JPH11505115A

JPH11505115A - Genetic manipulation of plant thioesterase and disclosure of plant thioesterase with novel substrate specificity

Info

Publication number: JPH11505115A
Application number: JP8534376A
Authority: JP
Inventors: ユアン，リン
Original assignee: カルジーン，インコーポレーテッド
Priority date: 1995-05-15
Filing date: 1996-05-15
Publication date: 1999-05-18
Also published as: EP0830453A2; WO1996036719A1; CA2206984A1

Abstract

(57)【要約】植物アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの基質特異性を変更する方法、およびそのために製造された遺伝子操作された植物アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを提供する。このための修飾について望ましいものとして、植物チオエステラーゼのＣ末端から三分の二の部分が同定される。遺伝子操作されたチオエステラーゼの発現のためのＤＮＡ配列および構築物、ならびにこれらから製造される新規なチオエステラーゼも提供する。こうしたＤＮＡ配列は宿主細胞中、特に脂肪酸組成の改変のために種子油作物の種子細胞中での遺伝子操作されたチオエステラーゼの発現のために使用される。ここに記載するＣ12選択性植物アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを変更して、Ｃ14およびＣ12に対してほぼ等しい活性を有する植物チオエステラーゼを得ることもできる。Ｃ12酵素をさらに改変して、Ｃ12基質に比較してＣ14の方に大きな活性を有するチオエステラーゼが得られる。 (57) [Summary] Methods for altering the substrate specificity of plant acyl-ACP thioesterase, and genetically engineered plant acyl-ACP thioesterase produced therefor are provided. As desired for modification for this, two thirds from the C-terminus of the plant thioesterase are identified. Also provided are DNA sequences and constructs for expression of the engineered thioesterase, and novel thioesterases produced therefrom. Such DNA sequences are used for the expression of engineered thioesterase in host cells, in particular in seed cells of seed oil crops for modification of the fatty acid composition. The C12 selective plant acyl-ACP thioesterase described herein can be modified to obtain a plant thioesterase having approximately equal activity on C14 and C12. Further modification of the C12 enzyme results in a thioesterase having greater activity on C14 compared to the C12 substrate.

Description

【発明の詳細な説明】植物チオエステラーゼの遺伝子操作および新規な基質特異性を有する植物チオエステラーゼの開示技術分野本発明はタンパク質、核酸配列および構築物、ならびにそれらに関する方法を対象としている。緒言背景脂肪酸は炭素数約４−24の炭化水素鎖を有する有機酸である。鎖長、ならびに二重結合の存在、数および位置において互いに異なる多数の種類の脂肪酸が知られている。細胞中で、脂肪酸は典型的には共有結合形態で存在し、そのカルボキシル部分は脂肪アシル基と称される。これらの分子の鎖長および飽和度はしばしば式ＣＸ：Ｙで示される。ここで、“Ｘ”は炭素の数を意味し、“Ｙ”は二重結合の数を意味する。植物中での脂肪酸の産生は、色素体における、酵素、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼIII によって触媒される、アセチル−ＣｏＡとマロニル−ＡＣＰとの反応によるブチリル−ＡＣＰの生成から開始する。アセチル−ＡＣＰの16−および18−炭素数脂肪酸への伸長には以下の反応順序の反応回路が含まれる：マロニル−ＡＣＰからの２炭素単位の縮合によるβ−ケトアシル−ＡＣＰの形成（β− ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ）、ケト基のアルコールへの還元（β−ケトアシル−ＡＣＰリダクターゼ）、脱水によるエノイル−ＡＣＰの形成（β−ケトアシル−ＡＣＰデヒドラーゼ）、および最後にエノイル−ＡＣＰの還元による伸長された飽和アシル−ＡＣＰの形成（エノイル−ＡＣＰリダクターゼ）。β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩはパルミトイル−ＡＣＰ（Ｃ16:0）までの伸長を触媒し、一方β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼIIは最後のステアロイル−ＡＣＰ（Ｃ18:0）までの伸長を触媒する。ＦＡＳによって産生される最長鎖脂肪酸は典型的には炭素数18である。色素体中で生起するその後の脂肪酸の生化学的ステップは、Δ−９デサチュラーゼによって触媒される反応におけるステアロイル−ＡＣＰ（Ｃ18:0）の不飽和化によるオレオイル−ＡＣＰ（Ｃ18:1）の形成である。この酵素はステアレートである18炭素数アシル−ＡＣＰに対する高活性のために、 “ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼとも称される。色素体における炭素鎖の伸長はアシル基のグリセロール３−リン酸への転移によって停止させることができ、その結果、色素体中の“原核”脂質生合成経路においてグリセロ脂質が残存する。あるいはまた、特異的チオエステラーゼが新しく産生されたアシル−ＡＣＰ類を加水分解して遊離の脂肪酸およびＡＣＰにすることによって、原核経路を遮断することもできる。続いて、遊離の脂肪酸は色素体のエンベロープ中で脂肪アシル−ＣｏＡに変換されて、細胞質に出される。そこで、これらは、リン脂質、トリグリセライドおよびその他の中性脂質の形成に関与する、小胞体中の、“真核”脂質生合成経路に取り込まれる。脂肪アシル−ＣｏＡの小胞体への輸送に続いて、トリグリセライド産生の連続ステップが開始され得る。例えば、膜結合酵素の作用によるオレオイルアシル基の連続的不飽和化の結果、リノレオイルまたはリノレノイルなどのポリ不飽和脂肪アシル基が産生される。トリグリセライドは、１−，２−，および３−アシル−ＡＣＰトランスフェラーゼ酵素、グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼおよびジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼの作用によって形成される。ある植物細胞の脂肪酸組成はアシルトランスフェラーゼ活性の結果である、遊離の脂肪酸の蓄積とトリグリセライド中に取り込まれた脂肪酸（脂肪アシル基）の反映である。あるトリグリセライドの特性はトリグリセライド分子中の異なる部位での脂肪アシル基の多様な組成によって決まる。例えば、脂肪アシル基が大部分飽和脂肪酸であれば、トリグリセライドは室温で固体となる。しかし、一般に植物油は各種のグリセライドの混合物となる傾向がある。したがって、トリグリセライド油の性質は油を構成しているトリグリセライドの組合せの結果であり、またこれらはそれぞれの脂肪アシル組成によって影響を受ける。植物アシル−アシル担持タンパク質チオエステラーゼは、脂肪酸合成における役割および稙物油種子の生物工学における有用性のため、生化学的関心を受けている。カリフォルニアベイトリー(California bay tree)、Umbellularia califo rnicaの中鎖アシル−ＡＣＰチオエステラーゼが単離され（Daviesら、(1991)Arc h.Biochem.Biophys.290:37-45）、そのｃＤＮＡがクローニングされ、またE. Coli中（Voelker ら、(1994)J.Bacterial.176:7320-7327）ならびに Arabidops is thaliana および Brassica napus の種子中（Voelker ら、(1992)Science 25 7:72-74）に発現された。すべての場合に、大量のラウリン酸塩（12:0）および少量のミリスチン酸塩（14:0）が蓄積した。これらの結果は、植物におけるde n ovo 脂肪酸生合成中の鎖長を決定する上でのＴＥの役割、および高等植物中の種子油組成を改変するためのこれらの酵素の有用性を示している。最近、各種の植物アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする多数のｃＤＮＡがクローニングされた（Knutzon ら(1992)Plant Physiol.100:1751-1758；Voe lker ら(1992)上記；Dormann ら、(1993)Planta 189:425-432 ；Dormann ら(199 4)biochim．Biophys.Acta 1212:134-136 ；Jones ら(1995)The Plant Cell 7:35 9-371）。これらのチオエステラーゼの配列分析は高い相同性を示しており、すなわち構造と機能の同一性を意味している。これらのチオエステラーゼｃＤＮＡのいくつかが E.coli 中で発現され、in vitroアッセイによってこれらの基質特異性が決定された。これらの酵素が顕著な配列相同性を有しながらも異なる基質特異性を示すという事実は、基質選択性を変更させるためにはアミノ酸をわずかに変更するだけで十分であることを意味している。これらの植物チオエステラーゼ間の構造および機能の相違についてはわずかな情報しか得られず、またどの植物チオエステラーゼの三次構造も未だ決定されていない。タンパク質工学はチオエステラーゼの基質認識および触媒の機構を理解するための強力な手段となることが証明され、またこれによって、所望の基質特異性を有する新規な酵素の合理的な設計が導かれると思われる。こうした新規な酵素は、植物の生物工学において、脂肪アシル組成の各種の改変、特に中鎖脂肪アシル基（Ｃ8 −Ｃ14）およびより長鎖の脂肪アシル基（Ｃ16またはＣ18）を含む、所望の脂肪アシル基を有意な割合で有する植物油の製造のための用途が見いだされるはずである。その上、広い範囲の用途を有する各種の油を提供するため、種子貯蔵油中に存在する各種の脂肪アシル基の割合を調節することも望まれる。文献酵母中のホスホトランスフェラーゼ（Hjelmstad ら(1994)J.Biol.Chem．269:2 0995-21002）および Flavobacterium の制限エンドヌクレアーゼ（Kim ら(199 4)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:883-887）の構造および機能を研究するために、キメラ遺伝子産物を使用する戦略が応用された。タンパク質工学において、タンパク質の機能ドメインを再編成するために、ドメインスワッピングが使用された（Hedstrom（1994）Current Opinion in Struc tural Biology 4:608-611）。最近、Vibrio harveyiからのミリストイル−ＡＣＰチオエステラーゼの構造が決定された（Lawsonら（1994）Biochemistry 33:9382-9388）。このチオエステラーゼはその他の細菌または哺乳類チオエステラーゼと同様に、植物チオエステラーゼと何ら配列相同性を有していない（Voelker ら（1992）上記）。図面の説明図１．代表的なクラスＩ（FatA）およびクラスII（FatB）チオエステラーゼのアミノ酸配列の整列図を提供する。UcFatB1（配列番号１）はカリフォルニアベイＣ14チオエステラーゼである。CcFatB1（配列番号２）は樟脳Ｃ14チオエステラーゼである。CpFatB1（配列番号３）は Cuphea palustris Ｃ8 およびＣ10チオエステラーゼである。CpFatB2（配列番号４）は Cuphea palustris Ｃ14チオエステラーゼである。GarmFatA1（配列番号５）はＣ18:0アシル−ＡＣＰ基質に対してもかなり活性を有するマンゴスチン18:1チオエステラーゼである。BrFatA 1（配列番号６）は Brassica rapa（aka Brassica campestris）からの18:1チオエステラーゼである。図示したすべてのチオエステラーゼにおいて同一のアミノ酸配列を白抜き太字で示している。図２．E.coli中に発現された野性型ベイ（図２Ａ）および野性型樟脳（図２Ｂ）チオエステラーゼのチオエステラーゼ活性アッセイを示す。図３．樟脳のクラスIIアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの成熟タンパク質部分をコードする領域を含むＰＣＲ断片（配列番号７）の核酸および翻訳アミノ酸の配列を提供する。図４．マンゴスチンのクラスＩアシル−ＡＣＰチオエステラーゼクローン（Ga rmFatA1）の核酸および翻訳アミノ酸の配列（配列番号８）を提供する。GarmFat A1 は主として18:1アシル−ＡＣＰ基質に対するチオエステラーゼ活性を示すが、18:0基質に対してもかなりの活性を示す（18:1活性の約 10-20％）。図５．マンゴスチンのクラスＩアシル−ＡＣＰチオエステラーゼクローン、Ga rmFatA2 の核酸および翻訳アミノ酸の配列（配列番号９）を提供する。GarmFatA 2 は主として18:1アシル−ＡＣＰ基質に対するチオエステラーゼ活性をし、16:0 および18:0基質に対しては同程度の低活性を示す。図６．Ｃ８およびＣ10アシル−ＡＣＰ基質に対する選択的活性を有するCuphea palustris のクラスIIアシル−ＡＣＰチオエステラーゼクローン（CpFatB1）の核酸および翻訳アミノ酸の配列（配列番号10）を提供する。図７．Ｃ14アシル−ＡＣＰ基質に対する選択的活性を有する Cuphea palustri s のクラスIIアシル−ＡＣＰチオエステラーゼクローン（CpFatB2）の核酸および翻訳アミノ酸の配列（配列番号11）を提供する。図８．ベイ（Ｃ12）（配列番号１）および樟脳（Ｃ14）（配列番号２）アシル −ＡＣＰチオエステラーゼのアミノ酸配列の比較を提供する。このチオエステラーゼ間で異なっているアミノ酸残基を白抜き陰影で示す。図９．チオエステラーゼのＮ−およびＣ−末端部分（左から右へ）のフレーム内融合としてのベイ／樟脳キメラ構築物、Ｃｈ−１およびＣｈ−２を示す。キメラ構築物を構築するのに使用したKpnI部位を示す。図10．C.Palustris CpFatB1（Ｃ8／Ｃ10）（配列番号３）およびC.Palustris CpFatB2（Ｃ14）（配列番号４）アシル−ＡＣＰチオエステラーゼのアミノ酸配列の比較を提供する。このチオエステラーゼ間で異なっているアミノ酸残基を白抜き太字で示す。図11．ベイ／樟脳キメラ酵素および２つのベイ変異体チオエステラーゼの基質特異性を提供する（黒色柱）。対照（ベクターのみで形質転換したE.coli）のバックグラウンド活性を斜線柱で示す。(A)Ｃｈ−１、(B)Ｃｈ−２、(c)ベイ変異体 M197R/R199H、および(D)ベイ変異体 M197R/R199H/T231K。図12．18:1、18:0および16:0アシル−ＡＣＰ基質に対する野性型（5247）および変異体 Garcinia mangifera チオエステラーゼ（GarmFatA1）のチオエステラーゼ活性比を提供する。図13．B.rapa BrFatA1（Ｃ18:1）（配列番号６）および Garcinia mangifera GarmFatA1（Ｃ18:1／Ｃ18:0）（配列番号５）アシル−ＡＣＰチオエステラーゼのアミノ酸配列の比較を提供する。このチオエステラーゼ間で異なっているアミノ酸残基を白抜き太字で示す。図14．ＰＣＲによる短鎖ドメインスワッピング。遺伝子の全長を２つの長い平行線で示す。斜線部分が対象ドメインを表す。各ＰＣＲプライマー（ａ，ｂ，ｃおよびｄ）について矢の先端が3'末端を示している。プライマーａおよびｂはＤＮＡ全長のための正および逆プライマーである。プライマーｃおよびｄの細い線は3'下流ドメインが正確に一致している配列を表す。プライマーｃおよびｄの太い尾部は新規なドメイン配列に相当する5'オーバーハングである。図15．ＰＣＲによる長鎖ドメインスワッピング。鋳型として遺伝子Ｉを使用して２つのＰＣＲ（ＰＣＲＩおよび２）を実施する。鋳型として遺伝子IIを使用して第３のＰＣＲを同時に実施する。プライマーａおよびｂは遺伝子Ｉの全長のための正および逆プライマーである。プライマーｃは遺伝子Ｉの当初のドメインの 3'のすぐ下流の配列に一致している。プライマーｄの細い線は遺伝子Ｉの当初のドメインの3'下流に一致する配列を表し、一方太い尾部は遺伝子IIの置換用のドメインの3'末端配列に一致する。プライマーｅは遺伝子IIのドメインの5'末端を先導（prime）し、一方ｆは他の末端を先導する。プライマーｆの細い尾部は遺伝子Ｉの当初のドメインの3'下流に一致する配列を表す。発明の要約本発明によって、遺伝子操作された植物アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの製造方法が提供される。ここでこの遺伝子操作された植物アシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、その植物チオエステラーゼによって加水分解されるアシル−ＡＣＰ基質に関して、天然のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼに比較して、変化した基質特異性を示す。これらの方法には、（１）１以上の修飾されたチオエステラーゼ遺伝子配列を産生させるための修飾を目的として、ある植物チオエステラーゼタンパク質をコードする遺伝子配列を修飾する工程（ここで修飾された配列は目的の植物チオエステラーゼの成熟部分における１以上のアミノ酸残基の置換、挿入または欠失を有する遺伝子操作されたアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする）、（２）宿主細胞中でこの修飾されたコード配列が発現されて、ここで遺伝子操作された植物チオエステラーゼが製造される工程、そして（３）基質特異性における所望の変更があるものを検出するために、この遺伝子操作された植物チオエステラーゼをアッセイする工程、が含まれる。アミノ酸の変更の中で特に対象となるのは、植物チオエステラーゼのＣ−末端から三分の二の部分であり、より特定すると、図１の配列整列図に示す植物チオエステラーゼ配列の第229−285（配列の上の共通番号）アミノ酸に相当する領域である。その他、第285−312アミノ酸領域はチオエステラーゼ基質特異性のＣ８およびＣ10などの短鎖脂肪酸側への改変の対象となる。目的とするチオエステラーゼにおける可能性のある修飾位置に関する有効な情報は、関連する植物アシル−ＡＣＰチオエステラーゼのアミノ酸配列の比較によって得られる。ここで比較するチオエステラーゼは異なる加水分解活性を表すものである。成熟タンパク質領域において少なくとも75％の配列同一性を有する植物チオエステラーゼのアミノ酸配列を比較するのが、この場合特に有効である。この方法において、関連するチオエステラーゼにおいて異なっているアミノ酸残基またはペプチドドメインを突然変異誘発のために選択するのがよい。修飾のためのアミノ酸またはペプチドドメインを選択するためのその他の方法として、対象とするチオエステラーゼの可変性および／または二次構造に与える置換、挿入または欠失の予測される影響に関してチオエステラーゼのタンパク質配列を分析することが含まれる。さらに、植物アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする配列のランダム突然変異と、それに続く基質特異性の変更を検出するためのチオエステラーゼ活性または脂肪酸組成の分析によって、有用なチオエステラーゼ遺伝子変異体を発見するのもよい。遺伝子操作されたチオエステラーゼを製造するためには、そのチオエステラーゼをコードするＤＮＡ配列を、アミノ酸配列の置換、挿入または欠失を導入するためのドメインスワッピングまたはランダム若しくは目的部位についての突然変異誘発によって、変更することもできる。その後このＤＮＡ配列が宿主細胞中で発現されて、それによって遺伝子操作されたチオエステラーゼが産生されて、生成した脂肪酸の組成が分析される。この方法で産生された遺伝子操作されたチオエステラーゼは、チオエステラーゼの基質特異性に及ぼすアミノ酸配列の修飾の影響もまたアッセイされる。この方法において、加水分解され得るアシル−ＡＣＰ基質の炭素鎖長の点で、または異なる炭素鎖長のアシル−ＡＣＰ基質に対するチオエステラーゼの比活性の点で、各種の様相を示す新規なチオエステラーゼを発見することができるであろう。こうして、遺伝子操作されたチオエステラーゼを発現するためのＤＡＮ配列および構築物、そしてまたこれらから製造される新規なチオエステラーゼもまた、ここで記載する発明の範囲内とされる。こうしたＤＮＡ配列は脂肪酸組成を改変するために宿主細胞中で遺伝子操作されたチオエステラーゼを発現させるのに使用することができる。本発明において特に対象とするのは、植物細胞、特に種子油農作物の種子細胞における遺伝子操作されたチオエステラーゼの発現のためのＤＮＡ構築物である。こうした構築物の発現の結果、植物トリグリセライド油が製造されるが、ここでこの油の組成はその遺伝子操作されたチオエステラーゼの変更された基質特異性を反映する。こうして、ここで提供される構築物を含む植物細胞、種子および植物はこの植物種子から収穫される新規な植物油とともに、すべて本発明の範囲となる。例えば、ここに記載するＣ12選択性植物アシル−ＡＣＰチオエステラーゼはＣ 14およびＣ12に対してほぼ等しい活性を有する植物チオエステラーゼとなるように変更することができる。このＣ12酵素をさらに改変してＣ12基質に比較してＣ 14に対してより大きい活性を有するチオエステラーゼが得られる。本発明において、Cuphea palustrisおよびマンゴスチン（Garcinia mangifer a）からの新規な植物アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ配列もまた提供される。この C.palustris配列、CpFatB1 は、Ｃ８およびＣ10脂肪アシル−ＡＣＰに対する基質特異性を示し、Ｃ８に対する活性の方が高い。マンゴスチンチオエステラーゼ遺伝子、GarmFatA1 は、主として18:1−ＡＣＰ基質に対する活性を示すが、 18:0−ＡＣＰに対する実質的活性をも示す。重要なことは、このクローンは16:0 基質に対する特異性を示さないことである。これらの新規なＣ８／Ｃ10およびＣ 18:1／Ｃ18:0植物チオエステラーゼの特異性を改変する方法もまた本発明において提供される。特に、マンゴスチンクローンの18:0／18:1活性比を増大させる突然変異が提供される。発明の詳細な説明この発明によって、変更された基質特異性を有する遺伝子操作された植物チオエステラーゼを製造する方法が提供される。この発明の遺伝子操作された植物チオエステラーゼとしては、植物酵素が反応し得る条件下で脂肪アシル−ＡＣＰ基質から遊離の脂肪酸（類）の生成を触媒する能力を示す、植物源から得ることができるタンパク質、ペプチドまたはペプチド断片などのアミノ酸の任意の配列が含まれる。“酵素が反応し得る条件”によって、ある環境下で酵素が機能することが可能になる任意の必要条件（すなわち、温度、ｐＨ、阻害性物質の欠如など）が利用し得ることを意味している。遺伝子操作された植物チオエステラーゼは、翻訳されたアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸の置換をもたらすための、チオエステラーゼをコードする配列のランダムまたは特異的な突然変異誘発によって調製することができる。あるいはまた、関連する植物チオエステラーゼ間のドメインスワッピングによって遺伝子操作された植物チオエステラーゼを調製することができる。これは、天然のチオエステラーゼをコードする配列の広い領域を別の植物チオエステラーゼからの対応する領域で置き換えるものである。ドメインスワッピングの対象として、５または６から10の長さのアミノ酸範囲のペプチドが含まれる。理想的な場合、この型の交換は両方のタンパク質をコードする遺伝子中の交換の厳密な位置における独特の保存された制限部位の存在によって実施することができる。オリゴベースの突然変異誘発（ルーピング）の過程は大きなドメイン配列を交換しなければならないので時間がかかるが、通常の制限部位が利用できないときに、この過程を適用することができる。あるいはまた、以下の実施例で記載するように、Hortonらによって記載された（BioTechniq ues（1990）8:528-535）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用した重複伸長手法の改変である、ドメインスワッピングのための迅速方法を適用することができる。in vivo の操作を含まずに、全操作法を６時間（２回のＰＣＲ操作のための時間）以内に実施することができる。重複伸長方法のための基本原理は、ＰＣＲにおいて、プライマーは先導するために十分鋳型の配列と一致しなければならないが、特に5'末端方向には厳格に一致する必要はないことである。実際、5'オーバーハング（非一致配列）を有するＰＣＲプライマーが通常使用される。ＰＣＲを基礎とするドメインスワッピングはドメインが約６またはそれ以下のアミノ酸を含有する（短ドメインスワッピング）か、またはずっと多数のアミノ酸を含有するドメインを交換しなければならない（長ドメインスワッピング）場合に適用するように設計される。遺伝子操作されたチオエステラーゼの変更された基質特異性は、天然のチオエステラーゼ酵素によっては加水分解されない、ある特定の鎖長のアシル−ＡＣＰ基質に対する加水分解活性の存在によって反映される。新しく認識されるアシル −ＡＣＰ基質には、より短いまたはより長い炭素鎖長（通常１またはそれ以上の２−炭素単位の追加または欠失によって反映される）を有する、より大きいまたはより小さい飽和度を有する、あるいは植物細胞中には普通存在しないある種の脂肪酸、すなわちイソおよびアンチイソ脂肪酸の中などのメチル基の存在、等々の各種の面においてその酵素の天然の基質とは異なっているものがある。あるいはまた、変更された基質特異性は鎖長および／または飽和度が異なる２またはそれ以上のアシル−ＡＣＰ基質に対する加水分解比の改変としてて反映されることもある。 30を超える植物アシル−ＡＣＰチオエステラーゼに関するＤＮＡおよびアミノ酸配列の情報が現在入手可能であり、本発明の方法において、遺伝子操作されたチオエステラーゼを発現する配列を製造するための修飾に関して望ましい領域を同定するために、これらの配列を使用することもよい。植物チオエステラーゼは配列相同性によって、２つのクラスに分類することができる。これらの植物チオエステラーゼのすべてが、色素体を標的とするために、60−80アミノ酸長のトランジットペプチドを含有している。このトランジットペプチドは種の間でほとんど相同性を示さず、一方成熟タンパク質領域（トランジットペプチドを除いた領域）はアミノ酸配列の有意な同一性を示す。第１番目のクラス、クラスＩ（またはFatA）には主として18:1−ＡＣＰに対する活性を有する長鎖アシル−ＡＣＰチオエステラーゼが含まれる。18:1−ＡＣＰは真核経路によって合成されるリン脂質およびトリグリセライド中に見られる大部分の脂肪酸の直前の前駆体である。このクラスのチオエステラーゼは本質的に今日までに調べられたすべての植物起源中に見出だされてきており、膜の生合成のために必要とされる本質的な“ハウスキーピング(houskeeping)”酵素（Jones ら（上記））であることが示唆されている。主として18:1−ＡＣＰ基質に対する活性を有する、ベニバナ、Cuphea hookeriana および Brassica rapa(campest ris)からのクラスＩチオエステラーゼの例が記載されている（国際公開公報第 9 2/20236 および国際公開公報第 94/10288）。Arabidopsis thaliana(Dormann ら（1995）Arch.Biochem.Biophys.316:612-618)、Brassica napus（Loaderら（199 3）Plant Mol.Biol.23:769-778）およびコリアンダー（Dormannら（1994）Bioch em.Biophys.Acta 1212:134-136）中の他の18:1チオエステラーゼが報告されている。同様の18:1−ＡＣＰ特異的クラスＩチオエステラーゼ（GarmFatA2）がマンゴスチン（Garcinia mangifera）からの発生中の胚中で発見され、これについては本文で記載する。大豆からのクラスＩチオエステラーゼは、E.coli中で発現されて、16:0−ＡＣＰおよび18:1−ＡＣＰ活性が10倍および96倍増大するが18:0− ＡＣＰ活性は少し（３−４倍）しか増大しないことが報告された（国際公開公報第 92/11373）。クラスＩ植物チオエステラーゼの成熟タンパク質領域は高度に相同性であり、80％を超える配列の同一性を表す。さらに、やはりここで記載する別のマンゴスチンのクラスＩチオエステラーゼ（GarmFatA1）が発見された。これは、主として18:1−ＡＣＰ基質に対するチオエステラーゼ活性（E.coli中での発現によって100 倍に増大）を表すが、16:0− ＡＣＰ対18:0−ＡＣＰの選択的活性をも表す。今日までに分析されたクラスＩチオエステラーゼの大部分においては18:1活性が高度に優勢であって、16:0および 18:0基質に対して検出される活性は18:1活性レベルの5 ％より低いのに、GarmFa tA1 の18:0活性は18:1活性のおよそ25％である。植物チオエステラーゼの２番目のクラス、クラスII（またはFatB）チオエステラーゼには、Ｃ8:0 からC14:0（中鎖脂肪酸）および16:0の短い方の鎖長の脂肪酸を利用する酵素が含まれる。クラスIIチオエステラーゼは飽和脂肪酸を含有する基質の加水分解を選択的に触媒する。カリフォルニアベイ、ニレ、Cuphea hoo keriana、Cuphea palustris、Cuphea lanceolata、ナツメッグ、Arabiodopsis t haliana、マンゴー、ニラおよび樟脳からクラスII（またはFatB）チオエステラーゼが単離されている。クラスII植物チオエステラーゼの成熟タンパク質領域もまた高度に相同的で、70−80％の配列同一性を示す。クラスIIチオエステラーゼの特性の１つは、成熟タンパク質のＮ−末端領域におけるおよそ40アミノ酸の比較的疎水性の領域の存在である。この疎水性領域は 18:1−ＡＣＰチオエステラーゼにおいては見られず、また酵素活性に対して見かけ上影響を及ぼさない。この領域を有するかまたは有していないベイのクラスII チオエステラーゼの組換え体の発現はin vitroで同一の活性プロファイルを示した（Jones ら（上記））。以下の実施例でより十分に示すように、植物チオエステラーゼのアシル−ＡＣＰ基質特異性は、その植物チオエステラーゼの成熟タンパク質部分における、アミノ酸の置換、挿入または欠失などのタンパク質配列に対する各種のアミノ酸の変更によって改変することがある。改変された基質特異性はE.coli中のこの遺伝子操作されたチオエステラーゼの発現およびこの酵素活性を検出するためのアッセイによって、検出することができる。改変された基質特異性は、遺伝子操作されたチオエステラーゼが天然のチオエステラーゼによっては認識されない基質を新たに加水分解することができるようになるといった、アシル−ＡＣＰ基質選択性の異動によって評価することもできる。新たに認識された基質は、その基質の脂肪アシル部分の炭素鎖長および／または飽和度によって天然の酵素の基質とは異なるものとなる。あるいはまた、改変された基質特異性は、遺伝子操作されたチオエステラーゼがアシル−ＡＣＰ基質に関して異なる順番の選択性を示すといった、天然のチオエステラーゼの２またはそれ以上の基質に対するチオエステラーゼ活性の比率が変動することによって反映されることもある。例えば、Ｃ12基質に対する主要な加水分解活性とＣ14に対するいくらか劣勢な活性を有する植物チオエステラーゼを、Ｃ₁₄に対する活性が増大した遺伝子操作されたチオエステラーゼを製造するように、例えば遺伝子操作されたチオエステラーゼがＣ12および14基質に対してほぼ等しい活性を有するように、改変することもできる。同様に、このような植物Ｃ12チオエステラーゼをさらに改変して、Ｃ14基質に対して主要な活性を有し、Ｃ12基質に対してはほとんどまたは全く活性を有しない遺伝子操作されたチオエステラーゼを製造することもできる。あるいはまた、比活性をより高いかまたはより低い飽和度を有する基質の方に変更するように、植物チオエステラーゼを改変することもできる。例えば、クラスＩ（ 18:1）チオエステラーゼを、Ｃ18:1およびＣ16:0などの酵素の別の基質に対する活性に比較したＣ18:0基質に対する比活性を増大させるように改変することもできる。これらの型のチオエステラーゼの改変の例を以下の実施例において提供する。植物チオエステラーゼのさらに別の改変もまた望ましく、ここに提供した方法および配列を使用してそれらを得ることもできる。例えば、Ｃ8 およびＣ10などのより短鎖の脂肪酸の加水分解側に酵素活性を移動するように、植物チオエステラーゼを改変することもできる。チオエステラーゼの特異性の変更のために可能性がある標的アミノ酸残基を同定するために、ここに提供した C.palustris Ｃ8/10、C.palustris Ｃ₁₄およびC.hookeriana Ｃ8/10チオエステラーゼ配列などの密接に関係があるチオエステラーゼの配列の比較を利用することもできる。植物チオエステラーゼ酵素の基質特異性を変更することを目的とする最初の試験において、カリフォルニアベイ（Umbellularia californica）からのＣ12選択性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼおよび樟脳（Cinnamomum camphora）からのＣ14選択性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの、２つの高度に関係があるクラス IIチオエステラーゼを研究した。これらの酵素は成熟タンパク質領域において90 ％のアミノ酸配列の同一性を有しているが、それでもなお異なる基質特異性を有している。樟脳またはベイチオエステラーゼの一方のＮ−末端成熟タンパク質領域および他方のチオエステラーゼのＣ−末端部分を含有するキメラチオエステラーゼ酵素をコードする、キメラ成熟チオエステラーゼの発現のための構築物を調製した。これらの構築物中にコードされたＮ−末端チオエステラーゼ部分は成熟チオエステラーゼタンパク質のおよそ三分の一を含有し、Ｃ−末端部分が成熟チオエステラーゼタンパク質領域の残りの三分の二を含有する。以下の実施例でより詳細に記載するように、これらの植物チオエステラーゼのＣ−末端の三分の二の部分が基質特異性を決定する決め手となることを、我々は発見した。樟脳チオエステラーゼのＣ−末端部分を含有するキメラ酵素（Ch-1）は天然の樟脳チオエステラーゼ（14:0に対して特異的）と同一の活性プロファイルを示し、ベイチオエステラーゼのＣ−末端を有するキメラタンパク質（Ch-2）は天然のベイチオエステラーゼ（12:0に対して特異的）と同一の活性プロファイルを示す。基質特異性にとって重要なチオエステラーゼタンパク質の領域をさらに限定するために、このタンパク質のＣ−末端のさらに進めた研究を実施した。これらの研究の一つとして、ベイチオエステラーゼの13の連続したＣ−末端アミノ酸を、この領域をコードするＤＮＡが欠如した突然変異遺伝子を製造することによって、欠失させた。発現した突然変異チオエステラーゼの活性を、ある発現した野性型のベイチオエステラーゼタンパク質と比較した。17のＣ−末端変異体と野性型のベイチオエステラーゼタンパク質の活性プロファイルは同じで、チオエステラーゼタンパク質のこのＣ−末端部は基質特異性にとって重要な領域ではないことが示された。基質特異性に関与する特定のアミノ酸を同定するために、ベイのＣ12選択性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼのＣ−末端の三分の二部分をさらに分析した。ベイおよび樟脳の配列整列図を調べることによって、このタンパク質のＣ−末端の三分の二部分における、２つのチオエステラーゼ間で最少の保存アミノ酸置換部を同定した。非保存性アミノ酸置換部には、置換されたアミノ酸が天然のアミノ酸残基と異なる荷電を有するものが含まれる。ｐＨ７において陽性荷電側鎖を有すると考えられるアミノ酸はリジンおよびアルギニンである。酸性ｐＨ条件下では、ヒスチジンもまた陽性に荷電した側鎖を有する。ｐＨ７において陰性荷電側鎖を有すると考えられるアミノ酸はアスパラギン酸およびグルタミン酸である。非保存性アミノ酸置換部とはまた、置換されたアミノ酸の大きさがその部位に普通位置しているアミノ酸の大きさと相当異なっている場合をも意味する。ベイおよび樟脳チオエステラーゼ間の非保存性のアミノ酸の相違の例は、M197→R（ベイTE→樟脳TE）、R199→H 、T231→K 、A293→D 、R327→Q 、P380→S 、および R381→S である（ベイおよび樟脳チオエステラーゼのアミノ酸配列番号は図８に示されている）。チオエステラーゼタンパク質の二次構造に影響を及ぼすと思われるアミノ酸置換を同定するために、二次構造の予測を使用することもできる。例えば、ChouおよびFasmanの方法を使用した二次構造の予測にしたがうと、ベイの第197-199 アミノ酸のトリペプチドM-R-R および樟脳の対応するトリペプチドR-R-H はβ−シートおよび２つの高度に保存されたグリシン（G193およびG196）によって固定されたターン部の後部に位置している。植物チオエステラーゼのこの領域は高度に保存されており、他の植物チオエステラーゼにおいても、このβ−シートおよびターン構造が予測される。以下の実施例において記載するように、ベイのM-R-R トリペプチドを樟脳チオエステラーゼに模擬化してR-R-H に変更すると、この変異体の12:0に対する活性は野性型に比較して約７倍減少するが14:0に対しては減少しない。この結果、12 :0および14:0基質に対してほぼ等しい特異的活性を有する遺伝子操作されたチオエステラーゼが生成する。さらにこの遺伝子操作されたベイM197R/R199H チオエステラーゼの第231 アミノ酸のトレオニン残基をリジンに転換する（T231K）修飾は、遺伝子操作されたチオエステラーゼM197R/R199H/T231K が高度に14:0−ＡＣＰ特異的となるように、基質特異性を変更させる。興味深いことに、T231K の突然変異のみではベイチオエステラーゼ活性に影響を及ぼさない。M197R/R199H 遺伝子操作されたチオエステラーゼに対するT231K 置換のこの非付加的な組合せによる影響は、この変更されたアミノ酸の部位が互いに近づくように折り畳まれていることを示唆している（Sandbergら(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.90:8367-8371）。以下の実施例において記載するように、植物アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの活性部位（YRREC 、図１における共通番号の第357-361 アミノ酸）の近辺のアミノ酸の置換がチオエステラーゼの活性に大きな減少をもたらすようである。ベイチオエステラーゼのR327Q となる修飾の結果、ベイチオエステラーゼ活性が10 0 倍減少する。R327Q の減少した活性は、このアミノ酸部位が図８中のベイチオエステラーゼ配列の活性部位システイン、C320にきわめて近接した位置にあるという事実によるもののようである。変更された基質特異性を有する遺伝子操作されたチオエステラーゼを宿主細胞中に発現させ、その結果生成した脂肪酸の組成を分析すると、遺伝子操作されたチオエステラーゼの変更された基質特異性は宿主細胞の脂肪酸組成プロファイルに反映されていることが示される。in vitroでの活性アッセイにおいては反映されない配列内の相互作用または寿命および折畳み／非折畳み割合などのパラメーターがin vivo での酵素活性に関与していたと考えられる点で、このことは意味がある。E.coli膜の主要な脂質組成はホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルグリセロールであり、これらは主として長鎖脂肪アシル部分を含有する。天然ベイチオエステラーゼｃＤＮＡのFadD細胞中の組換え発現体は長鎖から中鎖を産生する細菌型II脂肪酸シンターゼ系を再支配し、トランスジェニック植物の種子中での天然ベイチオエステラーゼの発現においても同様な結果が得られる（Voelker ら(1994)上記；Voelker ら(1992)上記）。したがって、E.coliの in vivo のデータをトランスジェニック植物における遺伝子操作されたチオエステラーゼの発現の影響を予測するのに使用することができるかも知れない。天然のベイチオエステラーゼによって、E.coli FadD 細胞は大量の12:0遊離脂肪酸および少量の14:0（12:0値の約5-10％）を産生する（Voelker ら(1994)および表Ｉ）。しかし、以下の実施例で示すように、２つのアミノ酸の置換(M197R/R 199H)による遺伝子操作されたベイチオエステラーゼの発現の結果、同量の12:0 および14:0脂肪酸が蓄積する。同様に、３つのアミノ酸が置換された（M197R/R1 99H/T231K）遺伝子操作されたベイチオエステラーゼの発現は、天然のベイチオエステラーゼによる結果に比較して、産生される脂肪酸の12:0／14:0比を完全に逆転させる。こうして、植物チオエステラーゼの基質特異性に対する改変の結果、加水分解のために各種の基質が利用し得る細胞中に産生される脂肪酸の量比を変更することもできることが示される。さらに、変更された基質特異性を有する遺伝子操作されたチオエステラーゼの発現の結果、植物種子のトリグリセライドなどの、利用し得る遊離脂肪酸から形成される分子もまた変更することもできる。ここで提供されるような、既知のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼおよびコード配列の他に、多数の植物種から別のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ配列を得ることもでき、こうしたチオエステラーゼおよびコード配列は本発明の方法において用途が見出されるであろう。上に記載したように、植物チオエステラーゼをコードする配列、特に同一クラスのチオエステラーゼ、すなわちクラスＩまたは IIに属するものについては、高度に保存される。こうして、別のチオエステラーゼの単離のために、注目する植物起源候補から調製したゲノムまたは他の好適なライブラリーを１以上のクラスＩまたはII植物チオエステラーゼからの保存配列で釣り上げ、相同性において関連するクローンを同定する。陽性クローンを制限酵素切断および／または配列決定によって分析する。プローブは全配列よりも相当短くてもよい。例えば、オリゴヌクレオチドを使用してもよいが、少なくとも長さ約10、好ましくは少なくとも約15、より好ましくは20のヌクレオチドとすべきである。比較のために短い長さの領域を使用する場合には、より長い配列の場合よりも高度の配列同一性が要求される。短いプローブは、殊に高度に保存された配列を含有する植物チオエステラーゼの単離のための、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Gould ら、PNAS USA(1989)86:1934-1938）において特に有用であることが多い。植物チオエステラーゼの保存領域に対するオリゴヌクレオチドを使用するＰＣＲもまた、ライブラリーのスクリーニングのために相同性プローブを産生させるのに使用してもよい。プローブとしてより長い核酸断片（＞100bp）を使用する場合、殊に完全なまたは大きなｃＤＮＡ配列を使用する時には、20-50 ％の差異を有する、すなわち相同的配列である標的サンプルからシグナルを得るために、中高度のストリンジェンシーによっても（例えば37℃で50％ホルムアルデヒドを使用し最少洗浄によって）なおスクリーニングすることができる（スクリーニング手法に関する詳しい情報については、Beltz ら、Methods in Enzymology（1983）100:266-285参照）。本発明の遺伝子操作された植物チオエステラーゼをコードする核酸またはアミノ酸配列を各種の方法によって他の非天然の、または“異型”配列と組み合わせることもできる。“異型”配列とは、例えば、天然には互いに結合して見られることがない、同一の植物からの核酸配列の組合せを含む、天然にはその植物アシル−ＡＣＰチオエステラーゼに結合して見られることがない任意の配列を意味する。宿主細胞中の発現のため、遺伝子操作された植物チオエステラーゼをコードする配列を、5'から3'への転写方向で、宿主細胞中での転写および翻訳を促進することができる転写開始調節領域、遺伝子操作された植物アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードするＤＮＡ配列ならびに転写および翻訳停止領域を有するＤＮＡ構築物中に組み込む。ＤＮＡ構築物はトランジットペプチドなどの予備プロセシング配列を含んでも含まなくてもよい。トランジットペプチドはタンパク質をあるオルガネラまで運搬するのを補助し、オルガネラへの入り口でそのアミノ酸部分を切り離して“成熟”配列を放出する。植物細胞発現のカセットにおいて、植物アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの前駆体のＤＮＡ配列の使用が好ましい。植物アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを目的とする各種のオルガネラに輸送するために、種子ＡＣＰのトランジットペプチドなどのその他の色素体トランジットペプチドを利用するのもよい。こうして、in vitroまたはin vivo での酵素の再生または研究のために、宿主細胞中での目的とするチオエステラーゼの発現などのための各種の構築物において、遺伝子操作された植物チオエステラーゼ配列を使用することができる。可能な宿主細胞には原核および真核細胞の両方が含まれる。宿主細胞は目的の用途に応じて、単細胞または多細胞の分化もしくは未分化生物中の一つでもよい。本発明の細胞はその中に遺伝子操作された植物アシル−ＡＣＰチオエステラーゼが存在している点に特徴がある。宿主に応じて、ウイルス、プラスミドもしくは染色体遺伝子、その他などからの領域など、調節領域は変わるはずである。原核または真核微生物、特に単細胞宿主中の発現のためには、きわめて広い範囲の種類の構成的または調節的プロモーターを使用することができる。微生物中での発現は遺伝子操作された植物酵素の完成された起源を提供することができ、こうした酵素の特定の性質を同定するのに有用である。すでに記載されている転写開始領域の中に、ベータガラクトシダーゼ、T7ポリメラーゼ、トリプトファンＥなどの遺伝子を含む、E.coli、B.su btilis、Saccharomyces cerevisiaeなどの細菌および酵母宿主からの領域がある。大部分において、構築物は植物中は植物アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを発現させる機能をもつ調節領域を含んでおり、その結果、植物細胞中の脂肪酸組成が改変されることになる。この植物アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードするオープンリーディングフレームを5'末端において、天然にはチオエステラーゼ構造遺伝子の5'上流に存在する野性型配列などの転写開始調節領域に連結させる。構造遺伝子機能の多岐に渡る構成的または調節的転写、例えば誘導性転写を提供する、その他の多数の転写開始領域を利用することができる。植物用に使用される転写開始領域の中には、ノパリン(nopaline)およびマンノピン(mannopine) シンターゼなどのための構造遺伝子と、またはナピン、ＡＣＰプロモーターなどと結合した領域がある。こうした構造遺伝子に対応する転写／翻訳開始領域は、相当する開始コドンのすぐ5'上流に見られる。遺伝子操作されたチオエステラーゼタンパク質の、植物宿主中での発現を目的とする態様において、天然の植物アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子の一部の使用が考えられる。すなわち、3' 下流非コード領域とともに、5'上流非コード領域（プロモーター）の全部または一部を使用する。対象とする植物宿主に固有のプロモーターまたは修飾プロモーター、すなわちある遺伝子供給源由来の転写開始領域及び別の遺伝子供給源由来の翻訳開始領域を有するもの（強化プロモーター）、例えば二重35S CaMVプロモーター、などの異なるプロモーターが必要ならば、標準的な手法を使用して、これらの配列を連結することもできる。 5'上流非コード領域を、種子の成熟中に調節される別の遺伝子から得る場合に応用するためには、ＡＣＰおよびナピン誘導転写開始制御領域などの、植物胚組織中で選択的に発現するものが望ましい。こうした“種子特異的プロモーター” は、U.S.Serial No.07/147,781、出願1/25/88（現在、U.S.Serial No.07/550,80 4、出願7/9/90）、および“初期種子発生中に選択的に発現する新規配列およびこれに関連する方法”という表題の、U.S.Serial No.07/494,722、出願1990年3 月16日またはその近日、の教示にしたがって得られ、そして使用することができる。これらの参考文献をここに参照として引用する。遺伝子産物の何らかの妨害的効果または逆効果を最少にするために、種子組織中で選択的に発現する、すなわち他の植物器官においては検出されない、転写開始領域が、脂肪酸の改変にとって望ましいと考えられる。調節転写停止領域も同様に本発明のＤＮＡ構築物中において提供される。転写停止領域は、その植物アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードするＤＮＡ配列、または、例えば天然において転写開始領域と結合している転写停止領域などの、別の遺伝子供給源由来の適切な転写停止領域によって提供される。転写停止領域が別の遺伝子供給源由来の物である場合、該停止領域はその起源である構造遺伝子の3'側の少なくとも約0.5 kb、好ましくは約1-3 kb配列を含む。対象のＤＮＡ配列として植物アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを有する植物の発現または転写構築物は、多くの種類の植物体、特に食用および工業用の植物油の製造に関与する植物体において利用することができる。特に最も好ましいのは温帯の脂肪種子作物である。対象とする植物としては、限定するわけではないが、菜種（カノラおよび高エルカ酸変種）、ヒマワリ、ベニバナ、綿実、Cuphea、大豆、ピーナッツ、ココナッツおよび油ヤシ、ならびにトウモロコシが含まれる。宿主細胞中に組換え構築物を導入する方法によって、他のＤＮＡ配列を必要とすることがある。重要なことは、本発明は双子葉および単子葉種に同様に応用でき、また新規なおよび／または改良された形質転換および調節技術にそのまま応用できることである。形質転換の方法は本発明にとって重要ではない。植物の形質転換の各種の方法を普通に利用し得る。作物を形質転換するためにより新しい方法が利用されれば、ここですぐに利用することもできる。例えば、元来アグロバクテリウム(Agrob acterium)感染を受けやすい多くの植物種は、アグロバクテリウム仲介形質転換のトリパータイトまたはバイナリーベクター法を介してうまく形質転換される。その上、各種の単子葉および双子葉植物種の形質転換を可能にする、マイクロインジェクション、ＤＮＡ粒子衝撃、エレクトロポレーションの技術が開発されてきた。ＤＮＡ構築物を開発する中で、細菌宿主、例えばE.coli中で複製することができる適切なクローニングベクター中に、該構築物またはそれらの断片の各種成分が正常に挿入される。文献中に記載されてきた多数のベクターが存在する。各クローニング後、プラスミドを単離して、所望の配列の成分を調製するために、制限酵素による切断、新しい断片の挿入、ライゲーション、欠失、挿入、切除その他の次の操作を実施してもよい。構築物が完成すると、続いて宿主細胞の形質転換方式にしたがってさらに操作するために、これを好適なベクター中に移入することができる。通常は、宿主中での発現に必要な調節領域を有し、形質転換細胞の選択機能を有する構造遺伝子をそのＤＮＡ構築物とともに含ませる。該遺伝子は、例えば抗生物質、重金属、毒素その他の細胞傷害性剤に対する抵抗性、栄養要求性変異体宿主に対する原栄養性(prototrophy)を提供する補足性、ウイルス免疫などを提供する。発現構築物またはその成分を導入する各宿主の種類数に応じて、１またはそれ以上のマーカーを利用し、その場合、異なる宿主に対しては異なる選別条件を使用する。ＤＮＡコードの縮重性のため、いくつかのコドンの置換があっても対応するアミノ酸配列の修飾をともなわないＤＮＡ配列が存在しうる点に注意すべきである。ＤＮＡ構築物が植物宿主中に導入される方式はこの発明にとって重要ではない。有効に形質転換できるいずれの方法も利用することができる。植物細胞の形質転換の各種の方法としては、Ti−またはRi−プラスミド、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ＤＮＡ粒子衝撃、リポソーム融合、ＤＮＡ衝撃などの使用が含まれる。多くの例において、片側または両側をＴ−ＤＮＡによってボーダーされた構築物、特に左および右のボーダー、さらに特定すると、右のボーダーを有するものとするのが好ましい。これは形質転換モードとして構築物が A.tumefaciensまたは A.rhizogenes を使用する場合に特に有用であるが、このＴ−ＤＮＡボーダーはその他の形質転換モードにおいても用途はある。植物細胞の形質転換のためにアグロバクテリウムを使用する場合、アグロバクテリウム宿主中に存在するＴ−ＤＮＡまたはTi−もしくはRi−プラスミドと相同組換えのためにアグロバクテリウム宿主中に導入される、あるベクターを使用することができる。組換えのためのＴ−ＤＮＡを含むTi−またはRi−プラスミドは強化しても（ゴール形成を引き起こすことが可能）しなくても（ゴール形成を引き起こすことが不可能）よい。vir 遺伝子が形質転換されたアグロバクテリウム宿主中に存在していれば、後者も可能である。強化されたプラスミドは正常な植物細胞とゴールの混合物を与えることができる。植物細胞を形質転換するためのビヒクルとしてアグロバクテリウムを使用するいくつかの例において、Ｔ−ＤＮＡボーダー（単数又は複数）によってボーダーされた発現構築物を広域宿主スペクトルベクター中に挿入する。広域宿主スペクトルベクターは文献中に記載されている。通常使用されるものは pRK2 またはその誘導体である。例えば、Ditta ら、PNAS USA,(1980)77:7347-7351および欧州特許公開公報第 0 120 515号を参照されたい。これらは参照として本文に組み込まれる。発現構築物およびＴ−ＤＮＡとともに１以上のマーカーが含まれ、これによって形質転換されたアグロバクテリウムおよび形質転換された植物細胞の選別が可能になる。植物細胞での使用のために、クロラムフェニコール、アミノグリコシド G418、ハイグロマイシンなどに対する耐性、などの多数のマーカーが開発されてきた。利用される特定のマーカーは本発明にとって必須ではなく、特定の宿主および構築の方式に応じて、１つのマーカーまたは別のマーカーが選ばれる。改変された脂肪酸組成を有する種子を産生することができるトランスジェニック植物が得られた後、さらに脂肪酸組成を操作するために、突然変異誘発を含む従来の植物栽培技術を利用することができる。あるいはまた、さらに脂肪酸組成を操作するために、遺伝子操作を介してさらに外来の脂肪酸改変用ＤＮＡ配列を導入することもできる。形質転換の方法は本発明にとって重要でないことに留意すべきである。しかし、遺伝子操作による植物形質転換法の使用、すなわち単一の所望のＤＮＡ配列を挿入する技術、は重要である。従来は、植物油の脂肪酸組成を改変し得る可能性は、植物交配によって有性的に移入することができる特性、または突然変異によって産生される生育し得る特性の導入に限定されていた。異種間遺伝子情報の導入および内因性遺伝子の組織特異的発現の調節手段を可能にする遺伝子操作技術の使用によって、改変された脂肪酸組成を有する植物種子油の製造のための新しい方法を利用することができる。その上、ここに記載する物質材料を応用することによって、新規な植物種子油の開発の可能性がある。植物宿主細胞中での遺伝子操作された植物アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの発現と同時に、対象とする１またはそれ以上の別の配列を転写または転写および翻訳させるように選択してもよい。特に、応用によっては、遺伝子操作された植物アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの発現と組み合わせて、中鎖または非常に長鎖の脂肪酸への活性を有する植物LPAAT タンパク質の発現が望ましい。植物LPAA T をコードする配列については、国際公開公報第 95/27791号を参照されたい。対象とする２以上の核酸配列の複合効果について形質転換された植物を提供しようとする場合、典型的にはそれぞれについて別々の核酸構築物が提供される。上述のように、構築物は転写または転写および翻訳調節制御領域を含んでいる。当業者であれば、対応する発現またはアンチセンス構築物について、上述の原理に一致する最終産物に好適な、所望のタイミングと組織特異性を提供する調節配列を特定することができるはずである。２以上の構築物を利用する場合は、それらの両方が同一の脂肪酸改変配列に関連するかまたは別の脂肪酸改変配列に関連するかにかかわらず、配列間で自然発生する相同組換えを減少させるために、各カセットにおいて異なる調節配列を使用するのが望ましい。構築物は、結果物が両方の特性がゲノム中に組み込まれた植物となるかぎり、従来の植物栽培法を介したトランスジェニツク植物の交配によるその性質の導入を含む、同一のまたは異なる方法によって、宿主細胞中に導入することができる。本発明をここに一般的に記載してきたが、以下の実施例を参照することによって、さらに容易に理解されるであろう。実施例は説明を目的とするためにのみ入れているもので、本発明を限定する目的ではない。実施例実施例１植物アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの配列Ａ．カリフォルニアベイ（Umbellularia californica）カリフォルニアベイのクラスIIチオエステラーゼクローン pCGN3822 のＤＮＡ配列および翻訳されたアミノ酸配列は国際公開公報第 92/20236 号の図１に示されている。ベイチオエステラーゼタンパク質の成熟部分の E.coli 中での発現およびチオエステラーゼ活性の分析の結果、14:0−ＡＣＰに対する幾らかの活性も観察されたが、12:0−ＡＣＰ基質に対するベイチオエステラーゼの強い特異性が明らかになった（Voelker ら(1994)、上述、および本明細書の図２Ａ）。さらに、ベイチオエステラーゼが E.coli fadD細胞中に発現された場合、大量のラウリン酸塩（対照のバックグラウンド値の500 倍以上）および少量のミリスチン酸塩（ラウリン酸塩の量の約10％）が産生される。このベイチオエステラーゼの Bra ssica napus または Arabidopsis thaliana の種子中の発現においても、ラウリン酸塩とミリスチン酸塩の同様の割合が観察される（Voelker ら(1992)、上述）。Ｂ．樟脳（Cinnamomum camphora）ＰＣＲによって産生されたクラスII樟脳チオエステラーゼをコードする領域のＤＮＡ配列および翻訳されたアミノ酸配列は国際公開公報第 92/20236 号の図５Ｂに示されている。逆転写されたｃＤＮＡからＰＣＲによって得られ、樟脳クローンの成熟タンパク質領域を含む、ＤＮＡ断片の配列（配列番号７）を図３に示す。配列は樟脳チオエステラーゼの推定上の成熟タンパク質をコードする領域の開始点に位置する XbaI 部位において開始している。上述の樟脳ＰＣＲ断片をｐＡＭＰベクター中にクローニングし、pCGN5219を生成させる。pCGN5219を XbaI および SalI で消化し、生成した樟脳チオエステラーゼ断片を XbaI および SalI で消化した pBCSK+(Stratagene)中にクローニングし、pCGN5220を生成させる。Pollard ら（Arch.Biochem.& Biophys.(1991)281 :306-312）の記載にしたがって、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を分析するために、E.coli fadD を形質転換するのに、pCGN5220を使用する。8:0，10:0 ，12:0，14:0，16:0，18:0および18:1アシル−ＡＣＰ基質を使用した、樟脳チオエステラーゼクローンのチオエステラーゼ活性のアッセイの結果は、主として 14:0基質に対する基質特異性を示すが、12:0の加水分解活性においてもわずかながら増加が観察される（図２Ｂ）。Ｃ．マンゴスチン（Garcinia mangifera） Stratagene Zap cDNA Synthesis Kit（Stratagene ;La Jolla,CA）に記載された方法を使用して、完熟マンゴスチン果実から取り出した種子から、ｃＤＮＡバンクを調製する。ＲＮＡの単離のために使用したマンゴスチン組織の油分分析はおよそ50％が18:0値であることを示している。熟成度が低いマンゴスチン果実由来の種子の油分分析は20−40％の18:0値を示している。Webb and Knapp（Plant Mol.Biol．Reporter（1990）8:180-195）のCTAB ＤＮＡ単離法を改変することによって、マンゴスチン種子から全ＲＮＡを単離する。緩衝液は下記のとおりである。ＲＥＣ： 50 mM ＴｒｉｓＣｌｐＨ9 、0.7 M ＮａＣｌ、10 mM ＥＤＴＡｐＨ8 、0.5％ＣＴＡＢ。ＲＥＣ＋：使用直前にＢ−メルカプトエタノールを 1％となるように添加。ＲＥＣＰ：50 mM ＴｒｉｓＣｌｐＨ9 、10 mM ＥＤＴＡｐＨ8 、および 0.5％ＣＴＡＢ。ＲＥＣＰ＋：使用直前にＢ−メルカプトエタノールを 1％となるように添加。組織 1 g の抽出のために、液体窒素中で磨砕してホモジナイズした組織に、ＲＥＣ＋ 10 mlおよびＰＶＰＰ 0.5 gを添加する。ホモジナイズした物質を1200 0 rpmで 10 分間遠心分離する。上清をミラクロス(miracloth)を通して冷クロロホルム 3 ml 上に注ぎ、再びホモジナイズする。12,000 RPMで 10 分間遠心分離後、上層を取り、その容量を測定する。同量のＲＥＣＰ＋を添加し、混合物を室温で20分間静置する。この物質を 10,000 rpm で20分間、２回遠心分離し、各回転後、上清を捨てる。ペレットを1 M ＮａＣｌ（ＤＥＰＣ）0.4 ml に溶解し、同量のフェノール／クロロホルムで抽出する。エタノール沈殿後、ペレットをＤＥＰＣ水 1 ml に溶解する。簡単に述べると、ｃＤＮＡ合成のためのクローニング方法は以下のとおりである。ｃＤＮＡの第一の鎖の合成は Robinson ら（Methods in Molecular and Cel lular Biology（1992）3:118-127）に従って改変を少し加えた Stratagene Inst ruction Manualにしたがう。特に、ポリ(A)+ＲＮＡ 5μg に代えて、ＬｉＣｌで沈殿させた全ＲＮＡ約 57μgを使用し、反応物を37℃ではなく45℃で１時間インキュベートした。植物アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの保存領域に対するオリゴヌクレオチドを使用して、マンゴスチンｃＤＮＡからのＰＣＲによって、ライブラリーのスクリーニング用プローブを調製する。以下のオリゴヌクレオチドを使用して、プローブ Garm 2 および Garm 106 を調製した。下記のオリゴヌクレオチドについてのヌクレオチド塩基の略号は以下の通りである。Ａ＝アデニンＣ＝シトシンＴ＝チミンＵ＝ウラシルＧ＝グアニンＳ＝グアニンまたはシトシンＫ＝グアニンまたはチミンＷ＝アデニンまたはチミンＭ＝アデニンまたはシトシンＲ＝アデニンまたはグアニンＹ＝シトシンまたはチミンＢ＝グアニン、シトシンまたはチミンＨ＝アデニン、シトシンまたはチミンＮ＝アデニン、シトシン、グアニンまたはチミン Garm 2 プライマー4874は保存ペプチド V/L/A W/S/Y V/A M M Nの可能なコード配列に対応するように設計されたセンスプライマーである。ここでは１文字のアミノ酸コードを使用し、アミノ酸間の斜線はその位置に対して２以上のアミノ酸が考えられることを意味している。プライマー4875は、ペプチドD/E Y R R E C の可能なコード配列に対応するように設計されたアンチセンスプライマーである。 Garm 106 プライマー5424はペプチド E/D H/R Y P K/T W G Dの可能なコード配列に対応するように設計されたセンスプライマーである。プライマー5577は、ペプチドT E W R K/P K の可能なコード配列に対応するように設計されたアンチセンスプライマーである。上記の反応によって得られたＤＮＡ断片をプローブとして使用するために、クローニングまたはさらなるＰＣＲによって増幅し、ランダムまたは特異的プライミングによって放射性標識する。製造者の指示にしたがって、およそ800,000 のプラークをプレートにまいた。スクリーニングのために、50％ホルムアミド、5X SSC、10X Denhardt's，0.1 % （w/v）SDS，5 mMＮａ₂ＥＤＴＡ，0.1 mg/ml 変性サーモン精子ＤＮＡ中、室温でプラークフィルターをプレハイブリダイズする。上記と同一の緩衝液中、10％ (W/V)硫酸デキストランおよびプローブを添加して、室温で、Garm 2およびGarm 106プローブの混合物とともにハイブリダイゼーションを実施する。Stratagene Zap cDNA Synthesis Kit の指示書の記載にしたがって、プラークの精製およびファージミドの切除を実施した。ＤＮＡ配列決定および／またはＰＣＲ分析によって、およそ90のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼクローンを特定し、チオエステラーゼの型によって分類した。分析したクローンの中で、少なくとも28がクラスＩ（FatA）型で、59がクラス II（FatB）型であった。FatA型クローンの２つのサブクラスが観察され、最も多い型を GarmFatA1と命名し、そして第２のサブクラスは GarmFatA2と命名する。 GarmFatA1 クローン C14-4(pCGN5252)（配列番号８）のＤＮＡおよび翻訳されたアミノ酸配列を図４に示す。FatA2 クローン C14-3（配列番号９）のＤＮＡ配列および翻訳されたアミノ酸配列を図５に示す。図４の Garm FatA1 クローンの E.coli 中の発現のための構築物を以下のように調製する。49番目のアミノ酸(SacI)においてＰＣＲ突然変異誘発によって、制限部位を挿入する。この位置は予測される成熟タンパク質のアミノ末端に近接し、このタンパク質をコードする領域の終止コドン(BamHI)に続いている。成熟タンパク質をコードする領域をSacI/BamHI断片として pBC SK（Stratagene;La Jolla ,CA）中に挿入し、pCGN5247を製造し、これを使用して lacZ 融合タンパク質としてマンゴスチンチオエステラーゼを発現させることができる。 16:0，18:0および18:1アシル−ＡＣＰ基質を使用した、マンゴスチンクラスＩチオエステラーゼクローン GarmFatA1のチオエステラーゼ活性アッセイの結果を以下に示す。 GarmFatA1 クローンはC18:1アシル−ＡＣＰ基質に対して選択的な活性を示すが、Ｃ18:0アシル−ＡＣＰ基質に対しても実質的な活性（18:1活性の約25％）を示す。Ｃ16:0活性については対照細胞の活性よりもわずかに大きな値が観察されただけで、16:0活性は18:1活性のわずか約3 ％を示している。 GarmFatA2 チオエステラーゼの E.coli 中での発現および生成したチオエステラーゼの活性のアッセイは、アシル−ＡＣＰ基質としてＣ18:1に対する選択性が高いことを示している。16:0および18:0アシル−ＡＣＰ基質に対するチオエステラーゼ活性はほぼ等しく、観察された18:1活性の5 ％よりも少ない。Ｄ．Brassica campestris(rapa) Brassica campestris のクラスＩアシル−ＡＣＰチオエステラーゼのＤＮＡ配列および翻訳されたアミノ酸配列は国際公開公報第 92/20236 号（図６）中に提供されている。Ｅ．Cuphea palustrisＣ8/Ｃ10 上記の改変ＣＴＡＢ法を使用して、C.palustris の発芽中の種子から全ＲＮＡを単離する。全ＲＮＡから約 6Ｘ10⁶ pfu を含有するラムダ(lambda)ZipLox(BRL ;Gaithersburg,MD)ｃＤＮＡライブラリーを構築する。Cuphea hookeriana のクラスIIチオエステラーゼクローンCUPH-1(CMT-9)、CUPH-2(CMT-7)およびCUPH-5 (CMT-10)由来のチオエステラーゼをコードする領域を含有する混合プローブを使用して、未増幅のライブラリーから約 500,000プラークをスクリーニングする（これらのクローンのＤＮＡ配列は国際公開公報第 94/10288 号中に提供されている）。以下のような低ストリンジェントハイブリダイゼーション条件を使用する：30％ホルムアミドおよび2ＸSSC（1Ｘ SSC＝0.15 MＮａＣｌ；0.015 M クエン酸Ｎａ）の溶液中、室温でハイブリダイゼーションを実施する。陽性と推定される82のクローンを特定し、その内の30をプラーク精製した。MCT29(CpFatB1)と称するクローン（配列番号10）の核酸配列および翻訳されたアミノ酸配列を図６に示す。このクローンの翻訳されたアミノ酸配列は、主としてＣ8:0 およびＣ10 :0脂肪アシル−ＡＣＰ基質に対する活性を有する、Cuphea hookeriana CUPH-2クローン（国際公開公報第 94/10288 号の図７におけるCMT-7）の配列と約83％の同一性がある。 MCT29 の E.coli 中での発現のための構築物を調製する。ＰＣＲによって、第 114 番目のアミノ酸位置にあると予測される成熟タンパク質のＮ末端の5'に、Sp hIおよびStuI部位を挿入する。成熟Ｎ末端は、ベイチオエステラーゼの成熟タンパク質Ｎ末端として元々同定されていた Leu 84 に対応させることによって予測した。この成熟タンパク質をコードする領域を StuI/XbaI断片として pUC118 中にクローニングし、クローン MCT29LZを生成させ、E.coli中で LacZ 融合タンパク質として C.palustrisチオエステラーゼを発現させるために使用する。MCT29 チオエステラーゼタンパク質を発現するように形質転換された E.coli 細胞のライゼートを、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性についてアッセイした。その結果は、CpFatB1 が、主としてＣ８−およびＣ10−ＡＣＰ基質に対する活性を有し、Ｃ10−ＡＣＰに対するよりもＣ８−ＡＣＰに対して50％高い活性を有するチオエステラーゼ酵素をコードしていることを示している。Ｃ８−ＡＣＰ活性の約 10％のレベルの、Ｃ14−ＡＣＰ基質に対する低い活性も観察される。脂質組成の分析のため、中鎖特異的アシル−ＣｏＡシンセターゼを欠失している E.coli 変異体である、E.coli fadD （Overath ら、Eur.J.Biochem.(1969)7: 559-574）中にも、MCT29LZ を形質転換させる。これらの分析の結果は、C.palus tris MCT29LZ クローンで形質転換された細胞中で8:0 および10:0脂肪酸の産生の実質的な増大があることを示している。密接な関係がある C.hookeriana ChFatB2 クローンもまた、Ｃ8:0 およびＣ10 :0アシル−ＡＣＰ基質に対する選択的な活性を示し、Ｃ8:0 基質に対比してＣ10 :0に対する活性が50％高い。トランスジェニック Brassica 植物の種子中での C hFatB2クローンの発現の結果、種子中のＣ8 およびＣ10脂肪酸の産生が増大し、Ｃ8 レベルよりもＣ10レベルが高い（1994年６月16日出願の同時出願中の SN 08 /261,695参照）。Ｆ．Cuphea palustrisＣ14 別の C.palustrisのクラスIIチオエステラーゼクローン、MCT34(CpFatB2)（配列番号11）の核酸配列および翻訳されたアミノ酸配列を図７に示す。このクローンの翻訳されたアミノ酸配列は Cuphea hookeriana CUPH-4 クローン（国際公開公報第94/10288号の図８におけるCMT-13）の配列と約80％の同一性がある。 MCT34 の E.coli 中での発現のための構築物を調製する。ＰＣＲによって、第 108 番目のアミノ酸位置の予測される成熟タンパク質のＮ末端の5'に、SphIおよびStuI部位を挿入する。この成熟タンパク質をコードする領域を StuI/XbaI断片として pUC118中にクローニングし、クローン MCT34LZを生成させ、E.coli中で LacZ 融合タンパク質として C.palustrisチオエステラーゼを発現させるために使用する。MCT34 チオエステラーゼタンパク質を発現するように形質転換された E.coli 細胞のライゼートを、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性についてアッセイした。その結果は、CpFatB2 が主としてＣ14−ＡＣＰ基質に対する活性を有するチオエステラーゼ酵素をコードしていることを示している。Ｃ14−ＡＣＰ活性の約30％のレベルの、C16−ＡＣＰ基質に対する低い活性も観察される。脂質組成の分析のため、中鎖特異的アシル−ＣｏＡシンセターゼを欠失している E.coli 変異体である、E.coli fadD（Overath ら、Eur.J.Biochem.(1969)7:5 59-574）中にも、MCT34LZ を形質転換させる。これらの分析の結果は、C.palust ris MCT34LZ クローンで形質転換された細胞中の14:0および14:1脂肪酸の産生の実質的な増大を示した。実施例２キメラチオエステラーゼ構築物ベイおよび樟脳チオエステラーゼのｃＤＮＡは両方とも382 のアミノ酸をコードするオープンリーディングフレームを含有している。31のアミノ酸のみが異なっており、その中の半数以上が保存性置換である（図８）。２つの遺伝子間でコドンの使われ方は高度に保存されており、これらが共通の起源であることを示唆している。プラスミド pCGN3823（国際公開公報第 92/20236 号および Voelkerら、(1994 )、上述）は、pBS-（Stratagene;La JoLLa,CA）プラスミドバックボーン中にベイＣ12選択性チオエステラーゼｃＤＮＡの 1.2-kb XbaI断片を含んでおり、第84 アミノ酸（Voelker ら、(1992)上述、中の番号による）位置で開始する成熟ベイチオエステラーゼタンパク質をコードする。ベイチオエステラーゼの第84アミノ酸は、精製タンパク質のアミノ酸配列分析に基づいて、当初、成熟タンパク質のアミノ末端として同定された。しかし、他のクローニングされた植物中鎖アシル −ＡＣＰチオエステラーゼの翻訳されたアミノ酸配列と比較すると、アミノ末端はLeu84 残基よりもさらに上流に位置するらしいことが示される（Jones ら、(1 995)、上述）。上記のプラスミドpCGN5220は、PBC⁺プラスミド（Stratagene）中に挿入された樟脳のＣ14選択性チオエステラーゼのｃＤＮＡのXbaI/XhoI 断片を含んでいる。樟脳ｃＤＮＡ中の XbaI 部位は、ベイチオエステラーゼをコードする領域と同様に、第84アミノ酸残基、ロイシンの位置に存在している。ベイおよび樟脳チオエステラーゼの前駆体をコードする配列の第177 アミノ酸残基における、ベイおよび樟脳の両方のｃＤＮＡクローン中に、保存された独特の Kpn I部位が存在する（図９）。二番目のKpn I 部位は、チオエステラーゼ配列の終止コドンの3'側のプラスミドのポリリンカー内に位置している。pCGN3823 および pCGN5220 間の２つのKpnI断片の交換によって、１つのチオエステラーゼのＮ末端領域がもう一つのチオエステラーゼのＣ末端領域に融合し、２つのキメラ酵素が形成される。キメラ構築物を調製するため、pCGN3823および pCGN5220 をKpnIで消化し、生成した断片をゲル精製し、相手側の起源からのバックボーンプラスミド中にライゲートした。正確な融合構築物を同定するために、ＤＮＡミニ調製および制限消化を使用した。発現および酵素アッセイのために使用したキメラ構築物もまたＤＮＡ配列決定によって確認した。生成したキメラ酵素は、１つのチオエステラーゼのＮ末端からの92のアミノ酸と、もう一方のチオエステラーゼのＣ末端部分からの207 のアミノ酸を含有している。樟脳チオエステラーゼのＣ末端部分を含有する融合タンパク質をキメラ− １（Ch-1）と称し、もう一方の融合タンパク質をキメラ−２（Ch-2）と称する（図９）。実施例３可変性および二次構造の分析コンピュータ解析によって、植物アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの予測二次構造を決定した。二次構造の予測はChouおよびFasmanの方法を基礎としている（ Chouら、(1974)Biochem．13:222-245；Prevelige ら、(1989)Prediction of Pro tein Structure and the Principles of Protein Conformation(Fasman,G.D.ed. )中、pp 391-416,Plenum,New York)；および Garnierら（1978）J.Mol.Biol．12 0:97-120）。 Karplus およびSchulz の可変性の予測方法（Naturwiss.（1985）72:212-213 ）を基礎として、MacVector（International Biotechnologies,Inc.）を使用し、コンピュータ解析によって、植物アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ領域の各種領域の可変性を予測する。実施例４ FatB チオエステラーゼの遺伝子操作Ａ．ベイＣ12チオエステラーゼアミノ酸の置換のために、ＰＣＲ目的部位突然変異誘発（Higuchi ら、(1988) Nucl.Acids Res．16:7351-7367）を使用する。突然変異誘発のために使用するセンス変異プライマーは以下のものである。ここで、太字Ｍ，Ｒ，Ｈ，Ｔ，ＫおよびＱはそれぞれアミノ酸、メチオニン、アルギニン、ヒスチジン、トレオニン、リジンおよびグルタミンの一文字略語であり、変異したヌクレオチドに下線を付けている。ＰＣＲ条件は以下の通りである。94℃で１分間の変性、48℃で30秒の再生、および72℃で２分間の伸長、の５サイクルのＰＣＲをプログラムした。これらの最初の５サイクルに続いて、60℃で30秒の再生を30サイクル実施した。増幅されたＤＮＡをエタノール沈殿によって回収し、ゲル電気泳動によって調べた。次に、このＤＮＡを XbaI および BamHIで消化し、エタノール沈殿させて、XbaI/BamHI で切断した pBCプラスミド中にライゲートした。ライゲーション混合物を使用して、エレクトロポレーションによって Sure 細胞（Stratagene）を形質転換し、形質転換された細胞を、 50 mg/lクロラムフェニコールを含有するLB培地プレート上にまいた。正しいインサートを含有する構築物を、ミニＤＮＡ調製および制限消化によって同定した。変異を確認するために挿入ＤＮＡを配列決定した。変異クローンについて、ＰＣＲプライマーについて使用した名称と同一の名称を使用した。一例として、M197R/R199H は（ベイチオエステラーゼの前駆体の）第197 残基のメチオニンがアルギニンに変更され、そして第199 残基のアルギニンがヒスチジンに変更されたクローンに相当する。同様に、T231K は第231 残基のトレオニンがリジンに変更された変異体を意味する。Ｂ．Cuphea palustrisＣ14チオエステラーゼチオエステラーゼの基質特異性をさらに短い鎖長の脂肪アシル−ＡＣＰ側に変更するために可能なアミノ酸の修飾を決定するため、Ｃ14:0選択性チオエステラーゼの配列をＣ8:0 およびＣ10:0選択性チオエステラーゼの配列と比較してもよい。チオエステラーゼ CpFatB2(Ｃ14)のアミノ酸配列と CpFatB1(Ｃ8/Ｃ10)の比較を図10に示す。これらのチオエステラーゼ配列の中で最も顕著な差異は第230 −312アミノ酸に見られる。H229I，H241N，W253Y，E275A，R290G，F292L，L295F ，およびC304R などの置換を単一−形態、または組合せ−形態で行なうことができる。あるいはまた、Ｃ8/10およびＣ14配列の部分の交換をさせるようなドメインスワッピングクローンを調製してもよい。この点について特に注目されるのは第274 アミノ酸から０まる配列 IEPQFV および第289 アミノ酸から始まる配列 D RKFHKLである。実施例５ベイ変異体およびキメラ酵素の特異性 lacZ発現構築物中で形質転換された E.coli 細胞を30℃で0.6 O.D.₆₀₀まで増殖させ、続いて 1 mM ＩＰＴＧを添加し、30℃で２時間増殖を続ける。沈降した細胞を再懸濁させ、アッセイ用緩衝液中で超音波処理し、アシル−ＡＣＰの加水分解を文献（Davies,H.M.（1993）Phytochemistry 33,1353-1356）にしたがって測定する。 pCGN3823 および pBCで形質転換されたSureな細胞をそれぞれ陽性および陰性対照として使用した。図11は、Ch-1および Ch-2 で形質転換した E.coli 細胞を誘導してアッセイしたときの、キメラベイ／樟脳酵素のチオエステラーゼの特異的活性を示す。Ch-1 について（図11Ａ）、好ましい基質は14:0−ＡＣＰで、一方Ch-2については（図 11Ｂ）12:0−ＡＣＰである。これらの結果は、チオエステラーゼタンパク質のＣ末端部分が基質特異性を決定することを示している。２つのベイ変異体の酵素の特異性を図11Ｃおよび11Ｄに示す。Met197がアルギニンになり、そしてArg199がヒスチジンになっている変異体（M197R/R199H）は、酵素が12:0−ＡＣＰ基質および14:0−ＡＣＰ基質の両方に対して同等に特異的となるように、ベイチオエステラーゼの特異性が変化する結果となっている（図 11Ｃ）。もう一方の変異体、T231K は野性型と同一の活性プロフィールを与える（データは示されていない）。しかし、３つの変異の組合せである、三重変異体、M197R/R199H/T231K は14:0−ＡＣＰ特異的チオエステラーゼ活性を示す（図11 Ｄ）。この三重変異体酵素を高濃度でアッセイすると、非常に低いレベルの12:0 −ＡＣＰ活性が検出される。その他２つの変異体（R327Q およびR322M/R327Q）もまたチオエステラーゼ活性について試験した。両方の変異体はともに同一の活性プロフィールを示し、野性型ベイチオエステラーゼと比較して、12:0−ＡＣＰおよび14:0−ＡＣＰに対する特異的活性がそれぞれ約100 分の一および30分の一に減少する。これらのデータはR327Q の変異が活性の減少をもたらすことを示している。R327Q の活性の減少は、このアミノ酸の位置が活性部位のシステイン、C320に非常に近接しているという事実によるものらしい。C320の触媒活性を証明するための研究を以下のようにして実施した。C320を目的部位変異誘発によってセリンまたはアラニンに変更した。変異体C320A は完全にチオエステラーゼ活性を失ったが、一方C320S は野性型の活性の約60％を残存させていた。活性部位におけるシステインとセリンの交換は動物チオエステラーゼについても証明されている（Witkowski ら、(199 2)J.Biol.Chem．267:18488-18492）。動物においては、活性部位がセリンであり、したがって変更はセリンからシステインに、であった。実施例６ E.coli fadD 細胞中のベイ変異体の発現アシル−補酵素Ａシンセターゼを欠失している菌株である、E.coli脂肪酸分解性突然変異株、K27(fadD88)は、培地中に供給された遊離の脂肪酸を利用することができない（Klein ら、(1971)Eur.J.Biochem．19:442-450）。したがって、脂肪酸分解による妨害をともなわずに、バクテリアの脂肪酸シンターゼに対する組換えチオエステラーゼの影響を観察するためには、これは理想的な宿主である。E.coli fadD はエール大学の E.coli ジェネティックストックセンター（E.co li Genetic Stock Center,Yale University）(CGSC 5478)から入手した。このfa dD細胞を野性型ベイチオエステラーゼ遺伝子のpBC またはその変異構築物のいずれかで形質転換させ、50 mg/mlクロラムフェニコールおよび 1 mM ＩＰＴＧを含有する LB 培地中、30℃で一晩増殖させた。文献（Voelker ら、(1994)上述）にしたがって、全脂質を分析した。これらの分析結果を下記の表Ｉに示す。 fadD細胞中にベイチオエステラーゼが発現された場合、大量のラウリン酸塩（対照バックグラウンド値の500 倍を超える）および少量のミリスチン酸塩（ラウリン酸塩の約10％）が産生される（表Ｉ）。この結果は先の報告（Voelker ら、 (1994)上述）と一致している。fadD細胞中に変異体 M197R/R199Hが発現された場合、蓄積比、12:0対14:0は1 対1.5 に変化し（表Ｉ）、この変異体のチオエステラーゼ特異性を反映している（図11Ｃ）。fadD細胞中に変異体 M197R/R199H/T23 1Kが発現された場合、12:0対14:0の比は野性型ベイチオエステラーゼで見られるものとは完全に逆になった。この結果もまたこの変異体の酵素特異性と一致している（図11Ｄ）。実施例７反応速度論的分析ベイチオエステラーゼに対する変異の影響を洞察するため、基本的な反応速度論および阻害の研究を実施した。アッセイ容量を大きくし、５分毎に 100μl をサンプリングして停止溶液 0.5 ml 中に入れることによって、チオエステラーゼ活性の反応進行曲線を得た。100 mM Tris-ＨＣｌ、ｐＨ8.0 、0.01％トライトン X-100 、1 mM DTT、10％グリセロールを含有する緩衝液中、30℃で反応速度論アッセイを実施した。各反応混合物をジメチルエーテル 2.0 ml で抽出した後、有機画分 900μl 中の放射能を液体シンチレーションカウンティングによって測定した。この操作によって、有機および水性画分の界面の妨害をともなわずに、抽出し得る全遊離（¹⁴Ｃ−標識）脂肪酸の正確な測定が可能となる。このアッセイにおいて、ラウリン酸塩およびミリスチン酸塩の産生は、時間に関しては少なくとも30分まで、そして酵素濃度に関しては 1 mU までは直線性であった。すべてのアッセイを二回ずつ実施した。Bio-Metallics,Inc.の反応速度論用ソフトウェア（Ｋ_cat）を使用して、初速度データを以下の等式にあてはめた。：拮抗阻害については、Ｖ＝Ｖ_maxＳ／［Ｋ_m,app（１＋Ｉ／Ｋ_is）＋Ｓ］；非拮抗阻害については、Ｖ＝Ｖ_maxＳ／［Ｋ_m,app（１＋Ｉ／Ｋ_is）＋Ｓ（１＋Ｉ／Ｋ_ii）］；および不拮抗阻害については、Ｖ＝Ｖ_maxＳ／［Ｋ_m,app＋Ｓ（１＋Ｉ／Ｋ_ii）］；式中、Ｖは速度；Ｖ_max は最大速度；Ｓは基質濃度；Ｋ_m.app は見かけのミカエリス定数；Ｋ_isおよびＫ_iiはそれぞれ勾配阻害定数およびインターセプト阻害定数(intercept inhibition constant)；Ｉは阻害剤濃度、である。これらの分析の結果を下記表IIに示す。同一の実験条件下において、ベイチオエステラーゼおよび三重変異体 M197R/R 199H/T231Kは、14:0−ＡＣＰについて同様のＫ_m,app 値を有している。この変異体の12:0−ＡＣＰに対する特異的活性は非常に低いので、我々のアッセイシステムでは有意な速度論的パラメーターを得ることができない。それでも、これらの結果は、この変異によってこの変異体酵素に対する基質（14:0−ＡＣＰ）の結合親和性が有意に増加しないことを示している。基質（¹⁴Ｃ標識14:0−ＡＣＰ）と拮抗させるための冷した12:0−ＡＣＰを使用して、上記の条件下で阻害アッセイを実施した。これらのアッセイの結果を下記の表III に示す。これらの阻害アッセイにおいて、野性型および変異体酵素間できわめて類似した結果が見られる。アッセイ中、同量の阻害剤（12:0−ＡＣＰ）および基質（14 :0−ＡＣＰ）が存在する場合、14:0−ＡＣＰＴＥ活性は約50％減少する。12:0 −ＡＣＰの量が14:0−ＡＣＰの量の５倍の時は、14:0−ＡＣＰＴＥ活性は75％よりも大きく減少する。以前に観察された結果（Pollard ら、上述）と一致して、野性型ベイＴＥについてのものと同様な反応速度論機構が使用される。すなわち、12:0−ＡＣＰおよび14:0−ＡＣＰの両方が同様のＫmを有するが、Ｖ_maxは12 :0−ＡＣＰの方がずっと優勢である。これらのデータは、変異体酵素の特異性はアシル加水分解段階で確定する、つまり12:0−ＡＣＰおよび14:0−ＡＣＰの両者が同様の親和性で変異体酵素に結合することができるけれども、14:0−ＡＣＰの方がずっと高い割合で切断されることを示唆している。この結果は、12:0−ＡＣＰが14:0−ＡＣＰに対する拮抗阻害剤であることを示す阻害反応速度論（Ｋ_i値がそれぞれ野性型および変異体酵素について10.2＋1.2 μM および11.6＋0.2 μ M である（表II））によってさらに支持される。このように、12:0−ＡＣＰは野性型および変異体酵素の両方において14:0−ＡＣＰに対する確実な拮抗阻害剤であるので、ベイチオエステラーゼに関して述べたアミノ酸の置換は明らかに基質結合部位に直接には影響していない。実際に、ミカエリス定数はベイチオエステラーゼおよび遺伝子操作されたベイ酵素に関して同様であり、また基質の長さに無関係であり、特異性の大部分がアシル加水分解段階において決定されることを示唆している。基質（アシル−ＡＣＰ）は比較的大きな分子である（ＡＣＰのＭ_rは約 9 Kd）ので、植物チオエステラーゼはおそらく非常に弛緩した結合ポケットを有していると思われる。しかし、これらの酵素は脂肪酸の鎖長または構造（すなわち二重結合の存在または不存在）に関しては高い選択性を有している。さらに、天然ベイチオエステラーゼのトリペプチド、Met-Arg-Arg は12:0−ＡＣＰに対する選択性に関する唯一の決定因子ではない。なぜならば、このトリペプチドは別の中鎖特異的チオエステラーゼにおいても共通して見られるからである。したがって、遺伝子操作されたベイチオエステラーゼにおける変化は、Baci llus stearothermophilus 乳酸デヒドロゲナーゼの表面ループが修飾された時に観察されたもの（El Hawraniら、(1994)Trends in Biotech.12:207-211）と同様に、ある二次構造をわずかに変更するだけのようである。タンパク質における鎖の可変性の予測（Karplus ら、(1985)Naturwiss.77,212-213）によれば、M-R-R からR-R-H へのトリペプチドの変更は、このトリペプチドのすぐ後のβ−構造の可変性を減少させたものと見られる。これが基質結合ポケットおよび活性部位の可変性の減少を導くのかも知れない。実施例８ FatAチオエステラーゼの遺伝子操作 FatAまたはクラスＩ型チオエステラーゼの改変の一例として、マンゴスチン G arm FatA1 クローンのチオエステラーゼ酵素特異性の変更を提供する。FatAチオエステラーゼについての望ましい改変としては、Ｃ18:1またはＣ16:0脂肪アシル −ＡＣＰ基質に対する活性に比べてＣ18:0脂肪アシル−ＡＣＰに対する活性が増大するような基質特異性の変更が挙げられる。例えば、Ｃ18:0などの飽和脂肪酸に対する相対活性を増大させるために、主として飽和脂肪酸に作用するクラスIIチオエステラーゼの対応する領域と異なっている、クラスＩチオエステラーゼの領域における突然変異が有効なようである。ベイチオエステラーゼの遺伝子操作実験のデータによれば、第229 から第285 （図１の共通配列の最上段の番号）アミノ酸の領域がチオエステラーゼの基質結合において重要であることが示される。この領域のアミノ酸配列の比較によると、第250-265 アミノ酸の高度に保存された領域において、FatBチオエステラーゼに比較してFatAにおいて、いくつかの荷電アミノ酸が異なっていることが示される。FatAチオエステラーゼにおいて、二、三の例外はあるが、第261 アミノ酸が陰性荷電しており、一方現在までに分析されたFatBクローンにおいては、第261 アミノ酸は大部分が陽性荷電である。また、FatAチオエステラーゼにおいて、今日までに研究されたすべてのFatAについて第254 アミノ酸が陽性荷電であるが、今日までに分析されたFatBクローンにおいては、すべてについて第254 アミノ酸は荷電を持たないアミノ酸である。このように、これらの位置におけるアミノ酸の荷電の変化が基質選択性の変化を導くようである。ベイチオエステラーゼ配列の改変について記載した方法と同様のＰＣＲ目的部位突然変異誘発を使用して、マンゴスチンの FatA1の第261（図１の共通番号）アミノ酸における FatA ＴＥ変異体、D261K を産生させる。変異体 D261Kのチオエステラーゼ活性を上記（Davies,H.M.(1993)、上述）のように測定する。これらの分析の結果（図12）は、18:1の選択性に対する18:0の選択性は野性型 Garm FatA1 において25％（18:0／18:1）であるのに比較して、変異体 D261Kにおいては35％であったことを示している。野性型および変異体 Garm FatA1 クローンの両者ともに16:0に対する活性は非常に低く、Ｃ10:0からＣ14:0までのような中鎖長基質に対しては活性を示さない。上に示した D261K変異とともに第 254アミノ酸をリジンからバリンに変更する変異をしている、さらに別の Garm FatA1 変異体を調製した。この変異体、K254V/D261K は18:0／18:1比が40％に増大した。これらの結果は、この領域の修飾によって酵素活性および特異性を変化させることができるというベイの事実をさらに支持している。さらなる特異性の改変の評価のため、 Garm FatA1 クローンをさらに FatB チオエステラーゼの構造に近付ける改変をするために、三重変異体、G249T/K254V/D261K を構築中である。この18:0について強化された Garm FatA1 チオエステラーゼのアミノ酸配列を、主として18:1基質に対する活性を有し、18:0基質に対してはほとんどまたは全く活性を有していない、ある FatA クローンのアミノ酸配列と比較することによって、マンゴスチン Garm FatA1 クローンのその他の望ましいアミノ酸修飾を選択することもできる。Garm FatA1のアミノ酸配列と18:1選択性の Brassica camp estris(rapa)由来のあるチオエステラーゼクローン、Br FatA1のアミノ酸配列の比較を図13に示す。ベイチオエステラーゼについて証明された、予測されるβ− シートおよびターン（図13のマンゴスチンおよび Brassica チオエステラーゼの比較における G169 および G172 アミノ酸によって固定）に続く領域における結合基質の変更から見て、この領域もまたマンゴスチンチオエステラーゼクローン、Garm FatA1の基質特異性の変更の標的である。マンゴスチンおよび Brassica rapaのクラスＩチオエステラーゼの二次構造分析およびアミノ酸配列の比較の結果、マンゴスチンチオエステラーゼ、Garm FatA1の基質特異性をさらに変更するために、いくつかの標的変異部分が特定される。標的アミノ酸としては Y182V、 Q186 E、D209S、V210D および H219Fが含まれる。さらに、Garm FatA1の第241 および第293 アミノ酸（図４中の番号）位置の独特の制限部位、BglII およびSpeIは、マンゴスチンチオエステラーゼの第242 および第293 アミノ酸（図４中の番号）の間の領域の好都合なドメインスワッピングを提供する。この領域は、突然変異誘発および生化学的アッセイによって同定された、ヒスチジン248 およびシステイン283 の両方の活性部位アミノ酸を含んでいる。こうして、マンゴスチンチオエステラーゼの活性部位の主要な部分を除去し、他のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ由来の対応する領域（ＰＣＲ増幅によって得ることができる）と置換することもできる。こうした方法によれば、特異的活性が高いベイチオエステラーゼクローン、Uc FatB1の活性部位と置換することによって、マンゴスチンチオエステラーゼの特異的活性を増大させるなど、さらなるアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性の改変ができる。実施例９ドメインスワッピング技術好都合な制限部位が利用できない場合のチオエステラーゼのドメインスワッピング構築物の調製方法を提供する。短ドメインスワッピングの方法を図14に図示する。２つの別々のＰＣＲの結果、２つの断片（プライマーａ＋ｄ、およびプライマーｂ＋ｃ）を形成させる。この断片は新しいドメインと同一の重複配列を含有する。プライマーｃおよびｄを、元来のドメインの3'末端下流に等しい配列に加えて新しいドメイン配列に相当する5'オーバーハングをつなぎ合わせるように合成する。つなぎ合わせる配列の長さは50℃またはそれ以上のＴ_m（ＣまたはＧ＝４℃およびＴまたはＡ＝２℃と仮定して計算）を与えるのに十分長くすべきである。理想的には、5'オーバーハングの長さは18塩基（６アミノ酸）を超えないものにすべきである。ただし、もっと長いオーバーハングでも有効性は低いが作用する。下記のＰＣＲ条件下で約 0.2μM のプライマーおよび 0.1μg の鋳型ＤＮＡを使用して、最初の２つのＰＣＲを実施する。ＰＣＲ１および２の各産物 10μlを混合し、プライマーａおよびｂを最終濃度が 0.2μM になるように添加して、２番目のＰＣＲ過程（ＰＣＲ３）を実施する。こうして得られる産物は新しいドメイン配列で置換された元来のドメインを有する標的遺伝子である。ＰＣＲ産物を沈殿させ、サブクローニングのために制限消化する前に、アガロースゲル上で調べるのもよい。所望の変異を確かめるために、修飾ＤＮＡ断片は配列決定すべきである。比較的長いドメインのスワッピングのためには、図15に図示するように、ＰＣＲ１，２および３からの３つの断片を最初に増幅することによって、遺伝子IIから遺伝子Ｉへのドメインの交換が達成される。その後、プライマーａおよびｂによる次のＰＣＲのために、これらの部分的に重複した断片を混合する。得られる完全長生成物は遺伝子II由来の新しいドメインを有する遺伝子Ｉである。同様の原理によって、最初の過程においてＰＣＲを追加し、続く４つの断片の存在下での第２のＰＣＲによって、２つのドメインを同時に遺伝子Ｉ中にスワッピングすることができる（図示されていない）。結果が良好であったＰＣＲ条件は以下の通りである：94℃で１分間の変性、48 ℃で30秒の再生、および72℃で２分間の伸長、の５サイクルのＰＣＲをプログラムした。これらの最初の５サイクルに続いて、60℃で30秒の再生にした他は同一のプログラムを使用して、30サイクル実施した。最初の５サイクルをより低温で実施する根拠は、5'オーバーハングを有するＰＣＲプライマーのアニーリングを確実にするためである。後期のサイクルにおいて温度を上昇させると、その後の増幅が最初の５サイクル中に増幅された配列に限定される。全プライマーについてのＴ_mを60℃付近に設定すべきである。それに続くクローニングの便宜のため、完全長アンカープライマー（ａおよびｂ、図14および15）には通常、種々のＰＣＲサブクローニングベクターのためのその他の制限部位および／またはオーバーハングが含まれる。非突然変異バックグラウンド値を減少させるために、できるだけ少量（通常 0.1μgより少量）の鋳型ＤＮＡを使用することが重要である。上の結果は、変更された基質特異性を有する遺伝子操作されたチオエステラーゼを産生するような、植物アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ配列の修飾の可能性を証明している。こうしたチオエステラーゼは宿主細胞中で発現されて、その遺伝子操作されたチオエステラーゼを供給し、そして脂肪酸合成の在来の経路を新規な組成の脂肪酸が得られるように改変することができる。特に、遺伝子操作されたチオエステラーゼは脂肪種子植物の種子中に発現されて、望ましいＴＡＧ分子の天然の原料を提供することができる。この明細書中に言及したすべての出版物および特許出願は、この発明が属する分野の当業者の技術水準を示している。すべての出版物および特許出願は、各出版物および特許出願が特別に、そして個別に参照として組み込まれると文中で示したように、同程度に参照としてここに組み込まれる。前記の発明を、理解を明確にする目的で、図示および実施例によってある程度まで詳細に記載してきたが、特許請求の範囲の範囲内で、ある程度の変更および改変が可能であることは明らかであろう。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Genetic manipulation of plant thioesterase and plant thio with novel substrate specificity Esterase disclosure Technical field The present invention provides proteins, nucleic acid sequences and constructs, and methods related thereto. It is targeted. Introduction background Fatty acids are organic acids having a hydrocarbon chain of about 4 to 24 carbon atoms. Chain length, and Many types of fatty acids are known that differ from each other in the presence, number and location of double bonds. Have been. In cells, fatty acids typically exist in a covalent form, The sil moiety is called a fatty acyl group. The chain length and saturation of these molecules are often For example, it is represented by the formula CX: Y. Here, “X” means the number of carbons, and “Y” is a double bond. Means the number of cases. The production of fatty acids in plants is determined by the enzyme, β-ketoacyl-ACP, in the plastids. Of acetyl-CoA and malonyl-ACP catalyzed by synthase III The reaction starts with the production of butyryl-ACP. Acetyl-ACP 16- and Extension to 18-carbon fatty acids involves a reaction circuit of the following sequence: Formation of β-ketoacyl-ACP from 2-ACP by condensation of 2-carbon units (β- Ketoacyl-ACP synthase), reduction of keto group to alcohol (β-ketoacid -ACP reductase), formation of enoyl-ACP by dehydration (β-ketoacid -ACP dehydrase), and finally the extension of enoyl-ACP by reduction. Formation of saturated acyl-ACP reductase (enoyl-ACP reductase). β-ketoa Syl-ACP synthase I catalyzes extension to palmitoyl-ACP (C16: 0) On the other hand, β-ketoacyl-ACP synthase II replaces the last stearoyl-ACP ( Catalyzes elongation to C18: 0). The longest chain fatty acids produced by FAS are typical It typically has 18 carbon atoms. Subsequent fatty acid biochemical steps occurring in plastids Is a stearoyl-AC in a reaction catalyzed by a Δ-9 desaturase. Oleoyl-ACP (C18: 1) formation by desaturation of P (C18: 0). This Is highly active against stearate, 18-carbon acyl-ACP, "It is also called stearoyl-ACP desaturase. Carbon chain elongation in plastids leads to transfer of acyl group to glycerol 3-phosphate Thus, it can be stopped, resulting in a "prokaryotic" lipid biosynthesis pathway in plastids. Glycerolipids remain. Alternatively, new specific thioesterases Hydrolyzes acyl-ACPs produced to free fatty acids and ACP This can also block prokaryotic pathways. Subsequently, the free fatty acids are converted to fatty acyl-CoA in the plastid envelope. Is then released into the cytoplasm. So these are phospholipids, triglycerides and "Eukaryotic" Lipid Biosynthetic Pathway in the Endoplasmic Reticulum Involved in the Formation of and Other Neutral Lipids It is taken in. Following transport of the fatty acyl-CoA to the endoplasmic reticulum, triglycera Consecutive steps of id production may be initiated. For example, by the action of membrane-bound enzymes As a result of continuous desaturation of oil acyl groups, such as linoleoyl or linolenoyl Of polyunsaturated fatty acyl groups are produced. Triglycerides are 1-, 2-, and And 3-acyl-ACP transferase enzyme, glycerol-3-phosphate Syltransferase, lysophosphatidic acid acyltransferase and And diacylglycerol acyltransferase. The fatty acid composition of some plant cells is the result of acyltransferase activity. Of fatty acids and fatty acids (fatty acyl groups) incorporated in triglycerides It is a reflection. Some triglycerides have different properties in the triglyceride molecule. Depends on the diverse composition of the fatty acyl group at the position. For example, fatty acyl groups are mostly If it is a partially saturated fatty acid, the triglyceride will be solid at room temperature. But in general Vegetable oils tend to be mixtures of various glycerides. Therefore, trig The properties of celide oil are the result of the combination of the triglycerides that make up the oil, They are also affected by their fatty acyl composition. Plant acyl-acyl supported protein thioesterases are involved in fatty acid synthesis. Given biochemical interest due to its role and usefulness in plant engineering oil seeds in biotechnology I have. California bay tree (California bay tree), Umbellularia califo rnica medium-chain acyl-ACP thioesterase has been isolated (Davies et al., (1991) Arc h. Biochem. Biophys. 290: 37-45), whose cDNA has been cloned and In Coli (Voelker et al. (1994) J. Bacterial. 176: 7320-7327) and Arabidops is thaliana and Brassica napus seeds (Voelker et al., (1992) Science 25 7: 72-74). In all cases, large amounts of laurate (12: 0) and A small amount of myristate (14: 0) accumulated. These results indicate that de n ovo Role of TE in determining chain length during fatty acid biosynthesis, and species in higher plants The utility of these enzymes for modifying child oil composition has been demonstrated. Recently, a number of cDNs encoding various plant acyl-ACP thioesterases have been identified. A was cloned (Knutzon et al. (1992) Plant Physiol. 100: 1751-1758; Voe lker et al. (1992) supra; Dormann et al. (1993) Planta 189: 425-432; Dormann et al. (1992) 4) biochim. Biophys. Acta 1212: 134-136; Jones et al. (1995) The Plant Cell 7:35 9-371). Sequence analysis of these thioesterases shows high homology and In other words, it means the identity of structure and function. These thioesterase cDNAs Some are expressed in E. coli and these substrate characteristics are determined by in vitro assays. The isomerism was determined. These enzymes have significant sequence homology but different substrates The fact that it exhibits specificity means that few amino acids are needed to alter substrate selectivity. Means that it is enough. Minor differences in structure and function between these plant thioesterases Only information is available and the tertiary structure of any plant thioesterase has not yet been determined. Not in. Protein engineering understands thioesterase substrate recognition and catalytic mechanisms Has proven to be a powerful tool for It is likely that a rational design of novel enzymes with isomerism will be guided. These new Enzymes can be used in plant biotechnology to modify various fatty acyl compositions, especially medium chain fats. An acyl group (C8 -C14) and a longer chain fatty acyl group (C16 or C18). Find use for the production of vegetable oils having a significant proportion of the desired fatty acyl groups. Should be done. In addition, to provide a variety of oils with a wide range of uses It is also desirable to adjust the ratio of various fatty acyl groups present in seed storage oil. . Literature Phosphotransferase in yeast (Hjelmstad et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 2 0995-21002) and the restriction endonuclease of Flavobacterium (Kim et al. 4) To study the structure and function of Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91: 883-887) A strategy using a chimeric gene product has been applied. In protein engineering, to rearrange the functional domains of a protein, Main swapping was used (Hedstrom (1994) Current Opinion in Struc tural Biology 4: 608-611). Recently, the structure of myristoyl-ACP thioesterase from Vibrio harveyi was (Lawson et al. (1994) Biochemistry 33: 9382-9388). This thioester Lase is, like other bacterial or mammalian thioesterases, a plant thioesterase. It has no sequence homology to the lase (Voelker et al. (1992) supra). Description of the drawings FIG. Representative class I (FatA) and class II (FatB) thioesterases 1 provides an alignment of amino acid sequences. UcFatB1 (SEQ ID NO: 1) I C14 thioesterase. CcFatB1 (SEQ ID NO: 2) is camphor C14 thioester Rase. CpFatB1 (SEQ ID NO: 3) is for Cuphea palustris C8 and C10 Oesterase. CpFatB2 (SEQ ID NO: 4) is Cuphea palustris C14 thio Esterase. GarmFatA1 (SEQ ID NO: 5) is a C18: 0 acyl-ACP substrate It is also a mangostin 18: 1 thioesterase with considerable activity. BrFatA 1 (SEQ ID NO: 6) is an 18: 1 thio from Brassica rapa (aka Brassica campestris) Esterase. Identical amino acids in all thioesterases shown The acid sequence is shown in bold white outline. FIG. Wild-type bay (FIG. 2A) and wild-type camphor (FIG. 2B) expressed in E. coli 2) shows the thioesterase activity assay for thioesterase. FIG. Mature protein portion of camphor class II acyl-ACP thioesterase Of the nucleic acid and translated amino acid of the PCR fragment (SEQ ID NO: 7) containing the region encoding Provide an array. FIG. Mangosteen class I acyl-ACP thioesterase clone (Ga rmFatA1) nucleic acid and translated amino acid sequences (SEQ ID NO: 8) are provided. GarmFat A1 shows mainly thioesterase activity on the 18: 1 acyl-ACP substrate, It also shows considerable activity against the 18: 0 substrate (about 10-20% of the 18: 1 activity). FIG. Mangosteen class I acyl-ACP thioesterase clone, Ga Nucleic acid and translated amino acid sequence of rmFatA2 (SEQ ID NO: 9) is provided. GarmFatA 2 mainly has thioesterase activity on the 18: 1 acyl-ACP substrate, And 18: 0 substrates show comparable low activity. FIG. Cuphea with selective activity on C8 and C10 acyl-ACP substrates palustris class II acyl-ACP thioesterase clone (CpFatB1) The nucleic acid and translated amino acid sequences (SEQ ID NO: 10) are provided. FIG. Cuphea palustri having selective activity on C14 acyl-ACP substrate s class II acyl-ACP thioesterase clone (CpFatB2) And the sequence of the translated amino acid (SEQ ID NO: 11). FIG. Bay (C12) (SEQ ID NO: 1) and camphor (C14) (SEQ ID NO: 2) acyl -Provides a comparison of the amino acid sequences of ACP thioesterase. This thioestera Amino acid residues that differ between the enzymes are indicated by open shading. FIG. Frame of N- and C-terminal portions of thioesterase (from left to right) The bay / camphor chimera constructs, Ch-1 and Ch-2, are shown as internal fusions. Texture 2 shows the KpnI site used to construct the construct. FIG. C.Palustris CpFatB1 (C8 / C10) (SEQ ID NO: 3) and C.Palustris Amino acid sequence of CpFatB2 (C14) (SEQ ID NO: 4) acyl-ACP thioesterase Provides column comparison. Amino acid residues that differ between the thioesterases Indicated in bold. FIG. Substrates for Bay / Camphor Chimera Enzyme and Two Bay Mutant Thioesterases Provides specificity (black columns). Control (E.coli transformed with vector only) Background activity is indicated by hatched columns. (A) Ch-1, (B) Ch-2, (c) Bay mutation M197R / R199H and (D) Bay mutant M197R / R199H / T231K. Figure 12. Wild-type (5247) and 18: 1, 18: 0 and 16: 0 acyl-ACP substrates. And mutant Garcinia mangifera thioesterase (GarmFatA1) thioestera Provide the activity ratio of the enzyme. FIG. B.rapa BrFatA1 (C18: 1) (SEQ ID NO: 6) and Garcinia mangifera GarmFatA1 (C18: 1 / C18: 0) (SEQ ID NO: 5) Acyl-ACP thioesterase 5 provides a comparison of the amino acid sequences of Amino acids that differ between thioesterases Noic acid residues are shown in bold white outline. FIG. Short domain swapping by PCR. Two full lengths of gene Shown by line. The shaded portion indicates the target domain. Each PCR primer (a, b, c For and d), the tip of the arrow indicates the 3 'end. Primers a and b are D Forward and reverse primers for NA full length. Thin lines of primers c and d Represents a sequence in which the 3 'downstream domain is exactly matched. Thickness of primers c and d The tail is a 5 'overhang corresponding to the novel domain sequence. FIG. Long domain swapping by PCR. Using gene I as template Perform two PCRs (PCRI and 2). Using gene II as template And simultaneously perform the third PCR. Primers a and b correspond to the full length of gene I. Forward and reverse primers. Primer c is the first domain of gene I It corresponds to the sequence immediately downstream of 3 '. The thin line of the primer d The sequence corresponding 3 'downstream of the domain represents the sequence, while the thick tail represents the gene replacement gene II site. Matches the main 3 'terminal sequence. Primer e is the 5 'end of the domain of gene II Lead, while f leads the other end. The thin tail of primer f is left Represents the sequence corresponding 3 'downstream of the original domain of gene I. Summary of the Invention According to the present invention, production of a genetically engineered plant acyl-ACP thioesterase A fabrication method is provided. Here, this genetically engineered plant acyl-ACP thioes Terase is an acyl-ACP that is hydrolyzed by its plant thioesterase. With respect to the substrate, an altered group as compared to the native acyl-ACP thioesterase Shows quality specificity. These methods include (1) one or more modified thioesters A plant thioesterase for the purpose of modifying it to produce a ze gene sequence Modifying the gene sequence encoding the protein (the modified sequence is And / or insertion of one or more amino acid residues in the mature part of the plant thioesterase Coding for an engineered acyl-ACP thioesterase with an insertion or deletion (2) expressing the modified coding sequence in a host cell, wherein Steps in which a genetically engineered plant thioesterase is produced, and (3) substrate characteristics This genetically engineered plant is used to detect those with the desired alteration in the opposite sex. Assaying for thioesterase. Of particular interest among the amino acid changes are the C-termini of plant thioesterases From the plant thiol, and more specifically, the plant thiols shown in the sequence alignment diagram of FIG. A region corresponding to amino acids 229-285 (common number above the sequence) of the esterase sequence It is. In addition, the 285-312 amino acid region is C8 of thioesterase substrate specificity. And C10 and other short-chain fatty acids. Efficient information regarding potential modification positions in the thioesterase of interest The report was based on a comparison of the amino acid sequences of related plant acyl-ACP thioesterases. Is obtained. The thioesterases compared here exhibit different hydrolytic activities It is. Plants with at least 75% sequence identity in the mature protein region In this case, it is particularly effective to compare the amino acid sequences of thioesterases. In this method, amino acid residues that differ in the relevant thioesterase The groups or peptide domains may be selected for mutagenesis. Other methods for selecting amino acids or peptide domains for modification As variability and / or secondary structure of the thioesterase of interest Thioesterase proteins with respect to the predicted effects of substitutions, insertions or deletions Analyzing the sequence is included. In addition, random bursts of sequences encoding plant acyl-ACP thioesterase Thioesterase activity to detect mutations and subsequent changes in substrate specificity Or analysis of fatty acid composition to find useful thioesterase gene variants It is good to do. To produce a genetically engineered thioesterase, the thioesterase Introducing amino acid sequence substitutions, insertions or deletions in the DNA sequence encoding Domain swapping or random or targeted mutations It can be changed by induction. This DNA sequence is then Expressed, thereby producing an engineered thioesterase, The composition of the fatty acids formed is analyzed. Engineered thio produced by this method Esterases are amino acid sequence modifications that affect the substrate specificity of thioesterases. The effect is also assayed. In this method, the acyl-AC that can be hydrolyzed In terms of the carbon chain length of the P substrate or for acyl-ACP substrates of different carbon chain length New thioesterases that show various aspects in terms of thioesterase specific activity Will be able to discover. Thus, the DAN sequence and the expression of the engineered thioesterase And constructs, and also novel thioesterases made therefrom, It is within the scope of the invention described herein. These DNA sequences alter fatty acid composition Used to express the engineered thioesterase in the host cell to Can be used. Of particular interest in the present invention are plant cells, especially seeds. For expression of genetically engineered thioesterase in seed cells of oil crops DNA construct. As a result of the expression of these constructs, plant triglyceride oils Manufactured, where the composition of this oil depends on its genetically engineered thioesterase. Reflects altered substrate specificity. Thus, the plant containing the construct provided herein Product cells, seeds and plants, along with new vegetable oils harvested from the plant seeds, All fall within the scope of the present invention. For example, the C12 selective plant acyl-ACP thioesterase described herein has To be a plant thioesterase with approximately equal activity for 14 and C12 Can be changed to This C12 enzyme is further modified to provide a C12 A thioesterase with greater activity for 14 is obtained. In the present invention, Cuphea palustris and mangosteen (Garcinia mangifer A novel plant acyl-ACP thioesterase sequence from a) is also provided. This C. palustris sequence, CpFatB1, is associated with C8 and C10 fatty acyl-ACPs. Substrate activity and higher activity for C8. Mangosteen thioestera The Garse gene, GarmFatA1, mainly shows activity against 18: 1-ACP substrate, It also shows substantial activity against 18: 0-ACP. Importantly, this clone is 16: 0 It does not show specificity for the substrate. These new C8 / C10 and C Methods for altering the specificity of 18: 1 / C18: 0 plant thioesterases are also contemplated by the present invention. Provided. In particular, a sudden increase in the 18: 0/18: 1 activity ratio of mangosteen clones. Mutations are provided. Detailed description of the invention According to the present invention, a genetically engineered plant thio with an altered substrate specificity A method for producing an esterase is provided. The genetically engineered plant of the present invention Oesterases include fatty acyl-ACP groups under conditions where plant enzymes can react. Obtained from plant sources that exhibit the ability to catalyze the production of free fatty acid (s) from food Any sequence of amino acids such as proteins, peptides or peptide fragments that can be included. “Conditions under which the enzyme can react” may allow the enzyme to function in a certain environment. Any requirements (ie temperature, pH, lack of inhibitory substances, etc.) ) Means available. Genetically engineered plant thioesterases Coating a thioesterase to produce a substitution of one or more amino acids. Can be prepared by random or specific mutagenesis of the sequence You. Alternatively, for domain swapping between related plant thioesterases Thus, a genetically engineered plant thioesterase can be prepared. this is A large region of the natural thioesterase-encoding sequence can be combined with another plant thioestera Replace with the corresponding region from the ISE. 5 or 6 to 10 amino acids in length for domain swapping Are included. In an ideal case, this type of exchange would code both proteins The presence of a unique conserved restriction site at the exact location of the exchange in the transgene Therefore, it can be implemented. Excessive oligo-based mutagenesis (looping) It takes time to exchange large domain sequences. This process can be applied when restriction sites are not available. Or Also described by Horton et al. As described in the Examples below (BioTechniq ues (1990) 8: 528-535) An overlap extension method using the polymerase chain reaction (PCR). A quick method for domain swapping, which is a modification of the method, can be applied You. The entire procedure was performed for 6 hours (not including two in vivo runs) without in vivo procedures. Hours). The basic principle for the overlap extension method is PCR In, the primers must match the sequence of the template enough to take the lead However, it is not necessary to strictly match, especially in the 5 'end direction. In fact, 5 'oh PCR primers with bar hangs (non-matching sequences) are commonly used. PCR Domain swapping is based on amino acids whose domain is about 6 or less amino acids (Short domain swapping) or contains much more amino acids Applicable when the domain to be replaced has to be exchanged (long domain swapping) Designed to be. The altered substrate specificity of the engineered thioesterase is Acyl-ACP of a specific chain length that is not hydrolyzed by a sterase enzyme Reflected by the presence of hydrolytic activity on the substrate. Newly recognized acyl -ACP substrates include shorter or longer carbon chain lengths (typically one or more (As reflected by the addition or deletion of two-carbon units) May have a lower degree of saturation, or may be of some type not normally present in plant cells. The presence of methyl groups in fatty acids, i.e. in iso and antiiso fatty acids, etc. Are different from the natural substrate of the enzyme in various aspects. There Alternatively, the altered substrate specificity may be two or different in chain length and / or saturation. Reflected as modification of the hydrolysis ratio for more acyl-ACP substrates There is also. DNA and amino acids for over 30 plant acyl-ACP thioesterases Acid sequence information is currently available and has been genetically engineered in the methods of the invention. Desirable regions for modification to produce thioesterase expressing sequences These sequences may be used for identification. Plant thioesterases can be divided into two classes based on sequence homology. it can. All of these plant thioesterases need to target plastids , Containing a transit peptide 60-80 amino acids in length. This transit The peptides show little homology between species, while the mature protein region (trans The region excluding the jet peptide) shows significant amino acid sequence identity. The first class, class I (or FatA), is primarily for 18: 1-ACP Long-chain acyl-ACP thioesterases having high activity. 18: 1-ACP Is a major feature found in phospholipids and triglycerides synthesized by the eukaryotic pathway. It is the immediate precursor of some fatty acids. This class of thioesterases is essentially Biosynthesis of membranes has been found in all plant sources examined to date Essential “housekeeping” enzyme required for (Supra)). Primarily for 18: 1-ACP substrate Safflower, Cuphea hookeriana and Brassica rapa (campest ris) have been described (WO 9). 2/20236 and WO 94/10288). Arabidopsis thaliana (Dormann et al. (1995) Arch. Biochem. Biophys. 316: 612-618), Brassica napus (Loader et al. (199 3) Plant Mol. Biol. 23: 769-778) and coriander (Dormann et al. (1994) Bioch. em.Biophys.Acta 1212: 134-136) has been reported for other 18: 1 thioesterases. You. A similar 18: 1-ACP-specific class I thioesterase (GarmFatA2) Found in developing embryos from Gostin (Garcinia mangifera) Is described in the text. Class I thioesterase from soy is expressed in E. coli. Increases the activity of the 16: 0-ACP and 18: 1-ACP by a factor of 10 and 96, ACP activity was reported to increase only slightly (3-4 times) (WO No. 92/11373). The mature protein region of class I plant thioesterases is highly Homologous, representing greater than 80% sequence identity. Additionally, another mangosteen class I thioesterase also described herein (GarmFatA1) was discovered. This is primarily due to the thiol to 18: 1-ACP substrate. Esterase activity (increased 100-fold by expression in E. coli) It also shows the selective activity of ACP versus 18: 0-ACP. Class I Chi analyzed to date In most of the esterases, 18: 1 activity was highly predominant, with 16: 0 and Although the activity detected for the 18: 0 substrate is less than 5% of the 18: 1 activity level, GarmFa The 18: 0 activity of tA1 is approximately 25% of the 18: 1 activity. A second class of plant thioesterases, class II (or FatB) thioesterase The enzymes include C8: 0 to C14: 0 (medium chain fatty acids) and 16: 0 shorter chain length fats. Includes enzymes that utilize acids. Class II thioesterases contain saturated fatty acids Selectively catalyze the hydrolysis of the substrate. California Bay, Elm, Cuphea hoo keriana, Cuphea palustris, Cuphea lanceolata, nutmeg, Arabiodopsis t Class II (or FatB) thioeste from haliana, mango, leek and camphor The lase has been isolated. Mature protein region of class II plant thioesterase Are also highly homologous, exhibiting 70-80% sequence identity. One of the properties of class II thioesterases is that they are located in the N-terminal region of the mature protein. There is a relatively hydrophobic region of about 40 amino acids in the region. This hydrophobic region is Not found in 18: 1-ACP thioesterase, It does not have any effect. Bay Class II with or without this region Recombinant expression of thioesterase shows the same activity profile in vitro (Jones et al., Supra). As shown more fully in the examples below, the acyl-AC of the plant thioesterase The P-substrate specificity is determined by the A in the mature protein part of the plant thioesterase. Various amino acid substitutions for protein sequences, such as amino acid substitutions, insertions or deletions Subject to change. The altered substrate specificity has been linked to this inheritance in E. coli. Expression of the engineered thioesterase and an assay to detect this enzyme activity It can be detected by the force. The altered substrate specificity indicates that the engineered thioesterase is New hydrolysis of substrates not recognized by sterases Can be evaluated by the change in acyl-ACP substrate selectivity. You. The newly recognized substrate is the carbon chain length and / or the fatty acyl portion of the substrate. Or, depending on the degree of saturation, it differs from the substrate of the natural enzyme. Alternatively, The altered substrate specificity indicates that the engineered thioesterase has an acyl-ACP group. Two of the natural thioesterases exhibit different orders of selectivity for quality. Or the ratio of thioesterase activity to the substrate May also be reflected. For example, the major hydrolytic activity on the C12 substrate and the somewhat less favorable on C14 Plant thioesterase having activity₁₄Engineering with increased activity against To produce an engineered thioesterase, such as a genetically engineered thioesterase Modified to have approximately equal activity on C12 and C14 substrates. Can also be. Similarly, such plant C12 thioesterases may be further modified to It has major activity on C14 substrates and little or no activity on C12 substrates. A genetically engineered thioesterase having no sex can also be produced. is there Alternatively, change the specific activity towards a substrate with higher or lower saturation. As such, the plant thioesterase can be modified. For example, class I ( 18: 1) Thioesterase to another substrate of the enzyme such as C18: 1 and C16: 0 It can also be modified to increase the specific activity on the C18: 0 substrate relative to its activity. Wear. Examples of modifications of these types of thioesterases are provided in the Examples below. You. Still other modifications of the plant thioesterase are also desirable, as provided herein. They can also be obtained using methods and sequences. For example, C8 and C10 How to transfer enzyme activity to the hydrolysis side of shorter chain fatty acids Terases can also be modified. Available for changing the specificity of thioesterase C. palustris provided here to identify potential target amino acid residues C8 / 10, C.palustris C₁₄And C. hookeriana C8 / 10 thioesterase sequence A comparison of the sequences of any closely related thioesterases can also be used. First attempt to alter substrate specificity of plant thioesterase enzymes Of C12 from California Bay (Umbellularia californica) Acyl-ACP thioesterase and camphor (Cinnamomum camphora) Two highly related classes of C14 selective acyl-ACP thioesterases II thioesterase was studied. These enzymes are 90 % Amino acid sequence identity, but still have different substrate specificities doing. N-terminal mature protein region of one of camphor or bayeoesterase Thioestera containing a C-terminal portion of the thioesterase and the other A construct for expression of a chimeric mature thioesterase, encoding a protease enzyme, was prepared. Made. The N-terminal thioesterase moiety encoded in these constructs is mature Contains approximately one-third of the thioesterase protein and has a C-terminal moiety Contains the remaining two thirds of the oeesterase protein region. In the following example As described in more detail, two-thirds of the C-terminal of these plant thioesterases Have been found to be the key to determining substrate specificity. Camphor thio Chimeric enzyme containing the C-terminal part of esterase (Ch-1) is a natural camphor thioe Shows the same activity profile as the sterase (specific for 14: 0) Chimeric protein having esterase C-terminus (Ch-2) It shows the same activity profile as the stelases (specific for 12: 0). Further define regions of the thioesterase protein that are important for substrate specificity To this end, further studies of the C-terminus of this protein were performed. these In one study, 13 consecutive C-terminal amino acids of bayeoesterase were By producing a mutant gene lacking the DNA encoding this region Was deleted. The activity of the expressed mutant thioesterase is Compared to the type of bayeoesterase protein. 17 C-terminal variants and wild type Have the same activity profile of thioesterase That this C-terminal part of the protease protein is not a critical region for substrate specificity It has been shown. To identify specific amino acids involved in substrate specificity, Bay's C12 selective The C-terminal two-thirds of the sil-ACP thioesterase were further analyzed. Be By examining the sequence alignment diagrams of A and camphor, the C-terminal Minimal conservative amino acid substitutions between the two thioesterases in the two-thirds Was identified. Non-conservative amino acid substitutions may be substituted for the natural amino acid Those having a charge different from the acid residue are included. Positively charged side chains at pH 7 The amino acids considered to be lysine and arginine. Under acidic pH conditions Has histidine, which also has a positively charged side chain. Negative charge side at pH7 Amino acids considered to have a chain are aspartic acid and glutamic acid. Non-conservative amino acid substitutions also mean that the size of the substituted amino acid It also means that the size of the amino acid is considerably different from that of the amino acid. Bay Examples of non-conservative amino acid differences between and camphor thioesterase are M197 → R (be (TE → Camphor TE), R199 → H, T231 → K, A293 → D, R327 → Q, P380 → S, and R381 → S (The amino acid sequence numbers of bay and camphor thioesterase are shown in FIG. It is shown). Amino acid positions likely to affect secondary structure of thioesterase protein Secondary structure predictions can also be used to identify exchanges. For example, Chou According to the prediction of the secondary structure using the method of Fazman and Fasman, Bay No. 197-199 The amino acid tripeptide M-R-R and the corresponding camphor tripeptide R-R-H And two highly conserved glycines (G193 and G196) It is located at the back of the turn section. This region of plant thioesterase is highly It is conserved, and in other plant thioesterases, this β-sheet and A turn structure is expected. Bay M-R-R tripeptide was converted to camphor thiol as described in the Examples below. When simulated to esterase and changed to R-R-H, the activity of this mutant against 12: 0 Decreases about 7 times compared to the wild type, but does not decrease at 14: 0. As a result, 12 Genetically engineered thios with nearly equal specific activity on 0: 0 and 14: 0 substrates Esterase is produced. In addition, the engineered Bay M197R / R199H thioesterase A modification that converts the threonine residue of carboxylic acid to lysine (T231K) has been engineered Thioesterase M197R / R199H / T231K to be highly 14: 0-ACP specific Alter the substrate specificity. Interestingly, the T231K mutation alone Does not affect oeesterase activity. M197R / R199H Genetically engineered Thioe The effect of this non-additive combination of the T231K substitution on the sterase is Suggest that the amino acid positions are folded closer together. (Sandberg et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 8367-8371). As described in the examples below, plant acyl-ACP thioesterases Near the active site (YRREC, amino acids 357-361 of the common number in FIG. 1) It appears that replacement of the amino acid results in a significant decrease in the activity of the thioesterase. Be Modification of thioesterase to R327Q results in thioesterase activity of 10 0 times decrease. The reduced activity of R327Q is due to the fact that this amino acid site When the active site cysteine of the esterase sequence is located very close to C320 It seems to be due to the fact. Genetically engineered thioesterase with altered substrate specificity in host cells Analysis of the composition of the resulting fatty acids expressed in Altered substrate specificity of thioesterase is associated with the fatty acid composition profile of host cells It is shown that it is reflected in. Reflected in in vitro activity assays Parameters such as interactions or lifetimes and unfolded / unfolded ratios in unmatched sequences This is important in that it is likely that the protein was involved in enzymatic activity in vivo. There is. The major lipid composition of E. coli membranes is phosphatidylethanolamine and Sphatidyl glycerol, which mainly contains long chain fatty acyl moieties I do. Is the Long-chain Recombinant Expression of the Native Baythioesterase cDNA in FadD Cells? Redistributes the bacterial type II fatty acid synthase system that produces Similar results were obtained with the expression of native bayeoesterase in plant seeds. (Voelker et al. (1994) supra; Voelker et al. (1992) supra). Therefore, E.coli In vivo data from genetically engineered Thioes in transgenic plants It could be used to predict the effect of expression of Terase. E. coli FadD cells are exposed to large amounts of 12: 0 free fat by natural baitioesterase. It produces fatty acids and small amounts of 14: 0 (about 5-10% of the 12: 0 value) (Voelker et al. (1994) and And Table I). However, as shown in the examples below, two amino acid substitutions (M197R / R 199H), the expression of the engineered bayeoesterase resulted in the same amount of 12: 0 And 14: 0 fatty acids accumulate. Similarly, three amino acids were replaced (M197R / R1 99H / T231K) The expression of the engineered bayeoesterase is The 12: 0/14: 0 ratio of fatty acids produced was completely reduced compared to the results with esterase. Reverse. Thus, modifications to the substrate specificity of plant thioesterases result in hydrolysis To change the ratio of fatty acids produced in the cells where various substrates are available for It is shown that you can do it. Further, genetic engineering with altered substrate specificity As a result of the expression of the modified thioesterase, the use of triglycerides in plant seeds The molecules formed from the free fatty acids that can be used can also vary. Known acyl-ACP thioesterases and cords as provided herein. In addition to the nucleotide sequence, other acyl-ACP thioesterase sequences have been obtained from many plant species. Such thioesterases and coding sequences can be used in the methods of the invention. Application will be found. As described above, plant thioesterases The coding sequence, in particular thioesterases of the same class, ie class I or Those belonging to II are highly conserved. Thus another thioester For the isolation of zeolites, a genome prepared from a candidate plant of interest or other suitable Conserved sequences from one or more class I or II plant thioesterases To identify clones related in homology. Restrict positive clones Analyze by enzymatic cleavage and / or sequencing. Probes are better than whole sequences It may be short. For example, oligonucleotides may be used, but at least Total length of about 10, preferably at least about 15, more preferably 20 nucleotides. It is. If shorter regions are used for comparison, the longer sequence A higher degree of sequence identity is required. Short probes are particularly well preserved Polymerase chain reaction for the isolation of plant thioesterases containing different sequences (PCR) (Gould et al., PNAS USA (1989) 86: 1934-1938). Often. Use oligonucleotides for conserved regions of plant thioesterase The PCR used also employs homology probes for library screening. It may be used to produce. Particularly when using longer nucleic acid fragments (> 100 bp) as probes, Or when using large cDNA sequences, there is a 20-50% difference, ie To obtain signals from target samples that are homologous sequences, use (For example, using 50% formaldehyde at 37 ° C and minimal washing). Can still be screened (details on screening techniques) For additional information, see Beltz et al., Methods in Enzymology (1983) 100: 266-285. ). Nucleic acids or amino acids encoding the engineered plant thioesterases of the invention Combining the amino acid sequence with other unnatural or "heterologous" sequences in various ways You can also. "Atypical" sequences are found, for example, in association with each other in nature That contain a combination of nucleic acid sequences from the same plant Refers to any sequence that is not found in binding to le-ACP thioesterase You. Encodes a genetically engineered plant thioesterase for expression in host cells Enhances transcription and translation in host cells in the 5 'to 3' transcription direction -Regulated transcription initiation regulatory region, engineered plant acyl-ACP thioes DNA having a DNA sequence encoding a Terase and transcription and translation termination regions Incorporate into the A construct. DNA constructs may contain pre-processing sequences such as transit peptides. It may not be included. Transit peptides transport proteins to an organelle Assists in transporting and separating the amino acid portion at the entrance to the organelle, Release the "mature" sequence. In the cassette for plant cell expression, the plant acyl-ACP Preference is given to using the DNA sequence of the precursor of oeesterase. Plant acyl-ACP To transport oeesterase to various organelles for the purpose, seed ACP Use other plastid transit peptides such as transit peptides Is also good. Thus, for in vitro or in vivo regeneration or study of enzymes, the host Various constructs for expression of desired thioesterase in cells Thus, genetically engineered plant thioesterase sequences can be used. Possible Suitable host cells include both prokaryotic and eukaryotic cells. Host cells for the intended use Accordingly, it may be one of a single cell or a multicellular differentiated or undifferentiated organism. Departure Light cells contain genetically engineered plant acyl-ACP thioesterase. There is a characteristic in that it exists. Depending on the host, from viruses, plasmids or chromosomal genes, etc. The regulatory region, such as the region of, should change. Prokaryotic or eukaryotic microorganisms, especially single cells A wide variety of constitutive or regulatory promoters are available for expression in the host. Data can be used. Expression in microorganisms is a genetically engineered plant enzyme Can identify the specific properties of such enzymes that can provide a complete source of Useful for Among the transcription initiation regions already described, E. coli, B. su, including genes such as dase, T7 polymerase, tryptophan E Has regions from bacterial and yeast hosts such as btilis, Saccharomyces cerevisiae . For the most part, the constructs release plant acyl-ACP thioesterase in plants. It contains a regulatory region that has the function of expressing Will be modified. This plant acyl-ACP thioesterase encodes Open reading frame at the 5 'end, naturally a thioesterase Link to the transcription initiation regulatory region, such as the wild-type sequence 5 'upstream of the structural gene . Provides diverse constitutive or regulated transcription of structural gene function, such as inducible transcription Many other transcription initiation regions that are provided can be utilized. Used for plants Some of the transcription initiation regions are nopaline and mannopine Structural genes for synthase, etc., or napin, ACP promoter, etc. There is an area connected with. Transcription / translation initiation regions corresponding to these structural genes are: It is found just 5 'upstream of the corresponding start codon. Genetically modified thioesters In embodiments where the protein is intended to be expressed in a plant host, the natural plant Partial use of the sil-ACP thioesterase gene is contemplated. That is, 3 ' Along with the downstream noncoding region, all or all of the 5 'upstream noncoding region (promoter) Use some. Promoter or modified promoter specific to the plant host of interest The transcription initiation region from one gene source and another Having a translation initiation region (enhanced promoter), such as the double 35S CaMV promoter If different promoters are needed, such as These sequences can also be linked. When obtaining the 5 'upstream noncoding region from another gene that is regulated during seed maturation For application, plant embryos such as ACP and napin-induced transcription initiation control regions Those that are selectively expressed in the weave are desirable. These "seed-specific promoters" Is U.S. Serial No. 07 / 147,781, filed 1/25/88 (currently U.S. Serial No. 07/550, 80 4, application 7/9/90), and "a novel sequence selectively expressed during early seed development and U.S. Serial No. 07 / 494,722, filed March 1990, entitled "Methods Related thereto." Obtained and used in accordance with the teachings of or about 16 March You. These references are incorporated herein by reference. Any interruption of the gene product Selective expression in seed tissue to minimize In other words, the transcription initiation region, which is not detected in other plant organs, Is considered desirable. A regulatory transcription termination region is also provided in the DNA constructs of the present invention. Transcription The termination region is a DNA sequence encoding the plant acyl-ACP thioesterase. , Or, for example, a transcription termination region that is naturally associated with a transcription initiation region, Provided by an appropriate transcription termination region from another gene source. Transfer stop area If is from another gene source, the stop region is the structural genetic It contains at least about 0.5 kb, preferably about 1-3 kb, 3 'sequence of the offspring. Of a plant having a plant acyl-ACP thioesterase as the DNA sequence of interest Expression or transcription constructs are useful for many types of plants, especially edible and industrial vegetable oils. It can be used in plants involved in the production of. Most particularly preferred It is a temperate oilseed crop. The target plants are not limited, , Rapeseed (canola and high erucic acid varieties), sunflower, safflower, cottonseed, Cuphea, Contains soy, peanuts, coconut and oil palm, and corn . Depending on the method by which the recombinant construct is introduced into the host cell, other DNA sequences may be required. May be. Importantly, the present invention is equally applicable to dicotyledonous and monocotyledonous species. As well as new and / or improved transformation and regulation techniques. It can be used. The method of transformation is not critical to the invention. Various methods for plant transformation Can be used normally. If new methods are used to transform crops , You can use it right away. For example, originally Agrobacterium (Agrob acterium) Many susceptible plant species are transformed by Agrobacterium-mediated transformation. Successfully transformed via a tripartite or binary vector method. Moreover, microinjection enables transformation of various monocot and dicot species. Injection, DNA particle bombardment and electroporation Came. In developing a DNA construct, it can be replicated in a bacterial host, such as E. coli. The various components of the construct or fragments thereof in a suitable cloning vector Is inserted normally. There are a number of vectors that have been described in the literature. Each ku After cloning, the plasmid is isolated and controlled to prepare components of the desired sequence. Restriction digestion, insertion of new fragments, ligation, deletion, insertion, excision Other following operations may be performed. Once the construct is complete, the transformation of the host cell Transfer this into a suitable vector for further manipulation according to the exchange scheme This Can be. Usually, it has the necessary regulatory regions for expression in the host and has the function of selecting transformed cells. The included structural gene is included together with the DNA construct. The gene may be, for example, an anti- Resistance to biomaterials, heavy metals, toxins and other cytotoxic agents, auxotrophic variants Supplemental properties that provide prototrophy to the host, viral immunity, etc. Offer. Depending on the number of types of each host into which the expression construct or its components are introduced, one or Utilizes more markers, in which case different selection conditions may be used for different hosts. Use Due to the degeneracy of the DNA code, even if some codons are replaced, the corresponding It should be noted that there may be DNA sequences without modification of the amino acid sequence . The manner in which the DNA construct is introduced into the plant host is not critical to the invention . Any method that can be used for effective transformation can be used. Plant cell traits Various methods of conversion include Ti- or Ri-plasmid, microinjection Solution, electroporation, DNA particle bombardment, liposome fusion, DNA bombardment Such as use is included. In many cases, one or both sides are provided with T-DNA. Bordered constructs, especially the left and right borders, and more specifically, the right It preferably has a border. This is the construct as transformation mode Is especially useful when using A. tumefaciens or A. rhizogenes. The T-DNA border has applications in other transformation modes. When using Agrobacterium for transformation of plant cells, Agrobacterium Homologous to T-DNA or Ti- or Ri-plasmid present in terium host Use certain vectors that are introduced into the Agrobacterium host for recombination. Can be Ti- or Ri-plasmids containing T-DNA for recombination are With or without (can cause goal formation) It is impossible to wake up). Agrobacterium transformed with vir gene The latter is also possible if present in the host. The enhanced plasmid is A mixture of object cells and goals can be given. Use Agrobacterium as a vehicle for transforming plant cells In some examples, the border is provided by T-DNA border (s). The resulting expression construct is inserted into a broad host spectrum vector. Wide-area host Vector vectors have been described in the literature. The commonly used one is pRK2 or Its derivatives. See, for example, Ditta et al., PNAS USA, (1980) 77: 7347-7351 and Europe. See State Patent Publication No. 0 120 515. These are incorporated into the text by reference. Be included. One or more markers are included with the expression construct and T-DNA, Transformed Agrobacterium and transformed plant cells Sorting becomes possible. For use in plant cells, use chloramphenicol, Numerous markers, including noglycoside G418, resistance to hygromycin, etc. Has been developed. The particular marker utilized is not essential to the invention Depending on the particular host and mode of construction, one marker or another To be elected. Transgenic plants capable of producing seeds having an altered fatty acid composition After the plant is obtained, include mutagenesis to further manipulate the fatty acid composition Conventional plant cultivation techniques can be used. Alternatively or additionally, the fatty acid composition In order to manipulate DNA, a foreign DNA sequence for fatty acid modification is further It can also be introduced. Note that the method of transformation is not critical to the invention Should. However, the use of genetically engineered plant transformation methods, The technique of inserting the desired DNA sequence is important. Conventionally, fatty acid group of vegetable oil Possibility of altering the growth is a property that can be sexually transferred by plant crossing Or the introduction of viable characteristics produced by mutation. Enables introduction of cross-species genetic information and regulation of tissue-specific expression of endogenous genes Plant seeds with altered fatty acid composition by using genetic engineering techniques New methods for the production of oil are available. Besides, it is described here By applying substance materials, there is a possibility of developing new vegetable seed oils. Genetically modified plant acyl-ACP thioesterase in plant host cells Simultaneously with expression, one or more other sequences of interest are transcribed or transcribed and transcribed. You may choose to have it translated. In particular, for some applications, genetically engineered plants Medium-chain or very long in combination with the expression of acyl-ACP thioesterase Expression of plant LPAAT proteins having activity on fatty acids of the chain is desirable. Plant LPAA See WO 95/27791 for sequences encoding T. Provided is a plant transformed for the combined effect of two or more nucleic acid sequences of interest. If so, typically a separate nucleic acid construct is provided for each. As described above, the construct includes transcriptional or transcriptional and translational regulatory control regions. One skilled in the art will appreciate the principles described above for the corresponding expression or antisense construct. A regulatory arrangement that provides the desired timing and tissue specificity suitable for the final product that matches the You should be able to identify the columns. If more than one construct is used, Both of which relate to the same fatty acid modification sequence or to another fatty acid modification sequence To reduce spontaneous homologous recombination between sequences, It is desirable to use different regulatory sequences in the cassette. The resulting structure is As long as both traits are integrated into the genome, traditional plant cultivation methods can be used. Including the introduction of its properties by crossing transgenic plants It can be introduced into host cells by different methods. The invention has been described generally herein, but by reference to the following examples. And will be more easily understood. The examples are included for illustrative purposes only. It is not intended to limit the invention. Example Example 1 Sequence of plant acyl-ACP thioesterase A. California Bay (Umbellularia californica) DNA of California Bay class II thioesterase clone pCGN3822 The sequence and translated amino acid sequence are shown in FIG. 1 of WO 92/20236. Have been. Expression and expression of the mature portion of the bayeoesterase protein in E. coli As a result of analysis of thioesterase activity and thioesterase activity, some activity against 14: 0-ACP was also found. It was observed that the strong specificity of bayeoesterase for the 12: 0-ACP substrate (Voelker et al. (1994), supra, and FIG. 2A herein). further When bathioesterase is expressed in E. coli fadD cells, (More than 500 times the background value of the control) and a small amount of myristate (About 10% of the amount of laurate) is produced. Bra of this biothioesterase Lauri is also expressed in ssica napus or Arabidopsis thaliana seeds. Similar proportions of phosphate and myristate are observed (Voelker et al. (1992), supra). . B. Camphor (Cinnamomum camphora) Of the region encoding the class II camphor thioesterase produced by PCR The DNA sequence and translated amino acid sequence are shown in FIG. 5 of WO 92/20236. B. PCR obtained from reverse transcribed cDNA The sequence of the DNA fragment (SEQ ID NO: 7) containing the mature protein region of You. Sequence of the region coding for the putative mature protein of camphor thioesterase. It starts at the XbaI site located at the start point. The above camphor PCR fragment was cloned into a pAMP vector to generate pCGN5219. Let it run. Digestion of pCGN5219 with XbaI and SalI, resulting in camphor thioestera Clones into pBCSK + (Stratagene) digested with XbaI and SalI To generate pCGN5220. Pollard et al. (Arch. Biochem. & Biophys. (1991) 281) : 306-312) and assay for acyl-ACP thioesterase activity. To transform E. coli fadD, pCGN5220 is used. 8: 0, 10: 0 , 12: 0, 14: 0, 16: 0, 18: 0 and 18: 1 acyl-ACP substrates using camphor thiol The results of the assay for thioesterase activity of the esterase clones are mainly Demonstrates substrate specificity for the 14: 0 substrate, but has minimal An increase is observed (FIG. 2B). C. Mangosteen (Garcinia mangifera) Described in the Stratagene Zap cDNA Synthesis Kit (Stratagene; La Jolla, CA) CDNA seeds from seeds from ripe mangosteen fruit Prepare ink. Oil analysis of mangosteen tissue used for RNA isolation Approximately 50% indicates an 18: 0 value. Mangosteen fruit with low maturity Oil analysis of the original seed shows an 18: 0 value of 20-40%. Webb and Knapp (Plant Mol. Biol. Reporter (1990) 8: 180-195) to modify the CTAB DNA isolation method. Therefore, total RNA is isolated from mangosteen seeds. Buffer solution is as follows You. REC: 50 mM TrisCl pH9, 0.7 M NaCl, 10 mM EDTA pH 8, 0.5% CTAB. REC +: B-mercaptoethanol was added to 1% immediately before use. RECP: 50 mM TrisCl pH9, 10 mM EDTA pH8, and 0.5% CTAB. RECP +: B-mercaptoethanol was added to 1% immediately before use. For extraction of 1 g of tissue, homogenize the tissue by grinding in liquid nitrogen. Add 10 ml of REC + and 0.5 g of PVPP. 1200 homogenized substances Centrifuge at 0 rpm for 10 minutes. Cool the supernatant through miracloth Pour over 3 ml of form and homogenize again. Centrifuge at 12,000 RPM for 10 minutes Thereafter, the upper layer is removed and its capacity is measured. Add the same amount of RECP + and allow the mixture to Let stand for 20 minutes at warm. Centrifuge this material twice at 10,000 rpm for 20 minutes. After inversion, discard the supernatant. Dissolve the pellet in 0.4 ml of 1 M NaCl (DEPC), Extract with the same amount of phenol / chloroform. After ethanol precipitation, pellet Dissolve in 1 ml of EPC water. Briefly, the cloning method for cDNA synthesis is as follows. You. The synthesis of the first strand of cDNA is described by Robinson et al. (Methods in Molecular and Cel. Stratagene Inst modified slightly according to lular Biology (1992) 3: 118-127) Follow the ruction Manual. In particular, instead of 5 μg of poly (A) + RNA, use LiCl Using about 57 μg of total RNA precipitated, incubate the reaction for 1 hour at 45 ° C instead of 37 ° C. Cubbed. Oligonucleotides to conserved regions of plant acyl-ACP thioesterase The library is screened by PCR from the mangosteen cDNA using Prepare a leaning probe. Use the following oligonucleotides to Garm 2 and Garm 106 were prepared. About the following oligonucleotides Abbreviations of the nucleotide bases are as follows. A = Adenine C = Cytosine T = thymine U = uracil G = guanine S = guanine or cytosine K = guanine or thymine W = adenine or thymine M = adenine or cytosine R = adenine or guanine Y = cytosine or thymine B = guanine, cytosine or thymine H = adenine, cytosine or thymine N = adenine, cytosine, guanine or thymine Garm 2 Primer 4874 binds to a possible coding sequence for the conserved peptide V / L / A W / S / Y V / A M M N It is a sense primer designed to correspond. Here is one letter amino acid Using the code, the diagonal lines between amino acids indicate that two or more amino acids It means that it can be done. Primer 4875 is available for peptide D / E Y R R E C Antisense primer designed to correspond to a unique coding sequence. Garm 106 Primer 5424 corresponds to the possible coding sequence for peptide E / DH / RYPK / TWGD This is a sense primer designed to be used. Primer 5577 was a peptide T Antisense plugs designed to correspond to the possible coding sequences of EWRK / PK I am an immer. In order to use the DNA fragment obtained by the above reaction as a probe, Amplify by roning or additional PCR, random or specific Radioactively label by mining. Approximately 800,000 plaques were plated on the plates according to the manufacturer's instructions. For screening, 50% formamide, 5X SSC, 10X Denhardt's, 0.1% (W / v) SDS, 5 mM Na_TwoEDTA, 0.1 mg / ml in denatured salmon sperm DNA, room temperature Prehybridize the plaque filter with. 10% in the same buffer as above (W / V) Add dextran sulfate and probe, add Garm 2 and Garm 2 at room temperature. Hybridization is performed with a mixture of 106 probes. Stratagene Purify plaques as described in the Zap cDNA Synthesis Kit instructions. Phagemid excision was performed. By DNA sequencing and / or PCR analysis, approximately 90 acyl-ACs P thioesterase clones were identified and classified by thioesterase type . Of the clones analyzed, at least 28 were class I (FatA) and 59 were class Type II (FatB). Two subclasses of the FatA clone were observed, the most The new type is named GarmFatA1, and the second subclass is named GarmFatA2. GarmFatA1 clone C14-4 (pCGN5252) (SEQ ID NO: 8) DNA and translated The amino acid sequence is shown in FIG. DNA sequence of FatA2 clone C14-3 (SEQ ID NO: 9) The translated amino acid sequence is shown in FIG. The construct for expression of the Garm FatA1 clone of FIG. 4 in E. coli is as follows: To be prepared. At the 49th amino acid (SacI), it was controlled by PCR mutagenesis. Insert a restriction site. This position is close to the amino terminus of the predicted mature protein. Followed by a stop codon (BamHI) in the region encoding this protein. Mature N The region coding for the protein is converted as a SacI / BamHI fragment into pBC SK (Stratagene; La Jolla , CA) to produce pCGN5247, which is used to construct a lacZ fusion protein. To express mangosteen thioesterase. Mangosteen class I using 16: 0, 18: 0 and 18: 1 acyl-ACP substrates The results of the thioesterase activity assay for the thioesterase clone GarmFatA1 It is shown below. GarmFatA1 clone shows selective activity for C18: 1 acyl-ACP substrate Has a substantial activity (about 25% of the 18: 1 activity) also on the C18: 0 acyl-ACP substrate Show. A slightly larger value of C16: 0 activity than that of control cells was observed. As such, the 16: 0 activity represents only about 3% of the 18: 1 activity. Expression of GarmFatA2 thioesterase in E. coli and thioester produced Assays for the activity of the lase showed a selectivity for C18: 1 as an acyl-ACP substrate It is high. Thioester for 16: 0 and 18: 0 acyl-ACP substrates Lase activity is about equal, less than 5% of the observed 18: 1 activity. D. Brassica campestris (rapa) DNA sequence of class I acyl-ACP thioesterase of Brassica campestris The sequence and translated amino acid sequence are provided in WO 92/20236 (FIG. 6). Has been provided. E. FIG. Cuphea palustris C8 / C10 Total RNA from germinating seeds of C. palustris using the modified CTAB method described above Is isolated. About 6 × 10 from total RNA⁶ Lambda ZipLox containing pfu (BRL ; Gaithersburg, MD) Construct a cDNA library. Cuphea hookeriana Ras II thioesterase clones CUPH-1 (CMT-9), CUPH-2 (CMT-7) and CUPH-5 Use a mixed probe containing a region encoding the thioesterase from (CMT-10). To screen approximately 500,000 plaques from the unamplified library ( The DNA sequences of these clones are provided in WO 94/10288. There). Use low stringency hybridization conditions, such as: 30% formamide and 2 × SSC (1 × SSC = 0.15 M NaCl; 0.015 M Hybridization is performed at room temperature in a solution of Na). Presumed positive 82 clones were identified, 30 of which were plaque purified. MCT29 (CpFatB1) The nucleic acid sequence and translated amino acid sequence of the named clone (SEQ ID NO: 10) are shown in FIG. Shown in The translated amino acid sequence of this clone is primarily C8: 0 and C10 : 0, having activity on fatty acyl-ACP substrate, Cuphea hookeriana CUPH-2 Of the loan (CMT-7 in FIG. 7 of WO 94/10288) and about 83% There is identity. Prepare a construct for expression of MCT29 in E. coli. By PCR, At the N-terminal 5 'of the mature protein predicted to be at amino acid position 114, Sp Insert the hI and StuI sites. The mature N-terminus is the mature tannin of Predicted by matching Leu 84, originally identified as the N-terminus of protein did. The region coding for this mature protein is used as a StuI / XbaI fragment in pUC118. To generate the clone MCT29LZ and clone it into the E. coli LacZ fusion protein. Used to express C. palustris thioesterase as a protein. MCT29 E. coli cells transformed to express thioesterase protein Isates were assayed for acyl-ACP thioesterase activity. That The results show that CpFatB1 has activity mainly on C8- and C10-ACP substrates. Have a 50% higher activity on C8-ACP than on C10-ACP. It indicates that it encodes an oeesterase enzyme. About C8-ACP activity A low activity at the 10% level on the C14-ACP substrate is also observed. For analysis of lipid composition, medium chain specific acyl-CoA synthetase was deleted. E. coli fadD (Overath et al., Eur. J. Biochem. (1969) 7: 559-574) also transform MCT29LZ. The results of these analyses, C.palus Production of 8: 0 and 10: 0 fatty acids in cells transformed with the tris MCT29LZ clone Indicates that there is a substantial increase in raw. The closely related C.hookeriana ChFatB2 clone is also known as C8: 0 and C10 : 0 shows a selective activity on acyl-ACP substrate, showing C10 relative to C8: 0 substrate. 0% 50% higher activity. C in seeds of transgenic Brassica plants Expression of the hFatB2 clone results in increased production of C8 and C10 fatty acids in the seed, C10 level is higher than C8 level (SN 08, filed concurrently with / 261,695). F. Cuphea palustris C14 Another C. palustris class II thioesterase clone, MCT34 (CpFatB2) The nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 11) and the translated amino acid sequence are shown in FIG. This claw Translated amino acid sequence of the Cuphea hookeriana CUPH-4 clone (International Publication There is about 80% identity with the sequence of CMT-13) in FIG. 8 of Publication No. 94/10288. Prepare a construct for expression of MCT34 in E. coli. By PCR, SphI and 5 ′ at the N-terminus of the predicted mature protein at amino acid position 108 And insert a StuI site. The region coding for this mature protein is called StuI / XbaI fragment. Cloned into pUC118 to generate clone MCT34LZ and To express C.palustris thioesterase as a LacZ fusion protein use. MCT34 transformed to express thioesterase protein Lysates of E. coli cells were assayed for acyl-ACP thioesterase activity. I did it. The results indicate that CpFatB2 showed activity primarily on C14-ACP substrates. It encodes a thioesterase enzyme. C14-ACP A low activity on the C16-ACP substrate at a level of about 30% of the activity is also observed. For analysis of lipid composition, medium chain specific acyl-CoA synthetase was deleted. E. coli fadD (Overath et al., Eur. J. Biochem. (1969) 7: 5). 59-574), also transform MCT34LZ. The results of these analyses, C.palust production of 14: 0 and 14: 1 fatty acids in cells transformed with the ris MCT34LZ clone It showed a substantial increase. Example 2 Chimeric thioesterase construct Bay and camphor thioesterase cDNAs both encode 382 amino acids. It contains an open reading frame. Only 31 amino acids differ And more than half of them are conservative substitutions (FIG. 8). Co between two genes Don usage is highly conserved, suggesting that they have a common origin doing. Plasmid pCGN3823 (WO 92/20236 and Voelker et al., (1994 ), Supra) is a vector in pBS- (Stratagene; La JoLLa, CA) plasmid backbone. It contains a 1.2-kb XbaI fragment of the C12 selective thioesterase cDNA, Mature bay starting at amino acid position (by number in Voelker et al., (1992) supra). Encodes a thioesterase protein. 84th amino acid of bayeoesterase The acid is based on amino acid sequence analysis of the purified Identified as the amino terminus. However, other cloned plant medium-chain acyls -Compared to the translated amino acid sequence of ACP thioesterase, the amino terminal Is likely to be located further upstream than the Leu84 residue (Jones et al., (1 995), supra). The above plasmid pCGN5220 is used for PBC⁺In plasmid (Stratagene) The XbaI / XhoI fragment of the C14 selective thioesterase cDNA of camphor inserted into Contains. The XbaI site in the camphor cDNA encodes bayeoesterase. The amino acid residue at position 84, leucine. Amino acid 177 of the sequence encoding the precursor of bay and camphor thioesterase Unique residues conserved in both bay and camphor cDNA clones Kpn I site is present (FIG. 9). The second Kpn I site is a thioesterase It is located within the polylinker of the plasmid 3 'to the stop codon of the row. pCGN3823 Exchange of two KpnI fragments between the thioesterase and the pCGN5220 Is fused to the C-terminal region of another thioesterase, The enzyme is formed. To prepare chimeric constructs, pCGN3823 and pCGN5220 were digested with KpnI and The resulting fragment is gel purified and ligated into a backbone plasmid from the other source. Gated. DNA mini preparation and restriction digestion to identify the correct fusion construct Was used. The chimeric construct used for expression and enzyme assays was also Confirmed by NA sequencing. The resulting chimeric enzyme is 92 amino acids from the N-terminus of one thioesterase And containing 207 amino acids from the C-terminal portion of the other thioesterase I have. Chimera fusion protein containing the C-terminal part of camphor thioesterase 1 (Ch-1) and the other fusion protein is called chimera-2 (Ch-2) ( (FIG. 9). Example 3 Analysis of variability and secondary structure Predictive secondary of plant acyl-ACP thioesterase by computer analysis The structure was determined. Secondary structure prediction is based on Chou and Fasman's method ( Chou et al., (1974) Biochem. 13: 222-245; Prevelige et al., (1989) Prediction of Pro tein Structure and the Principles of Protein Conformation (Fasman, G.D.ed. ), Pp 391-416, Plenum, New York); and Garnier et al. (1978) J. Mol. Biol. 12 0: 97-120). Karplus and Schulz's method of predicting variability (Naturwiss. (1985) 72: 212-213) ) Based on MacVector (International Biotechnologies, Inc.) By computer analysis, various types of plant acyl-ACP thioesterase regions Predict region variability. Example 4 Genetic engineering of FatB thioesterase A. Bay C12 thioesterase For amino acid substitution, PCR-directed site mutagenesis (Higuchi et al., (1988) Nucl.Acids Res. 16: 7351-7367). The cells used for mutagenesis The mutation primers are as follows. Here, bold letters M, R, H, T, K and Q represent amino acids, methionine, Arginine, histidine, threonine, lysine and glutamine Yes, mutated nucleotides are underlined. The PCR conditions are as follows. Denaturation at 94 ° C for 1 minute, regeneration at 48 ° C for 30 seconds, Five cycles of PCR were programmed, and extension at 72 ° C. for 2 minutes. The best of these Following the first 5 cycles, 30 cycles of regeneration at 60 ° C. for 30 seconds were performed. Amplified DNA was recovered by ethanol precipitation and examined by gel electrophoresis. next, This DNA was digested with XbaI and BamHI, ethanol precipitated, and XbaI / BamHI And ligated into the pBC plasmid cut with. Using the ligation mixture To transform Sure cells (Stratagene) by electroporation, Transformed cells are plated on LB medium containing 50 mg / l chloramphenicol. Sowed on Constructs containing the correct inserts were used for mini DNA preparation and control. Identified by restriction digestion. The inserted DNA was sequenced to confirm the mutation. For the mutant clone, the same name as that used for the PCR primer It was used. As an example, M197R / R199H is (a precursor of thiothioesterase) The methionine at residue 197 was changed to arginine, and the arginine at residue 199 Corresponds to a clone in which histidine has been changed. Similarly, T231K is residue 231 Is a mutant in which threonine is changed to lysine. B. Cuphea palustris C14 thioesterase Change the substrate specificity of thioesterase to fatty acyl-ACP with shorter chain length To determine possible amino acid modifications for further modification, the C14: 0 selective thioestera Comparing the sequence of the C8: 0 and C10: 0 selective thioesterases. No. Amino acid sequence of thioesterase CpFatB2 (C14) and ratio of CpFatB1 (C8 / C10) The comparison is shown in FIG. The most striking difference among these thioesterase sequences is 230 Found at -312 amino acids. H229I, H241N, W253Y, E275A, R290G, F292L, L295F , And C304R can be substituted in single-form or in combination-form. Wear. Alternatively, a domain that allows replacement of portions of the C8 / 10 and C14 sequences Swapping clones may be prepared. Of particular interest in this regard is Sequence IEPQFV, which starts at amino acid 274, and sequence D, which starts at amino acid 289 RKFHKL. Example 5 Specificity of bay mutant and chimeric enzymes E. coli cells transformed in the lacZ expression construct were treated with 0.6 O.D.₆₀₀Increase to Allow to grow, then add 1 mM IPTG and continue growing at 30 ° C. for 2 hours. Sank Cells are resuspended, sonicated in assay buffer, and acyl-ACP hydrolyzed. The decomposition was performed according to the literature (Davies, H.M. (1993) Phytochemistry 33, 1353-1356). Measure. Sure cells transformed with pCGN3823 and pBC And used as a negative control. Figure 11 shows the induction and assay of Ch-1 and Ch-2 transformed E. coli cells. The specific activity of the chimeric bay / camphor enzyme thioesterase is shown in FIG. Ch-1 (FIG. 11A), the preferred substrate is 14: 0-ACP, while for Ch-2 (FIG. 11A). 11B) 12: 0-ACP. These results indicate that the thioesterase protein C It indicates that the terminal portion determines the substrate specificity. The enzyme specificity of the two Bay variants is shown in FIGS. 11C and 11D. Met197 is Argi The mutant (M197R / R199H), which becomes nin and argin199 becomes histidine, The enzyme is equally specific for both the 12: 0-ACP substrate and the 14: 0-ACP substrate Results in a change in the specificity of the bacterioesterase so that 11C). The other mutant, T231K, gives the same activity profile as the wild type (Data not shown). However, a triple mutant, which is a combination of three mutations , M197R / R199H / T231K show 14: 0-ACP-specific thioesterase activity (FIG. 11). D). Assaying this triple mutant enzyme at high concentrations showed very low levels of 12: 0 -ACP activity is detected. Two other mutants (R327Q and R322M / R327Q) also have thioesterase activity. Tested for gender. Both mutants show the same activity profile, Compared to sex-type thioesterases, 12: 0-ACP and 14: 0-ACP Specific activity is reduced by a factor of about 100 and 30 respectively. These days Show that mutation of R327Q results in decreased activity. Reduction of R327Q activity At least this amino acid is very close to the active site cysteine, C320 It seems to be due to the fact that. Below are some studies to demonstrate the catalytic activity of C320. It was carried out. C320 changed to serine or alanine by target site mutagenesis I changed it. Mutant C320A completely lost thioesterase activity, whereas C320S lost About 60% of the wild-type activity remained. Cysteine and serine in the active site Exchange has also been demonstrated for animal thioesterases (Witkowski et al., (199 2) J. Biol. Chem. 267: 18488-18492). In animals, the active site is serine Thus, the change was from serine to cysteine. Example 6 Expression of bay mutants in E. coli fadD cells E. coli fatty acid degradation, a strain lacking acyl-coenzyme A synthetase Sex mutant K27 (fadD88) utilizes free fatty acids supplied in the medium. (Klein et al., (1971) Eur. J. Biochem. 19: 442-450). Therefore, Bacterial fatty acid synthases are not affected by fatty acid degradation This is an ideal host to observe the effects of recombinant thioesterase . E.coli fadD is the E.coli Genetic Stock Center at Yale University (E.co. li Genetic Stock Center, Yale University) (CGSC 5478). This fa dD cells were isolated from either the wild-type bacterioesterase gene pBC or its mutant constructs. With 50 mg / ml chloramphenicol and 1 mM IPTG. The cells were grown overnight in LB medium at 30 ° C. In the literature (Voelker et al., (1994) supra) Therefore, total lipids were analyzed. The results of these analyzes are shown in Table I below. When bathioesterase is expressed in fadD cells, large amounts of laurate ( Control background values (> 500 times) and small amounts of myristate (lau (About 10% of phosphate) is produced (Table I). This result was reported earlier (Voelker et al., (1994) described above). When mutant M197R / R199H was expressed in fadD cells In this case, the accumulation ratio, 12: 0: 14: 0, changed to 1: 1.5 (Table I), indicating that the thioester Reflects the specificity of the enzyme (FIG. 11C). Mutant M197R / R199H / T23 in fadD cells When 1K is expressed, a ratio of 12: 0 to 14: 0 is found with wild-type bacterioesterase It was completely reversed. This result is also consistent with the enzyme specificity of this variant. (FIG. 11D). Example 7 Kinetic analysis Basic kinetics to gain insight into the effects of mutations on bayeoesterase The study of theory and inhibition was performed. Increase assay volume and add 100 μl every 5 minutes By sampling and placing in 0.5 ml of stop solution, thioesterase A reaction progress curve of activity was obtained. 100 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.01% Triton Reaction kinetics in a buffer containing X-100, 1 mM DTT, 10% glycerol at 30 ° C. Was carried out. After extracting each reaction mixture with 2.0 ml of dimethyl ether, Radioactivity in 900 μl fractions measured by liquid scintillation counting did. This procedure allows extraction without interfering with the interface between the organic and aqueous fractions. Total free release (¹⁴Accurate measurement of (C-labeled) fatty acids is possible. This assay Laurate and myristate production is low in time Both were linear up to 30 minutes and up to 1 mU for enzyme concentration. all Were performed in duplicate. Bio-Metallics, Inc. kinetics software A (K_cat) Was used to fit the initial velocity data to the following equation: : Competitive inhibition For V = V_maxS / [K_{m, app}(1 + I / K_is) + S]; non-antagonistic inhibition And V = V_maxS / [K_{m, app}(1 + I / K_is) + S (1 + I / K_ii)]; And for antagonistic inhibition, V = V_maxS / [K_{m, app}+ S (1 + I / K_ii)]; Where V is velocity; V_max Is the maximum velocity; S is the substrate concentration; K_m.app Is an apparent mikae Squirrel constant; K_isAnd K_iiAre the gradient inhibition constant and the intercept inhibition constant, respectively. Number (intercept inhibition constant); I is the inhibitor concentration. These analyzes Are shown in Table II below. Under the same experimental conditions, baythioesterase and the triple mutant M197R / R 199H / T231K has a similar K for 14: 0-ACP._{m, app} Have a value. This mutation The specific activity of the body on 12: 0-ACP is so low that our assay system Cannot obtain significant kinetic parameters. Still, these The result shows that this mutation allows binding of the substrate (14: 0-ACP) to this mutant enzyme. This indicates that the affinity does not increase significantly. Substrate (¹⁴Use cold 12: 0-ACP to antagonize C-labeled 14: 0-ACP) Then, an inhibition assay was performed under the conditions described above. The results of these assays are shown below. The results are shown in Table III. In these inhibition assays, there is very similarity between the wild-type and mutant enzymes. Results can be seen. During the assay, equal amounts of inhibitor (12: 0-ACP) and substrate (14 : 0-ACP), the 14: 0-ACP TE activity is reduced by about 50%. 12: 0 -When the amount of ACP is 5 times the amount of 14: 0-ACP, the 14: 0-ACP TE activity is 75% It is greatly reduced. Consistent with previously observed results (Pollard et al., Supra) , A kinetic mechanism similar to that for the wild type bay TE is used. Sand That is, both 12: 0-ACP and 14: 0-ACP have similar Km,_maxIs 12 : 0-ACP is much more dominant. These data indicate that the specificity of the mutant enzyme Determined in the acyl hydrolysis step, ie both 12: 0-ACP and 14: 0-ACP Can bind to the mutant enzyme with similar affinity, but the 14: 0-ACP Which suggests a much higher rate of disconnection. The result is 12: 0-AC Inhibition kinetics indicating that P is a competitive inhibitor for 14: 0-ACP (K_ivalue Are 10.2 + 1.2 μM and 11.6 + 0.2 μM for wild-type and mutant enzymes, respectively. M (Table II)). Thus, 12: 0-ACP is 14: 0-ACP in both wild-type and mutant enzymes. As it is a reliable antagonist for CP, Amino acid substitutions apparently do not directly affect the substrate binding site. actually, Michaelis constants for baitioesterase and engineered bay enzymes The specificity is largely independent of the length of the acyl It suggests that it will be decided at the solution stage. Substrate (acyl-ACP) comparison (ACP M_rIs about 9 Kd), so plant thioesterase It probably has a very loose binding pocket. But these Enzymes relate to the fatty acid chain length or structure (ie, the presence or absence of double bonds). Has high selectivity. In addition, Met-Arg-Arg, a tripeptide of natural bayeoesterase, is 12: 0-A It is not the only determinant of selectivity for CP. Because this tripe Peptides are commonly found in other medium-chain specific thioesterases. You. Therefore, changes in the engineered bayeoesterase were When the surface loop of llus stearothermophilus lactate dehydrogenase is modified Same as observed (El Hawrani et al., (1994) Trends in Biotech. 12: 207-211) It seems that some secondary structure is only slightly changed. Chains in proteins According to the prediction of the variability of M-R-R (Karplus et al. (1985) Naturwiss. 77, 212-213) The change of the tripeptide from to R-R-H results in the β-structure of It appears to have reduced variability. This is the substrate binding pocket and active site May lead to reduced variability. Example 8 Genetic engineering of FatA thioesterase An example of a modification of FatA or class I thioesterase is mangosteen G Provides alteration of thioesterase enzyme specificity of arm FatA1 clone. FatA thio Desirable modifications for esterases include C18: 1 or C16: 0 fatty acyls. Increased activity on C18: 0 fatty acyl-ACP compared to activity on ACP substrate Substantial changes in substrate specificity can be mentioned. For example, to increase the relative activity on saturated fatty acids such as C18: 0, Different from the corresponding regions of class II thioesterases acting on saturated fatty acids In some cases, mutations in the region of class I thioesterase appear to be effective. According to the data of the genetic manipulation experiment of bayeoesterase, the 229th to 285th ( 1) The amino acid region is the substrate binding of thioesterase. Is important. According to the amino acid sequence comparison of this region, In the highly conserved region of amino acids 250-265, FatB thioesterase Some charged amino acids are shown to be different in FatA in comparison . For FatA thioesterase, amino acid 261 is implicit, with a few exceptions. FatB clones that have been charged to date, whereas Mino acids are mostly positively charged. In FatA thioesterase, Amino acid 254 is positively charged for all FatA studied up to now, In FatB clones analyzed by day, amino acid 254 for all It is an amino acid without charge. Thus, the amino acid at these positions Changes in charge appear to lead to changes in substrate selectivity. PCR target similar to the method described for the modification of the bayeoesterase sequence Using position mutagenesis, mangosteen FatA1 261 (common number in FIG. 1) It produces a FatATE variant in amino acids, D261K. Mutant D261K thio Esterase activity is measured as described above (Davies, H.M. (1993), supra). this The results of these analyses (FIG. 12) show that the 18: 1 selectivity versus the 18: 1 selectivity is wild-type Garm In the mutant D261K compared to 25% (18: 0/18: 1) in FatA1 Indicates that it was 35%. Wild-type and mutant Garm FatA1 clones Both have very low activity against 16: 0, medium chain like C10: 0 to C14: 0 No activity on long substrates. Amino acid 254 with D261K mutation shown above Yet another Garm FatA1 mutation that changes the acid from lysine to valine The body was prepared. This mutant, K254V / D261K, increased the 18: 0/18: 1 ratio to 40%. This These results indicate that modification of this region alters enzyme activity and specificity. He further supports Bay's fact that he can. Evaluation of further specificity modifications The Garm FatA1 clone closer to the structure of FatB thioesterase A triple mutant, G249T / K254V / D261K, is under construction to make further modifications. The amino acid sequence of Garm FatA1 thioesterase enhanced for this 18: 0 Has activity primarily on the 18: 1 substrate and little or no activity on the 18: 0 substrate By comparing with the amino acid sequence of one FatA clone To select other desirable amino acid modifications of the mangosteen Garm FatA1 clone. You can also choose. Garm FatA1 amino acid sequence and 18: 1 selectivity Brassica camp estris (rapa) -derived thioesterase clone, Br FatA1 The comparison is shown in FIG. The predicted β- Sheets and turns (Fig. 13 of mangosteen and Brassica thioesterase) (Fixed by G169 and G172 amino acids in comparison) In view of the change in the composite substrate, this region is also a mangosteen thioesterase clone. , Is a target for altering the substrate specificity of Garm FatA1. Mangosteen and Brassica Secondary structure analysis of rapa class I thioesterase and comparison of amino acid sequences. As a result, further alters the substrate specificity of mangosteen thioesterase, Garm FatA1 To this end, several target mutations are identified. The target amino acids are Y182V, Q186 E, D209S, V210D and H219F. In addition, the amino acids 241 and 293 of Garm FatA1 (numbers in FIG. 4) Special restriction sites, BglII and SpeI, are available at positions 242 and 242 of the mangosteen thioesterase Convenient domain swapping of the region between amino acids 293 and 293 (number in FIG. 4) Offer This region is identified by mutagenesis and biochemical assays Contains the active site amino acids of both histidine 248 and cysteine 283 In. Thus, a major part of the active site of mangosteen thioesterase was removed. And remove the corresponding region from another acyl-ACP thioesterase (for PCR amplification). Therefore, it can be obtained. According to these methods, Displacement of the active site of Uc FatB1, a baioesterase clone with high extraordinary activity By increasing the specific activity of mangosteen thioesterase, Further modifications of the acyl-ACP thioesterase activity can be made. Example 9 Domain swapping technology Domain swaps for thioesterases when convenient restriction sites are not available The present invention provides a method for preparing a signaling construct. The method of short domain swapping is illustrated in FIG. Results of two separate PCRs To form two fragments (primer a + d and primer b + c). This Fragment contains the same overlapping sequence as the new domain. Primers c and d , Equivalent to the new domain sequence in addition to the sequence equal to the 3 'end downstream of the original domain The 5 'overhangs are joined together. Of the array to be joined Length is 50 ℃ or more T_m(C or G = 4 ° C. and T or A = 2 ° C. (Assuming calculations). Ideally, 5 'overha The length of the ring should not exceed 18 bases (6 amino acids). However, also Longer overhangs are less effective but still work. Under the following PCR conditions Using 0.2 μM primer and 0.1 μg template DNA, the first two P Perform CR. Mix 10 μl of each product of PCR1 and PCR2 and mix primer a and And b were added to a final concentration of 0.2 μM and the second PCR step (PCR Perform 3). The resulting product was originally replaced with a new domain sequence Is a target gene having a domain of Precipitate the PCR product and subclonin Before restriction digestion for digestion, it may be examined on an agarose gel. Desired mutation The modified DNA fragment should be sequenced to confirm For swapping of relatively long domains, as shown in FIG. By first amplifying the three fragments from R1, 2 and 3 Exchange of the domain from gene to gene I is achieved. Then, primers a and b These partially overlapping fragments are mixed for subsequent PCR. can get The full length product is gene I with a new domain from gene II. similar By principle, add PCR in the first step and in the presence of the following four fragments Swap two domains into gene I simultaneously by the second PCR (Not shown). PCR conditions with good results are as follows: denaturation at 94 ° C. for 1 minute, 48 5 cycles of PCR, regeneration at 30 ° C for 30 seconds and extension at 72 ° C for 2 minutes. I did Following these first five cycles, except that regeneration was performed at 60 ° C. for 30 seconds. The program was used for 30 cycles. First 5 cycles at lower temperature The rationale for this is to anneal the PCR primers with 5 'overhangs. This is to ensure. Increasing the temperature in the later cycle Amplification is limited to the sequence amplified during the first 5 cycles. About all primers T_mShould be set around 60 ° C. For convenience of subsequent cloning And full-length anchor primers (a and b, FIGS. 14 and 15) Other restriction sites and / or overs for CR subcloning vectors -Hang included. To reduce non-mutated background values, It is important to use as little template DNA as possible (usually less than 0.1 μg) . The above results show that the engineered thioester has an altered substrate specificity Of modification of the plant acyl-ACP thioesterase sequence so as to produce Prove that. These thioesterases are expressed in host cells and Provides gene-engineered thioesterases and redefines the native pathway of fatty acid synthesis Modifications can be made to obtain fatty acids of defined composition. In particular, genetically manipulated The expressed thioesterase is expressed in the seeds of oilseed plants and has the desired TAG content. The child's natural raw materials can be provided. All publications and patent applications mentioned in this specification are subject to the present invention. It shows the state of the art for those skilled in the art. All publications and patent applications are Indicate in print that editions and patent applications are specifically and individually incorporated by reference. As noted, to the same extent is incorporated herein by reference. The foregoing invention has been illustrated and described in some detail by way of illustration and example for purposes of clarity of understanding. Have been described in detail, but within the scope of the claims, It will be clear that modifications are possible.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, L U, MC, NL, PT, SE), CA, JP

Claims

[Claims] 1. Modified acyl-ACP substrate hydrolyzed by thioesterase Engineered plant acyl-ACP thioestera with modified substrate specificity A method for obtaining a protease, comprising: (A) modifying the gene sequence encoding the first plant thioesterase protein To produce one or more modified thioesterase gene sequences, wherein said modified sequences are Substitution or insertion of one or more amino acid residues in the mature part of one plant thioesterase Coding for an engineered acyl-ACP thioesterase with an insertion or deletion And (B) expressing the modified gene sequence in a host cell, Producing a child engineered plant thioesterase; and (C) assaying the engineered plant thioesterase to modify Detecting the substrate specificity, A method that includes 2. The amino acid substitution, insertion or deletion is the C-terminal of the first plant thioesterase. 2. The method of claim 1, wherein the two thirds of the side. 3. Amino acid substitution, insertion or deletion of the amino acid of thioesterase shown in FIG. Claims which are in the region corresponding to amino acids 230 to 285 by the common number of the sequence. The method according to box 1. 4. Amino acid substitution, insertion or deletion of the amino acid of thioesterase shown in FIG. Claims which are in the region corresponding to amino acids 315 to 375 by the common number of the sequence. The method according to box 1. 5. One or more amino acid residues in the mature portion of the first plant thioesterase 2 with the corresponding amino acid of the plant thioesterase, at which time the first and An acyl-ACP substrate selective for the two plant thioesterases 2. The method according to claim 1, wherein the method differs in terms of saturation and / or saturation. 6. The first thioesterase is a peptide domain from the second thioesterase 6. The method of claim 5, wherein the method is modified by substitution of 7. The peptide domain is the active histidine and second thioesterase protein 7. The method according to claim 6, comprising an active cysteine residue. 8. A genetically engineered plant acyl-ACP thioesterase, For acyl-ACP substrates hydrolyzed by thioesterase, the plant Altered substrate specificity compared to wild type acyl-ACP thioesterase in The genetically engineered thioesterase shown. 9. 9. The method according to claim 8, wherein the wild-type thioesterase is a class II thioesterase. A genetically engineered thioesterase as described. Ten. 9. The method according to claim 8, wherein the wild-type thioesterase is a class I thioesterase. A genetically engineered thioesterase as described. 11． DNA encoding genetically modified plant acyl-ACP thioesterase An acyl-ACP substrate, wherein said substrate is hydrolyzed by said thioesterase Has been modified compared to the wild type acyl-ACP thioesterase of the plant. A sequence encoding a genetically engineered thioesterase that exhibits specific substrate specificity. 12． Claim 11 wherein the wild type thioesterase is a class II thioesterase. DNA sequence as described. 13. 11. The method according to claim 11, wherein the wild-type thioesterase is a class I thioesterase. DNA sequence as described.