。 ３．ａ．タンパク質分画を、25 mMトリス（pH 8.7）、10 mM NaClに対して透 析し、Savant Speed Vac濃縮器で１〜２mlまで濃縮した。 ｂ．濃縮物を、25 mMトリス、150 mM NaCl（pH 8.7）で平衡化したSuperd ex 75カラムにアプライした。産物を、図1Bのカラム８に示される均一なタンパ ク質として溶出した。 Ｌ．16 KD 細胞外産物 １．ａ．0〜25％硫酸アンモニウム画分（０℃で１時間）を廃棄した。 ｂ．25％〜60％硫酸アンモニウム画分（０℃で一晩）を保持した。 ２．ａ．DEAE CL-6Bカラム（Pharmacia）を、１M NaClを含有する2.5 mMトリ ス（pH 8.7）で充填し、次いで25 mMトリス、10 mM NaCl（pH 8.7）で平衡化し た。 ｂ．タンパク質サンプルを、25 mMトリス、10 mM NaCl（pH 8.7）に対し て透析し、そしてカラムにアプライし、その後続いて同一の緩衝液で一晩洗浄し た。 ｃ．カラムを、25 mMトリス（pH 8.7）緩衝液での塩濃度勾配（10 mM〜20 0 mM）で溶出した。16 KDタンパク質は、約50 mM NaClで溶出した。 ３．ａ．16 KD生産物を含有する分画を回収してプールし、25 mMトリス、10 m M NaCl（pH 8.7）に対して透析し、そしてSpeed Vac濃縮器でタンパク質サンプ ルを１mlまで濃縮した。 ｂ．次いで、濃縮物を、25 mMトリス、150 mM NaCl（pH 8.7）で平衡化し たSuperdex 75カラムにアプライし、そして同一の緩衝液で溶出した。溶出タン パク質を、SDS-PAGEを用いてモニターし、その結果として図1Bのカラム９に示し た単一バンドを生じた。 Ｍ．14 KD 細胞外産物 １．ａ．0〜25％硫酸アンモニウム画分（０℃で１時間）を廃棄した。 ｂ．25％〜60％硫酸アンモニウム画分（０℃で一晩）を保持した。 ２．ａ．DEAE CL-6Bカラム（Pharmacia）を、１M NaCl含有25 mMトリス（pH 8 .7）で充填し、次いで25 mMトリス、10 mM NaCl（pH 8.7）で平衡化した。 ｂ．タンパク質サンプルを、25 mMトリス、10 mM NaCl（pH 8.7）に対し て透析し、そしてカラムにアプライし、その後続いて同一の緩衝液で一晩洗浄し た。 ｃ．カラムを、25 mMトリス（pH 8.7）緩衝液での塩濃度勾配（10 mM〜20 0 mMまで）で溶出した。14 KDタンパク質は、約60 mM NaClで溶出した。 ３．ａ．Q-Sepharose HPカラムを、１M NaCl含有25 mMトリス（pH 8.7）で充 填し、25 mM NaCl（pH 8.7）で再平衡化した。 ｂ．タンパク質サンプルを、25 mMトリス、10 mM NaCl（pH 8.7）に対し て透析し、そしてカラムにアプライし、その後続いて同一の緩衝液で洗浄した。 ｃ．カラムを、25 mMトリス（pH 8.7）中、10〜150 mM NaClで溶出した。 ｄ．ステップ3a〜3cを繰返した。 ４．ａ．14 KD生産物を含有する分画を回収してプールし、25 mMトリス、10 m M NaCl（pH 8.7）に対して透析し、そしてSpeed Vac濃縮器でタンパク質サンプ ルを１mlまで濃縮した。 ｂ．次いで、濃縮物を、25 mMトリス、150 mM NaCl（pH 8.7）で平衡化し たSuperdex 75カラムにアプライし、この緩衝液で溶出した。14 KD産物は、均一 タンパク質として溶出した。溶出タンパク質を、SDS-PAGEを用いてモニターし、 その結果として図1Cのカラム２に示した単一バンドを生じた。 Ｎ．12 KD 細胞外産物 １．0〜10％硫安沈殿物を得た（4℃で一晩）。 ２．再可溶化した沈殿物を、S200 Sephacrylサイズ分画カラムにアプライし、 12 KD分子のタンパク質を溶出した。 ３．タンパク質画分を、DEAE-Sepharose CL-6BまたはQAE-Sepharoseイオン交 換カラムにアプライし、そして上述のようにNaCl濃度勾配で溶出した。約12 KD の分子量を有する２つの相同なタンパク質を含有する画分を、約300〜350mM NaC lで溶出し、そして回収した。タンパク質は、12Aおよび12Bと標識し、図1D,カラ ム(col.)２に示したダブレットとして精製した。 図１のSDS-PAGEプロフィールに示したように、M．tuberculosisの主要である か、または豊富な細胞外タンパク質を、上記の実施例2A〜2Nに詳述したプロトコ ルを用いて均一になるまで精製した。より詳細には、図１にSDS-PAGEおよび標識 した1A、1B、1C、および1Dを用いて展開した4つの典型的な12.5％アクリルアミ ドゲルを示す。ゲル1A〜1Cのレーン１の標準は、分子量66、45、36、29、24、20 および14 KDの分子量のタンパク質を含有した。ゲルIDでは、レーン１の標準は 、分子量68、45、31、29、20および14 KDの分子量のタンパク質を含有した。各 々の精製細胞外産物を含むレーンは、報告された個々のタンパク質の分子量で本 質的に１つのバンドを示す。ゲル1Dでは、12 KDタンパク質がレーン２に見える ダブレットとして泳動することに注目されたい。配列決定分析では、より下部の 12 KD（または12B KDバンド）が、最初の3 Ｎ末端アミノ酸を欠陥することを除 いて、より上部の12 KD（または12A KD）バンドと等価であることを示す。 これらの個々の典型的な主に豊富な細胞外産物のさらなる分析を図２に示す。 より詳細には、図２は、これらの精製細胞外産物から得たＮ末端配列データの表 編集であり、単離された産物の大部分が実質的に異なることを示す（配列番号１ 〜14）。タンパク質32A、32Bおよび30のすべては５つのＮ末端アミノ酸が同じな ので、これらのタンパク質を十分に特徴づけおよび識別するためにはさらなる配 列決定が必須であった。図３は、これら３つの精製分泌産物（配列番号15〜17） の延長したＮ末端アミノ酸配列を示す。16位（配列番号17）、31位（配列番号16 ）および36位（配列番号16）でのアミノ酸の相違は、これらの単離されたタンパ ク質が、その分子量の類似性にもかかわらず互いに異なることを証明する。 タンパク質30、32Aおよび32Bに加えて、他の主に豊富な細胞外産物の延長Ｎ末 端アミノ酸配列を決定して一次構造データを提供し、そしてタンパク質間の潜在 的な関係を明らかにした。配列決定を、実施例２に従って精製した細胞外産物に ついて、当該分野で周知の技術を用いて行った。インタクトなタンパク質の見か けの分子量によって同定され、そして天然に生じるアミノ酸について標準一文字 表記を用いて表される、各々の細胞外産物について決定した種々の長さのＮ末端 アミノ酸配列を以下に示す。確立された表示法の規則を遵守して、Ｎ末端配列を アミノ末端からカルボキシ末端への方向で左から右へ記述する。決定したアミノ 明または曖昧な場合には、配列における当該位置をダッシュで表わす。最後に、 2個のアミノ酸を斜線によって分離する場合には、正確な成分が明瞭に確認され ていないか、どちらか一方がその配列の位置を占有し得ない。 DNA配列決定を、当該分野での周知の技法を用いて30、32A、16、58、23.5およ び24 KDタンパク質について行った。インタクトなタンパク質の見かけの分子量 によって同定されたこれらのDNA配列と上流配列および下流配列を含む対応する アミノ酸を、標準略語および表記法の法則を用いて示す。 この配列データは、SDS-PAGEを用いて確認した物理的特性と組み合わせて、本 発明のこれらの代表的な主に豊富な細胞外産物の特徴づけおよび識別ことを可能 にする。記載した分析は、これらのタンパク質が、全有効細胞外産物の約60％重 量を含む71 KD、30 KD、32A KD、23 KDおよび16 KDを有するM．tuberculosisの 細胞外産物の大多数を構成することを示す。さらに、30 KDタンパク質は、M．tu berculosisにより放出される全産物の25％（対重量）までを構成し得ることがさ に推定される。従って、個々の典型的に主に豊富ななM．tuberculosisの細胞外 産物は、細胞外産物の総重量の約0.5％〜約25％までのいずれかの範囲であり得 る。 先に議論されたように、従来のウエスタンブロット法が最も免疫学的に特定の 細胞外産物を一貫して同定することができないことに続いて、本発明者は、豊富 な細胞外産物の免疫原性を、その豊富さおよびその結果としての同定および単離 の容易さに基づいて分析した。驚くべきことに、これらの主に豊富な細胞外産物 は、意外に有効な免疫応答を誘導することが見出されたため、本発明者はこれら の細胞外産物がワクチンとして機能し得るという結論に至った。この驚くべき発 見は、上述の本発明の関する非限定的な機能理論の発展をもたらした。 本発明の有効性を証明するために、当該分野で認められている実験モデルにお いて、防御免疫を誘導する種々の典型的な用量で、複数の主に豊富な細胞外産物 およびその組合わせを用いてさらなる実験を行った。より詳細には、精製した主 に豊富な細胞外産物を用いて、モルモットで防御免疫を誘導し、次いでモルモッ トをM．tuberculosisで抗原投与した。これらのタンパク質が防御免疫を誘導す ることができたことを示す際に、５つの精製した主に豊富な細胞外産物の組合わ せを、異なる投与経路を用いて同様に試験した。特に30 KDの豊富な細胞外産物 を用いて、71 KD細胞外産物の精製型として認められている動物モデルで防御免 疫を誘導した。個々の典型的な主に豊富な細胞外産物の場合と同様に、５つの主 に豊富な細胞外産物の組み合わせワクチンは、致死量のM．tuberculosisでの抗 原投与に対して防御を付与した。本発明のこれらの典型的ワクチンの種々の研究 の結果を下記に示す。 M．tuberculosisによる免疫原性抗原投与またはエアゾール抗原投与を含むす べての実験で、特異的な病原性を有さない雄のHartley系モルモット（Charles R iver Breeding Laboratories，North Wilmington，Massachusetts）を使用した 。動物を、ステンレス鋼のケージに２〜３匹ずつ飼育し、標準的なモルモット用 飼料および水を自由摂取させた。動物施設に到着後、モルモットは健常であるこ とを確認するために、各実験の開始に先立ち少なくとも１週間以上観察した。 最初の実験は、通常存在する全細胞外タンパク質の３％〜25％を占めると考え られる主に豊富な細胞外産物を用いて行われた。これらの実験は、主に豊富な細 胞外産物が恋おうか的な免疫応答を引き起こすことを実証する。より詳細には、 単離した30 KDおよび71 KD細胞外産物は、以下の致死量のM．tuberculosisへの 曝露の際にモルモットを防御する、細胞媒介性免疫応答を生じる能力が個別にあ ることが示された。 実施例３ 30 KD免疫モルモットの細胞性免疫に関する 精製30 KDタンパク質の皮膚試験 豊富な細胞外産物の精製型により側底可能なの免疫応答を誘導し得ることを実 証するために、皮膚過敏性試験を行った。モルモットは、実施例２にしたがって 精製し、そしてM．tuberculosisの全細胞外産物の約25％を占めると考えられる 典型的な主に豊富なM．tuberculosis 30 KD分泌産物で免疫化された。別々の３ 件の実験において、モルモットを、SAFアジュバントにて実質的に精製した100μ gの30 KDタンパク質で、３週間の間隔で３回免疫した。対照動物には、SAFにて 調製した緩衝液を同様に注射した。最後の免疫化から３週間後、モルモットを、 皮膚過敏性アッセイにおいて、典型的な30 KDタンパク質で抗原投与した。 モルモットは背部を剃毛し、そして0.1、１および10μgの30 KDタンパク質の 注射を皮下に投与した結果生じる紅斑（皮膚の発赤）および降下を、以下の表Ａ に示されるように24時間後に測定した。データを、従来の法を用いて測定される 、群の平均測定値±標準誤差（SE）について報告する。NDは、本発明のこの特定 の 局面を行わなかったことを示す。 表Ａに示すように、典型的な30 KD分泌産物で免疫化されたモルモットは、顕 著な紅斑および硬化によって証明されたように、強力な細胞媒介性免疫応答を示 した。対照的に、対照動物は最小の応答を呈した。 30 KD分泌産物の免疫反応性を確認し、そしてその感染性の結核に対する適用 性を示すために、非免疫化モルモットを、M．tuberculosisで感染し、そして以 下のような本発明のタンパク質で抗原投与した。 実施例４ M．tuberculosisで感染したモルモットの 細胞媒介性免疫応答についての精製30 KDタンパク質試験 モルモットの感染を必要とする実験で使用するための細菌を得るために、M．t uberculosisをまず7H11寒天上で培養し、そしてこれらの菌が毒性であることを 確認するために、モルモット肺を1回通過させた。この目的のために、モルモッ トを、約５×104細菌／mlを含有する7H9ブロース中の10 mlの細菌の懸濁液を有 するエアゾールにより抗原投与した。モルモットが発病した後、この動物を屠殺 し、そして顕著なM．tuberculosis病変を含む肺を取り除いた。各肺を粉砕し、7 H11寒天で７日間〜10日間培養した。細菌をプレートからかき取り、10％グリセ ロールを含有する7H9ブロースで希釈し、単一細胞懸濁液を得るために水浴中で 超音波破砕し、そして約２×107生存細菌／mlの濃度で−70℃でゆっくりと凍結 した。凍結細胞の生存能を、細菌懸濁液を解凍し、そして7H11寒天上で本懸濁液 の連続希釈物を培養することにより測定した。抗原投与の直前に、細菌細胞のバ イアルを解凍し、そして7H9ブロスで所望の濃度まで希釈した。 モルモットを、特別に設計したルサイト製エアゾールチャンバー中で、生存能 力のあるM．tuberculosisのエアゾールに曝露した。エアゾールチャンバーは14 ×13×24インチで、相対する面にモルモットを導入または除去するための直径６ インチの入口が２個含有する。エアゾール注入口は、チャンバーの天井の中央に 位置した。真空ポンプ（Gast Mfg．Co.，Benton Harbor，Michigan）は、30 1b ／in2でネブライザー-ベンチュリユニット（Mes Inc.，Burbank，California） に空気を送達し、そしてエアゾールは10mlの細菌懸濁液から生成した。0.2μmの 呼吸回路フィルターユニット（Pall Biomedical Inc.，Fajardo，Puerto Rico） は、このアセンブリの内外で圧力を平衡化するために、チャンバーの一方の端に 位置した。安全性の考慮のため、エアゾール抗原投与はチャンバーを完全に層流 フード内に配置して行った。 動物を、ネブライザー中の細菌の懸濁液が完全に消費される30分間、病原菌エ アゾールに曝露した。各エアゾールを、約１mlあたり5.0×104の細菌を含有する 10 mlの懸濁液から生成した。先の研究は、この濃度の細菌へのモルモットの曝 露が非防御動物において一貫して感染を引き起こすことを示している。エアゾー ル注入後、モルモットを層流バイオハザード安全囲い（Airo Clean Engineering Inc.，Edgemont，Pennsylvania）の中のステンレス鋼ケージ中で飼育し、そし て感染の徴候を観察した。なお、動物には全実験期間を通じて標準的なモルモッ ト用飼料および飲料水を自由摂取させた。 本実験では、感染したモルモットを屠殺し、そして種々の濃度の30 KDタンパ ク質に応じて脾臓リンパ球増殖を測定した。より詳細には、脾臓リンパ球を採取 し、そして本明細書中で参考として援用するBriemanおよびHorwitz（J．Exp．Me d．164:799-811）（これは本明細書中に参考として援用される）に記載されたよ うに精製した。リンパ球を、ペニシリン（100 Ｕ／ml）、ストレプトマイシン（ 100μg／ml）、および10％ウシ胎児血清（GIBCO）を含有するRPMI 1640（GIBCO Laboratories，Grand Island，New York）で107／mlの最終濃度に調整し、総容 量100μlで、種々の濃度の精製30 KD分泌産物とともに、マイクロウェル（96-ウ ェル丸底組織培養プレート；Falcon Labware，Oxnard，California）中で、５％ CO2-95％空気かつ湿度100％で37℃で2日間インキュベートした。非感染動物は陰 性対照として用いた。インキュベーション期間の終了時、0.25μCiの［3Ｈ］チ ミジン（New England Nuclear，Boston，Massachusetts）を各ウェルに添加し、 そして細胞を５％CO2-95％空気かつ湿度100％下で37℃でさらに2時間インキュベ ートした。多サンプル自動細胞採取器(multisample automated cell harvester) （Skatron Inc.，Sterling，Virginia）を用いて各ウェルを洗浄し、そして溶出 液をフィルターマット（Skatron）に通過させた。別々のマイクロテストウェル の標本を示すフィルターマット切片をシンチレーションバイアルに入れ、そして ２mlのEcoscintＨ液体シンチレーションカクテル（National Diagnostics，Manv ille，New Jersey）を添加した。β粒子放出を、βシンチレーションカウンタ（ Beckman Instruments Inc.，Fullerton，California）で測定した。 感染モルモットおよび非感染モルモット由来の組織サンプルを、１および10μ g／mlの単離された30 KD分泌タンパク質に対してアッセイした。次いで、サンプ ルを［3Ｈ］チミジンの取込み能力についてモニターした。これらのアッセイの 結果を表にし、下記の表Ｂに示した。 データは、本開示の目的のために、以下： 抗原とともにインキュベートしたリンパ球の平均［3Ｈ］チミジン取込み／抗 原なしでインキュベートしたリンパ球の平均［3Ｈ］チミジン取込み、を意味す るものとして定義される刺激指数として報告する． 表Ｂに示すように、主に豊富な分泌産物に対する曝露に応答する用量非依存的 な脾臓リンパ球増殖により明らかなように、感染動物の細胞は、主要な30 KDの タンパク質に対する強力な応答を示した。逆に、非感染対照動物はリンパ球増殖 をほとんど示さなかった。従って、30 KDの分泌産物は、M．tuberculosisに感染 した哺乳動物において、細胞媒介性免疫応答を誘導する。 本発明のワクチンの防御局面を例証するために、モルモットを精製30 KDタン パク質で免疫化し、そして以下のようにM．tuberculosisに曝露した。 実施例５ エアゾール化M．TUBERCULOSISでの 30 KD免疫化モルモットの抗原投与 前述したように、動物はSAFにて100μgの典型的30 KDタンパク質で、３週間の 間隔で３回免疫した。対照モルモットを、SAFにて120μgの大量のEP で免疫化す るか、または同一アジュバントで調整した緩衝液で擬似免疫化された。最後の免 疫化の３週間後、動物を実施例４に記載したようにエアゾール化M．tuberculosi sで抗原投与した。３つの群の動物の生存率をモニターし、図４に図表を用いて 示す。絶対的な死亡率を、以下の表Ｃに示されるように抗原投与の14週間後に決 定した。 図４に示されるように、典型的な30 KDタンパク質で3回免疫化されたモルモッ トは死から防御された。30 KDタンパク質で免疫化されたモルモットの約67％が 生存していたのに対し、対照の擬似免疫化されたモルモットではわずか17％しか 生存しなかった。 免疫動物の体重保持をまたモニターし（データ不記載）、そして本発明により 教示されるように、病原菌により産生された主に豊富な細胞外産物を取込むワク チンの予防能力をさらに示す。免疫化された動物が体重を維持するようであるの に対して、擬似免疫化された動物の高い死亡率は免疫化された動物と対照動物と を図表で比較することができなかった。 体重モニタリング試験の終了後、生存している動物を屠殺し、そして各動物の 右肺および脾臓を生存能力のあるM．tuberculosisについてアッセイした。動物 を２％ amphyl溶液（National Laboratories，Montvale，New Jersey）に浸漬し 、そして肺および脾臓を無菌的に取り除いた。肺の肉眼的初期表面病変の数を、 視検により計測した。右肺および脾臓におけるM．tuberculosisのコロニー形成 単位（CFU）を、乳鉢ならびに乳棒および90-メッシュNorton Alundum（Fisher） を用いて、10 mlの7H9ブロスで各臓器をホモジナイズし、7H9中で組織ホモジネ ートを連続的に希釈することにより、そして0.1 ml／滴の滴下を用いることによ り、希釈液を２連の7H11寒天プレート上で培養することにより測定した。すべて のプ レートはモジュール調整したインキュベーターチャンバー内に置き、そして湿度 100％の５％CO2-95％空気で、37℃で12〜14日間した。アッセイをこのプロトコ ールを用いて行い、計測の結果を、平均コロニー形成単位（CFU）±標準誤差（S E）に関して下記の表Ｄに示す。 表Ｄに示すように、典型的な30 KD分泌タンパク質による免疫化は、肺および 脾臓でのM．tuberculosisの増殖を制限した。１匹の生存している疑似免疫化動 物からの１つのデータのみが比較の目的のために利用可能であったが、４匹の生 存している30 KD免疫動物は、生存している擬似免疫化動物よりも、CFUが肺で0. 7ログ、脾臓で１ログ少なかった。CFU数と死亡率との高い相関関係を示す先の実 証に基づいて、生存している動物は、CFU分析を実施し得る前に死亡した動物よ りも肺および脾臓のCFUが少なかったようである。再び、免疫化動物の肺および 脾臓におけるCFUのこの減少は、本発明の範囲および実施可能性を実証する。 71KD細胞外産物である、M．tuberculosis由来の別の主に豊富な細胞外産物の 免疫防御の潜在性を、その単離型で試験して免疫防御能力を実証した。 実施例６ EPの大量調製薬剤で免疫化したモルモットの 精製71 KDタンパク質皮膚試験 71 KDタンパク質が動物において有効な免疫応答を引き起こす可能性を証明す るために、この分離した主に豊富な細胞外産物を用いて、皮膚過敏性アッセイに おいてM．tuberculosis細胞外タンパク質（EP）の大量調製薬剤で免疫したモル モットに皮膚試験を行った。上記で議論したように、大量のEPは、本発明のワク チンより軽度であるが、M．tuberculosisによる感染に対する後天性免疫性を付 与する。 モルモットを、実施例１に詳述したように調製した120μgの大量のEP調製物に より3週間の間隔で2回免疫化した。ワクチン接種は不完全Freundアジュバントで 調製し、EPの代わりに緩衝液を投与した擬似免疫化動物に行った。最後のワクチ ン接種の３週間後、各群からのモルモットは背部を剃毛し、そして0.1、1.0およ び10μgの71 KDタンパク質の皮内注射により皮膚試験を行った。10.0μgの緩衝 液を対照として用い、そしてすべての注射を0.1 mlの全容量を用いて行った。紅 斑および硬化の直径を24時間後に測定し、下記の表Ｅに示すような結果となった 。データは、従来の方法を用いて決定されたような群についての平均測定値±標 準誤差（SE）に関して報告する。 免疫化された動物の応答は、緩衝液のみで抗原投与したモルモットの応答のほ ぼ約２倍であり、動物の免疫化に用いたものと同一の容量のEPで抗原投与したモ ルモットのものと類似していた（データ不記載）。 精製した典型的な71 KDの主に豊富な細胞外産物が細胞媒介性免疫応答を引き 起こすことをさらに確認するために、大量のEPを免疫したモルモットを屠殺し、 そして種々の濃度の71 KDタンパク質に応じて脾臓リンパ球増殖を測定した。非 免疫動物を対照として用いた。実施例４のプロトコルに従って、リンパ球を71 K Dとともにおよび71 KDなしで２日間インキュベートし、そして次いで［3Ｈ］チ ミジンの取込み能力についてアッセイした。 データは、実施例４のように計算した刺激指数に関して報告する。この71 KD 抗原投与の結果を、下記の表Ｆに示す。 表Ｆに示すように、リンパ球増殖分析の刺激指数は、皮膚過敏性アッセイで得 られた結果と比較できる。71 KDおよび大量のEP試験サンプルはともに、対照サ ンプルでの応答より２〜３倍高い応答を示したが、これは単離された典型的な71 KD主に豊富な細胞外産物がM．tuberculosis抽出物で免疫化した動物において細 胞媒介性免疫応答を刺激し得ることを示した。しかし、精製された最多主に豊富 な細胞外産物または主な細胞外産物は先行技術または容量の組成に関連する問題 はなく、合成および商業産生により容易に適応できるため、本発明のワクチンの 製造は先行技術より優れていることを再度、強調しなければならない。 より詳細には、バルク調製は、近年の生体分子技法により容易に大規模製造し 得ない。すべての細胞外産物を含有するこれらの未精製バルク調製物の商業的な 生産はいずれも、標的病原体または緊密に関連する種の大量培養工程、および結 果として得られた上清液の採集工程を包含する。このような生産方法論は、標的 病原体、毒性副産物または他の寄生薬剤による汚染に高度に感受性である。さら に、こうした調製物に含まれる多数の免疫原性決定基は、免疫母化集団の感受性 セグメントにおいて毒性免疫反応を誘発する可能性がはるかに高いようである。 これらの未精製バルク調製物の使用はまた、結核のスクリーニングおよびコント ロールに現在用いているもっとも一般の皮膚試験の使用を否定する。 正反対に、本発明のワクチンは、高収率形質転換宿主を用いて比較的安全に大 量生産され得る。同様に、本発明のワクチンは全く同じに産生され得、バルク細 胞外産物の広範な種類の生産と反対にバッチを容易に標準化する。さらに、宿主 免疫系に与えられる免疫原性決定基の数が比較的少ないため、毒性反応および一 般的なスクリーニングテストを無効にする機会は大いに減少する。 実施例７ 71KD免疫化モルモットの精製71KDタンパク質皮膚試験 単離された典型的に71Kbの主に豊富な細胞外産物が、バルクEP免疫化動物にお いて細胞性免疫応答を生じることを示した後、この主に豊富な産物の精製された 形態が71KDで免疫化した動物に細胞性免疫応答を誘導し得ることが示された。 SAF中100μgの精製71KDタンパク質で、モルモットを３週間おきに２回ワクチ ン接種した。コントロール動物をSAF中緩衝液で、同一スケジュールで疑似免疫 化した。最終免疫から３週間後、両方の組の動物に１および10μgの単離71KDタ ンパク質を経皮的に抗原投与した。24時間後に生じた紅斑および硬化を測定した 。結果を以下の表Ｇに示す。 硬化および紅斑の程度は非免疫化コントロール動物よりも免疫化動物の方が非 常に大きく、71KDタンパク質に対する強い細胞性免疫応答が本発明のワクチン接 種プロトコルで開始されたことを示す。 この豊富細胞外生成物が、本発明の教示によりそれ自体の有効な免疫応答を誘 導する能力をさらに確認するために、リンパ球増殖アッセイを行った。表Ｇにお ける免疫化された動物を屠殺し、そして実施例４で確立されたプロトコルを用い て、脾臓リンパ球増殖アッセイを行った。71KD免疫化モルモット由来の組織サン プルおよびコントロールモルモット由来の組織サンプルに0.1、１および10μg/m lの単離71KDタンパク質を抗原投与し、そして［3H］チミジン取り込み能につい てモニターした。先に記載のように、刺激指数を計算した。これらのアッセイの 結果を以下の表Ｈに示す。 皮膚過敏性アッセイと同じく、71KD免疫化動物は疑似免疫化コントロールより も精製71KDに対してきわめて大きい応答を示した。外来タンパク質で予想される ことではあるが、そのような結果は、主に豊富な細胞外産物に細胞性免疫応答を 誘導する能力を有することを明らかに示す。 単離された主に豊富な細胞外タンパク質が有効な細胞性免疫応答を誘導するこ とを確立した後、このような反応のいづれもが結核菌に対し交差反応性であるこ とを確認するため以下の様にさらに実験を行った。 実施例８ M．TUBERCULOSIS感染モルモットの精製71KDタンパク質抗原投与試験 非免疫化モルモットを実施例４に報告されるように、エアゾル化したM．tuber culosisに感染させた。感染動物が、M．tuberculosisを示唆する細胞性免疫応答 を示すことを確実にするために、精製タンパク質誘導体（PPD-CT68、Connaught Laboratories Ltd.）をポジティブコントロールとして使用した。結核の暴露に 対するマントー試験（Mantoux test）で広く用いられるPPDは、一般に硫酸アン モニウム分画によって調製され、平均分子量約10KDを有する小さなタンパク質の 混合物を含む。PPDに対する免疫応答は、実施例１で単離されたバルクEP画分で 誘発されるものと実質的に相同である。 感染の3週間後、モルモットに0.1、１および10μgの典型的な精製主に豊富な7 1KD細胞外タンパク質を経皮的に抗原投与した。コントロールとして使用した非 感染動物にも同様に単離タンパク質で抗原投与した。紅斑および硬化の程度を24 時間後に測定し、結果を以下の表Ｉに報告する。 表Ｉに示すように、本発明の典型的な精製主に豊富な細胞外タンパク質で抗原 投与した感染動物に強い免疫応答が存在する。これらの応答は、紅斑に関して3 〜4倍程度、硬化について10倍を超えて、非感染動物よりも強く、主な71KD細胞 外タンパク質は、M．tuberculosis感染動物において強い細胞性免疫応答を誘導 することが確認されている。 これらの結果をさらに確認するために、感染動物および非感染動物を屠殺し、 実施例４のプロトコルに従ってリンパ球増殖アッセイに供した。両方の組のモル モット由来の組織サンプルを、0.1、１および10μg/mlの単離された71KDタンパ ク質およびPPDに対しアッセイした。次いで、先に記載のような[3H]チミジン取 り込み能についてサンプルをモニターし、これらのアッセイの結果を以下の表Ｊ に示す。 皮膚過敏性アッセイと同じく、表Jは非感染サンプルよりも感染組織で刺激指 数がはるかに大きいことを示す。より具体的には、感染動物の平均ピーク刺激指 数は、非感染コントロールに対する指数よりも、典型的な71KDタンパク質に対し ２倍高く、PPDに対し３倍高く、このことから、本発明の典型的な主に豊富な細 胞外タンパク質ワクチンによりM．tuberculosis感染動物において強い細胞性免 疫応答が誘導されることが確認された。 典型的な精製71KD主に豊富なタンパク質とM．tuberculosisとの間の交差反応 性の実証に続いて、本発明に開示されるように主に豊富な細胞外産物のこれらの 典型的な精製サンプルにより有効な免疫応答が刺激され得ることを実証するため 、さらなる実験を行った。実施例９ エアゾル化M．TUBERCULOSISによる71KD免疫化モルモットの抗原投与 典型的な主に豊富なまたは主に豊富な細胞外タンパク質ワクチンの免疫防御能 を示すため、実施例２に従って精製した100μgの典型的な主に豊富な71KDタンパ ク質で、モルモットを3週間おきに２回免疫した。コントロール動物は、実施例 １由来のバルクEP120μg、または緩衝液で免疫化した。すべての動物をアジュバ ントSAFを用いて免疫化した。最後の免疫の３週間後、典型的な71KDタンパク質 で免疫化したモルモットに10μgのサンプルで皮膚試験を行い、細胞性免疫応答 を生じたかどうかを評価した。次にコントロール動物および71KD免疫化モルモッ トを実施例４に詳述したようにエアゾル化M．tuberculosisに感染させた。感染 後、動物をモニターし、そして６ヶ月間体重を測定した。 図５のグラフは、疑似免疫グループに生じた体重減少と、71KDおよびバルクEP 免疫化動物によって示される比較的正常な体重増加とを対比する。各グループで データは平均体重±SEである。同じ動物に対する致死率曲線を図６のグラフに示 す。検討した絶対致死率比を以下の表Ｋに示す。 体重減少曲線および致死率の両方とも、明らかに、本発明の主に豊富な細胞外 タンパク質は予防免疫応答を付与することを示す。このことは非免疫化動物の10 0％がモニター期間の終了までに死亡したという事実からも裏付けられる。 実施例10 エアゾル化M．TUBERCULOSISによる71KD免疫化モルモットの抗原投与 先の実施例の結果を確認し、そして典型的な主に豊富な細胞外タンパク質の投 与が動物における防御免疫応答を与え得ることを示すため、同様の実験を行った 。この実験では、モルモットを３回、３週間おきに100μgのSAF中の71KD細胞外 タンパク質で再度免疫化した。コントロールモルモットをSAF中の緩衝液で疑似 免疫化した。最後の免疫から3週間後、動物にエアゾル化M．tuberculosisで抗原 投与し、毎週１回、13週間体重を測定した。６モルモットの各グループの平均体 重±SEを計算し、そして図７にグラフを示す。この曲線は、免疫化した動物はほ とんど同じ体重を維持したが、疑似免疫化動物はモニター期間中にわたってかな り の体重を減少させたことを示す。体質量の減少または「消耗」は、結核の古典的 な副作用の１つであり、これらの結果は、免疫化された動物中の結核菌の成長と 増殖が本発明の典型的なワクチンによって阻害されたことを示す。 単離形態の豊富細胞外産物によるワクチン接種を介して、モルモットに防御免 疫性が発現したので、本発明のワクチンの種間免疫反応性を実証し、モルモット モデルの妥当性および適用性をさらに確認するために実験を行った。 実施例11 精製71KDタンパク質によるPPDポジティブのヒト細胞性免疫試験 典型的な71KD主に豊富なタンパク質に対するヒト免疫応答の細胞性成分を評価 するために、実施例４で報告されたようにタンパク質に対するPPDポジティブ個 体およびPPDネガティブ個体の抹消血リンパ球の増殖を、標準リンパ球増殖アッ セイで研究した。ポジティブPPD、またはツベルクリン反応は、過去にM．tuberc ulosisに感染したことを示すものとして当業者に周知である。増殖応答およびそ れに対応する［3H］チミジン取り込みを２日目および４日目に測定した。これら の研究データを図8Aおよび8Bに示す。図8Aは2日後の種々のレベルの71KDに対す る応答を、図8Bは４日目の同じ応答を示す。 図8Aおよび8Bに示すように、PPDポジティブ個体の平均ピーク刺激指数はPPDネ ガティブ個体のそれよりも、71KDタンパク質に対して２倍高く、PPDに対して３ 倍高かった。PPDポジティブ個体の間でも、典型的な71KDタンパク質とPPDに対す るピーク刺激指数の間に直線的相関関係があり、先にM．tuberculosisに曝され たヒトにおけるM．tuberculosisの主成分または主に豊富な細胞外産物により強 い細胞性反応が刺激されることを実証する。このデータはモルモットで見られる 反応性プロフィルに相当し、モルモットモデルを感染しやすい他の哺乳動物に応 用できることが確認される。 従って、先に議論した30KDの典型的なタンパク質のように、主に豊富な71KD細 胞外産物に対する強い免疫応答の発現は、71KD生成物はヒトにおける細胞性免疫 を刺激するのにも有効であるという事実で証明されるように本発明の広い範囲を 実証する。 また、本発明はM．tuberculosisの細胞外産物、または典型的な71KDタンパク 質の使用に限定されるものではないことも強調されなけらばならない。むしろ、 本発明の教示は実施例に実証されるように、いずれの主に豊富な細胞外産物にも 応用できる。 M．tuberculosisの主に豊富な細胞外産物の組合せも防御免疫を提供するかど うかを確かめるため、さらなる研究を行った。一般にこれらの研究は、M．tuber culosisの５つの精製された細胞外タンパク質の組合せを含むSAF中のワクチンの 種々の経皮または皮下のいずれかの免疫化で３回、３〜４週間おきに免疫化され たモルモットを利用した。 組合せＩとラベルされた免疫手順に使用した第１のタンパク質の組合せは実施 例２のプロトコルにより精製された71KD、32A KD、30KD、23KDおよび16KDタンパ ク質含んだ。この組合せは、M．tuberculosis培養上清中に通常存在する細胞外 総タンパク質の60％までを含むと思われる。組合せＩに使用するために選択され たこれらのタンパク質は、図２でアスタリスクで示される。各タンパク質の100 μg、20μgおよび2μgを含有する組合せＩワクチンを、アジュバントSAFと共に 経皮的に投与した。また各タンパク質20μgを含有する組合せワクチンＩを皮下 的に類似の実験で投与した。ネガティブコントロールモルモットを同じスケジュ ールで等容量のSAFおよび緩衝液で疑似免疫化し、一方、ポジティブコントロー ルをSAF中、実施例１由来の120μgのバルク細胞外タンパク質調製物で免疫化し た。全ての注入容積は緩衝液を用いて標準化した。 実施例12 組合せＩワクチンに対する組合せＩ免疫化モルモットの応答 主要細胞外産物の組合せＩ混合物によるワクチン接種後に動物が測定可能な免 疫応答を発現したかどうかを決定するために、皮膚過敏性アッセイを行った。モ ルモットの背中を剃毛し、５つの精製細胞外タンパク質の同じ組合せを1.0μgお よび10.0μgを皮下注射した。10.0μgの緩衝液をコントロールとして使用し、そ してすべての注射は全容積0.1mlを用いて行った。皮膚の試験部位での紅斑およ び硬化の直径を、注射後24時間に測定した。 測定結果を以下の表Ｌに示す。データは従来の方法を用いて決定される、群に ついての平均測定値±標準誤差（SE）で報告される。NDはこの特定の局面の実験 が行われなかったことを示す。 データは明らかに、組合せＩ細胞外タンパク質に対する強い細胞性免疫応答が ワクチン接種した動物によって作製されたことを示す。免疫化モルモットは、コ ントロール動物よりもほとんど３倍大きい紅斑および硬化の測定値を示した。 実施例13 エアゾル化M．TUBERCULOSISに対する組合せＩワクチンの免疫防御性分析 最後の免疫から3週間後、先の過敏性アッセイに用いたモルモットをエアゾル 化したエアゾル化M．tuberculosis、Erdman株で抗原投与し、そして10週間、毎 週体重測定した。このエアゾル抗原投与は実施例４のプロトコルを用いて行った 。100μｇの主要細胞外産物の組合せＩで免疫化した6匹の動物を、ポジティブお よびネガティブコントロールの等サイズのグループと共に、同時に、エアゾル化 したM．tuberculosisを抗原投与した。ポジティブコントロールはSAF中の120μg のEPで３回免疫化した。 観察期間終了前に死亡したモルモットを剖検し、結核病巣の塊があることを検 査した。このような病巣は実験中に死亡したすべての動物に見い出された。 エアゾル抗原投与後の、免疫化動物とコントロール動物との間の平均体重の差 を、偏差の繰り返し測定分析（ANOVA）により解析した。抗原投与後の免疫化モ ルモットとコントロールモルモットとの間の生存率の差を両側フィッシャー（Fi sher）試験（two-tailed exact test）で解析した。データは６匹のモルモット の各グループに対する平均体重±標準誤差（SE）である。 抗原投与後の週毎の体重測定の結果を図９に示す。細胞外産物の組合せで免疫 化したモルモットと比べて、疑似免疫化動物は全体重の15.9％を失った。ポジテ ィブコントロールの体重は、５つの精製細胞外タンパク質の組合せで免疫化した 動物の体重と同様であった。体重は抗原投与直前の体重で正規化した。組合せＩ で免疫化した動物と疑似免疫化コントロールとの間の差は繰り返し測定ANOVAに よるp<.0000001で高度の有意性があった。 抗原投与から10.5週後に致死率を測定した。疑似免疫化動物のすべての３匹は 、抗原投与から10週と10.5週の間に互いに３日以内の間隔で死亡した。実験の致 死率の結果を以下の表Ｍに示す。 体重モニター研究の結論後、生存した動物を炭酸過剰で屠殺し、個々の動物の 右肺と脾臓を実施例５のプロトコルを用いて、生存M．tuberculosisについてア ッセイした。実験の最後の週に死亡した３匹の動物を含む計数の結果を、平均コ ロニー形成単位（CFU）±標準誤差（SE）で以下の表Ｎに示す。 精製タンパク質の組合せで免疫化した動物と疑似免疫化動物との間の肺中の細 菌濃度の差の対数は1.4であり、一方、脾臓中の細菌の差の対数は0.9であった。 これと並んで、免疫化動物剖検全体を観察すると、疑似免疫化動物と比べて結核 との肺の関連性は顕著に減少していた。実施例１のバルク細胞外調製物（EP）で 免疫化したポジティブコントロール動物は、精製細胞外タンパク質の組合せＩ混 合物による免疫化動物より肺中に0.7log、脾臓中に0.5logだけ多い細菌を示した 。 実施例14 皮下および経皮送達による低用量での組合せＩワクチンの免疫防御分析 実施例13は、組合せＩタンパク質が100μgの個々のタンパク（30+32A+16+23+7 1）で3回、4週間、皮下的に免疫した動物で免疫防御を示したが、組合せＩタン パク質のより低い抗原投与量、特に各タンパク質20μgまたは2μgの免疫防御能 を示すために別の実験を行った。実施例13のように、モルモット（１グループあ たり６匹）を組合せタンパク質（30+32A+16+23+71）でSAF中で皮下的に４回、3 週間おきに免疫化した。動物は免疫毎に20μgまたは2μgの個々のタンパク質を 投与された。コントロール動物は先のプロトコルを用いて疑似免疫化された。３ 週間後、動物をエアゾル化M．tuberculosisで抗原投与し、体重を毎週、9週間測 定した。すべての免疫化した動物は実験終了まで生存したが、疑似免疫化動物の １匹は実験終了以前に死亡した。以下の結果に示すように、実施例13より５倍、 および50倍低い用量においても免疫化動物をエアゾル化M．tuberculosisから保 護し、経皮および皮下経路の両方による送達が有効であった。 組合せＩタンパク質のそれぞれ20μgで免疫化したモルモットと比べて、疑似 免疫化動物は実験９週間中に全体重の12％を失った（体重は抗原投与直前に対し て正規化された）。組合せＩタンパク質のそれぞれ２μgで免疫化したモルモッ トに比べて、疑似免疫化動物は全体重の11％を失った。従って、低用量の組合せ Ｉタンパク質で経皮免疫化したモルモットは、M．tuberculosisでのエアゾル化 抗原投与後も体重減少から防御された。 同様に、低用量の組合せＩタンパク質で経皮免疫化したモルモットも、M．tub erculosisの脾臓への播種に関連する脾腫から防御された。表Ｏに示すように、 組合せＩのそれぞれのタンパク質20μgまたは2μgで免疫化した動物でそれぞれ 脾臓の重さは4.6±1.2gおよび4.0±0.8g（平均±SE）であったが、疑似免疫化動 物では脾臓の重さは平均9.6±1.8g（表１）、もしくは2倍大きかった。 低用量の組合せＩタンパク質で経皮免疫化したモルモットはまた、脾臓中に、 より少量のM．tuberculosisのCFUを有していた。表Ｐに示すように、疑似免疫化 動物と比較すると、20μgまたは2μgのそれぞれの組合せＩタンパク質で免疫化 したモルモットは脾臓中にそれぞれ平均0.6〜0.4log少ないCFUを有していた。 さらに、組合せタンパク質で皮下的に免疫化したモルモットは体重減少、脾腫 、および脾臓中のM．tuberculosisの繁殖から保護された。実施例14に記載と同 じ実験でも、モルモットは皮下免疫化でなく、20μgの組合せＩタンパク質で4回 、3週間おきに経皮免疫化された。これらの動物は20μgの組合せＩタンパク質で 皮下的に免疫化された動物とほとんど同じ量の抗原投与で防御された。 実施例15 組合せＩおよび組合せIIによる抗原投与に対する 組合せＩおよび組合せII免疫化モルモットの反応 M．tuberculosisの主に豊富な細胞外産物の他の組合せも防御免疫を提供する かどうかを確かめるために、別の実験を行った。１つの実験では、２つの組合せ −組合せＩ（71、32A、30、23および16）および組合せII（32A、30、24、23およ び16）−を含むワクチンで免疫化されたモルモットを利用した。組合せIIは、M ．tuberculosis上清に通常存在する全細胞外タンパク質の62％までで構成される と考えられる。動物（グループ当たり6匹）をSAF中の組合せＩおよびIIの個々の タンパク質100μgで４回、３週間おきに免疫化した。ネガティブコントロールも 同じスケジュールで、同じ容積のSAFおよびバッファーで疑似免疫化した。 実施例12と同様、動物がワクチン接種後測定可能な免疫応答を発現するかどう かを決定するために、動物を皮膚遅延型過敏性について試験した。組合せIIで免 疫化した動物は組合せIIによる皮膚試験に応答して16.8±1.3mm（平均±SE）の 紅斑と12.8±1.2mmの硬化を有し、一方、疑似免疫化動物は組合せIIに応答して わずか1.3±0.8mmの紅斑と0.3±3mmの硬化を有した。従って、組合せIIで免疫化 した動物はコントロールより12倍大きい紅斑と40倍大きい硬化を有した。比較と して、組合せＩで免疫化した動物は組合せＩによる皮膚試験に応答して21.3±2. 0mmの紅斑および15.8±0.1の硬化を有し、一方、疑似免疫化動物は組合せＩに反 応してわずか6.4±0.8mmの紅斑および2.6±0.7mmの硬化を有した。従って、従っ て組合せＩで免疫化した動物はコントロールより3倍大きい紅斑および６倍大き い硬化を有した。組合せIIタンパク質に対するコントロールとの差は、組合せＩ のタンパク質のそれより大きかった。 同じ実験で、より低い用量（各タンパク質20μg対100μg）の組合せIIタンパ ク質で免疫化した動物も、組合せIIに対し強い皮膚過敏性を発現した。上記のよ うに、それらは組合せIIに応答して21.0±2.0mmの紅斑および15.3±0.9mmの硬化 を有し、一方、疑似免疫化動物はわずか1.3±0.8mmの紅斑および0.3±0.3mmの硬 化を有した。従って組合せIIタンパク質のより低い用量で免疫化した動物はコン トロールより16倍大きい紅斑および50倍大きい硬化を有し、その差はより高い用 量の組合せIIタンパク質で免疫化した動物よりむしろ大きい。 実施例16 エアゾル化M．TUBERCULOSISに対する 組合せＩおよびIIワクチンの免疫防御性分析 最終免疫の3週間後、先の過敏性アッセイに使用されたモルモットをエアゾル 化M．tuberculosis、Erdman株で抗原投与し、週１回、７週間体重測定した。実 施例13と同様、各グループ６匹であった。抗原投与後の最初の7週間の間、疑似 免疫化動物は平均19,5ｇの体重が減少した。それに対し、組合せII（各タンパク 質100μg）で免疫化した動物は体重が52.4g増加し、より低い用量（各タンパク 質20μg）で免疫化した動物は平均67.2gの体重が増加した。対照的に、組合せＩ で免疫化した動物は体重が68g増加した。従って、組合せII（100μg）で免疫化 したモルモットと比較して、疑似免疫化動物は全体重の11％を失った。より低い 用量（20μg）の組合せIIで免疫化したモルモットと比べて、疑似免疫化動物は 全体重の14％を失った。組合せＩで免疫化した動物に比べ、疑似免疫化動物はま た全体重の14％を失った。 実施例17 同じワクチンまたはその組合せの抗原投与に対する 組合せIII〜XIIで免疫したモルモットの応答 M．tuberculosis主に豊富な細胞外産物の様々な組合せの有効性を示すため、 さらに実験を行った。これらの実験では、ハートレー型モルモットを実施例２と 同様に精製した２つ以上の主に豊富な細胞外産物を含むワクチンで皮内で免疫化 した。精製した細胞外産物を、SDS-PAGEで測定した見かけの分子量を用いて同定 する。モルモットを以下の組合せの主に豊富な細胞外産物で免疫化した。 組合せ タンパク質組成 III 30＋32A＋32B＋16＋23 IV 30＋32A Ｖ 30＋32B VI 30＋16 VII 30＋23 VIII 30＋71 IX 30＋23.5 Ｘ 30＋12 XI 30＋24 XII 30＋58 組合せワクチンはそれぞれ、表に挙げたタンパク質のそれぞれを100μg含んで いた。組合せワクチンの容量を調節し、アジュバントSAF中で皮内に注射した。 前と同様に、モルモットを４回、３週間ごとに免疫した。 皮膚過敏性アッセイを、組合せIII〜XIIによるワクチン接種後、動物が測定可 能な免疫応答を発現するかどうかを調べるために行った。６匹のモルモットから なる群は背中を剃り、そしてそれらが免疫された精製細胞外産物の同じ組合せを 経皮に注射した。この抗原投与に関して、組合せ中の10μgの各タンパク質を注 射した。注射はすべて、0.1mlの全容量で行った。SAFのみで免疫化した疑似免疫 化コントロールもまた、個々の組合せで各10μgのタンパク質を再使用して、組 合せIII〜XIIで皮膚試験を行った。皮膚試験部位での紅斑と硬化の直径を、実施 例３の記載と同様に注射後24時間に測定した。 これらの測定の結果を以下の表Ｑに示す。データを、従来の方法を用いて決定 された群の平均測定値±標準誤差（SE）に関して報告する。 結果は、精製された細胞外タンパク質の組合せのそれぞれに対して、強い細胞 媒介免疫応答が生じたことを明らかに示す。免疫化モルモットは、すべての組合 せに対し、コントロールよりも少なくとも２倍、そして通常３倍以上の紅斑を示 した。さらに免疫化モルモットは、すべての組合せに対して、コントロールより も少なくとも3倍の硬化を示した。 実施例18 エアゾル化M.TUBERCULOSISに対する組合せIII〜XIIの免疫防禦性分析 精製した細胞外産物のこれらの典型的な組合せの予防効率を示すために、実施 例４のプロトコルを用いて最終免疫化から３週間後に、組合せIII〜XIIで免疫化 モルモットにM.tuberculosisを抗原投与した。 先の結果と一致して、組合せIII〜XIIで免疫化したモルモットはすべて、抗原 投与後の死から防禦された。抗原投与後４週で、組合せIV〜XIIで免疫化した群 の動物は０匹、そして組合せIIIで免疫化した群では６匹の動物の内１匹（17％ ）に比べ、６匹の疑似免疫化動物のうち２匹が死亡した（33％）。抗原投与後10 週で、組合せIXおよびXIIで免疫化した群の動物では死亡０（0％）、組合せIII 、IV、Ｖ、VI、Ｘ、およびXIで免疫化した群の動物では６匹のうち死亡１匹（17 ％）、組合せVIIIで免疫化した動物の５匹のうち死亡１匹（20％）、および組合 せVIIで免疫化した動物の６匹のうち死亡２匹（33％）に比べ、疑似免疫化動物 の50％が死亡した。 観察期間終了以前に死亡したモルモットを剖検し、そして肥大した結核病巣の 形跡を調べた。研究中に死亡したすべての動物で病巣が見つかった。 死亡率研究の結論に従い、生存した動物を炭酸過剰で屠殺し、実施例５のプロ トコルを用いて各動物の脾臓を生存M.tuberculosisについてアッセイした。結果 を疑似免疫化動物に由来する対数の減少と共に、平均コロニー形成単位（CFU） により以下の表Ｒに示す。CFU値の隣のアステリスクは、各群の１匹の動物で脾 臓計数がゼロであったことを示す。計算の目的で、計数ゼロは、脾臓あたり103C FUまたは３logとして扱った。 組合せIII、IV、VI、VII、IX、Ｘ、XIおよびXIIで免疫化した動物は、疑似免 疫化コントロールよりも、平均して少なくとも0.5 log少ないコロニー生成単位 のM.tuberculosisを脾臓中に有していた。特に、組合せIVおよびVIIは、コロニ ー形成単位の平均数がほぼ10倍減少し、特に有効であることが分かった。組合せ ＶおよびVIIIで免疫化した動物は、疑似免疫コントロールよりも、平均してそれ ぞれ0.3および0.1 log少ないコロニー形成単位（CFU）を脾臓中に有していた。 本発明の教示に従って免疫化動物におけるコロニー形成単位のこの劇的な減少は 、本発明が免疫防禦に実施できることを、再度示す。 実施例19 組合せXIIIでの抗原等よに対する組合せXIIIの３つの異なる投与量で 免疫化したモルモットの応答 本発明の実施可能性および範囲をさらに定義すると共に、精製細胞外産物のさ らなる組合せるの効率を示すために、別のワクチン接種投与量を用いて、前と同 じようにモルモットを免疫化した。特に、３つの主に豊富な細胞外産物の別な組 合せの50μg、100μgおよび200μgが、組合せXIIIと同定され、そして30KD、32( A)KDおよび16KDのタンパク質を含んだ。先の実施例と同じく、動物群を、４回、 ３週間毎に、SAF中の組合せXIIIで別の投与量で皮下で免疫化した。 動物が、ワクチン接種後、測定可能な免疫応答を発現するかどうかを決めるた めに、皮膚過敏性アッセイを行った。動物の背中を剃り、そして精製した細胞外 産物の10.0μgのそれぞれを含む組合せXIIIで皮内に注射した。注射はすべて、0 .1mlの全容量を用いて行った。疑似免疫化コントロールもまた、組合せXIIIの同 じ投与量で試験した。皮膚の試験部位の紅斑と硬化の直径を注射後24時間で測定 した。 結果を、従来の方法を用いて決定した群の平均測定値±標準誤差（SE）で以下 の表Ｓに示す。 これらの結果は、組合せXIIIの３つの投与量のそれぞれで免疫化した動物で、 組合せXIIIに対する強い細胞媒介免疫応答が生じたことを、再度、明らかに示す 。免疫化動物は、コントロールの紅斑の約２〜３倍の紅斑を示した。さらに衝撃 的なことに、すべての場合で最低限の応答を示したコントロール動物に対し、免 疫化動物は少なくとも35倍の硬化を示した。 実施例20 エアゾル化M.TUBERCULOSISに対する３つの異なる投与量での 組合せXIIIの免疫防禦分析 様々の投与量における本発明のワクチンの防禦免疫特性をさらに示すために、 先の皮膚過敏性アッセイに用いた免疫化モルモット（群あたり６匹）に、最終免 疫化から３週間後にエアゾル化M.tuberculosisを抗原投与した。エアゾル化抗原 投与は実施例４に詳細に記したプロトコルを用いて行った。コントロール群の12 匹の疑似免疫化動物にも同時に抗原投与した。 抗原投与後の各週の体重測定の結果を図10に示す。これは、組合せXIIIの３つ の投与量のそれぞれで免疫化したモルモットは、明らかに体重減少から防禦され たことを示す。組合せXIIIのより高い投与量（100および200μg）で免疫化した 動物は、実際、正味の体重が増加し、そしてより低い投与量（50μg）で免疫化 した動物は体重減少が比較的少ないことを示した。対照的に、疑似免疫化動物は 、抗原投与直後の数週間でその全体重が約22％減少し、そして10週の観察期間中 、平均して182gの減少であった。 以下の表Ｕは、抗原投与終了後の平均体重を測り、抗原投与開始時の平均体重 を差し引き、そしてその結果を抗原投与開始時の体重で割った、免疫化動物およ びコントロール動物に対する体重変化パーセントを示す。同様に、防禦パーセン トを、コントロールの平均体重減少パーセントを免疫化動物の平均体重の増加ま たは減少パーセントから差し引いて求めた。 表Ｕは、疑似免疫化動物は、モニター期間中、免疫化動物に比べて、相当量の 体重の減少（18〜29％）を示す。図10は、10週間のモニター期間にわたる１週間 毎の間隔でプロットした、疑似免疫化動物に対する免疫化動物の各群の正味の体 重減少のより図式化された表示を提出する。体重減少または「消耗」は結核の古典 的な副作用の一つであるので、これらの結果は、免疫化動物での結核菌の成長お よび増殖が、本発明の典型的な組合せワクチンの３つの異なる投与量で阻害され たことを示す。 実施例21 組合せXIV〜XVIIIの抗原投与に対する組合せXIV〜XVIIIの免疫防禦分析 本発明の範囲と、その教示により調合され得る有効ワクチンの広い範囲を示す ため、さらに５つの組合せワクチン（組合せXIV〜XVIII）をモルモットで試験し た。SDS-PAGEを用いて決定した精製細胞外産物の見かけの分子量により同定し、 各組合せワクチンの組成を以下の表に示す。 組合せ タンパク質組成 XIV 30、32A、16、32B、24、23、45 XV 30、32A、16、32B、24、23、45、23.5、12 XVI 30、32A、16、32B、24、23 XVII 30、32A、16、32B、24、71 XVIII Ｉ 30、32A、16、23、71 新しい組合せワクチンおよび適切なコントロールに加えて、組合せＩもまた、 このシリーズの実験に用いた。モルモットを、組合せXIVまたはXVの各タンパク 質50μg、および組合せＩ、XVI、XVIIおよびXVIIIの各タンパク質100μgで、す べてSAFアジュバント中、皮内で免疫化した。動物は、合計４回、各注射を３週 間おきに免疫化した。 皮膚過敏性アッセイを、先に議論したプロトコルを用いるワクチン接種後、動 物が測定可能な免疫応答を発現するかどうかを決めるために行った。モルモット の背中を剃り、そして免疫される精製細胞外タンパク質の同じ組合せを皮内に注 射した。各抗原投与について、10μgの各タンパク質を含有する適切な組合せワ クチンを注射した。注射はすべて、0.1mlの全容量を用いて行った。疑似免疫化 コントロールもまた、各組合せの同じ抗原投与量で皮膚試験した。実施例３の記 載の通りに、皮膚試験部位での紅斑および硬化の直径を注射後24時間で測定した 。 これらの測定結果を以下の表Ｖに示す。これは、従来の方法を用いて決定され る群の測定値±標準誤差（SE）で報告される。 これらの結果は、明らかに、組合せXIV〜XVIII、および前述のように組合せＩ に対して強い細胞媒介免疫応答が生じたことを示す。免疫化動物は、コントロー ルの紅斑の約２倍の紅斑を示した。さらに衝撃的なことに、免疫化動物は、すべ ての場合で最低限の応答を示した疑似免疫化コントロールよりも少なくとも10倍 大きい硬化を示した。 実施例22 エアゾル化M.TUBERCULOSISに対する 組合せXIV〜XVIIIおよび組合せＩの免疫防禦分析 実施例21の組合せワクチンの免疫応答性を確認し、そして感染性結核への適用 性を示すために、先の皮膚過敏性アッセイに使用した免疫化モルモットに、最終 免疫化から３週間後にエアゾル化M.tuberculosisを抗原投与し、そして実施例４ のプロトコルを用いてモニターした。実施例20で用いたと同じ12匹の疑似免疫化 動物のコントール群にも同様に抗原投与した。これらの抗原投与の結果を図11に グラフで示し、以下の表Ｗに直接示す。 抗原投与終了後の平均体重を測り、抗原投与開始時の平均体重を差し引き、そ してその結果を抗原投与開始時の体重で割った、免疫化動物およびコントロール 動物に対する体重変化パーセントを示す。同様に、防禦パーセントを、コントロ ールの平均体重減少パーセントを免疫化動物の平均体重の増加または減少パーセ ントから差し引いて求めた。 表Ｗに示すように、各組合せワクチンで免疫化したモルモットは体重減少から 防禦された。疑似免疫化動物は、全合計体重の約22％を失った。対照的に、組合 せワクチンの予防効果は、試験群の一つで実際に体重が増加し、そしてその他で は体重が減少する結果となった。特に、組合せXIVで免疫化した動物は、３％の 体重増加を示し、一方、他の組合せで免疫化した動物は、その全合計体重のわず か4〜15％を失った。 結果をグラフで図11に示す。これは、エアゾル抗原投与後、各群の動物の正味 の体重の増加および減少に関して、週毎の体重測定をプロットする。図11に示さ れた、免疫化動物と疑似免疫化コントロールとの統計的に有意な差は、本発明の 組合せワクチンにより発現した免疫予防応答に対するさらなる証拠を提供する。 実施例23 ３つの異なるアジュバントで免疫化したモルモットにおける細胞媒介免疫 本発明のワクチン処方の広い適用性および多様性をさらに示すために、異なる アジュバントを用いて免疫原性研究を行った。特に３つの異なる免疫原（精製さ れた30KDタンパク質、組合せＩ（30、32A、16、23、71）および組合せXIII（30 、 32A、16））を、それぞれ、３つの異なるアジュバント（シンテックス（Syntex ）アジュバント製剤Ｉ（SAF）、不完全フロイントアジュバント（IFA）およびモ ノホスホリルリピッドＡ含有アジュバント（MPL））を用いて処方した。このよ うなアジュバントは、一般に、免疫原と一緒に投与された場合、生物の免疫応答 を増強することが知られている。 モルモットを、100μgの各タンパク質含有の組合せＩおよびXIII、および３つ の異なるアジュバント処方物において、約100μgの精製した30KDタンパク質で免 疫化した。モルモットを、各処方物で３回、３週間おきの注射で免疫化した。 免疫化後、モルモットが測定可能な免疫応答を発現したかどうかを決めるため 、皮膚過敏性アッセイを行った。モルモットの背中を剃り、そして免疫したもの と同じ免疫原を皮内に注射した。抗原投与のため、組合せＩおよびXIII中の各タ ンパク質I0μg、または精製した30KDタンパク質10μgを、100μlの全容量で注射 した。３つのアジュバントのうちの１つで疑似免疫化したモルモットを、同じア ジュバントを含むそれぞれの免疫原製剤で皮膚試験した。皮膚試験部位での紅斑 と硬化の直径を、実施例３の記載の通りに、抗原投与後24時間に測定した。 これらの測定の結果を以下の表Ｘに示す。先に議論したように、データは認め られた統計的手法を用いて群の測定値±標準誤差で報告される。 表Ｘに提示されたデータが示すように、本発明の組合せワクチンおよび精製細 胞外産物は、異なるアジュバントで処方された場合、強い細胞媒介免疫原応答を 提供する。さらに、３つのアジュバントのそれぞれは、それぞれの免疫原に対し 同じ免疫原性応答を提供する。一般に、免疫モルモットは疑似免疫モルモットの それの約7〜10倍の紅斑直径を示したが、硬化はコントロール動物で測定された ものより約4〜6倍大きかった。 異なるアジュバントと組合せて強い免疫原性応答を誘発する本発明の能力は、 ワクチンの最適化を促進する。すなわち、本明細書の教示に従って有効なワクチ ン処方物を製造するために使用されるアジュバントは、主として、例えば、安定 性、副作用がないこと、コストおよび貯蔵し易さの２次的な基準の考慮に基づい て選択される。免疫応答の刺激に直接関連しない、これらおよび他の基準は、比 較的初期の条件で広範囲に使用されるワクチン製剤を開発する場合、特に重要で ある。 実施例24 組み合せXIX〜XXVIIIの抗原投与に対する組み合せXIX〜XXVIIIの免疫防御性分析 本発明の広い適用範囲は、さらに10種の組み合せワクチン、組み合せXIX〜XXV IIIを用いる免疫応答の発生によって示される。新しい組み合せワクチンと適切 なコントロールに加えて、モルモットに免疫応答を誘起するための陽性対照とし て組み合せIVとXIIIも使用された。SDS-PAGEを用いて測定された精製細胞外産物 の見かけの分子量で同定して、組み合せワクチンそれぞれの組成は以下のように なる。 組み合わせ タンパク質構成物 XIX 30,32A,23 XX 30,32A,23.5 XXI 30,32A,24 XXII 30,32A,71 XXIII 30,32A,16,23 XXIV 30,32A,16,23.5 XXV 30,32A,16,24 XXVI 30,32A,16,71 XXVII 30,32A,16,32B XXVIII 30,32A,16,45 IV 30,32A XIII 30,32A,16 モルモットを合計4回、それぞれの注射を3週間間隔で免疫化した。動物を免疫 するために使用された各組み合せワクチンは、SAFアジュバント中で各タンパク 質100μgでなり、全容積0.1mlであった。 実施例3で議論されたプロトコルを用い、選ばれた組み合せワクチンを用いた ワクチン接種後に動物が測定可能な免疫応答を生じたかどうか決めるために皮膚 過敏性アッセイを行った。モルモットの背中を剃り、それらを免疫したものと同 じ精製細胞外タンパク質の組み合せで経皮注射を行った。動物に抗原投与するた めに用いられたタンパク質の組み合せは、各タンパク質10μｇで構成された。疑 似免疫対照も、各組み合せの同じ投与量で皮膚試験された。実施例3と同様、皮 膚試験部位での紅斑と硬化の直径を、注射後24時間で測定した。 これらの測定の結果を以下の表Yに示すが、各グループの動物に対する平均測 定値±標準誤差で表されている。 表Yに示された結果は同じ免疫原を抗原投与した場合、組み合せXIX〜XXVIIIに 対し強い細胞媒介免疫応答が生じたことを明らかに示している。前と同様、組み 合せIVおよびXIIIによっても強い細胞媒介免疫応答が誘発された。免疫モルモッ トが示す紅斑は、対応する疑似免疫対照動物で引き起こされる反応よりも少なく とも2倍、一般には４倍およびそれ以上であった。同様に、免疫動物が示す硬化 は非免疫対照のそれより少なくとも2倍、一般には3〜4倍大きかった。本発明 の教示に従って免疫された動物で生じた相当強い免疫応答は、再び本発明の組み 合せワクチンの免疫防御の有用性を示す。 当業者はまた、本発明のワクチンと方法のさらなる利点を理解する。例えば、 高度に精製された分子種のそれぞれの化合物または選ばれた組み合せは、バクテ リア全体またはその成分よりもむしろ目的のワクチンに使用され、従来技術の弱 毒化または殺したバクテリアのワクチンと比較すると、本発明のワクチンは毒性 反応をより誘起しにくいと考えられる。その上、本発明の分子ワクチンは免疫無 防備の個体に対して生命の危険がない。実際、本発明の組成物は感染個体で病原 体に対し、指向された免疫応答を刺激するために治療目的で使用される。 主に豊富な細胞外産物またはその免疫的アナログを選択的に使用することはま た、細胞内バクテリアの病原性を増加させ得るオプソニン化体液性反応の発症を 防止する。本発明で生じる防御的免疫は非結合タンパク質を指向しているので、 寄生バクテリアの包含を促進するよりもむしろ、オプソニン反応は単に食菌作用 と主に豊富な細胞外産物の分解となる。その上、精製細胞外産物を選択的に使用 することは、免疫原性試薬の宿主認識に基づいた広く使用されているスクリーニ ングおよびコントロール手法の使用を排除する反応の発生可能性を低減する。従 来技術のワクチンと異なり、病原体で発現しているが本発明により製造されたワ クチンには含まれていない免疫応答性分子を用いてスクリーニング試験をなお行 うことができる。このような免疫原決定因子を用いることは、標的病原体に曝さ れたこれらの個体で応答を誘起するのみであり、適切な対抗策を取ることを可能 にする。 本発明の別な利点は、従来技術のワクチンの弱毒化バクテリアまたはバクテリ ア成分と対照的に、精製された細胞外産物は大量に容易に得られ、そして周知の 技術を用いて容易に単離されることである。本発明のこのような免疫応答産物は 、ほとんどの目的の生物の周辺媒体中へ自然に放出されるため、細胞内不純物お よび細胞破片の除去は簡単になる。さらに最も重要または主に豊富な細胞外産物 、またはその免疫的アナログは所望の免疫応答を刺激するために使用されるので 、収穫できる産物の発現レベルおよび培養濃度は一般に、ほとんどの生産システ ムで上昇する。従って、どのような形式の生産を採用しても、所望の生成物の大 ス ケールの単離は、クロマトグラフィーまたは超濾過等の日常的な生化学手法で容 易に行われる。本発明で使用される免疫原決定因子の固有の属性および分子の特 性は、大スケールで用いるための調和、標準化、高品質の組成物の製造を大いに 促進する。 あるいは、標的病原体の最も重要な、または主に豊富な細胞外産物の免疫的性 質に基づく精製分子化合物を使用することはまた、本発明の免疫活性ワクチン成 分の大スケール合成を比較的容易にする。例えば、目的の細胞外産物またはその 免疫的アナログは組換えDNA技術を用いて非病原性宿主バクテリア中にクローン され得、そして安全に収穫され得る。当該分野で周知の分子クローニング技術を 、Escherichia coli等の宿主バクテリア中に挿入するための選択された高度発現 ベクター中の目的の細胞外産物、そのアナログまたは任意のセグメントに対応す るDNAを単離し発現するのに用いることができる。代表的な技術は、II R．Anon 、合成ワクチン（Synthetic Vaccines）31〜77頁、1987年；Tamら、「化学的に定 義された抗マラリア合成ワクチン中のサーカムスポロゾイトタンパク質のTおよ びBエピトープの取り込み（Incorporation of T and B Epitopes of the Circum sporozoite Protein in a Chemically Defined Synthetic Vaccine Against Mal aria）」、J．Exp．Med.，171:299〜306、1990；およびStoverら、「外表面タン パク質A（OspA）リポタンパク質を発現する組換えカルメット-ゲラン型結核菌（ BCG）で誘発される防御免疫性：ライム病ワクチンの候補物（Protective Immuni ty Ellcited by Recombinant Bacille Calmette-Guerin（BCG）Expressing Oute r Surface Protein A（OspA）Lipoprotein: A Candidate Lyme Disease Vaccine ）」、J．Exp．Med．178:197〜209、1993に見出される。 同様に、細胞外タンパク質、そのアナログ、ホモログ、または免疫応答性タン パク質サブユニットを普通の実験室技術および自動配列決定技術を用いて、比較 的純粋な形で、大スケールで化学的に合成できる。この生産法は細胞外産物の抗 原決定因子のペプチドサブユニットまたは低分子量アナログの構築に特に魅力的 である。タンパク質の小さいサブユニット製造のための典型的な技術は当該分野 で周知であり、II R．Anon、「合成ワクチン」、15〜30頁、1987年、およびA．Str eitwieser，Jr.,「有機化学入門（Introduction to Organic Chemistry）」、953 〜55頁、1985年（第3版）に見出される。別の技術は、Grossら、「ペプチド結合 の非酵素的切断：ウシ膵臓リボヌクレアーゼ中のメチオニン残基（Nonenzymatic Cleavage of Peptide Bonds: The Methionine Residues in Bovine Pancreatic Ribonuclease）」、The Journal of Biological Chemistry、237(6)1962；Maho ney、「o-ヨードソ安息香酸によるトリプトファンペプチド結合の高収率切断（Hi gh-Yield Cleavage of Tryptophanyl Peptide Bonds by o-Iodosobenzoic Acid ）」、Biochemistry 18(17)1979; およびShoolnikら、「Gonococcal Pili」、Journ al of Experimental Medicine 159，1984に見出される。ペプチド、ヌクレオチ ドまたは擬体等の他の分子を用いる抗イディオタイプまたは指向性分子進化等の 免疫原技術も、所望の予防反応を生じる有効な免疫応答性化合物を生成するため に用いることができる。 本発明の実施に有用な核酸分子は、種々のベクターにより発現され得る。これ らのベクターには、例えばヘルペスウイルスベクター（例えば米国特許第5、288、 641号）、レトロウイルス（例えばEPO、415、731号；WO第90/07936号；WO第91/028 5号；WO第94/03622号；WO第93/25698号；WO第93/25234号；米国特許第5、219、740 号；WO第89/09271号；WO第86/00922号；WO第90/02797号；WO 90/02806号；米国 特許第4,650,764号；米国特許第5、124、263号；米国特許第4、861、719号；WO第93/ 11230号；WO第93/10218号；VileおよびHart、Cancer Res.、53:3860〜3864、199 3；VileおよびHart、Cancer Res．53:962〜967、1993；Ramら、Cancer Res．53: 83〜88、1993年；Takamiyaら、J．Neurosci．Res．33:493〜503、1992；Babaら 、J．Neurosurg．79:729〜735，1993）、プソイドタイプウイルス、アデノウイ ルス（例えばWO第94/26914号；WO第93/9191号；Kollsら、PNAS 91(1):215〜219 、1994；Kass-Eislerら、PNAS 90(24):11498〜502、1993；Guzmanら、Circulati on88(6):2838〜48頁、1993年；Guzmanら、Cir．Res．73(6):1202〜1207、1993； Zabnerら、Cell 75(2)：207〜216、1993；Liら、Hum．Gene．Ther．4(4)：403〜 409、1993；Caillaudら、Eur．J．Neurosci．5(10)：1287〜1291，1993；Vincen tら、Nat．Genet．5(2)：130〜134、1993；Jaffeら、Nat．Genet．1(5)：372〜3 78、1992；およびLevreroら、Gene 101(2)：195〜202、1991）、アデノウイルス 関連ウイルスベクター（Flotteら、PNAS 90(22)：10613〜10617、1993）、パル ボウイルスベクター（Koeringら、Hum．Gene Therap．5：457〜463、1994）およ びポックスウイルスベクター（PanicaliおよびPaoletti、PNAS 79:4927〜4931、 1982）が挙げられる。 核酸分子（またはベクター、すなわち関連するシーケンスの発現を指向し得る アセンブリ）は、様々な機構で宿主細胞中に導入され得る。これらの構造には、 例えば、トランスフェクション(例えば、死滅アデノウイルスに連結したDNA(Mic haelら、J．Biol．Chem．268(10):6866〜6869、1993；およびCurielら、Hum．Ge ne Ther．3(2):147〜154、1992)、シトフェクチン媒介導入(DMRIE-DOPE、Vical 、Calif.)、直接DNA注入(Acsadiら、Nature、352:815〜818、1991)、DNAリガン ド(Wuら、J．Biol．Chem．264:16985〜16987、1989)を含む）；リポフェクショ ン(Felgnerら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:7413〜7417、1989）；リポソー ム(Pickeringら、Circ．89(1):13〜21、1994；およびWangら、PNAS 84:7851〜78 55、1987)；ミクロ弾丸爆撃(Williamsら、PNAS 88:2726〜2730、1991)；および 酵素それ自体をコードする核酸を単独(VileおよびHart、Cancer Res．53:3860〜 3864、1993）またはPEG−核酸複合体を利用する直接送達(WO第93/18759号；WO第 93/04701号；WO第93/07283号およびWO第93/07282号参照）が挙げられる。 さらに別な方法として、本発明の1個以上の細胞外産物、アナログ、ホモログ 、またはサブユニットの発現を誘発し得る1個以上の遺伝子をコードするDNAまた は他の遺伝物質を、いわゆる「裸のDNA」手法を用いて哺乳動物宿主中へ直接注入 し得る。インビボ導入とその結果の宿主細胞による遺伝構成の取り込み後、宿主 は、1個以上のコードされた免疫応答産物の内因性生産を開始し、その後の抗原 投与に対し有効な免疫応答を引き起こす。当業者が認識するように、遺伝構築物 を眞核プロモーター配列および／または分泌シグナルとカップリングすることに より、コードされた免疫応答産物（単数または複数）の内因性発現およびその結 果としての分泌を促進する。裸のDNAをワクチンとして利用するための典型的な 技術は、国際特許WO第9421797号（Merck & Co．Inc.およびViCal Inc.）、国際 特許出願WO第9011092号（ViCal Inc.）、およびRobinson、「ヘマグルチニン発現 プラスミドDNA免疫による致死インフルエンザウイルス抗原投与に対する防御（P rotection Against a Lethal Influenza Virus Challenge by Immunization wit h a Hema gglutinin-Expressing Plasmid DNA）」、Vaccine 11:9、1993、およびUlmerら、「 ウイルスタンパク質をコードするDNAの注射によるインフルエンザに対する異種 防御（Heterologous Protection Against Influenza by Injection of DNA Enco ding a Viral Protein）」、Science 259、1993（本明細書に参考として援用され る）に見出される。 あるいは、強い免疫原性タンパク質末尾の融合技術がTaoら、「B−Ceoリンパ腫 ワクチンとしてのイディオタイプ／顆粒球−マクロファージコロニー刺激基因子 融合タンパク質（Idiotype/Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Facto r Fusion Protein as a Vaccine for B-Ceo Lymphoma）」、Nature 362,1993に開 示されており、そしてT細胞エピトープマッピングの技術については、Goodら、 「Plasmodium falciparumサーカムスポロソイトタンパク質のヒトT細胞認識：分 子の多形領域の免疫優性T細胞ドメインマップ（Human T-Cell Recognition of t he Circumsporozoite Protein of Plasmodium falciparum: Immunodominant T-C ell Domains Map to the Polymorphic region of the Molecule）」Proc．Natl ．Acad．Sci．USA 85、1988およびGaoら、「インフルエンザAウイルス中のヌク レオプロテインヘルパーエピトープの同定とキャラクラリゼーション（Identifi cation and Characterization of T Helper Epitopes in the Nucleoprotein of Influenza A Virus）」J．Imm．143(9)、1989に開示されている。 多くのバクテリア属は相同性を示すので、先に述べた実施例は説明のために提 供されるものであって、本発明の範囲と内容を制限したり、本発明をMycobacter ium属、または特定の種またはその血清グループまたは結核ワクチンのみに限定 するものではない。微生物のDNAおよび対応するタンパク質における種間相同性 が一般的であることは、本発明のワクチンが交差反応免疫を誘導し得ることを再 度強調しておく。主に豊富な細胞外産物の免疫優性エピトープは、他の血清グル ープおよび選ばれた属の抗原投与に対して交差防御免疫を与えるので、ある種を 指向するワクチンを細胞外産物または他の種の免疫原性同族体を用いて開発し得 ることは、当業者が認めるところである。 例えば、M．bovisはM．tuberculosisと90〜100％の間で相同であり、免疫応答 を誘起する点で高度に交差応答性を有する。従って、M．bovisまたは他のMycoba cteriumの主に豊富な細胞外産物に基づくワクチンは、M．tuberculosisによる感 染に対し種々の程度の防御を提供し、またその逆でもある。従って、適切な主に 豊富な細胞外産物の高度に相同である免疫原性決定因子を用いて、同じ属の数種 のバクテリア種に対する免疫防御反応を提供することは、本発明の範囲内にある ことが意図される。 本発明を実施するために選ばれた免疫原性決定因子は、有効な防御性または免 疫診断免疫応答を誘発するために多くの異なった形で使用され得ることもまた強 調されるべきである。従って、宿主免疫系に対する選ばれた主に豊富な細胞外産 物の１個以上の免疫原性決定因子の提示法は重要でなく、生産または投与を促進 するために変更し得る。例えば、本発明のワクチンは全細胞外生成物またはペプ チド、タンパク質サブユニット、上記免疫原性アナログおよびホモログを含む任 意の免疫刺激性分画を用いて製剤してもよい。本発明の教示によれば、M．tuber culosisの主に豊富な細胞外産物の有効なタンパク質サブユニットは、哺乳動物 種の遺伝的に多様な分布中に同定できる。その結果、同定された免疫優性T細胞 エピトープはヒトおよびウシを含む他の哺乳動物で認識されなければならない。 これらの免疫優性Ｔ細胞エピトープは従って免疫診断試薬のみならずワクチンと しても有用である。M．tuberculosisの30KD主要分泌タンパク質の免疫優性T細胞 エピトープを同定する典型的な研究は、以下のように行われた。 実施例25 30KDタンパク質の免疫優性エピトープマッピング 未変性30KDタンパク質全体をカバーし、そして10アミノ酸でオーバーラップし ている55個の合成ペプチド（15量体）を、M．tuberculosis 55の30KD主要分泌タ ンパク質の免疫優性T細胞エピトープを同定するための脾臓リンパ球増殖アッセ イに用いた。使用したそれぞれの15量体合成ペプチドの配列を、図12aおよびbの 抗原ペプチド配列番号、およびアミノ酸残基の同定および各配列の相対位置に対 応する同定番号（1−55）と組み合せて以下に示す。 SAF中にエマルジョン化した100μgの精製30KDタンパク質で3〜4回、経皮免疫 した非近交系オスハートレ（Hartley）系モルモット（Charles River Breeding Laboratories）から脾臓リンパ球を得た（AllisonおよびByars，1986年）。対照 動物にはSAF中のリン酸緩衝液−生理食塩水を投与した。上記のように細胞媒介 免疫応答を皮膚試験で評価した。リンパ球を96ウェル組織培養プレートに接種し （Falcon Lanware）、そして20μg・ml-1の合成15量体ペプチド、20μg・ml-1の精 製30KDタンパク質、20μg・ml-1の精製タンパク質誘導体[（PPD）；Connaught La boratories LTD]、または10μｇ・ml-1のコンカナヴァリンAと、I0Uのポリミキシ ンBの存在下に２日間、３重でインキュベートした。続いて細胞を16時間、１μC iの[3H]チミジン(New England Nuclear)で標識し、その後収穫した（Breimanお よびHorwitz、1987年）。陽性増殖反応を以下のように定義した：（抗原のdpm） −（培地のdpm）≧1500および（抗原のdpm）／（培地のdpm）≧1.2。精製M．tub erculosisの30KDタンパク質で免疫したモルモットの25％以上に認識された免疫 優性エピトープを以下の表Zに示し、そして図12aおよび12bにグラフ表示する。 表Zに示す結果は、M．tuberculosisの30KD主要分泌タンパク質の免疫優性T細 胞エピトープを同定する。当業者は、先行研究者がM．tuberculosisタンパク質 と高度に関連するM．bovisの30KDタンパク質を研究していたことを理解するであ ろう。しかしながら、これらのM．bovisタンパク質の先行研究は、先行技術が実 際のタンパク質、BCGワクチン、結核患者、またはPPD陽性個体を研究していた点 で、従来技術の研究と明らかに異なる。このような個体でのこのタンパク質に対 する反応はしばしば弱いので、従来技術のエピトープマッピング研究は困難で、 精度に疑問がある。対照的に、実施例25の研究は精製タンパク質で免疫した非近 交系モルモットを利用しており、そのため免疫系はこの単一タンパク質に集中し ており、極めて強い細胞性免疫応答を生じる。その上、これらのモルモットは免 疫から数週間以内 − T細胞反応性のピーク時 − に調べられた。 本発明の教示によれば、上記同定された免疫優性エピトープの一つ、またはそ れ以上は、結核に対するワクチンに取り込まれ得る。例えば、個々の免疫優性エ ピトープを、多重抗原ペプチド系中で単独または組み合せて合成し使用すること ができる。あるいは、２つ以上の免疫優性エピトープを化学的に連結することも できる。連結されていても単独であっても。ペプチドは、適切なアジュバントと 組み合せることができ、そしてヒトまたは他の哺乳類に対するサブユニットワク チンで使用することができる。その上、免疫優性エピトープを新規皮膚試験等の 新規免疫診断試薬に使用することもできる。 当業者はまた、ペプチドをコードするDNAを単独または集合でペプチドを発現 するために合成し使用することができ、またはヒトまたは他の哺乳類に直接注射 されたDNAワクチンと組み合せることもできることを理解するであろう。免疫原 性エピトープ（またはそれをコードするＤＮＡ）のみでなる構築物は、分子の保 護部位上の免疫応答に集中する。無関係または免疫抑制エピトープを避けること で、このような構築物はより強く、かつうより防御的な免疫応答を誘発し得る。 主に豊富な細胞外産物のより小さいサブユニット、そのアナログ分子、それを コードする遺伝子、およびそれらのそれぞれの組み合せは、それらが有効な免疫 防御性または免疫診断試薬としての機能を発揮するかぎり本発明の範囲にある。 さらに、融合タンパク質または公知の分子組換え技術で修飾された細胞外産物等 の組換えタンパク質産物は、本発明の教示と完全に両立し得る。その上、選ばれ た免疫活性決定因子またはペプチドの免疫原性的に生成したアナログ、および指 向性進化を用いて誘導されたヌクレオチドも、本発明の範囲内である。さらに、 選ばれた免疫活性決定因子を、ヒトまたは他の種の特異的MHC分子とより強固に 結合する様に、または抗体表示細胞によりより有効に表現される様に修飾するこ とができる。そのうえ、選択された免疫活性決定因子を、ワクチン接種宿主の分 解に抵抗する様に修飾することもできる。 同様に、免疫原性試薬の調剤と宿主免疫系への表示は、アジュバント中のタン パク質またはそのアナログの溶液に限られない。例えば、適切な細胞外タンパク 質から誘導される免疫原性決定因子は、非病原性であり組換え技術で修飾された Ｍ．tuberculosis、Mycobacteriaの異なった株、バクテリア、ファージ、マイコ プラズマまたはウイルスの異なった株で発現され得る。この場合、所望の反応を 刺激するために生き微生物全体を製剤し使用することができる。逆に悪環境中で の大量ワクチン接種計画には、面倒なアジュバントまたは添加剤なしできわめて 安定な製剤が要求される。さらにワクチン製剤は、凍結乾燥、経口投与、カプセ ル化等の過酷な条件に曝される場合、活性成分の安定性または免疫応答性を促進 することを目的とすることができる。従って、本発明は、製品の意図される使用 に依存して、目的のワクチンを含む免疫原性決定因子のきわめて異なった製剤を 包含する。 当業者は、ワクチンの投与量が日常の実験を用いて各病原体と宿主について決 められなければならないることを理解するであろう。現在のところ、実際的な最 低投与量は0.1μg〜2.0μgであり、20.0μg、100μgおよび1mgでさえ適切な系で は最適であり得る。適切な投与量を、当該分野で公知の従来の免疫技法および手 順で投与することができる。 実施例26 組み換え30kDaタンパク質の発現 成熟30kDaタンパク質の発現のために、30kDaタンパク質をコードする遺伝子を 、成熟タンパク質のイニシエーターであるフェニルアラニンを、pET22b中のNcoI 部位またはpelBリーダ配列のカルボキシル末端に人工的に挿入されたグリシン残 基に融合するように操作した（Novagen，Madison，WI）；図13を参照のこと）。 こ のストラテジーは、成熟30kDaタンパク質が容易に放出され得る融合分子を提供 し、そして４時間にわたって比較的に大量の組み換え30kDaタンパク質の発現を 誘導する。その後、組み換えタンパク質の発現はプラトーに達した。組み換え分 子の発現は、細菌培地に重要な有害な影響を示すことなく８時間まで持続した。 1リットルのE．coli培養物からの代表的な収量は約50mgであり、全菌体タンパク 質の25％に達した。 組み換え30kDaタンパク質のその全長または切り出しバージョンでの発現を達 成するために、pET22b中の構築物を1mMのイソプロピル-b-D-チオガラクトピラノ シド（IPTG）での誘導の際にE．coli BL21（DE3）pLysS中で発現させた。誘導培 養物中のサンプルを１時間毎に８時間まで採取し、培地上清のアリコートおよび 細胞ペレットを12.5％変性ポリアクリルアミドゲル上に展開し、そしてクマシー ブリリアントブルーRで染色した。全てのクロマトグラフィー工程で緩衝液に８ Ｍの尿素を加えた以外はHorwitzら（「Mycobacterium tuberculosisの主要細胞外 タンパク質でのワクチン接種により誘導される、結核に対する防御免疫」、Proc ．Natl．Acad．Sci．USA.92：1530-1534，1995）により記載されるように、組み 換えタンパク質を精製した。精製した組み換えタンパク質をリン酸緩衝化生理食 塩水に対し透析し、可溶性のまま保持した。 成熟30kDaタンパク質を、それ自体のまたはpelBリーダーペプチドをコードす るプラスミドでのいずれかでpET22bベクター中で発現させた。細胞ペレットの電 気泳動の結果を図14に示す。レーンＡおよびＢは、pelBリーダーDNA配列（A）に 融合された成熟30kDaタンパク質遺伝子を有するpET22ベクター、および全長30kD aタンパク質遺伝子（B）を含むpET22bを有する細菌のIPTG誘導の際のクマシー染 色タンパク質抽出物を示す。レーンＣは対照として、M．tuberculosis培地濾過 液から単離した成熟30kDaタンパク質を示す。レーンＤ、Ｅ、およびＦは、抗30/ 32A-BkDa複合体特異性抗体でプローブしたＡ、Ｂ、およびＣと同様に、同じタン パク質のウエスターンブロット分析を示す。レーンＧは、pET22bベクターのみを 有するE．coli培養物からのタンパク質抽出物を、同じ抗体でプローブした。全 長および成熟30kDaタンパク質の位置はそれぞれ30Ｗおよび30Ｍで示され、これ らの組み換えタンパク質はそれらの最初の５または７個のＮ末端アミノ酸により さらに同定される。左側の番号はkDa単位の分子量標準である。 実施例27 MYCOBACTERIUM SMEGMATISおよびMYCOBACTERIUM VACCAE中の プラスミドpSMT3を用いる、可溶性のプロセスされた 細胞外M．TUBERCULOSIS 30kDa主要分泌タンパク質の発現 この実施例は、Mycobacterium中のM．tuberculosis 30kDa主要分泌タンパク質 の発現および分泌を示すことを目的とする。本発明者らは、pSMT3プラスミド（D ouglas B．Young博士、Dept．Medical Microbiology、St．Mary's Hospital Med ical School、Norfolk Place、London、W21PG、英国）、E．coli（カラムEl ori ）およびmycobacterium（Mycobacterium fortuitum プラスミドpAL5000 ori）の 両方の複製起点を有する5.7kb（キロベース対）プラスミド、ハイグロマイシン 耐性マーカー、hps60プロモーター（Mycobacterium bovis BCGヒートショックタ ンパク質プロモーター配列）、およびhsp60プロモーターのマルチクローニング 部位下流を使用した。発現系を図15に図示する。 インサートは30kDaタンパク質の配列を含むM．tuberculosis Erdman株由来の4 .7kb HinDIII-BamHIゲノムDNAフラグメントからなる。インサートをE．coli DH5 a中でpSMT3中でクローン化し、組み換えプラスミドDNAをM．smegmatis 1-2cおよ びM．vacce R877R（ナショナルコレクション・オフ・タイプカルチャー （NCTC ）11659）中に、6250V／cmおよび25mファラッドの条件でエレクトロポーレーシ ョンにより形質転換した。M．smegmatis 1-2cはM．smegmatis mc26の治療した単 離体であり、Zhangら（Molecular Microbiology、５(2)：381-391、1991）によ り記載される手順によりM．smegmatis mc26から調製されたATCC 607（アメリカ ン・タイプ・カルチャー・コレクション）の単細胞単離体である。M．smegmatis mc26はATCC607から、Jacobsら（Nature、327：532-535、1987）により記載され る手順により単離された。 １mgの組み換えプラスミドDNAおよび約4×109CFUのMycobacteriaを用いて、こ の方法で100−200ハイグロマイシン耐性形質転換体を得た。この形質転換体はブ ロス培地中で安定であり、そしてM．tuberculosisの30kDaタンパク質を構成的に 発現して、約10mgのプロセスされたタンパク質／Ｌを産生した。最も重要なこと は、タンパク質は可溶性であり、そして発現されたタンパク質の約90％が培地上 清中に分泌されたことである（図16を参照のこと）。 図16に示される電気泳動の結果は、以下のようにして得られた。M．tuberculo sisの30kDa遺伝子を有するpSMT3構築物を含む５つの組み換えM．smegmatisクロ ーンそれぞれからの上清液をSDS-PAGE（ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリル アミドゲル電気泳動）分析を行った（５本の右側のレーン）。主なタンパク質（ 図16中の矢印）は組み換えM．tuberculosisの30kDa主要分泌タンパク質である。 最も左側のレーンは分子量標準を示す（66、45、36、29、24、20、14kDa）。組 み換えタンパク質は29kDaマーカーのすぐ上に移動する。 培地上清中の主要細胞外タンパク質が組み換えM．tuberculosisの30kDa主要分 泌タンパク質であることを確認するために、ウエスターンブロット分析を用いた 。結果を図17に示す。図17では、図16の右側の４本にレーンで示されるタンパク 質は、SDS-PAGEに供し、そしてニトロセルロース上にブロットした（４本の右側 レーン）。ブロットを、M．tuberculosis 30/32kDaタンパク質複合体特異的ウサ ギポリクローン抗体でプローブした。組み換えM．tuberculosisの30kDaタンパク 質のみが染色される（矢印）。左側のレーンはあらかじめ染色された分子量マー カーを含む（106、80、49.5、32.5、27.5、および18.5kDa）。組み換えタンパク 質は32.5と27.5kDa分子量標準との間に移動する。 さらに最初の６つのＮ末端アミノ酸のＮ末端配列はFSRPGLを示し、このＮ末端 配列は成熟M．tuberculosis 30kDaタンパク質のそれと同一であることを確認す る。 pET20（Novagen、Madison、WI）中の2つの構築物（１つは30kDaタンパク質の ためであり、そしてもう１つは32AkDaタンパク質のためである）はいずれも、E. coli中で発現しなかった。pKK233の単離体は、AmannおよびBrosius（Gene、40、 183-190、1985）により記載されている。pTrc99A（Pharmacia Biotech、Sweden ）をpKK233ベクターの代わりに使用し得る。pKK233中の３個の異なる構築物−１ つは全長30kDaタンパク質のため、１つは全長32kDaタンパク質のため、そして １つは成熟30kDaタンパク質のため−はE．coli中で全てのタンパク質を発現しな かった。 成熟30kDaタンパク質のためのpRSET-A中の１つの構築物はE．coli中で融合タ ンパク質を産生したが、30kDaタンパク質はエンテロキナーゼでこの融合タンパ ク質がなくなる様には切断され得なかった。同様に、pTrx-Fus中の２つの構築物 −１つは成熟30kDaタンパク質のため、そして１つは成熟32kDaタンパク質のため −はE．coli中で融合タンパク質を産出したが、この融合タンパク質からのM．tu berculosisタンパク質はエンテロキナーゼで効率よく切り出され得なかった。多 様な発現系の適用性の要約を表AAに示す。すべてのインサートは32A kDaタンパ ク質用である。 表AAに見られ得るように、すべての構築物がタンパク質を発現する結果とはな らなかった。構造遺伝子の前のリーダー配列が発現のために必要であった。従っ て、成熟30kDaタンパク質遺伝子を含む１つのpET22b構築物と、成熟32AkDaタン パク質遺伝子を含む１つの構築物はどちらのタンパク質も発現しなかった。タン パク質のそれぞれのリーダー配列を構造遺伝子の前に加えることによって、30お よび32A kDaのM．tuberculosisタンパク質のpET22b中での発現の成功が得られた 。両方のタンパク質について、これは全長およびプロセスされたタンパク質の発 現をもたらした。これらの構築物はE．coli中で比較的安定であった。すなわち 、これらは２回または３回の継代培養後に発現したが、それ以上の継代培養後に は発現しなかった。 各タンパク質の構造遺伝子の前にE．coli由来pelBリーダー配列を加えること により、30および32A kDaのM．tuberculosisタンパク質のpET22b中での発現の成 功が得られた。これらの構築物における発現レベルは、30または32A kDaタンパ ク質のそれぞれのリーダー配列を利用するものより高かった。しかし、pelB構築 物の欠点はその不安定性であった。これらの構築物は１回の継代培養後に全ての 組み換えタンパク質を発現するそれらの能力を失った。 所望のタンパク質を発現するための一般的なアプローチの簡単な説明を、上記 実施例24に示す。 主に豊富な細胞外産物とそれらの分子アナログのより小さいタンパク質サブユ ニットは、それらが有効な免疫防御を誘導するかぎり本発明の範囲内である。さ らに、公知の分子組み換え技術で修飾された融合タンパク質または細胞外産物の ような組み換えタンパク質産物は、本発明の教示と完全に適合する。さらに、抗 イディオタイプ抗体、または直接進化を用いて誘導されたペプチドおよびヌクレ オチドのような選択された免疫活性決定因子の免疫原性的に発生したアナログも また、本発明の範囲内である。 同様に、宿主免疫系に対する免疫原性薬剤の処方および提示は、アジュバント 中のタンパク質またはそれらのアナログの溶液に限定されない。例えば、適切な 細胞外タンパク質由来の免疫原性決定因子は、病原性でなく、かつ組み換え技術 を用いて修飾された細菌、ファージ、マイコプラズマ、またはウイルスの異なる 種でも発現され得る。このような場合、所望の応答を刺激するために、全ての存 在している生物が処方され、そして使用され得る。逆に、不適切な環境中での大 量ワクチン接種計画では、複雑なアジュバントまたは添加剤を含まないきわめて 安定な処方物が必要とされる。さらに、凍結乾燥または経口投与またはカプセル 化などの過酷な条件に曝された場合、ワクチンの処方物は活性成分の安定性また は免疫応答性を促進することを目的とし得る。従って本発明は、産物の目的の用 途により目的のワクチンを含む免疫原性決定因子の極めて多様な処方物を含む。 当業者は、ワクチン用量が、日常的な実験を用いて、個々の病原体および宿主 について決定されるはずであることを理解する。現在のところ、最小実用用量は 0.1mg〜2.0mg、20.0mg、100mgの程度であり、そして１mgでも適切な系では最適 であり得る。当該分野で公知の任意の通常の免疫化技術および手順を用いて、適 切な用量が投与され得る。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION      Abundant extracellular products and methods for producing and using themRelations with government   The present invention is based on grant numbers AI-35275 and AI-31338 issued by the Ministry of Insurance and Social Welfare. This was done with government support. The Government has certain rights in this invention. Having.Field of the invention   The invention generally relates to pathogenic agents such as bacteria, protozoa, viruses, and fungi. The present invention relates to an immunotherapeutic agent and a vaccine for an organism. More specifically, maximum and Is based on the pathogenic subunit or product with the most specific molecular immunogenicity Also, unlike prior art vaccines and immunotherapeutics, the present invention provides In order to stimulate an effective immune response in the main, Mycobacterium tuberculosis The most predominant or mainly released by such selected pathogens Use abundant immunogenic determinants. Thus, produced by the present invention The acquired immunity, and the immunotherapeutic activity, is relative or absolute of the administered compound. Irrespective of immunogenicity, during the course of the pathogen's infection, Are also directed against frequently presented antigen markers.Background of the Invention   Parasitic microorganisms can infect animals and thereby cause disease in the host, and often The ability to cause death has long been recognized. Virulence factors, history Is the leading cause of death, and continues to cause immense suffering . In the last hundred years, dramatic progress has been made in the prevention and treatment of many infectious diseases. However, due to the complex host-parasite interactions, the universal Limited effectiveness. Elaborate entry mechanisms of many virulence vectors The difficulty of stopping is the resurgence of various diseases, such as tuberculosis, as well as bacteria and C Evidence is given by the emergence of numerous drug resistant strains of irs.   Of these virulence factors of primary epidemiological interest, intracellular bacteria are Proven particularly refractory despite therapeutic or prophylactic measures It has been. Intracellular bacteria, including Mycobacterium and Legionella, All or part of the life cycle within the cells of the infected host organism rather than outside Complete. Worldwide, intracellular bacteria kill millions of people each year and count Not cause any distress. Tuberculosis caused by Mycobacterium tuberculosis is Worldwide, it is the leading cause of death from infectious diseases, with 10 million new cases each year. , And 2.9 million deaths. In addition, intracellular bacteria can cause millions of leprosy Cause cases. Other debilitating diseases transmitted by intracellular factors include: Leishmaniasis of the skin and internal organs, Trypanosomiasis americans (Chagas disease) ), Listeriosis, toxoplasmosis, histoplasmosis, trachoma, parrot Diseases, Q fever, and Legionnaires 'disease, including veterans' disease, are included. Even now, these Can prevent debilitating infections in susceptible individuals exposed to different organisms Is relatively small.   The inability to effectively protect the population from tuberculosis, and Due to morbidity and death, this is one of the most important diseases facing humanity is there. More specifically, M. Tuberculosis, primarily caused by human pulmonary tuberculosis, It is the leading cause of death in developing countries. Survives in macrophages and monocytes M. Tuberculosis can cause chronic intracellular infection. Outpatient Itself in cells that are primarily responsible for detecting factors and subsequently activating the immune system Is hidden, M. tuberculosis compares evasion of the host organism's normal defenses I have been successful. These same pathogenic properties are effective against M. tuberculosis infection This has hindered the development of immunotherapeutics or vaccines. At the same time, tuberculosis (tube) rcle bacilli) is relatively easy to culture and observe under laboratory conditions. Obedience What is M. Tuberculosis is particularly well-documented to demonstrate the principles and advantages of the present invention. Are suitable.   Those skilled in the art will appreciate The following exemplary discussion of tuberculosis has never been tu It is not intended that the scope of the invention to treat berculosis be limited. Understand. Similarly, the teachings herein are in no way limited to the treatment of M. tuberculosis infection. Not. Conversely, the present invention can be used to isolate any virulence factors that express extracellular products. Advantages of safe and effective vaccines and immunotherapeutics against epidemic determinants And thereby inhibit the transmission of infection of these organisms.   Currently, about half of the world's population is M. Millions of lungs infected each year with tuberculosis It is believed to cause tuberculosis. The disease is particularly relevant in Latin America, While serious health problems in developing African and Asian countries, It is also becoming more prevalent in the world. In the United States, certain groups, Poorly immunocompromised individuals in cities and migration from areas with high disease prevalence The danger is increasing for the people. Tuberculosis in developed countries mainly due to the AIDS epidemic The incidence is often multidrug resistant It is increasing in the form of tuberculosis.   Recently, 36 of the 50 U.S. states have developed tuberculosis resistant to one or more drugs. Was reported. In New York City, three of all cases tested in 1991 One-half was resistant to one or more major drugs. Non-resistant tuberculosis Prospects for drug-resistant strains that can be cured with antibiotics during interim treatment strategies Is tough. Nearly 50 patients infected with strains resistant to two or more major antibiotics % Mortality. Therefore, such various M. against tuberculosis There is a great need for safe and effective vaccines.   M. Initial infection of tuberculosis is almost always due to inhalation of aerosolized particles. It happens. Because this pathogen can spread for several weeks in wet or dry sputum Because it can remain viable for months or months. Primary infection site is lung However, the organism also causes bone, spleen, meningeal, and skin infections. I can do it. Depending on the virulence of the particular strain and the resistance of the host, infection and And the corresponding damage may be small or large. For humans In early infections are controlled in the majority of individuals exposed to virulent strains of bacteria . The development of acquired immunity after the first challenge reduces bacterial growth, thereby Lesions heal, and the subject remains predominantly asymptomatic, or It remains sex.   M. If tuberculosis is not controlled by the infected subject, spread of lung tissue Extensive degeneration often occurs. Mycobacterium tuberculosis propagates in alveoli or lung macrophages When bred, lesions usually form in the lungs in susceptible individuals. This creature As they breed, they can spread to distant lymph nodes through the lymphatic system and, through the bloodstream, to the lungs Can spread to the apex, bone marrow, kidney, and meninges surrounding the brain. Primarily cell-mediated hypersensitivity As a result of a sexual response, characteristic granulomatous lesions, in proportion to the severity of the infection, Produces nodules. These lesions are adjacent to monocytes, lymphocytes, and fibroblasts. Consists of epithelioid cells. In most cases, the lesion or nodule eventually breaks down. Becomes deadly and undergoes caseinization.   M. Tuberculosis is an important pathogen, but another species of the genus Mycobacterium is also Causes disease in animals, including humans, and is clearly included within the scope of the present invention. You. For example, M. bovis, M .; Closely related to tuberculosis, cattle, pigs, sheep It is responsible for Mycobacterium tuberculosis infection in livestock such as di, horse, dog, and cat. Sa M. et al. bovis provides humans via the intestinal tract, typically from ingesting raw milk. Can be infected. Local intestinal infection eventually spreads to the respiratory tract and is soon followed by classical Cause severe tuberculosis symptoms. Another important virulence vector of the genus Mycobacterium is M. acnes causes millions of cases of leprosy, an ancient disease. leprae . Another species of this genus that causes disease in animals and humans includes M. kansasii , M. avium intracellulare, M.A. fortuitum, M.P. marinum, M .; chelonei, M.P. afr icanum, M.P. ulcerans, M.P. microti, and M. scrofulaceum included. Pathogenicity Mycobacterium species often have their respective DNA and corresponding Show a high degree of homology in the protein sequence tuberculosis and M . Some species, such as bovis, are highly related.   For obvious and ethical reasons, there are no First study in humans to determine the efficacy of experimental compositions is not feasible Noh. Therefore, in the first development of any drug or vaccine, safe It is standard practice to use appropriate animal models for reasons of gender and cost. You. The theory that immunodominant epitopes are often active in different host species The solution predicts the successful execution of the experimental animal model. Thus, one species (eg, Immunogenicity in rodents or guinea pigs) Are also immunoreactive in different species such as Appropriate animal models are well developed Only to further demonstrate the safety and efficacy of the vaccine in humans To this end, clinical trials in humans are performed.   M. For tuberculosis infection of the alveoli or lungs, guinea pig models In many respects, it closely resembles the human pathology of the disease. Therefore, human And it is appropriate to extrapolate a guinea pig model of this disease to other mammals. It is well understood by those skilled in the art. Guinea pigs, like humans, Aerosolized human pathogen M. It is susceptible to M. tuberculosis infection. First Guinea pigs are aerosolized When exposed to the body, they consistently develop sporadic disease, facilitating subsequent analysis. In addition, both guinea pigs and humans can test for dense monocyte sclerosis or skin testing Cutaneous delayed-type hypersensitivity reaction characterized by the onset of rigid areas of the site Show. Finally, the characteristic tuberculosis lesions in humans and guinea pigs are Langhans-type It shows a similar morphology, including the presence of giant cells. Guinea pigs are not And is more susceptible to progression than humans. Protection provided in humans or other less sensitive mammals Provide strong suggestions that the same protective immunity can occur. Therefore, restrict The present invention is not intended to serve as a mammalian host, but for illustrative purposes only. First demonstrated in the exemplary context of Lumotte. The present invention relates to humans and homes. One of skill in the art will appreciate that other mammalian hosts, including domesticated animals, can be practiced. Will be understood.   The pathogenic vector, and in particular, the animal or human infected with the intracellular organism, Gives a difficult challenge to the immune system. Many infectious agents have a humoral response and a corresponding Although these can be effectively controlled by the production of protective antibodies, these mechanisms It is mainly effective only against those pathogens located in the extracellular fluid of the body. Details In some cases, opsonizing antibodies bind to extracellular factors Thereby making them susceptible to phagocytosis and subsequent intracellular killing. You. Furthermore, this does not apply to other pathogens. For example, in a previous study Humoral immune response is M. Heavy against infection by intracellular bacteria such as tuberculosis Required Did not appear to play a significant defensive role. However, the present invention Can produce a beneficial humoral response to pathogenic pathogens and, as such, Sex is not limited to any particular component of the stimulated immune response.   More specifically, antibody-mediated protection apparently reduces the initial infection of intracellular pathogens Does not block, and becomes ineffective once the bacteria are sequestered in the host cell. water As a soluble protein, antibodies can penetrate extracellular fluids and blood, Is difficult to move through lipid membranes. Furthermore, against the surface structure of bacteria The production of antibodies with opsonic effects is in fact an intracellular pathogen invading host cells Can help you. Therefore, it is effective against intracellular factors such as Mycobacterium. Effective prophylactic assays activate unprotected phagocytes or are cytotoxic. Aggressive cell media that results in rapid proliferation of antigen-specific lymphocytes, eliminating them The components of the mediated immune response should be incorporated. However, as discussed in detail below Inducing a cell-mediated immune response is not equivalent to inducing protective immunity. No. Cell-mediated immunity may be a prerequisite for protective immunity, Production of vaccines according to the teachings requires animal-based challenge experiments.   This cell-mediated immune response generally involves two steps. When cells are infected The first step in sending a signal is a special step that delivers a fragment of the pathogen to the cell surface. (A major histocompatibility molecule or MHC molecule). These MHC The molecule binds to small fragments of bacterial proteins that are broken down in infected cells, And present them on the cell surface. These presentations to T cells are immune to the host. Stimulate the epidemic system to remove infected host cells or Induce host cells to eradicate any bacteria that are present.   Unlike most infectious bacteria, M. Mycobacterium, including tuberculosis, Tends to grow in vacuoles that are substantially sealed from the rest of the cells by the membrane There is a direction. Phagocytes spontaneously form these protective vacuoles, which indicates that It makes phagocytic cells particularly susceptible to infection by ras pathogens. Such a vacuole Bacteria are effectively protected from degradation and the immune system It makes it difficult to present complete bacterial components. However, MHC molecules in infected cells Move to the vesicles and collect free (dissociated) bacterial products or For the normal presentation of the product on the surface, the foreign extracellular bacterial product has been transported Move to other parts of the main cell. As previously shown, presentation of foreign bacterial products Trigger a proper response by the host's immune system.   The intracellular pathogens at issue raised against the immune system also Make up a special challenge. To date, most researchers have reported that Mycobacterium infection And, in particular, M.E. Finding effective vaccine production against tuberculosis Was. Currently, a widely available vaccine against intracellular pathogens is available from M.D. bovis nothing The only virulent strain, the live attenuated vaccine BCG, is Used as a preventive measure. Furthermore, in 1988, the promotion of India's World Health Organization Extensive research suggests that the efficacy of the best BCG vaccine is insignificant It has been determined. Despite the potential effects of this problem, TB-prone areas around the world Thus, BCG vaccines have been widely used. Making the problem even more complicated Individuals vaccinated with BCG are often screened for TB screening and Tuberculin counteracts the effectiveness of the most common skin tests on controls Is to develop susceptibility to   Another serious problem with using live attenuated vaccines such as BCG is that A disease that is life-threatening in a disease-free patient. Rush These vaccines have a reduced ability to fight rapidly growing induced infections Poses a particular danger to people with reduced cell-mediated immunity. Such individuals Is an individual who is weakened by malnutrition and poor living conditions, organ transplant recipes Ent, as well as persons infected with HIV. Danger in case of BCG vaccine Highly likely individuals include those with emphysema, chronic bronchitis, pneumoconiosis, silicosis, and previous tuberculosis. Includes people with severe lung disease. Therefore, the use of attenuated vaccines is Well, they are limited to the populations with the highest potential benefits.   The use of live attenuated vaccines can also have other undesirable side effects. Because live vaccines propagate in recipients, they have a broader antimicrobial potential than non-infectious vaccines. Induces a less body- and directional cell-mediated immune response. This shotgun The approach blocks immune responses directed at the molecular structures most involved in cellular defense. Has a tendency to harm. Furthermore, the use of live vaccines with intact membranes is Antibodies with opsonic action to prepare foreign bodies for fruitful phagocytosis Can be induced. Therefore, when the host is exposed to a virulent strain of the target organism, such Hosts in which the presence of the antibody allows the survival and growth of the unattenuated pathogen Uptake of these pathogens into cells can actually be enhanced. In addition, attenuated wax Chin contains thousands of different molecular species, possibly resulting in toxicity in patients. Includes molecular species that may or may elicit an adverse immune response. Has a live vaccine Other problems include the resurgence of toxicity, natural transmission through contact, contaminating viruses, And virus interference, as well as the difficulties associated with standardization.   Similarly, conventional killer organisms or highly antigenic membrane-bound structures Like a second generation subunit vaccine Non-infectious vaccines are limited with respect to inhibition of intracellular bacteria. With an attenuated vaccine Similarly, killed bacteria elicit indiscriminate responses that can inhibit the most effective protective determinants You. In addition, killed vaccines still have a large number of potentially antigenic Presents a structure that allows for a toxic reaction or opsonization by the immune system. Increase performance. Traditional subunit vaccines that incorporate membrane-bound structures also , Both synthetic and purified, are foods where intracellular pathogens propagate. It can induce a strong opsonic effect that promotes the entry of intracellular pathogens into the vesicle. Bacteria By increasing the content of the killed vaccine against intracellular surface antigens, It may increase the relative toxicity of the virulence factor. Therefore, a strongly antigenic bacterial surface Traditional attenuated or killed vaccines against components are contraindicated in the case of intracellular pathogens Can be shown.   To avoid problems associated with the use of traditional vaccines, certain intracellular pathogens Extracellular proteins or their immunity to stimulate protective immunity against the body Development has been carried out using native analogs. See, for example, our April 28, 1992 U.S. Patent No. 5,108,745 issued to Legionella pneumophila, and M.M. tuberc vaccines that produce protective immunity against ulosis, and other intracellular pathogens; A method is disclosed. These prior art vaccines are It is released extracellularly by the bacteria into the broth culture and, in vivo, Protein compounds that are released extracellularly by bacteria into host cells Widely based on extracellular products derived. As disclosed therein, this These vaccines stimulate a strong immune response against a target pathogen in a mammalian host Selectively, based on the identification of extracellular products, or analogs thereof.   More specifically, in mammals immunized against the pathogen of interest, strong phosphorus Determines the ability to elicit either a papuloproliferative response or a cutaneous delayed-type hypersensitivity response By screening these prior art candidate extracellular proteins, I was leaning. This disclosed method, and related vaccines, are Avoids many of the disadvantages inherent in the use of Kuching, but conflicts with cross-reacting immunity The outcome of the response and changes in the host complicate the selection of an effective immunizing agent. obtain. Thus, while molecular immunogenicity is one indicator of an effective vaccine, , Other factors complicate its use in inducing an effective immune response in vivo Can be.   More importantly, surprisingly, especially M.E. Effective for tuberculosis Conventional prior art methods for identifying vaccines that induce protective immunity are cumbersome. It has been found to be and potentially ineffective. For example, the most immune Large amounts of M. aureus were used to identify these extracellular components that are protogenic. tubercu SDS-PAGE analysis of the extracellular protein of losis followed by conventional Western blot The technology has produced conflicting results. Repeat tests indicate which extracellular products are the strongest immunogens Sexual response and is consistent with the prior art views, thereby providing the most effective No function could be identified. M. of extracellular products of tuberculosis Many are well known in the art, have already been identified, and in some cases Has been sequenced. In addition, as with any foreign protein, these known Compounds can be shown to induce an immune response. However, in the field, Any of these known compounds induce protective immunity as traditionally identified There is no direct indication that this is the case.   Therefore, traditional techniques based on highly specific and strong immunogenic viability Effective against infectious bacterial pathogens without relying on Kuching considerations and selection techniques Vaccines or immunotherapeutics, as well as the production of It is a primary object of the present invention to provide and methods for use.   In mammalian hosts, M. tuberculosis, M.P. bovis, M .; kansasii, M .; avium -intracellulare, M.P. fortuitum, M.P. chelonei, M.P. marinum, M .; scrofulaceum , M. leprae, M .; africanum, M.A. ulcerans, and M. Intracellular diseases, including mlcroti Provide vaccines or immunotherapeutic agents to confer acquired immunity to the drug substance It is another object of the present invention to provide a method for using them, You.   Easily produced, showing weak toxicity compared to killed or attenuated vaccines It is a further object of the present invention to provide vaccines and immunotherapeutics.Summary of the Invention   The present invention relates to compounds for use as vaccines and / or immunotherapeutics, And protective or therapeutic immunity against infection by a pathogen in a mammalian host. Provide methods for producing and using them to generate epidemics This achieves the above and other objects. In a broad context, books The invention provides a method for protecting or treating infectious vectors producing extracellular compounds. Means are provided for inducing an immune response. The compounds of the present invention are effective against pathogenic bacteria. Is particularly effective, but primarily against any pathogen that produces abundant extracellular products. Can be used to generate a protective or therapeutic immune response.   For the purposes of the present invention, "predominantly abundant" refers to the most significant, depending on the pathogen of interest. Should be understood as relative terms identifying those extracellular products that are released in It is. For example, under various culture conditions, M. cerevisiae grown to an optimal density of about 0.5. tu With respect to berculosis, those skilled in the art will recognize that mainly abundant extracellular products are on the order of 10 μg / L or more. Should be expected to be obtained by Therefore, the total amount of the exemplary 4 mg / L (normal Cultured under heat shock conditions or under heat shock conditions. All of the extracellular products of tuberculosis About 15 to 20 (alone or 100) of 100 or known extracellular products Or in combination) make up about 90% of the total. These are within the scope of the present invention. Predominantly abundant extracellular products intended to be extracellular products, and SDS / PAGE It can be easily identified as a thick band appearing in the gel. In addition, extracellular The product can be further characterized and distinguished by amino acid sequencing . The remaining extracellular products are small. One skilled in the art will also recognize the phase of the specific major extracellular product. versus It is right to recognize that the quantitative abundance can vary depending on the culture conditions. I However, in most cases, the identification of individual predominantly abundant extracellular products does not change.   Accordingly, the present invention relates to a viral, bacterial, fungal, or protozoal agent. Can be used to protect a mammalian host against infection by a pathogen. C In some cases, such as ills infection, mainly abundant extracellular products are Can be produced by a selected host cell. All that release mainly extracellular products Although active against microorganisms, the vaccines and methods of the present invention To produce protective immunity against intracellular pathogens, including various species and serotypes of It is especially effective. The vaccines of the invention also treat existing disease states It is also effective as an immunotherapeutic agent.   Surprisingly, extracellular by bacterial pathogens or their immunogenic analogs Immunization with the most or most abundant product released to the The present inventors have shown that effective immune responses can be elicited regardless of the opposite immunogenicity. Was found by: Due to their release from the organism, thus the antigen processing Availability and sensitivity to host molecules involved in In tissues during staining, due to their natural high concentration, The predominantly abundant extracellular products of offspring are processed more frequently than other bacterial components, and And presented to the host immune system. For intracellular pathogens, mainly abundant extracellular products are: It is the major immunogenic determinant displayed on the surface of infected host cells and, therefore, Shows higher appearance in the surrounding environment. Therefore, mainly abundant extracellular products of pathogenic organisms Immunity acquired against the host defense system is isolated in the host cell It may be possible to detect pathogens quickly and to inhibit them efficiently.   More specifically, the main or major abundant product released by pathogenic bacteria is , Phagocytic cells and other host immune system mechanisms cause their respective immunogens Non-predominant pathogenic component or membrane-associated disease, independent of sexual activity or specificity It appears to be processed at a faster rate than the bulk components. This immune processing Imbalance occurs when the virulence factor is an intracellular bacterium that is sequestered from normal immune activity. It is especially important if Abundant and continuous against the infected host immune system Most of the extracellular products of bacteria or their immunogens Sex Nalogs produce a violent immune response almost independently of the immunogenic characteristics of individual molecules. Trigger.   Primarily abundant extracellular products are released into the surrounding environment by the target pathogen It is a major component of proteins and other molecular entities. According to recent research, A single, mainly abundant extracellular product accounts for up to 40% by weight of the product released by the microorganism. It has been shown that can include More often, each predominantly abundant extracellular product is They make up between about 0.5% to about 25% of the total products released by the infectious agent. Further In addition, the top 5 or 6 predominantly abundant extracellular products are It can be found to contain between 60% and 70% of the amount. Of course, those skilled in the art So that the relative level of the product can be released in absolute or relative amounts of the product , Recognize that it can vary over time. For example, pH, oxidants, permeability, heat, and And other stress conditions on the organism, stages of the life cycle, reproductive status, and surrounding The composition of the environment can vary the composition and amount of the released product. In addition, extracellular Absolute and relative levels of a product vary greatly within a strain between species and even between species. Can get.   In the case of intracellular pathogens, extracellular products are antibacterial against macrophages, including live bacteria. Seems to expand the population of specific immune lymphocytes that can detect and exercise effects is there. In addition, their repetitive presentation on the surface of infected cells, mainly due to their rich Or the major extracellular products function as effective antigenic markers. Therefore, According to the teachings of Ming, the predominantly extracellular products of pathogenic bacteria or their immunogenicity Vaccination directed against equivalent determinants and induction of protective immunity When infected by a target pathogen, the host's immune system may have strong cell-mediated components. Encourage you to have a quick and effective immune response.   Based on highly specific molecular antigenicity of individually screened pathogen components Prior art has focused on vaccine production and stimulating the immune response. Contrary to the immunization effect, the present invention has a lower immunogenicity than less predominant extracellular products. Establish or induce protective immunity using compounds that can actually demonstrate epidemic specificity Relative abundance of bacterial extracellular products or their immunogenic analogs (But not their immunogenic specificity). For the purposes of this disclosure, Epidemiological analogs are primarily abundant extracellular products expressed by target pathogens. Any molecule or compound sufficiently similar to at least one, or any The vaccinated mammal upon subsequent infection with the target pathogen. Has the ability to stimulate a protective immune response in the host. Easy, mostly abundant cells Foreign products or products released extracellularly by specific pathogens (or Molecular analogues capable of stimulating an immune response equivalent to Enables their synthetic or endogenous production after isolation in pure form By sequencing the DNA or RNA responsible for their production, the present invention Vaccines are identified or produced. Then use techniques well known in the art. Formulating one or more isolated immunoreactive products or encoded genetic material, And by immunizing the mammalian host prior to infection by the target pathogen, The desired prophylactic immune response to the target pathogen can be elicited.   The invention is well-defined to include at least one, two, or even a few. Consists of defined immunogenic determinants. As a result, the invention makes it relatively simple and fast A consistent, standardized vaccine is produced that can be developed, tested, and administered. Sa In addition, some well-regulated, mainly corresponding to abundant secretory or extracellular products, The use of defined molecules increases the risk of harmful side effects associated with traditional vaccines. Potential occlusion of reduced and effective immunogenic markers To eliminate. Similarly, the invention is neither an attenuated vaccine nor a killed vaccine Thus, the risk of infection during manufacture, purification or administration is effectively eliminated. Obedience Thus, the vaccines of the present invention can be used for immunotherapy, including asymptomatic tuberculosis patients and HIV It can be safely administered to unprotected individuals. In addition, the humoral immune response Harmful opsonic immunogenesis because it is exclusively directed to products released by the body There is little opportunity to generate minutes. Thus, the present invention provides a method for detecting A stimulated humoral response that assists in the removal of strategic pathogens.   Another beneficial aspect of the invention is the collection or production of vaccines, and subsequent It is easy to purify and sequence. For example, dominant rich extracellular products Without much effort, M. tuberculosis, or M. target pathogens including bovis It can be obtained from culture. During growth, the desired compound is released into the medium Utilizing conventional techniques, they facilitate the in-cell components and membranes of the target pathogen It can be separated from the binding component. More preferably, the desired immune response of the vaccine of the invention The components are: tuberculosis, M.P. bovis, M .; leprae, or any other pathogen of interest Genetically engineered genes that express specific extracellular products of the body It can be produced and purified from the produced organism. As known in the art In addition, the organisms so engineered can be selected extracellular products or modified immune The native analog can be modified to produce high levels. Or immune defense The product, a portion thereof, or an analog thereof can be obtained using techniques well known in the art. In which the naked gene encoding it can be chemically synthesized or injected It can be expressed directly in the main cell. Dominant whatever production source is used The immunogenic components of the abundant or predominantly abundant extracellular product can be separated and Followed by fractionation, chromatography, or other purification methodologies and conventional formulation techniques Can be formulated into a transportable vaccine using common biochemical procedures such as Or directly in the host cell containing the genetic construct encoding it, which has been introduced directly. It can be expressed indirectly.   For example, in an exemplary embodiment of the invention, the target pathogen is a M. aureus. with tuberculosis Yes, and M. Released from outside the cell into broth culture by tuberculosis Mainly abundant products are separated from other bacterial components and isolated in mammalian hosts. Used to elicit an epidemiological response. Then, individual proteins, or proteins Groups of proteins can be utilized in animal-based challenge experiments in accordance with the teachings of the present invention. Elicits protective immunity that is made suitable for use as a vaccine Or identify a group of proteins. More specifically, after bacterial growth and recovery, Due to their physical abundance, intracellular components and other Separate major extracellular products from the components of If desired, then the resulting mass From the filtrate, subjected to ammonium sulfate precipitation and subsequent fractionation using dialysis, A mixture of extracellular products, commonly called EP, is obtained. Then, in the field Appropriate chromatography techniques known and more fully described below Used to purify the solubilized extracellular product in the dialyzed fraction until it is substantially homogeneous. You.   By these exemplary means, a fraction ranging from 110 kilodaltons (KD) to 12 KD 14 individual proteinaceous, M. Major extracellular production of tuberculosis Product is produced. After purification, it is subjected to polyacrylamide gel electrophoresis If each predominantly abundant extracellular product is a single band corresponding to its molecular weight Indicates that each individual product or product corresponds to a predominantly abundant extracellular product. Each of the groups was identified for use as a vaccine in accordance with the teachings of the present invention. And can be prepared. Purified mainly abundant extracellular products are Using common techniques in the field, all of their respective amino acid sequences Can be characterized and distinguished by determining the parts. Sequencing Also provides information on possible structural relationships, mainly among abundant extracellular products. obtain.   Subsequently, a continuous subcutaneous or intradermal application of the purified extracellular product over time Utilizing injections and immunizing and harvesting in mammalian host systems in accordance with the teachings of the present invention The resulting immune stimulation is achieved. For example, purified mainly abundant extracellular products Or injection with the product in incomplete Freund's adjuvant, the same after about 3 weeks Challenge with a second injection in adjuvant followed by a pathogenic pathogen Elicit a protective response during Other examples within the scope and teachings of the present invention Typical immunization protocols include purified extracellular products or Syntex Adjuvant Formulat 3 or 4 consecutive runs of the product or its analog in ion (SAF) over a period of time It may include injection. Continuous injections can generally prove more effective and Predominantly abundant extracellular products or immunogenic subunits or analogs thereof A single dose of can provide the desired immune response and is also within the scope of this invention. Is intended.   Such an exemplary protocol, such as guinea pigs accepted in the art, It can be shown using an experimental model. For example, as discussed in detail, Mott immunization is based on five predominantly abundant extracellular products (as previously described, M. tuber Bacterial production in SAF adjuvant using the combination (purified from culosis) With three consecutive injection immunizations of the product and a mock immunization of the corresponding control animals Was. Exemplary dosages for each protein ranged from 100 μg to 2 μg. last After vaccination, all animals are infectious and potentially lethal at the same time. Aerosolized amount of M. Exposure to tuberculosis and monitoring for additional time I did it. M. Tuberculosis is immunized primarily using abundant extracellular product combinations None of the immunized animals died of tuberculosis when compared to the infected animals . In addition, half of the control animals died during the monitoring period, Animals showed significant weight loss. Necropsy following this experiment revealed that non-immunized Troll animals have significantly higher colonies in lung and spleen than protected animals. -Formed units (CFU) and corresponding damage. Further refined mainly rich Provides immunoprevention when 17 additional combinations of extracellular products are tested Was. This makes it possible for vaccines that can be formulated in accordance with the scope of the invention and its teachings. A wide range was shown.   However, the invention is not limited to combinations of secreted or extracellular products That should be emphasized. For example, with some different experimental protocols, One Abundant Extracellular Product Induces Protective Immunity in Mammalia According to the Teachings of the Invention Is shown. In each experiment, guinea pigs were treated with a mouse as detailed herein. M. using a chromatographic protocol. Single, purified from tuberculosis EP Immunized with mainly abundant extracellular products. In one embodiment, in multiple experiments Containing abundant purified secreted products with a molecular weight corresponding to 30 KD The animals were vaccinated with the genotype composition. In another embodiment of the present invention, Guinea pig has a molecular weight corresponding to 71 KD; isolated from tuberculosis Vaccinated with an adjuvant composition containing the abundant extracellular product obtained. Movement Lethal dose after each immunization of both sets of controls and appropriate controls Aerosolization of M. Exposure to tuberculosis determined the efficacy of the vaccine.   More specifically, in one experiment, six guinea pigs were treated for a period of six weeks. Immunization was performed three times with 100 μg of 30 KD protein in SAF. Correspondence Using a simulated preparation or buffer of extracellular protein (EP) Troll animals were vaccinated simultaneously. Death 3 weeks after last vaccination Aerosolized doses of M. Administer antigen using tuberculosis and monitor for 14 weeks - Guinea pigs immunized at 30 KD and those immunized with mock extracellular preparations Lumots had 67% and 50% viability, respectively (mainly abundant extracellular Shows the unexpectedly superior performance of the substance vs. EP), but the mock-immunized animals Had a 17% survival rate. At the end of the experiment, the animals are sacrificed and viability Mycobacterium tuberculosis was examined. Of course, non-immunized animals will have lung and spleen And significantly higher concentrations of M. showed tuberculosis.   Similar experiments were performed on animals vaccinated with the 71 KD protein. In one experiment, 100 μg of purified 71 KD protein was given twice over three weeks. Vaccination of 6 guinea pigs with a SAF adjuvant composition comprising did. Similarly, unpurified extracellular protein for use as a positive control Use a mock preparation of quality or EP and buffer for use as a negative control Was used to immunize another animal. After exposure to a lethal dose of aerosolized M. tuberculosis, Guinea pig weight was monitored for 6 months. Here, too, extracellular Animals immunized with the product are pathogenic M. Protective immunity for tuberculosis Was. Until the end of this period, animals immunized with buffer will not be When compared, showed significant weight loss. In addition, a positive control and 71  Animals immunized with KD had 63% and 50% survival rates, respectively, and non-immunized animals Died before the end of the observation period.   Vaccine formulation is not critical to the invention and is optimal for facilitating administration It is important to note that it can be Mainly abundant extracellular products of pathogens A solution of the purified immunogenic determinants from which it is derived may produce a protective immune response It can be administered alone or in combination in any manner designed. Purification The protein solution can be transported alone or adjuvanted before administration. And may be prescribed. In the present invention, to enhance the activity of a selected immunogenic determinant, Specific exemplary adjuvants used are SAF, monophosphoryl lipid A (Mon adjuvant containing ophosphoryl lipid A (MPL), Freund's incomplete adjuvant Complete Freund's adjuvant containing dead bacteria, gamma interferon (Radford et al.) , American Society of Hepatology 2008-2015, 1991; Watanabe et al., PNAS 86: 9 456-9460, 1989; Gansbacher et al., Cancer Research 50: 7820-7825, 1990; Maio et al. , Can. Immunol. Immunother. 30: 34-42, 1989; U.S. Patent No. 4,762,791, and And No. 4,727,138), MF59, MF59 plus MTP, MF59 plus IL-12, MPL plus TDM ( Trehalose (Dimycolate), QS-21, QS-21 plus IL-12, IL-2 (American Type Culture Collection Nos. 39405, 39452, and 39516; U.S. Patent No. 4,518,584), IL-12, IL-15 (Grabstein et al., Science 264: 965-968). , 1994), dimethyldioctadecyl ammonium (ddA), ddA plus dextra , Alum, Quil A, ISCOMS (immunostimulating complex), liposome, Rear, protein carriers, and microencapsulation techniques. The present invention Further adjuvants that may be useful are oil-in-water emulsifiers, inorganic salts (eg, Alum), nucleic acids, block polymer surfactants, and microbial cell walls (pepe) Tide glycolipid). Although not limiting the scope of the invention, adjuvants may It is believed that the immune response may be enhanced due to the delayed release of the antigen from the firing site.   Alternatively, induces endogenous expression of immunogenic determinants and subsequent protective immunity To achieve this, one or more immunogenic determinant genes derived primarily from abundant extracellular products The encoding genetic material is linked to a eukaryotic promoter and / or secretory sequence. And can be injected directly into a mammalian host.   Other objects, features and advantages of the present invention will be described with reference to the drawings briefly described first. Thus, by considering the following detailed description of its preferred exemplary embodiments, It is clear to the trader.BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES   FIG. 1 shows four gels stained with Coomassie blue, classified as 1a to 1d. And sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) Thus, M.I. Purification of exemplary mainly abundant extracellular products of tuberculosis Is shown.   FIG. 14 mainly (SEQ ID NOs: 1-14) exemplary predominantly abundant of tuberculosis 5 is a tabular representation identifying the five N-terminal amino acids of various extracellular products.   FIG. Tuberculosis can be distinguished by the N-terminal amino acid shown in FIG. There were no elongations of three (SEQ ID NO: 15-17) exemplary predominantly abundant secreted products This is a table showing the N-terminal amino acids.   Figure 4 shows lethal doses of aerosolized M. After exposure to tuberculosis, Made M. 30 KD of tuberculosis mainly in guinea pigs immunized with abundant secretions Viability and positive cells immunized with prior art mock preparations of extracellular proteins Graphically with control and non-immunized negative control viability It is a comparison.   FIG. 5 shows lethal doses of aerosolized M. Purified 71 after exposure to tuberculosis Immunized with mainly abundant extracellular products of KD and non-immunized negative controls 4 is a graphical comparison of the average guinea pig body weight of animals.   Figure 6 shows lethal doses of aerosolized M. M. after exposure to tuberculosis. tubercul viability of the guinea pig of FIG. M. according to the prior art. Immunized with whole preparations of tuberculosis extracellular protein Graph of survival rate of positive control and non-immunized negative control It is a comparison by.   FIG. 7 shows that in a second separate experiment, lethal doses of aerosolized M. tuberculosi immunization with an exemplary purified 71 KD predominantly abundant extracellular product after exposure to Object, M. Immunization with a prior art mock preparation of extracellular protein from tuberculosis Of positive control and non-immunized negative control It is a graph comparison of the average weight of the Mott.   Figures 8a and 8b show PPD + (indicator of infection by M. tuberculosis) and PPD- Reagents for an exemplary purified 71 KD predominantly abundant extracellular product in human subjects It is a graph comparison of the response of the hematopoietic cells. FIG. 8a shows the relationship between this antigen and lymphocytes. FIG. 8b is a graph of the values measured two days after incubation, while FIG. It is a graph of the value measured on the 4th day after incubation.   FIG. 9 shows lethal doses of aerosolized M. teaching of the present invention after exposure to tuberculosis A vaccine immunized with a combination of extracellular products produced as indicated Guinea pigs of animals immunized with the control and non-immunized negative controls Figure 4 is a graphical comparison of body weight.   FIG. 10 shows lethal doses of aerosolized M. teaching of the present invention after exposure to tuberculosis Three different doses of vaccine containing a combination of extracellular products produced as indicated Of animals immunized with, and animals immunized with non-immunized negative control Figure 4 is a graphical comparison of guinea pig average body weight.   FIG. 11 shows lethal doses of aerosolized M. teaching of the present invention after exposure to tuberculosis Six different doses of vaccine containing a combination of extracellular products produced as indicated Animals immunized at the given dose, and animals immunized with a non-immunized negative control. Figure 4 is a graphical comparison of the average guinea pig body weight of animals.   FIG. Immunodominant epitome of 30 KD protein in tuberculosis 6 is a graphical illustration of the mapping of a loop. Figure 12a shows the 30 KD protein sequence. Immune with 30 KD protein that responds to the entire overlapping peptide (15 mer) The percentage of 24 guinea pigs converted is illustrated. FIG. 12b shows mock immunizations of 19 animals. A corresponding set of data is illustrated for a group of guinea pigs as described. Animals in each group , Natural 30 KD protein, purified protein derivative (PPD), and concanavali The response to Con A is shown on the right side of each graph.   FIG. 13 is a schematic representation of the construct used for expression of the recombinant 30 kDa protein. Provide an indication. This figure shows the pE used for expression of the recombinant 30 kDa protein. Draw T22b. This vector has its own leader (30W-pET22b) or Mature 30 kDa protein fused to Sumid-encoded pelB leader (30M-pET22b) Express the protein. Abbreviations used: Ori, ColE1 origin of replication; F1 ori, F1 phage Origin of replication; Amp, ampicillin resistance gene; 30 W / M, full length (30 W) or mature (3 0M) 30 kDa protein; lacI, lac repressor gene; PT7RN of phage T7 A polymerase specific promoter; NdeI and NcoI, vector / insert Restriction enzyme site at the junction.   FIG. length 30 kDa protein and mature 30 in E. coli BL21 (DE3) pLysS  Confirmation of KDa protein expression, electrophoresis test results and Western blot 2 shows the analysis.   FIG. 15 shows a schematic of another construction system used to express the 30 kDa protein. You.   FIG. M. in smegmatis. Expression of 30 kDa protein of tuberculosis The result of the electrophoresis test for confirming the above is shown.   FIG. M. in smegmatis. Expression of 30 kDa protein of tuberculosis 2 shows the results of Western blot analysis confirming the above.Detailed description   The present invention relates to a compound and a method for producing the compound, and a vaccine and an immunotherapeutic agent. Use against pathogenic organisms. More specifically, the present invention provides Predominantly abundant extracellular products released by organisms, their immunogenic analogs, Or the related genetic material that encodes them as vaccines or immunotherapeutics. Protective immunity against infection in production and use, and in mammalian hosts And related methods for producing These compounds are used for convenience. Throughout the application is called a vaccine.   In an exemplary embodiment, which illustrates the teachings of the present invention, M.P. tuberculosis The abundant extracellular product was fractionated and subsequently purified. Specific of individual products Using the purified forms of these major dominant extracellular products without determination of molecular immunogenicity And immunized guinea pigs. In addition, purified extracellular products can be used alone or In combination, and using various dosages and routes of administration, Done. One of skill in the art will appreciate any pathogenic organism or Any of the additional strategies described above with bacteria can be utilized, and Is M. Not limited to vaccines and methods for tuberculosis Recognize.   In these exemplary embodiments, The mainly abundant extracellular products of tuberculosis are Separated and purified using column chromatography. Polyacrylia Achieve relative extracellular product abundance determination and purification using midgel electrophoresis Was done. After purification of the vaccine components, the predominantly abundant extracellular product, alone or in combination, To immunize guinea pigs and subsequently Antigen administration using tuberculosis did. As described in detail, after immunization, In addition to producing a measurable response, the vaccines of the invention Azole lethal dose of M. Unexpectedly effective immunity against tuberculosis This They were given to these experimental animals.   Although these exemplary embodiments used extracellular products in a purified form, those skilled in the art will appreciate that By recombinant means using techniques well known in the art, or by another form of chemical synthesis. It has been found that the present invention can be easily practiced using immunogenic analogs produced by Understand. Further, within the scope and teachings of the present invention, substitution for naturally occurring products Instead, a selection of immunogenic analogs, homologs, or predominantly abundant extracellular products Segment may be used.   A further understanding of the present invention is based on the identification and mere identification of abundant extracellular products as vaccines. Exemplary protocols for release, production, and use (alone and in combination) The following non-limiting examples, which show the file, are provided to those skilled in the art.                                  Example                                 Example 1      Of bulk extracellular protein (EP) from Mycobacterium tuberculosis                              Separation and production   M. Tuberculosis Erdman strain (ATCC 35801) was transferred to American Tissue Culture Coll. Section (Rockville, Md.). Lyophilized bacteria were grown in Middlebrook 7H9 Dissolve in ground (Difco Laboratories, Detroit, Mich.) And place on Middlebrook 7H11 agar Maintained. 7H11 agar was prepared using Cohn (Cohn, Ml., Am. Rev. Respir. Dis. 98: 295-). 296) was previously described and incorporated herein by reference. ok 7H10 agar (Difco), OADC enrichment medium (Difco), 0.1% casein enzyme hydrolyzate (Si gma) and glycerol. After autoclaving, remove the agar for bacteria. The mixture was divided into Petri dishes (100 × 15 mm) and allowed to cool.   Then M. Tuberculosis is plated using aseptic technique and 5% COTwo-95% air, Grow at 37 ° C. under 100% humidity. After 7 days of culture on 7H11, colonies are plated Scrape, suspend in 7H9 broth and 1081.8 ml Nunc cryotube with CFU / ml (Roskilde, Denmark). This broth is per liter, Bacto Middl 4.7 g of ebrook 7H9 powder was mixed with 998 ml of distilled water and glycerol (Sigma Chemical Co., St. (Louis, Mo.) by rehydration with 2 ml and then adjusting the pH value of the mixture to 6.75. The broth was conditioned and autoclaved at 121 ° C. for 15 minutes. Then, aliquot the cells into Each was frozen and stored at -70 ° C. Cells stored under these conditions survive indefinitely Since it was possible, it was used as needed.   The bulk extracellular protein (EP) preparation was prepared using the Middlebroo M. k. grown in k7H9 broth. Obtained from culture of tuberculosis. After dissolution, broth A 150 ml aliquot of was autoclaved at 121 ° C. for 15 minutes and a vented Co-star 225 cmTwoset The tissue culture flask was divided. M. stored at -70 ° C as described in the previous paragraph. tubercu losis cells were thawed and used to inoculate 7H11 agar plates. 7 days After culturing, the colonies are scraped off the plate, suspended in several ml of 7H9 broth, and A single cell suspension was prepared by sonication in water. M. Tuberculosis cells, Perkin- As measured by an Elmer Junior Model 35 spectrophotometer (Norwalk, Conn), Resuspended in a sterile 150 ml aliquot at an initial optical density of 0.05. Then the suspension 5% CO2 until the cells reach an optical density of 0.4-0.5Two-95% air at 37 ℃ for 3 weeks Cubbed. These cultures can also be stored for subsequent culture in 7H9 broth. Used as a bottle. Sonicate the stock bottle in a water bath and prepare a single cell suspension Was prepared. Then, M. Tuberculosis cells in 7H9 broth to initial optical density of 0.05 And 5% CO 2 until the suspension shows an optical density of 0.4-0.5.Two-95% Incubated at 37 ° C. under air for 21/2 to 3 weeks. Then, the culture supernatant is 0.8 μm and 0.2 μm low protein binding filters (Gelman Sci. ences Inc., Ann Arbor, Mich.). Then the filtrate is 10 KD Using an Omega membrane with a cutoff, concentrate about 35 times with a Filtron Minisette, And stored at 4 ° C. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel swimming Analysis of bulk extracellular protein preparations by kinetic (SDS-PAGE) The composition of the protein with the cysteine was revealed. Bulk extracellular protein mixture (EP ) Was prepared by obtaining a 40% to 95% ammonium sulfate fraction of the culture filtrate .                                 Example 2          Purification of mainly abundant extracellular products of Mycobacterium tuberculosis   Ammonium sulfate (grade I, Sigma) at a concentration ranging from 10% to 95% at 0 ° C. To the sterile culture filtrate of Example 1 and gently shake to separate proteins. Stirred. The suspension was then transferred to a plastic bottle and the RC3B Sorvall Centrifuge centrifuge with a swinging rotor at 3,000 rpm, and pellet the resulting pellet. It was shaped like a pit. Decant the supernatant and discard the supernatant or pellet, depending on the product of interest. The batch was subjected to further purification. If the desired product is contained in the supernatant, a second sulfur The ammonium ammonium fraction is increased by increasing the salt concentration above that of the first fraction. Achieved. After a period of gentle stirring, the solution is then allowed to settle to the desired product. And the second supernatant was subjected to further purification as described above. .   After centrifugation, the precipitated protein is resolubilized in a suitable cold buffer and the salts are removed. Spectrapor dialysis membrane with 6,000-8,000 molecular weight cut-off (Spectrum M (Edical Industries, Los Angeles, California). Extracellular tan The protein concentration was determined by a bicinchoninic acid protein assay (Pierce Chemical Co., Rockf. ord, Illinois) and fractions were determined using SDS-PAGE. The fractions were then applied to a chromatography column for further purification .   Using the general scheme outlined immediately above, the process detailed in Example 1 was used. Of 14 extracellular proteins from the bulk extracellular protein filtrate obtained did. Accurate ammonium sulfate precipitation procedure and procedure for each isolated extracellular product And chromatography protocols are detailed below. A.110 KD Extracellular products   1. A 50% to 100% ammonium sulfate precipitate was obtained as discussed above.   2. The resolubilized precipitate is dialyzed and 10% sorbitol, 10 mM phosphate Consists of lithium (pH 7), 5 mM 2-mercaptoethanol, and 0.2 mM EDTA DEAE Sepharose CL-6B or QAE Sepharose ion exchange Apply to the ram and elute with a sodium chloride gradient. 110 KD protein The containing fraction was eluted at about 550 mM salt and collected.   3. Collect the collected fractions in PBS (phosphate buffered saline) buffer It was applied to the size separation column. Protein is dissolved as a homogeneous 110 KD protein Issued. B.80 KD Extracellular products   1. Discard the 0-25% ammonium sulfate fraction (1 hour at 0 ° C) and discard the 25% -60% ammonium sulfate fraction (1 hour at 0 ° C). Evening) was held as discussed above.   2. Using a DEAE CL-6B column (Pharmacia) with 25 mM Tris (pH 8.7) containing 1 M NaCl And equilibrated with 25 mM Tris (pH 8.7), 10 mM NaCl, and The sample was dialyzed against 25 mM Tris (pH 8.7), 10 mM NaCl, and Applied. The column was washed overnight with the same buffer. 25 mM Tris (pH 8. 7), the first salt concentration gradient from 10 mM to 200 mM NaCl was applied to the column, The protein was eluted. Run a second salt gradient (200-300 mM NaCl) through the column, And 80 KD protein eluted at about 275 mM NaCl.   3. Pack a Q-Sepharose HP column with 25 mM Tris (pH 8.7), 1 M NaCl, Then, it was re-equilibrated with 25 mM Tris (pH 8.7) and 10 mM NaCl. Protein sump Dialysed against 25 mM Tris (pH 8.7), 10 mM NaCl and applied to the column. I plied. Wash the column with the same buffer, then in 25 mM Tris (pH 8.7) Eluted with 200-300 mM NaCl.   4. The fraction containing the 80 KD protein was collected and 25 mM Tris (pH 8.7), 10 mM It was dialyzed against M NaCl and then concentrated in a Speed-Vac concentrator to 1-2 ml. Tan The protein sample was applied to a Superdex 75 column, 25 mM Tris (pH 8.7), Elution was with 150 mM NaCl. The 80 KD protein eluted as a homogeneous protein. C.71 KD Extracellular products   1. 40% to 95% ammonium sulfate precipitate, 71 KD product at 0% COTwoUnder pH 7.4 Cultured in 7H9 broth and heat shocked once a week at 42 ° C for 3 hours Obtained as discussed in. The precipitate was separated from the Initial Buffer (20 mM HEPES, 2 mM MgAc, 25 mM KCl, 10 mM (NHFour)TwoSOFourTo 0.8 mM DL-dithiothreitol (pH 7.0) Dialysis was performed.   2. ATP agarose equilibrated with Initial Buffer It was applied to the column. Collect the eluate and reapply to an ATP agarose column. Was. The 71 KD protein bound to the column.   3. Thereafter, the ATP agarose column was firstly treated with Initlal Buffer, then 1M K Washed with Cl followed by Initial Buffer.   4. The homogeneous 71 KD protein was eluted from the column with 10 mM APT and Dialysis was performed against phosphate buffer. D.58 KD Extracellular products   1. A 25% to 50% ammonium sulfate precipitate was obtained as discussed above.   2. The resolubilized precipitate is dialyzed and subjected to DEAE Sepharose CL-6B or QAE Se It was applied to a pharose column and eluted with NaCl. Recovered 58 KD protein Fraction eluted at approximately 400 mM NaCl.   3. Next, the collected fraction was applied to a Sepharose CL-6B size fractionation column. did. The protein eluted at approximately 670-700,000 daltons.   4. Apply the eluted protein to a thiopropyl-Sepharose column. Was. Homogeneous 58 KD protein elutes at approximately 250-350 mM 2-mercaptoethanol did. The eluted protein was monitored using SDS-PAGE and the color of FIG. The single band shown in FIG. E. FIG.45 KD Extracellular products   1. a. The 0-25% ammonium sulfate fraction (1 hour at 0 ° C.) was discarded.       b. The 25% -60% ammonium sulfate fraction (0 ° C. overnight) was retained.   2. a. A DEAE CL-6B column (Pharmacia) was loaded on a 2.5 mM tris containing 1 M NaCl. (PH 8.7) and equilibrated with 25 mM Tris, 10 mM NaCl (pH 8.7). Was.       b. Protein samples were run against 25 mM Tris, 10 mM NaCl (pH 8.7). Dialyzed and applied to the column. The column is then overnight in the same buffer Washed.       c. The column is run in a 25 mM Tris (pH 8.7) buffer with a salt gradient (10 mM to 20 mM). 0 mM). The 45 KD protein eluted at approximately 40 mM NaCl.   3. a. Use a Q-Sepharose HP column (Pharmacia) with a 25 mM gel containing 1 M NaCl. Packed with squirrel (pH 8.7) and re-equilibrated with 25 mM Tris, 10 mM NaCl (pH 8.7) .       b. Protein samples were run against 25 mM Tris, 10 mM NaCl (pH 8.7). Dialyzed and applied to the column, followed by a subsequent wash with the same buffer.       c. The column was eluted with 10-150 mM NaCl in 25 mM Tris (pH 8.7).   4. a. Fractions containing 45 KD product are collected, pooled, and Speed Vac concentrated And then dialyzed against 25 mM Tris, 10 mM NaCl (pH 8.7). did.       b. The concentrate was Superd equilibrated with 25 mM Tris, 150 mM NaCl (pH 8.7). It was applied to ex 75 column. The product eluted as a homogeneous protein. Elute The protein was monitored using SDS-PAGE and shown in column 2 of FIG. 1B. Presented a single band. F.32 KD Extracellular product (A)   1. a. The 0-25% ammonium sulfate fraction (1 hour at 0 ° C.) was discarded.       b. The 25% -60% ammonium sulfate fraction (0 ° C. overnight) was retained.   2. a. A DEAE CL-6B column (Pharmacia) was loaded with 25 mM Tris containing 1 M NaCl. (PH 8.7) and equilibrated with 25 mM Tris, 10 mM NaCl (pH 8.7).       b. Protein samples were run against 25 mM Tris, 10 mM NaCl (pH 8.7). Dialyzed and applied to the column, followed by an overnight wash with the same buffer. Was.       c. The column is loaded with a salt gradient (10 mM to 200 mM) at 25 mM Tris (pH 8.7). Eluted. The 32 KD protein eluted at approximately 70 mM NaCl.   3. a. Fractions containing the 32 KD product were collected, pooled, and 25 mM Tris , Dialyzed against 10 mM NaCl (pH 8.7) and sampled with a Speed Vac concentrator. Le Was concentrated to 1 ml.       b. The concentrate was then equilibrated with 25 mM Tris, 150 mM NaCl (pH 8.7). Was applied to a Superdex 75 column and eluted with this buffer. 32 KD products are uniform Eluted as protein.   4. a. Using a Q-Sepharose HP column (Pharmacia) in 25 mM Tris containing 1 M NaCl (PH 8.7) and re-equilibrated with 25 mM Tris, 10 mM NaCl (pH 8.7). Was.       b. Protein samples were run against 25 mM Tris, 10 mM NaCl (pH 8.7). Dialyzed and applied to the column, followed by a subsequent wash with the same buffer.       c. The column was eluted with a 100-300 mM NaCl gradient. Labeling of homogeneous proteins 32A elutes at about 120 mM NaCl and shows a single band in column 4 of FIG. 1B. G. FIG.32 KD Extracellular product (B)   1. a. The 0-25% ammonium sulfate fraction (1 hour at 0 ° C.) was discarded.       b. The 25% -60% ammonium sulfate fraction (0 ° C. overnight) was retained.   2. a. A DEAE CL-6B column (Pharmacia) was loaded with 25 mM Tris containing 1 M NaCl. (PH 8.7) and then equilibrated with 25 mM Tris, 10 mM NaCl (pH 8.7) .       b. Protein samples were run against 25 mM Tris, 10 mM NaCl (pH 8.7). And applied to the column, followed by an overnight wash with the same buffer.       c. Preliminary salt gradient from 10 mM to 200 mM NaCl in 25 mM Tris (pH 8.7) To elute various proteins. After column equilibration, a second salt concentration gradient (20 0-300 mM NaCl). The 32 KD protein eluted at approximately 225 mM NaCl.   3. a. Use a Q-Sepharose HP column (Pharmacia) with a 25 mM gel containing 1 M NaCl. Load squirrel (pH 8.7) and re-equilibrate with 25 mM Tris, 10 mM NaCl (pH 8.7) It has become.       b. Protein samples were run against 25 mM Tris, 10 mM NaCl (pH 8.7). Dialyzed, applied to the column, and subsequently washed with the same buffer.       c. The column was eluted with a 200-300 mM NaCl gradient in the same buffer.   4. a. Fractions containing the 32 KD product were collected and pooled, 25 mM Tris, 10 mM Dialyze against NaCl (pH 8.7), then protein sample on Speed Vac concentrator Was concentrated to 1 ml.       b. The concentrate was then equilibrated with 25 mM Tris, 150 mM NaCl (pH 8.7). Superdex 75 column and eluted with the same buffer. Protoco In order to distinguish between the 32 KD protein and the 32 KD product separated using H The 32B product was eluted as a homogenous protein and a single buffer was applied to column 3 of FIG. As a command. H.30 KD Extracellular products   1. a. The 0-25% ammonium sulfate fraction (1 hour at 0 ° C.) was discarded.       b. The 25% -60% ammonium sulfate fraction (0 ° C. overnight) was retained.   2. a. A DEAE CL-6B column (Pharmacia) was loaded with 25 mM Tris (pH 8) containing 1 M NaCl. .7) and then equilibrated with 25 mM Tris, 10 mM NaCl (pH 8.7).       b. Protein samples were run against 25 mM Tris, 10 mM NaCl (pH 8.7). Dialyzed and applied to the column, followed by an overnight wash with the same buffer. Was.       c. The column is run in a 25 mM Tris (pH 8.7) buffer with a salt gradient (10 mM to 20 mM). 0 mM). The 30 KD protein eluted at approximately 140 mM NaCl.   3. a. Fractions containing the 30 KD product were collected and pooled, 25 mM Tris, 10 mM Dialyze against NaCl (pH 8.7), then protein sample on Speed Vac concentrator Was concentrated to 1 ml.       b. The concentrate was then equilibrated with 25 mM Tris, 150 mM NaCl (pH 8.7). Applied to a Superdex 75 column and eluted with this buffer. 30 KD products It elutes as a homogeneous protein and shows a single band in column 5 of Figure IB. I.24 KD Extracellular products   1. a. The 0-25% ammonium sulfate fraction (1 hour at 0 ° C.) was discarded.       b. The 25% -60% ammonium sulfate fraction (0 ° C. overnight) was retained.   2. a. A DEAE CL-6B column (Pharmacia) was loaded with 25 mM Tris containing 1 M NaCl. (PH 8.7) and then equilibrated with 25 mM Tris, 10 mM NaCl (pH 8.7) .       b. Protein samples were run against 25 mM Tris, 10 mM NaCl (pH 8.7). Dialyzed and applied to the column, followed by an overnight wash with the same buffer. Was.       c. Preliminary salt gradient from 10 mM to 200 mM NaCl in 25 mM Tris (pH 8.7) To elute various proteins. After column equilibration, a second salt concentration gradient (20 0-300 mM NaCl). 24 KD eluted at approximately 250 mM NaCl.   3. a. Use a Q-Sepharose HP column (Pharmacia) with a 25 mM gel containing 1 M NaCl. Fill with squirrel (pH 8.7) and re-equilibrate with 25 mM Tris, 10 mM NaCl (pH 8.7) It has become.       b. Protein samples were run against 25 mM Tris, 10 mM NaCl (pH 8.7). Dialyzed and applied to the column, followed by a subsequent wash with the same buffer.       c. The column was eluted with a 200-300 mM NaCl gradient in the same buffer.   4. a. Fractions containing the 24 KD product were collected and pooled, and 25 mM Tris, Dialyze against 10 mM NaCl (pH 8.7), then protein concentrate on Speed Vac concentrator. The sample was concentrated to 1 ml.       b. The concentrate was then equilibrated with 25 mM Tris, 150 mM NaCl (pH 8.7). On a Superdex 75 column and eluted with the same buffer. 24 KD products are It elutes as a single protein and shows a single band in column 7 of FIG. 1B. J.23.5 KD Extracellular products   1. a. The 0-25% ammonium sulfate fraction (1 hour at 0 ° C.) was discarded.       b. The 25% -60% ammonium sulfate fraction (0 ° C. overnight) was retained.   2. a. The DEAE CL-6B column (Pharmacia) contains 25 mM Tris containing 1 M NaCl. (PH 8.7) and then equilibrated with 25 mM Tris, 10 mM NaCl (pH 8.7) .       b. Protein samples were prepared against 25 mM Tris, 10 mM NaCl (pH 8.7) It was dialyzed and applied to the column before a subsequent overnight wash with the same buffer.       c. The column was subjected to a salt gradient (10 mM to 20 mM) in 25 mM Tris (pH 8.7) buffer. 0 mM). The 23.5 KD protein eluted at approximately 80 mM NaCl.   3. a. The Q-Sepharose HP column was loaded with 25 mM Tris (pH 8.7) containing 1 M NaCl. ) And re-equilibrated with 25 mM Tris, 10 mM NaCl (pH 8.7).       b. Protein samples were run against 25 mM Tris, 10 mM NaCl (pH 8.7). Dialyzed and applied to the column, followed by a subsequent wash with the same buffer.       c. The column eluted with 100-300 mM NaCl in 25 mM Tris (pH 8.7) .       d. Steps 3a to 3c were repeated.   4. a. Fractions containing the 23.5 KD product were collected and pooled, 25 mM Tris, 10 m Dialyze against M NaCl (pH 8.7), and then protein in a Speed Vac concentrator The sample was concentrated to 1 ml.       b. The concentrate was then equilibrated with 25 mM Tris, 150 mM NaCl (pH 8.7). Superdex 75 column and eluted with the same buffer. 23.5 KD The product eluted as a homogeneous protein. The eluted protein is analyzed using SDS-PAGE. And resulted in the single band shown in column 6 of FIG. IB. K.23 KD Extracellular products   1. a. 0-25% (1 hour at 0 ° C.) and 25% -60% (overnight at 0 ° C.) The ammonium fraction was discarded.       b. The 60% -95% ammonium sulfate fraction was retained.   2. a. DEAE CL-6B column (Pharmacia) was loaded with 50 mM bis-containing 1 M NaCl. Fill with Tris (pH 7.0), then 50 mM Bis-Tris, 100 mM NaCl (pH 7.0) To equilibrate.       b. Protein samples were prepared using 50 mM Bis-Tris (pH 7.0), 100 mM NaCl Dialyze against buffer and wash the column with the same buffer overnight before washing the column. Applied.       c. The column was linearized with 100-300 mM NaCl in 50 mM Bis-Tris (pH 7.0). Eluted with a gradient.       d. The fraction containing the 23 KD protein eluted at approximately 100-150 mM NaCl was recovered. Received.   3. a. The protein fraction was permeated against 25 mM Tris (pH 8.7), 10 mM NaCl. The mixture was separated and concentrated to 1-2 ml with a Savant Speed Vac concentrator.       b. The concentrate was Superd equilibrated with 25 mM Tris, 150 mM NaCl (pH 8.7). It was applied to ex 75 column. The product was washed with the uniform tamper shown in column 8 of FIG. 1B. And eluted as a solid. L.16 KD Extracellular products   1. a. The 0-25% ammonium sulfate fraction (1 hour at 0 ° C.) was discarded.       b. The 25% -60% ammonium sulfate fraction (0 ° C. overnight) was retained.   2. a. A DEAE CL-6B column (Pharmacia) was loaded on a 2.5 mM tris containing 1 M NaCl. And then equilibrated with 25 mM Tris, 10 mM NaCl (pH 8.7). Was.       b. Protein samples were run against 25 mM Tris, 10 mM NaCl (pH 8.7). Dialyzed and applied to the column, followed by an overnight wash with the same buffer. Was.       c. The column was subjected to a salt gradient (10 mM to 20 mM) in 25 mM Tris (pH 8.7) buffer. 0 mM). The 16 KD protein eluted at approximately 50 mM NaCl.   3. a. Fractions containing the 16 KD product were collected and pooled, 25 mM Tris, 10 m Dialyze against M NaCl (pH 8.7) and protein sump in a Speed Vac concentrator. Was concentrated to 1 ml.       b. The concentrate was then equilibrated with 25 mM Tris, 150 mM NaCl (pH 8.7). Superdex 75 column and eluted with the same buffer. Elution tan The protein was monitored using SDS-PAGE and the results are shown in column 9 of FIG. 1B. This resulted in a single band. M.14 KD Extracellular products   1. a. The 0-25% ammonium sulfate fraction (1 hour at 0 ° C.) was discarded.       b. The 25% -60% ammonium sulfate fraction (0 ° C. overnight) was retained.   2. a. A DEAE CL-6B column (Pharmacia) was loaded with 25 mM Tris (pH 8) containing 1 M NaCl. .7) and then equilibrated with 25 mM Tris, 10 mM NaCl (pH 8.7).       b. Protein samples were run against 25 mM Tris, 10 mM NaCl (pH 8.7). Dialyzed and applied to the column, followed by an overnight wash with the same buffer. Was.       c. The column was subjected to a salt gradient (10 mM to 20 mM) in 25 mM Tris (pH 8.7) buffer. Eluted to 0 mM). The 14 KD protein eluted at approximately 60 mM NaCl.   3. a. Pack a Q-Sepharose HP column with 25 mM Tris (pH 8.7) containing 1 M NaCl. And re-equilibrated with 25 mM NaCl (pH 8.7).       b. Protein samples were run against 25 mM Tris, 10 mM NaCl (pH 8.7). Dialyzed and applied to the column, followed by a subsequent wash with the same buffer.       c. The column was eluted with 10-150 mM NaCl in 25 mM Tris (pH 8.7).       d. Steps 3a to 3c were repeated.   4. a. Fractions containing the 14 KD product were collected and pooled, 25 mM Tris, 10 m Dialyze against M NaCl (pH 8.7) and protein sump in a Speed Vac concentrator. Was concentrated to 1 ml.       b. The concentrate was then equilibrated with 25 mM Tris, 150 mM NaCl (pH 8.7). Was applied to a Superdex 75 column and eluted with this buffer. 14 KD products are homogeneous Eluted as protein. Monitor the eluted protein using SDS-PAGE, The result was the single band shown in column 2 of FIG. 1C. N.12 KD Extracellular products   1.0 to 10% ammonium sulfate precipitate was obtained (overnight at 4 ° C).   2. The resolubilized precipitate was applied to an S200 Sephacryl size fractionation column, The protein of 12 KD molecules was eluted.   3. The protein fraction was subjected to DEAE-Sepharose CL-6B or QAE-Sepharose ion exchange. The column was applied to an exchange column and eluted with a NaCl gradient as described above. About 12 KD Fractions containing two homologous proteins having a molecular weight of about 300-350 mM NaC eluted and collected. Proteins are labeled 12A and 12B, and FIG. Purified as the doublet shown in column 2.   As shown in the SDS-PAGE profile of FIG. tuberculosis is major Alternatively, abundant extracellular proteins may be obtained from the protocol detailed in Examples 2A-2N above. And purified to homogeneity. More specifically, FIG. 1 shows SDS-PAGE and labeling. Four typical 12.5% acrylamides developed using 1A, 1B, 1C, and 1D Shows Dogel. The standards in lane 1 of gels 1A-1C have molecular weights of 66, 45, 36, 29, 24, 20 And 14 KD molecular weight protein. For gel ID, the standard for lane 1 is , Containing proteins with molecular weights of 68, 45, 31, 29, 20, and 14 KD. each The lane containing each purified extracellular product is labeled with the molecular weight of the individual protein reported. One band is qualitatively shown. On gel 1D, 12 KD protein is visible in lane 2 Note that it runs as a doublet. For sequencing analysis, the lower 12 KD (or 12B KD band) except that it lacks the first 3 N-terminal amino acids And is equivalent to the upper 12 KD (or 12 A KD) band.   Further analysis of these individual typical predominantly abundant extracellular products is shown in FIG. More specifically, FIG. 2 shows a table of N-terminal sequence data obtained from these purified extracellular products. Compilation, showing that the majority of the isolated products are substantially different (SEQ ID NO: 1 ~14). All of proteins 32A, 32B and 30 have the same five N-terminal amino acids. Therefore, additional features are needed to fully characterize and identify these proteins. Column determination was mandatory. FIG. 3 shows these three purified secretion products (SEQ ID NOS: 15-17) 1 shows an extended N-terminal amino acid sequence. Position 16 (SEQ ID NO: 17), Position 31 (SEQ ID NO: 16 ) And 36 (SEQ ID NO: 16) differ by amino acids in these isolated proteins. Prove that the proteins differ from each other despite their molecular weight similarities.   Extended N-terminal of proteins 30, 32A and 32B plus other mainly abundant extracellular products Determine the terminal amino acid sequence to provide primary structural data, and Clarified the relationship. Sequencing was performed on extracellular products purified according to Example 2. This was performed using techniques well known in the art. Look at intact proteins Standard letter for naturally occurring amino acids, identified by their molecular weight N-terminals of various lengths determined for each extracellular product, expressed using the notation The amino acid sequence is shown below. The N-terminal sequence must be Write from left to right in the direction from the amino terminus to the carboxy terminus. Amino determined Where apparent or ambiguous, the position in the sequence is indicated by a dash. Finally, If two amino acids are separated by diagonal lines, the exact components are clearly identified. Or either one cannot occupy the position in the sequence.   DNA sequencing was performed using techniques well known in the art at 30, 32A, 16, 58, 23.5 and And 24 KD proteins. Apparent molecular weight of intact protein DNA sequences identified by these and their corresponding, including upstream and downstream sequences Amino acids are indicated using standard abbreviations and notational rules.   This sequence data is combined with the physical properties identified using SDS-PAGE, Allows characterization and identification of these representative predominantly abundant extracellular products of the invention To The described analysis indicates that these proteins account for approximately 60% of the total available extracellular product. M. with 71 KD, 30 KD, 32 A KD, 23 KD and 16 KD including the amount. tuberculosis It shows that it constitutes the majority of extracellular products. In addition, the 30 KD protein is M. tu It can constitute up to 25% (by weight) of all products released by berculosis. Is estimated. Thus, each typically typically mainly rich M. extracellular of tuberculosis The product can range anywhere from about 0.5% to about 25% of the total weight of the extracellular product You.   As discussed earlier, traditional Western blotting is the most immunologically specific Following the inability to consistently identify extracellular products, the inventor The immunogenicity of various extracellular products, their abundance and consequent identification and isolation Analyzed based on ease of Surprisingly, these mainly abundant extracellular products Have been found to elicit a surprisingly effective immune response. It has been concluded that the extracellular product of can function as a vaccine. This amazing departure The look has led to the development of the non-limiting functional theory of the invention described above.   In order to prove the effectiveness of the present invention, an art-recognized experimental model was used. And several predominantly abundant extracellular products at various typical doses to induce protective immunity Further experiments were carried out using this and combinations thereof. More specifically, the purified primary Protective immunity is induced in guinea pigs using extracellular products To M. The antigen was administered by tuberculosis. These proteins induce protective immunity To demonstrate that the combination of the five purified, predominantly abundant extracellular products Were similarly tested using different routes of administration. Abundant extracellular products, especially at 30 KD Immunization in animal models approved as a purified form of 71 KD extracellular product Induced the epidemic. As with each typical predominantly abundant extracellular product, five A combination vaccine of extracellular products, which is abundant in anti-tuberculosis Protection was provided against the original dose. Various studies of these typical vaccines of the present invention The results are shown below.   M. Includes immunogenic or aerosol challenge by tuberculosis In all experiments, male Hartley guinea pigs without specific pathogenicity (Charles R iver Breeding Laboratories, North Wilmington, Massachusetts) . Animals are housed in stainless steel cages in groups of two and three for standard guinea pigs. Food and water were available ad libitum. After arriving at the animal facility, the guinea pig must be healthy. In order to confirm the above, observation was performed for at least one week before the start of each experiment.   Initial experiments assumed that they accounted for 3% to 25% of the total extracellular proteins normally present Performed mainly with abundant extracellular products. These experiments are mainly Demonstrates that extracellular products elicit a romantic immune response. More specifically, The isolated 30 KD and 71 KD extracellular products had the following lethal doses of M. to tuberculosis The ability to individually produce a cell-mediated immune response that protects guinea pigs during exposure is Rukoto has been shown.                                 Example 3                 30 KD immunity                       Skin test of purified 30 KD protein   Demonstrates that abundant extracellular product purified forms can induce basolaterally possible immune responses To prove, a skin sensitivity test was performed. Guinea pigs are prepared according to Example 2. Purified and May account for about 25% of all extracellular products of tuberculosis Typical mainly rich M. Tuberculosis was immunized with 30 KD secretion product. Separate 3 In one experiment, guinea pigs were substantially purified with SAF adjuvant at 100 μM. Three immunizations were performed with g of 30 KD protein at three week intervals. For control animals, use SAF The prepared buffer was similarly injected. Three weeks after the last immunization, guinea pigs were In a skin hypersensitivity assay, a typical 30 KD protein was challenged.   Guinea pigs have shaved backs and 0.1, 1 and 10 μg of 30 KD protein. Erythema (skin redness) and depression resulting from the subcutaneous administration of the injections are shown in Table A below. Measured after 24 hours as indicated in. Data is measured using conventional methods , The group mean ± standard error (SE) is reported. The ND is this identification of the invention of Indicates that the phase was not performed.   As shown in Table A, guinea pigs immunized with a typical 30 KD secretion product were Shows a strong cell-mediated immune response as evidenced by marked erythema and sclerosis did. In contrast, control animals exhibited minimal response.   Confirm the immunoreactivity of the 30 KD secretion product and its application to infectious tuberculosis To demonstrate sex, non-immunized guinea pigs were isolated from M. guinea pigs. infected with tuberculosis, and Antigen was administered with the protein of the present invention as shown below.                                 Example 4                   M. Guinea pigs infected with tuberculosis           Purified 30 KD protein test for cell-mediated immune response   In order to obtain bacteria for use in experiments that require guinea pig infection, M. guinea pigs have been identified. t Culture uberculosis on 7H11 agar first, and confirm that these bacteria are toxic. One pass was made through the guinea pig lung to confirm. For this purpose, guinea pigs About 5 × 10FourWith a suspension of 10 ml of bacteria in 7H9 broth containing bacteria / ml Challenge with aerosols. The animal is killed after the guinea pig becomes ill And remarkable M. The lung containing the tuberculosis lesion was removed. Crush each lung, 7 The cells were cultured on H11 agar for 7 to 10 days. Bacteria are scraped off the plate and 10% glyce Dilute with 7H9 broth containing rolls and in a water bath to obtain a single cell suspension Sonicate and about 2 × 107Slow freezing at -70 ° C at a concentration of viable bacteria / ml did. For viability of frozen cells, thaw the bacterial suspension and suspend this suspension on 7H11 agar. Was determined by culturing serial dilutions of Immediately prior to antigen administration, the bacterial cell The vials were thawed and diluted with 7H9 broth to the desired concentration.   Viable guinea pigs in a specially designed Lucite aerosol chamber Powerful M. Exposure to tuberculosis aerosol. Aerosol chamber is 14 X 13 x 24 inches, diameter 6 for introducing or removing guinea pigs on opposing surfaces Includes two inch inlets. The aerosol inlet is located at the center of the chamber ceiling It was located. The vacuum pump (Gast Mfg. Co., Benton Harbor, Michigan) is 30 1b / InTwoNebulizer-Venturi Unit (Mes Inc., Burbank, California) The aerosol was generated from 10 ml of the bacterial suspension. 0.2μm Respiratory circuit filter unit (Pall Biomedical Inc., Fajardo, Puerto Rico) At one end of the chamber to balance pressure inside and outside this assembly It was located. For safety considerations, aerosol challenge is completely laminar in the chamber Placed in the hood.   The animals are allowed to grow for 30 minutes when the bacterial suspension in the nebulizer is completely consumed. Exposure to azole. Each aerosol, 5.0 × 10 per 1 mlFourContains bacteria Produced from 10 ml of suspension. Previous studies have shown exposure of guinea pigs to this concentration of bacteria. Dew shows consistent exposure to infection in unprotected animals. Air After injection, guinea pigs are placed in a laminar flow biohazard safety enclosure (Airo Clean Engineering  Inc., Edgemont, Pennsylvania). For signs of infection. The animals were given standard guinea pigs throughout the experiment. Food and drinking water ad libitum.   In this experiment, infected guinea pigs were sacrificed and various concentrations of 30 KD Spleen lymphocyte proliferation was measured according to the quality of the spleen. More specifically, collecting spleen lymphocytes And Brieman and Horwitz (J. Exp. Me), which are incorporated herein by reference. d. 164: 799-811), which is incorporated herein by reference. Purified. Lymphocytes were treated with penicillin (100 U / ml), streptomycin ( RPMI 1640 (GIBCO) containing 100 μg / ml) and 10% fetal bovine serum (GIBCO). Laboratories, Grand Island, New York)7/ Ml final concentration and total volume In a volume of 100 μl, microwells (96-well) In a round bottom tissue culture plate; Falcon Labware, Oxnard, California) COTwoIncubated at -95% air and 100% humidity at 37 ° C for 2 days. Uninfected animals are shade Used as a sex control. At the end of the incubation period, 0.25 μCi [ThreeH] J Midine (New England Nuclear, Boston, Massachusetts) was added to each well, And the cells are 5% COTwoIncubation at 37 ℃ under -95% air and 100% humidity for another 2 hours I did it. Multisample automated cell harvester Wash each well using (Skatron Inc., Sterling, Virginia) and elute The liquid was passed through a filter mat (Skatron). Separate microtest wells Put a filter mat section showing the specimen in a scintillation vial, and 2 ml of Ecoscint H liquid scintillation cocktail (National Diagnostics, Manv ille, New Jersey). Beta emission is measured by a β scintillation counter ( (Beckman Instruments Inc., Fullerton, California).   Tissue samples from infected and uninfected guinea pigs were Assayed against g / ml isolated 30 KD secreted protein. Then sump To [Three[H] Thymidine incorporation was monitored. Of these assays The results are tabulated and are shown in Table B below.   The data, for the purposes of this disclosure, is as follows:   Average of lymphocytes incubated with antigen [ThreeH] Thymidine uptake / anti- Average of lymphocytes incubated without primordia [ThreeH] thymidine incorporation Report as the stimulation index defined as   As shown in Table B, a dose-independent response primarily to exposure to abundant secreted products Cells from infected animals showed a major 30 KD It showed a strong response to the protein. Conversely, uninfected control animals have lymphocyte proliferation Showed little. Thus, the 30 KD secretion product is Infection with tuberculosis Induces a cell-mediated immune response in the mammal.   To illustrate the protective aspects of the vaccine of the present invention, guinea pigs were purified 30 KD Immunized with protein, and M. Exposure to tuberculosis.                                 Example 5                      Aerosolized M. At TUBERCULOSIS                      30 KD immunized guinea pig antigen administration   As described above, animals were treated with 100 μg of typical 30 KD protein in SAF for 3 weeks. Three immunizations were made at intervals. Control guinea pigs are immunized with a large volume of 120 μg EP with SAF. Or mock immunized with buffer adjusted with the same adjuvant. Last exemption Three weeks post-epidemiation, animals were aerosolized as described in Example 4. tuberculosi s. The survival rates of the three groups of animals were monitored and the diagram is shown in FIG. Show. Absolute mortality was determined 14 weeks after challenge as shown in Table C below. Specified.   As shown in FIG. 4, guinea pigs immunized three times with a typical 30 KD protein He was protected from death. About 67% of guinea pigs immunized with 30 KD protein Only 17% of control mock-immunized guinea pigs survived Did not survive.   The weight retention of the immunized animals was also monitored (data not shown) and according to the invention As taught, a vaccine incorporating mainly abundant extracellular products produced by pathogens Further illustrates the preventive potential of chin. Immunized animals seem to maintain weight In contrast, the high mortality of sham-immunized animals was higher than that of immunized and control animals. Could not be compared graphically.   At the end of the weight monitoring test, surviving animals are sacrificed and The right lung and spleen were transformed with viable M. Assayed for tuberculosis. animal In a 2% amphyl solution (National Laboratories, Montvale, New Jersey) And the lungs and spleen were aseptically removed. The number of gross initial surface lesions in the lungs, It was measured by visual inspection. M. in right lung and spleen. Tuberculosis colonization Units (CFU) are mortar and pestle and 90-mesh Norton Alundum (Fisher) Homogenize each organ with 10 ml of 7H9 broth using By serially diluting the plate and using a drop of 0.1 ml / drop. The dilutions were measured by culturing the dilutions on duplicate 7H11 agar plates. all No The rate is placed in a modular conditioned incubator chamber and the humidity 100% 5% COTwoWorked at -95% air at 37 ° C for 12-14 days. Assay with this protocol The results of the measurement were calculated using the average colony forming unit (CFU) ± standard error (S E) is shown in Table D below.   As shown in Table D, immunization with a typical 30 KD secreted protein resulted in lung and M. in spleen. The growth of tuberculosis was restricted. One surviving simulated immunization Only one data from the product was available for comparison purposes, but 4 live The surviving 30 KD immunized animals have less CFU in the lungs than the surviving sham immunized animals. Seven logs, one log less in the spleen. Previous results showing high correlation between CFU count and mortality Based on the evidence, surviving animals are those that died before CFU analysis could be performed. It appears that the lung and spleen had low CFU. Again, the lungs of the immunized animal and This reduction in CFU in the spleen demonstrates the scope and feasibility of the present invention.   M., a 71 KD extracellular product. of another mainly abundant extracellular product from tuberculosis The potential of immunoprotection was tested in its isolated form to demonstrate its immunoprotective potential.                                 Example 6                 Guinea pigs immunized with a large preparation of EP                       Purified 71 KD protein skin test   71 KD protein demonstrates potential for eliciting an effective immune response in animals To use this isolated, predominantly abundant extracellular product for skin sensitivity assays M. Mole immunized with a large preparation of tuberculosis extracellular protein (EP) Motts were subjected to skin testing. As discussed above, large numbers of EPs are Mild than Chin, but M. Acquired immunity against infection by tuberculosis Give.   Guinea pigs were combined with a large volume of 120 μg of the EP preparation prepared as detailed in Example 1. Two more immunizations were given at three week intervals. Vaccination with incomplete Freund adjuvant Prepared and performed on mock-immunized animals that received a buffer instead of EP. Last Wakuchi Three weeks after vaccination, guinea pigs from each group had their backs shaved and 0.1, 1.0 and Skin tests were performed by intradermal injection of 10 and 10 μg of 71 KD protein. 10.0 μg buffer Fluid was used as a control and all injections were made using a total volume of 0.1 ml. deep red The spot and stiffness diameters were measured after 24 hours with the results shown in Table E below. . Data are the mean measurements for groups as determined using conventional methods ± Report on quasi-error (SE).   Responses of the immunized animals were similar to those of guinea pigs challenged with buffer only. Approximately twice as large, a model challenged with the same volume of EP used to immunize the animals. Similar to that of Lumotte (data not shown).   Purified typical 71 KD predominantly abundant extracellular products trigger a cell-mediated immune response To further confirm what happened, guinea pigs immunized with large amounts of EP were killed, Then, spleen lymphocyte proliferation was measured according to various concentrations of 71 KD protein. Non Immunized animals were used as controls. Lymphocytes were isolated at 71 K according to the protocol of Example 4. Incubate with D and without 71 KD for 2 days and then [ThreeH] J Assays were performed for the capacity for incorporation of midine.   Data is reported on the stimulation index calculated as in Example 4. This 71 KD The results of the challenge are shown in Table F below.   As shown in Table F, the stimulation index for the lymphocyte proliferation assay was obtained with a skin sensitivity assay. Can be compared to the results obtained. Both the 71 KD and large EP test samples The response was 2-3 times higher than the response in the sample  KD mainly abundant extracellular products are M. Tumor cull in animals immunized with tuberculosis extract Has been shown to be able to stimulate a vesicle-mediated immune response. But most of the refined mostly abundant Extracellular products or major extracellular products are problems related to prior art or volume composition Of the vaccine of the present invention because it is more readily adaptable to synthetic and commercial production. Again, it must be emphasized that manufacturing is superior to the prior art.   More specifically, bulk preparation is easily manufactured on a large scale by modern biomolecular techniques. I can't get it. Commercial production of these crude bulk preparations containing all extracellular products Both productions involve large-scale cultivation steps for the target pathogen or closely related species, and Collecting the supernatant obtained as a fruit. Such a production methodology is targeted Highly susceptible to contamination by pathogens, toxic by-products or other parasitic agents. Further In addition, a number of immunogenic determinants contained in such preparations are sensitive to the sensitivity of the immune maternal population. It is much more likely to elicit a toxic immune response in the segment. The use of these crude bulk preparations is also Denies the use of the most common skin tests currently used for rolls.   Conversely, the vaccines of the present invention are relatively safe to use with high yield transformed hosts. Can be mass-produced. Similarly, the vaccines of the invention can be produced exactly the same, and Batches are easily standardized as opposed to the production of a wide variety of extracellular products. In addition, the host Due to the relatively small number of immunogenic determinants presented to the immune system, toxic reactions and Opportunities to invalidate general screening tests are greatly reduced.                                 Example 7             Purified 71KD protein skin test of guinea pigs immunized with 71KD   Isolated, typically 71 Kb, predominantly abundant extracellular products are found in bulk EP immunized animals. Have been shown to produce a cell-mediated immune response, followed by purification of this predominantly abundant product. It was shown that the morphology could induce a cellular immune response in animals immunized at 71 KD.   Guinea pigs are vaccinated twice every three weeks with 100 μg of purified 71KD protein in SAF. Was inoculated. Mock immunization of control animals with buffer in SAF on the same schedule It has become. Three weeks after the final immunization, both sets of animals received 1 and 10 μg of isolated 71 KD The protein was challenged transdermally. Erythema and sclerosis occurring after 24 hours were measured . The results are shown in Table G below.   The degree of sclerosis and erythema was less in immunized animals than in non-immunized control animals. Always large, strong cellular immune response to 71KD protein Indicates that it was started with a seed protocol.   This abundant extracellular product elicits its own effective immune response according to the teachings of the present invention. To further confirm the ability to induce, a lymphocyte proliferation assay was performed. Table G Immunized animals are sacrificed and using the protocol established in Example 4 Then, a spleen lymphocyte proliferation assay was performed. Tissue sun derived from 71KD immunized guinea pig 0.1, 1 and 10 μg / m for tissue samples from pull and control guinea pigs l of the isolated 71KD protein, and [ThreeH] About thymidine uptake ability And monitored. The stimulation index was calculated as described above. Of these assays The results are shown in Table H below.   As with the skin sensitivity assay, the 71 KD immunized animals were better than the sham-immunized controls. Also showed a very large response to the purified 71 KD. Expected by foreign protein Nevertheless, such results are mainly due to the abundant extracellular products It clearly shows that it has the ability to induce.   Isolated mainly abundant extracellular proteins can induce effective cellular immune responses After establishing that any of these reactions are cross-reactive with M. tuberculosis, Further experiments were performed as follows to confirm the above.                                 Example 8       M. Purified 71KD protein antigen administration test of guinea pigs infected with TUBERCULOSIS   Non-immunized guinea pigs were aerosolized as described in Example 4. tuber Infected with culosis. If the infected animal is M. Cellular immune response suggests tuberculosis Purified protein derivatives (PPD-CT68, Connaught Laboratories Ltd.) was used as a positive control. Tuberculosis exposure PPD, which is widely used in the Mantoux test for Of small proteins with an average molecular weight of about 10 KD, prepared by Contains mixtures. The immune response to PPD was determined with the bulk EP fraction isolated in Example 1. Substantially homologous to the one induced.   Three weeks after infection, 0.1, 1 and 10 μg of a typical purified mainly abundant 7 A 1KD extracellular protein was administered transdermally. Non used as control Infected animals were similarly challenged with the isolated protein. 24 degree of erythema and hardening Measured after time and the results are reported in Table I below.   As shown in Table I, typical purified predominantly abundant extracellular proteins of the invention There is a strong immune response in the treated infected animals. These responses are 3 for erythema ~ 4 times, more than 10 times for hardening, stronger than uninfected animals, the main 71KD cells External proteins are M. Induces strong cellular immune responses in tuberculosis-infected animals Has been confirmed to be.   To further confirm these results, infected and uninfected animals were sacrificed, The cells were subjected to a lymphocyte proliferation assay according to the protocol of Example 4. Moles in both sets Mott-derived tissue samples were isolated at 0.1, 1 and 10 μg / ml of the isolated 71 KD protein. Assayed for protein and PPD. Then, as described above [ThreeH] Thymidine The samples were monitored for penetration and the results of these assays were reported in Table J below. Shown in   As with the skin sensitivity assay, Table J shows that the irritated fingers were more Indicates that the number is much larger. More specifically, the average peak stimulation finger of infected animals Numbers are greater for the typical 71 KD protein than for the uninfected control. Twice as high and three times as high as PPD, which is why the typical mainly rich details of the present invention M. extracellular protein vaccine Strong cellular immunity in tuberculosis-infected animals It was confirmed that an epidemiological response was induced.   Typical purified 71 KD mainly abundant protein and M. Cross-reaction with tuberculosis Following the demonstration of sex, these predominantly abundant extracellular products as disclosed in the present invention To demonstrate that a typical purified sample can stimulate an effective immune response Further experiments were performed.Example 9 Aerosolization M. Challenge administration of 71KD immunized guinea pigs by TUBERCULOSIS   Typical predominantly or predominantly abundant extracellular protein vaccine immunoprotective capacity 100 μg of a typical mainly abundant 71 KD protein purified according to Example 2 to show Guinea pigs were immunized twice with a guinea pig every three weeks. The control animals were Immunized with 120 μg of bulk EP from 1 or buffer. Ajuba all animals Immunization was carried out using the SAF. Three weeks after the last immunization, a typical 71 KD protein Skin test with 10 μg sample on guinea pigs immunized with Was evaluated. Next, control animals and 71 KD immunized guinea pigs As described in detail in Example 4, aerosolized M. Infected with tuberculosis. infection Thereafter, the animals were monitored and weighed for 6 months.   The graph in FIG. 5 shows the weight loss that occurred in the sham-immunized group with 71 KD and bulk EP. Contrast with relatively normal weight gain exhibited by immunized animals. In each group Data are mean body weights ± SE. The mortality curve for the same animal is shown in the graph of FIG. You. The absolute lethality ratios studied are shown in Table K below.   Both the weight loss curve and the mortality are clearly the predominantly abundant extracellular The protein is shown to confer a protective immune response. This means that 10 This is supported by the fact that 0% died by the end of the monitoring period.                                 Example 10       Aerosolization M. Challenge administration of 71KD immunized guinea pigs by TUBERCULOSIS   The results of the previous example were confirmed, and the injection of typical predominantly abundant extracellular proteins Similar experiments were performed to show that feeding could confer a protective immune response in animals . In this experiment, guinea pigs were treated three times every three weeks with 71 KD extracellular cells in 100 μg of SAF. It was immunized again with the protein. Mock control guinea pigs with buffer in SAF Immunized. Three weeks after the last immunization, animals received aerosolized M.E. Antigen in tuberculosis They were dosed and weighed once a week for 13 weeks. Average body of each group of 6 guinea pigs The weight ± SE was calculated and a graph is shown in FIG. This curve shows that immunized animals Almost the same weight was maintained, but the mock-immunized animals R Indicates that the weight of the subject has decreased. Loss or "depletion" of body mass is a classic of tuberculosis One of the major side effects is the consequence of the growth of M. tuberculosis in the immunized animal. 4 shows that growth was inhibited by a typical vaccine of the invention.   Guinea pigs are protected through vaccination with abundant extracellular products in isolated form Since the epidemic was developed, the interspecific immunoreactivity of the vaccine of the present invention was demonstrated, and guinea pigs were Experiments were performed to further confirm the validity and applicability of the model.                                 Example 11         PPD positive human cellular immunity test with purified 71KD protein   Assess the cellular component of the human immune response to a typical 71KD predominantly abundant protein To do this, PPD positive cells for the protein as reported in Example 4 The proliferation of peripheral blood lymphocytes in body and PPD negative individuals Studied in Say. Positive PPD, or tuberculin reactions, have been described in M.P. tuberc It is well known to those skilled in the art as an indication of infection with ulosis. Proliferative response and its Corresponding toThree[H] thymidine incorporation was measured on days 2 and 4. these The study data for is shown in FIGS. 8A and 8B. Figure 8A shows various levels of 71 KD after 2 days. FIG. 8B shows the same response on day 4.   As shown in FIGS. 8A and 8B, the average peak stimulation index of PPD positive individuals was 2 times higher for 71KD protein and 3 times higher for PPD than It was twice as expensive. Even among PPD-positive individuals, the typical 71KD protein and PPD There is a linear correlation between the peak stimulation indices. exposed to tuberculosis M. in humans Strong due to tuberculosis's main component or mainly abundant extracellular products Demonstrate that a stimulating cellular response is stimulated. This data is found in guinea pigs The guinea pig model responds to other mammals susceptible to infection, corresponding to the reactive profile. It is confirmed that it can be used.   Therefore, like the typical 30 KD protein discussed earlier, it is primarily abundant 71 KD The development of a strong immune response against extracellular products indicates that the 71 KD product is Broad range of the present invention as evidenced by the fact that it is also effective in stimulating Demonstrate.   The present invention also relates to M. Extracellular product of tuberculosis, or typical 71KD protein It must also be emphasized that the use of quality is not limited. Rather, The teachings of the present invention apply to any predominantly abundant extracellular product, as demonstrated in the Examples. Can be applied.   M. Whether a predominantly abundant extracellular product combination of tuberculosis also provides protective immunity Further research was done to ascertain whether this was the case. In general, these studies were tuber of a vaccine in SAF containing a combination of five purified extracellular proteins of culosis Immunized 3 times with various transdermal or subcutaneous immunizations, every 3-4 weeks Utilized guinea pigs.   The first protein combination used in the immunization procedure labeled combination I was performed 71 KD, 32 KD, 30 KD, 23 KD and 16 KD tampers purified by the protocol of Example 2 Quality included. This combination is described in M.E. Extracellular cells normally present in tuberculosis culture supernatant It appears to contain up to 60% of total protein. Selected for use in combination I These proteins are indicated by an asterisk in FIG. 100 for each protein μg, 20 μg and 2 μg in combination I vaccine with adjuvant SAF It was administered transdermally. The combination vaccine I containing 20 μg of each protein was subcutaneously Were administered in similar experiments. Use the same schedule for the negative control guinea pig Immunization with equal volumes of SAF and buffer, while positive control Were immunized in SAF with 120 μg of the bulk extracellular protein preparation from Example 1. Was. All injection volumes were standardized with buffer.                                 Example 12          Response of combination I immunized guinea pigs to combination I vaccine   Animals are measurable after vaccination with the combination I mixture of major extracellular products A skin sensitivity assay was performed to determine if an epidemiological response had developed. Mo Shaving the back of the guinea pig and adding 1.0 μg of the same combination of five purified extracellular proteins And 10.0 μg were injected subcutaneously. Use 10.0 μg of buffer as a control and All injections were made using a total volume of 0.1 ml. Erythema at the test site on the skin The diameter of stiffening was measured 24 hours after injection.   The measurement results are shown in Table L below. Data is determined using conventional methods, grouped Reported as mean ± standard error (SE). ND is an experiment for this particular aspect Indicates that no action was taken.   The data clearly shows that a strong cellular immune response to the combination I extracellular protein Indicates that it was produced by a vaccinated animal. Immunized guinea pigs It showed a measure of erythema and induration almost three times greater than the control animals.                                 Example 13     Aerosolization M. Immunoprotective analysis of combination I vaccine against TUBERCULOSIS   Three weeks after the last immunization, the guinea pig used in the previous hypersensitivity assay was aerosolized. Aerosolized M. tuberculosis, challenge with Erdman strain, and every 10 weeks Weekly body weight was measured. This aerosol challenge was performed using the protocol of Example 4. . Six animals immunized with 100 μg of the major extracellular product combination I were given positive and Aerosolization at the same time with equal-sized groups of negative and negative controls M. Tuberculosis was challenged. Positive control is 120 μg in SAF Immunized 3 times with EP.   Necropsy of guinea pigs that died before the end of the observation period was performed to detect the presence of tuberculosis foci. Inspected. Such lesions were found in all animals that died during the experiment.   Mean weight difference between immunized and control animals after aerosol challenge Was analyzed by repeated measures analysis of deviation (ANOVA). Immunization mode after antigen administration Viability differences between guinea pigs and control guinea pigs Sher) analysis (two-tailed exact test). Data are from 6 guinea pigs Is the average body weight ± standard error (SE) for each group.   The results of weekly weight measurement after antigen administration are shown in FIG. Immune with a combination of extracellular products Sham-immunized animals lost 15.9% of their total body weight compared to guinea pigs that had become guinea pigs. Posité Control body weights were immunized with a combination of five purified extracellular proteins Similar to animal weight. Body weight was normalized by body weight immediately before antigen administration. Combination I Differences between animals immunized with and sham-immunized controls were determined by repeated measures ANOVA There was a high degree of significance at p <.0000001.   The mortality was measured 10.5 weeks after the antigen administration. All three of the sham-immunized animals Died within 3 days of each other between 10 and 10.5 weeks after challenge. Experiment The mortality results are shown in Table M below.   After conclusion of the weight monitor study, surviving animals were sacrificed with excess carbonation and individual animals The right lung and spleen were harvested using the protocol of Example 5 to survive live M. About tuberculosis I did it. The results of the count, including the three animals that died in the last week of the experiment, were It is shown in Table N below in Ronnie forming units (CFU) ± standard error (SE).   Cells in the lungs between animals immunized with the purified protein combination and sham-immunized animals The log of the difference in bacterial concentration was 1.4, while the log of the difference in bacteria in the spleen was 0.9. Alongside this, the overall necropsy of the immunized animal shows that tuberculosis is higher than that of the sham-immunized animal. The association of the lung with was significantly reduced. With the bulk extracellular preparation (EP) of Example 1 Immunized positive control animals were treated with Combination I of purified extracellular protein. 0.7log more bacteria in lung and 0.5log more spleen than animals immunized with the compound .                                 Example 14     Immunoprotective analysis of combination I vaccine at low dose by subcutaneous and transdermal delivery   Example 13 shows that 100 μg of the individual protein (30 + 32A + 16 + 23 + 7 + 7) In 1), the animals immunized subcutaneously three times for 4 weeks showed immune protection, Lower antigen dose of protein, especially the immunoprotective ability of 20 μg or 2 μg of each protein Another experiment was performed to show As in Example 13, guinea pigs (one group 6) were subcutaneously subcutaneously in SAF with the combination protein (30 + 32A + 16 + 23 + 71) 3 times. Immunizations were given every other week. Animals receive 20 μg or 2 μg of individual protein per immunization Was administered. Control animals were mock-immunized using the previous protocol. 3 After a week, the animals were aerosolized M.p. Administer antigen with tuberculosis and measure body weight weekly for 9 weeks Specified. All immunized animals survived to the end of the experiment, but were not sham-immunized. One died before the end of the experiment. As shown in the following results, 5 times higher than in Example 13, Immunized animals were also aerosolized M. and at 50-fold lower doses. tuberculosis And delivery by both transdermal and subcutaneous routes was effective.   Simulated compared to guinea pigs immunized with 20 μg of each of the combination I proteins Immunized animals lost 12% of their total body weight during the 9 weeks of the experiment (body weight was Normalized). Guinea pigs immunized with 2 μg of each of the combination I proteins The sham-immunized animals lost 11% of their total weight compared to Therefore, low dose combinations Guinea pigs transcutaneously immunized with the I protein are described in Aerosolization with tuberculosis Protected against weight loss after challenge.   Similarly, guinea pigs transcutaneously immunized with low doses of Combination I protein are also described in tub Protected against splenomegaly associated with erculosis inoculation into the spleen. As shown in Table O, Animals immunized with 20 μg or 2 μg of each protein of Combination I respectively The spleen weighed 4.6 ± 1.2 g and 4.0 ± 0.8 g (mean ± SE), but the The average weight of the spleen was 9.6 ± 1.8 g (Table 1), or twice as large.   Guinea pigs transcutaneously immunized with low doses of the combination I protein also have Smaller M. It had tuberculosis CFU. As shown in Table P, sham immunization Immunization with 20 μg or 2 μg of each combination I protein compared to animals The guinea pigs had an average of 0.6-0.4 log less CFU in the spleen, respectively.   In addition, guinea pigs immunized subcutaneously with the combination protein lost weight, splenomegaly , And M. in the spleen. Protected from tuberculosis breeding. Same as described in Example 14. In the same experiment, guinea pigs were not subcutaneously immunized, but 4 times with 20 μg of the combination I protein. Dermally every 3 weeks. These animals had 20 μg of the combination I protein Protected animals received almost the same amount of challenge as animals immunized subcutaneously.                                 Example 15               For antigen administration by combination I and combination II               Response of combination I and combination II immunized guinea pigs   M. Other combinations of mainly abundant extracellular products of tuberculosis also provide protective immunity To confirm this, another experiment was performed. In one experiment, two combinations -Combination I (71, 32A, 30, 23 and 16) and Combination II (32A, 30, 24, 23 and And guinea pigs immunized with a vaccine containing 16)-. Combination II is M . Consists of up to 62% of all extracellular proteins normally present in tuberculosis supernatant it is conceivable that. Animals (6 per group) were treated individually with combinations I and II in SAF. Immunization was performed four times with 100 μg of protein every three weeks. Negative control also Mock immunizations were performed on the same schedule with the same volumes of SAF and buffer.   As in Example 12, whether the animal develops a measurable immune response after vaccination Animals were tested for delayed skin type hypersensitivity to determine this. Exempt with Combination II Infected animals were 16.8 ± 1.3 mm (mean ± SE) in response to skin test with Combination II. Mice with erythema and sclerosis of 12.8 ± 1.2 mm, while mock-immunized animals responded to combination II It had erythema of only 1.3 ± 0.8 mm and hardening of 0.3 ± 3 mm. Therefore, immunization with combination II The animals had erythema 12 times larger and sclerosis 40 times larger than the control. Comparison and Thus, animals immunized with combination I responded to the skin test with combination I by 21.3 ± 2. The sham-immunized animals had 0 mm erythema and a sclerosis of 15.8 ± 0.1, whereas It had a corresponding erythema of only 6.4 ± 0.8 mm and a hardening of 2.6 ± 0.7 mm. Therefore, Animals immunized with Combination I were 3 times larger than controls and 6 times larger Hardening. The difference from the control for the combination II protein is Was larger than that of the protein.   In the same experiment, the lower dose (20 μg of each protein vs. 100 μg of each) combination II protein Animals immunized with dentin also developed strong skin hypersensitivity to combination II. Above Thus, they responded to combination II with an erythema of 21.0 ± 2.0 mm and a hardening of 15.3 ± 0.9 mm Sham-immunized animals had only 1.3 ± 0.8 mm erythema and 0.3 ± 0.3 mm hard Had Therefore, animals immunized with a lower dose of Combination II protein Has 16 times greater erythema and 50 times greater stiffness than trolls, the difference is higher Larger than animals immunized with the amount of Combination II protein.                                 Example 16                     Aerosolization M. Against TUBERCULOSIS                 Immunoprotective analysis of combination I and II vaccines   Three weeks after the final immunization, the guinea pigs used in the previous hypersensitivity assay were aerosolized. Chemical M. Tuberculosis and Erdman strains were challenged and weighed once a week for 7 weeks. Real As in Example 13, there were 6 animals in each group. During the first 7 weeks post-challenge, sham Immunized animals lost an average of 19.5 g of body weight. In contrast, combination II (each protein Immunized with 100 μg) gained 52.4 g of body weight and a lower dose (each protein Animals immunized with 20 μg) gained an average of 67.2 g body weight. In contrast, combination I Animals immunized with increased body weight by 68 g. Therefore, immunization with combination II (100 μg) Sham-immunized animals lost 11% of total body weight compared to guinea pigs. Lower Compared to guinea pigs immunized with the dose (20 μg) of combination II, the mock immunized animals Lost 14% of total body weight. Sham-immunized animals are better than animals immunized with combination I. Lost 14% of the total weight.                                 Example 17              Against the same vaccine or combination of antigens                 Responses of Guinea Pigs Immunized with Combinations III-XII   M. To demonstrate the efficacy of various combinations of tuberculosis mainly abundant extracellular products, Further experiments were performed. In these experiments, Hartley-type guinea pigs were Intradermal immunization with two or more similarly purified vaccines containing predominantly extracellular products did. Identify purified extracellular products using apparent molecular weight measured by SDS-PAGE I do. Guinea pigs were immunized with the following combinations of mainly abundant extracellular products.                 Combination protein composition                 III 30 + 32A + 32B + 16 + 23                 IV 30 + 32A                 V 30 + 32B                 VI 30 + 16                 VII 30 + 23                 VIII 30 + 71                 IX 30 + 23.5                 X 30 + 12                 XI 30 + 24                 XII 30 + 58   Each combination vaccine contains 100 μg of each of the proteins listed in the table. Was. The volume of the combination vaccine was adjusted and injected intradermally in adjuvant SAF. As before, guinea pigs were immunized four times every three weeks.   Animals can be measured in skin sensitivity assay after vaccination with combinations III-XII Performed to determine if a potent immune response was developed. From six guinea pigs Groups shaved their backs and used the same combination of purified extracellular products they were immunized with. It was injected transdermally. For this challenge, dispense 10 μg of each protein in the combination. Fired. All injections were made in a total volume of 0.1 ml. Simulated immunization immunized with SAF only Activation controls were also used, reusing 10 μg of each protein in individual combinations. Skin tests were performed on Combinations III to XII. Perform erythema and sclerosis diameter at the skin test site Measurements were taken 24 hours after injection as described in Example 3.   The results of these measurements are shown in Table Q below. Determine data using traditional methods We report on the mean of the groups given ± standard error (SE).   The results show that for each combination of purified extracellular proteins, a strong cell It clearly shows that a mediated immune response has occurred. Immunized guinea pigs, all unions Erythema at least twice, and usually more than three times, did. In addition, immunized guinea pigs are better than controls for all combinations Also showed at least three times the cure.                                 Example 18      Immunoprotective analysis of combinations III-XII against aerosolized M. TUBERCULOSIS   To demonstrate the protective efficacy of these typical combinations of purified extracellular products, Immunization with Combinations III-XII 3 weeks after the final immunization using the protocol of Example 4 Guinea pigs were challenged with M. tuberculosis.   Consistent with the previous results, all guinea pigs immunized with combinations III-XII Protected from death after administration. Group immunized with combinations IV to XII 4 weeks after antigen administration 0 animals and 1 of 6 animals (17%) in the group immunized with combination III ), Two of the six sham-immunized animals died (33%). 10 after antigen administration At week 0 (0%) died in animals immunized with combinations IX and XII, combination III , IV, V, VI, X, and XI, one of 6 animals died (17 %), 1 of 5 animals immunized with combination VIII (20%), and union Sham-immunized animals compared to 2 dead (33%) of the 6 animals immunized with 50% died.   Guinea pigs that died before the end of the observation period were necropsied and enlarged tuberculosis lesions were identified. The traces were examined. Lesions were found in all animals that died during the study.   According to the conclusions of the mortality study, surviving animals were sacrificed with excess carbonation and The spleen of each animal was assayed for viable M. tuberculosis using Tokol. result Mean colony forming unit (CFU) with decreasing log from sham-immunized animals Is shown in Table R below. The asterisk next to the CFU value indicates spleen from one animal in each group. Indicates that the gut count was zero. For the purpose of calculation, the count zero is 10 per spleenThreeC Treated as FU or 3log.   Animals immunized with combinations III, IV, VI, VII, IX, X, XI and XII were sham-immunized On average at least 0.5 log fewer colony forming units than the epidemiological control M. tuberculosis in the spleen. In particular, combinations IV and VII -The average number of forming units was reduced by a factor of almost 10 and proved to be particularly effective. combination Animals immunized with V and VIII averaged less than sham-immunized controls It had 0.3 and 0.1 log less colony forming units (CFU) in the spleen, respectively. This dramatic reduction in colony forming units in immunized animals in accordance with the teachings of the present invention Again, it will be shown that the present invention can be applied to immune defense.                                 Example 19      At three different doses of combination XIII against antigen etc. in combination XIII                        Responses of immunized guinea pigs   Further defining the feasibility and scope of the present invention, the size of purified extracellular products Using different vaccination doses to demonstrate the efficiency of the combination Guinea pigs were immunized as described. In particular, another set of three mainly abundant extracellular products 50 μg, 100 μg and 200 μg of the combination were identified as combination XIII and 30 KD, 32 ( A) Included KD and 16KD proteins. As in the previous example, the group of animals was Every three weeks, the mice were immunized subcutaneously with another dose of combination XIII in SAF.   To determine if animals develop a measurable immune response after vaccination For this purpose, a skin sensitivity assay was performed. Shaved animal back and extracellular purified The product was injected intradermally with combination XIII containing 10.0 μg of each. All injections are 0 Performed using a total volume of .1 ml. The mock immunization control is also the same as for combination XIII. At the same dose. Measure erythema and sclerosis diameter at test site on skin 24 hours after injection did.   The results are expressed as the mean of the group determined using the conventional method ± standard error (SE). Is shown in Table S.   These results indicate that animals immunized with each of the three doses of combination XIII Again clearly shows that a strong cell-mediated immune response to combination XIII has occurred . The immunized animals exhibited erythema about 2-3 times that of the control erythema. More shock Significantly, control animals that showed minimal response in all cases were immune Epidemic animals showed at least 35 times hardening.                                 Example 20           At three different doses for aerosolized M. TUBERCULOSIS                         Immunoprotection analysis of combination XIII   To further demonstrate the protective immunity properties of the vaccines of the present invention at various doses, Immunized guinea pigs (6 per group) used in the previous skin sensitivity assay were Three weeks after the infection, aerosolized M. tuberculosis was challenged. Aerosolized antigen Administration was performed using the protocol detailed in Example 4. 12 in control group Simulated animals were also challenged at the same time.   FIG. 10 shows the results of body weight measurement each week after antigen administration. This is a combination XIII Guinea pigs immunized with each of the three doses were clearly protected from weight loss. Indicates that Immunized with higher doses of combination XIII (100 and 200 μg) Animals do indeed gain net weight and immunize at lower doses (50 μg) Animals showed relatively little weight loss. In contrast, sham-immunized animals , Its total weight decreased by about 22% in the weeks immediately following antigen administration, and during the 10-week observation period , An average reduction of 182 g.   Table U below shows the average body weight at the end of antigen administration and the average body weight at the start of antigen administration. Immunized animals and the results divided by the body weight at the start of the challenge. And the percent change in body weight for control animals and control animals. Similarly, the defense percent The mean percentage weight loss of the control to the average weight gain of the immunized animal. Or subtracted from percent reduction.   Table U shows that the sham-immunized animals had significant amounts of immunized animals during the monitoring period. Indicates weight loss (18-29%). Figure 10 shows one week over a 10 week monitoring period Net body of each group of immunized animals against mock immunized animals, plotted at each interval Submit a more graphical representation of the weight loss. Weight loss or "wasting" is a classic of tuberculosis These results indicate that growth of M. tuberculosis in immunized animals is one of the major side effects. And growth is inhibited at three different doses of a typical combination vaccine of the invention Indicates that                                 Example 21     Immunoprotection analysis of combinations XIV-XVIII against antigen administration of combinations XIV-XVIII   Shows the scope of the invention and the wide range of effective vaccines that can be formulated according to the teachings Therefore, five more combination vaccines (combinations XIV-XVIII) were tested in guinea pigs. Was. Identified by the apparent molecular weight of the purified extracellular product determined using SDS-PAGE, The composition of each combination vaccine is shown in the table below.                 Combination protein composition                 XIV 30, 32A, 16, 32B, 24, 23, 45                 XV 30, 32A, 16, 32B, 24, 23, 45, 23.5, 12                 XVI 30, 32A, 16, 32B, 24, 23                 XVII 30, 32A, 16, 32B, 24, 71                 XVIII                 I 30, 32A, 16, 23, 71   In addition to the new combination vaccine and appropriate controls, combination I also Used in this series of experiments. Guinea pigs are combined with each protein of combination XIV or XV. 50 μg of protein and 100 μg of each protein of combinations I, XVI, XVII and XVIII All were immunized intradermally in SAF adjuvant. Animals received a total of 4 injections for 3 weeks Immunizations were performed at intervals.   The skin sensitivity assay was performed after vaccination using the protocol discussed above. The test was performed to determine whether the product developed a measurable immune response. Guinea pig Shave back and inject the same combination of purified extracellular protein to be immunized intradermally Fired. For each challenge, a suitable combinatorial solution containing 10 μg of each protein Kuching was injected. All injections were made using a total volume of 0.1 ml. Sham immunization Controls were also skin tested at the same antigen dose for each combination. Description of Example 3 As indicated, erythema and sclerosis diameters at the skin test site were measured 24 hours after injection .   The results of these measurements are shown in Table V below. It is determined using conventional methods Are reported as the measured value of one group ± standard error (SE).   These results clearly show that Combinations XIV-XVIII and Combination I as described above Shows that a strong cell-mediated immune response was generated against Immunized animals are controlled The erythema was about twice as large as that of the erythema. Even more shockingly, immunized animals are not At least 10 times higher than sham-immunized controls, which showed minimal response in all cases It showed great hardening.                                 Example 22                     For aerosolized M.TUBERCULOSIS               Immunoprotection analysis of combinations XIV-XVIII and combination I   Confirm the immunoreactivity of the combination vaccine of Example 21 and apply to infectious tuberculosis The immunized guinea pig used in the previous skin sensitivity assay was Three weeks after immunization, aerosolized M. tuberculosis was challenged and Example 4 Was monitored using the following protocol. Mock immunization of the same 12 animals used in Example 20 The control group of animals was similarly challenged. Figure 11 shows the results of these antigen administrations. Shown graphically and directly in Table W below.   Measure the average body weight after the end of antigen administration, subtract the average body weight at the start of antigen administration, and Immunized animals and controls divided by the weight at the start of challenge 2 shows the percent change in body weight for animals. Similarly, the defense percentage is Average weight loss of the immunized animal And deducted from the account.   As shown in Table W, guinea pigs immunized with each combination vaccine showed Defended. Sham-immunized animals lost about 22% of their total body weight. In contrast, unions The preventive effect of vaccinated vaccine is that the weight gain actually increases in one of the test groups and Resulted in weight loss. In particular, animals immunized with combination XIV had 3% Animals that showed weight gain, while immunized with other combinations, had less than their total total weight Or lost 4-15%.   The results are shown graphically in FIG. This is the net of animals in each group after aerosol challenge. Weekly body weight measurements are plotted for weight gain and loss in. Shown in Figure 11 The statistically significant difference between the immunized animals and the sham-immunized controls Provides further evidence for the immunopreventive response developed by the combination vaccine.                                 Example 23    Cell-mediated immunity in guinea pigs immunized with three different adjuvants   To further demonstrate the broad applicability and diversity of the vaccine formulations of the present invention, different Immunogenicity studies were performed using adjuvants. In particular, three different immunogens (purified 30KD protein, combination I (30, 32A, 16, 23, 71) and combination XIII (30 , 32A, 16)), each with three different adjuvants (Syntex ) Adjuvant formulation I (SAF), incomplete Freund's adjuvant (IFA) and Nophosphoryl lipid A-containing adjuvant (MPL)). This Such adjuvants generally produce an immune response in an organism when administered with an immunogen. It is known to enhance   Guinea pigs were treated with combinations I and XIII containing 100 μg of each protein and three Approx. 100 μg of purified 30KD protein in different adjuvant formulations It has become epidemic. Guinea pigs were immunized three times with each formulation by injection every three weeks.   To determine if the guinea pig has developed a measurable immune response after immunization A skin sensitivity assay was performed. Guinea pig shaved and immunized The same immunogen was injected intradermally. For antigen administration, each tag in combinations I and XIII Inject 0 μg of protein I or 10 μg of purified 30KD protein in a total volume of 100 μl did. Guinea pigs mock-immunized with one of the three adjuvants were Skin testing was performed with each immunogenic formulation containing adjuvant. Erythema at the skin test site And the diameter of the sclerosis were measured 24 hours after challenge, as described in Example 3.   The results of these measurements are shown in Table X below. As discussed earlier, the data is accepted Groups are reported as ± SEM using statistical techniques provided.   As the data presented in Table X show, the combination vaccines and purified cells of the invention Extracellular products have a strong cell-mediated immunogenic response when formulated with different adjuvants. provide. In addition, each of the three adjuvants has Provide the same immunogenic response. In general, immune guinea pigs are Showed erythema diameter about 7-10 times that of it, but sclerosis was measured in control animals It was about 4-6 times larger than the one.   The ability of the present invention to elicit strong immunogenic responses in combination with different adjuvants Facilitates vaccine optimization. That is, a vaccine effective according to the teachings herein. The adjuvants used to produce the pharmaceutical formulations are primarily, for example, stable Based on consideration of secondary criteria of gender, absence of side effects, cost and storability Selected. These and other criteria not directly related to stimulating the immune response This is particularly important when developing vaccine formulations that are used widely in relatively early conditions. is there.                                 Example 24 Immunoprotective analysis of combinations XIX-XXVIII against antigen administration of combinations XIX-XXVIII   The broad scope of the invention extends to 10 additional combination vaccines, combinations XIX-XXV. Indicated by the generation of an immune response using III. New combination vaccine and appropriate Controls as well as positive controls to elicit an immune response in guinea pigs. Combinations IV and XIII were also used. Purified extracellular products measured using SDS-PAGE And the composition of each combination vaccine is as follows: Become.                     combination      Protein components                     XIX 30,32A, 23                     XX 30,32A, 23.5                     XXI 30,32A, 24                     XXII 30,32A, 71                     XXIII 30,32A, 16,23                     XXIV 30,32A, 16,23.5                     XXV 30,32A, 16,24                     XXVI 30,32A, 16,71                     XXVII 30,32A, 16,32B                     XXVIII 30,32A, 16,45                     IV 30,32A                     XIII 30,32A, 16   Guinea pigs were immunized a total of four times, each injection at three week intervals. Immunize animals Each combination vaccine used to perform the And a total volume of 0.1 ml.   Using the combination vaccine selected, using the protocol discussed in Example 3. Skin to determine if the animal has developed a measurable immune response after vaccination A hypersensitivity assay was performed. Shave the guinea pig back and use the same Percutaneous injection was performed with a combination of the same purified extracellular proteins. Animals The protein combination used for this was composed of 10 μg of each protein. Doubt Mock immune controls were also skin tested at the same dose of each combination. As in Example 3, leather The diameter of erythema and sclerosis at the skin test site was measured 24 hours after injection.   The results of these measurements are shown in Table Y below, with the average measurements for each group of animals. Expressed as the standard value ± standard error.   The results shown in Table Y show that when the same immunogen was challenged, combinations XIX to XXVIII This clearly shows that a strong cell-mediated immune response was generated. As before, the pair Combinations IV and XIII also elicited strong cell-mediated immune responses. Guinea pig Show less erythema than the response elicited in the corresponding sham-immune control animals Both were 2 times, generally 4 times and more. Similarly, stiffness exhibited by immunized animals Was at least 2 times, generally 3 to 4 times larger than that of the non-immunized control. The present invention The considerably stronger immune response generated in animals immunized according to the teachings of Fig. 7 shows the usefulness of the combined vaccine in immune protection.   One skilled in the art will also appreciate further advantages of the vaccines and methods of the present invention. For example, Each compound or selected combination of highly purified molecular species is Used in vaccines of interest rather than whole rear or its components The vaccine of the present invention is toxic when compared to a poisoned or killed bacterial vaccine. It is considered that the reaction is hardly induced. Moreover, the molecular vaccines of the present invention are immune-free. There is no danger to the defensive individual. In fact, the compositions of the present invention are Used for therapeutic purposes to stimulate an immune response directed against the body.   The selective use of predominantly abundant extracellular products or their immunological analogs is unlikely. In addition, the development of an opsonized humoral response that can increase the virulence of intracellular bacteria To prevent. Since the protective immunity arising in the present invention is directed to unbound proteins, Rather than facilitating the inclusion of parasitic bacteria, the opsonic reaction is merely phagocytosis And mainly the breakdown of abundant extracellular products. Plus, selective use of purified extracellular products Is a widely used screen based on host recognition of immunogenic reagents. Reduce the likelihood of reactions that eliminate the use of control and control techniques. Obedience Unlike vaccines of the prior art, vaccines expressed in pathogens but produced according to the invention Screening test using immunoreactive molecules not contained in Kuching I can. The use of such immunogenic determinants can reduce exposure to the target pathogen. Only elicit a response in these isolated individuals and take appropriate countermeasures To   Another advantage of the present invention is that attenuated bacteria or bacteria In contrast to components, purified extracellular products are readily available in large quantities and It is easily isolated using techniques. Such an immune response product of the present invention It is naturally released into the surrounding medium of most organisms of interest, resulting in intracellular impurities and And removal of cell debris is simplified. Even the most important or mainly abundant extracellular products Or its immunological analogs are used to stimulate the desired immune response Expression levels and culture concentrations of harvestable products are generally Rise in time. Therefore, whatever type of production is employed, the desired product size is S Kale isolation can be accomplished by routine biochemical techniques such as chromatography or ultrafiltration. It is easily done. The unique attributes and molecular characteristics of the immunogenic determinants used in the present invention Properties greatly enhance the production of harmonized, standardized, and high-quality compositions for use on a large scale. Facilitate.   Alternatively, the immunogenicity of the most important or predominantly abundant extracellular product of the target pathogen The use of purified molecular compounds based on quality also provides the immunologically active vaccine compositions of the present invention. Makes large-scale synthesis of minutes relatively easy. For example, the extracellular product of interest or its Immunological analogs are cloned into non-pathogenic host bacteria using recombinant DNA technology And can be harvested safely. Using molecular cloning techniques well known in the art Selected high expression for insertion into host bacteria such as Escherichia coli and Escherichia coli Correspond to the extracellular product of interest, its analog or any segment in the vector DNA can be used to isolate and express DNA. A typical technique is IIR. Anon Synthetic Vaccines, 31-77, 1987; Tam et al. T and circumsporozoite proteins in a synthetic antimalarial vaccine Incorporation of T and B Epitopes of the Circum sporozoite Protein in a Chemically Defined Synthetic Vaccine Against Mal aria) ", J. Am. Exp. Med., 171: 299-306, 1990; and Stover et al., "External Surface Tan. Recombinant Calmette-Guerin M. tuberculosis expressing protein A (OspA) lipoprotein ( Protective Immunity Induced by BCG: Lyme Disease Vaccine Candidate (Protective Immuni ty Ellcited by Recombinant Bacille Calmette-Guerin (BCG) Expressing Oute r Surface Protein A (OspA) Lipoprotein: A Candidate Lyme Disease Vaccine ) ", J.M. Exp. Med. 178: 197-209, 1993.   Similarly, extracellular proteins, their analogs, homologs, or immunoreactive proteins Compare protein subunits using standard laboratory and automated sequencing techniques It can be chemically synthesized on a large scale in an extremely pure form. This method of production is an extracellular product Particularly attractive for the construction of peptide subunits or low molecular weight analogs of proto-determinants It is. Typical techniques for the production of small subunits of proteins are described in the art. II R. Anon, "Synthetic vaccines", pp. 15-30, 1987, and A.I. Str eitwieser, Jr., "Introduction to Organic Chemistry", 953 ~ 55, 1985 (3rd edition). Another technique is Gross et al., "Peptide Bonding. Non-enzymatic cleavage of methionine residues in bovine pancreatic ribonuclease (Nonenzymatic  Cleavage of Peptide Bonds: The Methionine Residues in Bovine Pancreatic  Ribonuclease) ", The Journal of Biological Chemistry, 237 (6) 1962; ney, "High-yield cleavage of tryptophan peptide bonds by o-iodosobenzoic acid (Hi gh-Yield Cleavage of Tryptophanyl Peptide Bonds by o-Iodosobenzoic Acid ) ", Biochemistry 18 (17) 1979; and Shuolnik et al.," Gonococcal Pili ", Journal. al of Experimental Medicine 159, 1984. Peptides, nucleoti Anti-idiotypic or directional molecular evolution using other molecules such as Immunogenic techniques are also used to generate effective immunoreactive compounds that produce the desired prophylactic response. Can be used.   Nucleic acid molecules useful in the practice of the present invention can be expressed by a variety of vectors. this These vectors include, for example, herpesvirus vectors (eg, US Pat. No. 5,288, No. 641), retroviruses (e.g. EPO, 415, 731; WO 90/07936; WO 91/028). No. 5, WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; US Pat. No. 5,219,740. No. WO 89/09271; WO 86/00922; WO 90/02797; WO 90/02806; United States US Patent No. 4,650,764; US Patent No. 5,124,263; US Patent No. 4,861,719; WO 93 / 11230; WO 93/10218; Vile and Hart, Cancer Res., 53: 3860-3864, 199. 3; Vile and Hart, Cancer Res. 53: 962-967, 1993; Ram et al., Cancer Res. 53: 83-88, 1993; Takamiya et al. Neurosci. Res. 33: 493-503, 1992; Baba et al. J. Neurosurg. 79: 729-735, 1993), pseudotyped virus, adenowis Lus (e.g. WO 94/26914; WO 93/9191; Kolls et al., PNAS 91 (1): 215-219. Kass-Eisler et al., PNAS 90 (24): 11498-502, 1993; Guzman et al., Circulati. on88 (6): 2838-48, 1993; Guzman et al., Cir. Res. 73 (6): 1202-1207, 1993; Zabner et al., Cell 75 (2): 207-216, 1993; Li et al., Hum. Gene. Ther. 4 (4): 403- 409, 1993; Caillaud et al., Eur. J. Neurosci. 5 (10): 1287-1291, 1993; Vincen t et al., Nat. Genet. 5 (2): 130-134, 1993; Jaffe et al., Nat. Genet. 1 (5): 372-3 78, 1992; and Levrero et al., Gene 101 (2): 195-202, 1991), adenovirus. Related viral vectors (Flotte et al., PNAS 90 (22): 10613-10617, 1993), pal Bovirus vectors (Koering et al., Hum. Gene Therap. 5: 457-463, 1994) and And poxvirus vectors (Panicali and Paoletti, PNAS 79: 4927-4931, 1982).   A nucleic acid molecule (or vector, ie, capable of directing the expression of a related sequence) Assembly) can be introduced into the host cell by various mechanisms. These structures include: For example, transfection (e.g., DNA linked to a killed adenovirus (Mic hael et al. Biol. Chem. 268 (10): 6866-6869, 1993; and Curiel et al., Hum. Ge ne Ther. 3 (2): 147-154, 1992), cytotofectin-mediated transduction (DMRIE-DOPE, Vical Calif.), Direct DNA injection (Acsadi et al., Nature, 352: 815-818, 1991), DNA ligand. Lipofection (including Wu et al., J. Biol. Chem. 264: 16985-16987, 1989); (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7417, 1989); (Pickering et al., Circ. 89 (1): 13-21, 1994; and Wang et al., PNAS 84: 7851-78. 55, 1987); micro-bullet bombardment (Williams et al., PNAS 88: 2726-2730, 1991); and Nucleic acid encoding the enzyme itself (Vile and Hart, Cancer Res. 53: 3860- 3864, 1993) or direct delivery utilizing PEG-nucleic acid conjugates (WO 93/18759; WO 93/04701; see WO 93/07283 and WO 93/07282).   In yet another alternative, one or more extracellular products, analogs, homologs of the invention Or DNA encoding one or more genes capable of inducing subunit expression. Injected other genetic material directly into mammalian hosts using so-called "naked DNA" techniques I can do it. After introduction in vivo and the resulting uptake of the genetic makeup by the host cell, the host Initiates endogenous production of one or more encoded immune response products, followed by antigen Produces an effective immune response to administration. As the skilled artisan will appreciate, genetic constructs Is coupled to a eukaryotic promoter sequence and / or a secretion signal. From the endogenous expression of the encoded immune response product (s) and its consequences. Promotes fruit secretion. Typical for using naked DNA as a vaccine The technology is described in International Patent No. WO94221797 (Merck & Co. Inc. and ViCal Inc.) Patent application WO9011092 (ViCal Inc.) and Robinson, "Hemagglutinin expression Protection against lethal influenza virus antigen challenge by plasmid DNA immunization (P rotection Against a Lethal Influenza Virus Challenge by Immunization wit h a Hema gglutinin-Expressing Plasmid DNA) ", Vaccine 11: 9, 1993, and Ulmer et al.," Heterologous to influenza by injection of DNA encoding viral proteins Heterologous Protection Against Influenza by Injection of DNA Enco ding a Viral Protein), Science 259, 1993, which is hereby incorporated by reference. ).   Alternatively, Tao et al., "B-Ceo Lymphoma," Idiotype / granulocyte-macrophage colony stimulating factor as vaccine Fusion protein (Idiotype / Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Facto r Fusion Protein as a Vaccine for B-Ceo Lymphoma), published in Nature 362, 1993. And for techniques of T cell epitope mapping, see Good et al. "Recognition of human T cells by Plasmodium falciparum circumsporozoite protein: min Immunodominant T cell domain map of the polymorphic region of offspring (Human T-Cell Recognition of t he Circumsporozoite Protein of Plasmodium falciparum: Immunodominant T-C ell Domains Map to the Polymorphic region of the Molecule) "Proc. Natl . Acad. Sci. USA 85, 1988 and Gao et al., "Nu in influenza A virus. Identification and Characterization of Leoprotein Helper Epitopes (Identifi cation and Characterization of T Helper Epitopes in the Nucleoprotein of  Influenza A Virus) " Imm. 143 (9), 1989.   Since many bacterial genera show homology, the examples described above are provided for illustration. Provided to limit the scope and content of the present invention or to ium or specific species or serogroup or tuberculosis vaccine only It does not do. Interspecies homology in microbial DNA and corresponding proteins Is common, reconfirming that the vaccine of the present invention can induce cross-reactive immunity. I will emphasize it. The immunodominant epitopes of mainly abundant extracellular products are Confer cross-protective immunity to antigens and antigens of selected genera, Directed vaccines can be developed using extracellular products or other species of immunogenic homologues. It will be appreciated by those skilled in the art.   For example, M. bovis is M. 90-100% homologous to tuberculosis and immune response Have a high degree of cross-response in inducing Therefore, M. bovis or other Mycoba A vaccine based on mainly abundant extracellular products of cterium is described in Feeling by tuberculosis It offers varying degrees of protection against dyeing and vice versa. Therefore, mainly suitable Using highly homologous immunogenic determinants of abundant extracellular products, several species of the same genus It is within the scope of the present invention to provide an immune defense response against bacterial species of Is intended.   The immunogenic determinants chosen for practicing the present invention may be effective protective or immune It is also strong that it can be used in many different forms to elicit an epidemiological diagnostic immune response. Should be adjusted. Therefore, selected predominantly abundant extracellular production against the host immune system The presentation of one or more immunogenic determinants of a product is not important and facilitates production or administration Can be changed to For example, the vaccines of the present invention may contain whole extracellular products or peptides. Including immunogenic analogs and homologs It may be formulated using any desired immunostimulatory fraction. According to the teachings of the present invention, M.P. tuber Effective protein subunits of mainly abundant extracellular products of culosis are Species can be identified in genetically diverse distributions. As a result, the identified immunodominant T cells The epitope must be recognized by humans and other mammals, including bovines. These immunodominant T cell epitopes can therefore be used not only for immunodiagnostic reagents, but also for vaccines. It is still useful. M. Immunodominant T cells of the 30KD major secreted protein of tuberculosis A typical study to identify epitopes was performed as follows.                                 Example 25               Immunodominant epitope mapping of 30KD protein   Covers the entire native 30KD protein and overlaps with 10 amino acids 55 synthetic peptides (15-mers) were tuberculosis 55 30KD main secretor Spleen lymphocyte proliferation assay to identify immunodominant T-cell epitopes in proteins Used for b. The sequences of each of the 15-mer synthetic peptides used are shown in FIGS. Identification of the antigen peptide SEQ ID NO, and amino acid residue identification and relative position of each sequence Shown below in combination with the corresponding identification numbers (1-55).   Percutaneous immunization 3-4 times with 100 μg of purified 30KD protein emulsified in SAF Outbred male Hartley guinea pig (Charles River Breeding) Laboratories) (Allison and Byars, 1986). Contrast Animals received phosphate buffer-saline in SAF. Cell-mediated as above The immune response was evaluated by a skin test. Lymphocytes are inoculated into a 96-well tissue culture plate. (Falcon Lanware) and 20μg ・ ml-1Synthetic 15-mer peptide, 20 μg-1Spirit of 30KD protein, 20μg ・ ml-1Purified protein derivative [(PPD); Connaught La boratories LTD] or 10μg ・ ml-1Concanavalin A and I0U polymix For 3 days in the presence of B. The cells are then incubated for 16 hours at 1 μC i [Three[H] thymidine (New England Nuclear) and then harvested (Breiman et al.). And Horwitz, 1987). Positive proliferative response was defined as: (dpm of antigen) -(Medium dpm)> 1500 and (antigen dpm) / (medium dpm)> 1.2. Purified M. tub Immunity recognized in more than 25% of guinea pigs immunized with erculosis 30KD protein The dominant epitopes are shown in Table Z below and are graphically depicted in FIGS. 12a and 12b.   The results shown in Table Z are Immunodominant T cell of 30KD major secreted protein of tuberculosis Vesicle epitopes are identified. Those skilled in the art will recognize that prior tuberculosis protein M. highly related to Understand that you were studying the bovis 30KD protein. Would. However, these M. Prior research on bovis protein has Studying protein, BCG vaccine, tuberculosis patients, or PPD positive individuals This is clearly different from the prior art research. Against this protein in such individuals Prior art epitope mapping studies are difficult because There is a doubt in accuracy. In contrast, the study of Example 25 shows that We use crossed guinea pigs, so the immune system focuses on this single protein. And produce an extremely strong cellular immune response. Moreover, these guinea pigs are exempt It was examined within a few weeks of the epidemic-at the peak of T cell reactivity.   According to the teachings of the present invention, one of the above identified immunodominant epitopes, or Anything more can be incorporated into a vaccine against tuberculosis. For example, individual immunodominant Synthesize and use pitopes alone or in combination in a multi-antigen peptide system Can be. Alternatively, two or more immunodominant epitopes can be chemically linked. it can. Connected or alone. Peptides are combined with an appropriate adjuvant Subunit vaccines for humans or other mammals Can be used in chin. In addition, immunodominant epitopes can be used for new skin tests, etc. It can also be used as a new immunodiagnostic reagent.   One of skill in the art also expresses the peptide encoding DNA alone or collectively. Can be synthesized and used to inject directly into humans or other mammals It will be understood that they can also be combined with the DNA vaccines described. Immunogen A construct consisting solely of a sexual epitope (or the DNA encoding it) will Focus on the immune response on the protected site. Avoid irrelevant or immunosuppressive epitopes Thus, such constructs can elicit a stronger and more protective immune response.   The smaller subunit, mainly its abundant extracellular products, its analog molecules, The genes that they encode, and their respective combinations, are As long as they function as protective or immunodiagnostic reagents, they are within the scope of the present invention. Furthermore, fusion proteins or extracellular products modified by known molecular recombination techniques, etc. Are completely compatible with the teachings of the present invention. Besides, chosen Immunogenically generated analogs of immunoreactivity determinants or peptides, and fingers Nucleotides derived using directional evolution are also within the scope of the invention. further, Selected immune activity determinants are more robust with specific MHC molecules of human or other species Be modified to bind or be more effectively expressed by antibody-displaying cells. Can be. In addition, the selected immunoreactivity determinants are Modifications can be made to resist the solution.   Similarly, the dispensing of immunogenic reagents and the presentation to the host immune system is based on the It is not limited to solutions of parkin or its analogs. For example, a suitable extracellular protein Quality-derived immunogenic determinants are nonpathogenic and modified by recombinant techniques M. tuberculosis, different strains of Mycobacteria, bacteria, phage, myco It can be expressed in different strains of plasma or virus. In this case, the desired reaction Whole living microorganisms can be formulated and used to stimulate. On the contrary, in a bad environment High-volume vaccination programs are extremely difficult without cumbersome adjuvants or additives. A stable formulation is required. In addition, vaccine preparations can be lyophilized, orally administered, Promotes the stability or immune response of active ingredients when exposed to harsh conditions such as Can be aimed at. Therefore, the present invention relates to the intended use of the product. Very different formulations of immunogenic determinants, including the vaccine of interest, Include.   One of skill in the art would determine the dose of vaccine for each pathogen and host using routine experimentation. Will understand that it must be done. At present, Low doses range from 0.1 μg to 2.0 μg, with 20.0 μg, 100 μg and even 1 mg in a suitable system May be optimal. Appropriate dosages may be determined by conventional immunization techniques and techniques known in the art. They can be administered in order.                                 Example 26                       Expression of recombinant 30kDa protein   For expression of the mature 30 kDa protein, a gene encoding the 30 kDa protein Phenylalanine, the initiator of the mature protein, was replaced with NcoI in pET22b. Glycine residue artificially inserted at the carboxyl terminus of the pelB leader sequence or of the pelB leader sequence It was engineered to fuse to a group (Novagen, Madison, WI); see Figure 13). This Strategy provides a fusion molecule from which the mature 30 kDa protein can be easily released And expresses relatively large amounts of the recombinant 30 kDa protein over 4 hours. Induce. Thereafter, the expression of the recombinant protein reached a plateau. Recombination Offspring expression persisted for up to 8 hours without significant adverse effects on the bacterial medium. 1 liter of E. Typical yields from E. coli cultures are approximately 50 mg, and total cell protein Reached 25% of quality.   Achieve expression of the recombinant 30 kDa protein in its full length or truncated version To construct, the construct in pET22b was converted to 1 mM isopropyl-b-D-thiogalactopyrano Induction with Syd (IPTG). coli BL21 (DE3) expressed in pLysS. Induction culture Samples in nutrients are taken hourly for up to 8 hours, aliquots of medium supernatant and Run the cell pellet on a 12.5% denaturing polyacrylamide gel and coomassie. Stained with Brilliant Blue R. 8 buffers for all chromatographic steps Except for the addition of M urea (see “Mycobacterium tuberculosis major extracellular Protective immunity against tuberculosis induced by vaccination with protein, "Proc . Natl. Acad. Sci. USA. 92: 1530-1534, 1995). The recombinant protein was purified. Phosphate buffered physiological diet It was dialyzed against saline and kept soluble.   Encodes the mature 30 kDa protein, itself or the pelB leader peptide Was expressed in the pET22b vector on either of the plasmids. Cell pellet The results of the electrophoresis are shown in FIG. Lanes A and B show the pelB leader DNA sequence (A) PET22 vector with fused mature 30 kDa protein gene, and full length 30 kD a Coomassie staining during IPTG induction of bacteria with pET22b containing the protein gene (B) 1 shows a color protein extract. Lane C is a control, M.P. tuberculosis medium filtration Shows the mature 30 kDa protein isolated from the liquid. Lanes D, E and F show anti-30 / Similar to A, B and C probed with 32A-BkDa complex specific antibody Figure 5 shows Western blot analysis of protein. Lane G contains only pET22b vector E. having Protein extracts from E. coli cultures were probed with the same antibodies. all The positions of the long and mature 30 kDa proteins are indicated at 30 W and 30 M, respectively. These recombinant proteins are distinguished by their first 5 or 7 N-terminal amino acids. Further identified. The numbers on the left are molecular weight standards in kDa.                                 Example 27           In MYCOBACTERIUM SMEGMATIS and MYCOBACTERIUM VACCAE             Soluble processed using plasmid pSMT3           Extracellular M. Expression of TUBERCULOSIS 30kDa major secreted protein   This example demonstrates the ability of M. tuberculosis 30kDa major secreted protein The purpose is to show the expression and secretion of We believe that the pSMT3 plasmid (D ouglas B. Dr. Young, Dept. Medical Microbiology, St. Mary's Hospital Med ical School, Norfolk Place, London, W21PG, UK); coli (column El ori) ) And mycobacterium (Mycobacterium fortuitum plasmid pAL5000 ori) 5.7 kb (kilobase pair) plasmid with both origins of replication, hygromycin Resistance marker, hps60 promoter (Mycobacterium bovis BCG heat shock Multi-cloning of hsp60 promoter The site downstream was used. The expression system is illustrated in FIG.   The insert is an M. cerevisiae containing the sequence of the 30 kDa protein. 4 from tuberculosis Erdman strain Consists of a .7 kb HinDIII-BamHI genomic DNA fragment. Insert the insert into E. coli DH5 The recombinant plasmid DNA was cloned in pSMT3 in M.a. smegmatis 1-2c and And M. vacce R877R (National Collection Off Type Culture (NCTC ) During 11659) electroporation at 6250V / cm and 25m farad conditions Transformation M. smegmatis 1-2c is M.P. smegmatis mcTwo6 treated simple Is an isotope, according to Zhang et al. (Molecular Microbiology, 5 (2): 381-391, 1991). According to the procedure described in smegmatis mcTwoATCC 607 prepared from US 6 Type culture collection). M. smegmatis  mcTwo6 is from ATCC 607 and is described by Jacobs et al. (Nature, 327: 532-535, 1987). By the following procedure.   1 mg of recombinant plasmid DNA and about 4 × 109Using Mycobacteria of CFU, A 100-200 hygromycin-resistant transformant was obtained by the method described above. This transformant is Stable in Roth's medium and Tuberculosis 30kDa protein constitutively Expressed to produce about 10 mg of processed protein / L. The most important thing Indicates that the protein is soluble and about 90% of the expressed protein is It was secreted during Qing (see FIG. 16).   The results of the electrophoresis shown in FIG. 16 were obtained as follows. M. tuberculo Five recombinant M. cis containing the pSMT3 construct with the 30 kDa gene of sis. smegmatis black The supernatant from each of the samples was subjected to SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylic acid). Amide gel electrophoresis) analysis was performed (5 right lanes). Main protein ( The arrow in FIG. Tuberculosis is a major 30kDa secreted protein. The leftmost lane shows the molecular weight standard (66, 45, 36, 29, 24, 20, 14 kDa). set The replacement protein migrates just above the 29 kDa marker.   The major extracellular protein in the culture supernatant is recombinant M. Tuberculosis 30kDa main component Western blot analysis was used to confirm that it was a secreted protein. . The results are shown in FIG. In FIG. 17, the four proteins on the right side of FIG. Quality was subjected to SDS-PAGE and blotted on nitrocellulose (4 right lane). The blots were tuberculosis 30 / 32kDa protein complex specific rabbit It was probed with a gipoliclonal antibody. Recombinant M. tuberculosis 30kDa protein Only the quality is stained (arrow). The left lane shows the pre-stained molecular weight markers. Includes cars (106, 80, 49.5, 32.5, 27.5, and 18.5 kDa). Recombinant protein The quality shifts between 32.5 and 27.5 kDa molecular weight standards.   Furthermore, the N-terminal sequence of the first six N-terminal amino acids indicates FSRPGL, The sequence is mature M. Confirm that it is the same as that of the 30 kDa tuberculosis protein You.   Two constructs in pET20 (Novagen, Madison, WI), one for the 30 kDa protein And the other is for the 32 AkDa protein). Not expressed in E. coli. Isolates of pKK233 were obtained from Amann and Brosius (Gene, 40, 183-190, 1985). pTrc99A (Pharmacia Biotech, Sweden ) Can be used instead of the pKK233 vector. Three different constructs in pKK233-1 One for the full length 30 kDa protein, one for the full length 32 kDa protein, and One is for the mature 30 kDa protein-is for E. coli. Do not express all proteins in E. coli won.   One construct in pRSET-A for the mature 30 kDa protein is E. coli. fusion in E. coli Protein, but the 30 kDa protein is enterokinase and this fusion protein It could not be cut to remove the quality. Similarly, the two constructs in pTrx-Fus One for the mature 30 kDa protein and one for the mature 32 kDa protein − Is E. A fusion protein was produced in E. coli, but M. tu The berculosis protein could not be efficiently excised with enterokinase. Many A summary of the applicability of various expression systems is shown in Table AA. All inserts are 32A kDa tamper It is for quality.   As can be seen in Table AA, not all constructs express protein. I didn't. A leader sequence before the structural gene was required for expression. Follow And one pET22b construct containing the mature 30 kDa protein gene and the mature 32 AkDa protein One construct containing the protein gene did not express either protein. Tan By adding the leader sequence of each of the proteins in front of the structural gene, And 32A kDa of M. Successful expression of tuberculosis protein in pET22b . For both proteins, this is the full-length and processed protein Brought the reality. These constructs are described in Relatively stable in E. coli. Ie , These were expressed after two or three subcultures, but after more subcultures Was not expressed.   E. before the structural gene of each protein. Adding pelB leader sequence from E. coli By 30 and 32 A kDa M. Expression of tuberculosis protein in pET22b The merit was obtained. The expression level in these constructs is 30 or 32 A kDa protein. Quality was higher than that utilizing the respective leader sequence. But pelB build The disadvantage of the product was its instability. After one passage, all of these constructs They have lost their ability to express recombinant proteins.   A brief description of the general approach to expressing the desired protein is given above. This is shown in Example 24.   Predominantly abundant extracellular products and smaller protein subunits of their molecular analogs Knits are within the scope of the invention as long as they induce an effective immune defense. Sa In addition, fusion proteins or extracellular products modified by known molecular recombination techniques Such recombinant protein products are fully compatible with the teachings of the present invention. Furthermore, anti Peptides and Nuclei Derived Using Idiotype Antibodies or Direct Evolution Immunogenicly generated analogs of selected immune activity determinants such as otide It is also within the scope of the present invention.   Similarly, the formulation and presentation of immunogenic agents to the host immune system can be It is not limited to solutions of proteins or analogs thereof. For example, Immunogenicity determinants derived from extracellular proteins are non-pathogenic and recombinant Bacteria, phages, mycoplasmas, or viruses modified with different It can also be expressed in species. In such cases, all stimuli should be used to stimulate the desired response. Existing organisms can be formulated and used. Conversely, large High-volume vaccination schemes require extremely complex adjuvants or additives. A stable formulation is needed. In addition, lyophilized or oral administration or capsule When exposed to harsh conditions such as vaccination, the formulation of the vaccine will May be aimed at promoting immune responsiveness. Therefore, the present invention It includes a wide variety of formulations of immunogenic determinants, including the vaccine of interest.   One of skill in the art will recognize that vaccine doses may vary depending on the particular pathogen and host using routine experimentation. Understand that should be determined. At present, the minimum practical dose is 0.1mg to 2.0mg, 20.0mg, 100mg, and even 1mg is optimal for an appropriate system Can be Using any of the conventional immunization techniques and procedures known in the art, A sharp dose can be administered.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:32） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:32） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (31)優先権主張番号 ０８／５５１，１４９ (32)優先日 1995年10月31日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／５６８，３５７ (32)優先日 1995年12月６日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ハース，グンダー アメリカ合衆国 カリフォルニア 90025, ロスアンジェルス，ソーテル ブールバー ド ナンバー16 1525──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. 6 Identification symbol FI // (C12N 15/09 ZNA C12R 1:32) (C12P 21/02 C12R 1:32) (C12P 21/02 C12R 1:19 (31) Priority claim number 08 / 551,149 (32) Priority date October 31, 1995 (33) Priority claim country United States (US) (31) Priority claim number 08 / 568,357 (32) Priority Date December 6, 1995 (33) Priority Country United States (US) (81) Designated State EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (KE, LS, MW) , SD, SZ, UG), U (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GE, HU, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX , NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN (72) Inventor Haas, Gunder United States of America California 90025, Los Angeles, Sawtell Boulevard Number 16 1525

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．哺乳動物宿主での、Mycobacterium属に由来する感染性病原体に対する有効 な免疫応答の促進における使用のためのワクチン接種用薬剤であって： M．tuberculosis 110KDタンパク質、80KDタンパク質、71KDタンパク質、58KD タンパク質、45KDタンパク質、32A KDタンパク質、32B KDタンパク質、30KDタン パク質、24KDタンパク質、23.5KDタンパク質、23KDタンパク質、16KDタンパク質 、14KDタンパク質、12KDタンパク質、ならびにそれらのそれぞれのアナログ、ホ モログ、およびサブユニットからなる群より選択される少なくとも１つの主に豊 富な細胞外産物の少なくとも一部、 を含有する、ワクチン接種用薬剤。 ２．前記少なくとも１つの主に豊富な細胞外産物がM．tuberculosis 58KDタンパ ク質である、請求項１に記載のワクチン接種用薬剤。 ３．M．tuberculosis 58KDタンパク質、ならびにそれらのフラグメントおよび誘 導体のアミノ酸配列の少なくとも一部のコード配列を含む、DNA分子。 ４．真核生物プロモーター配列に作動可能に連結される、請求項３に記載のDNA 分子。 ５．前記コード配列が以下の配列の少なくとも一部を含む、請求項３に記載のDN A分子： ６．請求項５に記載のDNA分子によってコードされる、アミノ酸配列。 ７．哺乳動物宿主での、Mycobacterium属に由来する感染性病原体に対する有効 な免疫応答の促進における使用のためのワクチン接種用薬剤であって： M．tuberculosis 110KDタンパク質、80KDタンパク質、71KDタンパク質、58KD タンパク質、45KDタンパク質、32A KDタンパク質、32B KDタンパク質、30KDタン パク質、24KDタンパク質、23.5KDタンパク質、23KDタンパク質、16KDタンパク質 、14KDタンパク質、12KDタンパク質、ならびにそれらのそれぞれのアナログ、ホ モログ、およびサブユニットからなる群より選択される少なくとも１つの主に豊 富な細胞外産物の少なくとも一部をコードするDNA構築物を包含し、かつ 該哺乳動物宿主細胞へのインビボの形質導入の際に該細胞外産物の発現を誘導 し得、そしてその結果、該細胞に取込まれる、ワクチン接種用薬剤。 ８．前記DNA構築物が以下の式のDNA配列の少なくとも一部を含む、請求項７に記 載のワクチン接種用薬剤： ９．Mycobacterium属に由来する感染性病原体に対して哺乳動物宿主を免疫化す る方法であって、該方法は以下の工程： M．tuberculosis 110KDタンパク質、80KDタンパク質、71KDタンパク質、58KD タンパク質、45KDタンパク質、32A KDタンパク質、32B KDタンパク質、30KDタン パク質、24KDタンパク質、23.5KDタンパク質、23KDタンパク質、16KDタンパク質 、14KDタンパク質、12KDタンパク質、ならびにそれらのそれぞれのアナログ、ホ モログ、およびサブユニットからなる群より選択される少なくとも１つの主に豊 富な細胞外産物の少なくとも一部をコードする核酸を包含し、かつインビボで導 入され、その結果、哺乳動物宿主細胞により取込まれる際に該少なくとも１つの 主に豊富な細胞外産物の発現を誘導し得る核酸構築物を提供する工程；および 該構築物を該哺乳動物宿主に導入して、該感染性病原体による引き続く感染に 対して有効な免疫応答を誘導する工程、 を包含する、方法。 １０．前記少なくとも１つの主に豊富な細胞外産物がM．tuberculosis 58KDタン パク質である、請求項９に記載の方法。 １１．前記核酸構築物が以下の式のDNA配列の少なくとも一部を含む、請求項１ ０に記載の方法： １２．前記少なくとも１つの主に豊富な細胞外産物がM．tuberculosis 23.5KDタ ンパク質である、請求項１に記載のワクチン接種用薬剤。 １３．M．tuberculosis 23.5KDタンパク質、ならびにそれらのフラグメントおよ び誘導体のアミノ酸配列の少なくとも一部のコード配列を含む、DNA分子。 １４．真核生物プロモーター配列に作動可能に連結される、請求項１３に記載の DNA分子。 １５．前記コード配列が以下の配列の少なくとも一部を含む、請求項１３に記載 のDNA分子： １６．請求項１５に記載のDNA分子によってコードされる、アミノ酸配列。 １７．前記DNA構築物が以下の式のDNA配列の少なくとも一部を含む、請求項７に 記載のワクチン接種用薬剤： １８．前記少なくとも１つの主に豊富な細胞外産物がM．tuberculosis 23.5KDタ ンパク質である、請求項９に記載の方法。 １９．前記核酸構築物が以下の式のDNA配列の少なくとも一部を含む、請求項１ ８に記載の方法： ２０．前記少なくとも１つの主に豊富な細胞外産物がM．tuberculosis 24KDタン パク質である、請求項１に記載のワクチン接種用薬剤。 ２１．M．tuberculosis 24KDタンパク質、ならびにそれらのフラグメントおよび 誘導体のアミノ酸配列の少なくとも一部のコード配列を含む、DNA分子。 ２２．真核生物プロモーター配列に作動可能に連結される、請求項２１に記載の DNA分子。 ２３．前記コード配列が以下の配列の少なくとも一部を含む、請求項２１に記載 のDNA分子： ２４．請求項２３に記載のDNA分子によってコードされる、アミノ酸配列。 ２５．前記DNA構築物が以下の式のDNA配列の少なくとも一部を含む、請求項７に 記載のワクチン接種用薬剤： ２６．前記少なくとも１つの主に豊富な細胞外産物がM．tuberculosis 24KDタン パク質である、請求項９に記載の方法。 ２７．前記核酸構築物が以下の式のDNA配列の少なくとも一部を含む、請求項２ ６に記載の方法： ２８．M．tuberculosis 30KDタンパク質、ならびにそれらのフラグメントおよび 誘導体のアミノ酸配列のコード配列を含む、DNA分子。 ２９．前記少なくとも１つの主に豊富な細胞外産物がM．tuberculosis 16KDタン パク質である、請求項１に記載のワクチン接種用薬剤。 ３０．M．tuberculosis 16KDタンパク質、ならびにそれらのフラグメントおよび 誘導体のアミノ酸配列の少なくとも一部のコード配列を含む、DNA分子。 ３１．真核生物プロモーター配列に作動可能に連結される、請求項３０に記載の DNA分子。 ３２．前記コード配列が以下の配列の少なくとも一部を含む、請求項３０に記載 のDNA分子： ３３．請求項３０に記載のDNA分子によってコードされる、アミノ酸配列。 ３４．前記DNA構築物が以下の式のDNA配列の少なくとも一部を含む、請求項７に 記載のワクチン接種用薬剤： ３５．前記少なくとも１つの主に豊富な細胞外産物がM．tuberculosis 16KDタン パク質である、請求項９に記載の方法。 ３６．前記核酸構築物が以下の式のDNA配列の少なくとも一部を含む、請求項３ ５に記載の方法： ３７．哺乳動物宿主での、Mycobacterium属に由来する感染性病原体に対する有 効な免疫応答の促進における使用のためのワクチン接種用薬剤であって： M．tuberculosis 110KDタンパク質、80KDタンパク質、71KDタンパク質、58KD タンパク質、45KDタンパク質、32A KDタンパク質、32B KDタンパク質、30KDタン パク質、24KDタンパク質、23.5KDタンパク質、23KDタンパク質、16KDタンパク質 、14KDタンパク質、12KDタンパク質、ならびにそれらのそれぞれのアナログ、ホ モログ、およびサブユニットからなる群より選択される少なくとも１つの主に豊 富な細胞外産物の少なくとも１つの免疫優性エピトープ、 を包含する、ワクチン接種用薬剤。 ３８．前記少なくとも１つの主に豊富な細胞外産物がM．tuberculosis 30KDタン パク質である、請求項３７に記載のワクチン接種用薬剤。 ３９．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープが、アミノ酸配列 を有するM．tuberculosis 30KDタンパク質サブユニット、ならびに単一または複 数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、および反転を含むそれらのそれぞれのアナロ グ、ホモログ、およびサブユニットからなる群より選択される、請求項３８に記 載のワクチン接種用薬剤。 ４０．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列FSRPGLPVEYLQVP S（配列番号37）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸 の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、 請求項３９に記載のワクチン接種用薬剤。 ４１．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列LPVEYLQVPSPSMG R（配列番号38）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸 の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、 請求項３９に記載のワクチン接種用薬剤。 ４２．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列LQVPSPSMGRDIKV Q（配列番号39）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸 の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、 請求項３９に記載のワクチン接種用薬剤。 ４３．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列DIKVQFQSGGNNSP A（配列番号41）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸 の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、 請求項３９に記載のワクチン接種用薬剤。 ４４．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列FQSGGNNSPAVYLL D（配列番号42）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸 の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、 請求項３９に記載のワクチン接種用薬剤。 ４５．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列YYQSGLSIVMPVGG Q（配列番号49）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸 の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、 請求項３９に記載のワクチン接種用薬剤。 ４６．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列LTSELPQWLSANRA V（配列番号57）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸 の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、 請求項３９に記載のワクチン接種用薬剤。 ４７．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列SMAGSSAMILAAYH P（配列番号62）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸 の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、 、請求項３９に記載のワクチン接種用薬剤。 ４８．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列SAMILAAYHPQQFI Y（配列番号63）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸 の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、 請求項３９に記載のワクチン接種用薬剤。 ４９．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列ALLDPSQGMGPSLI G（配列番号67）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸 の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、 請求項３９に記載のワクチン接種用薬剤。 ５０．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列PSLIGLAMGDAGGY K（配列番号69）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸 の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、 請求項３９に記載のワクチン接種用薬剤。 ５１．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列AADMWGPSSDPAWE R（配列番号72）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸 の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、 請求項３９に記載のワクチン接種用薬剤。 ５２．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列GPSSDPAWERNDPT Q（配列番号73）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸 の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、 請求項３９に記載のワクチン接種用薬剤。 ５３．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列VANNTRLWVYCGNG T（配列番号77）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸 の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、 請求項３９に記載のワクチン接種用薬剤。 ５４．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列GANIPAEFLENFVR S（配列番号81）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸 の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、 請求項３９に記載のワクチン接種用薬剤。 ５５．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列QDAYNAAGGHNAVF N（配列番号85）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸 の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、 請求項３９に記載のワクチン接種用薬剤。 ５６．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列THSWEYWGAQLNAM K（配列番号89）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸 の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、 請求項３９に記載のワクチン接種用薬剤。 ５７．Mycobacterium属に由来する感染性病原体を同定する哺乳動物宿主の検出 可能な免疫応答の促進における使用のための免疫診断薬剤であって： M．tuberculosis 110KDタンパク質、80KDタンパク質、71KDタンパク質、58KD タンパク質、45KDタンパク質、32A KDタンパク質、32B KDタンパク質、30KDタン パク質、24KDタンパク質、23.5KDタンパク質、23KDタンパク質、16KDタンパク質 、14KDタンパク質、12KDタンパク質、ならびにそれらのそれぞれのアナログ、ホ モログ、およびサブユニットからなる群より選択される少なくとも１つの主に豊 富な細胞外産物の少なくとも１つの免疫優性エピトープ、 を包含する、免疫診断薬剤。 ５８．前記少なくとも１つの主に豊富な細胞外産物がM．tuberculosis 30KDタン パク質である、請求項５７に記載の免疫診断薬剤。 ５９．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープが、アミノ酸配列 を有するM．tuberculosis 30KDタンパク質サブユニット、ならびに単一または複 数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、および反転を含むそれらのそれぞれのアナロ グ、ホモログ、およびサブユニットからなる群より選択される、請求項５８に記 載の免疫診断薬剤。 ６０．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列FSRPGLPVEYLQVP S（配列番号37）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸 の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、 請求項５９に記載の免疫診断薬剤。 ６１．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列LPVEYLQVPSPSMG R（配列番号38）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸 の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、 請求項５９に記載の免疫診断薬剤。 ６２．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列LQVPSPSMGRDIKV Q（配列番号39）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸 の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、 請求項５９に記載の免疫診断薬剤。 ６３．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列DIKVQFQSGGNNSP A（配列番号41）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸 の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、 請求項５９に記載の免疫診断薬剤。 ６４．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列FQSGGNNSPAVYLL D（配列番号42）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸 の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、 請求項５９に記載の免疫診断薬剤。 ６５．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列YYQSGLSIVMPVGG Q（配列番号49）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸 の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、 請求項５９に記載の免疫診断薬剤。 ６６．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列LTSELPQWLSANRA V（配列番号57）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸 の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、 請求項５９に記載の免疫診断薬剤。 ６７．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列SMAGSSAMILAAYH P（配列番号62）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸 の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、 、請求項５９に記載の免疫診断薬剤。 ６８．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列SAMILAAYHPQQFI Y（配列番号63）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸 の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、 請求項５９に記載の免疫診断薬剤。 ６９．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列ALLDPSQGMGPSLI G（配列番号67）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸 の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、 請求項５９に記載の免疫診断薬剤。 ７０．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列PSLIGLAMGDAGGY K（配列番号69）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸 の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、 請求項５９に記載の免疫診断薬剤。 ７１．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列AADMWGPSSDPAWE R（配列番号72）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸 の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、 請求項５９に記載の免疫診断薬剤。 ７２．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列GPSSDPAWERNDPT Q（配列番号73）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸 の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、 請求項５９に記載の免疫診断薬剤。 ７３．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列VANNTRLWVYCGNG T（配列番号77）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸 の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、 請求項５９に記載の免疫診断薬剤。 ７４．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列GANIPAEFLENFVR S（配列番号81）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸 の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、 請求項５９に記載の免疫診断薬剤。 ７５．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列QDAYNAAGGHNAVF N（配列番号85）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸 の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、 請求項５９に記載の免疫診断薬剤。 ７６．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列THSWEYWGAQLNA MK（配列番号89）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸 の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、 請求項５９に記載の免疫診断薬剤。 ７７．Mycobacterium属の感染性病原体に対して哺乳動物宿主を免疫化する方法 であって、該方法は以下の工程： M．tuberculosis 110KDタンパク質、80KDタンパク質、71KDタンパク質、58KD タンパク質、45KDタンパク質、32A KDタンパク質、32B KDタンパク質、30KDタン パク質、24KDタンパク質、23.5KDタンパク質、23KDタンパク質、16KDタンパク質 、14KDタンパク質、12KDタンパク質、ならびにそれらのそれぞれのアナログ、ホ モログ、およびサブユニットからなる群より選択される少なくとも１つの主に豊 富な細胞外産物の少なくとも１つの免疫優性エピトープを提供する工程；および 該少なくとも１つの免疫優性エピトープを該哺乳動物宿主に導入して該感染性 病原体による引き続く感染に対して有効な免疫応答を誘導する工程、 を包含する、方法。 ７８．前記少なくとも１つの主に豊富な細胞外産物がM．tuberculosis 30KDタン パク質である、請求項７７に記載の方法。 ７９．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープが、アミノ酸配列 を有するM．tuberculosis 30KDタンパク質サブユニット、ならびに単一または複 数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、および反転を含むそれらのそれぞれのアナロ グ、ホモログ、およびサブユニットからなる群より選択される、請求項７８に記 載の方法。 ８０．Mycobacterium属の病原体に対する哺乳動物における免疫応答の存在を検 出する方法であって、該方法は以下の工程： M．tuberculosis 110KDタンパク質、80KDタンパク質、71KDタンパク質、58KD タンパク質、45KDタンパク質、32A KDタンパク質、32B KDタンパク質、30KDタン パク質、24KDタンパク質、23.5KDタンパク質、23KDタンパク質、16KDタンパク質 、14KDタンパク質、12KDタンパク質、ならびにそれらのそれぞれのアナログ、ホ モログ、およびサブユニットからなる群より選択される少なくとも１つの主に豊 富な細胞外産物の少なくとも１つの免疫優性エピトープを提供する工程； 該少なくとも１つの免疫優性エピトープを該哺乳動物に投与する工程；および その結果生じる免疫応答を測定する工程、 を包含する、方法。 ８１．前記少なくとも１つの主に豊富な細胞外産物がM．tuberculosis 30KDタン パク質である、請求項８０に記載の方法。 ８２．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープが、アミノ酸配列 を有するM．tuberculosis 30KDタンパク質サブユニット、ならびに単一または複 数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、および反転を含むそれらのそれぞれのアナロ グ、ホモログ、およびサブユニットからなる群より選択される、請求項８１に記 載の方法。 ８３．M．tuberculosis 110KDタンパク質、80KDタンパク質、71KDタンパク質、5 8KDタンパク質、45KDタンパク質、32A KDタンパク質、32B KDタンパク質、30KD タンパク質、24KDタンパク質、23.5KDタンパク質、23KDタンパク質、16KDタンパ ク質、14KDタンパク質、12KDタンパク質、ならびにそれらのそれぞれのアナログ 、ホモログ、およびサブユニットからなる群より選択される主に豊富な細胞外産 物を産生するプロセスであって、該プロセスは以下の工程： ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換細胞を形成する工程であって、該 ベクターは、該主に豊富な細胞外産物のうちの１つをコードする核酸分子を含む 、工程；および 該形質転換細胞を培養し、それにより該主に豊富な細胞外産物を産生する工程 、を包含する、プロセス。 ８４．前記形質転換細胞を培養することによって産生される前記主に豊富な細胞 外産物を回収するさらなる工程を包含する、請求項８３に記載のプロセス。 ８５．前記ベクターがpET22bを包含する、請求項８３に記載のプロセス。 ８６．前記宿主細胞がE．coli、M．smegmatis、またはM．vaccaeである、請求項 ８３に記載のプロセス。 ８７．前記核酸分子が、30KDタンパク質、32A KDタンパク質、または32B KDタン パク質からなる群より選択されるM．tuberculosis タンパク質をコードする、請 求項８３に記載のプロセス。 ８８．前記形質転換細胞の培養の間に産生される前記タンパク質を回収するさ らなる工程を包含する、請求項８３に記載のプロセス。 ８９．前記ベクターがpSMT3またはpET22bを包含する、請求項８８に記載のプロ セス。 ９０．前記宿主細胞がE．coli、M．smegmatis、またはM．vaccaeである請求項８ ８に記載のプロセス。 ９１．M．tuberculosis 110KDタンパク質、80KDタンパク質、71KDタンパク質、5 8KDタンパク質、45KDタンパク質、32A KDタンパク質、32B KDタンパク質、30KD タンパク質、24KDタンパク質、23.5KDタンパク質、23KDタンパク質、16KDタンパ ク質、14KDタンパク質、12KDタンパク質、ならびにそれらのそれぞれのアナログ 、ホモログ、およびサブユニットからなる群より選択される主に豊富な細胞外産 物をコードする核酸分子を含む、ベクター。 ９２．前記核酸分子が、30KDタンパク質、32A KDタンパク質、または32B KDタン パク質からなる群より選択されるM．tuberculosis タンパク質をコードする、請 求項９１に記載のベクター。 ９３．前記ベクターがpET22bを包含する、請求項９１に記載のベクター。[Claims] 1. A vaccination agent for use in promoting an effective immune response against an infectious pathogen from the genus Mycobacterium in a mammalian host, comprising: tuberculosis 110KD protein, 80KD protein, 71KD protein, 58KD protein, 45KD protein, 32A KD protein, 32B KD protein, 30KD protein, 24KD protein, 23.5KD protein, 23KD protein, 16KD protein, 14KD protein, 12KD protein, and each of them A vaccination agent comprising at least a portion of at least one predominantly abundant extracellular product selected from the group consisting of: analogs, homologs, and subunits of 2. The at least one predominantly abundant extracellular product is The vaccination agent according to claim 1, which is a tuberculosis 58KD protein. 3. M. A DNA molecule comprising a coding sequence for at least a portion of the amino acid sequence of tuberculosis 58KD protein, and fragments and derivatives thereof. 4. 4. The DNA molecule of claim 3, which is operably linked to a eukaryotic promoter sequence. 5. 4. The DNA molecule of claim 3, wherein said coding sequence comprises at least a portion of the following sequence: 6. An amino acid sequence encoded by the DNA molecule of claim 5. 7. A vaccination agent for use in promoting an effective immune response against an infectious pathogen from the genus Mycobacterium in a mammalian host, comprising: tuberculosis 110KD protein, 80KD protein, 71KD protein, 58KD protein, 45KD protein, 32A KD protein, 32B KD protein, 30KD protein, 24KD protein, 23.5KD protein, 23KD protein, 16KD protein, 14KD protein, 12KD protein, and each of them In vivo transducing the mammalian host cell comprising a DNA construct encoding at least a portion of at least one predominantly abundant extracellular product selected from the group consisting of analogs, homologs, and subunits of A vaccination agent that is capable of inducing expression of the extracellular product and thereby being taken up by the cell. 8. The vaccination agent of claim 7, wherein the DNA construct comprises at least a portion of a DNA sequence of the formula: 9. A method of immunizing a mammalian host against an infectious pathogen from the genus Mycobacterium, comprising the following steps: tuberculosis 110KD protein, 80KD protein, 71KD protein, 58KD protein, 45KD protein, 32A KD protein, 32B KD protein, 30KD protein, 24KD protein, 23.5KD protein, 23KD protein, 16KD protein, 14KD protein, 12KD protein, and each of them Comprising a nucleic acid encoding at least a portion of at least one predominantly abundant extracellular product selected from the group consisting of: analogs, homologs, and subunits of a mammalian host cell Providing a nucleic acid construct that is capable of inducing expression of the at least one predominantly abundant extracellular product when taken up by the host; and introducing the construct into the mammalian host for subsequent infection by the infectious pathogen Inducing an effective immune response against . 10. The at least one predominantly abundant extracellular product is The method according to claim 9, which is a tuberculosis 58KD protein. 11. 11. The method of claim 10, wherein said nucleic acid construct comprises at least a portion of a DNA sequence of the formula: 12. The at least one predominantly abundant extracellular product is The vaccination agent according to claim 1, which is a tuberculosis 23.5KD protein. 13. M. A DNA molecule comprising the coding sequence of at least a portion of the amino acid sequence of the tuberculosis 23.5KD protein, and fragments and derivatives thereof. 14． 14. The DNA molecule of claim 13, which is operably linked to a eukaryotic promoter sequence. 15. 14. The DNA molecule of claim 13, wherein said coding sequence comprises at least a portion of the following sequences: 16. An amino acid sequence encoded by the DNA molecule of claim 15. 17． The vaccination agent of claim 7, wherein the DNA construct comprises at least a portion of a DNA sequence of the formula: 18. The at least one predominantly abundant extracellular product is The method according to claim 9, which is a tuberculosis 23.5KD protein. 19. 19. The method of claim 18, wherein said nucleic acid construct comprises at least a portion of a DNA sequence of the formula: 20. The at least one predominantly abundant extracellular product is The vaccination agent according to claim 1, which is a tuberculosis 24KD protein. 21. M. A DNA molecule comprising the coding sequence of at least a portion of the amino acid sequence of the tuberculosis 24KD protein, and fragments and derivatives thereof. 22. 22. The DNA molecule of claim 21 operably linked to a eukaryotic promoter sequence. 23. 22. The DNA molecule of claim 21, wherein said coding sequence comprises at least a portion of the following sequences: 24. An amino acid sequence encoded by the DNA molecule of claim 23. 25. The vaccination agent of claim 7, wherein the DNA construct comprises at least a portion of a DNA sequence of the formula: 26. The at least one predominantly abundant extracellular product is The method according to claim 9, which is a tuberculosis 24KD protein. 27. 27. The method of claim 26, wherein said nucleic acid construct comprises at least a portion of a DNA sequence of the following formula: 28. M. A DNA molecule comprising the coding sequence of the amino acid sequence of the tuberculosis 30KD protein, and fragments and derivatives thereof. 29. The at least one predominantly abundant extracellular product is The vaccination agent according to claim 1, which is a tuberculosis 16KD protein. 30. M. A DNA molecule comprising the coding sequence of at least a portion of the amino acid sequence of the tuberculosis 16KD protein, and fragments and derivatives thereof. 31. 31. The DNA molecule of claim 30, wherein the DNA molecule is operably linked to a eukaryotic promoter sequence. 32. 31. The DNA molecule of claim 30, wherein said coding sequence comprises at least a portion of the following sequences: 33. An amino acid sequence encoded by the DNA molecule of claim 30. 34. The vaccination agent of claim 7, wherein the DNA construct comprises at least a portion of a DNA sequence of the formula: 35. The at least one predominantly abundant extracellular product is The method according to claim 9, which is a tuberculosis 16KD protein. 36. 36. The method of claim 35, wherein the nucleic acid construct comprises at least a portion of a DNA sequence of the formula: 37. A vaccination agent for use in promoting an effective immune response against an infectious pathogen from the genus Mycobacterium in a mammalian host, comprising: tuberculosis 110KD protein, 80KD protein, 71KD protein, 58KD protein, 45KD protein, 32A KD protein, 32B KD protein, 30KD protein, 24KD protein, 23.5KD protein, 23KD protein, 16KD protein, 14KD protein, 12KD protein, and each of them A vaccination agent comprising at least one immunodominant epitope of at least one predominantly abundant extracellular product selected from the group consisting of analogs, homologs, and subunits of 38. The at least one predominantly abundant extracellular product is The vaccination agent according to claim 37, which is a tuberculosis 30KD protein. 39. The at least one immunodominant epitope is an amino acid sequence With M. 39. The tuberculosis 30KD protein subunit, and selected from the group consisting of analogs, homologs, and subunits thereof, including single or multiple amino acid substitutions, deletions, insertions, and inversions, according to claim 38. Vaccination drug. 40. The at least one immunodominant epitope has the amino acid sequence FSRPGLPVEYLQVP S (SEQ ID NO: 37), wherein the amino acid sequence has those single or multiple amino acid substitutions, deletions, insertions, inversions, analogs, homologs, and subunits. The vaccination agent according to claim 39, comprising: 41. The at least one immunodominant epitope has the amino acid sequence LPVEYLQVPSPSMGR (SEQ ID NO: 38), wherein the amino acid sequence has those single or multiple amino acid substitutions, deletions, insertions, inversions, analogs, homologs, and subunits. The vaccination agent according to claim 39, comprising: 42. The at least one immunodominant epitope has the amino acid sequence LQVPSPSMGRDIKV Q (SEQ ID NO: 39), wherein the amino acid sequence has those single or multiple amino acid substitutions, deletions, insertions, inversions, analogs, homologs, and subunits. The vaccination agent according to claim 39, comprising: 43. The at least one immunodominant epitope has the amino acid sequence DIKVQFQSGGNNSP A (SEQ ID NO: 41), wherein the amino acid sequence has substitutions, deletions, insertions, inversions, analogs, homologs, and subunits of those single or multiple amino acids. The vaccination agent according to claim 39, comprising: 44. The at least one immunodominant epitope has the amino acid sequence FQSGGNNSPAVYLL D (SEQ ID NO: 42), wherein the amino acid sequence has those single or multiple amino acid substitutions, deletions, insertions, inversions, analogs, homologs, and subunits. The vaccination agent according to claim 39, comprising: 45. The at least one immunodominant epitope has the amino acid sequence YYQSGLSIVMPVGG Q (SEQ ID NO: 49), wherein the amino acid sequence has single or multiple amino acid substitutions, deletions, insertions, inversions, analogs, homologs, and subunits. The vaccination agent according to claim 39, comprising: 46. The at least one immunodominant epitope has the amino acid sequence LTSELPQWLSANRA V (SEQ ID NO: 57), wherein the amino acid sequence has those single or multiple amino acid substitutions, deletions, insertions, inversions, analogs, homologs, and subunits. The vaccination agent according to claim 39, comprising: 47. The at least one immunodominant epitope has the amino acid sequence SMAGSSAMILAAYHP (SEQ ID NO: 62), wherein the amino acid sequence has those single or multiple amino acid substitutions, deletions, insertions, inversions, analogs, homologs, and subunits. 40. The vaccination agent of claim 39, comprising: 48. The at least one immunodominant epitope has the amino acid sequence SAMILAAYHPQQFIY (SEQ ID NO: 63), wherein the amino acid sequence has those single or multiple amino acid substitutions, deletions, insertions, inversions, analogs, homologs, and subunits. The vaccination agent according to claim 39, comprising: 49. The at least one immunodominant epitope has the amino acid sequence ALLDPSQGMGPSLIG (SEQ ID NO: 67), wherein the amino acid sequence has substitutions, deletions, insertions, inversions, analogs, homologs, and subunits of one or more of those amino acids. The vaccination agent according to claim 39, comprising: 50. The at least one immunodominant epitope has the amino acid sequence PSLIGLAMGDAGGY K (SEQ ID NO: 69), wherein the amino acid sequence has those single or multiple amino acid substitutions, deletions, insertions, inversions, analogs, homologs, and subunits. The vaccination agent according to claim 39, comprising: 51. The at least one immunodominant epitope has the amino acid sequence AADMWGPSSDPAWE R (SEQ ID NO: 72), wherein the amino acid sequence has those single or multiple amino acid substitutions, deletions, insertions, inversions, analogs, homologs, and subunits. The vaccination agent according to claim 39, comprising: 52. The at least one immunodominant epitope has the amino acid sequence GPSSDPAWERNDPT Q (SEQ ID NO: 73), wherein the amino acid sequence has single or multiple amino acid substitutions, deletions, insertions, inversions, analogs, homologs, and subunits. The vaccination agent according to claim 39, comprising: 53. The at least one immunodominant epitope has the amino acid sequence VANNTRLWVYCGNG T (SEQ ID NO: 77), wherein the amino acid sequence has single or multiple amino acid substitutions, deletions, insertions, inversions, analogs, homologs, and subunits. The vaccination agent according to claim 39, comprising: 54. The at least one immunodominant epitope has the amino acid sequence GANIPAEFLENFVRS (SEQ ID NO: 81), wherein the amino acid sequence has substitutions, deletions, insertions, inversions, analogs, homologs, and subunits of one or more of those amino acids. The vaccination agent according to claim 39, comprising: 55. The at least one immunodominant epitope has the amino acid sequence QDAYNAAGGHNAVFN (SEQ ID NO: 85), wherein the amino acid sequence has those single or multiple amino acid substitutions, deletions, insertions, inversions, analogs, homologs, and subunits. The vaccination agent according to claim 39, comprising: 56. The at least one immunodominant epitope has the amino acid sequence THSWEYWGAQLNAM K (SEQ ID NO: 89), wherein the amino acid sequence has those single or multiple amino acid substitutions, deletions, insertions, inversions, analogs, homologs, and subunits. The vaccination agent according to claim 39, comprising: 57. An immunodiagnostic agent for use in enhancing a detectable immune response in a mammalian host identifying infectious agents derived from the genus Mycobacterium, comprising: tuberculosis 110KD protein, 80KD protein, 71KD protein, 58KD protein, 45KD protein, 32A KD protein, 32B KD protein, 30KD protein, 24KD protein, 23.5KD protein, 23KD protein, 16KD protein, 14KD protein, 12KD protein, and each of them An immunodiagnostic agent comprising at least one immunodominant epitope of at least one predominantly abundant extracellular product selected from the group consisting of analogs, homologs, and subunits of 58. The at least one predominantly abundant extracellular product is 58. The immunodiagnostic agent according to claim 57, which is a tuberculosis 30KD protein. 59. The at least one immunodominant epitope is an amino acid sequence With M. 59. The tuberculosis 30KD protein subunit, and selected from the group consisting of single or multiple amino acid substitutions, deletions, insertions, and their respective analogs, including homologs, and subunits, including inversions. Immunodiagnostic drug. 60. The at least one immunodominant epitope has the amino acid sequence FSRPGLPVEYLQVP S (SEQ ID NO: 37), wherein the amino acid sequence has those single or multiple amino acid substitutions, deletions, insertions, inversions, analogs, homologs, and subunits. 60. The immunodiagnostic agent according to claim 59, comprising: 61. The at least one immunodominant epitope has the amino acid sequence LPVEYLQVPSPSMGR (SEQ ID NO: 38), wherein the amino acid sequence has those single or multiple amino acid substitutions, deletions, insertions, inversions, analogs, homologs, and subunits. 60. The immunodiagnostic agent according to claim 59, comprising: 62. The at least one immunodominant epitope has the amino acid sequence LQVPSPSMGRDIKV Q (SEQ ID NO: 39), wherein the amino acid sequence has those single or multiple amino acid substitutions, deletions, insertions, inversions, analogs, homologs, and subunits. 60. The immunodiagnostic agent according to claim 59, comprising: 63. The at least one immunodominant epitope has the amino acid sequence DIKVQFQSGGNNSP A (SEQ ID NO: 41), wherein the amino acid sequence has those single or multiple amino acid substitutions, deletions, insertions, inversions, analogs, homologs, and subunits. 60. The immunodiagnostic agent according to claim 59, comprising: 64. The at least one immunodominant epitope has the amino acid sequence FQSGGNNSPAVYLL D (SEQ ID NO: 42), wherein the amino acid sequence has those single or multiple amino acid substitutions, deletions, insertions, inversions, analogs, homologs, and subunits. 60. The immunodiagnostic agent according to claim 59, comprising: 65. The at least one immunodominant epitope has the amino acid sequence YYQSGLSIVMPVGG Q (SEQ ID NO: 49), wherein the amino acid sequence has single or multiple amino acid substitutions, deletions, insertions, inversions, analogs, homologs, and subunits. 60. The immunodiagnostic agent according to claim 59, comprising: 66. The at least one immunodominant epitope has the amino acid sequence LTSELPQWLSANRA V (SEQ ID NO: 57), wherein the amino acid sequence has those single or multiple amino acid substitutions, deletions, insertions, inversions, analogs, homologs, and subunits. 60. The immunodiagnostic agent according to claim 59, comprising: 67. The at least one immunodominant epitope has the amino acid sequence SMAGSSAMILAAYHP (SEQ ID NO: 62), wherein the amino acid sequence has those single or multiple amino acid substitutions, deletions, insertions, inversions, analogs, homologs, and subunits. 60. The immunodiagnostic agent according to claim 59, comprising: 68. The at least one immunodominant epitope has the amino acid sequence SAMILAAYHPQQFIY (SEQ ID NO: 63), wherein the amino acid sequence has those single or multiple amino acid substitutions, deletions, insertions, inversions, analogs, homologs, and subunits. 60. The immunodiagnostic agent according to claim 59, comprising: 69. The at least one immunodominant epitope has the amino acid sequence ALLDPSQGMGPSLIG (SEQ ID NO: 67), wherein the amino acid sequence has substitutions, deletions, insertions, inversions, analogs, homologs, and subunits of one or more of those amino acids. 60. The immunodiagnostic agent according to claim 59, comprising: 70. The at least one immunodominant epitope has the amino acid sequence PSLIGLAMGDAGGY K (SEQ ID NO: 69), wherein the amino acid sequence has those single or multiple amino acid substitutions, deletions, insertions, inversions, analogs, homologs, and subunits. 60. The immunodiagnostic agent according to claim 59, comprising: 71. The at least one immunodominant epitope has the amino acid sequence AADMWGPSSDPAWE R (SEQ ID NO: 72), wherein the amino acid sequence has those single or multiple amino acid substitutions, deletions, insertions, inversions, analogs, homologs, and subunits. 60. The immunodiagnostic agent according to claim 59, comprising: 72. The at least one immunodominant epitope has the amino acid sequence GPSSDPAWERNDPT Q (SEQ ID NO: 73), wherein the amino acid sequence has single or multiple amino acid substitutions, deletions, insertions, inversions, analogs, homologs, and subunits. 60. The immunodiagnostic agent according to claim 59, comprising: 73. The at least one immunodominant epitope has the amino acid sequence VANNTRLWVYCGNG T (SEQ ID NO: 77), wherein the amino acid sequence has single or multiple amino acid substitutions, deletions, insertions, inversions, analogs, homologs, and subunits. 60. The immunodiagnostic agent according to claim 59, comprising: 74. The at least one immunodominant epitope has the amino acid sequence GANIPAEFLENFVRS (SEQ ID NO: 81), wherein the amino acid sequence has substitutions, deletions, insertions, inversions, analogs, homologs, and subunits of one or more of those amino acids. 60. The immunodiagnostic agent according to claim 59, comprising: 75. The at least one immunodominant epitope has the amino acid sequence QDAYNAAGGHNAVFN (SEQ ID NO: 85), wherein the amino acid sequence has those single or multiple amino acid substitutions, deletions, insertions, inversions, analogs, homologs, and subunits. 60. The immunodiagnostic agent according to claim 59, comprising: 76. The at least one immunodominant epitope has the amino acid sequence THSWEYWGAQLNA MK (SEQ ID NO: 89), wherein the amino acid sequence has single or multiple amino acid substitutions, deletions, insertions, inversions, analogs, homologs, and subunits. 60. The immunodiagnostic agent according to claim 59, comprising: 77. A method of immunizing a mammalian host against an infectious pathogen of the genus Mycobacterium, comprising the following steps: tuberculosis 110KD protein, 80KD protein, 71KD protein, 58KD protein, 45KD protein, 32A KD protein, 32B KD protein, 30KD protein, 24KD protein, 23.5KD protein, 23KD protein, 16KD protein, 14KD protein, 12KD protein, and each of them Providing at least one immunodominant epitope of at least one predominantly abundant extracellular product selected from the group consisting of analogs, homologs, and subunits of: Inducing an effective immune response against subsequent infection by said infectious agent. 78. The at least one predominantly abundant extracellular product is 78. The method of claim 77, which is a tuberculosis 30KD protein. 79. The at least one immunodominant epitope is an amino acid sequence With M. 79. The tuberculosis 30KD protein subunit, and selected from the group consisting of single or multiple amino acid substitutions, deletions, insertions, and their respective analogs, including homologs, and subunits, including inversions. Method. 80. A method for detecting the presence of an immune response in a mammal against a pathogen of the genus Mycobacterium, comprising the following steps: tuberculosis 110KD protein, 80KD protein, 71KD protein, 58KD protein, 45KD protein, 32A KD protein, 32B KD protein, 30KD protein, 24KD protein, 23.5KD protein, 23KD protein, 16KD protein, 14KD protein, 12KD protein, and each of them Providing at least one immunodominant epitope of at least one predominantly abundant extracellular product selected from the group consisting of analogs, homologs, and subunits of the above; administering the at least one immunodominant epitope to the mammal And measuring the resulting immune response. 81. The at least one predominantly abundant extracellular product is 81. The method of claim 80, which is a tuberculosis 30KD protein. 82. The at least one immunodominant epitope is an amino acid sequence With M. 90.The tuberculosis 30KD protein subunit, and selected from the group consisting of single or multiple amino acid substitutions, deletions, insertions, and their respective analogs, including homologs, and subunits, including inversions. Method. 83. M. tuberculosis 110KD protein, 80KD protein, 71KD protein, 58KD protein, 45KD protein, 32A KD protein, 32B KD protein, 30KD protein, 24KD protein, 23.5KD protein, 23KD protein, 16KD protein, 14KD protein, 12KD protein, and those A process for producing a predominantly abundant extracellular product selected from the group consisting of each analog, homolog, and subunit, the process comprising the steps of: transforming a host cell with a vector and transforming the transformed cell Wherein said vector comprises a nucleic acid molecule encoding one of said predominantly abundant extracellular products; and culturing said transformed cell, whereby said predominantly abundant Producing an extracellular product. 84. 84. The process of claim 83, comprising the further step of recovering said predominantly abundant extracellular product produced by culturing said transformed cells. 85. 84. The process of claim 83, wherein said vector comprises pET22b. 86. The host cell is E. coli. coli, M. smegmatis, or M.P. 84. The process of claim 83, wherein the process is vaccae. 87. Said nucleic acid molecule is selected from the group consisting of a 30 KD protein, a 32A KD protein, and a 32B KD protein; 84. The process of claim 83, which encodes a tuberculosis protein. 88. 84. The process of claim 83, comprising the further step of recovering said protein produced during culturing of said transformed cells. 89. 89. The process of claim 88, wherein said vector comprises pSMT3 or pET22b. 90. The host cell is E. coli. coli, M. smegmatis, or M.P. 9. The process of claim 8, wherein the process is vaccae. 91. M. tuberculosis 110KD protein, 80KD protein, 71KD protein, 58KD protein, 45KD protein, 32A KD protein, 32B KD protein, 30KD protein, 24KD protein, 23.5KD protein, 23KD protein, 16KD protein, 14KD protein, 12KD protein, and those A vector comprising a nucleic acid molecule encoding a predominantly abundant extracellular product selected from the group consisting of each analog, homolog, and subunit. 92. Said nucleic acid molecule is selected from the group consisting of a 30 KD protein, a 32A KD protein, and a 32B KD protein; 92. The vector of claim 91, which encodes a tuberculosis protein. 93. 92. The vector of claim 91, wherein said vector comprises pET22b.
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