JPH11501829A

JPH11501829A - Method for facilitating autologous blood donation and treating oxygen debt

Info

Publication number: JPH11501829A
Application number: JP8525893A
Authority: JP
Inventors: エフ．カスパリ，ロバート; エイ．マッカーティ，マイケル; エイ．シューメーカー，スティーブン; ジュニアテンプルトン，ダブリュー．デイビス; ジェイ．ガーバー，マイケル
Original assignee: ソマトジェン，インコーポレイテッド
Priority date: 1995-01-13
Filing date: 1996-01-16
Publication date: 1999-02-16
Also published as: AU4746596A; CA2207775A1; WO1996028197A1; EP0802805A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、自家供与を容易にするための方法に関する。患者血液の一部を取り出し、次に、酸素送達を増強する量の無細胞ヘモグロビンを投与する。本発明はさらに、酸素送達を増強する量の無細胞ヘモグロビンの投与によって、酸素負債を処置するための方法に関する。 (57) [Summary] The present invention relates to a method for facilitating self-donation. A portion of the patient's blood is removed, and then an amount of cell-free hemoglobin that enhances oxygen delivery is administered. The invention further relates to a method for treating oxygen debt by administering an oxygen-enhancing amount of cell-free hemoglobin.

Description

【発明の詳細な説明】自家血液供与を容易にし、そして酸素負債を処置するための方法発明の背景手術中に、多くの患者は血液を失う。臨床実施上では、ごく普通量の血液の急性損失の患者は、失った容量を補うことのみを必要とし得る。しかし、より重症な血液損失は、容量の補充および酸素運搬容量の補充の両方を必要し得る。多量の血液損失を伴う状況では、他の血液成分（例えば、血小板および凝固因子）を、全血を輸血することにより補充する必要があり得る。多くの手術は、血液損失のために血液輸血の必要性をもたらし得る。毎年手術処置に関連して、約９百万ユニットの血液が輸血されると概算されている。ヘモグロビン濃度を10g/dL（これは、輸血に対して一般的に認められている指標である）未満にさせないとき、術後回復が促進され得ることが一般的に認められている（Zauder，Anesth．Clin．North Amer．8:471-80，1990）。同種異系の血液輸血（提供者（患者ではない）から集められた血液の輸血）は、以下の(1)および( 2)を含む、受血者に固有の危険を負わす：(1)感染性疾患の伝染（すなわち、ヒト免疫不全症ウイルス(HIV)、非Ａおよび非Ｂ型肝炎、Ｂ型肝炎、Yersinia ente rocolitica、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１および２、サイトメガロウイルス）、および(2)免疫学的反応（すなわち、輸血反応、免疫抑制、移植片対宿主反応）。同種異系の血液の輸血を用いる他の欠点は、普遍的ではない適合性、制限された入手性、および制限された安定性（42日以下の貯蔵寿命：凍結され得ない）を包含する。これらの危険および制限は、輸血用の自家血液（患者自身の血液）の使用が望ましいことを強調してきた。輸血用の自家血液は、手術前の予備献血（pre-dona tion）によって集められ得る。予備献血（predonation）は、典型的には、手術前の６週間程度の期間内で数ユニットの患者血液を取り出すことを包含する。次に、取り出された血液は、手術中（手術時）または手術が完了した後の回復期（手術後）に使用され得る。急性正常血液量血液希釈（acute normovolemic hemodilution）（ANH）は、自家血液に曝らすことを減少するために使用される別の技法である。この手順では、血液は、手術時または手術の直前に患者から取り出される。患者から取り出される血液容量は、次に、等容量の非酸素運搬の晶質またはコロイド溶液と交換される。最終的に、患者から取り出された血液は、次に、手術の最後または必要であれば回復期間の間に再注入される。輸血のために自家血液ユニットを提供することに加えて、ANHプロセスは、晶質またはコロイド溶液による血液の希釈のために患者血液の粘度が減少するので、いくつかの手術手法の成果を改善し得る。希釈された血液の減少した酸素容量の大部分を補う基本的な機構は、心臓血液拍出量の上昇および増大された器官血液流であるようであり、その両方は有益であり得、そしてその両方は、より低いヘマトクリットでの減少した血液粘度から生じるようである（Messmerら、Eur． Surg．Res．18: 254-263，1986）。 ANHおよび予備献血の両方に関連する主要な制限は、患者の酸素運搬容量を損なうことなく、患者から取り出され得る血液量に関する制限である。すなわち、過剰の血液の供与または取り出しは、血液の酸素運搬容量を損ない得る。すなわち、患者に酸素不足または酸素負債をもたらすに十分な血液が失われ得る。従って、交換液体中の適切な酸素運搬化合物の使用が、ANH手法において、自家血液のさらなる量を供与することを可能にし得る。さらに、取り出した血液の酸素運搬液体との交換は、予備献血の間に取り出され得る血液量を増加し得る。交換液体として酸素運搬パーフルオロカーボンを使用するANH手法は、特定の限定された環境中で利用された（Rothら、米国特許第5,344,393号）。しかし、これらの手法は、50％〜100％酸素で富化された呼吸ガスの投与を必要とする。呼吸ガス中の高酸素濃度は、酸素毒性による合併症を導き得る（Beisbarthら、A dvances in Blood Substitute Research，Bolin，GeyerおよびNemo(編)、Alan R .Liss，Inc.，New York，373-380頁，1983）。従って、パーフルオロカーボン以外の酸素運搬分子の使用は、酸素運搬分子による酸素送達を増強するために呼吸ガス中の酸素を増加する必要はないので、現在認められている麻酔法とより適合する。酸素運搬交換液体としてのこのような候補物はヘモグロビンである。これは、損失血液を補充するための血液置換物（HoffmanおよびNagai，米国特許第5, 028,588号）として、および、少なくとも約50％の酸素の呼吸ガスと組み合わせて使用されるときの、急性正常血液量血液希釈における血液希釈物（Rothら、米国特許第5,344,393号）として提供された。しかし、ヘモグロビン、特に組換えヘモグロビンが、一般的な麻酔実施下での予備献血またはANHの間、血液容量増量剤および／または酸素キャリアとして有用であり得る教示は先行技術に存在しない。多くの細胞外ヘモグロビンが、酸素送達媒体としての使用および他の使用（薬物送達媒体、血管収縮剤、鉄供給源など）に提案されている。組換えヒトヘモグロビン（例えば、rHb1.1，Lookerら、Nature，356: 258-260(1992)）は、その安全性および薬物動力学が、動物および正常成人男性において評価された、新規なヘモグロビンベースの酸素キャリア（HBOC）である。 rHb1.1は、全血からではなく、培養由来の遺伝子工学された無赤血球のHBOCであるので、それは、血液の輸血に伴う危険性および制限を除外また最小限にし得る。rHb1.1が容量交換特性および酸素運搬特性を有する事実は、それを外傷、手術あるいは献血により血液を失った患者または酸素負債患者（原因が何であれ）のための潜在的な多方面での交換液体とする。rHb1.1の投与は、予備献血または ANH中に失われた酸素運搬容量部の一部分を補充する。発明の要旨本発明は、患者による自家血液供与（autologous blood donation）を容易にするための方法に関し、以下の工程を包含する： (a)患者の血液の一部の取り出す工程； (b)酸素送達を増強する量の無細胞ヘモグロビンを投与する工程；および (c)必要に応じて呼吸ガスを投与する工程（ここで、この呼吸ガスは酸素で富化されない）。本発明のさらなる局面では、患者から取り出される血液は貯蔵され得る。この方法は、この貯蔵血液をこの患者へ再投与する工程をさらに包含し得る。本発明の別の実施態様では、患者血液の一部の取り出しおよび貯蔵は、血液損失を受ける患者に対して、72時間未満前である。さらなる実施熊様では、無細胞ヘモグロビンは、非赤血球由来であり、特に組換えヘモグロビンであり、詳細にはrHb1.1 である。本発明のなおさらなる実施態様では、自家血液供与は予備献血である。本発明のさらなる局面では、自家血液供与は手術時である。本発明の別の実施態様では、本発明は、酸素負債を処置するための方法であって、酸素負債を処置するために無細胞ヘモグロビンの治療有効量を投与する工程を包含する方法に関する。本発明のさらなる局面では、無細胞ヘモグロビンは、非赤血球由来であり、特に組換えヘモグロビン、詳細にはrHb1.1である。本発明はさらに、無細胞ヘモグロビンおよび関連する供給品を含むキットを意図する。図面の説明図１は、時間の関数としての酸素負債である。最初にイヌから放血し、次に、取り出された血液容量の120％を、組換えヘモグロビン（rHb1.1；-X-）、またはコロイドその後自家血液（コントロール；-▲-）のいずれかと交換した。発明の詳細な説明一般的に、本発明は、取り出された血液の全てまたは一部を、酸素を結合し、そして組織へ酸素を放出し得る無細胞ヘモグロビンと交換することによって、自家血液供与を容易にするための方法を提供する。従って、血液希釈とは違って、本発明は、取り出された血液中のほとんどない赤血球の可能な恩恵（例えば、より多い心臓拍出）を提供するために、失われた容量のみではなく、血液の取り出しによる酸素送達容量損失の一部または全部とともに、取り出された血液を交換する。本明細書に記載するように、この違いは、特に、多量または迅速な自家血液供与が有利であるか、または酸素負債が起こりそうな結果であるときに、ある種の利点を提供する。容量増量剤による取り出された血液の補充は、しばしば、「血液希釈（hemodilution）」または「急性正常血液量血液希釈（acute normov olemic hemodilution）」と呼ばれるが、本発明は、より適切に、「急性正常血液量血液維持（acute normovolemic hemosupport」、「血液維持（hemosuppor t）」、「急性正常血液量血液増加（acute normovolemic hemoaugmentation）」、「血液増加（hemoaugmentaion）」、「手術時等容量置換（perioperative iso volemic substitution）」、または「急性正常血液量酸素処理（acute normovol emic oxgenation）」として記載される。予備蓄積は、手術があらかじめ計画されることを必要とする。血液は、手術前の数週間および数ヶ月の間に患者から供与され、次いで手術中または手術後に患者に引き続いて投与するために貯蔵される。300〜400mlユニットの血液供与が、典型的には、手術前72時間以前の最後の採血とともに、２〜７日の間隔で得られる。血液は、全血として液体状態で貯蔵され得るか、または、赤血球、および不安定成分を保存するために凍結され得る血漿に分離され得る。本発明によって、予備献血が改良され得、そして１つ以上の方法で使用が拡大される。最初に、本発明は、取り出された血液の酸素運搬容量の一部は、供与時に、無細胞ヘモグロビンと交換されるので、通常、供与される以上の血液を患者は供与することを可能にし得る。第二に、血液は、血液損失が生じるようなときの間際（すなわち、手術の72時間未満前）に、患者によって自家的に予備献血され得る。この方法は、典型的な技法による予備献血が現在可能でない、予定されていない手術のような緊急事態において、特に有用であり得る。第三に、予備献血は、複数の予備献血の間で、より頻繁にまたは時間をおかずに行われ得る。手術時等容量希釈（ANH）は、十分な容量の血液容量増量剤、特に晶質またはコロイド溶液に伴う交換により、手術の直前または手術中に血液を得るプロセスである。この実施は、手術中の血液粘度を減少し、そのことによって心臓の仕事量を減少し、そして微小循環を増加させる。次に、患者から取り出された血液は、手術中または手術後に患者に再投与され得るために貯蔵される。急性正常血液量血液希釈法の間に取り出され得る血液量、および患者における生じる望ましい残存ヘモグロビンレベルは、当業者によって容易に決定され得、そして多数の因子に依存する。これらの因子は、実施されるべき方法、患者の状態、減少する血液粘度の必要性、当業者の評価における患者のための最小限の安全ヘモグロビン量、患者へのさらなる再投与に必要とされる血液の予測量などを包含する。例えば、冠状動脈バイパス手術を受ける患者は、15％のヘマトクリットに血液希釈された（Mathru，M.およびM．Rooney，Problems Crit．Care(USA), 400-410，1991）。いくらかの血液の取り出し後または取り出しと同時に、晶質またはコロイドの血漿増量剤（または両方）を患者に投与し、例えば、任意の血液の取り出し前の血液容量に近い所望の値に血液容量を維持する。手術時血液容量増量剤が酸素の結合または放出をなし得るヘモグロビンを含む場合、手術時等容量希釈法は、患者血液の酸素運搬容量の希釈を中止し、そして「手術時等容量置換」になる。本発明では、自家血液を集める方法、特に予備蓄積および手術時等容量置換は、血液損失に面している患者にその後の輸血を可能にするための血液を得るために使用される。手術中、手術後および自家輸血を含む、血液細胞回収のための方法が、米国特許第5,344,393号に記載され、これは本明細書に参考として援用される。血液損失に面している患者は、適切な酸素を組織に送達する血液の能力を十分に危うくするような十分な血液を失い得る状況に直面しているか、または直面しそうな人である。このような状況は、前もって計画された手術ならびに緊急の計画されない手術および外傷を包含する。外傷および緊急の計画されない手術の場合、手術時等容量置換は、基本的に手術実施の開始まで、または手術実施中でさえ、血液の供与を可能にする。組織へ適切な酸素を送達する血液の能力が危うくなると、酸素負債または酸素不足と呼ばれる。酸素負債は、身体または身体の任意の組織の酸素消費必要量が身体の酸素供給能力を超えるときに、生じ得る。酸素負債は、例えば、吸入された酸素の消費の減少として測定され得る。この減少は、肺で酸素を結合し、そして代謝組織へ酸素を送達する血液の減少した能力を反映する。酸素不足はまた、酸素要求量（ベースラインの安定したVO₂に等しい）と実際のVO₂との間の時間経過に伴う累積する差として定義されている。次に、VO₂は、吸入酸素消費量、すなわち、吸入ガスと排出ガスとの間の酸素含有量の差として定義され、そしてFi ckの式を解くことによって求められ得る：VO₂＝心臓血液拍出量（ml血液／分）＊動静脈酸素含有量差（ml O₂／ml血液）。従って、不足または負債は、所定の期間にわたる要求量を下回るVO₂の減少の全量である（Siegel，Amer．Asso c．Clin．Chem．36(8B):1585，1990）。本発明の方法では、無細胞ヘモグロビンは、赤血球輸血よりもより迅速に、酸素負債を逆転させることを示した。従って、本発明はまた、しばしば血液損失、特に多量の血液損失に関連する酸素負債の徴候を予防および処置するのに有用である。その後の再投与のために患者によって典型的に予備献血される血液（急性の予備献血）量は、２ユニット程度である。いかなるときにも、より多くの血液の取り出しは、適切に組織を酸素化する血液の能力を危うくすることをもたらし得、従って各予備献血間の十分な回復時間を伴う複数の予備献血は、医療手法の前に十分な自家血液を預けることを要求し得る。しかし、典型的には、集められた血液の貯蔵における制限ならびに治療手法および献血を計画することの論理から、わずかに12ユニットが、拡大された予備献血中に集められる。従って、手術時の自家輸血の要求を満たすため十分な時間にわたり、十分な血液を集めることは可能ではない。患者の必要性を満たすに十分な自家血液がない場合、患者は、同種異系の血液ユニットに曝され得る。しかし、取り出された血液のいくらかまたは全体が、酸素を結合し放出し得る無細胞ヘモグロビンと交換されると、患者から一時に取り出され、そしてその後の使用のために貯蔵された血液の部分が増加され得るか、または献血間の回復時間が減少され得る。従って、任意の一時的な献血で集められた量はともに、本発明の方法を用いることによって、拡大された予備献血プロトコル中に集められた総血液量であり得るので増加され得る。さらに、本発明は、血液損失に直面する患者のみに限定される必要はなく、従って自家血液ユニットを貯蔵する；本発明の方法は、このような輸血が必要な任意の患者に対する輸血のための任意の提供者によって供与された血液（同種輸血）の量を増加するために使用され得る。従って、急性正常血液量血液増加のための利用に加えて、本発明は、可能なまたは勧められる以上の血液の供与を可能にするために使用され得る（「過度供与（hyperdonation）」。本発明の実施において、自家血液供与での可能な使用のための血液の取り出しと同時またはその後に、無細胞ヘモグロビンが患者に投与される。好ましくは、血液の取り出しおよび無細胞ヘモグロビンの投与は、互いに連続して、またはその後に実施されるが、同時の血液取り出しおよび無細胞ヘモグロビンの投与は、特定の医療状況に有利であり得ることが予想される。例えば、外傷および緊急の予定されていない手術の場合には、重症な出血または手術を即ちに開始する必要性から、同時の血液取り出しおよび無細胞ヘモグロビン投与を実施する必要があり得る。患者の予備献血される血液の取り出しおよび貯蔵は、血液供与および貯蔵の任意の周知方法を用いて達成され得る。無細胞ヘモグロビンの投与は、典型的には、注入、特に静脈内注入の形態である。無細胞ヘモグロビインの投与量は、当業者によって容易に決定され得、そして他の因子の中でも、患者によって要求される液体量、注入速度、取り出された血液量、無細胞ヘモグロビンの量および酸素運搬容量（Ｐ₅₀）、および注入されるべき液体総量に依存する。投与される無細胞ヘモグロビンの量は、好ましくは、血液の取り出しの結果としての酸素送達損失のいくらかまたはすべてを交換するのに十分な量である。投与されるべき無細胞ヘモグロビンの量は、取り出される血液量のすべてまたは一部、例えば、取り出される血液量の約10％から取り出される血液量の約150％、好ましくは取り出される血液量の約50％から取り出される血液量の約150％を、交換し得る。あるいは、本発明の方法に従って投与され得る無細胞ヘモグロビンの量は、血液の取り出しの結果としての酸素送達容量の損失のすべてまたは一部を交換し得る；損失血液量の酸素送達容量の1:1の交換は必要ではない。しかし、最少で、ヘモグロビン形態での十分な酸素送達容量を、組織に十分な酸素を送達するか（酸素不債の予防または処置のため）、または過度供与を容易にする血液の能力における重大な危機を回避するために、注入しなければならない。過度供与、血液増加のため、または酸素負債の予防もしくは処置のために使用される無細胞ヘモグロビンの最適な投与量は、当業者によって決定され得る。このよな最適投与量は、例えば、基礎をなす医療状態、個々の患者の特性、予備献血の計画、自家輸血の必要条件などに依存する。別の代替として、無細胞ヘモグロビンは、上記のようなヘマトクリットレベルを減少させるため、そして酸素送達を保つ間の血液粘度を減少させるために投与され得る。典型的には、無細胞ヘモグロビンに対する注入速度は、約１ml/kg/時から約75ml/kg/時の範囲の速度での、制御された流れから本質的には重力による流れの範囲である。適切な速度は、約７ml/kg/時から約30ml/kg/時を包含する。自家血液供与の促進または酸素負債を処置するために用いられる本発明の方法の無細胞ヘモグロビンは、活性成分として、生理学的および／または薬学的および／または治療的に有効量のヘモグロビンを、単独で、またはその他の活性因子または不活性因子と組み合わせて含有し得る。例えば、非経口治療組成物は、0. 001％と50％（W/V）との間のヘモグロビンを含有する滅菌等張食塩水を含有し得る。適切な組成物はまた、０〜200mMの１種以上の緩衝液（例えば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、重炭酸緩衝液、またはグッド緩衝液）を含有し得る。塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウムのような塩類もまた、０〜２Mの濃度で本発明の組成物に含有され得る。さらに、本発明の組成物は、０〜２Mの１種以上の炭水化物（例えば、グルコース、マルトース、ラクトースのような還元性炭水化物、またはスクロース、トレハロース、ラフィノース、マンニトール、イソスクロース、またはスタキオースのような非還元性炭水化物）、および０〜２Mの１種以上のアルコールまたはポリアルコール（例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、デキストラン、またはポリオール）を含有し得る。本発明の組成物はまた、 0.005〜１％の１種以上の界面活性剤、および０〜200μMの１種以上のキレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、エチレングリコール-ビス（β- アミノエチルエーテル）N,N,N',N'-四酢酸（EGTA）、ｏ-フェナントロリン、ジエチルアミントリアミン五酢酸（DTPAはまた五酢酸として知られている）などを含有し得る。本発明の組成物はまた、約pH 6.5〜9.5であり得る。別の実施態様では、組成物は、０〜300mMの１種以上の塩（例えば、塩化物塩）、０〜100mMの１種以上の非還元性糖、０〜10mMの酸化防止剤、０〜100mMの１種以上の緩衝液、0.01〜0.5％の１種以上の界面活性剤、および０〜150mMの１種以上のキレート剤を含有する。なおさらなる実施態様では、組成物は、０〜150m M NaCl、０〜10mMリン酸ナトリウム、および0.01〜0.1％の界面活性剤、および０〜50μMの１種以上キレート剤を含有し、pH 6.6〜7.8である。別の適切なヘモグロビン含有組成物は、５mMリン酸ナトリウム、100〜150mM NaCl、0.025％〜 0.1％のポリソルベート80、２mMアスコルビン酸ナトリウム、および25μM EDTA を含有し、pH 6.8-7.6である。必要であれば、他の成分が添加され得る。例えば、０〜５mM還元剤（例えば、亜ジチオン酸塩、第一鉄塩、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、およびアスコルビン酸塩）が、組成物に添加され得る。処方剤へのさらなる添加物は、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸またはその塩、αトコフェノール）、抗菌剤、膨張圧剤（例えば、アルブミンまたはポリエチレングリコール）、鉄キレート剤（例えば、デスフェロキサミン）、および当業者に公知の他の処方可能な塩、糖、および賦形剤を包含し得る。その選択は、達成されるべき特定の目的、および容易に決定され得るこのような添加物の特性に依存する。本発明の組成物は、当該分野の任意の公知の方法によって処方され得る。このような処方方法は、例えば、単純混合、連続添加、乳化、透析濾過などを包含する。本発明のこのような組成物は、酸素負債の処置に使用され得る。さらに、このよな組成物は、血液希釈または血液増加の手法でのように自らの意志によるか、または外傷のような自分の意志によらない場合にでも、出血を処置するために使用され得る。本発明の処方剤は、上記のような、組織への酸素送達を増大するためのみならず、大きなヘモグロビンタンパク質分子の存在による膨張圧を提供する単純な容量増量剤としても使用され得る。タンパク質のような高分子によって及ぼされる浸透圧部分は、コロイド浸透圧または膨張圧である。脈管内血漿の膨張圧は、間質液の膨張圧より高い。血漿の膨張圧は、脈管内空間に水を保持する主要な力あり、従って脈管内容量を維持する。投与される無細胞ヘモグロビンは、可溶性血漿タンパク質として循環するので、コロイド浸透圧効果を働かせることによって、脈管内容量を維持および膨張させる可能性を有する。これは、脈管内空間から水を押し出す傾向の毛細血管系内での流体静力学的圧力を反対平衡させる。膨張圧は、毛細血管非透過性高分子のモル濃度に比例する。通常、血漿アルブミンは、血漿の膨張圧の70〜80％を担う。ヘモグロビンの５％溶液のコロイド浸透圧は、Wescor 4420 Colloid Osmometerで測定される場合、５％ヒト血清アルブミンのコロイド浸透圧に類似する。アルブミンの分子量が66,500ダルトンであり、そしてヘモグロビンの分子量が64,600ダルトンであるので、それらは類似のモル濃度を有し、従って、類似の膨張圧を有する。アルブミンは、通常約500ml 容量中25g投与量で一般的に処方される。従って、同様の容量中での25gのヘモグロビンの投与は、アルブミン25gの投与と同様の容量増加特性を有し得る。本発明のヘモグロビンの生理学的および／または薬学的および／または治療的有効量は、患者の肺で酸素を結合し、そして組織中での酸素欠損（低酸素症）の病的影響を予防するために、組織中に十分な酸素を放出し得るヘモグロビン量である。ヘモグロビンが酸素を結合し、そして組織に酸素を放出するのに有用であるかどうかは、酸素平衡結合曲線（OEC−P₅₀値およびHill係数[n]によって典型的に特徴づけられる）および下記の他の因子によって決定され得る。OECを測定するための適切な方法は、HoffmanおよびNagaiの米国特許第5,028,588号（本明細書に参考として援用される）に記載されている。組織に送達される酸素量は、例えば、無細胞ヘモグロビンのOEC、所定の組成物中の無細胞ヘモグロビン濃度、患者に投与される無細胞ヘモグロビンの量、無細胞ヘモグロビンの患者における半減期、および動脈中の酸素分圧ならびに標的組織中の酸素分圧を包含する複数の因子によって決定される。例えば、米国特許第5,028,588号に記載されるように、低親和性ヘモグロビンは本発明の方法に従って使用され得る。低親和性ヘモグロビンは、赤血球中で結合した等量のヘモグロビンよりも十分に酸素を送達し得、従って、より低い投与量（例えば、赤血球輸血中に含有されるヘモグロビン量と比較して）が利用され得る（実施例１〜３を参照のこと）。反対に、より高い親和性ヘモグロビンが使用されると、同量の酸素送達を達成するために、より高い投与量の投与（kg体重当りのヘモグロビン量）が要求される。より高い親和性ヘモグロビンは、腫瘍のようなより大きな低酸素症を体験する組織で、より多くの酸素を放出するために使用され得る。本発明に従って、血液粘度は、無細胞ヘモグロビンの投与の結果として低下することは注目される。一般的に、「急性正常血液量血液維持」、「血液維持」、「急性正常血液量血液増加」、「血液増加」、「手術時等容量置換」、または「急性正常血液量酸素処理」で生じる血液粘度の減少により、種々の器官での平均的な組織PO₂を増加させることが認められた（Messmerら、Res ．Exp．Med. 159 :152-56，1973）。さらに、酸素送達媒体（無細胞ヘモグロビン）からの酸素拡散は、ヘモグロビンからの酸素の解離のみに関連し、赤血球膜を通しての酸素の拡散には関連しないので、組織の酸素化は無細胞ヘモグロビンの投与によって増強され得る。理論に捕らわれることなく、ヘモグロビン溶液の投与は、O₂の増加した拡散送達および血液粘度の減少の両方の結果として、組織の増加した酸素化をもたらし得る。血液増加の場合、酸素は、赤血球からのみではなく、血漿自身中の溶解したヘモグロビンからも得られることは注目される。無細胞ヘモグロビンは、実質的に細胞中で結合されず、そして完全な細胞または細胞破片の実質的な量を含有しないヘモグロビンである。無細胞ヘモグロビン溶液の出発材料として適するヘモグロビン含有細胞（例えば、赤血球）は、多数の供給源から容易に入手可能である。このような供給源は、限定されないが、古いヒト赤血球、ウシ赤血球を包含する。ヘモグロビンを発現し、従ってヘモグロビン含有細胞を提供するために使用される非赤血球系は、限定されないが、細菌、酵母、植物、および哺乳動物細胞を包含する。例えば、屠殺ウマは、非常に多量のヘモグロビン含有細胞を生じる。さらに、特定種または特定品種の動物が、特定の使用に特に適するヘモグロビン含有細胞を産生する場合、これらの動物は、必要とされる血液を供給するために、この目的のために特に繁殖され得る。さらに、組換え変異体、非変異体、またはトランスジェニックヘモグロビン赤血球およびそれらの先駆体を発現し得るトランスジェニック動物が産生され得る。ヒト血液バンクは、特定の満期日後に、ヘモグロビン含有細胞を含むヒト血液を破棄しなければならない。このように破棄される血液もまた、本発明の出発材料として用いられ得る。任意の供給源からのヘモグロビンの精製は、当該分野で公知の精製技法を用いて達成され得る。例えば、ヘモグロビンは、古いヒト赤血球から以下により単離および精製され得る：赤血球の溶血、その後のクロマトグラフィー（Bonhard，K .ら、米国特許第4,439,357号；Tayot，J.L.ら、欧州特許公開第0132178号；Hsia , J.C.欧州特許第0231236 B1号）、濾過（Rabiner，S.F.ら、J ．Exp．Med. 126: 1127-1142，1967；Kothe，N.およびEichentopf，B.米国特許第4,562,715号）、加熱（Estep，T.N.，PCT出願番号PCT/US89/01489，Estep，T.N.，米国特許第4,8 61,867号）、沈澱（Simmonds，R.S.およびOwen，W.P.，米国特許第4,401,652号；Tye，R.W.，米国特許第4,473,494号）、またはこれらの技法の組み合わせ（Ra usch,C.W.およびFeola,M.，欧州特許第0277289 B1号）。トランスジェニック動物で産生された組換えヘモグロビンは、クロマトフォーカシングにより精製されたが（Townes，T.M.およびMcCune，PCT公開PCT/US/09624）、一方、酵母および細菌で産生されたものは、イオン交換クロマトグラフィーおよび固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによって精製された（Hoffman，S.J.およびNagai ,K.，米国特許第5,028,588号、Hoffmanら、WO90/13645およびMilneら、WO95/140 38；これらは本明細書に参考として援用される）。天然および組換え供給源に由来するヘモグロビンは、種々の技法によって、解離の予防および／または酸素運搬特性を改良するために化学修飾される。任意のこれらの技法が、本発明の方法に適するヘモグロビンを調製するために使用され得る。このような修飾の例は以下に見出される：Iwashita，Y.ら、米国特許第4, 412,989号；Iwashita，Y.およびAjisaka，K.，米国特許第4,301,144号；Iwashit a，K.ら、米国特許第4,670,417号；Nicolau,Y.-C.，米国特許第4,321,259号；Ni colau,Y.-C.およびGersonde，K.，米国特許第4,473,563号；Wong，J.T．米国特許第4,710,488号；Wong，J.T.F.，米国特許第4,650,786号；Bonhard，K.ら、米国特許第4,336,248号；Walder，J.A.，米国特許第4,598,064号；Walder，J.A.，米国特許第4,600,531号；およびAjisaka,K.およびIwashita，Y.，米国特許第4,3 77,512号など。一般的に、ヘモグロビンのこれらの化学改変は、ヘモグロビン分子の１つ以上のアミノ酸残基の化学的変化または反応を包含する。これらは、α ／βダイマーに化学的に連結するか、またはヘモグロビンの立体的な変換を改変するか（例えば、ジホスフォグリセレート結合部位での結合により）、またはダイマーを連結し、それと同時に酸素結合特性を改変するいずれかの試薬を用いる。本明細書に参考として援用されるAndersonらのWO93/09143の同時係属出願に記載されるような、グロビン鎖の化学的な重合化のような改変、グリコシル化、およびポリエチレングリコール化(pegylation)および／またはリポソームまたは細胞膜中へのカプセル化もまた意図される。しかし、これらのすべてのヘモグロビンは、無細胞ヘモグロビンでなければならない。すなわち、それらは、出発材料の細胞成分を実質的に含有してはならない。ダイマー化に対してヘモグロビンを安定させるか、または酸素親和性を変えるために改変された遺伝子的に改変されたヘモグロビンもまた、本発明の方法に適する。特に適切なヘモグロビンは、組換え的に誘導されたヘモグロビンであり、例えば、ダイマー形成に対して安定化するために少なくとも変異を有するE．col iで産生されたヘモグロビン、好ましくは、Hoffmanらの同時係属の特許公開番号 WO90/13645に記載される、ダイマー形成に対して安定化する変異を少なくとも有し、かつ酸素親和性を変える変異を有するE.coliで産生されたヘモグロビン（rH b1.1と呼ばれる）であり、Milneら、特許公開番号WO 95/14038の方法によって精製されたヘモグロビンである。無細胞ヘモグロビンの投与に続いて、患者は血液損失を体験し得るか、または体験し得ない。このような血液損失は、多くの型の外傷の結果として生じ得るが典型的には手術によって生じる。この投与後の間に失なった血液量に依存して、患者の血液のいくらかは再投与され得る。血液の再投与方法は周知であり、再投与される血液量は、たとえ行われるとしても当業者によって決定され得る。患者血液の一部の取り出し後の任意の時、特に血液損失の間および／または無細胞ヘモグロビン投与後に、増強された酸素含有量を有する呼吸ガスを患者に投与することがときには推奨される。呼吸ガス中のより高い濃度の酸素は、肺中の酸素分圧を増加し、そしていくらかのヘモグロビン、特に赤血球細胞内のヘモグロビンよりも有意に低い酸素親和性を有するヘモグロビンの酸素結合を改善し得る。従って、要求されないが、本発明は、本発明によって考慮されるような血液損失を体験する患者に、酸素を富化した呼吸ガスを投与することを意図する。呼吸ガスは、本質的には100％酸素までの、空気中に認められる約20％よりも多い任意の酸素量で富化され得る。本発明の実施中に患者に酸素を富化した呼吸ガスを投与する利点が存在し得るが、酸素を特に50％を超える酸素富化した呼吸ガスの吸入から、潜在的な有害の効果が生じ得る。富化された酸素含有量の呼吸ガスを吸入することによる有害効果のいくつかは、肺水腫および内皮組織損傷を包含する（Harper，Principles a nd Methods in Toxicology ,第３編、Raven Press，883頁）。そのような過剰に酸素化された呼吸ガスが麻酔と組み合わせて使用されるとき、これらの影響はさらに増強され得る。従って、患者に投与される呼吸ガスは、50％未満の酸素、そしてより好ましくは約20％（周囲空気酸素含有率）であることが望ましい。血液増加キットもまた、本発明によって意図される。このようなキットは、血液増加に使用されるヘモグロビン溶液、さらにこの手法に必要な供給物を含む。これらの供給物は、例えば、試薬、チューブ、バッグ、容器、フィルターなどを含み得る。本発明は、血液の自家供与を容易にするのに有用であり、そしてそうでなければ可能なまたは推奨されるよりも多くの血液の供与を可能にし得るのに特に有用である（「過剰供与」）。本発明はまた、輸血のみによるよりも迅速に、酸素負債からの回復に有用である。例えば、本発明は、予備献血された血液の酸素運搬容量の一部が無細胞ヘモグロビンに交換されるので、通常供与されるよりも多くの血液を患者は供与し得る。さらに、血液は、血液損失が生じるようなとき間際（すなわち手術の前72時間未満）に、患者によって予備献血され得る。この方法は、典型的な技法による予備献血が現在可能でない緊急時、予定にない手術において特に有用であり得る。さらに、予備献血は、より頻繁に、または複数回の予備献血事象の間のわずかの時間に行い得る。本発明はまた、血液増加を体験する患者が、高酸素含有量の呼吸ガスを吸入することが要求されない場合に有用であり、そのことによって、増強された酸素含有量を含むこのような呼吸ガスの吸入が有害であり得る場合、患者の自家血液供与を可能にする。本発明または、血液損失、特に多量の血液に関連する血液損失と合併してしばしば生じる酸素負債に関連する症状の予防および処置に有用である。実施例以下の実施例は、あらゆる点で本発明の範囲を限定することを意図せず、本発明の特定の実施態様を記載するために提供される。実施例１ 5g/dL 無細胞ヘモグロビン溶液による組織への酸素送達の実証 ³¹Ｐ核磁気共鳴（NMR）分光法は、細胞組織および器官への酸素輸送、ならびに細胞組織および器官の生物エネルギー学的状態の、鋭敏で非侵襲的な精査である（Taylorら、Proc ．Soc．Magn．Reson．Med. 4: 292,1985；Bittlら、Biochem istry ，26: 6083-6090，1987；Rosenbergら、Ann ．Emerg．Med. 18: 341-347(19 89)；MassonおよびQuistorff，Biochemistry 31: 7488-7493，1992；Blumら、An n ．Surgery 83-88，1986年７月；Icenogleら、Proc ．Soc．Magn．Reson．Med. 5 : 899-900，1986；Kushmerickら、Adv ．Exp．Med．Biol. 159: 303-325，1982； Murrayら、Anesthesiology 67: 649-653，1987；Katzら、Am ．J．Physiol. 255: H189-H196，1988；Marcovitzら、Am ．Heart J. 124: 1205-1212，1992；Martin ら、Am ．J．Surgery 164: 132-139，1992；Thompsonら、Quart ．J．Med. 85: 89 7-899，1992）。³¹Ｐ NMRを用いて、組織における酸化的エネルギー代謝に関係するリン酸化合物[ホスホクレアチン（PCr）、オルトリン酸（Pi）、およびヌクレオチド三リン酸（おもにアデノシン三リン酸(ATP)）]の量を、非侵襲的にモニターし得る。例えば、Piは、低酸素または虚血の間に蓄積する、リン代謝の低エネルギー分解産物であり、一方、ATPおよび特にPCrは、低酸素または虚血の間に減少する（Taylorら、前出；Blumら、前出；Icenogleら、前出；Marcovitzら、前出；Martinら、前出）。 ³¹Ｐ NMR分光法を、等容の交換輸血の前、交換輸血中、および交換輸血後に、ラット消化管をモニターするのにリアルタイムで適用して、全血の代替物としてのその機能の全範囲に関して、組換えヒトヘモグロビン（rHb1.1；Hoffmanら、P roc ．Nat．Acad．Sci. USA 87: 8521-8525，1990）の酸素送達の効力を決定した。これらの実験のコントロールは、ヒト血清アルブミン（HSA）を含有しそして酸素キャリアを含有しない溶液での交換輸血を受けたラット、および擬似カニューレ挿入のみを受けそして交換していないラットであった。雌雄どちらかのSprague-Dawleyラット（体重283〜552g）を、シラスチック（s ilastic）チューブ（内径0.012インチ、外径0.025インチ）を使用して、大腿の動脈および静脈を通してカニューレ挿入した。血液試料を、ヘマトクリット決定用に動脈カテーテルから定期的に取り出した（コントロールについては40％〜57 ％）。組換えヒトヘモグロビンを凍結し、-70°Fで貯蔵し、そして５mMリン酸緩衝化生理食塩水中の５％(w/v)溶液として使用直前に解凍した。動物をネンブタール（50mg/kg）で麻酔し、計量し、そして内径31cmの水平1.9 Tマグネットの中の38℃の加熱パッド上に置いた。カニューレを、ヘパリン化した生理食塩水で洗浄し、次に約１mL/分の速度にセットした蠕動ポンプに接続した。rHb1.1またはHSAのいずれかを、静脈カニューレ中に汲み上げ、そして血液を除去して、ヘマトクリットが低過ぎて（＜３％）、確実に測定できなくなるまで（約45分間）、動脈カニューレを通して容量を測定し；次いでポンプを止めた。肝臓、消化管、腹筋系、および横隔膜からのベースライン³¹Ｐ NMRスペクトルを、カニューレ挿入後１時間までの間および等容交換の前に、直径30mmの表面コイルを用いて、32.5MHzにて５〜10分間ブロックで得た。次に、動物の血液をrHb 1.1またはHSAのいずれかと交換し、そして標的器官の³¹Ｐ NMRスペクトルを、４〜６時間行った。動物を、等容交換の前後に計量し、そして交換プロセスの間に２％以内で液体平衡を維持したことが認められた。 60μs rfパルス（コイル表面で約200°）後の自由誘導減衰を、２kHz掃引（61 .54ppm）および２秒間の繰り返し時間で２Ｋデータポイントで収集した。２秒オーダーのスピン−格子緩和時間（Ｔ₁）を有するので、この繰り返し時間はPCrシグナルをいくぶん弱めた（Bittlら、前出）。分光計のVAXコンピューターからの時間−ドメインデータを、Sun SPARC-2ワークステーションに移し、そしてNMRi （Syracuse，New York）フォーマットに変換し、10Hzフィルターでアポダイゼーション（apodization）し、フーリエ変換し、位相を揃え、そしてベースライン補正した。ピーク面積、ピーク位置、およびピーク幅を、NMRiソフトウェアを用いてシグナルをローレンツ型（Lorentzians）にあわせることにより、全ての分離可能なピークについて決定した。シグナルの幅は、PCrの30HzからATPのβ-リン酸の約60Hzまで変化した。化学シフトを、PCrに関してδ＝-2.35ppmで報告する。 pHを、下記の式に従って、PCrとP1との間の化学シフトの差（ppm）から決定した： pH＝pK ＋ log[(Δ-Δ_min)/(Δ_max-Δ)] ここで、pK＝6.75であり、Δ_min＝3.27ppmであり、そしてΔ_max＝5.69ppmである。ラット全血についての正常pH（Bittlら、前出）は、7.38±0.11である。この方法は、確立された調査結果（Kushmerickら、Adv ．Exp．Med．Biol. 159:303-3 25，1982）と一致して、7.03の正常ヒト前腕筋肉の静止pHを与えた。 PCrおよびATPからのシグナルを、ベースライン³¹Ｐ NMRスペクトルで観察した。小さなPiシグナルの化学シフト（δ＝2.93ppm）から、pH 7.44±0.10が計算された。この値は、全血（前記を参照のこと）について報告された値に近く、そして腹部組織について報告された値（7.35±0.11）(Bittlら、前出)と一致する。化学シフト（および、よってpH）測定における標準誤差が、ベースラインスペクトルで±0.10ppm（n＝21）であることが見い出された。酸素送達の減少および排除に関連する³¹Ｐ NMRスペクトルにおける変化をモニターし得ることを明確に決定するために、ラット（n＝3）の全ての血液を、1.2m L/分の速度でHSAと交換した。指数関数的交換プロセス（ｔ_1/2 約８分）を終了し、そして³¹Ｐ NMRスペクトルをさらに40分間モニターした。交換開始後43±11 分（または半減期の約５倍）で、動物は呼吸停止に陥った。交換開始後80分で得られた動物の³¹Ｐ NMRスペクトルは、ベースラインレベルに比較して、PCrシグナルにおける２倍降下をともなって、増加したP_i（＞800％）シグナルによって占められた。主な変化は、約25％未満のヘマトクリットで生じた。ここで、P_i、における指数関数的な増加が、ゼロに降下したヘマトクリットとして認められた。動物のヘマトクリットは正常より低下していたので、約25％の明白な臨界ヘマトクリットが達成されるまで、普通の高エネルギーリン酸（PCrとして）の³¹Ｐ NMRシグナルでの＜10％の降下、およびPiでの＜50％の中程度の上昇が存在した。この臨界ヘマトクリットで、高エネルギーリン酸対ヘマトクリットのデータは、明白な傾きの変化を示す。25％を超えるヘマトクリット（ｈ＞25％）に対する直線回帰(l inear fits)は、0.017±0.094の傾きおよび101.3±3.1％の切片を与えるが、一方、25％未満のヘマトクリットに対しては、傾きおよび切片は、それぞれ2.12± 0.14および50.6±4.5％であった。h＞25％に対して決定された傾きが、ゼロと有意に異ならなかったという事実は、ラットが、ヘマトクリットにおける約２倍までの減少の、血液希釈に耐えるかなりの予備能力を有することを示す。近似臨界ヘマトクリット未満では、直線の傾きは、ゼロと有意に異なることに留意されたい。このラットモデルでの臨界ヘマトクリット（hc）を、上記の２つの直線回帰の交差点からhc＝26.0±2.0％として決定した。ヘマトクリットが低下し、そして組織の酸素化が下降するので、組織は、乳酸蓄積からアシドーシスになった。交換前の平均pH（h＝57％）は7.58±0.12であり、そしてヘマトクリットがゼロに近づくにつれ、これは6.8未満に低下した。さらに、57％と約25％との間のヘマトクリットについてはpH変化はほとんどなく、そして約25％未満では著しい低下がみられた。従って、ヘマトクリットによる pH変化は、２つの直線をデータに回帰すること、および上記のように交差点を計算することによって、臨界ヘマトクリットの独立的な評価として使用され得る。従って、約25％と57％との間のヘマトクリットについては、直線に対する式は、 pH＝(2.05±3.16)×10^-3h＋(7.32±0.14)であり、約25％未満のヘマトクリットについては、直線に対する式は、pH＝(2.06±0.55)×10^-2h＋(6.85±0.03)であった。そこで、計算された臨界ヘマトクリットは25.3±12.4％であり、データの分散はこの評価をより信頼しにくくするが、この値は、上記で認められた値と本質的に同一であった。 HSA交換輸血は、本発明者らが５％rHb1.1の緩衝化溶液での交換輸血と比較した、胎児組織低酸素の有用なモデルを生み出した。rHb1.1による交換輸血手順を受けた４匹のラットは、HSAによる交換輸血より、平均7.8倍長く生存した（それぞれ、337±52分間対43±11分間）。これらのラットの³¹Ｐ NMRスペクトルは、交換後、＞４時間の間、コントロール値で安定のままであった。HSA交換輸血で観察された挙動と対照的に、高エネルギーリン酸における時間依存的降下、およびPiにおける付随的な上昇はなかった。時間依存的rHb1.1交換データに対する直線回帰は、PCrデータの傾きがゼロと有意に異なることのみを示した（P_iの傾き＝(-3.9±10.8)×10^-3積分単位／分）。HSAで認められた低下とは対照的に、PCrがrHb1.1交換によって経時的に小さな増加を示すことに留意すること。全てのrHb1.1交換のラットからの7.35±0.15（n＝68）の平均pHは、正常なpH と一致する（Bittlら、前出）。rHb1.1での血液交換中またはその後のいずれかから動物の死亡まで、経時的なpHにおける有意な変化はなかった。時間依存的pH データに回帰された直線の傾き、および全pH変化は、それぞれ-6.71±17.29×10^-5 分^-1およびΔpH＝0.08±0.07であることが見出された。ヘマトクリットの０〜 57％の全範囲にわたる傾きおよび全pH変化のいずれも、ゼロと有意に異ならなかった。 HSAデータによって示されるpH調節および組織代謝の特徴は、高エネルギーリン酸の加水分解とpHとの間の関係；ATPおよびPCrの加水分解がプロトンおよびオルトリン酸アニオンを生じることである。組織が低酸素になるので、電子伝達およびNADH（およびNADPH）産生に利用可能な酸素がほとんどない。細胞質の還元力が減少するにつれて、乳酸塩が蓄積する。酸−塩基平衡のこの失敗は、pHとオルトリン酸産生との相関関係に現れる。このような関係は、ラットがHSAで交換輸血されたときには認められたが、ラットがrHb1.1で交換されたときには認められなかった。この場合のrHb1.1のデータは、ほぼ平均pHに集まっており、このことは、rHb1.1が正常な組織／血液pH調節を支持することを示す。この挙動は、動物の血液をHSAで交換する場合に、ヘマトクリットが25％未満に低下したときに見られるpHの減少と著しく対照的である。動物の死亡は、組織へ酸素を供給することのrHb1.1自体の失敗というよりむしろ、循環からのrHb1.1クリアランス（ｔ_1/2約107分）（Vlahakesら、Euro J ．Ca rdio-Thoracic Surgery 3: 353-354，1989；Hessら、J ．Appl．Physiol. 70: 16 39-1644，1991；Hoffmanら、Proc ．Natl．Acad．Sci(USA) 87: 8521-8525，1990 ；Lookerら、Nature 356: 258-260，1992；Shenら、Proc ．Natl．Acad．Sci.(US A) 90: 8108-8112，1993）、および結果的な組織の低酸素に帰因し得る；従って、ｔ_1/2の改良が増進された生存期間を導き得る。これらの実験は、全血交換の極限状態でのインビボでのrHb1.1の効力を実証し、そして使用されるヘモグロビン（rHb1.1）濃度（5g/dL）が、たとえ正常血液（約15g/dL）の濃度の1/3のみであったとしても、無細胞ヘモグロビンが、全血が存在するときに認められるレベルと見分けがつかないレベルで組織の生命エネルギー産生機能を維持することを明らかにする。実施例２ヘモグロビン3g/dL溶液による組織への酸素送達の実証交換輸血に無細胞ヘモグロビンの5g/dL溶液ではなく3g/dL溶液を使用した以外は、ラットを実施例１に記載のように処置した。８匹のラットを交換輸血した。 [Hb]_rbc＞10については、高エネルギーリン酸濃度[HEP]の平均値は、100.00％（ ±1.6％、n＝９測定）であり、一方、[Hb]_rbc＜1.0については、[HEP]の平均値は91.0％（±3.8％、n＝６測定）であった。この値は、交換開始時の[HEP]より有意に小さい（α＝0.025）。従って、血液中の３g/dLの全[Hb]では、リン代謝はわずかに影響されたが、動物は生存し続けた。事実、rHb1.1を用いて3g/dLの全[Hb]で決定された[HEP]（91.0％(±3.8％、n＝６)）は、ヒト血清アルブミン交換中の赤血球を用いて認められたもの（78.5％±4.6％、n＝５）より有意に高かった（α＝0.05）。実施例３循環血液量減少性ショックからイヌを蘇生させるためのヒト組換えヘモグロビン溶液の使用これらの実験は、無細胞ヘモグロビン溶液（rHb1.1）による蘇生の有効性を、晶質での標準的な蘇生および全血放出と比較した。急性の影響を、（デルタトラック（delta trac）代謝モニターを用いる）酸素消費の連続測定との組み合わせて、動脈内塩基欠乏の連続測定の使用によって評価した。これを、液体容量の使用に対する正確なガイドとして使用した。循環血液量減少性ショックに基づく酸素負債のイヌモデルを利用した。麻酔した動物に挿管し、そして動脈血圧、中心静脈圧、肺動脈圧、および心拍出量（熱希釈法および／またはカルディオグリーン(Cardiogreen)染色法による）の測定のために計器を取り付けた。気管内挿管チューブをデルタトラック（Delta Tra c）O₂消費ベンチレーターに接続し、そして大腿動脈にもまたPaO₂、PaCO₂、pH、および塩基過剰の頻繁な断続的測定および連続的測定用に計器を取り付けた。これらの条件下での酸素消費の基礎レベルを評価するための安定化期間の後、動物調製物を、この調製物での広範囲な研究によって以前に決定された（Dunhamら、Crit ．Care Med. 19(2): 231-243，1991）ように、平均LD₅₀酸素負債（114ml/kg ）に近似する酸素負債のレベルまで出血させた。酸素負債のこのレベルは60分以内に達成され、従って、O₂負債形成の標準速度および標準化した最終酸素負債が存在した。目的の酸素負債の達成後に行われたベースライン測定の後に、２つの方法の一方による蘇生を開始した。酸素消費の回復率および行き過ぎ（overshoot）率、塩基不足の減少率、ならびに乳酸の低下を、蘇生手順中および蘇生手順後にモニターした。比較された２つの蘇生方法は、以下の通りである：１．コントロール蘇生。蘇生を、蘇生を開始した後最初の20分間に、放出血液容量の60％に等しい晶質-コロイド溶液を用いて実施し、その後、全放出血液容量の60％を戻した（自家血液の再注入）。この手順は、最初の晶質-コロイド蘇生、およびその後の血液バンクから得られた直後の全血輸血を一般的に包含する、標準的な臨床的蘇生をまねる。２．ヘモグロビン溶液（rHb1.1）蘇生。出血によって除去されたヘモグロビンの 60％に等しいrHb1.1の開始容量（イヌの体重に依存して約75〜108gのrHb1.1）およびある晶質-コロイド容量を用いる蘇生であって、従って、蘇生液の全容量は、上記の(１)で使用された量に等しかった。全パーセントのrHb1.1を用いる最初の研究の後に、同じ全交換容量でより少量のrHb1.1の使用を、より低レベルの循環ヘモグロビンが、酸素送達の臨界レベルの維持のために、より高いヘモグロビンレベルと同程度に有効であり得るかどうかを決定するために評価し得る。これらの各グループにおいて、ベースラインレベルへの酸素消費の回復率、ならびに行き過ぎの大きさおよびその継続期間を、正確に定量した。さらに、塩基不足の減少率を、それがどのように密接に、容量の減少率（最初に晶質-コロイド溶液、次に放出血液）と対応するかをみるために追跡した。コントロールの蘇生グループから決定されたLD₅₀酸素負債レベルを、生き残っている動物で、残存酸素毒性の証拠についてモニターするために肝機能および腎機能の生化学的決定法を用いてショック後７日間追跡した。７日間の最終日に、生き残っている動物を麻酔し、そして組織を、肝臓、肺、および腎臓の組織学的研究のために取り出した。次に、麻酔下で動物を屠殺した。典型的な組織の光学的組織学および電子顕微鏡の研究の両方を、虚血および再潅流損傷を反映し得る超微構造損傷の存在または持続性を決定するために実施した。このようにして、コントロール蘇生に対するヘモグロビン溶液蘇生により生じる、酸素消費の回復率、ならびに酸素負債および塩基不足の減少は、生存率のみならず、回復後の器官不全続発症の存在または非存在とも関連した。これらの実験は、循環血液量減少性ショックのイヌモデルにおいて、rHb1.1による蘇生が、血液消失によって生じた酸素負債の、より迅速でかつ本質的に完全な償還をもたらすことを実証した。晶質および自家血液による従来の蘇生は、循環血液量減少の開始後140分で、酸素負債の73％のみを償還した。対照的に、rHb 1.1による蘇生は、140分で酸素負債の95％を（図１）、そして182分で酸素負債の100％近くを償還した。従って、rHb1.1は、血液輸血と比較して、より迅速でかつより完全な酸素負債の償還をもたらす。示されたように、正常酸素消費のこの迅速な償還は生存に重要である（Siegel，Clin ．Chem. 36: 1585，1990）。実施例４ヘモグロビンの前臨床毒素学研究 rHb1.1の安全性を、５つの動物研究およびヒト細胞を使用する２つのインビボ研究で評価した。これらは、イヌにおける予備毒素学研究、ストレスのかかったイヌでの中枢の単回用量毒素学研究、激しいストレスにさらされ麻酔されたイヌでの単回用量血行力学的研究、麻酔をかけたイヌでの心臓血管研究、ラットでの胃脳研究、ならびにヒト補体活性化およびヒト好中球機能に対するrHb1.1の影響のインビトロ研究を包含する。処置に関連する深刻な影響は、ストレスのかかったイヌでの中枢の単回用量毒素学研究において、30％までの血液容量蘇生の用量（1.1g/kg）のrHb1.1の投与後に認められなかった。結果は、一時的な好中球減少ならびにASTおよびCKの上昇を含む限定された可逆的な効果のみを示した。主要な器官系はいずれも影響されず、組織病理学的変化は全く認められず、そして尿中にヘモグロビンは全く検出されなかった。血行力学的パラメーターおよび心臓血管パラメーターを、容量蘇生の前および後に、激しいストレスにされられ、麻酔されたイヌでの単回用量血行力学的研究で測定した。循環血液量減少性ショックを、動物の血液の50％除去により誘導し、そしてrHb1.1、5％ヒト血清アルブミン（HSA）、または自家血液による蘇生前に、30分間持続させた。心拍数、心拍出量、全身および肺の血圧、ならびに血管抵抗を決定した。これらのパラメーターでの著しい変化が、誘導された循環血液量減少ストレスおよび蘇生に応じて認められたが、rHb1.1によって蘇生された動物と自家血液で蘇生した動物との間では、心臓血管パラメーターおよび血行力学的パラメーターの大きさまたは時間経過のいずれにおいても、明白な相違は認められなかった。この研究は、rHb1.1が、重篤な循環血液量減少イヌを蘇生するために使用されるときには、有害な心臓血管の影響または血行力学的影響をもたらさなかったことを実証した。心臓血管の影響を評価するための研究を、麻酔されたイヌにおけるrHb1.1の投与後に完了した。この研究でのイヌを、ハロタンで麻酔し、心肺モニターのために計器を取り付け、そしてrHb1.1での50％等容血液希釈に供した。rHb1.1は軽い全身的高血圧を生じ、肺および冠の高血圧はこの研究では認められなかったが、心拍数は、rHb1.1血液希釈後に有意に変化しなかった。rHb1.1は、心筋機能または冠状血行力学に全く影響しなかった。臨床研究での胃腸の有害事象の観察の後に、rHb1.1のなんらかの潜在的な膵臓影響または肝胆汁影響を詳細に観察するために、ラットで研究を実施した。ヘム代謝の研究でのこの広範囲の使用に加えて、この動物を、種々の因子による膵炎を研究するための一般的なモデルとしで選択した。ラットでは、膵炎を、血清アミラーゼおよびリーパゼ、ならびに膵臓の湿潤／乾燥重量比（これは膵臓水腫の鋭敏な尺度である）の測定によって決定し得る。研究を、0.35g/kg〜2.85g/kg（それぞれ、血液容量の約10％および80％）の範囲のrHb1.1単回用量のボーラスでの静脈内トップ負荷後に、rHb1.1が膵臓に影響をもたらす可能性を試験するために設計した。一連の血清アミラーゼおよびリパーゼの決定値は、rHb1.1の投与後２時間から48時間は正常であった。rHb1.1投与後24時間および48時間では、膵臓の湿潤／乾燥比の変化は全くなかった。ALTおよびASTのレベルの可逆的で穏和な上昇が、2.85g/kg rHb1.1トップ負荷を投薬した12匹のうち３匹のラットにおいて認められた。腹部器官の肉眼的病理学的実験は、著しい異常を全く示さなかった。腹部の組織病理学の実験は、膵臓または肝胆汁の組織に影響を全く示さなかった。軽度から中程度の影響が、rHb1.1処置ラットの腎臓に認められ、これは、大容量のトップ負荷での投与に帰因し得ると考えられる。膵臓または肝胆汁の著しい損傷は、現在までに得られた最大臨床用量より約20倍多い用量でのrHb1.1 の大容量トップ負荷後に、このラットモデルでは誘導されなかった。ヒト免疫系に対するrHb1.1の潜在的な影響を、インビトロ補体活性化アッセイおよびインビトロ好中球アッセイの両方で決定した。第一の研究では、補体活性化を、全溶血補体（CH50）、ならびに古典的補体活性化経路および補体活性化副経路の両方からの補体分解産物を測定することによってアッセイした。rHb1.1は、この研究ではいずれの補体系の経路にも全く影響しなかった。第二の研究では、rHb1.1が、ヒト好中球を活性化、阻害、または直接損傷する可能性を調べた。 rHb1.1は、いずれの測定されたパラメーター（顆粒球走化性、付着、または生存性）に対しても全く影響しなかった。実施例５ rHb1.1 の前臨床薬理学研究臨床的に有効な酸素キャリアおよび容量拡大剤は、コロイド浸透圧を発揮し、肺から組織へと酸素を輸送するために、血漿中に局在したままであるべきであり、そして注入後迅速に除去されるべきではない。薬物動態学的研究を、rHb1.1が臨床的に有用な半減期を有し、そして投与後に脈管内腔に閉じ込められたままであるかどうかを決定するために、rHb1.1の単回用量の後にイヌで実施した。さらに、rHb1.1蘇生の潜在的な血行力学的影響および心臓血管への影響に関するデータを、rHb1.1の前臨床毒物学研究の間に得た。イヌにおける薬物動態学研究は、1.8g/kgの注入後のrHb1.1の血漿半減期が、1 1.6±2.5時間であることを実証した。イヌにおけるrHb1.1のピーク濃度は、30分間のrHb1.1注入の最後に認められた30±2.7mg/mLであった。イヌにおけるrHb1.1 の分配容量（60.6±2.0mL/kg）は血漿容量とほとんど等しかった。このことは、 rHb1.1が、投与後に脈管内腔にほとんど完全に閉じ込められたままであったことを示す。実施例６覚醒ボランティアにおけるrHb1.1の臨床研究全部で76人の男性被検体にrHb1.1を投薬した。ここで、投与された最高用量レベルは、3.75mL/kg/時間での注入で0.32g/kg（25.5g全用量）であった。被検体の大部分は、0.15g/kgより多いかまたはそれに等しいrHb1.1を受けた。用量漸増研究を、正常ヒト男性ボランティアにおけるrHb1.1の単回静脈内注入の安全性および薬物動態学を評価するために設計した。別の研究は、高用量で認められる軽度から中程度の胃腸（GI）有害事象を評価するため、および特定の治療介入が症状を軽減するかまたは消散させ得るどうかを決定するために実施した。別の研究を、rHb1.1注入後に食道検圧法を行うことにより、GI事象をさらに評価および定量するために設計した。深刻な有害事象は、これらのいずれの研究においても、rHb1.1の静脈内投与中または投与後に全く認められなかった。さらに、無細胞ヘモグロビン溶液の注入と歴史的に関連した多数の有害事象および毒性は認められなかった。特に、腎臓機能不全またはrHb1.1のかなりの腎臓クリアランスの証拠、ならびに肝臓毒性および肺の毒性の変化またはエフェクター系活性化の証拠は存在しなかった。しかし、rHb1.1注入の間に、何人かの被検体に血圧の弱い増加が存在した。さらに、軽度から中程度の有害事象が、これらの研究でrHb1.1注入完了後に生じた。第一の研究での優勢な有害事象は、発熱性応答であった。高用量での後者の研究では GI有害事象が認められた。認められた発熱性応答は、発熱、悪寒、筋肉痛、頭痛、および一過性の軽度の好中球増加症の軽度から中程度の症状によって現わされた。これらの症状は、自発的に、またはイブプロフェンの投与後に消散した。生成物製造プロセスにおいて改変を行い、これは生成物純度の改良をもたらした。この製造変化後に製造されたより高い用量のrHb1.1を受けた次の研究の被検体は、時折、軽い発熱および好中球増加症を現したが、しかしその他の症状はほとんど現さなかった。高用量で実施された研究では、0.15および0.18g/kg用量グループの大部分の被検体は、軽度から中程度のGI有害事象を現した。これらの事象は、典型的に注入後１〜３時間で現れ、そして嚥下困難、中間上腹部の不快、そして時折、悪心、嘔吐、腹部痙攣および／または下痢からなる。これらの事象は、重篤ではないが、これらの正常ボランティアでの用量漸増を制限した。これらの所見は、全身性 GI運動異常(dysmotility)、特に、上腹部の不快および嚥下困難の特性によって現れる下部食道括約筋痙縮の診断と一致した。この診断は、胃運動描写法の食道図(gastrografin esophagram)、ならびにヒトおよび動物のGI検圧法研究からの観察によって１人の被検体で確認された。以前の研究の回顧的概説は、16人の被検体中の２人が、軽度だが同様の有害事象が報告されたことを示した。 GI現象は、平滑筋収縮およびGI運動異常に関連し得る。従って、数種の介入物を、被検体の症状を予防、緩和、または消散することについて評価した。今までに評価されたもののうち、どれも一貫して治療的というわけではなかったが、グルカゴン、ニフェジピン、およびナロキソンが、いくぶん有用であった。予防的に投与されるときには、硫酸テルブタリンが最も有用であり、そして用量漸増を可能にした。これらの研究は、注入後の実験室異常を実証した。臨床的に有意でなかったが、ビリルビンおよびトランスアミナーゼの増加が時折生じた。数人の被検体は、血清アミラーゼおよびリパーゼ値の弱い一時的な増加を示し、これは 12〜24時間以内に自発的に消失した。腹部の実験は良性であった。これらの所見は、腹部の病気がこれらの被検体の何人かに認められたが、報告された腹部の病気と相関しなかった。実験室異常は、なんらかの人工統計学的データ、観察時間、または血清ヘモグロビンレベルと相関するようではなかった。これらの研究では、その他の多数の有害事象がより低い頻度で認められた。例えば、rHb1.1注入後、被検体の約９％に弱い一時的な尋麻疹が認められた。尋麻疹は、自発的に、または抗ヒスタミン処置で消散したが、尋麻疹を現わしたいずれの被検体も、なんらかの関連する心臓血管所見、気管支痙攣またはアナフィラキシーの証拠を起さなかった。 0.15g/kgのrHb1.1を受けた１人の被検体は、注入開始の約15分後、軽い気管支痙攣を現した。注入が終わり、そして被検体がエピネフリンおよびジフェンヒドラミン（Benadryl）を受けた直後に喘鳴音が消散した。彼は、関連する尋麻疹または心臓血管の妥協を有さず、そして症状は、臨床続発症なしに消散した。このような事象は、これ以上認められなかった。一時的な無症候性の心臓伝導欠損が、76人中３人の被検体で、rHb1.1注入後に認められた。欠損が起きた被検体全てが0.15g/kgのrHb1.1を受けた。１人の被検体は、rHb1.1注入後にＩ型第二度AV心臓ブロックの多くのエピソードおよびII型第二度AVブロックの１つの短いエピソードを現した。彼は、心臓血管の妥協なしに、無症候性であった。伝導欠損は、処置なしで自発的に消散した。全評価は陰性であった。もっとも、いくつかの軽いリズム変化（彼の年齢グループでは正常である）が、24時間のECGモニタリングによって認められた。２人の他の被検体は、等頻度AV解離での一時的なSA結節低下および連結部の補充調律を現した。１人の被検体もまた、rHb1.1を受ける前にこのAV解離を実証した。これらの被検体は無症候性であり、そして伝導欠損は自発的に消散した。これらの影響の病因は不明なままである。実施例７麻酔をかけた患者において手術中に使用されるrHb1.1の臨床研究全身麻酔下での選択的手術患者において、rHb1.1の最初の安全性評価が、研究されてきた。この研究に登録された患者は、rHb1.1または容量コントロールとしての通常生理食塩水を、3.75mL/kg/時間で注入される0.075g/kg（70kgの個体に対して5.25g）〜0.35g/kg（70kgの個体に対して24.5g）の範囲の用量で受けた。今までに投薬された14人の患者では、深刻な有害事象は認められなかった。コントロールを含むほとんどの患者は、軽度から中程度の手術後悪心および嘔吐を起こした。さらに、rHb1.1グループの４人の患者は、治療を必要とする軽度の高血圧症を現した。麻酔をかけないボランティア研究で認められた症状と一致する胃腸有害事象は、依然として認められなかった。実施例８ ANH で交換溶液として使用されるrHb1.1の臨床研究上記の研究に加えて、rHb1.1を、急性正常血液量血液希釈中の交換溶液として評価した。この手順の間に、２ユニットまでを、生理学的食塩溶液／rHb1.1または生理学的食塩溶液単独で交換する。グループあたり３人のrHb1.1患者を有する、12.5g、25g、および50gの３つの用量グループを、表１に示されるように評価したかまたは評価する。さらに、３人の生理学的食塩溶液コントロール患者が存在した。今までにrHb1.1を与えられた患者は、臨床的に深刻な有害な影響を全く示さなかった。実施例９心肺バイパス手術を受ける患者での急性正常血液量血液希釈のための組換えヒトヘモグロビン（rHb1.1）の使用この研究の目的は、心肺バイパス手術（CPB）の前および手術中に血液希釈溶液として投与されるrHb1.1の安全性を決定すること、ならびに手術中および手術後の血行力学的パラメーターの変化への血液希釈の必要条件、液体の必要条件、および輸血の必要条件の一部分としてのrHb1.1投与の影響を評価することである。患者は、25gまたは50g（それぞれ、500mLまたは1000mL）の静脈内rHb1.1の２つの用量のうち１つか、または1000mLの通常生理食塩水（容量コントロールとして）を受けさせて無作為化する。この研究中に、少なくとも２ユニットの血液を集めるが、血液希釈は４ユニットもの血液を集めるに使用され得る。麻酔の誘導および前注入手順が完了した後に、２ユニットの血液を取り出す。正常血液量を、2000mLの通常生理食塩水交換で維持する。25g用量グループでは、３分の１ユニットの血液を取り出し、そしてrHb1.1（500mL）または通常生理食塩水（1000m L）で交換する。50g用量グループでは、３分の１ユニットの血液を取り出し、そして25g（500mL）rHb1.1または通常生理食塩水（1000mL）で交換する。可能であれば、４分の１ユニットを取り出し、そしてさらに25g rHb1.1（500mL）または通常生理食塩水（1000mL）で交換する。 rHb1.1を受けていない患者と比較するとき、rHb1.1が与えられた患者は、同種間血液輸血および／または自家血液輸血の必要性がより少ない。本発明の先の記載は、例示および説明の目的のために例証的である。変更および改変が、本発明の精神および範囲から逸脱することなく可能であることは、当業者に明白である。以下の請求の範囲はこのような変更および改変の全てを包含すると解釈されることが、意図される。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Method for facilitating autologous blood donation and treating oxygen debt Background of the Invention During surgery, many patients lose blood. In clinical practice, a very Patients with sex loss may only need to make up for the lost volume. But more severe Great blood loss may require both volume replenishment and oxygen carrying volume replenishment. Large amount In situations involving blood loss, other blood components (eg, platelets and clotting factors) May need to be replenished by transfusing whole blood. Many surgeries can result in the need for blood transfusion due to blood loss. Every year surgery It has been estimated that approximately 9 million units of blood are transfused in connection with the procedure. Hemo Increase globin concentration to 10 g / dL (this is a generally accepted It is generally accepted that post-operative recovery can be accelerated if not (Zauder, Anesth. Clin. North Amer. 8: 471-80, 1990). Allogeneic blood transfusion Blood (transfusion of blood collected from donors (not patients)) includes the following (1) and ( At-risk recipients at inherent risk, including 2): (1) transmission of infectious diseases (ie, Immunodeficiency virus (HIV), non-A and non-B hepatitis, hepatitis B, Yersinia ente rocolitica, human T-cell leukemia virus 1 and 2, cytomegalovirus), And (2) immunological reactions (ie, transfusion reactions, immunosuppression, graft-versus-host reactions) . Other disadvantages of using allogeneic blood transfusion are non-universal compatibility, limited Availability and limited stability (shelf life less than 42 days: cannot be frozen) Include. These dangers and limitations suggest that the use of autologous blood for transfusion (patient's own blood) is desirable. We have emphasized the good things. Autologous blood for transfusion is pre-dona option). Predonation typically involves surgery It involves withdrawing several units of patient blood within the last six weeks or so. Next At the same time, the drawn blood is used during the operation (at the time of surgery) or during the recovery period after the operation is completed ( After surgery). Acute normovolemic hemodilution (ANH) Another technique used to reduce exposure to house blood. In this step , Blood is removed from the patient at or shortly before surgery. Removed from the patient The blood volume is then exchanged for an equal volume of non-oxygen carrying crystalline or colloidal solution. It is. Eventually, the blood drawn from the patient will be If present, it will be reinjected during the recovery period. In addition to providing an autologous blood unit for transfusion, the ANH process Because the viscosity of the patient's blood decreases due to the dilution of the blood with the quality or colloidal solution Can improve the outcome of some surgical procedures. Reduced oxygen capacity of diluted blood The basic mechanisms that make up most of the body are increased cardiac blood output and increased organ blood. Seems to be liquid flow, both can be beneficial, and both are lower It appears to result from reduced blood viscosity at the hematocrit (Messmer et al., Eur. Surg. Res. 18: 254-263, 1986). A major limitation associated with both ANH and preliminary blood donation impairs a patient's oxygen carrying capacity. Without limitation, a limitation on the amount of blood that can be drawn from a patient. That is, Donating or removing excess blood can compromise the oxygen carrying capacity of the blood. Sand Sufficient blood may be lost to cause oxygen deficiency or oxygen debt to the patient. Follow The use of a suitable oxygen-carrying compound in the exchange May be provided. In addition, the oxygen transport of the drawn blood Replacement with a transfer fluid may increase the amount of blood that can be removed during a preliminary blood donation. The ANH approach, which uses oxygen-carrying perfluorocarbon as the exchange liquid, is Used in a restricted environment (Roth et al., US Pat. No. 5,344,393). But, These procedures require administration of respiratory gas enriched with 50% to 100% oxygen. High oxygen levels in respiratory gases can lead to complications from oxygen toxicity (Beisbarth et al., A dvances in Blood Substitute Research, Bolin, Geyer and Nemo (eds.), Alan R .Liss, Inc., New York, pp. 373-380, 1983). Therefore, less than perfluorocarbon The use of extraneous oxygen-carrying molecules allows the breathing to enhance oxygen delivery by the oxygen-carrying molecules. No need to increase oxygen in the gas, so it is more compatible with accepted anesthesia I do. One such candidate as an oxygen carrying exchange liquid is hemoglobin. this Are blood substitutes for replenishing lost blood (Hoffman and Nagai, US Pat. No. 5, 028,588) and in combination with breathing gas of at least about 50% oxygen Blood dilution in acute normovolemia hemodilution (Roth et al., US No. 5,344,393). However, hemoglobin, especially recombinant Hemoglobin increases blood volume during pre-donation or ANH under general anesthesia Teachings that may be useful as bulking agents and / or oxygen carriers exist in the prior art. Absent. Many extracellular hemoglobins have been identified for use as oxygen delivery vehicles and other uses (drugs). Product delivery vehicles, vasoconstrictors, iron sources, etc.). Recombinant human hemog Robin (eg, rHb1.1, Looker et al., Nature, 356: 258-260 (1992)) New sex and pharmacokinetics have been evaluated in animals and normal adult males Hemoglobin-based oxygen carrier (HBOC). rHb1.1 is HBOC in genetically engineered red blood cells, not from whole blood, but from culture As such, it may eliminate or minimize the risks and limitations associated with blood transfusion. You. The fact that rHb1.1 has capacity-exchange and oxygen-carrying properties has led to Patients who have lost blood due to surgery or blood donation or have oxygen debt (whatever the cause) A potential versatile exchange liquid for and with. Administration of rHb1.1 may be Replenish the portion of the oxygen carrying volume lost in the ANH. Summary of the Invention The present invention facilitates autologous blood donation by patients The method comprises the following steps: (a) removing a portion of the patient's blood; (b) administering an amount of cell-free hemoglobin that enhances oxygen delivery; and (c) administering respiratory gas as needed (where the respiratory gas is rich in oxygen) Is not converted). In a further aspect of the invention, blood drawn from a patient may be stored. this The method may further include the step of re-administering the stored blood to the patient. The present invention In another embodiment, removing and storing a portion of the patient's blood is subject to blood loss. Less than 72 hours ago for patients. Further practice Bear-free, cell-free hemoglobin Bins are derived from non-erythrocytes, especially recombinant hemoglobin, in particular rHb1.1 It is. In a still further embodiment of the invention, the autologous blood donation is a preliminary blood donation. The present invention In a further aspect, the autologous blood donation is at the time of surgery. In another embodiment of the invention, the invention is a method for treating oxygen debt. Administering a therapeutically effective amount of cell-free hemoglobin to treat oxygen debt A method comprising: In a further aspect of the invention, the cell-free hemoglobin comprises: It is derived from non-erythrocytes, especially recombinant hemoglobin, specifically rHb1.1. The invention further contemplates a kit comprising cell-free hemoglobin and related supplies. Figure. Description of the drawings FIG. 1 is the oxygen debt as a function of time. First, the dog bleeds, then 120% of the drawn blood volume is either recombinant hemoglobin (rHb1.1; -X-), or The colloid was then replaced with one of the autologous blood (control;-▲-). Detailed description of the invention In general, the present invention provides that all or a portion of the drawn blood binds oxygen, And by replacing it with cell-free hemoglobin, which can release oxygen to tissues, A method is provided for facilitating home blood donation. Therefore, unlike hemodilution, The present invention addresses the possible benefits of little red blood cells in the drawn blood (eg, Not only lost volume but also blood removal to provide Replace the drawn blood with some or all of the oxygen delivery volume loss I do. As described herein, this difference is particularly significant in large or rapid autologous blood. When liquid dispensing is advantageous or oxygen debt is a likely consequence Provides some benefits. Replenishment of drawn blood with bulking agents is often "Hemodilution" or "acute normovolemia hemodilution (acute normov) olemic hemodilution), but the present invention more appropriately describes Blood volume maintenance (acute normovolemic hemosupport), "blood maintenance (hemosuppor t) "," Acute normovolemic hemoaugmentation " , "Hemoaugmentaion", "perioperative iso volemic substitution) or "acute normovol oxygenation (acute normovol emic oxgenation) ". Pre-accumulation requires that the surgery be pre-planned. Blood before surgery Provided by the patient during the weeks and months of the Is stored for subsequent administration to the individual. Blood donation of 300-400ml unit, Typically obtained at 2-7 day intervals with the last blood draw 72 hours prior to surgery You. Blood may be stored in liquid form as whole blood or may contain red blood cells and non-red blood cells. The stable components can be separated into plasma that can be frozen to preserve. According to the present invention, Preliminary blood donation can be improved, and its use expanded in one or more ways. First, the book The invention provides that a portion of the oxygen-carrying capacity of the drawn blood, at the time of donation, is acellular hemoglobin. Patients are allowed to donate more blood than is normally given, as they are exchanged for bottles. Can do it. Secondly, the blood is just before blood loss occurs (ie, Less than 72 hours before surgery), a pre-donation can be made by the patient autonomously. This method is , Like unplanned surgery, where a pre-donation by typical techniques is not currently possible Can be particularly useful in emergency situations. Third, the preliminary blood donation is more than one It can be done more frequently or in less time between blood. Intraoperative isovolumetric dilution (ANH) is a sufficient volume of blood volume expander, especially crystalline or The process of obtaining blood immediately before or during surgery by exchange with a colloid solution It is. This practice reduces blood viscosity during surgery, thereby reducing heart work Decrease volume and increase microcirculation. Next, the blood drawn from the patient Is stored so that it can be re-administered to the patient during or after surgery. Acute normovolemia Blood volume that can be drawn during hemodilution, and in patients The resulting desired residual hemoglobin level can be readily determined by one skilled in the art, And it depends on many factors. These factors depend on the method to be performed, Condition, need for reduced blood viscosity, minimal Including the total hemoglobin volume, the expected amount of blood needed for further readministration to the patient, etc. Include. For example, patients undergoing coronary artery bypass surgery have a 15% hematocrit (Mathru, M. and M. Rooney, Problems Crit. Care (USA), 400-410, 1991). After or simultaneously with the removal of some blood, A plasma expander (or both) is administered to the patient, eg, prior to any blood removal Maintain the blood volume at the desired value close to the blood volume. Blood volume increase during surgery In cases involving hemoglobin that can bind or release, intraoperative, The dilution of the oxygen-carrying capacity of the patient's blood is discontinued, resulting in "surgical volume replacement". In the present invention, the method of collecting autologous blood, in particular, pre-accumulation and intraoperative volume replacement, To obtain blood to allow subsequent blood transfusion in patients facing blood loss Used for For blood cell collection, including during, post-surgery and autotransfusion The method is described in U.S. Patent No. 5,344,393, which is incorporated herein by reference. It is. Patients facing blood loss should have sufficient blood capacity to deliver adequate oxygen to the tissue. Face or are in a situation where you may lose enough blood to jeopardize Such a person. Such a situation may indicate planned surgery as well as emergency planning. Includes undefined surgery and trauma. A place for trauma and emergency unplanned surgery In the case of surgery, volume replacement during surgery is basically performed until the start of surgery or during surgery. And blood can be donated. When blood's ability to deliver adequate oxygen to tissues is compromised, oxygen debt or oxygen Called shortage. Oxygen debt is the oxygen consumption requirement of the body or any tissue of the body. It can occur when the body's ability to supply oxygen is exceeded. Oxygen debt is, for example, inhaled It can be measured as a reduction in consumed oxygen. This decrease binds oxygen in the lungs, Reflects the blood's diminished ability to deliver oxygen to metabolic tissues. Lack of oxygen also Oxygen demand (stable VO at baseline)_TwoEqual to) and the actual VO_TwoTime between It is defined as the cumulative difference over time. Next, VO_TwoIs the inhaled oxygen consumption, That is, defined as the difference in oxygen content between the intake and exhaust gases, and It can be found by solving the equation for ck: VO_Two= Cardiac blood output (ml blood / min) * Arteriovenous oxygen content difference (ml O_Two/ Ml blood). Therefore, the shortage or debt VO below demand over time_Two(Siegel, Amer. Asso. c. Clin. Chem. 36 (8B): 1585, 1990). In the method of the present invention, cell-free hemoglobin is more rapidly acidified than red blood cell transfusion. It has shown that the primary debt will be reversed. Thus, the present invention also often involves blood loss, Particularly useful in preventing and treating the symptoms of oxygen debt associated with massive blood loss is there. Blood typically donated by the patient for subsequent re-administration (acute The amount of blood donation is about 2 units. At any time, get more blood Extrusion can result in jeopardizing the blood's ability to properly oxygenate tissue, Therefore, multiple pre-donations with sufficient recovery time between each pre-donation are required before medical procedures. It may require that sufficient autologous blood be deposited. However, typically, the collected blood From the limitations in fluid storage and the logic of planning treatment procedures and blood donations, Only 12 units will be collected during the expanded preliminary blood donation. Therefore, at the time of surgery It is possible to collect enough blood for a sufficient time to meet the requirements of autotransfusion. No. If there is not enough autologous blood to meet the patient's needs, May be exposed to allogeneic blood units. But some of the drawn blood or When whole is exchanged for cell-free hemoglobin, which can bind and release oxygen, patients The portion of blood removed at one time and stored for subsequent use is increased Or the recovery time between blood donations can be reduced. Therefore, any temporary offerings Both amounts collected in blood are expanded by using the method of the present invention. It can be increased since it can be the total blood volume collected during the donation protocol. further However, the present invention need not be limited to patients who face blood loss, and Storing the blood unit; the method of the present invention may be used for any patient in need of such a transfusion. The amount of blood (homologous transfusion) donated by any donor for transfusion against Can be used to increase. Therefore, the use for acute normovolemia In addition, the present invention provides for the provision of more blood than is possible or recommended. ("Hyperdonation"). In the practice of the present invention, removal of blood for possible use in autologous blood donation At the same time or after, cell-free hemoglobin is administered to the patient. Preferably, Blood withdrawal and administration of cell-free hemoglobin can be continuous with each other or , But simultaneous blood removal and administration of cell-free hemoglobin It is envisioned that it may be advantageous for certain medical situations. For example, trauma and emergency In the case of unscheduled surgery, severe bleeding or surgery must be initiated The need for simultaneous blood removal and cell-free hemoglobin administration. Can get. Removal and storage of the patient's predonated blood is the responsibility of blood donation and storage. It can be achieved using any known method. Administration of cell-free hemoglobin is typically Injection, especially intravenous injection. The dosage of cell-free hemoglobin Can be easily determined by the patient and, among other factors, Fluid volume, infusion rate, blood volume drawn, cell-free hemoglobin volume and oxygen Transport capacity (P₅₀), And the total amount of liquid to be injected. No administration The amount of alveolar hemoglobin is preferably the oxygen delivery loss as a result of blood withdrawal. It is enough to replace some or all of the losses. Indeterminate to be administered The amount of alveolar hemoglobin can be determined by all or part of the Approximately 150% of the blood volume removed from approximately 10% of the blood volume delivered, preferably About 150% of the drawn blood volume from about 50% of the drawn blood volume can be replaced. is there Alternatively, the amount of cell-free hemoglobin that can be administered according to the method of the present invention depends on the amount of blood collected. All or part of the loss of oxygen delivery capacity as a result of expulsion may be replaced; A 1: 1 exchange of oxygen delivery volume for blood loss is not required. But at a minimum, hemog Sufficient oxygen delivery capacity in robin form should be sufficient to deliver sufficient oxygen to the tissue (no oxygen (For the prevention or treatment of debt), or in the ability of blood to facilitate over donation It must be injected to avoid a serious crisis. Excessive donation, increased blood Cell-free hemoglobin used for or for the prevention or treatment of oxygen debt Optimal dosage of the drug can be determined by one skilled in the art. Such optimal dosages are For example, the underlying medical condition, individual patient characteristics, pre- It depends on the requirements. As another alternative, cell-free hemoglobin may be used at hematocrit levels as described above. Administered to reduce blood viscosity while maintaining oxygen delivery Can be done. Typically, the infusion rate for cell-free hemoglobin is about 1 ml / kg / hr. From controlled flow, essentially by gravity, at speeds ranging from to about 75 ml / kg / hr The range of the flow. Suitable rates include about 7 ml / kg / hour to about 30 ml / kg / hour. Method of the Invention Used to Promote Autologous Blood Donation or Treat Oxygen Debt Cell-free hemoglobin has physiological and / or pharmaceutical and And / or a therapeutically effective amount of hemoglobin, alone or with another active agent. Alternatively, it may be contained in combination with an inactive factor. For example, a parenteral therapeutic composition may contain 0. Can contain sterile isotonic saline containing between 001% and 50% (W / V) hemoglobin You. Suitable compositions also include 0-200 mM of one or more buffers (e.g., acetate buffer , Phosphate buffer, citrate buffer, bicarbonate buffer, or good buffer) I can do it. Sodium chloride, potassium chloride, sodium acetate, calcium chloride, salt Salts such as magnesium chloride are also included in the compositions of the present invention at a concentration of 0-2M. Can be Further, the compositions of the present invention may comprise from 0 to 2M of one or more carbohydrates (e.g., Reducing carbohydrates such as glucose, maltose, lactose, or sucrose Trehalose, raffinose, mannitol, isosucrose, or starch. Non-reducing carbohydrates such as chiose) and 0 to 2 M of one or more alcohols Or polyalcohols (eg, polyethylene glycol, propylene glycol Dextran, or polyols). The compositions of the present invention also include 0.005 to 1% of one or more surfactants and 0 to 200 μM of one or more chelates Agents (eg, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), ethylene glycol-bis (β- Aminoethyl ether) N, N, N ', N'-tetraacetic acid (EGTA), o-phenanthroline, Such as ethylamine triamine pentaacetic acid (DTPA is also known as pentaacetic acid) May be included. The compositions of the present invention may also have a pH of about 6.5-9.5. In another embodiment, the composition comprises 0-300 mM of one or more salts (eg, chloride salts). ), 0-100 mM of one or more non-reducing sugars, 0-10 mM antioxidant, 0-100 mM 1 One or more buffers, 0.01 to 0.5% of one or more surfactants, and one of 0 to 150 mM Contains the above chelating agent. In yet a further embodiment, the composition comprises from 0 to 150 m M NaCl, 0-10 mM sodium phosphate, and 0.01-0.1% surfactant, and It contains 0 to 50 μM of one or more chelating agents and has a pH of 6.6 to 7.8. Another suitable hemo The globin-containing composition comprises 5 mM sodium phosphate, 100-150 mM NaCl, 0.025% 0.1% polysorbate 80, 2 mM sodium ascorbate, and 25 μM EDTA And has a pH of 6.8-7.6. If necessary, other components can be added. For example, 0-5 mM reducing agent (for example, Dithionite, ferrous salt, sodium borohydride, sodium cyanoborohydride Lium, and ascorbate) can be added to the composition. Further to prescription Additives are antioxidants (eg, ascorbic acid or a salt thereof, α-tocopher Knol), an antibacterial agent, an inflating agent (eg, albumin or polyethylene glycol) ), Iron chelators (eg, desferoxamine), and others known to those skilled in the art. Formulatable salts, sugars, and excipients. That choice should be achieved It depends on the particular purpose and the properties of such additives that can be easily determined. The compositions of the present invention can be formulated by any known method in the art. this Such formulation methods include, for example, simple mixing, continuous addition, emulsification, diafiltration, etc. You. Such compositions of the invention may be used for treating oxygen debt. Furthermore, this Good compositions are voluntary, such as in the case of hemodilution or blood augmentation, Or to treat bleeding, even if it is not your will, such as trauma Can be used. The formulation of the present invention may be used only to increase oxygen delivery to tissues, as described above. But a simple volume that provides inflation pressure due to the presence of large hemoglobin protein molecules. It can also be used as a bulking agent. Influenced by macromolecules like proteins The osmotic pressure portion is the colloid osmotic or swelling pressure. The inflation pressure of intravascular plasma Higher than the expansion pressure of the liquid. The inflation pressure of plasma is the main force that holds water in the intravascular space. And thus maintain intravascular volume. Administered cell-free hemoglobin contains soluble blood It circulates as a serum protein, so by using the colloid osmotic effect Has the potential to maintain and expand intravascular volume. This is from the intravascular space Counterbalance the hydrostatic pressure in the capillary system, which tends to push out water. The inflation pressure is proportional to the molar concentration of the capillary impermeable polymer. Usually plasma albu Min is responsible for 70-80% of the inflation pressure of plasma. Colloidal immersion of 5% solution of hemoglobin Osmotic pressure, as measured by Wescor 4420 Colloid Osmometer, is 5% human serum Similar to the colloid osmotic pressure of Bumin. Albumin has a molecular weight of 66,500 daltons And the molecular weight of hemoglobin is 64,600 daltons, they are similar. It has a molarity and therefore a similar expansion pressure. Albumin is usually about 500ml It is generally prescribed in doses of 25 g per volume. Thus, 25 g of hemog in a similar volume Administration of robin may have similar volume-enhancing properties to administration of 25 g of albumin. Physiological and / or pharmaceutical and / or therapeutic use of the hemoglobin of the present invention An effective amount binds oxygen in the patient's lungs and reduces oxygen loss (hypoxia) in the tissue. With the amount of hemoglobin that can release enough oxygen into the tissue to prevent pathological effects is there. Hemoglobin is useful for binding oxygen and releasing oxygen to tissues. Is determined by the oxygen equilibrium binding curve (OEC-P₅₀Typical by value and Hill coefficient [n] And the other factors described below. Measure OEC A suitable method for doing this is described in U.S. Pat. Which is incorporated herein by reference). The amount of oxygen delivered to the tissue For example, OEC of cell-free hemoglobin, cell-free hemoglobin concentration in a given composition The amount of cell-free hemoglobin administered to a patient, in patients with cell-free hemoglobin Half-life and oxygen tension in the artery and oxygen in the target tissue. Determined by a number of factors. For example, as described in U.S. Pat.No. 5,028,588. Thus, low affinity hemoglobin can be used according to the method of the present invention. Low affinity Moglobin delivers more oxygen than equivalent amounts of hemoglobin bound in red blood cells Therefore, lower doses (eg, hemoglobin contained in red blood cell transfusions) (Compared to the amount of the active ingredient) (see Examples 1-3). On the contrary, more When high-affinity hemoglobin is used, more is needed to achieve the same amount of oxygen delivery. Higher doses (hemoglobin / kg body weight) are required. Higher parent Compatible hemoglobin is found in tissues that experience greater hypoxia, such as tumors, Can be used to release a lot of oxygen. According to the present invention, blood viscosity is reduced as a result of administration of cell-free hemoglobin. It is noteworthy. Generally, "acute normovolemia blood maintenance", "blood maintenance", "Acute normovolemia", "Blood", "Surgery volume replacement", or " The decrease in blood viscosity caused by “Acute normovolemia” leads to Average organization PO_Two(Messmer et al.,Res . Exp. Med. 159 : 152-56, 1973). In addition, oxygen delivery from the oxygen delivery vehicle (cell-free hemoglobin) Dispersion is only associated with the dissociation of oxygen from hemoglobin, Tissue oxygenation is increased by administration of cell-free hemoglobin because it is not associated with diffusion. Can be strengthened. Without being bound by theory, administration of hemoglobin solution is_Twoincrease of Tissue increased oxygenation as a result of both reduced diffusional delivery and reduced blood viscosity Can be brought. In the case of a blood increase, oxygen comes from the plasma itself, not only from red blood cells. It is noted that it can also be obtained from dissolved hemoglobin therein. Cell-free hemoglobin is not substantially bound in cells, and Is hemoglobin that does not contain substantial amounts of cell debris. Cell-free hemoglobin Hemoglobin-containing cells (eg, erythrocytes) suitable as starting materials for solutions are numerous. Are readily available from commercial sources. Such sources include, but are not limited to, Human red blood cells and bovine red blood cells. Expresses hemoglobin and therefore hemoglobin The non-erythroid system used to provide the bin-containing cells includes, but is not limited to, bacteria , Yeast, plant, and mammalian cells. For example, slaughtered horses produce very large amounts of hemoglobin-containing cells. further, Hemoglobin-containing cells that are of particular species or breed are particularly suitable for particular uses When producing these animals, these animals are It can be bred especially for the purpose. In addition, recombinant mutants, non-mutants Transgenics capable of expressing sgenic hemoglobin erythrocytes and their precursors Genetic animals can be produced. The human blood bank, after a certain maturity date, Human blood containing the bin-containing cells must be discarded. Destroyed like this Blood can also be used as a starting material in the present invention. Purification of hemoglobin from any source uses purification techniques known in the art. Can be achieved. For example, hemoglobin is isolated from old human red blood cells by And can be purified: hemolysis of red blood cells followed by chromatography (Bonhard, K Et al., U.S. Patent No. 4,439,357; Tayot, J.L. et al., European Patent Publication No. 0132178; Hsia , J.C. EP 0231236 B1), filtration (Rabiner, S.F. et al.J . Exp. Med. 126: Kothe, N. and Eichentopf, B. U.S. Patent No. 4,562,715), Heating (Estep, T.N., PCT Application No. PCT / US89 / 01489, Estep, T.N., U.S. Pat. No. 61,867), precipitates (Simmonds, R.S. and Owen, W.P., U.S. Pat. No. 4,401,652). Tye, R.W., U.S. Pat. No. 4,473,494), or a combination of these techniques (Ra usch, C.W. and Feola, M., EP 0277289 B1). Transgenic movement Hemoglobin produced by the product is purified by chromatofocusing (Townes, T.M. and McCune, PCT published PCT / US / 09624), while yeast and Produced by bacteria, ion-exchange chromatography and immobilized metal Purified by affinity chromatography (Hoffman, S.J. and Nagai No. 5,028,588, Hoffman et al., WO 90/13645 and Milne et al., WO 95/140. 38; these are incorporated herein by reference). Hemoglobin from natural and recombinant sources can be decomposed by various techniques. Chemically modified to prevent release and / or improve oxygen carrying properties. any These techniques are used to prepare hemoglobin suitable for the method of the present invention. obtain. Examples of such modifications are found below: Iwashita, Y. et al., US Pat. 412,989; Iwashita, Y. and Ajisaka, K., U.S. Pat. No. 4,301,144; Iwashit. Nicolau, Y.-C., U.S. Pat. No. 4,321,259; Ni. colau, Y.-C. and Gersonde, K., U.S. Pat. No. 4,473,563; Wong, J.T. US special No. 4,710,488; Wong, J.T.F., U.S. Pat. No. 4,650,786; Bonhard, K. et al., US Walder, J.A .; U.S. Patent No. 4,598,064; Walder, J.A., U.S. Pat. No. 4,600,531; and Ajisaka, K. and Iwashita, Y., U.S. Pat. No. 77,512 etc. Generally, these chemical modifications of hemoglobin are Includes a chemical change or reaction of one or more amino acid residues of the offspring. These are α Chemically linked to / β-dimer or modified steric conversion of hemoglobin (Eg, by binding at the diphosphoglycerate binding site), or Use any reagent that ligates the imer while simultaneously modifying its oxygen binding properties . In a co-pending application of WO93 / 09143 of Anderson et al., Which is incorporated herein by reference. Modifications, such as chemical polymerization of globin chains, glycosylation, and And polyethylene glycolation and / or liposomes or Encapsulation in the alveolar membrane is also contemplated. But all these hemoglobins N Must be cell-free hemoglobin. That is, they are It must be substantially free of cellular components. Stabilizes hemoglobin against dimerization or alters oxygen affinity Genetically modified hemoglobin modified for use in the method of the present invention is also suitable. I do. A particularly suitable hemoglobin is recombinantly derived hemoglobin, For example, E. coli having at least a mutation to stabilize against dimer formation. col hemoglobin produced in i, preferably a co-pending patent publication number of Hoffman et al. At least a mutation described in WO90 / 13645 that stabilizes against dimer formation Hemoglobin produced in E. coli (rH b1.1) and purified by the method of Milne et al., Patent Publication No. WO 95/14038. It is manufactured hemoglobin. Following administration of cell-free hemoglobin, the patient may experience blood loss, or I can't experience it. Although such blood loss can occur as a result of many types of trauma, It typically results from surgery. Depending on the amount of blood lost during this administration, Some of the patient's blood may be re-administered. Methods for readministration of blood are well known, and The amount of blood given, if any, can be determined by one skilled in the art. At any time after removal of a portion of the patient's blood, particularly during and / or during blood loss. After administration of cellular hemoglobin, respiratory gas with an enhanced oxygen content is administered to the patient. Giving is sometimes recommended. Higher concentrations of oxygen in the respiratory gas Increases oxygen tension and some hemoglobin, especially hemoglobin in red blood cells Can improve oxygen binding of hemoglobin with significantly lower oxygen affinity than robin You. Thus, although not required, the present invention relates to a blood sample as contemplated by the present invention. It is intended to administer oxygen-enriched breathing gas to patients experiencing loss. Call Gas absorption is essentially more than about 20% found in air, up to 100% oxygen It can be enriched with any amount of oxygen. There may be advantages to administering oxygen-enriched respiratory gas to a patient during the practice of the present invention. But potentially harmful from the inhalation of oxygen-enriched respiratory gas, especially in excess of 50% oxygen. An effect can occur. Harmful effects of inhaling enriched oxygen content breathing gas Some of the fruits include pulmonary edema and endothelial tissue damage (Harper,Principles a nd Methods in Toxicology , Vol. 3, Raven Press, p. 883). In such excess These effects are less likely when oxygenated respiratory gases are used in combination with anesthesia. Can be further enhanced. Therefore, the breathing gas administered to the patient should be less than 50% oxygen and And more preferably about 20% (ambient air oxygen content). Blood augmentation kits are also contemplated by the present invention. Such a kit is It contains the hemoglobin solution used for fluid augmentation, as well as the supplies needed for this procedure. These supplies include, for example, reagents, tubes, bags, containers, filters, etc. May be included. The present invention is useful to facilitate self-donation of blood, and otherwise Particularly useful in allowing more blood to be donated than is possible or recommended ("Excess donation"). The present invention also provides faster oxygen depletion than transfusion alone. Useful for recovering from bonds. For example, the present invention provides that a portion of the oxygen-carrying capacity of pre-donated blood is Patients can donate more blood than is usually donated because it is exchanged for robin . In addition, blood can be delivered just before blood loss occurs (ie, 72 hours before surgery). ), May be pre-donated by the patient. This method is based on typical techniques. It may be particularly useful in emergencies where blood donation is not currently possible, in unscheduled surgery. In addition, pre-donation may be more frequent or may occur during multiple pre-donation events. May be done on time. The present invention also provides that a patient experiencing an increase in blood inhales high oxygen content respiratory gases. This is useful when no oxygen is required, thereby providing enhanced oxygen If inhalation of such respiratory gases, including large quantities, can be harmful, the patient's autologous blood To be given. In conjunction with the present invention or blood loss, especially blood loss associated with large amounts of blood, It is useful in preventing and treating the symptoms associated with frequently occurring oxygen debt. Example The following examples are not intended to limit the scope of the invention in any respect, and It is provided to describe certain specific embodiments. Example 1 5g / dL Demonstration of oxygen delivery to tissues by cell-free hemoglobin solution ³¹P nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is used to transport oxygen to cell tissues and organs, Sensitive and non-invasive scrutiny of the bioenergetic state of tissue and organs (Taylor et al.,Proc . Soc. Magn. Reson. Med. 4: 292,1985; Bittl et al.Biochem istry , 26: 6083-6090, 1987; Rosenberg et al.Ann . Emerg. Med. 18: 341-347 (19 89); Masson and Quistorff,Biochemistry 31: 7488-7493, 1992; Blum et al.An n . Surgery 83-88, July 1986; Icenogle et al.Proc . Soc. Magn. Reson. Med. Five : 899-900, 1986; Kushmerick et al.Adv . Exp. Med. Biol. 159: 303-325, 1982; Murray et al.Anesthesiology 67: 649-653, 1987; Katz et al.Am . J. Physiol. 255: H189-H196, 1988; Marcovitz et al.Am . Heart J. 124: 1205-1212, 1992; Martin Et al.,Am . J. Surgery 164: 132-139, 1992; Thompson et al.Quart . J. Med. 85: 89 7-899, 1992).³¹Using P NMR to relate to oxidative energy metabolism in tissues Phosphoric acid compounds [phosphocreatine (PCr), orthophosphoric acid (Pi), Non-invasive monitoring of the amount of leotide triphosphate (mainly adenosine triphosphate (ATP)) Can be For example, Pi may reduce phosphorus metabolism that accumulates during hypoxia or ischemia. ATP and especially PCr are energy breakdown products during hypoxia or ischemia. Decreased (Taylor et al., Supra; Blum et al., Supra; Icenogle et al., Supra; Marcovitz et al. Supra; Martin et al., Supra). ³¹P NMR spectroscopy was performed before, during, and after equal volume transfusions. Applicable in real time to monitor rat gastrointestinal tract and as an alternative to whole blood For its full range of functions, recombinant human hemoglobin (rHb1.1; Hoffman et al.,P roc . Nat. Acad. Sci. USA 87: 8521-8525, 1990). . Controls for these experiments contained human serum albumin (HSA) and Rats undergoing transfusion with a solution containing no oxygen carrier, and Rats that received only the insertion and were not replaced. Either male or female Sprague-Dawley rats weighing 283-552 g were treated with silastic (s ilastic) tube (0.012 inch id, 0.025 inch od) Cannulated through arteries and veins. Hematocrit determination of blood sample Removed regularly from arterial catheters (40% to 57% for controls) %). Recombinant human hemoglobin is frozen, stored at -70 ° F, and 5 mM phosphate buffered. Thawed immediately prior to use as a 5% (w / v) solution in impacted saline. Animals are anesthetized with Nembutal (50 mg / kg), weighed, and weighed 1.9 cm with an inner diameter of 31 cm. Placed on a 38 ° C. heating pad in a T magnet. Heparinizes the cannula Washed with saline, and then connected to a peristaltic pump set at a rate of about 1 mL / min. Was. Pump either rHb1.1 or HSA into the venous cannula, and To ensure that the hematocrit is too low (<3%) and cannot be measured reliably. Volume (approximately 45 minutes), measure volume through arterial cannula; then stop pump . Baseline from liver, gastrointestinal tract, abdominal system, and diaphragm³¹P NMR spectrum Up to 1 hour after cannulation and prior to volume replacement Obtained in blocks at 32.5 MHz for 5-10 minutes using Ill. Next, the animal's blood is Replace with either 1.1 or HSA and target organ³¹P NMR spectrum ６6 hours. Animals are weighed before and after the volume exchange and during the exchange process It was noted that the liquid equilibrium was maintained within 2%. The free induction decay after a 60 μs rf pulse (about 200 ° at the coil surface) was swept by 2 kHz (61 .54 ppm) and 2 K data points with a 2 second repetition time. 2 seconds Spin-lattice relaxation time (T₁), This repetition time is Slightly weakened Gunnar (Bittl et al., Supra). From a spectrometer VAX computer Transfer the time-domain data to a Sun SPARC-2 workstation and (Syracuse, New York) format and apodize with 10Hz filter Apodization, Fourier transform, phase alignment, and baseline Corrected. Peak area, peak position and peak width can be determined using NMRi software And adjust the signal to Lorentzians so that all Determined for releasable peaks. The signal range is from 30 Hz of PCr to β- The acid changed to about 60Hz. Chemical shifts are reported at δ = -2.35 ppm for PCr You. The pH is determined from the difference in chemical shifts (ppm) between PCr and P1 according to the following equation: Was: pH = pK + log [(Δ-Δ_min) / (Δ_max-Δ)] Here, pK = 6.75 and Δ_min= 3.27 ppm and Δ_max= 5.69 ppm . The normal pH for rat whole blood (Bittl et al., Supra) is 7.38 ± 0.11. this Methods are based on established findings (Kushmerick et al.,Adv . Exp. Med. Biol. 159: 303-3 25, 1982), giving a resting pH of 7.03 normal human forearm muscle. Baseline signal from PCr and ATP³¹Observed by P NMR spectrum . From the chemical shift of the small Pi signal (δ = 2.93 ppm), a pH of 7.44 ± 0.10 was calculated. Was. This value is close to the value reported for whole blood (see above), and In agreement with the value reported for abdominal tissue (7.35 ± 0.11) (Bittl et al., Supra). The standard error in chemical shift (and therefore pH) measurements is It was found to be ± 0.10 ppm (n = 21) in torr. Related to reduced and eliminated oxygen delivery³¹Monitor changes in P NMR spectra In order to determine with certainty, all blood of rats (n = 3) was Replaced with HSA at a rate of L / min. Exponential exchange process (t_1/2 About 8 minutes) And then³¹The P NMR spectrum was monitored for an additional 40 minutes. 43 ± 11 after start of replacement At minutes (or about 5 half-lives), the animal went into respiratory arrest. 80 minutes after starting exchange Animal³¹The P NMR spectrum was compared to the baseline level by the PCr signal. P increased with a two-fold drop in Naru_i(> 800%) depending on the signal Occupied. The major change occurred at less than about 25% hematocrit. Where P_iFinger in The exponential increase was noted as a hematocrit falling to zero. Animal Since the matcrit was lower than normal, about 25% of the apparent critical hematocrit Until ordinary energy is achieved in ordinary high energy phosphoric acid (as PCr)³¹P NMR signal There was a <10% descent in le and a <50% moderate rise in Pi. This critical At hematocrit, the high energy phosphate vs. hematocrit data shows a clear trend. Shows the change of Linear regression (l) for hematocrit greater than 25% (h> 25%) inear fits) gives a slope of 0.017 ± 0.094 and an intercept of 101.3 ± 3.1%, but On the other hand, for hematocrit less than 25%, the slope and intercept are 2.12 ± 0.14 and 50.6 ± 4.5%. The slope determined for h> 25% is zero and yes The fact that they did not differ is that rats are about twice as large in hematocrit. Demonstrating that it has significant reserve capacity to withstand hemodilution. Approximate critical It was noted that below the hematocrit, the slope of the line was significantly different from zero. No. The critical hematocrit (hc) in this rat model is calculated using the above two linear regressions. It was determined as hc = 26.0 ± 2.0% from the intersection. As hematocrit decreases and tissue oxygenation decreases, tissue loses lactate. From accumulation to acidosis. Average pH (h = 57%) before replacement is 7.58 ± 0.12 And as hematocrit approached zero, this dropped to less than 6.8. Furthermore, there is little pH change for hematocrit between 57% and about 25% And less than about 25% there was a significant decrease. Therefore, by hematocrit The pH change is calculated by regressing two straight lines on the data and measuring the intersection as described above. By calculation, it can be used as an independent assessment of critical hematocrit. Thus, for a hematocrit between about 25% and 57%, the equation for the straight line is pH = (2.05 ± 3.16) × 10^-3h + (7.32 ± 0.14), less than about 25% hematocrit For the equation for the straight line, pH = (2.06 ± 0.55) x 10^-2h + (6.85 ± 0.03) Was. So the calculated critical hematocrit is 25.3 ± 12.4%, Although variance makes this assessment less reliable, this value is less than the value observed above. Qualitatively identical. HSA exchange transfusions were compared to exchange transfusions in a buffered solution of 5% rHb1.1 by the inventors. He has also produced a useful model of fetal tissue hypoxia. Exchange blood transfusion procedure using rHb1.1 The four rats that received survived an average of 7.8 times longer than exchange transfusions with HSA. 337 ± 52 minutes vs. 43 ± 11 minutes, respectively). Of these rats³¹P NMR spectra are controlled for> 4 hours after exchange. Values remained stable. In contrast to the behavior observed with HSA exchange transfusion, high energy No time-dependent drop in rugiphosphate and no incidental rise in Pi Was. Linear regression on time-dependent rHb1.1 exchange data shows that the slope of the PCr data is zero Only significantly different from (P_iSlope = (-3.9 ± 10.8) × 10^-3Integral unit / Minutes). In contrast to the decrease seen with HSA, PCr was reduced over time by rHb1.1 exchange. Note that it shows a small increase. The average pH of 7.35 ± 0.15 (n = 68) from all rHb1.1-exchanged rats is the normal pH (Bittl et al., Supra). Either during or after blood exchange with rHb1.1 There was no significant change in pH over time from to animal death. Time-dependent pH The slope of the straight line regressed to the data and the total pH change were -6.71 ± 17.29 x 10^-Five Minute^-1And ΔpH = 0.08 ± 0.07. Hematocrit 0 Both the 57% slope over the full range and the total pH change are not significantly different from zero Was. The characteristics of pH regulation and tissue metabolism indicated by the HSA data are Relationship between acid hydrolysis and pH; ATP and PCr hydrolysis To produce the rutophosphate anion. As the tissue becomes hypoxic, electron transfer and Little oxygen is available for NADH and NADH (and NADPH) production. Cytoplasmic reduction As the force decreases, lactate accumulates. This failure of the acid-base equilibrium Appears in a correlation with rutophosphate production. Such a relationship is a rat exchanged by HSA Recognized when transfused, but recognized when rats were replaced with rHb1.1. Was not. The data for rHb1.1 in this case are concentrated around the average pH, Indicates that rHb1.1 supports normal tissue / blood pH regulation. This behavior is When hematocrit drops to less than 25% when replacing blood with HSA In sharp contrast to the decrease in pH seen. Animal death is more of a failure of rHb1.1 itself to supply tissue with oxygen. RHb1.1 clearance from circulation (t_1/2(About 107 minutes) (Vlahakes et al.,Euro J . Ca rdio-Thoracic Surgery 3: 353-354, 1989; Hess et al.J . Appl. Physiol. 70:16 39-1644, 1991; Hoffman et al.Proc . Natl. Acad. Sci (USA) 87: 8521-8525, 1990 Looker et al.Nature 356: 258-260, 1992; Shen et al.Proc . Natl. Acad. Sci. (US A) 90: 8108-8112, 1993), and consequent tissue hypoxia; , T_1/2Can lead to an improved survival time. These experiments demonstrate the efficacy of rHb1.1 in vivo at the extremes of whole blood exchange. And the hemoglobin (rHb1.1) concentration used (5g / dL) is (About 15 g / dL) of cell-free hemoglobin Of the organization at a level indistinguishable from the level observed when To clarify that it maintains the function of producing lug. Example 2 Demonstration of oxygen delivery to tissue by hemoglobin 3g / dL solution Except for using 3g / dL solution instead of 5g / dL solution of cell-free hemoglobin for exchange transfusion Treated rats as described in Example 1. Eight rats were exchange transfused. [Hb]_rbcFor> 10, the average value of high-energy phosphoric acid concentration [HEP] is 100.00% ( ± 1.6%, n = 9 measurements), while [Hb]_rbcFor <1.0, the average value of [HEP] Was 91.0% (± 3.8%, n = 6 measurements). This value is based on [HEP] at the start of replacement. Significantly smaller (α = 0.025). Therefore, in total 3g / dL [Hb] in blood, phosphorus metabolism Animals were slightly affected, but the animals remained alive. In fact, 3g / dL using rHb1.1 [HEP] (91.0% (± 3.8%, n = 6)) determined by total [Hb] is human serum albumin. Significantly higher than that observed with red blood cells during replacement (78.5% ± 4.6%, n = 5) (Α = 0.05). Example 3 To resuscitate dogs from hypovolemic shock Use of human recombinant hemoglobin solution These experiments demonstrate the efficacy of resuscitation with cell-free hemoglobin solution (rHb1.1) Compared to standard resuscitation in crystalline and whole blood release. Acute effects, (Delta tiger Combined with continuous measurement of oxygen consumption (using a delta trac metabolic monitor) And was assessed by using serial measurements of intraarterial base deficiency. This is the use of liquid volume. Used as an accurate guide for use. A dog model of oxygen debt based on hypovolemic shock was used. Anesthetize Animals were intubated and arterial blood pressure, central venous pressure, pulmonary artery pressure, and cardiac output (heat Measurement by dilution and / or Cardiogreen staining) The instrument was installed for Insert the endotracheal intubation tube into the Delta Trak c) O_TwoConnect to the consumption ventilator, and also to the femoral artery_Two, PaCO_Two, PH, Instruments were installed for frequent intermittent and continuous measurement of base excess. This After a stabilization period to assess basal levels of oxygen consumption under these conditions, the animals The preparation was previously determined by extensive studies on this preparation (Dunham et al.,Crit . Care Med. 19 (2): 231-243, 1991), the average LD₅₀Oxygen debt (114ml / kg Bleeding to a level of oxygen debt close to). This level of oxygen debt is less than 60 minutes Achieved within, and therefore, O_TwoStandard rate of debt formation and standardized final oxygen debt Were present. After a baseline measurement made after achieving the desired oxygen debt, one of two methods Resuscitation started. Oxygen consumption recovery rate and overshoot rate, The rate of reduction of base deficiency and reduction of lactate were monitored during and after the resuscitation procedure. I started The two resuscitation methods compared are as follows: 1. Control resuscitation. Resuscitation is performed during the first 20 minutes after resuscitation begins. Performed with a crystalline-colloidal solution equal to 60% of the volume, then the total released blood volume Returned 60% (autologous blood reinfusion). This procedure is the first crystalloid-colloid resuscitation And generally includes whole blood transfusions immediately obtained from a blood bank, Mimics standard clinical resuscitation. 2. Hemoglobin solution (rHb1.1) resuscitation. Of hemoglobin removed by bleeding Starting capacity of rHb1.1 equal to 60% (approximately 75-108 g of rHb1.1 depending on dog weight) And resuscitation using some crystalloid-colloid volume, so that the total volume of resuscitation fluid is , Equal to the amount used in (1) above. First with full percent rHb1.1 Use of less rHb1.1 at the same total exchange capacity after lower Circular hemoglobin can be used to maintain higher levels of hemoglobin to maintain critical levels of oxygen delivery. Can be evaluated to determine if it can be as effective as the control level. In each of these groups, the rate of recovery of oxygen consumption to baseline levels, The magnitude of the overshoot and its duration were accurately quantified. Furthermore, the base Insufficient reduction rate, how closely it is, the rate of capacity reduction (initial Solution and then released blood). LD determined from control resuscitation group₅₀Survive oxygen debt levels Liver function and renal function in animals in order to monitor for evidence of residual oxygen toxicity. Follow-up was performed 7 days after shock using a biochemical determination of function. On the last day of the seven days, The surviving animals are anesthetized and the tissues are histologically analyzed for liver, lung, and kidney. Removed for study. The animals were then sacrificed under anesthesia. Typical tissue optics Histology and electron microscopy studies can reflect ischemia and reperfusion injury Performed to determine the presence or persistence of ultrastructural damage. In this way, Restoration of oxygen consumption caused by hemoglobin solution resuscitation versus control resuscitation Rates, and reductions in oxygen debt and base deficiency, not only are viability, but also It was also associated with the presence or absence of sequelae. These experiments show that in a dog model of hypovolemic shock, Resuscitation is faster and essentially more complete of oxygen debt caused by blood loss Has proved to be reimbursable. Traditional resuscitation with crystalline and autologous blood At 140 minutes after the onset of hypovolemia, only 73% of the oxygen debt had been repaid. In contrast, rHb Resuscitation by 1.1 gives 95% of oxygen debt in 140 minutes (Figure 1) and oxygen debt in 182 minutes Redemption of nearly 100%. Therefore, rHb1.1 is faster and faster than blood transfusion And results in more complete redemption of oxygen debt. As shown, the normoxic consumption Rapid reimbursement is important for survival (Siegel,Clin . Chem. 36: 1585, 1990). Example 4 Preclinical toxicology study of hemoglobin The safety of rHb1.1 has been demonstrated in 5 animal studies and 2 in vivo using human cells Evaluated in the study. These were pre-toxinological studies in dogs, stressed Central single-dose toxicology study in dogs, dogs anesthetized under severe stress Single-dose hemodynamic studies in dogs, cardiovascular studies in anesthetized dogs, Gastric brain studies and the effect of rHb1.1 on human complement activation and human neutrophil function In vitro studies. Serious treatment-related effects include central single-dose poisoning in stressed dogs. Administration of rHb1.1 up to 30% blood volume resuscitation dose (1.1 g / kg) in elementary studies Later was not recognized. Results were transient neutropenia and above AST and CK Only a limited reversible effect including elevation was shown. All major organ systems are affected No histopathological changes were observed, and no hemoglobin was detected in the urine. I was not issued. Hemodynamic and cardiovascular parameters were measured before and after volume resuscitation. Later, single-dose hemodynamic studies in severely stressed and anesthetized dogs Was measured. Circulating hypovolemic shock is induced by removing 50% of the animal's blood. And before resuscitation with rHb1.1, 5% human serum albumin (HSA), or autologous blood For 30 minutes. Heart rate, cardiac output, systemic and pulmonary blood pressure, and blood vessels Resistance was determined. Significant changes in these parameters are caused by the induced circulating blood Rehabilitation by rHb1.1, but not in response to dose reduction stress and resuscitation Cardiovascular parameters and hemodynamics between animals and animals resuscitated with autologous blood Distinct differences in the magnitude or time course of the statistical parameters I couldn't. This study shows that rHb1.1 resuscitates severe hypovolemic dogs When used to cause adverse cardiovascular or hemodynamic effects. Prove that you did not. A study to evaluate cardiovascular effects was performed using rHb1.1 in anesthetized dogs. It was completed after giving. The dogs in this study were anesthetized with halothane and used for cardiopulmonary monitoring The instrument was attached to and subjected to a 50% equal volume hemodilution with rHb1.1. rHb1.1 is light Although it resulted in systemic hypertension, pulmonary and coronary hypertension were not observed in this study, Heart rate did not change significantly after rHb1.1 hemodilution. rHb1.1 is used for myocardial function and Had no effect on coronary hemodynamics. After observing gastrointestinal adverse events in clinical studies, any potential pancreas of rHb1.1 Studies were performed on rats to closely observe the effects or hepatobiliary effects. Hem In addition to this widespread use in metabolic studies, the animal is also used to treat pancreatitis due to various factors. Was selected as a general model to study. In rats, pancreatitis is induced by serum Milase and lipase and pancreatic wet / dry weight ratio (this is (Which is a sensitive measure). Research was performed between 0.35 g / kg and 2.85 g / kg ( A single dose bolus of rHb1.1 in the range of about 10% and 80% of the blood volume, respectively) To test the potential of rHb1.1 to affect the pancreas after intravenous top loading in rats Designed for A series of serum amylase and lipase determinations were determined for rHb1.1 The rest was normal for 2 to 48 hours. At 24 and 48 hours after rHb1.1 administration, There was no change in the wet / dry ratio of the offal. Reversible and mild ALT and AST levels Significant elevation was observed in 3 out of 12 rats dosed with 2.85 g / kg rHb1.1 top load. Was accepted. Macroscopic pathological examination of abdominal organs shows no significant abnormalities Was. Abdominal histopathology experiments show no effect on pancreatic or hepatobiliary tissue won. Mild to moderate effects were observed in the kidneys of rHb1.1-treated rats, It can be attributed to administration at high volume, top load. Pancreatic or hepatobiliary Significant damage was noted at rHb1.1 at doses approximately 20 times higher than the maximum clinical dose obtained to date. Was not induced in this rat model after a large volume top load. Potential effects of rHb1.1 on the human immune system in an in vitro complement activation assay And in vitro neutrophil assays. In the first study, complement activity Is converted to whole hemolytic complement (CH50), as well as to the classical complement activation pathway and complement activation Assays were made by measuring complement degradation products from both pathways. rHb1.1 is However, this study had no effect on any of the complement system pathways. In the second study The potential of rHb1.1 to activate, inhibit, or directly damage human neutrophils was investigated. rHb1.1 was measured for any of the measured parameters (granulocyte chemotaxis, adherence, or viability Gender) at all. Example 5 rHb1.1 Preclinical pharmacology research Clinically effective oxygen carriers and volume expanders exhibit colloidal osmotic pressure, Should remain localized in plasma to transport oxygen from lungs to tissues And should not be removed immediately after injection. Pharmacokinetic studies show that rHb1.1 Has a clinically useful half-life and remains trapped in the vascular lumen after administration Performed in dogs after a single dose of rHb1.1 to determine if any. Further The data on the potential hemodynamic and cardiovascular effects of rHb1.1 resuscitation Was obtained during a preclinical toxicology study of rHb1.1. Pharmacokinetic studies in dogs show that the plasma half-life of rHb1.1 after 1.8 g / kg infusion is 1 1.6 ± 2.5 hours. The peak concentration of rHb1.1 in dogs was 30 minutes 30 ± 2.7 mg / mL found at the end of the rHb1.1 infusion during. RHb1.1 in dogs Distribution volume (60.6 ± 2.0 mL / kg) was almost equal to plasma volume. This means rHb1.1 remained almost completely confined to the vascular lumen after administration Is shown. Example 6 Clinical study of rHb1.1 in awake volunteers A total of 76 male subjects were dosed with rHb1.1. Where the highest dose level administered The bell was 0.32 g / kg (25.5 g full dose) at 3.75 mL / kg / hour infusion. Subject Received rHb1.1 greater than or equal to 0.15 g / kg. Dose escalation Studies have examined the safety and safety of a single intravenous infusion of rHb1.1 in normal human male volunteers. And designed to evaluate pharmacokinetics. Another study found that high doses To assess moderate to moderate gastrointestinal (GI) adverse events and certain therapeutic interventions Performed to determine whether the condition could be reduced or resolved. Another study GI events were further evaluated and determined by performing esophageal manometry after rHb1.1 infusion. Designed to weigh. Serious adverse events were noted during rHb1.1 IV in any of these studies. Or, none was observed after administration. In addition, injection of cell-free hemoglobin solution Numerous adverse events and toxicities historically related to were not observed. Especially the kidneys Evidence of dysfunction or substantial renal clearance of rHb1.1, as well as liver toxicity and And there was no evidence of altered lung toxicity or effector system activation. Only However, during rHb1.1 infusion, there was a slight increase in blood pressure in some subjects. further, Mild to moderate adverse events occurred in these studies after completion of the rHb1.1 infusion. first The dominant adverse event in our study was a febrile response. In the latter study at higher doses GI adverse events were noted. Fever responses observed included fever, chills, myalgias, headache, and transient mild It was manifested by mild to moderate symptoms of neutropenia. These symptoms are Dissipated spontaneously or after ibuprofen administration. In the product manufacturing process Modifications which resulted in improved product purity. Manufactured after this manufacturing change Subjects in the next study that received a higher dose of rHb1.1 He showed neutropenia, but few other symptoms. Studies conducted at higher doses showed that most subjects in the 0.15 and 0.18 g / kg dose groups Specimens exhibited mild to moderate GI adverse events. These events are typically injected Appears 1-3 hours later, and has difficulty swallowing, middle upper abdominal discomfort, and occasionally nausea, Consists of vomiting, abdominal cramps and / or diarrhea. These events are not serious Limited dose escalation in these normal volunteers. These findings are systemic GI dysmotility, especially due to the characteristics of upper abdominal discomfort and difficulty swallowing Consistent with the diagnosis of lower esophageal sphincter spasticity that appeared. This diagnosis is based on gastric motility Figures (gastrografin esophagram), and from human and animal GI barometric studies Observation confirmed in one subject. A retrospective review of previous studies shows that 16 Two of the samples showed that mild but similar adverse events were reported. The GI phenomenon may be associated with smooth muscle contraction and GI dyskinesia. Therefore, some interventions Were evaluated for preventing, alleviating, or resolving the subject's symptoms. until now Although none of the assessments were consistently therapeutic, Lucagon, nifedipine, and naloxone were somewhat useful. Preventive Terbutaline sulfate is most useful when administered to Made it possible. These studies demonstrated laboratory abnormalities after injection. Clinically significant None, but occasional increases in bilirubin and transaminase occurred. Several Subjects show a weak transient increase in serum amylase and lipase levels, which Disappeared spontaneously within 12-24 hours. Abdominal experiments were benign. These findings Reported that abdominal illness was observed in some of these subjects, but reported abdominal illness Did not correlate with qi. Laboratory abnormalities may include some demographic data, observation time , Or serum hemoglobin levels. In these studies, a number of other adverse events were less frequent. An example For example, after injecting rHb1.1, about 9% of the subjects had a weak temporary measles. Illness The rash resolved spontaneously or with antihistamine treatment, but did not want to show measles These subjects also had any relevant cardiovascular findings, bronchospasm or anaphylaxis. Did not make Kissy evidence. One subject receiving 0.15 g / kg rHb1.1 received a light bronchial tube about 15 minutes after the start of the infusion. The convulsions appeared. Infusion is complete and subject is epinephrine and diphenhydr The wheezing sound dissipated shortly after receiving Ramin (Benadryl). He has a related rash Or had no cardiovascular compromise, and the symptoms resolved with no clinical sequelae. this No further events were noted. Transient asymptomatic cardiac conduction deficits in 3 of 76 subjects after rHb1.1 injection Admitted. All deficient subjects received 0.15 g / kg rHb1.1. One examinee The body had many episodes of type I second-degree AV heart block and type II after rHb1.1 injection. A second episode revealed one short episode of the AV block. He has no cardiovascular compromise Was asymptomatic. The conduction defect resolved spontaneously without treatment. All ratings are shade Gender. However, some minor rhythm changes (normal in his age group) Was confirmed by 24 hours of ECG monitoring. Two other subjects Showed a temporary decrease in SA nodules and a rhythm of recruitment of the joints at equal frequency AV dissociation. 1 Human subjects have also demonstrated this AV dissociation prior to receiving rHb1.1. These subjects Was asymptomatic and the conduction defect resolved spontaneously. The etiology of these effects is It remains unknown. Example 7 Clinical study of rHb1.1 used during surgery in anesthetized patients Initial safety assessment of rHb1.1 in elective surgery patients under general anesthesia may be studied It has been. Patients enrolled in this study received rHb1.1 or dose control. All normal saline was injected at 3.75 mL / kg / hour at 0.075 g / kg (for a 70 kg individual). Doses ranging from 5.25 g) to 0.35 g / kg (24.5 g for a 70 kg individual). There were no serious adverse events in the 14 patients so far administered. Con Most patients, including trolls, have mild to moderate postoperative nausea and vomiting. I did it. In addition, four patients in the rHb1.1 group had mild hypertension requiring treatment. He showed pressure. Stomach consistent with symptoms observed in unanaesthetized volunteer study No intestinal adverse events were still noted. Example 8 ANH Study of rHb1.1 used as an exchange solution in the In addition to the above studies, rHb1.1 was used as an exchange solution during acute normovolemia hemodilution. evaluated. During this procedure, up to 2 units may be added to physiological saline solution / rHb1.1 or Is replaced with physiological saline solution alone. Has 3 rHb1.1 patients per group , 12.5 g, 25 g, and 50 g were evaluated as shown in Table 1. Do or evaluate. In addition, there are three physiological saline solution control patients. There. Patients who have ever received rHb1.1 have no clinically significant adverse effects. Not shown. Example 9 For acute normovolemia hemodilution in patients undergoing cardiopulmonary bypass surgery Use of recombinant human hemoglobin (rHb1.1) The purpose of this study was to perform hemodilution before and during cardiopulmonary bypass surgery (CPB). Determining the safety of rHb1.1 administered as a liquid, and during and during surgery Hemodilution requirements for changes in hemodynamic parameters afterwards, fluid requirements, To assess the effect of rHb1.1 administration as part of a blood transfusion requirement . Patients received 25 g or 50 g (500 mL or 1000 mL, respectively) of intravenous rHb1.1 One of the two doses or 1000 mL of normal saline (as volume control) ) And randomize. During this study, at least two units of blood Collect, but hemodilution can be used to collect as much as 4 units of blood. Induction of anesthesia And after the pre-infusion procedure is completed, two units of blood are removed. Normal blood volume , Maintained at 2000 mL normal saline exchange. In the 25g dose group, one third Remove the knit blood and add rHb1.1 (500 mL) or normal saline (1000 m Replace with L). In the 50g dose group, one-third unit of blood is drawn and And replace with 25 g (500 mL) rHb1.1 or normal saline (1000 mL). Possible If so, remove one quarter unit and add another 25g rHb1.1 (500mL) or Replace with normal saline (1000 mL). When compared to patients who have not received rHb1.1, patients given rHb1.1 are allogeneic There is less need for inter- and / or autologous blood transfusions. The foregoing description of the present invention is illustrative for purposes of illustration and description. Change and It is understood that changes and modifications can be made without departing from the spirit and scope of the invention. It is obvious to the trader. The following claims cover all such changes and modifications. It is intended to be interpreted as such.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号０８／４７７，５２９ (32)優先日 1995年６月７日 (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ )，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者シューメーカー，スティーブンエイ. アメリカ合衆国ユタ 84092，サンディ, フォックスウッドレーン 9497 (72)発明者テンプルトン，ダブリュー．デイビスジュニアアメリカ合衆国コロラド 80303，ボールダー，ブリアーウッドドライブ 2841 (72)発明者ガーバー，マイケルジェイ. アメリカ合衆国コロラド 80220，デンバー，クラーモントストリートパークウェイ 500────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (31) Priority claim number 08 / 477,529 (32) Priority date June 7, 1995 (33) Priority country United States (US) (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, M C, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG , CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (KE, LS, MW, SD, SZ, U G), UA (AZ, BY, KG, KZ, RU, TJ, TM ), AL, AM, AT, AU, AZ, BB, BG, BR , BY, CA, CH, CN, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GE, HU, IS, JP, KE, K G, KP, KR, KZ, LK, LR, LS, LT, LU , LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, S I, SK, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US , UZ, VN (72) Inventor Shoemaker, Stephen A. United States Utah 84092, Sandy, Foxwood Lane 9497 (72) Inventor Templeton, W. Davis the Junia United States Colorado 80303, Bo Ruder, Briarwood Drive 2841 (72) Inventors Gerber, Michael Jay. United States Colorado 80220, Den Bar, Claremont Street Park Way 500

Claims

[Claims] 1. A method for facilitating autologous blood donation by a patient, comprising the following steps: (a) removing a portion of the patient's blood to provide a removed portion of blood; (b) administering an oxygen delivery-enhancing amount of cell-free hemoglobin; and (c) administering respiratory gas, if necessary, wherein said respiratory gas is less than 50% Having an oxygen concentration; A method comprising: 2. The method of claim 1, further comprising storing the removed blood portion. The method described. 3. The method of claim 2, further comprising the step of re-administering the stored blood to the patient. The method described. 4. The withdrawal of patient blood is less than 72 hours for the patient receiving the blood loss. 2. The method of claim 1, wherein the method is full. 5. The method according to claim 1, wherein the cell-free hemoglobin is hemoglobin derived from non-erythrocytes. The described method. 6. The method of claim 1, wherein the cell-free hemoglobin is a recombinant hemoglobin. Law. 7. 7. The method of claim 6, wherein said recombinant hemoglobin is rHb1.1. 8. The method of claim 1, wherein the autologous blood donation is a preliminary blood donation. 9. 2. The method of claim 1, wherein the autologous blood donation is at the time of surgery. 10. The method of claim 1, wherein the respiratory gas is not enriched with oxygen. 11. Administer a therapeutically effective amount of cell-free hemoglobin to treat oxygen debt A method for treating oxygen debt, comprising the steps of: 12. 12. The cell-free hemoglobin is non-erythrocyte-derived hemoglobin. The method described in. 13. 12. The method of claim 11, wherein the cell-free hemoglobin is a recombinant hemoglobin. the method of. 14． 14. The method of claim 13, wherein said recombinant hemoglobin is rHb1.1. 15. For use in cell-free hemoglobin and autologous blood donation or oxygen debt treatment A kit containing related supplies for