JPH11505715A

JPH11505715A - CDNA clone encoding human G-protein γ subunit

Info

Publication number: JPH11505715A
Application number: JP8535609A
Authority: JP
Inventors: ロビショー，ジャネット・ディ; クンシュ，チャールズ・エイ
Original assignee: Human Genome Sciences Inc; SmithKline Beecham Corp
Current assignee: Human Genome Sciences Inc; SmithKline Beecham Corp
Priority date: 1995-05-22
Filing date: 1995-05-22
Publication date: 1999-05-25

Abstract

(57)【要約】ヒトγ₂、γ₃、γ₄、γ₅、γ₇、γ₁₀およびγ₁₁サブユニットをコードする核酸分子を提供する。サブユニットポリペプチドも提供する。さらに、ヒトγサブユニットの突然変異形およびヒトγサブユニットの改変レベルの検出方法を提供する。βγリガンドと、そのレセプターの相互作用のアンタゴニストおよびアゴニストの同定方法も提供する。 (57) Abstract: Human _{_{_{γ 2, γ 3, γ 4}}} , γ 5, γ 7, provides a nucleic acid molecule encoding a gamma ₁₀ and gamma ₁₁ subunits. Subunit polypeptides are also provided. Further, a method for detecting a mutant form of the human γ subunit and an altered level of the human γ subunit is provided. Also provided are methods for identifying antagonists and agonists of the interaction of a βγ ligand with its receptor.

Description

【発明の詳細な説明】ヒトＧ−蛋白質γサブユニットをコードするｃＤＮＡクローン発明の背景細胞外シグナルの細胞内透過は、種々のレセプターおよびエフェクターと結合し、適切な細胞応答を生じさせる、Ｇ蛋白質と称されるグアニン・ヌクレトチド結合蛋白質が介在するのが最も一般的である。Ｇ蛋白質結合レセプターは、ホルモン、神経伝達物質および化学誘引物質から、光、臭および味のような感覚刺激に及ぶ広範な種々のシグナルを変換（transduce）する（Kunapuli et al.，J．B iol．Chem．(1994)269(14):10209-10212)。Ｇ−蛋白質は、α、βおよびγサブユニットからなるヘテロトリマーである。適切なリガンドに対する結合に応じて、レセプターは、αサブユニットでの結合ＧＤＰのＧＴＰへの交換を刺激し、α サブユニットのβおよびγサブユニットからの解離をもたらす。ＧＴＰ−結合α サブユニットは、下流エフェクターの活性を直接調節することが示されている（Gilman，A.G.，Ann．Rev．Biochem．(1987)56:615-649; Simon et al.，Scien ce(1991)252:802-808; Birnbaumer，L．Cell，(1992)71:1069-1072）。Gilmanは、ＧＴＰ−結合αサブユニットの解離後、βγサブユニットが、in vivoで、しっかりと会合した複合体として存在することを示した。この複合体は、アデニルサイクラーゼ・サブタイプIIおよびIV、ホスホリパーゼＡ２、ホスホリパーゼＣサブタイプβ１,２,３ならびにＫ⁺およびＣa²⁺チャネルを包含する下流エフェクターの特異的なサブセットの活性を調節することが判明している（Tang，W.J.およびGilman，A.G.，Science(1991)254:1500-1503; Wickman et al.，Nature(199 4)368:254-257; Clapham，D.E.およびNeer，E.J.，Nature(1993)365:403-406）。このように、Ｇ蛋白質αおよびβγサブユニットは、これらのエフェクターの二又の機能を調節するシグナルを生じる。さらに、βγサブユニットは直接レセプターと結合でき（Phillips，W.J.およびCerioe，R.A.， J．Biol．Chem．(1992)24:17032-17039）、β−アドレナリン（β−ＡＲＫ）キナーゼを膜に対して直接相互作用させ、補充することにより、アゴニスト依存性ホスホリル化および脱感作を増加させることができる（Haga，K.およびHaga，T. ，J．Biol．Chem．(1992)267:2222-2227; Pitcher et al.，Science(1992)257:1 264-1267）。すなわち、βγサブユニットは、これらのエフェクターの調節およびレセプターの認識の両方において重要である。Ｇ蛋白質βおよびγサブユニットの両方は、大きな多重遺伝子族に属する。これまでに、５つの別異の哺乳動物βサブユニット（β₁−β₅）をコードする完全なｃＤＮＡが同定された（Watson et al.，J．Biol．Chem．(1994)269:22150-22 156）。最近同定されたラット心臓ｃＤＮＡは、ヒトβ₃サブユニットと９６％の同一性の第６のβサブユニットをコードし得る（Ray，K.およびRobishaw，J.D., Gene(1994)149:337-340）。アミノ酸レベルで、該βサブユニットは非常に保存的である。これに対し、γサブユニットはより分岐的である。すなわち、γサブユニットは、βγサブユニット複合体の機能的特異性を決定するものと考えられる。５つの異なるγサブユニットを表す完全なｃＤＮＡが報告され、ウシ網膜からγ₁サブユニットが（Hurley et al.，Proc．Nat'l．Acad．Sci．USA，(1984)81:6948- 6952）、ウシ脳からγ₂、γ₃およびγ₇が（Robishaw et al.，J．Biol．Chem.， (1989)264:15758-15761; Gautam et al.，Science(1989)244:971-974; Gautam e t al.，Proc．Not'l．Acad．Sci．USA,(1990)87:7973-7977; Cali et al.，J．B iol．Chem.，(1992)267:24023-24027）およびウシおよびラット肝臓からγ₅が（ Fisher，KおよびAronson，N.N.，Mol．Cell Biol.，(1992)12:1585-1591）単離されている。推定γ₄サブユニットの存在も報告され、マウス腎臓および網膜からＰＣＲフラグメントが単離されている（Gautam et al.，Proc．Nat'l．Acad． Sci．USA，(1990)87:7973-7977）。本発明においては、ヒトγ₂、γ₃、γ₄、γ₅、γ₇、γ₁₀およびγ₁₁サブユニットをコードするｃＤＮＡクローンを単離し、特徴付けした。発明の概要本発明の１つの態様によれば、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡならびにそれらのアナログおよび生物学的に活性な、診断的または治療的に有用なフラグメントを包含するヒトγ₂、γ₃、γ₄、γ₅、γ₇、γ₁₀およびγ₁₁サブユニットをコードする単離された核酸分子が提供される。本発明の他の態様によれば、γ₂、γ₃、γ₄、γ₅、γ₇、γ₁₀およびγ₁₁サブユニットならびにそれらの生物学的に活性な、診断的または治療的に有用なフラグメント、アナログおよび誘導体であるポリペプチドを提供される。本発明のポリペプチドは、ヒト起源である。本発明のさらなる態様においては、かかるポリペプチドに対する抗体が提供される。本発明のさらなる態様においては、γ₂、γ₃、γ₄、γ₅、γ₇、γ₁₀またはγ₁ ₁ サブユニットのいずれかのヒト核酸配列を含む組換原核および／または真核宿主細胞を、当該ポリペプチドの発現が促進される条件下で培養し、ついで当該ポリペプチドを回収することからなる、そのようなポリペプチドの製造法が提供される。本発明のさらなる態様においては、ヒトγ₂、γ₃、γ₄、γ₅、γ₇、γ₁₀およびγ₁₁サブユニット配列と特異的にハイブリダイズするのに十分な長さの核酸分子からなる核酸プローブも提供される。本発明のこれらおよび他の態様は、本明細書の教示から当業者に明らかであろう。発明の詳細な説明Ｇ蛋白質βγダイマーの、アデニルサイクラーゼ・サブタイプIIおよびIV、ホスホリパーゼＡ２、ホスホリパーゼＣサブタイプβ１,２,３ならびにＫ⁺およびＣa²⁺チャネルを包含する下流エフェクターの特異的なサブセットの活性調節およびレセプター認識における役割が、これらの蛋白質の同定および特徴付の重要性を増加させている。これらのダイマーの機能的特異性は、γサブユニットによって決定されると考えられる。網膜と脳のβγサブユニットとの著しい相違が、膜会合の見地から（Lee et al.，J．Biol．Chem.，(1992)267:24776-24781）、Ｇ蛋白質αサブユニット、レセプターとの相互作用の見地から（Fawzi et al.，J ．Biol．Chem.，(1991)266:12194-12200）、レセプターキナーゼの見地から（Pi tcher et al.，Science(1992)257:1264-1267）およびエフェクターの見地から（ Iniguez-Llihi et al.，J．Biol．Chem.，(1992)32:23409-23410）報告されている。網膜および脳βγサブユニットは共通のβ₁サブユニットを共有しているので、これらの相違はそれらに特有のγサブユニットに起因するようである。本発明においては、γサブユニットをコードする７つのヒトｃＤＮＡクローンを同定した。アミノ酸レベルの同一性に基づき、これら７つのｃＤＮＡクローンのうちの４つが、ヒトγ₂、γ₃、γ₅およびγ₇サブユニットを表すと決定した。 γ₂、γ₃、γ₅およびγ₇サブユニットクローンの塩基配列を決定し、各々、配列番号２０、２１、２２および２３として提供する。残りの３つのｃＤＮＡクローンは、いずれの公知のγサブユニットとも関係しないようである。これら３つのアミノ酸の相違は、蛋白質全体に分布しており、それらが公知のγサブユニットの別のスプライシングにより生じたものでないことを示した。これら３つのｃＤＮＡクローンの１つの予想アミノ酸配列は、推定マウスγ₄サブユニット（Gauta m et al.，Proc．Nat'l．Acad．Sci．USA，(1990)87:7973-7977）のＰＣＲフラグメントに対して著しい同一性（９７％）を示した。したがって、このサブユニットをγ₄サブユニットと命名した。他の２つのｃＤＮＡクローンをγ₁₀および γ₁₁サブユニットと命名した。γ₄、γ₁₀およびγ₁₁サブユニットクローンの完全な塩基配列を決定し、各々、配列番号９、１０および１１として提供する。 γ₄、γ₁₀およびγ₁₁サブユニットのｃＤＮＡクローンは、１９９５年５月４日に、各々、ＡＴＣＣ受託番号９７１４０、９７１３８および９７１３９として寄託された。γ₂、γ₃、γ₅およびγ₇サブユニットのｃＤＮＡクローンの混合物は、１９９５年５月４日に、ＡＴＣＣ受託番号９７１３７として寄託された。混合物中のこれらｃＤＮＡの各々のコード領域は、以下のプライマー対を使用するＰＣＲ増幅により得ることができる。γ₂サブユニットについて、センスプライマーは５’−ＣＴＡＴＣＣＡＧＣＡＣＴＣＣＧＡＴＧＧＣ−３’（配列番号１２）であり、アンチセンスプライマーは５’−ＡＧＡＣＴＴＡＡＡＧＧＡＴＧＧＣＡＣＡＧ−３’（配列番号１３）である。γ₃サブユニットについて、センスプライマーは、５’−ＴＧＴＧＧＣＴＴＣＡＧＧＡＴＧＡＡＡＧＧ−３’（配列番号１４）であり、アンチセンスプライマーは５’−ＧＡＧＣＴＣＡＧＡＧＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧ−３’（配列番号１５）である。γ₅サブユニットについて、センスプライマーは、５’−ＧＴＧＣＡＣＣＡＴＧＴＣＴＧＧＣＴＣＣＴ−３’（配列番号１６）であり、アンチセンスプライマーは、５’−ＣＡＣＴＧＧＡＴＣＡＴＡＡＧＧＡＧＴＧＧ−３’（配列番号１７）である。γ₇サブユニットについて、センスプライマーは、５’−ＧＡＴＧＧＣＡＧＡＣＡＡＴＧＴＣＡＧＣＣ −３’（配列番号１８）であり、アンチセンスプライマーは、５’−ＡＧＴＴＡＴＡＡＡＡＴＡＡＴＡＣＡＡＧＧ−３’（配列番号１９）である。 γ₄サブユニットのｃＤＮＡは長さ６８９ｂｐであり、各々、９８および３６５ｂｐの５’−および３’−非翻訳（ＵＴＲ）配列を含む（配列番号９）。位置９９の第１のＡＴＧコドンは翻訳開始コドンの特徴を有し、位置−３および＋４に予想したプリンを有する。位置１１１の第２のＡＴＧコドンは、予想プリンを欠き、開始コドンの可能性は少ない。ポリアデニン配列がｃＤＮＡの３’−末端近傍に観察された。 γ₁₀サブユニットのｃＤＮＡは長さ１２１３ｂｐであり、各々、２３および９８６ｂｐの５’−および３’−ＵＴＲ配列を含む（配列番号１０）。長い３’− ＵＴＲはポリ（Ａ）テール、３’−末端に向かうポリアデニレーション・シグナルおよびｍＲＮＡの安定性に関係する幾つかのＡ（Ｔ）_nＡモチーフを有する。 γ₁₁サブユニットのｃＤＮＡは長さ６５４ｂｐであり、各々、１０６および３２６ｂｐの５’−および３’−ＵＴＲ配列を含む（配列番号１１）。３’−ＵＴＲはポリアデニレーション・シグナルおよび３’−末端に向くポリ（Ａ）テールを有する。本発明は、さらに、配列番号２、３、４、５、６、７および８のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはヒトγ₂、γ₃、γ₄、γ₅、γ₇、γ₁₀またはγ₁₁サブユニットのｃＤＮＡクローンによってコードされるポリペプチドならびにそのようなポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体に関する。γ₂サブユニットのｃＤＮＡの推定アミノ酸配列は配列番号２である。γ₃サブユニットのｃＤＮＡの推定アミノ酸配列は配列番号３である。γ₄サブユニットのｃＤＮＡの推定アミノ酸配列は配列番号４である。γ₅サブユニットのｃＤＮＡの推定アミノ酸配列は配列番号５である。γ₇サブユニットのｃＤＮＡの推定アミノ酸配列は配列番号６である。γ₁₀サブユニットのｃＤＮＡの推定アミノ酸配列は配列番号７である。γ₁₁サブユニットのｃＤＮＡの推定アミノ酸配列は配列番号８である。 γ₄、γ₁₀およびγ₁₁サブユニットのｃＤＮＡによってコードされると予想される蛋白質配列と、γ₁（配列番号１）、γ₂、γ₃、γ₅およびγ₇サブユニットのホモログとの比較は、有意な相同性を示した。γ₄サブユニットについて、相同性は、低くはγ₁サブユニットに対する３８％から、高くはγ₂サブユニットに対する７７％までの範囲にわたった。γ₁₀サブユニットについて、相同性は、低くはγ₄サブユニットに対する３５％から、高くはγ₂、γ₅およびγ₇サブユニットに対する５３％までの範囲にわたった。この比較的低いレベルの相同性はγ₁₀ サブユニットが、他のγサブユニットと遠い関係しかない新しいサブクラスを代表し得ることを示唆している。γ₁₁サブユニットについて、相同性は、低くはγ₂ 、γ₃、γ₅およびγ₇サブユニットに対する３３〜４４％から、高くはγ₁サブユニットに対する７６％までの範囲にわたった。アミノ酸配列変換の分析は、γサブユニット族が、γ₁およびγ₁₁サブユニットを含む第１のクラス、γ₂、γ₃、γ₄およびγ₇サブユニットを含む第２のクラス、γ₅サブユニットを含む第３のクラスおよびγ₁₀サブユニットを含む第４のクラスの４つの別々のサブクラスに分類できることを示唆している。これらのサブクラスは相同性のみならず、機能的類似性にも基づく。すなわち、１つのサブクラス内の構成員は、同様な翻訳後の修飾、Ｇ蛋白質のβおよびαサブユニットとの同様な相互作用能を示す。例えば、１つのサブクラスを構成するγ₁および γ₁₁サブユニットは、ファルネシル基で修飾され、β₂サブユニットとは相互作用せず、α₀サブユニットと相互作用しない。これとは異なり、もう１つ別のサブクラスを構成するγ₂、γ₃、γ₄およびγ₇サブユニットは、ゲラニルゲラニル基で修飾され、β₂サブユニットと相互作用し、少なくともある程度、α₀サブユニットと相互作用する。配列表に示したポリペプチドまたは寄託したｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドに言及する場合、「フラグメント」、「誘導体」および「アナログ（類似体）」なる用語は、実質的にこのようなポリペプチドと同じ生物学的機能を有するポリペプチドを意味する。アナログは、プロ蛋白質部の開裂により活性化され、活性なマチュア(成熟)ポリペプチドを産生しうるプロ蛋白質を包含する。本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然のポリペプチドまたは合成ポリペプチドでよく、好ましくは組換えポリペプチドである。配列表に示したポリペプチドまたは寄託したｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログは、（ｉ）１またはそれ以上のアミノ酸残基が保存または非保存アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ残基）で置換されていて、このような置換アミノ酸残基が遺伝コードによりコードされているかまたはコードされていないものであるか、または（ii）１またはそれ以上のアミノ酸残基が置換基を包含するものであるか、または（iii）マチュアポリペプチドが他の化合物、例えば、ポリペプチドの半減期を増加させるような化合物（例えば、ポリエチレングリコール）と融合しているものであるか、または（ iv）さらに、リーダーまたは分泌配列あるいはマチュアポリペプチドまたはプロ蛋白質の精製に用いられる配列のような別のアミノ酸がマチュアポリペプチドと融合したものであってよい。このようなフラグメント、誘導体およびアナログは本明細書の教示から当業者の範囲内と考えられる。本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは好ましくは単離された形態で提供され、好ましくは等質になるよう精製される。「単離」なる用語は、物質がその最初の環境（例えば、天然に存在する場合には、自然環境）から取り出されたことを意味する。例えば、生体に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、その天然系における共存物質の一部または全部から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されている。このようなポリヌクレオチドはベクターの一部であり得るか、および／またはこのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の一部であってよく、このようなベクターまたは組成物がその天然環境の一部でなければ、やはり、単離されている。本発明はまた、本発明のｃＤＮＡクローンを含むベクター、本発明のベクターを用いて遺伝子操作される宿主細胞および組換え技術による本発明のポリペプチドの産生に関する。宿主細胞は、例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであってよい本発明のベクターを用いて遺伝子操作（形質導入または形質転換またはトランスフェクション）される。ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態であってよい。遺伝子操作された宿主細胞は、プロモーターの活性化、形質転換体の選択またはγサブユニット遺伝子の増幅用に適当に修飾した、通常の栄養培地中で培養できる。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現に関して選択した宿主細胞に関して既に用いられているものであり、当業者に自明である。本発明のｃＤＮＡクローンは、組換え技術によるポリペプチドの産生に用いられる。すなわち、例えば、ｃＤＮＡクローンはポリペプチドの発現のための種々の発現ベクターのいずれかに含まれる。このようなベクターは、染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０の誘導体；細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドおよびファージＤＮＡ、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、家禽ポックスウイルス、および偽狂犬病などのウイルスＤＮＡの組み合わせ由来のベクターを包含する。しかし、宿主中で複製可能であり、生存できるならば他のベクターを用いてもよい。適当なクローンを種々の操作によりベクター中に挿入することができる。一般に、ｃＤＮＡ配列は、当該分野で公知の操作により適当な制限エンドヌクレアーゼ部位中に挿入される。このような操作および他の操作は当業者の範囲内であると考えられる。発現ベクター中のｃＤＮＡ配列を、適当な発現調節配列（プロモーター）に操作可能に結合させて、ｍＲＮＡ合成を行う。このようなプロモーターの代表例として、ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、イー・コリ（E．coli）ｌａｃまたはｔｒｐ、ファージラムダＰ_Lプロモーターおよび原核または真核細胞またはそれらのウイルスにおける遺伝子発現を調節することが知られている他のプロモーターが挙げられる。発現ベクターはまた、翻訳開始のリボソーム結合部位および転写ターミネーターを含む。ベクターは、発現の増幅に適当な配列も包含する。加えて、発現ベクターは、好ましくは、真核細胞培養についてジヒドロ葉酸還元酵素またはネオマイシン耐性、あるいはイー・コリにおけるテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性などの形質転換された宿主細胞の選択のための表現型特性をもたらすような１またはそれ以上の選択可能なマーカー遺伝子を有する。上記した適当なｃＤＮＡ配列、ならびに適当なプロモーターまたは調節配列を有するベクターを用い、適当な宿主を形質転換させ、宿主が蛋白質を発現させることができる。適当な宿主の代表例として、イー・コリ、ストレプトマイセス(Streptomyces) 、サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）などの細菌細胞；酵母細胞などの真菌細胞；ショウジョウバエ（Drosophila）Ｓ２およびシロナヨトウ（Spodoptera）Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳまたはBowes黒色腫細胞などの動物細胞；アデノウイルス；および植物細胞が挙げられる。適当な宿主の選択は、本明細書の教示から当業者の範囲内であると考えられる。さらに具体的には、本発明は、広範囲にわたり記載したような１またはそれ以上の配列を含む組換え構築物も包含する。構築物は、本発明の配列が正または逆の向きでその中に挿入される、プラスミドまたはウイルスベクターなどのベクターを有してなる。本発明の好ましい態様において、構築物はさらに、例えば、配列に操作可能に結合したプロモーターを含む調節配列を有してなる。多数の適当なベクターおよびプロモーターが当該分野で公知であり、商業的に入手可能である。以下のベクターを例示のために挙げる。細菌性：ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Ｑiagen）、ｐＢＳ、ｐＤ１０、ファージスクリプト、ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓtratagene）；ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐharmacia）。真核細胞:ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓtratage ne）ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐharmacia）。しかし、他のプラスミドまたはベクターも宿主中で複製可能で、生存可能ならば用いることができる。また、完全哺乳動物転写ユニットおよび選択可能なマーカーも原核細胞プラスミドに挿入できる。ついで、得られたベクターは、培養した哺乳動物細胞にトランスフェクトする前に、増幅される。このタイプのベクターの例には、ｐＴＫ２、ｐＨｙｇおよびｐＲＳＶｎｅｏが包含される。プロモーター領域はＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択可能なマーカーを有する他のベクターを用いて望ましいいずれの遺伝子からも選択できる。２つの適当なベクターはｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７である。特に例示すべき細菌プロモーターには、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、ラムダＰ_R、Ｐ_Lおよびｔｒｐが包含される。真核細胞プロモーターにはＣＭＶ即時型、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスメタロチオネイン−Ｉを包含される。適当なベクターおよびプロモーターの選択は、当業者のレベル内である。さらに別の具体例において、本発明は上記構築を含む宿主細胞に関する。宿主細胞は、哺乳動物細胞などのより高等な真核細胞、または酵母細胞などのより低級な真核細胞、あるいは宿主細胞は細菌細胞などの原核細胞であってもよい。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ −デキストラン媒介トランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、リポゾーム、核への直接マイクロインジェクション、スクレープローディングまたはエレクトロポレーションにより行うことができる。宿主細胞中の構築物を常法にて用い、ｃＤＮＡクローンによりコードされる遺伝子産物を産生することができる。別法として、本発明のポリペプチドは通常のペプチドシンセサイザーにより合成により製造できる。マチュア蛋白質は哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞において適当なプロモーターの調節下で発現できる。無細胞翻訳系を使用して、in vitro およびin vivo両方において、本発明のＤＮＡ構築物由来のＲＮＡを用いてこのような蛋白質を産生することもできる。原核および真核宿主について用いられる適当なクーニングおよび発現ベクターは、Sambrookら、Molecular Cloning：ALabora tory Manual，第２版，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)に記載され、その開示を参照として本明細書に組み込む。高等な真核細胞による本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写を、エンハンサー配列をベクター中に挿入することに増加させる。エンハンサーはＤＮＡシス−作用エレメントで、通常約１０〜３００ｂｐの、プロモーターに作用してその転写を増加させるものである。その例としては、複製開始点ｂｐ１００ないし２７０の後側のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。一般に、組換体発現ベクターは複製の起点および宿主細胞の形質転換を可能にする選択可能なマーカー、例えば、イー・コリのアンピシリン耐性遺伝子およびエス・セレビシエ（S．cerevisiae）ＴＲＰ１遺伝子、ならびに高度に発現された遺伝子由来のプロモーターを包含し、下流の構造配列の転写を指令する。このようなプロモーターは、とりわけ、３−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）、α−ファクター、酸ホスファターゼ、または熱ショック蛋白質などの解糖酵素をコードするオペロンから誘導できる。ヘテロローガスな構造配列は翻訳開始および終止配列、好ましくは、翻訳された蛋白質のペリプラズム空隙または細胞外培地への分泌を指令することのできるリーダー配列を有する適当な相内で組み立てられる。所望により、ヘテロローガスな配列は、望ましい特性を付与する、例えば、発現された組換体産物の安定化または精製簡素化をもたらすＮ−末端同定ペプチドを包含する融合蛋白質をコードできる。細菌用の有用な発現ベクターは、望ましい蛋白質をコードする構造ＤＮＡ配列を適当な翻訳開始および終止シグナルとともに機能性プロモーターを有する操作可能なリーディング相中に挿入することにより構築される。ベクターは、ベクターの維持を確実にし、所望により、宿主内での増幅をもたらすような１またはそれ以上の表現型選択マーカーおよび複製開始点を含む。形質転換に適当な原核宿主はイー・コリ、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、サルモネラ・チフィムリウムおよび種々のシュードモナス、ストレプトマイセス／およびスタフィロコッカス属に含まれる種を包含するが、他のものを選択して利用してもよい。また、完全哺乳動物転写ユニットおよび選択可能なマーカーを原核細胞プラスミドに挿入できる。得られたベクターを、ついで、培養哺乳動物細胞にトランスフェクトする前に細菌中で増幅する。代表的であるが制限的でない例として、細菌用に有用な発現ベクターは、選択マーカーおよびよく知られたクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝子エレメントを含む市販のプラスミド由来の複製の細菌起源を含むことができる。このような市販のベクターは、例えば、ｐＫＫ２２３−３（ファーマシア・ファイン・ケミカルズ、ウプサラ、スウェーデン）およびＧＥＭ１（プロメガ・バイオテック、米国ワイオミング州マジソン）を包含する。これらのｐＢＲ３２２「主鎖」セクションが、適当なプロモーターおよび発現される構造配列と組み合わされる。適当な宿主株の形質転換および宿主株の適当な細胞密度への宿主株の増殖後、選択されたプロモーターを適当な手段（例えば、温度シフトまたは化学誘導）により誘発させ、細胞をさらなる期間培養する。細胞は典型的には遠心分離により収穫し、物理的または化学的手段により破砕し、得られた粗抽出物をさらに精製するために保存する。蛋白質の発現に用いた微生物細胞は、凍結−解凍サイクル、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤を含むいずれか都合のよい方法で破壊でき、このような方法は当業者によく知られている。種々の哺乳動物細胞培養系も、組換体蛋白質の発現に用いることができる。哺乳動物発現系の例としては、ＣＯＳおよび適合性ベクターを発現できる他のセルライン、例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよびＢＨＫセルラインが挙げられる。哺乳動物発現ベクターは、複製開始点、適当なプロモーターおよびエンハンサー、ならびにいずれかの必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終止配列、および５’ フランキング非転写配列を有してなる。ＳＶ４０スプライス由来のＤＮＡ配列、およびポリアデニル化部位を用いて所望の非転写遺伝エレメントを得る。大量の蛋白質は、目的の遺伝子の増幅コピーを有するセルラインから得ることができる。この方法において、遺伝子は、選択可能なマーカーを有するＤＮＡのセグメントに結合させて、細胞中にトランスフェクトされ、または細胞中に、コトランスフェクトされる。ついで、遺伝子のコピー数が大きく増幅されたサブラインを選択する。当該分野で入手できる種々の選択可能なマーカーがある。例えば、ｄｈｆｒ遺伝子が、共増幅によく使用される。メトトレキセートの漸進的に増加する濃度での数カ月の増殖の後、ｄｈｆｒ遺伝子の１０００までのコピーを有するセルラインを得る。本発明のポリペプチドは硫酸アンモニウムまたはエタノール沈降、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィおよびレクチンクロマトグラフィーを包含する方法により、組換え細胞から回収および精製できる。マチュア蛋白質の構造の完成において、必要ならば、蛋白質再生工程を用いることができる。最終的に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を最終精製段階として用いることができる。本発明のポリペプチドは天然に精製された産物、または化学合成法の産物であるか、または原核または真核宿主（例えば、培地中細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳物細胞）から組換え技術により産生されてもよい。組換え体製造法において用いた宿主に応じて、本発明のポリペプチドはグリコシル化されるかまたはグリコシル化されなくてもよい。本発明のポリペプチドはまた初めのメチオニンアミノ酸残基を包含してもよい。 γサブユニット族の構成員の組織分布には著しい差異がある。γ₁。γ₂、γ₃ およびγ₄サブユニットのような、幾つかの構成員はほんのわずかな組織に限定されているのに対し、γ₅、γ₇、γ₁₀およびγ₁₁サブユニットのような他の構成員は広範囲の組織で発現される（Cali et al.，J．Biol．Chem.，(1992)267:240 23-24027）。さらに、組織内の大部分の細胞型において、γサブユニットのある種のサブセットのみが存在する（Peng et al.，Proc．Nat'l．Acad．Sci．USA， (1992)89:10882-108856; Hansen et al.，J．Mol．Cell Cardiol.，(1995)27:47 1-484）。このような分布の差異は、機能的に別異のＧ蛋白質へのα、β、γサブユニットの結合会合（combinatorial association）数において重要であると考えられる。種々のγサブユニットのサブセルラー局在化も報告されている（Hansen et al.，J．Cell Biol.,(1994)126:811-819）。これまで同定された異なるβおよびγサブユニット間の選択的相互作用の結果としての異なるβγダイマーの形成は、Ｇ蛋白質介在シグナル経路の特異性に寄与するものと考えられる。公知のβγ相互作用を表１に総括する。表１中、＋はβγダイマー形成能を示し、−はβγダイマー形成不能を示し、ＮＤは測定せずを意味する。表１に示すごとく、γ₂、γ₃、γ₅およびγ₇サブユニットと同様（Schmidt et al.，J．Biol．Chem.，(1992)267:13807-13810; Pro nin，A.N.およびGautam，N.,Proc．Nat'l．Acad．Sci．USA，(1992)89:6220-622 4; Iniguez-Lluhi et al.，J．Biol．Chem.，(1992)32:23409-23410; Ueda et al.，J．Biol．Chem.，(1994)269:4388-4395)、γ₄およびγ₁₀サブユニットはβ₁およびβ₂サブユニットと相互作用することができるが、β₃サブユニットとはできない。これとは異なり、γ₁₁サブユニットは、よりγ₁サブユニットと類似しており（Schmidt et al.，J．Biol．Chem.，(1992)267:13807-13810; Pro nin，A.N.およびGautam，N.,Proc．Nat’l．Acad．Sci．USA，(1992)89:6220-62 24）、これらは共にβ₁サブユニットと相互作用するが、β₂およびβ₃サブユニットとは相互作用しない。Ｇ−タンパク質およびその結合レセプタは、ホルモン、神経伝達物質および化学誘引物質から光、臭いおよび味などの感覚刺激までの範囲の広範囲の細胞シグナルと関係していた。Kunapuliら，J．Biol．Chem．（1994）269(14): 10209-10 212。Ｇタンパク質のβγサブユニットの特異性を決定する際のγサブユニットの全体的な役割のために、γサブユニットにおける突然変異は、異常な細胞シグナルを生じ、したがって、異常な細胞性応答を生じる。「サブユニット」としては、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡが挙げられる。したがって、本発明ｃＤＮＡは、ヒトγサブユニットの突然変異形態の検出において診断薬として用いてよい。かかる検出により、突然変異γサブユニット疾患により生じる異常な細胞性応答の診断が可能になるであろう。 γ₂、γ₃、γ₄、γ₅、γ₇、γ₁₀またはγ₁₁サブユニットをコードしているヒト遺伝子において突然変異を担持する個体は、種々の方法によってＤＮＡレベルで検出されてよい。診断のための核酸は、血液、尿、唾液、組織生検および剖検物質などの患者の細胞から得られる。ゲノムＤＮＡは、直接、検出のために用いるか、または、分析前にＰＣＲ（Saikiら，Nature，324: 163-166(1986)）を用いることによって酵素的に増幅させてもよい。ＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた、同様の目的のために用いてよい。例えば、γ₂、γ₃、γ₄、γ₅、γ₇、γ₁₀または γ₁₁サブユニットのいずれかをコードしている核酸に相補的なＰＣＲプライマーを用いて、これらのサブユニットにおける突然変異を同定または分析することができる。例えば、欠失および挿入は、正常な遺伝子型と比較して増幅生産物のサイズの変化によって検出することができる。点突然変異は、増幅ＤＮＡを放射性標識γ₂、γ₃、γ₄、γ₅、γ₇、γ₁₀またはγ₁₁サブユニットＲＮＡまたは放射性標識γ₂、γ₃、γ₄、γ₅、γ₇、γ₁₀またはγ₁₁サブユニットアンチセンスＤＮＡ配列にハイブリダイズさせることによって同定することができる。完全にマッチした配列は、ＲＮａｓｅＡ消化によるかまたは融解温度の差異によって、ミスマッチ二本鎖と区別することができる。参照遺伝子と突然変異を含有する遺伝子との間の配列差異は、直接ＤＮＡ配列決定法によって示されてよい。さらに、クローンＤＮＡセグメントは、特異的ＤＮＡセグメントを検出するためのプローブとして用いてよい。この方法の感度は、ＰＣＲと組み合わせると非常に増強される。例えば、配列決定プライマーは、二本鎖ＰＣＲ生産物または修飾ＰＣＲによって生じた一本鎖鋳型分子と一緒に用いられる。配列決定は、放射性標識ヌクレオチドを用いる慣用的な手段によるかまたは蛍光タグを用いる自動配列決定法によって行われる。ＤＮＡ配列差異に基づく遺伝的試験は、変性剤を用いるかまたは用いないで、ＤＮＡ断片の電気泳動移動度の変化の検出によって行ってよい。小さな配列欠失および挿入は、高解像度ゲル電気泳動によって視覚化することができる。種々の配列のＤＮＡ断片は、種々のＤＮＡ断片の移動度がそれらの特異的な融解または部分融解温度に従って種々の位置でゲルにおいて妨害される変性ホルムアミド勾配ゲル上で区別されてよい（例えば、Myersら，Science，230: 1242（1985）を参照）。特定位置での配列変化は、ＲＮａｓｅおよびＳ１保護または化学的開裂法などのヌクレアーゼ保護アッセイによって示されてよい（例えば、cottonら，PNAS， USA，85: 4397-4401（1985）を参照）。かくして、特異的なＤＮＡ配列の検出は、ハイブリダイゼーション、ＲＮａｓｅ保護、化学的開裂、直接ＤＮＡ配列決定または制限酵素の使用（例えば、制限断片長多型（ＲＦＬＰ））およびゲノムＤＮＡのサザンブロット法などの方法によって行ってよい。より慣用的なゲル−電気泳動およびＤＮＡ配列決定に加えて、突然変異は、in situ分析によって検出することもできる。正常な対照組織試料と比較したこれらのサブユニットの過剰発現が異常な細胞性シグナルを生じることができるので、本発明は、種々の組織におけるγ₂、γ₃ 、γ₄、γ₅、γ₇、γ₁₀またはγ₁₁サブユニットの変化したレベルを検出するための診断アッセイにも関する。宿主由来の試料におけるこれらのサブユニットのレベルの検出のために用いらるアッセイは、当業者によく知られており、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロット分析法および好ましくはＥＬＩＳＡアッセイが挙げられる。ＥＬＩＳＡアッセイは、まず、γ₂、γ₃、 γ₄、γ₅、γ₇、γ₁₀またはγ₁₁サブユニットにたいして特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体を調製することからなる。さらに、該モノクローナル抗体に対してリポータ抗体が調製される。該リポーター抗体に、放射能、蛍光またはこの実施例ではホースラディッシュペルオキシダーゼ酵素などの検出可能な試薬を結合させる。ここで、宿主から試料を取り出し、例えばポリスチレン皿などの固体支持体上でインキュベートし、試料中のタンパク質を結合させる。次いで、ＢＳＡなどの非特異的タンパク質と一緒にインキュベートすることによって、皿上の遊離タンパク質結合部位を回収する。次いで、モノクローナル抗体を該皿でインキュベートすると、その間に、該モノクローナル抗体が、抗体の特異性に依存して、ポリスチレン皿に結合したγ₂、γ₃、γ₄、γ₅、γ₇、γ₁₀またはγ₁ ₁ サブユニットのいずれかに結合する。全ての未結合モノクローナル抗体をバッファーで洗浄する。ホースラディッシュペルオキシダーゼに結合したリポーター抗体を該皿に置くと、リポーター抗体がγ₂、γ₃、γ₄、γ₅、γ₇、γ₁₀または γ₁₁サブユニットのいずれかに結合したモノクローナル抗体に結合する。次いで、未結合リポーター抗体を洗浄す。次いで、該皿にペルオキシダーゼ基質を添加し、所定の時間のうちに発色した色の量は、標準曲線に対して比較すると所定の体積の患者試料のに存在するγ₂、γ₃、γ₄、γ₅、γ₇、γ₁₀またはγ₁₁サブユニットの量の測定値である。 γ₂、γ₃、γ₄、γ₅、γ₇、γ₁₀またはγ₁₁サブユニットに対して特異的な抗体が固体支持体に結合し、標識γ₂、γ₃、γ₄、γ₅、γ₇、γ₁₀またはγ₁₁サブユニットおよび宿主由来の試料を該固体支持体上を通過させ、固体支持体に結合した標識の検出量を試料中のγ₂、γ₃、γ₄、γ₅、γ₇、γ₁₀またはγ₁₁サブユニットの量と比較することができる競合アッセイを用いてよい。本発明の配列は、染色体同定のためにも利用可能である。該配列は、個々のヒト染色体の特定の位置に特異的に標的化されるか、または、該特定の位置とハイブリダイズすることができる。さらにまた、現在、染色体の特定の部位を同定することが必要とされている。実際の配列データ（リピート染色体の多型）に基づくいくつかの染色体マーキング剤は、現在、染色体位置をマークするために利用可能である。本発明の染色体に対するＤＮＡのマッピングは、これらの配列を疾患に関連する遺伝子と相互に関係付ける際の重要な第１段階である。すなわち、ｃＤＮＡからＰＣＲプライマー（好ましくは１５−２５ｂｐ）を調製することによって、配列を染色体上に位置付けることができる。該遺伝子の３ '未翻訳領域のコンピューター分析を用いて、増幅プロセスを複雑にするゲノムＤＮＡにおける１以上のエキソンには及ばないプライマーを迅速に選択する。次いで、これらのプライマーを、個々のヒト染色体を含有する幹細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングのために用いる。該プライマーに対応するヒト遺伝子を含有するこれらのハイブリッドのみが増幅断片を産するであろう。幹細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定のＤＮＡを特定の染色体に割り当てるための迅速な方法である。同一りオリゴヌクレオチドプライマーについて本発明を用いると、下位位置決定は、類似の方法で、特異的な染色体由来の断片のパネルまたは大きなゲノムクローンのプールを用いて行うことができる。同様に染色体上に位置付けるために用いることができる他のマッピングストラテジーとしては、in situハイブリダイゼーション、標識したフロー選別染色体（lab eled flow-sorted chromosome）を用いる予備スクリーニング、および染色体特異的ｃＤＮＡライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによる予備選択が挙げられる。ｃＤＮＡクローンの中期染色体拡散への蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を用いて、１つの段階で正確な染色体位置を提供することができる。この方法は、５００または６００塩基程度の短いｃＤＮＡと一緒に用いることができる；しかしながら、２，０００ｂｐよりも大きなクローンは、単純な検出のために充分なシグナル強度を有する固有の染色体位置に結合するらしい。ＦＩＳＨは、発現した配列ｔａｇ（ＥＳＴ）が誘導されるクローンの使用を必要とし、長ければ長いほど良好である。例えば、２,０００ｂｐは、良好であり、４,０００は、より良好であり、４,０００を超えるものは、たぶん、良好な結果、時間の適度なパーセンテージを得るのに必要ではない。この技術の概観については、Vermaら，“Human Chromosomes: a Manual of Basic Te chniques”，Pergamon Press，New York（1988）を参照。配列を正確な染色体位置にマッピングしたならば、染色体上の配列の物理学的位置を遺伝学的マップのデータと関係づけることができる。かかるデータは、例えば、V.McKusick,"Mendelian Inheritance in Man"（Johnes Hopkins Universi ty Welch Medical Libraryを通じてオンライン利用できる）において見いだされる。次いで、連関分析（物理的に隣接した遺伝子の同時遺伝）により、同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾病との間の相関関係を確認する。次に、罹病個体と未罹病個体との間のｃＤＮＡまたはゲノム配列の相違を決定することが必要である。罹病個体においていくつかまたはすべての変異が見いだされるが、正常個体においては見いだされない場合、変異は疾病の病因である可能性がある。物理的マッピングおよび遺伝学的マッピング法の現在の分離能によれば、疾病関連染色体領域に正確に位置決めされるｃＤＮＡは、５０ないし５００個の潜在的に病因である遺伝子のうちの１つである可能性がある（１メガベースのマッピング分解能であり、２０ｋｂごとに１個の遺伝子があると仮定して）。一般的には、罹病個体と未罹病個体の比較には、まず、染色体スプレッドにより可視化可能な、あるいは当該ｃＤＮＡ配列に基づくＰＣＲを用いて検出可能な欠失または転座のごとき染色体における構造上の変化を探すことが必要である。最終的には、変異の存在を確認し、変異と多型性を区別するためには、いくつかの個体由来の遺伝子の完全な配列決定が必要である。ポリペプチド、それらのフラグメントまたは他の誘導体、またはそれらのアナログ、またはそれらを発現する細胞を免疫原として用いて抗体を得ることができる。これらの抗体は、例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であってよい。また本発明は、キメラ、１本鎖、およびヒト化抗体、ならびにＦａｂフラグメント、またはＦａｂ発現ライブリーの産物を包含する。当該分野で知られた種々の方法を、かかる抗体およびフラグメントの製造に用いてもよい。動物へのポリペプチドの直接注射により、あるいはポリペプチドを動物に、好ましくは非ヒトに投与することにより、本発明配列に対応するポリペプチドに対して生成する抗体を得ることができる。そのようにして得られた抗体は、そのポリペプチド自身に結合するであろう。このようにして、ポリペプチドのフラグメントのみをコードする配列を用いてもとのポリペプチド全体に結合する抗体を得ることさえできる。次いで、かかる抗体を用いて、そのポリペプチドを発現する組織からそのポリペプチドを単離することができる。モノクローナル抗体の調製のために、連続細胞系培養により生成される抗体を得る方法を用いることができる。例として、ハイブリドーマ法（Kohler and Mil stein（1975）256:495-497）、トリオーマ法、ヒト・Ｂ細胞ハイブリドーマ法（ Kozbor et al.Immunology Today(1983)4:72）、ならびにヒト・モノクローナル抗体製造のためのＥＢＶ−ハイブリドーマー法（Cole et al.,1985,"Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy",Alan R.Liss,Inc.,pp.77-96）が挙げられる。１本鎖抗体の製造に関して説明された方法（米国特許第４９４６７７８号）を用いて、本発明免疫原性ポリペプチド生成物に対する１本鎖抗体を製造することができる。また、トランスジェニックマウスを用いて、本発明免疫原性ポリペプチド生成物に対するヒト化抗体を発現させてもよい。 γ₂、γ₃、γ₄、γ₅、γ₇、γ₁₀またはγ₁₁サブユニットをコードしているｃＤＮＡのフラグメントをｃＤＮＡライブラリー用ハイブリダイゼーションプローブとして用いて全長のγ₂、γ₃、γ₄、γ₅、γ₇、γ₁₀またはγ₁₁サブユニット遺伝子を単離し、さらにこれらの遺伝子に対する高い類似性または類似の生物学的活性を有する他の遺伝子を単離してもよい。一般的には、このタイプのプローブは少なくとも２０塩基を有する。しかしながら、好ましくは、プローブは少なくとも３０塩基を有し、一般的には５０塩基を超えないものであるが、それよりも多い塩基を有していてもよい。また、プローブを用いて、全長の転写物に対応するｃＤＮＡクローンならびに調節およびプロモーター領域、エキソンおよびイントロンを含む完全なγ₂、γ₃、γ₄、γ₅、γ₇、γ₁₀またはγ₁₁サブユニット遺伝子を含むゲノムクローンを同定してもよい。スクリーニングの一例は、オリゴヌクレオチドプローブを合成するための既知ＤＮＡ配列を用いることによるγ₂ 、γ₃、γ₄、γ₅、γ₇、γ₁₀またはγ₁₁サブユニット遺伝子のコーディング領域の単離を含む。本発明遺伝子配列に相補的な配列を有する標識オリゴヌクレオチドを用いてヒト・ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングし、ライブラリーのいずれのメンバーがプローブにハイブリダイゼーションするのかを決定する。ヒトの疾病の研究試薬および治療および診断を見いだすための材料として本発明ｃＤＮＡクローンおよびポリペプチドを用いてもよい。本発明は、選択βγリガンドに対する受容体の同定方法を提供する。当業者に知られた多くの方法、例えば、リガンドパンニングおよびＦＡＣＳソーティング（Coligan et al.,"Current Protocols in Immun.",1(2),Chapter 5,(1991)）により、受容体をコードしている遺伝子を同定することができる。好ましくは、選択βγリガンドに応答する細胞からポリアデニル化ＲＮＡを調製する場合には、発現クローニングを用い、このＲＮＡから得られるｃＤＮＡライブラリーをプールに分割し、選択βγリガンドに応答しないＣＯＳ細胞または他の細胞をトランスフェクションする。スライドグラス上で増殖したトランスフェクション細胞を標識βγリガンドに曝露する。ヨウ素化により、または部位特異的蛋白キナーゼの認識部位を含めることにより、選択βγリガンドを標識することができる。固定およびインキュベーション後、スライドグラスをオートラジオグラフィー分析にかける。陽性のプールを同定し、サブプールを調製し、繰り返しサブプーリングおよび再スクリーニングプロセスを用いて再トランスフェクションし、最終的に、推定上の容体をコードしている単一クローンを得る。受容体同定の別のアプローチとして、受容体分子を発現する膜または抽出調製物に標識リガンドを光アフィニティー結合させる。クロスリンク物質をＰＡＧＥにより分離し、Ｘ線フィルムに露出する。リガンドー受容体を含む標識複合体を切り出し、ペプチドフラグメントに分離し、蛋白の微量配列決定にかける。微量配列決定により得られたアミノ酸配列を用いて縮重したオリゴヌクレオチドプローブのセットを設計し、推定上の受容体をコードしている遺伝子を同定する。また本発明は、受容体に対するリガンドの相互作用を促進（アゴニスト）またはブロック（アンタゴニスト）する可能性のある薬剤をスクリーニングする方法を提供する。アゴニストは、特定のリガンドの本来の生物学的機能を増大させる化合物であるが、アンタゴニストは、これらの機能を除去する化合物である。例えば、特定のβγサブユニットに対する受容体を発現する哺乳動物細胞または膜調製物を、試験化合物存在下にて標識リガンドとともにインキュベーションする。この試験化合物が相互作用を促進するアゴニストとして作用する能力、あるいは相互作用をブロックするアンタゴニストとして作用する能力を測定することができる。適当なアッセイ条件下で潜在的アゴニストと特定のβγサブユニットを膜結合βγサブユニット受容体または組み換えβγサブユニット受容体とを結合させる競争的阻害アッセイにより、潜在的アンタゴニストを同定してもよい。当業者はかかる適当なアッセイ条件を日常的に決定することができる。これらのアッセイにおいて、βγサブユニットを標識、好ましくは放射性標識して、受容体に結合したβγサブユニット数から潜在的アンタゴニストの有効性を決定することができる。潜在的アンタゴニストは、抗体、またはいくつかの場合にはβγサブユニットに結合するオリゴペプチドを包含するが、これらに限らない。あるいはまた、潜在的アンタゴニストは、受容体部位に結合するが不活性である、密接に関連した蛋白であり、かくして、受容体部位を占領することによりβγサブユニットの作用を妨害する。もう１つの潜在的アンタゴニストは、アンチセンス法を用いて調製されるアンチセンス構築物である。アンチセンス法を用いて、三重ヘリックス形成またはアンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡによって遺伝子発現を制御することができる（いずれの方法も、ＤＮＡもしくはＲＮＡへのポリヌクレオチドの結合に基づく）。例えば、本発明成熟ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列の５’コーディング領域を用いて、約１０塩基対ないし約４０塩基対の長さのアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計する。転写に関与する遺伝子の領域に相補的であるようにＤＮＡオリゴヌクレオチドを設計し（三重ヘリックス-Lee et al.Nucl.Acids Res.(1979)6:3073;Cooney et al.Science(1988)241 :456およびDervan et al.Science(1991)251:1360参照）、そのことにより、γ₂ 、γ₃、γ₄、γ₅、γ₇、γ₁₀またはγ₁₁サブユニットのいずれかの転写および産生を防止する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドはｍＲＮＡにハイブリダイゼーションし、ｍＲＮＡ分子のγ₂、γ₃、γ₄、γ₅、γ₇、γ₁₀またはγ₁₁サブユニットへの翻訳をブロックする。これらのオリゴヌクレオチドをインビボにおいて細胞に送達してγ₂、γ₃、γ₄、γ₅、γ₇、γ₁₀またはγ₁₁サブユニットの産生を阻害することもできる。以下の限定的でない実施例は本発明をさらに説明するためのものである。実施例実施例１：Ｇタンパク質γサブユニットの単離および分析慣用的操作を用いて組織およびセルラインからポリ（Ａ）⁺ＲＮＡを単離することにより、特異的なヒト組織またはセルライン由来の数種のｃＤＮＡライブラリーを製造した。ｃＤＮＡクローンの部分ヌクレオチド配列を、ｐＢluescript ベクターのＴ７またはＴ３プライマー（Ｓtratagene，Ｌa Ｊolla，ＣＡ）のいずれかを用いることで得た。これを配列決定した結果、数個の発現配列タグ（ＥＳＴ）を得た。ＥＳＴの配列を既知配列の遺伝子と対合させることで、ヒトＧタンパク質γサブユニットファミリーを系統的に分類し、類別した。実施例２：ノーザンブロットハイブリダイゼーション数種のヒト組織（Ｃlontech，Ｐalo Ａlto，ＣＡ）より調製したポリ（Ａ）⁺ ｍＲＮＡ（２μｇ）を含有するノーザンブロットを、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＰＥ（２０ＸＳＳＰＥ＝３ＭＮaＣl、０.２Ｍリン酸ナトリウム、０.０２ＭＥＤＴＡ、ｐＨ７.４）、０.１％ポリビニルピロリドン、０.１％ウシ血清アルブミンおよび２％ドデシル硫酸ナトリウム、ならびに１００μｇ／ｍｌのせん断されたサケ精子ＤＮＡ中、４２℃でハイブリダイゼーションした。そのγ₄ 、γ₁₀およびγ₁₁ｃＤＮＡのフラグメントを、ｐＢluescript ベクター中の対応するｃＤＮＡクローンをＥｃｏＲＩおよびＸｈｏｌ制限酵素で二重消化することにより単離した。プローブを、［³²Ｐ］−ｄＣＴＰ（３０００Ｃｉ／ミリモル、Ａmersham Ｃorp.，Ａrlington Ｈeights，ＩＬ）の存在下、ＤＮＡポリメラーゼ−Ｉのクレノー(Ｋlenow）フラグメントでランダムプライムすることで、精製したフラグメントより得た。ハイブリダイゼーションした後、高ストリンジェンシー洗浄を、６５℃、０.１ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣは０.１５Ｍ塩化ナトリウム、０.０１５Ｍクエン酸ナトリウムである）、０.１％ＳＤＳ中で行った。ブロットを、−８０℃で指示された時間、増強スクリーンに暴露した。実施例３：プラスミドの構築転写および翻訳を目的として、ヒトβ₁、β₂、γ₄、γ₁₀およびγ₁₁のコーディング配列を、対応するｃＤＮＡクローンを適当なオリゴヌクレオチドプライマーでＰＣＲ増幅することにより、ｐＧＥＭ（Ｐromega，Ｍadison，ＷＩ）またはｐＢluescript ベクターのいずれかにサブクローンした。ついで、そのコーディング配列を完全に配列決定し、ＰＣＲ増幅の結果としてエラーが導入されていないことを確認した。β₃サブユニットの場合、ヒトβ₃ｃＤＮＡクローンの１０５０ｂｐフラグメント（Ｌevineら、Ｐroc．Ｎat'l Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ(1990)87 ：2389-2393）をＡｐａＩで切除し、Ｂluescript ＫＳベクターのＡｐａＩ部位にサブクローンした。実施例４：インビトロ転写およびプレニル化分析プラスミドＤＮＡ（１μｇ）を直鎖状とし、γ₂、γ₁₀およびγ₁₁サブユニットの場合はＴ７で、またはγ₄サブユニットＲＮＡポリメラーゼの場合はＴ３で転写した。転写はＲＮＡキャッピングキット（Ｓtratagene，Ｌa Ｊolla，ＣＡ）で得られるプロトコルに従って行った。翻訳を評価するために、２０μＣｉの［³⁵Ｓ］メチオニン（Ａmersham Ｃorp.，Ａrlington Ｈeights，ＩＬ）を用い、５０μｌのＴＮＴ結合ウサギ網状赤血球ライゼート系（Ｐromega，Ｍadison，ＷＩ）の反応体にて、得られたＲＮＡ（４μｇ）を翻訳した。プレニル化を試験するために、５０μＣｉの［³Ｈ］−ファルネシルピロホスフェート（ＦＰＰ）または［³Ｈ］−ゲラニルゲラニルピロホスフェート（ＧＧＰＰ）のいずれかを用いて、冷メチオニンを補足したＴＮＡ結合ウサギ網状赤血球ライゼート系にてＲＮＡを翻訳した。３０℃で２時間翻訳を行った後、１０ｐｌの［³⁵Ｓ］標識翻訳混合物のアリコートまたは２５μｌの［³Ｈ］標識翻訳混合物のアリコートを電気泳動サンプル緩衝液に溶かし、Ｌaemmli、Ｕ.Ｋ．Ｊ.Ｂiol.Ｃhem．（1991）2 66：19867−19870で記載されているように、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した。実施例５：インビトロ翻訳およびトリプシンのタンパク質分解トリプシンのタンパク質分解分析によりβγ相互反応を評価した。βおよびγ サブユニットの各々についてのプラスミドＤＮＡ（１μｇ）をＴＮＴ結合ウサギ網状赤血球ライゼート系（Ｐromega，Ｍadison，ＷＩ）にて共転写および共翻訳した。各γサブユニットについてのプラスミドＤＮＡを直線鎖状にし、高分子量の翻訳産物の生成を制限した。γ₂およびγ₄の両方のサブユニットはこの系にて効果的に翻訳されるが、γ₁₀およびγ₁₁サブユニットは著しく低いレベルで翻訳された。γ₁₀およびγ₁₁サブユニットのレベルを増大させるために、２μｇのキャップＲＮＡを共転写β−γ混合体に加えた。別法として、別々に翻訳したγ₁₀ およびγ₁₁サブユニットを共転写β−γ混合体に添加した。トリプシン消化のため、２０μｌの最終容量（５０ｍＭＮａ−ＨＥＰＥＳを含む、ｐＨ８.０）中、１μｌのトリプシン（１μｇ）を添加することで、５または１０μｌの共翻訳β −γ混合体のアリコートを消化した。３０℃で１時間インキュベートした後、Ｌ aemmliサンプル緩衝液を添加し、３分間煮沸することで消化を停止させた。サンプルを１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に泳動させることで、βサブユニットの防御フラグメントを視覚化した。電気泳動に付した後、ゲルを４０％メタノール／１０％酢酸の混合液中に固定し、ＥＮＨＡＮＣＥ（ＤuＰont−ＮＥＮ，Ｂoston ，ＭＡ）に浸漬し、乾燥させた。その乾燥ゲルを、−８０℃で８ないし４８時間、暴露した。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION CDNA clone encoding human G-protein γ subunit Background of the Invention Intracellular transmission of extracellular signals binds various receptors and effectors Guanine nucleotide, called G protein, which produces an appropriate cellular response Most commonly, it is mediated by a binding protein. G protein-coupled receptors are From mons, neurotransmitters and chemoattractants, sensory stimuli like light, smell and taste (Kunapuli et al., J.B.) iol. Chem. (1994)269(14): 10209-10212). G-proteins include α, β and γ sub It is a heterotrimer composed of units. Depending on the binding to the appropriate ligand , The receptor stimulates the exchange of bound GDP for GTP at the α subunit, This results in dissociation of the subunit from the β and γ subunits. GTP-bound α Subunits have been shown to directly regulate the activity of downstream effectors (Gilman, A.G., Ann. Rev. Biochem. (1987)56: 615-649; Simon et al., Scien ce (1991)252: 802-808; Birnbaumer, L .; Cell, (1992)71: 1069-1072). Gilman After dissociation of the GTP-linked α subunit, the βγ subunit It was shown to exist as a completely associated complex. This complex is adenyl Cyclase subtypes II and IV, phospholipase A2, phospholipase C Subtype β1,2,3 and K⁺And Ca²⁺Downstream effect containing channels Have been shown to modulate the activity of specific subsets of proteins (Tang, W.J. And Gilman, A.G., Science (1991)254: 1500-1503; Wickman et al., Nature (199 Four)368: 254-257; Clapham, D.E. and Neer, E.J., Nature (1993)365: 403-406) . Thus, the G protein α and βγ subunits Produces a signal that regulates bifurcated function. In addition, the βγ subunit Can be combined with Putter (Phillips, W.J. and Cerioe, R.A., J. Biol. Chem. (1992)twenty four: 17032-17039), β-adrenaline (β-ARK) key Agonist dependence by interacting and recruiting the enzyme directly to the membrane It can increase phosphorylation and desensitization (Haga, K. and Haga, T .; , J. et al. Biol. Chem. (1992)267: 2222-2227; Pitcher et al., Science (1992) 257: 1 264-1267). That is, the βγ subunit regulates and regulates these effectors. And recognition of both receptors. Both the G protein β and γ subunits belong to a large multigene family. This To date, five distinct mammalian β subunits (β₁−β_FiveComplete code) A unique cDNA was identified (Watson et al., J. Biol. Chem. (1994).269: 22150-22 156). A recently identified rat heart cDNA is human β_Three96% of subunits May encode the sixth β subunit of identity (Ray, K. and Robishaw, J.D., Gene (1994)149: 337-340). At the amino acid level, the β subunit is highly conserved It is a target. In contrast, the γ subunit is more divergent. That is, the γ subunit Is thought to determine the functional specificity of the βγ subunit complex. Five Complete cDNAs representing different γ subunits have been reported, and γ₁Sa Buunit (Hurley et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, (1984)81: 6948- 6952), γ from bovine brain_Two, Γ_ThreeAnd γ₇(Robishaw et al., J. Biol. Chem., (1989)264: 15758-15761; Gautam et al., Science (1989)244: 971-974; Gautam e t al., Proc. Not'l. Acad. Sci. USA, (1990)87: 7973-7977; Cali et al., J. Am. B iol. Chem., (1992)267: 24023-24027) and γ from bovine and rat liver_FiveBut( Fisher, K and Aronson, N.N., Mol. Cell Biol., (1992) 12: 1585-1591) Isolation Have been. Estimated γ_FourThe presence of subunits has also been reported in mouse kidney and retina. PCR fragments have been isolated (Gautam et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, (1990)87: 7973-7977). In the present invention, human γ_Two, Γ_Three, Γ_Four, Γ_Five, Γ₇, Γ_TenAnd γ₁₁Sub-uni A cDNA clone encoding the kit was isolated and characterized. Summary of the Invention According to one aspect of the present invention, mRNA, DNA, genomic DNA and the same Analogues thereof and biologically active, diagnostically or therapeutically useful fragments Human γ including_Two, Γ_Three, Γ_Four, Γ_Five, Γ₇, Γ_TenAnd γ₁₁Subunit An isolated nucleic acid molecule to be loaded is provided. According to another aspect of the present invention, γ_Two, Γ_Three, Γ_Four, Γ_Five, Γ₇, Γ_TenAnd γ₁₁sub Units and their biologically active, diagnostically or therapeutically useful Provided are polypeptides that are fragments, analogs and derivatives. The present invention Ripeptides are of human origin. In a further aspect of the invention, there are provided antibodies against such polypeptides. It is. In a further aspect of the invention, γ_Two, Γ_Three, Γ_Four, Γ_Five, Γ₇, Γ_TenOr γ₁ ₁ Recombinant prokaryotic and / or eukaryotic host containing any of the subunit human nucleic acid sequences The main cells are cultured under conditions that promote expression of the polypeptide, and then the A method for producing such a polypeptide comprising recovering the polypeptide is provided. It is. In a further aspect of the invention, a human γ_Two, Γ_Three, Γ_Four, Γ_Five, Γ₇, Γ_TenAnd And γ₁₁A nucleic acid segment of sufficient length to specifically hybridize to the subunit sequence Also provided is a nucleic acid probe comprising a child. These and other aspects of the invention will be apparent to those skilled in the art from the teachings herein. U. Detailed description of the invention Adenyl cyclase subtypes II and IV of G protein βγ dimer, Spholipase A2, phospholipase C subtype β1,2,3 and K⁺and Ca²⁺Regulation and activity of a specific subset of downstream effectors, including channels And their role in receptor recognition are important for the identification and characterization of these proteins Sex is increasing. The functional specificity of these dimers depends on the γ subunit. Tsu It is considered to be determined. A striking difference between the retina and the βγ subunit of the brain From the point of view of the meeting (Lee et al., J. Biol. Chem., (1992)267: 24776-24781), G From the viewpoint of the interaction between the protein α subunit and the receptor (Fawzi et al., J . Biol. Chem., (1991)266: 12194-12200), from the viewpoint of receptor kinase (Pi tcher et al., Science (1992)257: 1264-1267) and from the effector's point of view ( Iniguez-Llihi et al. Biol. Chem., (1992) 32: 23409-23410) You. Retinal and brain βγ subunits share a common β₁Because they share subunits , These differences appear to be due to their unique γ subunit. In the present invention, seven human cDNA clones encoding the γ subunit Was identified. Based on the identity at the amino acid level, these seven cDNA clones Four of which are human γ_Two, Γ_Three, Γ_FiveAnd γ₇It was determined to represent a subunit. γ_Two, Γ_Three, Γ_FiveAnd γ₇Determine the nucleotide sequence of the subunit clone, Provided as numbers 20, 21, 22 and 23. The remaining three cDNA clones Does not appear to be associated with any known γ subunit. These three Amino acid differences are distributed throughout the protein; Was not caused by another splicing of. These three cds One predicted amino acid sequence of the NA clone is the predicted mouse γ_FourSubunit (Gauta m et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, (1990)87: 7973-7977) Showed significant identity (97%). Therefore, this subunit To γ_FourNamed subunit. Replace the other two cDNA clones with γ_Tenand γ₁₁Named subunit. γ_Four, Γ_TenAnd γ₁₁Completion of subunit clone The complete nucleotide sequence was determined and provided as SEQ ID NOs: 9, 10 and 11, respectively. γ_Four, Γ_TenAnd γ₁₁The subunit cDNA clone was obtained on May 4, 1995. As ATCC accession numbers 97140, 97138 and 97139, respectively. Deposited. γ_Two, Γ_Three, Γ_FiveAnd γ₇Mixture of subunit cDNA clones Was deposited on May 4, 1995 as ATCC accession number 97137. Mixed The coding region for each of these cDNAs in the mix uses the following primer pairs: It can be obtained by PCR amplification. γ_TwoFor subunits, Is 5'-CTATCCAGCACTCCGATGGC-3 '(SEQ ID NO: 12). ), And the antisense primer is 5'-AGACTTAAAGGATGGGC ACAG-3 '(SEQ ID NO: 13). γ_ThreeFor subunits, The primer was 5'-TGTGGGCTTCAGGATGAAAAGG-3 '(SEQ ID NO: No. 14), and the antisense primer is 5'-GAGCTCAGAGGAG AGCACAG-3 '(SEQ ID NO: 15). γ_FiveSub-unit Primer is 5'-GTGCACCCATGTCTGGCTCCT-3 '( SEQ ID NO: 16), and the antisense primer is 5'-CACTGGATAC ATAAGGAGTGG-3 '(SEQ ID NO: 17). γ₇Subunit And the sense primer is 5'-GATGGCGACAATGTCAGCC -3 '(SEQ ID NO: 18) and the antisense primer is 5'-AGTTA TAAAATAATACAAAGG-3 '(SEQ ID NO: 19). γ_FourThe subunit cDNA is 689 bp long, 98 and 36, respectively. Contains 5 bp of 5'- and 3'-untranslated (UTR) sequences (SEQ ID NO: 9). position The first ATG codon at 99 has the characteristics of a translation initiation codon, with positions -3 and +4 Has the expected purine. The second ATG codon at position 111 has the expected purine Lacking, unlikely start codon. The polyadenine sequence is the 3'-end of the cDNA Observed nearby. γ_TenThe subunit cDNA is 1213 bp in length, 23 and 9 respectively. Contains 86 bp of 5'- and 3'-UTR sequences (SEQ ID NO: 10). Long 3'- The UTR is a poly (A) tail, a polyadenylation signal towards the 3'-end. A (T) related to the stability of mRNA and mRNA_nIt has an A motif. γ₁₁The subunit cDNA is 654 bp in length, 106 and 3 respectively. It contains a 26 bp 5'- and 3'-UTR sequence (SEQ ID NO: 11). 3'-UT R is the polyadenylation signal and the poly (A) tail towards the 3'-end Having. The invention further relates to the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2, 3, 4, 5, 6, 7 and 8. Or a human γ_Two, Γ_Three, Γ_Four, Γ_Five, Γ₇, Γ_TenOr γ₁₁Sa Polypeptide encoded by cDNA clone of buunit and its polypeptide Such polypeptide fragments, analogs and derivatives. γ_Twosub The deduced amino acid sequence of the unit cDNA is SEQ ID NO: 2. γ_ThreeSubunit The deduced amino acid sequence of the cDNA of is SEQ ID NO: 3. γ_FourSubunit cDN The deduced amino acid sequence of A is SEQ ID NO: 4. γ_FiveEstimation of subunit cDNA The amino acid sequence is SEQ ID NO: 5. γ₇Deduced amino acids of subunit cDNA The sequence is SEQ ID NO: 6. γ_TenThe predicted amino acid sequence of the subunit cDNA is Column number seven. γ₁₁The deduced amino acid sequence of the subunit cDNA is SEQ ID NO: 8. It is. γ_Four, Γ_TenAnd γ₁₁Predicted to be encoded by subunit cDNA Protein sequence and γ₁(SEQ ID NO: 1), γ_Two, Γ_Three, Γ_FiveAnd γ₇Subunit Comparison with the homolog of showed significant homology. γ_FourFor subunits, Homosexuality is as low as γ₁From 38% for subunits, as high as γ_TwoTo subunit Over a range of up to 77%. γ_TenFor subunits, homology is low Or γ_FourFrom 35% on subunits, as high as γ_Two, Γ_FiveAnd γ₇Sub-unit Over 53% of the total. This relatively low level of homology_Ten Subunit replaces new subclass with only distant relationships to other γ subunits Suggest that it can be represented. γ₁₁For subunits, the homology is as low as γ_Two , Γ_Three, Γ_FiveAnd γ₇From 33-44% for subunits, as high as γ₁sub It ranged up to 76% of units. Analysis of amino acid sequence conversion revealed that the γ subunit family₁And γ₁₁Sub-unit The first class, including gamma_Two, Γ_Three, Γ_FourAnd γ₇Second class including subunits , Γ_FiveThird class including subunits and γ_Ten4th including subunit It suggests that it can be classified into four separate subclasses of the class. These services Buclase is based not only on homology, but also on functional similarity. That is, one sub Members within the class include similar post-translational modifications, the β and α subunits of the G protein. Shows the same ability to interact with For example, γ constituting one subclass₁and γ₁₁The subunit is modified with a farnesyl group and β_TwoInteraction with subunit Not used, α₀Does not interact with subunits. Unlike this, another service Γ that constitutes the class_Two, Γ_Three, Γ_FourAnd γ₇The subunit is geranylgeranyl Modified with a group, β_TwoInteracts with subunits and, at least to some extent, α₀Sabyu Interacts with knits. The polypeptide encoded by the polypeptide shown in the sequence listing or the deposited cDNA When referring to peptides, “fragments”, “derivatives” and “analogs (classes) The term "analog") has substantially the same biological function as such a polypeptide. Polypeptide. Analogs are activated by cleavage of the proprotein part. And proproteins capable of producing active mature (mature) polypeptides. The polypeptide of the present invention can be a recombinant polypeptide, a natural polypeptide or a synthetic polypeptide. It may be a synthetic polypeptide, preferably a recombinant polypeptide. The polypeptide encoded by the polypeptide shown in the sequence listing or the deposited cDNA A fragment, derivative or analog of the peptide may comprise (i) one or more The amino acid residue is a conserved or non-conserved amino acid residue (preferably a conserved amino acid residue) Have been substituted, such substituted amino acid residues are encoded by the genetic code. Or uncoded, or (ii) one or more Wherein the amino acid residue of (c) includes a substituent, or (iii) Compounds in which the peptide increases the half-life of another compound, e.g., a polypeptide. (Eg, polyethylene glycol), or ( iv) a leader or secretory sequence or a mature polypeptide or pro Another amino acid, such as a sequence used for protein purification, is a mature polypeptide. It may be a fusion. Such fragments, derivatives and analogs It is deemed to be within the scope of those skilled in the art from the teachings herein. The polypeptides and polynucleotides of the present invention are preferably in isolated form Provided and preferably purified to homogeneity. The term “isolated” refers to a substance in its original environment (eg, where it occurs in nature). Means taken out of the natural environment). For example, naturally occurring organisms Polynucleotide or polypeptide has not been isolated, but is The same polynucleotide or polynucleotide separated from some or all of the coexisting materials The peptide has been isolated. Such a polynucleotide is part of a vector. And / or such polynucleotides or polypeptides may be Such a vector or composition may be part of its natural environment. If not, it is still isolated. The present invention also relates to a vector containing the cDNA clone of the present invention, a vector of the present invention. Cells of the present invention genetically engineered using The production of cadmium. A host cell can be, for example, a cloning vector or an expression vector. Genetic manipulation (transduction or transformation or trans Infection). Vectors include, for example, plasmids, viral particles, Page or the like. The genetically engineered host cell is Appropriately modified for sexual transformation, selection of transformants or amplification of γ subunit gene Can be cultured in a normal nutrient medium. Culture conditions such as temperature and pH Is already used for the selected host cell and will be obvious to those skilled in the art. . The cDNA clone of the present invention is used for producing a polypeptide by recombinant technology. It is. That is, for example, cDNA clones can be used to express various polypeptides. In any of the expression vectors. Such vectors are chromosomal, unstained Body and synthetic DNA sequences, eg, derivatives of SV40; bacterial plasmids; Baculovirus; yeast plasmid; plasmid and phage DN A, vaccinia virus, adenovirus, poultry poxvirus, and pseudomadness Includes vectors derived from combinations of viral DNAs such as canine diseases. But the inn Other vectors may be used as long as they are replicable in nature and can survive. An appropriate clone can be inserted into a vector by various operations. General Alternatively, the cDNA sequence may be prepared by appropriate procedures known in the art. Inserted into the site. Such and other operations are within the purview of those skilled in the art. it is conceivable that. The cDNA sequence in the expression vector is manipulated with an appropriate expression control sequence (promoter). Operably linked to perform mRNA synthesis. Representative examples of such promoters The LTR or SV40 promoter, E. coli lac or Is trp, phage lambda P_LPromoters and prokaryotic or eukaryotic cells or their Other promoters known to regulate gene expression in these viruses Tar. The expression vector also contains a ribosome binding site for translation initiation and Includes transcription terminator. Vectors also include sequences suitable for amplifying expression. In addition, the expression vector is preferably dihydrofolate-reduced for eukaryotic cell culture. Original enzyme or neomycin resistance or tetracycline in E. coli Or phenotypic features for selection of transformed host cells, such as ampicillin resistance. It has one or more selectable marker genes to render it gender. A suitable cDNA sequence as described above, and a suitable promoter or regulatory sequence The appropriate host is transformed using the vector having the host, and the host expresses the protein. be able to. Representative examples of suitable hosts include E. coli, Streptomyces Bacterial cells such as Salmonella typhimurium; Fungal cells such as mother cells; Drosophila S2 and Insect cells such as Spodoptera Sf9 cells; CHO, COS or Bowes black Animal cells such as tumor cells; adenoviruses; and plant cells. Appropriate Selection of a host is considered to be within the skill of the art in light of the teachings herein. More specifically, the invention relates to one or more of the foregoing, as broadly described. Also encompasses recombinant constructs comprising the above sequences. Constructs are those wherein the sequence of the invention is forward or reverse. Vector, such as a plasmid or viral vector, inserted into it in the orientation Have In a preferred embodiment of the invention, the construct further comprises, for example, A regulatory sequence comprising a promoter operably linked to the array. Multiple fit Various vectors and promoters are known in the art and are commercially available. You. The following vectors are provided for illustration. Bacterial: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pBS, pD10, phage script, psiX1 74, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16a , PNH18A, pNH46A (Stratagene); ptrc99a, pKK22 3-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia). Eukaryotic Vesicle: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Strage ne) pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia). But other Plasmids or vectors can also be used if they are replicable and viable in the host. it can. Prokaryotic cells also contain complete mammalian transcription units and selectable markers It can be inserted into a plasmid. Then, the obtained vector is a cultured mammalian cell. Amplified before transfection. Examples of this type of vector include p TK2, pHyg and pRSVneo are included. The promoter region is CAT (chloramphenicol transferase) vector Or any other vector that has a selectable marker. You can also select from genes. Two suitable vectors are pKK232-8 and pC232 M7. Bacterial promoters to be particularly exemplified include lacI, lacZ, T3. , T7, gpt, lambda P_R, P_LAnd trp. Eukaryotic cell promotion CMV immediate, HSV thymidine kinase, early and late SV40, LTRs from Torovirus and mouse metallothionein-I are included. Selection of the appropriate vector and promoter is within the level of ordinary skill in the art. In yet another embodiment, the invention relates to a host cell comprising the above construction. Host Cells can be higher eukaryotic cells, such as mammalian cells, or lower eukaryotic cells, such as yeast cells. The superior eukaryotic or host cells may be prokaryotic cells such as bacterial cells. Structure The introduction of the structure into the host cells was performed by calcium phosphate transfection, DEAE. -Dextran-mediated transfection, polybrene, protoplast fusion, Liposomes, direct microinjection into the nucleus, scraping, Or electroporation. The constructs in the host cells are used in a standard manner to Gene products can be produced. Alternatively, the polypeptides of the present invention It can be produced by synthesis using a peptide synthesizer. Mature proteins are suitable for use in mammalian cells, yeast, bacteria, or other cells. It can be expressed under the control of a promoter. Using cell-free translation systems, in vitro and Both in vivo and in vivo, this is achieved using RNA from the DNA constructs of the present invention. Protein can be produced. Suitable for prokaryotic and eukaryotic hosts Novel cooling and expression vectors are described in Sambrook et al., Molecular Cloning: ALabora. tory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) Is incorporated herein by reference. Transcription of a DNA encoding the polypeptide of the present invention by higher eukaryotic cells is Enhancer sequence by inserting it into a vector. Enhancer is DN A cis-acting element, usually about 10 to 300 bp, acting on the promoter To increase its transcription. As an example, the replication start point bp100 SV40 enhancer at the back of the chair 270, cytomegalovirus early promoter Ter enhancer, polyoma enhancer behind the replication origin, and adeno Virus enhancers. In general, recombinant expression vectors provide an origin of replication and transformation of host cells. Selectable markers such as the E. coli ampicillin resistance gene and S. cerevisiae TRP1 gene, as well as highly expressed And directs the transcription of downstream structural sequences. this Such promoters include, among others, 3-phosphoglycerate kinase (PGK) Glycolytic enzymes such as, α-factor, acid phosphatase, or heat shock protein Can be derived from the operon that encodes A heterologous structural sequence is And termination sequences, preferably in the periplasmic space or extracellularly of the translated protein Assembled in a suitable phase with a leader sequence capable of directing secretion into the medium I can Optionally, a heterologous arrangement imparts desired properties, e.g., For example, N-terminal identification resulting in stabilization or simplified purification of expressed recombinant products A fusion protein including a peptide can be encoded. Useful expression vectors for bacteria are structural DNA sequences encoding the desired protein. Having a functional promoter with appropriate translation initiation and termination signals It is constructed by inserting into possible reading phases. Vector is vector One or more to ensure maintenance of the strain and, if desired, to effect amplification in the host. Includes additional phenotypic selectable markers and origins of replication. Prokaryotic lodge suitable for transformation Lord E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella Typhimurium and various Pseudomonas, Streptomyces / Species included in the genus Philococcus, but other species may be selected and used. No. In addition, a complete mammalian transcription unit and a selectable marker are Can be inserted into Smid. The resulting vector is then transfected into cultured mammalian cells. Amplify in bacteria before sfecting. As a representative but non-limiting example, expression vectors useful for bacteria may be selected from Markers and the well-known cloning vector pBR322 (ATCC37 017) containing the bacterial origin of replication from a commercially available plasmid containing the genetic element. Can be taken. Such commercially available vectors are, for example, pKK223-3 (Fuki Armasia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) and GEM1 (Promega Biotech, Madison, Wyoming, USA). these The pBR322 “backbone” section of the plasmid is compatible with the appropriate promoter and expression construct. Combined with the structural arrangement. After transformation of an appropriate host strain and propagation of the host strain to an appropriate cell density, The selected promoter can be replaced by appropriate means (eg, temperature shift or chemical induction). More induced and the cells are cultured for an additional period. Cells are typically harvested by centrifugation and disrupted by physical or chemical means And save the resulting crude extract for further purification. The microbial cells used for protein expression are frozen-thaw cycles, sonication, mechanical Disruption, or disruption by any convenient method, including cell lysing agents, Various methods are well known to those skilled in the art. Various mammalian cell culture systems can also be used for recombinant protein expression. Nursing Examples of milk expression systems include COS and other cells capable of expressing compatible vectors. Lines, eg C127, 3T3, CHO, HeLa and BHK cell lines Is mentioned. Mammalian expression vectors contain an origin of replication, an appropriate promoter and And enhancers, and any necessary ribosome binding sites, polyadenyl Site, splice donor and acceptor sites, transcription termination sequence, and 5 ' It has a flanking non-transcribed sequence. A DNA sequence derived from the SV40 splice, And using the polyadenylation site to obtain the desired non-transcribed genetic element. Large quantities of protein can be obtained from cell lines that have amplified copies of the gene of interest Can be. In this method, the gene is a DNA of a DNA having a selectable marker. Attached to a segment and transfected into cells, or Be transfected. Next, the sub-clause whose gene copy number was greatly amplified Select the Inn. There are a variety of selectable markers available in the art. example For example, the dhfr gene is often used for co-amplification. Methotrexate progressively After months of growth at increasing concentrations, up to 1000 copies of the dhfr gene Obtain a cell line with The polypeptides of the present invention can be prepared by ammonium sulfate or ethanol precipitation, acid extraction, Nion or cation exchange chromatography, phosphocellulose chromatography Fee, hydrophobic interaction chromatography, affinity chromatography -, Hydroxylapatite chromatography and lectin chromatography Can be recovered and purified from recombinant cells. Mature protein In completing the quality structure, a protein regeneration step can be used if necessary. Finally, high performance liquid chromatography (HPLC) is used as the final purification step Can be The polypeptide of the present invention may be a naturally purified product or a product of a chemical synthesis method. Or a prokaryotic or eukaryotic host (eg, bacteria, yeast, higher plants, insects in a medium) And mammalian cells) by recombinant techniques. Recombinant production method Depending on the host used, the polypeptides of the invention may be glycosylated or May not be glycosylated. The polypeptides of the present invention may also Amino acid residues. There are significant differences in the tissue distribution of members of the gamma subunit family. γ₁. γ_Two, Γ_Three And γ_FourSome members, such as subunits, are limited to only a few organizations Γ_Five, Γ₇, Γ_TenAnd γ₁₁Other configurations such as subunits Members are expressed in a wide range of tissues (Cali et al., J. Biol. Chem., (1992)267: 240 23-24027). In addition, most cell types in tissues have gamma subunits. There is only a subset of species (Peng et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, (1992)89: 10882-108856; Hansen et al., J. Am. Mol. Cell Cardiol., (1995)27: 47 1-484). Such differences in distribution can be attributed to α, β, γ Is important in the number of combinatorial associations Conceivable. Subcellular localization of various γ subunits has also been reported (Hansen et al., J. Cell Biol., (1994)126: 811-819). Results of selective interaction between previously identified different β and γ subunits Formation of different βγ dimers as It is thought to give. Known βγ interactions are summarized in Table 1. In Table 1, + indicates βγ dimer-forming ability, − indicates βγ-dimer inability, ND means not measured. As shown in Table 1, γ_Two, Γ_Three, Γ_FiveAnd γ₇Sabyu Same as knit (Schmidt et al., J. Biol. Chem., (1992)267: 13807-13810; Pro nin, A.N. and Gautam, N., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, (1992)89: 6220-622 4; Iniguez-Lluhi et al. Biol. Chem., (1992)32: 23409-23410; Ueda et al., J. Amer. Biol. Chem., (1994)269: 4388-4395), γ_FourAnd γ_TenSubunit Is β₁And β_TwoCan interact with subunits, but β_ThreeSubunit I can not do such a thing. Unlike this, γ₁₁Subunits are more gamma₁With subunit (Schmidt et al., J. Biol. Chem., (1992)267: 13807-13810; Pro nin, A.N. and Gautam, N., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, (1992)89: 6220-62 24), these are both β₁Interacts with subunits, but β_TwoAnd β_ThreeSub-uni Does not interact with the G-proteins and their binding receptors are hormones, neurotransmitters and compounds Extensive cell sigs ranging from attractants to sensory stimuli such as light, smell and taste Was related to Naru. Kunapuli et al. Biol. Chem. (1994) 269 (14): 10209-10 212. Gamma subunit in determining the specificity of G protein βγ subunit Due to the overall role of the mutation in the γ subunit, abnormal cell signaling Produces a null, and thus an abnormal cellular response. As a "subunit" Include mRNA, DNA, cDNA and genomic DNA. Therefore, the cDNA of the present invention is useful for detecting a mutant form of the human γ subunit. May be used as a diagnostic agent. Such detection allows the mutant γ subunit disease The diagnosis of abnormal cellular responses caused by the disease will be possible. γ_Two, Γ_Three, Γ_Four, Γ_Five, Γ₇, Γ_TenOr γ₁₁A subunit encoding Individuals carrying mutations in the gene can be expressed at the DNA level by various methods. May be detected. Nucleic acids for diagnosis include blood, urine, saliva, tissue biopsy and autopsy Obtained from a patient's cells, such as a substance. Genomic DNA is used directly for detection Or use PCR (Saiki et al., Nature, 324: 163-166 (1986)) prior to analysis. May be enzymatically amplified. RNA or cDNA also May be used for various purposes. For example, γ_Two, Γ_Three, Γ_Four, Γ_Five, Γ₇, Γ_TenOr γ₁₁PCR primers complementary to nucleic acids encoding any of the subunits Can be used to identify or analyze mutations in these subunits. it can. For example, deletions and insertions may reduce the size of the amplified product as compared to the normal genotype. It can be detected by the change in noise. Point mutations cause amplified DNA to become radioactive Label γ_Two, Γ_Three, Γ_Four, Γ_Five, Γ₇, Γ_TenOr γ₁₁Subunit RNA or radiation Sex label γ_Two, Γ_Three, Γ_Four, Γ_Five, Γ₇, Γ_TenOr γ₁₁Subunit antisense D It can be identified by hybridizing to the NA sequence. Completely The sequence that was checked was due to RNase A digestion or due to differences in melting temperatures. It can be distinguished from mismatched duplex. Sequence differences between the reference gene and the gene containing the mutation It may be indicated by a decision method. In addition, the cloned DNA segment contains a specific D It may be used as a probe for detecting the NA segment. The sensitivity of this method is , When combined with PCR. For example, the sequencing primer For use with double-stranded PCR products or single-stranded template molecules generated by modified PCR Can be. Is sequencing by conventional means using radiolabeled nucleotides? Alternatively, it is performed by an automatic sequencing method using a fluorescent tag. Genetic testing based on DNA sequence differences, with or without denaturing agents, This may be performed by detecting a change in electrophoretic mobility of a DNA fragment. Small sequence deletion And insertions can be visualized by high resolution gel electrophoresis. Various The DNA fragments of the sequence are characterized by the mobility of the various DNA fragments due to their specific melting or Denatured formamide gradient hindered in gels at various locations according to partial melting temperature (See, eg, Myers et al., Science, 230: 1242 (1985). reference). Sequence changes at specific positions may include RNase and S1 protection or chemical cleavage methods (E.g., cotton et al., PNAS, USA, 85: 4397-4401 (1985)). Thus, the detection of a specific DNA sequence can be achieved by hybridization, RNase protection, chemical cleavage, direct DNA sequencing or use of restriction enzymes (eg, For example, restriction fragment length polymorphism (RFLP)) and Southern blotting of genomic DNA It may be performed by the method described above. In addition to more conventional gel-electrophoresis and DNA sequencing, the mutation It can also be detected by in situ analysis. Cells with abnormal expression of these subunits compared to normal control tissue samples The present invention is capable of producing γ signals in various tissues._Two, Γ_Three , Γ_Four, Γ_Five, Γ₇, Γ_TenOr γ₁₁To detect altered levels of subunits It also relates to diagnostic assays. Of these subunits in host-derived samples Assays used for detection of levels are well known to those of skill Immunoassays, competitive binding assays, western blot analysis and preferably Include an ELISA assay. The ELISA assay first proceeds with γ_Two, Γ_Three, γ_Four, Γ_Five, Γ₇, Γ_TenOr γ₁₁Antibody specific for subunit, preferred Or preparing a monoclonal antibody. Further, the monoclonal antibody A reporter antibody is prepared for the body. Radioactivity, fluorescence or In this example, a detectable sample such as horseradish peroxidase enzyme is used. Combine the drugs. Here, remove the sample from the host, for example, a polystyrene dish To allow the proteins in the sample to bind. Then By incubating with a non-specific protein such as BSA Collect the free protein binding sites on the dish. Then, the monoclonal antibody was added to the dish. In the meantime, the monoclonal antibody reacts to the specificity of the antibody. Depending on the gamma bound to the polystyrene dish_Two, Γ_Three, Γ_Four, Γ_Five, Γ₇, Γ_TenOr γ₁ ₁ Binds to any of the subunits. Back up all unbound monoclonal antibodies. Wash with fur. Reporter conjugated to horseradish peroxidase When the antibody is placed on the dish, the reporter antibody_Two, Γ_Three, Γ_Four, Γ_Five, Γ₇, Γ_TenOr γ₁₁Binds to a monoclonal antibody bound to any of the subunits. Then Wash unbound reporter antibody. Then add peroxidase substrate to the dish However, the amount of color developed within a predetermined time is a predetermined amount when compared with a standard curve. Γ present in the volume of the patient sample_Two, Γ_Three, Γ_Four, Γ_Five, Γ₇, Γ_TenOr γ₁₁Sabyu It is a measure of the amount of knit. γ_Two, Γ_Three, Γ_Four, Γ_Five, Γ₇, Γ_TenOr γ₁₁Specific anti-subunit The body is bound to a solid support and labeled γ_Two, Γ_Three, Γ_Four, Γ_Five, Γ₇, Γ_TenOr γ₁₁sub A unit and a sample from the host are passed over the solid support and bound to the solid support The detected amount of the labeled_Two, Γ_Three, Γ_Four, Γ_Five, Γ₇, Γ_TenOr γ₁₁Sabyu A competition assay that can be compared to the amount of knit may be used. The sequences of the present invention can also be used for chromosome identification. The sequence is Is specifically targeted to a particular location on the chromosome, or Can be bridged. Furthermore, it is now possible to identify specific sites on chromosomes. Is required. Based on actual sequence data (repeat chromosome polymorphisms) A few chromosome marking agents are currently used to mark chromosome locations It is possible. The mapping of DNA to chromosomes of the present invention translates these sequences into This is an important first step in correlating genes associated with the disease. That is, PCR primers (preferably 15-25 bp) are prepared from cDNA. Production allows the sequence to be located on the chromosome. 3 of the gene '' Genome complicates the amplification process using computer analysis of untranslated regions Quickly select primers that fall short of one or more exons in the DNA. Next Now, these primers can be used for stem cell hybrids containing individual human chromosomes. Used for PCR screening. A human gene corresponding to the primer Only those hybrids that contain will yield an amplified fragment. PCR mapping of stem cell hybrids assigns specific DNA to specific chromosomes. It is a quick way to assign. For the same oligonucleotide primer Using the present invention, sublocalization is performed in a similar manner by specific chromosome-derived breaks. This can be done with a panel of pieces or a pool of large genomic clones. same Mapping strategies that can be used to map on chromosomes Examples include in situ hybridization, labeled flow-selected chromosomes (lab Preliminary screening using eled flow-sorted chromosome) Preparing by hybridization to construct a heterogeneous cDNA library Choice. Fluorescence in situ hives to metaphase chromosomal spread of cDNA clones Provides accurate chromosome location in one step using residation (FISH) can do. This method is used for cDNAs as short as 500 or 600 bases. Can be used together; however, cracks larger than 2,000 bp The loan is located at a unique chromosomal location with sufficient signal strength for simple detection. It seems to be combined. FISH is a clone in which the expressed sequence tag (EST) is induced. Require the use of a needle, the longer the better. For example, 2,000 bp Is good, 4,000 is better, and more than 4,000 Perhaps good results are not necessary to get a reasonable percentage of time. this For an overview of the technology, see Verma et al., “Human Chromosomes: a Manual of Basic Te chniques ", Pergamon Press, New York (1988). Once a sequence has been mapped to a precise chromosomal location, the physical The location can be related to the genetic map data. Such data is For example, V. McKusick, "Mendelian Inheritance in Man" (Johnes Hopkins Universi (available online through ty Welch Medical Library) You. Then, the same staining is performed by association analysis (simultaneous inheritance of physically adjacent genes). The correlation between the gene mapped to the body region and the disease is confirmed. Next, the differences in the cDNA or genomic sequence between affected and unaffected individuals are determined. It is necessary to. Some or all mutations found in affected individuals If not found in a normal individual, the mutation may be etiological to the disease. There is a potential. According to the current resolution of physical and genetic mapping methods, disease CDNAs that are correctly located in the relevant chromosomal region have 50-500 potential May be one of the genetically pathogenic genes (1 megabase map Resolution, with one gene every 20 kb). Generally, comparisons between affected and unaffected individuals are based on chromosomal spreads. Visible or detectable using PCR based on the cDNA sequence It is necessary to look for structural changes in the chromosome, such as deletions or translocations. Ultimately, to confirm the presence of the mutation and distinguish it from the polymorphism, A complete sequencing of the genes from the individual is required. Polypeptides, fragments or other derivatives thereof, or analogs thereof. Antibodies can be obtained using logs, or cells that express them, as immunogens. You. These antibodies are, for example, polyclonal or monoclonal antibodies. May be. The invention also relates to chimeric, single chain, and humanized antibodies, and Fab fragments. Fragment, or the product of a Fab expression library. Known in the art Various methods may be used for the production of such antibodies and fragments. The polypeptide is preferably administered to the animal by direct injection of the polypeptide into the animal or by the animal. Preferably, by administering to a non-human, the polypeptide corresponding to the sequence of the present invention Thus, an antibody can be obtained. The antibody thus obtained is Will bind to the polypeptide itself. In this way, the fragmentation of the polypeptide Antibody that binds to the entire original polypeptide using the sequence encoding only the You can even do it. The polypeptide is then expressed using such an antibody. The polypeptide can be isolated from the tissue. For the preparation of monoclonal antibodies, antibodies produced by continuous cell line culture The method of obtaining can be used. As an example, the hybridoma method (Kohler and Mil stein (1975) 256: 495-497), trioma method, human / B cell hybridoma method ( Kozbor et al. Immunology Today (1983) 4:72), and human monoclonals EBV-hybridomer method for antibody production (Cole et al., 1985, "Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy ", Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). . The method described for the production of single chain antibodies (U.S. Pat. No. 4,946,778) Producing a single chain antibody against the immunogenic polypeptide product of the present invention. Can be. In addition, using the transgenic mouse, the immunogenic polypep Humanized antibodies to the tide product may be expressed. γ_Two, Γ_Three, Γ_Four, Γ_Five, Γ₇, Γ_TenOr γ₁₁C coding subunit Hybridization probe for cDNA library Γ_Two, Γ_Three, Γ_Four, Γ_Five, Γ₇, Γ_TenOr γ₁₁Subunit Isolate genes and have high similarity or similar biology to these genes Other genes having a specific activity may be isolated. Generally, this type of probe The tubes have at least 20 bases. However, preferably, the probe is less It has at least 30 bases and generally does not exceed 50 bases, but May have as many bases as possible. Also supports full-length transcripts using probes CDNA clones and regulatory and promoter regions, exons and Complete γ including thetron_Two, Γ_Three, Γ_Four, Γ_Five, Γ₇, Γ_TenOr γ₁₁Subunit A genomic clone containing the gene may be identified. One example of screening is Γ by using a known DNA sequence to synthesize a oligonucleotide probe_Two , Γ_Three, Γ_Four, Γ_Five, Γ₇, Γ_TenOr γ₁₁Subunit gene coding domain Including isolation of the area. Labeled oligonucleotide having a sequence complementary to the gene sequence of the present invention Library of human cDNA, genomic DNA or mRNA using Clean and hybridize any member of the library to the probe Decide whether you want to Originally developed as a research reagent for human diseases and a material for finding treatments and diagnoses Light cDNA clones and polypeptides may be used. The present invention provides a method for identifying a receptor for a selected βγ ligand. For those skilled in the art Many known methods, such as ligand panning and FACS sorting (Coligan et al., "Current Protocols in Immun.", 1 (2), Chapter 5, (1991)) Thus, the gene encoding the receptor can be identified. Preferably, the selection When preparing polyadenylated RNA from cells that respond to the selected βγ ligand, Using expression cloning, the cDNA library obtained from this RNA is pooled. Cells that do not respond to the selected βγ ligand or other cells Sfect. Transfected cells grown on glass slides Expose to labeled βγ ligand. By iodination or by site-specific protein kinase By including the recognition site of (1), the selected βγ ligand can be labeled. Solid After settling and incubation, slides are analyzed by autoradiography To Identify positive pools, prepare subpools, repeat subpoolins Re-transfection using the At this point, a single clone encoding the putative form is obtained. Another app for receptor identification As a roach, label the ligand to the membrane or extract preparation expressing the receptor molecule. Make the affinity binding. The cross-linked material is separated by PAGE and X-ray Exposure to Lum. The labeled complex containing the ligand-receptor is cut out and the peptide And subjected to microsequencing of proteins. Obtained by microsequencing Design a set of degenerate oligonucleotide probes using the amino acid sequence, Identify the gene encoding the putative receptor. In addition, the present invention also promotes the interaction of a ligand with a receptor (agonist) or To screen for potential blocking (antagonist) drugs I will provide a. Agonists increase the intrinsic biological function of a particular ligand While being compounds, antagonists are compounds that eliminate these functions. An example For example, a mammalian cell or membrane that expresses a receptor for a particular βγ subunit The preparation is incubated with the labeled ligand in the presence of the test compound . The ability of the test compound to act as an agonist that promotes the interaction, or Can measure its ability to act as an antagonist to block an interaction it can. Potential agonists and specific βγ subunits under appropriate assay conditions Binds to membrane-bound βγ subunit receptor or recombinant βγ subunit receptor Potential antagonists may be identified by a competitive inhibition assay. This One skilled in the art can routinely determine such appropriate assay conditions. These In the assay, the βγ subunit is labeled, preferably radioactively labeled, and the receptor Determining the efficacy of a potential antagonist from the number of βγ subunits bound to Can be. Potential antagonists are antibodies, or, in some cases, βγ subunits. , But not limited to. Alternatively, Potential antagonists bind to receptor sites but are inactive, closely related Protein, thus occupying the receptor site to produce the βγ subunit Interfere with use. Another potential antagonist is prepared using the antisense method. Antisense construct to be produced. Triple helix using antisense method Regulation of gene expression by formation or antisense DNA or RNA. (Either method binds a polynucleotide to DNA or RNA. Based on For example, a polynucleotide encoding the mature polypeptide of the present invention. Using the 5 'coding region of the peptide sequence, from about 10 base pairs to about 40 base pairs. Design antisense RNA oligonucleotides of length. Genetics involved in transcription DNA oligonucleotides are designed to be complementary to the Cous-Lee et al. Nucl. Acids Res. (1979) 6: 3073; Cooney et al. Science (1988) 241 : 456 and Dervan et al. Science (1991) 251: 1360), whereby γ_Two , Γ_Three, Γ_Four, Γ_Five, Γ₇, Γ_TenOr γ₁₁Transcription and production of any of the subunits Prevent life. Antisense RNA oligonucleotide hybridizes to mRNA Γ of the mRNA molecule_Two, Γ_Three, Γ_Four, Γ_Five, Γ₇, Γ_TenOr γ₁₁Sa Block translation to buunit. Inject these oligonucleotides in vivo Γ_Two, Γ_Three, Γ_Four, Γ_Five, Γ₇, Γ_TenOr γ₁₁Subunit Can also be inhibited. The following non-limiting examples serve to further illustrate the invention. Example Example 1: Isolation and analysis of G protein γ subunit Poly (A) from tissues and cell lines using conventional procedures⁺Isolate RNA This allows several cDNA libraries from specific human tissues or cell lines Lee manufactured. The partial nucleotide sequence of the cDNA clone was converted into pBluescript Vector T7 or T3 primers (Stratagene, La Jolla, CA) Obtained by using a shift. As a result of sequencing this, several expressed sequence tags (E ST). By pairing the EST sequence with a gene of a known sequence, human G The protein γ subunit family was systematically classified and categorized. Example 2: Northern blot hybridization Poly (A) prepared from several human tissues (Clontech, Palo Alto, CA)⁺ Northern blots containing mRNA (2 μg) were run on 50% formamide, 5 × SSPE (20X SSPE = 3M NaCl, 0.2M sodium phosphate, 0.0M 2M EDTA, pH 7.4), 0.1% polyvinylpyrrolidone, 0.1% bovine serum Albumin and 2% sodium dodecyl sulfate and 100 μg / ml Hybridization was performed at 42 ° C. in the cut salmon sperm DNA. That γ_Four , Γ_TenAnd γ₁₁The cDNA fragment is transferred to the corresponding pBluescript vector. Digestion of cDNA clones with EcoRI and Xhol restriction enzymes Was isolated. Change the probe to [³²P] -dCTP (3000 Ci / mmol, DNA Polymerase in the presence of Amersham Corp., Arlington Heights, IL) Purification by random priming with Klenow fragment of Ze-I Obtained from the fragment. After hybridization, high stringency Sea wash at 65 ° C., 0.1 × SSC (1 × SSC is 0.15 M sodium chloride, 0.015 M sodium citrate), in 0.1% SDS. Blot Was exposed to an intensifying screen at -80 ° C for the indicated time. Example 3: Construction of plasmid Human β for transcription and translation₁, Β_Two, Γ_Four, Γ_TenAnd γ₁₁Corde The corresponding cDNA clone to an appropriate oligonucleotide primer. PCR amplification with pGEM (Promega, Madison, WI) or Subcloned into any of the pBluescript vectors. Then, the Cody Sequence was completely sequenced and no errors were introduced as a result of PCR amplification. I confirmed that β_ThreeFor subunit, human β_Three105 cDNA clones 0 bp fragment (Levine et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA (1990) 87 : 2389-2393) was excised with ApaI and the ApaI site of the Bluescript KS vector Subcloned. Example 4: In vitro transcription and prenylation analysis Plasmid DNA (1 μg) was linearized and γ_Two, Γ_TenAnd γ₁₁Sub-unit In case of T, T7 or γ_FourT3 for subunit RNA polymerase Transcribed. Transcription is performed using an RNA capping kit (Stratagene, La Jolla, CA) )). 20 μCi to evaluate the translation [³⁵S] methionine (Amersham Corp., Arlington Heights, IL) , 50 μl TNT-conjugated rabbit reticulocyte lysate system (Promega, Madison, The resulting RNA (4 μg) was translated in the reaction product of WI). Test prenylation You To achieve this, 50 μCi [^ThreeH] -farnesyl pyrophosphate (FPP) Or [^ThreeH] -geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP) In a TNA-conjugated rabbit reticulocyte lysate system supplemented with cold methionine. Translated NA. After translation at 30 ° C. for 2 hours, 10 pl of [³⁵S] Sign translation Aliquots of the mixture or 25 μl of [^ThreeH] aliquot of labeled translation mixture Dissolved in a buffer sample for electrophoresis and used in Laemmli, UK. J. Biol. Chem. (1991) 2 66: 19867-19870, 15% SDS-PAGE. Example 5: In vitro translation and proteolysis of trypsin Βγ interaction was assessed by proteolytic analysis of trypsin. β and γ Plasmid DNA (1 μg) for each of the subunits was ligated to TNT-conjugated rabbits. Co-transcription and co-translation with reticulocyte lysate system (Promega, Madison, WI) did. Linearize the plasmid DNA for each γ subunit and Production of the translation product was restricted. γ_TwoAnd γ_FourBoth subunits in this system Effectively translated, but γ_TenAnd γ₁₁Subunits are translated at a significantly lower level Was done. γ_TenAnd γ₁₁To increase subunit levels, 2 μg of key Cap RNA was added to the co-transcribed β-γ mixture. Alternatively, separately translated γ_Ten And γ₁₁Subunits were added to the co-transcribed β-γ mixture. Trypsin digestion In a final volume of 20 μl (containing 50 mM Na-HEPES, pH 8.0) By adding 1 μl of trypsin (1 μg), 5 or 10 μl of co-translation β Aliquots of the -γ mixture were digested. After incubation at 30 ° C. for 1 hour, L Digestion was stopped by adding aemmli sample buffer and boiling for 3 minutes. Sun By running the pull on a 15% SDS-PAGE gel, the β subunit was protected. The fragment was visualized. After electrophoresis, the gel was treated with 40% methanol / Immobilized in a mixture of 10% acetic acid, ENHANCE (DuPont-NEN, Boston) , MA) and dried. Run the dried gel at -80 ° C for 8 to 48 hours , Was exposed.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (71)出願人ウェイス・センター・フォー・リサーチアメリカ合衆国17822ペンシルベニア州ダンビル、ノース・アカデミー・アベニュー100番ゲイシンガー・クリニック (72)発明者ロビショー，ジャネット・ディアメリカ合衆国17820ペンシルベニア州カタウィッサ、ボックス262、ルーラル・ルート２番 (72)発明者クンシュ，チャールズ・エイアメリカ合衆国20874メリーランド州ジャーマンタウン、アマリロ・コート15番────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, M C, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG , CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AM, AU, BB, BG, BR, BY, CA, CN, CZ, EE, FI, GE, HU, IS, J P, KE, KG, KP, KR, KZ, LK, LR, LT , LV, MD, MG, MN, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SG, SI, SK, TJ, T T, UA, US, UZ, VN (71) Applicant Weiss Center for Research United States 17822 Pennsylvania Danville, North Academy Avenue 100th Gay Singer Clinic (72) Inventors Rovishaw, Janet D United States 17820 Pennsylvania Catawissa, Box 262, Rural Route 2 (72) Inventor Kunch, Charles A United States 20874 Maryland Amarillo Court 15th

Claims

[Claims] 1. Human γ_Two, Γ_Three, Γ_Four, Γ_Five, Γ₇, Γ_TenOr γ₁₁Code subunit Nucleic acid molecule. 2. Human γ_Four, Γ_TenOr γ₁₁A nucleic acid molecule that encodes a subunit. 3. A polypeptide consisting of SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7 or 8. 4. A polypeptide consisting of SEQ ID NO: 4, 7, or 8. 5. (A) obtaining a cell sample from a patient; (B) isolating genomic DNA from said cells; (C) isolating the genomic DNA from γ_Two, Γ_Three, Γ_Four, Γ_Five, Γ₇, Γ_TenOr γ₁₁ Compared to a PCR primer complementary to the nucleic acid sequence encoding any of Mutated form of human γ subunit with deletion or insertion in DNA Detecting a mutant form of the human γ subunit in a patient. 6. (A) obtaining a cell sample from a patient; (B) isolating genomic DNA from said cells; (C) Radioactively labeled γ of genomic DNA_Two, Γ_Three, Γ_Four, Γ_Five, Γ₇, Γ_TenMa Or γ₁₁Hybridize with RNA, (D) having a point mutation by identifying the matched sequence from the mismatched double strand Detection of a mutant form of the human gamma subunit A method for detecting mutant forms of buunit. 7. (A) obtaining a tissue sample from a host, (B) incubating the tissue sample on a solid support to fix the proteins in the tissue sample; Combined with the body carrier, (C) γ_Two, Γ_Three, Γ_Four, Γ_Five, Γ₇, Γ_TenOr γ₁₁Subunit specific anti The body is incubated with the solid support and γ bound to the solid support_Two, Γ_Three, Γ_Four, Γ_Five , Γ₇, Γ_TenOr γ₁₁Binding the antibody to any of the subunits, (D) detecting any antibody bound to the solid support and detecting γ in the tissue;_Two, Γ_Three, Γ_Four , Γ_Five, Γ₇, Γ_TenOr γ₁₁Inn consisting of measuring the level of subunits Γ in various tissues of the Lord_Two, Γ_Three, Γ_Four, Γ_Five, Γ₇, Γ_TenOr γ₁₁Sub-unit A method for detecting the modification level of a target. 8. (A) Mammalian cell or membrane expressing receptor for βγ ligand The preparation was labeled with γ in the presence of the test compound._Two, Γ_Three, Γ_Four, Γ_Five, Γ₇, Γ_Ten Or γ₁₁Incubate with the subunit, (B) a receptor for the βγ ligand of the test compound;_Two, Γ_Three, Γ_Four , Γ_Five, Γ₇, Γ_TenOr γ₁₁Promotes or blocks interaction with subunits Interaction of βγ ligand with its receptor, which consists of measuring its ability to For screening test compounds to identify agonists or antagonists Law.