【発明の詳細な説明】
毒素感染性クロストリジウム症の診断
本発明は、ウマ毒素感染性クロストリジウム症、特に、（ウマ自律神経障害
としても知られている）牧草病の診断に関する。
アルゼンチンではセコ病（Mal Seco）として知られているウマ牧草病（Equi
ne Grass Sickness，EGS）は予測不能な疾病で、汚染された牧草地で放牧された
代々の若年個体のウマに、１０年単位のタイムスパンで感染することを特徴とし
ている。ウマ牧草病は、毒素感染性クロストリジウム症の一つの発現形態である
。ウマ牧草病の臨床症例では、ウマの胃腸障害および／または神経障害の合併症
のかたちで発現することもある。
本発明の発明者らは、地方病性ウマ牧草病の地域で放牧されているウマは、
ノーヴィ菌（Clostridium novyi）の表現型に対して一定の血清変換が生じてい
ることを見いだした。こうした個体群において疾病が散発的に生じている事実か
らは、自然状態での免疫防御には限界があることがはっきりしており、また、こ
うした免疫防御は、個々のウマのレベルでの免疫応答の効果的作用に依存する。
クロストリジウムによる毒素感染症は、特に年齢の高い動物の場合、病原性では
ない各種の非特異的胃腸障害および／または神経障害の徴候を呈することがあり
、こうした事情がウマ牧草病の診断の問題をさらに困難なものとしている。
これまで、ウマ牧草病の診断は、回腸の生検（開腹術）を行うか、剖検を行
うかのいずれかによってのみ、確認が可能であった。
１９２４年に、トッチャー(Tocher)らは、ある証拠にもとづいて、ウマ牧草
病（ＥＧＳ）がボツリヌス中毒の一形態であるとの結論を出した。この主張に対
しては、ただちに疑義が提出されたが、その理由は、微生物学的裏づけが不適切
であるという点と、自律神経障害（すなわち、自律神経系の障害）が支配的であ
るとともに、古典的なウマのボツリヌス中毒症やマグサ中毒とは外見上異なると
いうウマ牧草病に顕著な臨床上の特徴の数々を、この説では説明できないという
点であった。ウマ牧草病のボツリヌス毒素説は、ウマの感受性個体群で、（ボツ
リヌス菌（Clostridium botulinum）のＡ型毒素と、対応抗毒素とをin vitroで
組み合わせることによって製造した）典型的なワクチンが、明らかに疾病をコ
ントロールしえなかったことによってさらに不利になった。
そうこうするうちに、研究の関心は、ウマ牧草病に見られるニューロンの病
変へと集まってきた。ニューロンの病変は、この疾病の本質的な特徴であり、神
経毒が影響していることを例証する事実であると考えられており、ボツリヌス毒
素の関与と折り合いをつけることは、一見不可能であった。また、ポリンならび
にグリフィス（Pollin and Griffiths）による最近のレビューでも、剖検（また
は生検）でのウマ牧草病であるとの診断を裏づけるような神経障害の種類ならび
に分布を生じうる、または生じそうな感染性物質若しくは毒素に言及した文献は
ないことが述べられている。
本発明の端緒となった研究は、２つの基本的仮定にもとづくものであった。
すなわち、第一に、ウマ牧草病は、毒素産生性クロストリジウムによる腸（ある
いは併発的疾病の病変部）での先行的コロニー形成に依存した毒素感染症のプロ
セスであり、第二に、ウマ牧草病を生じるボツリヌス菌の系統は、２種の神経活
性毒素を不変的に産生しているというものである。２種の神経活性毒素が強調し
て作用していると考えることによって、ウマ牧草病の自律神経障害についても、
古典的な胃腸ならびに神経学的な発現についても説明がつき、これまで軽視され
てきたボツリヌス説の最も議論の多い点が十分に説明される。
第ＩＩＩ群の系統のボツリヌス菌（Ｃ型ならびにＤ型）の大半は、それぞれ
の型に特異的な神経毒（Ｃ1ならびにＤ1）に加えて、種々の量の二次毒素を産生
することが知られている。ボツリヌス菌Ｃ2型二元毒素は、有力なＡＤＰリボシ
ルトランスフェラーゼとしてのよく調べられた役割からしても、ウマ牧草病に関
する特段の重要性を有するものと考えられた。すなわち、ボツリヌス菌Ｃ2型二
元毒素は、in vitroでの各種の研究や実験動物モデルで特性が調べられてきた多
岐にわたる細胞膜受容体を活性化する能力を有している。ウマ牧草病の劇的な臨
床徴候を説明するうえで必須であるような、神経活性成分と腸毒性成分との組み
合わせを産生する能力を有している血清型は、ボツリヌス菌Ｃ型ならびにＤ型の
みである。
いくつかの細菌タンパク質毒素は、遊離したＡＤＰリボシルトランスフェラ
ーゼとして作用することによって、細胞のコミュニケーション、すなわち、シグ
ナル伝達、の各種プロセスを妨害する。ＡＤＰ分子にさらにリボース基が付加さ
れ、リン酸化されＡＴＰになりえないポリリボース複合体が形成される。
個々のＡＤＰリボシルトランスフェラーゼは、特異的な基質を有しており、
そうした基質が活性化されることによって、膜機能作動系や付随する細胞間の各
種プロセスが阻害される。ボツリヌスＣ2型毒素の場合、基質は、グアニル酸タ
ンパク質であるモノマー状のＧ−アクチンであり、この物質は、胚神経堤由来の
全ての分泌ならびに運動性細胞の細胞骨格構造を形成している。
ボツリヌスＣ2型毒素によって誘導されたＡＤＰリボシル化が正確にターゲ
ティングされた結果が、ウマ牧草病に伴うニューロンの病変であり、逆行性軸索
伝達のプロセスによって生じた腸内毒素感染フォーカスからの末梢への分布パタ
ーンであると考えられている。in vitroでの研究によって、ニューロンがＣ2二
元毒素に接触すると、制御されない神経化学的放出が生じ、同様の接触によって
運動性細胞の活性が阻害されることが例証された。これらの事象では、染色質溶
解として定義される超構造的変化を伴い、このことからは、極端な生理学的スト
レスが示唆される。すなわち、Ｃ2毒素とさらに長時間又はさらに高濃度で接触
した場合には、細胞溶解が生じることになる。こうした過程が、ウマ自律神経障
害に伴うニューロンの病変である。しかし、ボツリヌス菌Ｃ1ならびにＣ2型毒素
のウマ牧草病の神経毒性との関わりが考えられるようになる以前に、これら２種
の毒素のヒトあるいは動物の疾病プロセスとの関わりが示唆されたという記録は
全くない。
腐肉中に存在するＣ型菌は、最も動物間流行性のボツリヌス中毒症の原因と
なるが、ウマをはじめとするさまざまな種にみられる（あらかじめ形成された毒
素の摂取に伴う）そうした発症の場合には、Ｃ2型毒素の関与を示唆する臨床的
事実は認められない。
Ｃ1型神経毒は、ニューロンエンドペプチドであるシンタキシンの特異的な
亜鉛依存性分解を生じさせることよって、アセチルコリンのその貯蔵用小胞から
の放出を阻害する。
本発明の発明者らは、原始的な生物と、高度に特異的なＧタンパク質媒介性
のシグナル伝達系、すなわち、分泌や走化性をはじめとするあらゆるカルシウム
感受性プロセスを媒介しているホスファチジルイノシトールカスケードとの関係
性を例証した。
ボツリヌス中毒の毒素感染性の発現は、下等動物でしばしば観察され、ウマ
牧草病に関して重要なのは、こうした緊密な宿主−寄生体関係の進化上の重要性
を反映して、（Ｃ型菌が主に関与している）ニワトリの感染症は、いずれも毒素
感染性であることである。しかし、１９７６年になってはじめて、ヒト幼児の疾
病が、in vivoでのボツリヌス毒素の自然生成に関係していることがわかった。
すなわち、主に、生後３カ月から６カ月の感受性の乳児がボツリヌス芽胞（Ａ型
ならびにＢ型）を摂取することによって生じる、いわゆる幼児ボツリヌス中毒は
、疾病ならびに死亡の原因として、米国では広く認められている。
ケンタッキーをはじめとする米国東部で多発し、オーストラリアにも見られ
るウマの古典的な毒素感染性ボツリヌス中毒症（子ウマふるえ症候群(Shaker Fo
al Syndrome)）には、ボツリヌス菌Ｂ型が関係している。しかし、こうした状態
は、ヒト外傷性ボツリヌス中毒症との類似性の方が高い。というのも、この菌は
、既に存在している嫌気性の病変部位があってはじめて増殖可能だからである。
こうした病変部位は、臨床的に重要であるわけではないものの、毒素原物質が局
在化するフォーカスとなる。
名称からも示唆されるように、牧草病は、放牧にほとんど不変的に関連し、
疾病の発症パターンに季節性があるのは、牧草の一過性の有毒因子と接触するた
めであると一般に考えられている。しかし、本発明の発明者らは、感染が生じる
のは、土壌に含まれているクロストリジウムの芽胞が放牧の間に摂取されるため
ではないかと推論した。こうした芽胞は、腸内で成長して、キャリア状態を示す
特定の免疫応答を開始させると考えられる。
地方病性ウマ牧草病の地域のウマは、ボツリヌス菌（第ＩＩＩ群）の表現型
に対する抗体を発現しており、このことからも、疾病プロセスが毒素感染性の性
質を有することが例証される。血清学的（すなわち、抗体関連の）応答の意味を
もったパターンは、それまでの接触の程度を示唆し、疾病に対する感受性のめや
すとなる。
しかし、血清診断方法は、いずれのウマの腸にも、多岐にわたる非病原性ク
ロストリジウムの個体群が生息している事実より複雑となる。そのため、本発明
に至るまでの試験的方法では、後述の実施例に示すように、臨床的にみて正常な
ウマでのクロストリジウム血清変換と、特異的な疾病カテゴリーのウマでのクロ
ストリジウム血清変換とのグループ間ならびにグループ内での比較を考慮した。
本発明は、ウマ毒素感染性クロストリジウム症を診断する方法であって、生
体サンプル中のボツリヌス菌抗原若しくはその表現型に対する抗体、またはクロ
ストリジウム毒素に対する抗体の存在を検出する工程を含む診断方法を提供する
。本発明の方法は、ウマ毒素感染性クロストリジウム症の発現、たとえば、ウェ
ルチ菌（C.perfringens）の毒素原株に関連した前方腸炎あるいはX大腸炎を診断
するうえで有用である。
本発明は、さらに好ましくは、ウマ牧草病を診断するにあたって、ボツリヌ
ス菌第ＩＩＩ群の抗原またはその表現型に対する抗体の存在を検出するとともに
、ボツリヌスＣ型毒素に対する抗体の存在をも検出する工程を含んでなる診断方
法に関するものである。
本明細書中で表現型とは、クロストリジウム由来の抗原であって、各種の型
のボツリヌス菌に対する免疫反応と類似した免疫反応を生じるもののことを意味
する。ボツリヌス菌第ＩＩＩ群（Ｃ型ならびにＤ型）の場合には、表現型は、ノ
ーヴィ菌Ａ型から誘導するのが好ましい。本発明の方法は、好ましくはＥＬＩＳ
Ａ法である。
本発明は、さらに、ウマ毒素感染性クロストリジウム症診断用キットであっ
て、ボツリヌス菌抗原若しくはその表現型に対する抗体を検出する手段、および
／または、クロストリジウム毒素に対する抗体を検出する手段を含むキットを提
供する。このキットは、現場での使用に適したものとすることもできる。
本発明は、好ましくは、ウマ牧草病診断用キットであって、ボツリヌス菌第
ＩＩＩ群の抗原またはその表現型に対する抗体の存在を検出する手段、ならびに
、ボツリヌスＣ型毒素に対する抗体を検出する手段を含むキットに関するもので
ある。
本発明の試験方法を用いると、見かけ上は正常なウマであっても、指標生物
であるノーヴィ菌の細胞壁抗原に対する抗体を発現しているものを特定すること
ができる。ウマ牧草病であると疑われる個々の臨床症例では、ウマ牧草病特異的
な神経毒に対する抗体（抗毒素）を検出することによって、ウマ牧草病を特定す
ることができる。これまで、in vivoでウマ牧草病であることを確認するために
は、ウマの入院施設で、ストレスがかかり、費用もかさむ開腹術を行って、回腸
の生検を行わねばならなかった。
ウマ牧草病にかかったウマでは、ノーヴィ菌の細胞表面抗原に対する血清学
的（すなわち抗体の）応答が上昇し、それと並行して、ボツリヌスＣ1毒素への
応答が下がることが示されたことにも、この疾患の毒素感染性の性状が如実に示
されている。少なくともウマ牧草病の古典的な発現の場合には、腸が毒素産生部
位であることが特定されている。
本発明の試験の結果を調べたところ、多くの「キャリア」のウマが、ウマ牧
草病の毒素感染性物質と接触していたこと、そして、個々のウマのレベルでのそ
うした接触の事実が、ボツリヌス菌Ｃ／Ｄ型の指標表現型であるノーヴィ菌に対
する抗体応答の力価の測定によって測定しうるものであることが確認された。キ
ャリアのウマでは、古典的又は非典型的なウマ牧草病にかかるものが極めて少数
であるという事実も、免疫抑制機構および／または解毒過程の一般的有効性を裏
づけるものである。臨床での罹患が疑われる事例では、（現在では、ボツリヌス
Ｃ1型神経毒として特定されている）ウマ牧草病の一次毒素に対する血清学的応
答（すなわち、抗毒素力価）の事実が、免疫応答または防御反応の不全状態を示
唆する。こうした試験は、個々に使用して、感染動物を特定することもできるが
、組み合わせて使用することによって、信頼性の高いウマ牧草病の診断方法とす
るのが好ましい。
コリンデール（Colindale）の国立タイプカルチャーコレクション（Nationa
l Collection of Type Cultures）にNCTC8594として寄託されたスポロゲネス菌
（C.sporogenes）、NCTC8237として寄託されたウェルチ菌、ならびにNCTC538と
して寄託されたノーヴィ菌の細胞表面調製物が、それぞれ、ボツリヌス菌の第Ｉ
群（Ａ型、タンパク質分解性Ｂ型、Ｆ型）、第ＩＩ群（非タンパク質分解性Ｂ型
、Ｅ型）、ならびに第ＩＩＩ群（Ｃ型、Ｄ型）の表現型を表す抗原となる。本発
明者らは、毒素感染性クロストリジウム症が、主に、ボツリヌス菌第ＩＩＩ群、
ならびにボツリヌス菌第ＩＩＩ群の表現型を表すノーヴィ菌由来の抗原によって
生じていることを見いだした。
生体サンプル、好ましくは血清サンプルは、標準的なＥＬＩＳＡ法（酵素結合
イムノソルベント検定法）を本発明の方法に合致したかたちで実施することによ
って検査する。本発明では、非競合的なＥＬＩＳＡ法を使用するのが適当である
。酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ法）
ＥＬＩＳＡ法が有する診断上の価値は、抗原の純度に左右され、このことは
、抗原の構造が不定かつ可変であるような嫌気性の感染症を調べる場合には、特
にそうである。
したがって、本出願では、試験方法のスクリーニングにあたっての汎用性は
、適当なクロストリジウム表現型、すなわち、ノーヴィ菌、スポロゲネス菌、な
らびにウェルチ菌由来の菌体抗原を戦略的に使用することによって得ることがで
き、これらを組み合わせて使用することによって、ボツリヌス菌の既知の全系統
をはじめとする広範な毒素原性クロストリジウムに対する応答が示唆される。そ
の後、精製毒素抗原を使用することによって、得られた血清学的応答を特異的な
「診断」分析を確実に行い、毒素感染性の分泌物に対する宿主の反応の個々の抗
毒素成分を分類する。
本発明の診断方法で使用するのに適したＥＬＩＳＡのプロトコールは、以下
のようなものである。
１． コーティングバッファー（０．０２％のアジ化ナトリウムを含有する０．
０５ Mの炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．６）を用いて抗原の希釈液を作製し、
１０−１００μgの抗原を含有する１００μlの希釈液を、マイクロタイタープレ
ートのウェルに加える。プレートにふたをし、３７°Ｃで４時間、次に、４°Ｃ
で一晩インキュベートする。
２． ０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む０．９％ＮａＣｌで、プレートを３回
又は４回洗浄する。
３． 抗体複合体バッファーを用いて抗体の希釈液を作製し（０．８５％のＮａ
Ｃｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、０．０２％のアジ化ナトリウムを含有する
０．０５ Mのリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）、これをウェルに加える。ウェルを、
室温で４時間インキュベートする。
４． 洗浄工程２を繰り返す。
５． １００μlの適切に希釈した抗第１種抗体−酵素複合体（１対５００から
希釈率を倍にしていく）をウェルに加え、室温で一晩インキュベートする（酵素
複合体は、ホースラディッシュペルオキシダーゼを使用した）。
６． 洗浄工程２を繰り返す。
７． 希釈した酵素基質を加え、ウェルを室温で１時間インキュベートする。分
光光度計で結果を読みとる。
第ＩＩＩ群の抗原又は類似物質を含むサンプルは、生体液のサンプル又は組
織のサンプルでもよいが、好ましくは、血清である。
本発明の診断方法は、牧草病としても知られるウマの自律神経障害の診断を
確認するにあたっての、迅速かつ非侵襲性で確実な方法を提供するものである。
この方法を用いると、ウマの非特異的な胃腸および／または神経の障害での、ク
ロストリジウムの関与について示差的な診断を行うことができる。
さらなる特徴としては、本発明の方法は、個々のウマの、牧草病をはじめと
する毒素感染性クロストリジウム症の臨床症例での治療に対する応答を監視する
手段としても使用することができる。本発明の方法を実施し、得られた結果を解
釈することによって、ウマ毒素感染性クロストリジウム症の毒素学に関係した個
々のクロストリジウム毒素に対する宿主の応答を、特定及び定量することもでき
る。
本発明の診断方法は、並行して、細菌の毒力因子あるいは毒素を評価し、評
価結果を勘案して毒素原性クロストリジウムの野外株が有する病原性を決定する
際の方法上の基礎として使用することもできる。
特定の毒素原性クロストリジウムの病原性を生じている細菌の毒力因子ある
いは毒素を評価するのと並行して、個々のクロストリジウム毒素に対する宿主の
応答を特定及び定量することは、ウマの毒素感染症の疫学的研究にとって欠かせ
ない。
本発明を、以下の実施例によってさらに例示する。実施例では、臨床上の徴
候を示す４つのカテゴリーのウマを特定した。各群は以下のとおり。
第Ｉ群 − 急性牧草病（Acute Grass Sickness，AGS）
第ＩＩ群 − 慢性牧草病（Chronic Grass Sickness，CGS）
第ＩＩＩ群 − 腹部クリーゼを含む胃腸障害臨床例（Gasteroenteric，GE
）
第ＩＶ群 − 診断のすんだ又は診断の鍵となる徴候を有する広範な症例の
検体を含む種々雑多な臨床症例。
実施例１−指標抗原の決定
臨床症例の３４検体を、（ＩｇＧ）ＥＬＩＳＡ法で、２種の血清希釈度、す
なわち、１／２５ならびに１／５０で調べた。各検体は、２回調べ、ＥＬＩＳＡ
のＯＤ値は、２つの結果の平均値を示した。
表１に、４群の臨床症例の３つの指標抗原に対する平均ＯＤ値を（範囲なら
びに分散とともに）示す。
表１に示した代表的なデータからわかるように、ＥＬＩＳＡでのＯＤ値の全
範囲は、３種の抗原のいずれについても、だいたい似たようなものであった。し
かし、群間の有意な変異がはっきりと示されたのは、ノーヴィ菌抗原に関しての
みであった。
表１にまとめて示した臨床データによって、第Ｉ群（AGS）のすべてのウマ
と第ＩＶ群（種々雑多な臨床症例）のほとんどのウマが、ノーヴィ菌に対する抗
体のレベルが低く、したがって、ウマ牧草病に対して感受性であるという仮定が
裏づけられた。一方、第ＩＩ群（CGS）のウマは、サンプル採取時点での「イン
キュベーション」の段階に応じて、さまざまに血清変換していることが予想され
、非特異的胃腸障害を有する（第ＩＩＩ群の）個々のウマが不確実又は陽性の結
果を示したことは、疾病の過程での毒素感染性クロストリジウム要素の関与を示
唆している可能性がある。したがって、第Ｉ群（AGS）と第ＩＶ群（種々雑多な
臨床症例、非胃腸障害）とを合併させて、「血清反応陰性／不確実」の統合カテ
ゴリーとすることができ、同様に、第ＩＩ群（CGS）と第ＩＩＩ群（臨床症例、
胃腸障害）とは統計学的に区別不能であったので、「不確実／陽性」のカテゴリ
ーにまとめることができる。
実施例２
これらの２種の統合群Ｉ＋ＩＶならびにＩＩ＋ＩＩＩを比較すると、分散を
有意義なかたちで分析する基礎が得られる。
３種の指標抗原に対する血清学的応答の個別性は、データセット間で有意な
相関がみられなかったことからも裏づけられた。
実施例３ 臨床症例群のＥＬＩＳＡ
（ａ） 第Ｉ群 − 急性牧草病（AGS）
急性牧草病と確認された症例から採取した９検体では、１検体以外は、ノー
ヴィ菌抗原に対して血清反応が陰性であった（すなわち、ＯＤ＜０．４）。不確
実な検査結果（ＯＤ ０．６３５）の１例は、第Ｉ群の１２歳のウマに関して記
録されたもので、この検体は、２種の非特異的抗原に対して、群の平均値以上が
血清変換を示していた（表３）。
（ｂ） 第ＩＩ群 − 慢性牧草病（CGS）
定義上、慢性牧草病に対して感受性のウマは、病気の発症時点では血清反応
が陰性範囲（すなわち、ＯＤ＜０．４）にあるはずである。臨床症状が進行する
と、毒素感染症に対する個々の動物の応答に応じたかたちで、血清変換がさまざ
まな速度で進行するはずである。第ＩＩ群に含まれる検体（慢性牧草病が確認さ
れた検体）の大半は、疾病過程の比較的早期の段階で採取されたものである。
サンプル採取時点の平均持続期間 １９日
範囲 １１−３５日
ｎ ＝ ２３
（ｃ） 第ＩＩＩ群 − 胃腸障害臨床例
表４は、このカテゴリーに含まれる１２匹のウマについて記録された診断又
は臨床徴候をまとめたものである。
９匹のウマが、ＥＬＩＳＡ Ｎ５０診断試験で陽性（ＯＤ＞０．８）あるい
は不確実（ＯＤ、０．４−０．８）であり、したがって、慢性牧草病の症例（第
ＩＩ群）の大半と血清学的に区別不能であった。表中の残りの３匹のウマが、血
清反応陰性（ＯＤ＜０．４）で、したがって、急性牧草病と確認された症例（第
Ｉ群）と区別不能であった。症例１０ならびに１１が、急性腹部クリーゼであり
、最低のＯＤ値（０．０６４）が記録されたのが、子馬の下痢の「診断なし」の
症例であったことは注目に値する。
ウマ１、２、３及び５は、いずれも、地方病性牧草病の地域由来のもので、現
場 での慢性牧草病の診断と一致する徴候、すなわち散発性の食欲不振、弱い痛
痛及び体重減少を示していた。しかし、これらのウマは、血清学上、同一個体群
の臨床上正常なウマと区別することができなかった（第Ｖ群、平均ＯＤ、０．７
８１）。
ウマ６（X大腸炎）は、ウェルチ菌の関与をうかがわせる血清学試験結果
を示し（ＯＤ、１．００７）、他の２種の抗原に対する非特異的血清変換を伴っ
ている可能性があった（表５）。一方、ウマ４（咽頭麻痺）とウマ７、８（診断
なし）は、非特異的血清変換の事実を示さなかった。幽門狭窄の症例（ウマ９）
は、サンプル採取の１４日前に罹患したものであり、Ｎ５０反応は、境界線上（
ＯＤ、０．４２６）であったものの、特異的であった。
診断のすんでいない胃腸障害の徴候を示すウマは、慢性牧草病の早期段階（
すなわち＜２８日の持続期間）の症例と区別がつかない。しかし、確認された診
断がない場合、不確実なノーヴィ菌の応答が非特異的であると想定してしまうこ
とはできない。ウマ６（X大腸炎）のデータにからは、この試験方法によって、
ウマ牧草病でない疾病過程へのクロストリジウムの一次的に関与が示唆されうる
ことが例証された。一方、血清診断の有用性は、ウマ牧草病の可能性のある症例
（ウマ１、２及び３）を、地方病地域の個体群の正常な「免疫」動物と区別しえ
ないという点によって制約されている。
（ｄ） 第ＩＶ群 − 非胃腸障害臨床例
各種の「非腹部」障害と診断されるか、あるいはそうした徴候を示すウマか
ら、合計で２５の検体を採取した。このカテゴリーでは、１５／２５、すなわち
、６０％の検体が、血清希釈度１：５０で、ノーヴィ菌抗原に対して血清反応が
陰性であった。以下の表に、陽性（ＯＤ＞０．８）のウマ３頭ならびに不確実（
ＯＤ０．４−０．８）であったウマ７頭についてのデータを示す。
第ＩＶ群のカテゴリーに含まれるウマ４頭について、「非特異的」抗原に対
する応答を調べた。結果を、第７表に示す。
蹄葉炎の２症例では、ウマ６とウマ９の双方で、非特異的な血清変換が例証
され、このことは、同時に生じている腸性毒血症に対する応答と一致する。実施例３
− 正常なウマで実施した診断
表８は、ボツリヌス菌Ｃ型の指標生物、すなわちノーヴィ菌に関して試験を
行ったウマの起源と頭数を示す。すべてのルーチン試験を血清希釈度１：５０で
実施した。
データのまとめからわかるように、選択した個体群には、明らかな群間の差
があった。
この実施例で調べた正常なウマは、以下のようにグループ分けされる。第Ｖ群
このカテゴリーのウマは、北西スコットランドのウマ地方病性牧草病の地域
に「生涯にわたって」居住していたウマで、最初のバリー牧場の発祥地(origina
l Barry camp outbreak)（１９０９）地点から２マイル以内で放牧されていた２
０頭のウマを含むものであった。第Ｖ群３５頭中３３頭で、年齢にかかわりなく
、血清変換していた。第ＶＩ群
第ＩＶ群のウマの大半は、アイルランドからスコットランドに輸入されたウ
マで、到着の時点では、血清反応は陰性であった可能性が高い。サンプル採取の
時点では、これらのウマは、１週間から６カ月にわたって「居住」しており、統
計学的な血清変換のパターンでは、第Ｖ群のウマと区別がつかなかった。
これらの限られたデータから示唆されるように、地方病地域と「定期的往来
(regular traffic)」のある土地は、繰り返し「汚染」される結果、小型地方病
地域となりやすく、感受性の高い新たに搬入されたウマは、特に、潜伏期間中に
栄養あるいは気候のストレスが同時に加わった場合には、「危険」にさらされて
いる可能性がある。第ＶＩＩ群および第ＶＩＩＩ群
高栄養で「フル稼働」又は訓練中のイベント用あるいは競走用のウマ（第Ｖ
ＩＩ群）を、種々雑多の「非地方病」個体群（第ＶＩＩＩ群）の対照カテゴリー
として含めた。
表１０は、４種の非臨床症例カテゴリーについての、ノーヴィ菌抗原に対す
る血清変換のパターンを示す。
実施例４
したがって、本発明の診断方法の主要な特徴として、指標細胞壁抗原に対し
て不確実あるいは陽性の血清反応応答を示した臨床症例の検体は、「抗毒素」、
すなわち、特定のクロストリジウム毒素、たとえばボツリヌス菌Ｃ1型神経毒に
対する抗体、の存在について再検査を行う。結果を、下記の表ＩＩに示す。
実施例５
ウマ牧草病に罹患したウマの腸内容物中にボツリヌス菌Ｃ1型神経毒が存在する
ことの例証
ウマ牧草病に罹患したウマの一連の剖検で、大便の検体を集めた。いずれの
事例でも、安楽死の前に、回腸の生検検体の特徴的な神経病変の存在によって診
断し、確認した。
約２０ｇの大便検体を、０．２％のゼラチンを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．
２）（ＰＢＳＧ）２０mlに移し、毒素を保存した。ＰＢＳＧサンプルをかき混ぜ
て検体を分散させ、４°Ｃで２４時間浸出してから、−３０°Ｃで長期保存した
。
ＰＢＳＧ浸出液の上清について、ボツリヌスＣ1型神経毒の存在と効力とを
、標準化ボツリヌスＣ1型抗毒素で反応プレートを予めコーティングしておく工
程を含むＥＬＩＳＡの改良型プロトコールで測定し、検定した。方法
ボツリヌスＣ1型神経毒を検出するにあたってのサンドウィッチＥＬＩＳＡ
の使用
１． ＥＬＩＳＡプレートを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を希釈液として
使用して、ボツリヌス菌Ｃ型神経毒に対して特異的なモルモット抗体（５−１０
μg/ml）でコーティング（１００μl、ウェル）した。抗体溶液を加え、プレー
トを５分間振盪してから、４°Ｃで一晩インキュベートした。
２． ０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）を使用して、プレ
ートを１回洗浄した。
３． ５％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＰＢＳ−Ｔをブランキング溶液とし
て加え（１００μl／ウェル）、プレートを、連続的に振盪しつつ、３７°Ｃで
１時間インキュベートした。結合しなかった物質は、上述の洗浄によって除去し
た。
４． ５％ＦＢＳ含有ＰＢＳ−Ｔを用いて調製した抗原溶液（１０μg/ml；１：
５で希釈）を加えた（１００μl／ウェル）。プレートを、連続的に振盪しつつ
、３７°Ｃで６０−９０分間インキュベートした。
５． ＰＢＳ−Ｔを用いて、プレートを３回洗浄した。
６． ５％ＦＢＳ含有ＰＢＳ−Ｔを用いて調製した第２抗体−酵素複合体（１０
０μl／ウェルのホースラディッシュペルオキシダーゼ標識モルモット抗体）を
加えた。プレートを、連続的に振盪しつつ、３７°Ｃで６０−９０分間インキュ
ベートした。
７． ＰＢＳ−Ｔを用いて、プレートを３回洗浄した。
８． 基質*液（ＴＭＢ）を加え、酵素を反応させた。
９． ５０μl／ウェルのＨ2ＳＯ4（２Ｍ）で反応を停止してから、４５０mmで
の吸光度を測定した。
＊ １０mgのＴＭＢを１mlのＤＭＳＯへ加え、暗色のガラス試験管で溶解し
た。１００μlのＴＭＢ溶液を、４４μlの１％Ｈ2Ｏ2を含む１０mlのリン酸／ク
エン酸緩衝液（ｐＨ５．０）に加えた。
結果を、下記の表１２に示す。
ウマ牧草病に罹患したウマの３／４から得た大便浸出液が致死濃度のボツリ
ヌスＣ1型神経毒を含有することが例証され、同時に、ノーヴィ菌の表現型との
接触が血清学的に立証されたことから、疾病過程が毒素感染性の性状を有するこ
とがさらに示された。こうしたことから、Ｃ1神経毒の接触源が、腸の組織ある
いは管腔内に位置していることも示唆された。実施例６
ウマ牧草病に罹患したウマの各種組織での、ボツリヌスＣ1型毒素産生生物の位
置の確認
ウマ牧草病の神経病変が、不変的に回腸に影響を及ぼしていることからする
と、回腸が、毒素感染性の接触が成立するうえで重要な部位である可能性が高い
。
ウマ牧草病と確認された５症例の剖検で、回腸および／または脾臓組織の約
２０gのサンプルを採取し、直ちに、５０mlの予め還元しておいた増菌培養液に
加えた。選択した培地（AIM/CMB/SSGと称する）は、クックドミートブロス（coo
ked meat broth）を改良したもので、選好性の嫌気性菌の一次単離条件を最適化
するためにグルコース（０．２％）と可溶性でんぷん（０．３％）とを加え、優
占種あるいは混入種が過度に成長することを防止するためにゲンタマイシン（１
０ml／l）を加えてある。試料のボトルを、３０°Ｃで５日間嫌気的にインキュ
ベートし、上清を回収し、前述の実施例で使用したＥＬＩＳＡ法によって、毒素
の存在について調べた。
結果を、下記の表に示す。
ボツリヌスＣ1型神経毒が、３／５のＡＩＭ／ＣＭＢ／ＳＳＧブロスの上清に存
在していたことによって、生存可能な血清型のボツリヌス菌Ｃ型あるいはＤ型が
上清中に存在していることが確認された。上記実施例５ならびに６に提示された
データを組み合わせると、ウマ牧草病であることが確認されている５例の症例の
大便液および／または組織培養の上清中に、致死濃度のボツリヌスＣ1型神経毒
が存在していることが、このイムノアッセイによってうまく例証されていること
がわかる。ウマ牧草病の臨床症例で、有力な毒素と、その毒素を産生した毒素原
嫌気性生物とが、こうした陽性の関連性を有していることは、本明細書で本発明
の方法として提示した示差的血清学試験の診断上の有効性を裏付けするものであ
る。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Diagnosis of toxin infectious clostridial disease The present invention relates to the diagnosis of equine toxin infectious clostridial disease, in particular, forage disease (also known as equine autonomic neuropathy). Equine Grass Sickness (EGS), also known as Mal Seco in Argentina, is an unpredictable disease that affects young horses of successive generations grazing on contaminated pastures for 10 years. It is characterized by being transmitted in a unit time span. Equine grass disease is one manifestation of toxin infectious clostridial disease. In clinical cases of equine grass disease, it may manifest as complications of equine gastrointestinal and / or neurological disorders. The inventors of the present invention have found that horses grazing in areas of endemic horse pasture disease have undergone certain seroconversions to the Clostridium novyi phenotype. The sporadic occurrence of disease in these populations clearly indicates that natural immune defenses have limitations, and that these immune defenses are not immune responses at the level of individual horses. Depends on the effective action of Clostridium toxin infections, particularly in older animals, can present a variety of non-specific gastrointestinal and / or neurological disorders that are not pathogenic, which may make the diagnosis of equine grass disease difficult. It is even more difficult. Until now, the diagnosis of equine grass disease could only be confirmed by performing a ileal biopsy (laparotomy) or an autopsy. In 1924, Tocher et al. Concluded, based on some evidence, that equine grass disease (EGS) was a form of botulism. This claim was immediately raised, owing to inadequate microbiological support and the predominance of autonomic dysfunction (ie, autonomic nervous system disorders). However, this theory does not explain the many clinical features of equine pasture that are apparently different from classic horse botulism and magsa poisoning. The botulinum toxin theory of equine pastoral disease suggests that a typical vaccine (produced by combining a Clostridium botulinum type A toxin with a corresponding antitoxin in vitro) in equine susceptible populations is apparent. Further disadvantages were the inability to control the disease. In the meantime, research interests have focused on the neuronal lesions found in equine pasture disease. Neuronal lesions are considered to be an essential feature of the disease, a fact that illustrates the effects of neurotoxins, and seemingly impossible to reconcile with the involvement of botulinum toxin. there were. Also, recent reviews by Polin and Griffiths may, or are likely to produce, the type and distribution of neuropathy that supports the diagnosis of equine pasture at autopsy (or biopsy). It is stated that no literature mentions infectious agents or toxins. The work that led to the present invention was based on two basic assumptions. First, equine grass disease is a process of toxin infection that relies on prior colonization of the intestine (or the lesion of a concomitant disease) by toxin-producing clostridial; The strain of Clostridium botulinum that produces E. coli is invariably producing two neuroactive toxins. By considering that two neuroactive toxins act in an emphasis, the autonomic dysfunction of equine pasture disease and the classical gastrointestinal and neurological manifestations can be explained and neglected. The most controversial points of the botulinum theory are well explained. Most of the Group III strains of Clostridium botulinum (types C and D) contain specific neurotoxins (C 1 And D 1 ), It is known to produce varying amounts of secondary toxins. Clostridium botulinum C Two Type 2 toxins were also considered to have particular importance for equine grass disease, even from their well-documented role as potential ADP-ribosyltransferases. That is, Clostridium botulinum C Two Type 2 toxins have the ability to activate a wide variety of cell membrane receptors that have been characterized in a variety of in vitro studies and experimental animal models. Serotypes that have the ability to produce a combination of neuroactive and enterotoxic components that are essential in explaining the dramatic clinical manifestations of equine grass disease are Clostridium botulinum types C and D Only. Some bacterial protein toxins interfere with cellular communication, ie, signaling, by acting as free ADP-ribosyltransferase. An additional ribose group is added to the ADP molecule, forming a polyribose complex that cannot be phosphorylated and become ATP. Each ADP-ribosyltransferase has a specific substrate, and activation of such a substrate inhibits the membrane functioning system and associated processes between cells. Botulinum C Two In the case of type toxins, the substrate is monomeric G-actin, a guanylate protein, which forms the cytoskeletal structure of all secreted as well as motor cells from embryonic neural crest. Botulinum C Two Precise targeting of ADP ribosylation induced by type A toxin is a neuronal lesion associated with equine pasture disease, with peripheral distribution from enterotoxin-infected foci produced by the process of retrograde axonal transmission It is considered to be a pattern. In vitro studies have shown that neurons Two Contact with the binary toxin resulted in uncontrolled neurochemical release, demonstrating that similar contact would inhibit the activity of motor cells. These events are accompanied by ultrastructural changes defined as chromatin lysis, suggesting extreme physiological stress. That is, C Two Prolonged contact or higher concentrations with the toxin will result in cell lysis. Such a process is a neuronal lesion associated with equine autonomic neuropathy. However, Clostridium botulinum C 1 And C Two There is no record suggesting that these two toxins have been implicated in human or animal disease processes before the type toxins could be implicated in the neurotoxicity of equine pasture disease. Type C bacteria present in carrion are the most contributing to the epizootic botulism, but are found in a variety of species, including horses (with ingestion of preformed toxins). In that case, C Two No clinical facts suggest the involvement of type toxins. C 1 Type neurotoxins inhibit the release of acetylcholine from its storage vesicles by causing specific zinc-dependent degradation of the neuronal endopeptide syntaxin. The inventors of the present invention have described a primitive organism and a highly specific G-protein mediated signaling system, namely phosphatidylinositol, which mediates all calcium-sensitive processes including secretion and chemotaxis. The relationship with the cascade is illustrated. Toxic infectious manifestations of botulism are often observed in lower animals, and what is important for equine grass disease is that type C bacteria are primarily associated with the evolutionary importance of these close host-parasite relationships. All chicken infections are involved in toxin transmission. However, only in 1976, it was discovered that disease in human infants was associated with the spontaneous production of botulinum toxin in vivo. That is, so-called infant botulism, which is mainly caused by ingestion of botulinum spores (types A and B) by susceptible infants aged 3 to 6 months, is widely recognized in the United States as a cause of illness and death. ing. Botulinum type B is associated with the classic toxin-borne botulism of horses (Shaker Foal Syndrome), which occurs frequently in the eastern United States including Kentucky and also in Australia. I have. However, these conditions are more similar to human traumatic botulism. This is because this bacterium can only grow if there is an existing anaerobic lesion. These lesions, although not clinically significant, provide a focal point for localization of the toxin source. As the name suggests, grass disease is almost invariably associated with grazing and the seasonal pattern of disease development is generally attributed to contact with transient toxic agents in the grass. It is considered. However, the inventors of the present invention speculated that the infection would be caused by the ingestion of clostridial spores contained in the soil during grazing. These spores are thought to grow in the intestine and initiate a specific immune response indicative of a carrier state. Horses in the region of endemic equine grass disease express antibodies to the phenotype of Clostridium botulinum (Group III), again demonstrating that the disease process has a toxic infectious nature. Significant patterns of serological (ie, antibody-related) responses indicate the degree of previous contact and are a measure of susceptibility to disease. However, serodiagnostic methods are more complicated than the fact that a wide variety of non-pathogenic Clostridium populations live in the intestine of any horse. Therefore, in the experimental method leading to the present invention, as shown in the Examples below, between the clinically normal Clostridium seroconversion in horses and the Clostridium seroconversion in horses of a specific disease category. Comparisons between groups and within groups were considered. The present invention provides a method for diagnosing equine toxin-infectious clostridial disease, comprising the step of detecting the presence of an antibody against a Clostridium botulinum antigen or a phenotype thereof, or an antibody against a clostridial toxin in a biological sample. . The method of the present invention is useful for diagnosing the development of equine toxin infectious clostridial disease, for example, anterior enteritis or X colitis associated with the toxin strain of C. perfringens. The present invention more preferably further comprises a step of detecting the presence of an antibody against an antigen of botulinum group III or its phenotype and also detecting the presence of an antibody against a botulinum type C toxin in diagnosing equine grass disease. The invention relates to a diagnostic method comprising: As used herein, a phenotype refers to a Clostridial antigen that produces an immune response similar to that of various types of Clostridium botulinum. In the case of Clostridium botulinum group III (types C and D), the phenotype is preferably derived from Novi type A. The method of the present invention is preferably an ELISA method. The present invention further provides a kit for diagnosing equine toxin infectious clostridial disease, the kit comprising a means for detecting an antibody against a Clostridium botulinum antigen or a phenotype thereof, and / or a means for detecting an antibody against a clostridial toxin. I do. The kit may also be suitable for use in the field. The present invention is preferably a kit for diagnosing equine pastoral disease, which comprises a means for detecting the presence of an antigen against botulinum group III antigen or its phenotype, and a means for detecting an antibody against botulinum type C toxin. The kit contains By using the test method of the present invention, it is possible to specify an antibody that expresses an antibody against the cell wall antigen of the indicator organism, Novi, even if it is an apparently normal horse. In individual clinical cases suspected of equine hay disease, detection of antibodies to horse hay disease-specific neurotoxins (antitoxins) can identify horse hay disease. Until now, ileal biopsies had to be performed at stressed and costly laparotomy in horse hospitalization facilities to confirm equine pasture disease in vivo. In horses infected with equine forage, the serological (ie, antibody) response to cell surface antigens of Novi bacteria is increased, and in parallel, botulinum C 1 The decreased response to the toxin is also a good indication of the toxin infectious nature of the disease. The intestine has been identified as a site of toxin production, at least in the case of classical expression of equine forage. Examination of the results of the tests of the present invention showed that many "carrier" horses were in contact with the equine pasture toxin infectious agent, and the fact that such contact at the individual horse level was It was confirmed that it can be measured by measuring the titer of the antibody response to Novi, which is an indicator phenotype of Clostridium botulinum C / D. The fact that the carrier horses have very few classic or atypical equine pasture diseases also supports the general efficacy of immunosuppressive mechanisms and / or detoxification processes. In cases where clinical illness is suspected, (currently botulinum C 1 The fact of a serological response to the primary toxin of equine grass disease (specified as a type of neurotoxin) (ie, antitoxin titer) suggests an impaired immune or protective response. Although such tests can be used individually to identify infected animals, they are preferably used in combination to provide a reliable method for diagnosing equine grass disease. C. sporogenes deposited at the National Collection of Type Cultures at Colindale as NCTC 8594, Welch deposited at NCTC 8237, and Novy cells deposited at NCTC 538 The surface preparations were each made of botulinum group I (type A, proteolytic type B, type F), group II (non-proteolytic type B, type E), and group III (type C, D-type) phenotype. The present inventors have found that toxin infectious clostridial disease is mainly caused by Clostridium botulinum group III, as well as antigens from Novi bacteria that exhibit the phenotype of Clostridium botulinum group III. Biological samples, preferably serum samples, are tested by performing a standard ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) in a manner consistent with the method of the present invention. In the present invention, it is appropriate to use a non-competitive ELISA method. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) The diagnostic value of the ELISA method depends on the purity of the antigen, especially when examining anaerobic infections where the structure of the antigen is variable and variable. Thus, in the present application, versatility in screening test methods can be obtained by strategically using appropriate Clostridial phenotypes, i.e., Novi, Sporogenes, and Welch-derived cell antigens. The use of these in combination suggests a response to a wide range of toxinogenic clostridials, including all known strains of Clostridium botulinum. The use of the purified toxin antigen then ensures a specific "diagnostic" analysis of the resulting serologic response, classifying the individual antitoxin components of the host's response to toxin infectious secretions. An ELISA protocol suitable for use in the diagnostic method of the present invention is as follows. 1. Make a dilution of the antigen using coating buffer (0.05 M sodium carbonate buffer, pH 9.6 containing 0.02% sodium azide), and dilute 100 μl containing 10-100 μg antigen Add the solution to the wells of the microtiter plate. Cap the plate and incubate at 37 ° C for 4 hours, then at 4 ° C overnight. 2. Wash the plate three or four times with 0.9% NaCl containing 0.05% Tween20. 3. A dilution of the antibody was made using the antibody complex buffer (0.05 M phosphate buffer containing 0.85% NaCl, 0.05% Tween 20, 0.02% sodium azide). , PH 7.4), which is added to the wells. Incubate the wells for 4 hours at room temperature. 4. The washing step 2 is repeated. 5. Add 100 μl of appropriately diluted anti-type 1 antibody-enzyme conjugate (doubling dilution from 1: 500) to the wells and incubate overnight at room temperature (enzyme conjugate uses horseradish peroxidase did). 6. The washing step 2 is repeated. 7. Add diluted enzyme substrate and incubate wells for 1 hour at room temperature. Read the result on a spectrophotometer. The sample containing a Group III antigen or analog may be a sample of biological fluid or a sample of tissue, but is preferably serum. The diagnostic method of the present invention provides a quick, non-invasive, and reliable method for confirming the diagnosis of equine autonomic nervous disorder, also known as grass disease. Using this method, a differential diagnosis can be made for the involvement of Clostridia in non-specific gastrointestinal and / or neurological disorders of horses. As a further feature, the methods of the present invention can also be used as a means of monitoring the response of individual horses to treatment in clinical cases of toxic infectious clostridial disease, including grass disease. By practicing the methods of the present invention and interpreting the results obtained, the response of the host to individual clostridial toxins associated with the toxicology of equine toxin infectious clostridial disease can also be identified and quantified. The diagnostic method of the present invention is used as a basis for a method for evaluating the virulence factor or toxin of bacteria in parallel and determining the pathogenicity of a toxinogenic Clostridium field strain in consideration of the evaluation results. You can also. Identifying and quantifying the host response to an individual clostridial toxin, in parallel with assessing the virulence factors or toxins of the bacteria that are causing the virulence of the particular toxinogenic clostridial, is a matter of equine toxin infection. Indispensable for epidemiological research in Japan. The present invention is further illustrated by the following examples. In the examples, four categories of horses exhibiting clinical signs were identified. Each group is as follows. Group I-Acute Grass Sickness (AGS) Group II-Chronic Grass Sickness (CGS) Group III-Gastrointestinal disorders including abdominal crisis (Gasteroenteric, GE) Group IV-Diagnosis Miscellaneous clinical cases, including specimens from a wide range of cases with aborted or key symptoms of diagnosis. Example 1-Determination of Indicator Antigen 34 samples of clinical cases were examined by (IgG) ELISA at two serum dilutions, 1/25 and 1/50. Each sample was examined twice, and the OD value of the ELISA was the average of the two results. Table 1 shows the average OD values (with range and variance) for the three index antigens of the four groups of clinical cases. As can be seen from the representative data shown in Table 1, the entire range of OD values in the ELISA was generally similar for all three antigens. However, significant variation between the groups was clearly shown only for the Novi antigen. The clinical data summarized in Table 1 show that all horses in Group I (AGS) and most horses in Group IV (mixed clinical cases) have low levels of antibodies to Novi, and The assumption of susceptibility to grass disease was supported. On the other hand, horses of Group II (CGS) are expected to have various seroconversions depending on the stage of "incubation" at the time of sample collection and have non-specific gastrointestinal disorders (Group III ) Uncertain or positive results for individual horses may indicate the involvement of toxin infectious clostridial elements in the course of the disease. Therefore, group I (AGS) and group IV (miscellaneous clinical cases, non-gastrointestinal disorders) can be combined into a unified category of “sero-negative / uncertain”, and likewise Group II (CGS) and Group III (clinical cases, gastrointestinal disorders) were statistically indistinguishable and can be summarized in the category “Uncertain / positive”. Example 2 Comparison of these two integrated groups I + IV and II + III provides a basis for analyzing variance in a meaningful way. The individuality of the serological response to the three indicator antigens was also supported by no significant correlation between the data sets. Example 3 ELISA of clinical case group (a) Group I-Acute grass disease (AGS) Of the nine samples collected from cases confirmed to be an acute grass disease, except for one sample, a serum reaction against Novy antigen was observed. Negative (ie, OD <0.4). One example of an uncertain test result (OD 0.635) was recorded for a 12-year-old horse in Group I, where the sample was the mean of the group against two non-specific antigens. The above indicated seroconversion (Table 3). (B) Group II-Chronic Pasture Disease (CGS) By definition, horses susceptible to chronic pasture disease should have a negative serum response (ie, OD <0.4) at the onset of the disease. is there. As clinical symptoms progress, seroconversion should progress at different rates, depending on the individual animal's response to the toxin infection. Most of the samples included in Group II (samples with confirmed chronic grass disease) were collected at a relatively early stage of the disease process. Mean duration at the time of sampling 19 days Range 11-35 days n = 23 (c) Group III-clinical cases of gastrointestinal disorders Table 4 shows the diagnostic or clinical signs recorded for the 12 horses in this category. It is a summary. Nine horses are positive (OD> 0.8) or uncertain (OD, 0.4-0.8) in the ELISA N50 diagnostic test, and thus represent the majority of chronic grass disease cases (Group II). And serologically indistinguishable. The remaining three horses in the table were seronegative (OD <0.4) and were therefore indistinguishable from cases confirmed as acute grass disease (Group I). It is noteworthy that Cases 10 and 11 had an acute abdominal crisis and the lowest OD value (0.064) was recorded for "no diagnosis" of foal diarrhea. Horses 1, 2, 3 and 5 are all from the region of endemic grass disease and have signs consistent with the diagnosis of chronic grass disease in the field: sporadic anorexia, weak pain and weight loss. Was shown. However, these horses could not be distinguished serologically from clinically normal horses of the same population (Group V, mean OD, 0.781). Horse 6 (X colitis) showed serological results indicating an involvement of Welch bacteria (OD, 1.007) and may be associated with nonspecific seroconversion to the other two antigens. (Table 5). On the other hand, horse 4 (pharyngeal palsy) and horses 7, 8 (no diagnosis) showed no evidence of non-specific seroconversion. The case of pyloric stenosis (Horse 9) was affected 14 days prior to sampling and the N50 response was specific, although on the border (OD, 0.426). Horses showing undiagnosed signs of gastrointestinal disorders are indistinguishable from cases in the early stages of chronic grass disease (ie, <28 days duration). However, without a confirmed diagnosis, it is not possible to assume that the uncertain Novy response is non-specific. The data for horse 6 (X colitis) demonstrated that this test method could suggest a primary involvement of clostridial in disease processes that are not horse pasture. On the other hand, the usefulness of serodiagnosis is limited by the inability to distinguish possible cases of equine grass disease (horses 1, 2 and 3) from the normal "immune" animals of the population in the endemic area. ing. (D) Group IV—Clinical Cases of Non-Gastrointestinal Disorders A total of 25 specimens were drawn from horses that were diagnosed with or exhibited various “non-abdominal” disorders. In this category, 15/25, or 60%, of the samples had a serum dilution of 1:50 with a serum dilution of 1:50 for the Novi bacteria antigen. The table below shows data for three positive (OD> 0.8) horses and seven uncertain (OD 0.4-0.8) horses. Four horses in the Group IV category were examined for response to "non-specific" antigens. The results are shown in Table 7. In two cases of laminitis, both horse 6 and horse 9 demonstrate non-specific seroconversion, which is consistent with a concurrent response to enteric toxemia. Example 3 -Diagnosis performed on normal horses Table 8 shows the origin and the number of horses tested for the indicator organism of Clostridium botulinum type C, ie Novi. All routine tests were performed at a serum dilution of 1:50. As can be seen from the data summary, there was a clear intergroup difference in the selected population. The normal horses examined in this example are grouped as follows. Group V Horses in this category are horses that have lived "for life" in the equine endemic grassland area of northwest Scotland, within two miles of the origina l Barry camp outbreak (1909). It contained 20 horses that had been grazed in the country. Thirty-three out of thirty-five animals in Group V had seroconverted, regardless of age. Group VI The majority of Group IV horses were imported from Ireland to Scotland, and were likely to have negative serum reactions upon arrival. At the time of sampling, these horses were "living" for one week to six months, and their statistical seroconversion patterns were indistinguishable from Group V horses. As these limited data suggest, endemic areas and lands with "regular traffic" are prone to small endemic areas as a result of repeated "contamination" resulting in sensitive new imports. Horses that have been infected may be at risk, especially if they are simultaneously subjected to nutritional or climatic stress during the incubation period. Groups VII and VIII Highly nutritional "full occupation" or training events or race horses (Group VII) were included as a control category for a heterogeneous "non-endemic" population (Group VIII). Table 10 shows the pattern of seroconversion to Novy antigens for the four non-clinical case categories. Example 4 Therefore, as a main feature of the diagnostic method of the present invention, a clinical case specimen showing an uncertain or positive serum response to the indicator cell wall antigen is an "antitoxin", that is, a specific Clostridial toxin, for example, Clostridium botulinum. C 1 Retest for the presence of antibodies to type 1 neurotoxin. The results are shown in Table II below. Example 5 Clostridium botulinum C in the intestinal contents of horses infected with horse pasture 1 Demonstration of the Presence of Type Neurotoxin Stool specimens were collected from a series of necropsies of horses affected by horse forage. In all cases, diagnosis and confirmation were made prior to euthanasia by the presence of characteristic neurological lesions in ileal biopsy specimens. About 20 g of the stool sample was transferred to 20 ml of a phosphate buffer (pH 7.2) containing 0.2% gelatin (PBSG) to preserve the toxin. The PBSG sample was stirred to disperse the specimen, leached at 4 ° C for 24 hours, and then stored at -30 ° C for a long time. For the supernatant of PBSG leachate, Botulinum C 1 Botulinum C 1 The assay was performed using a modified ELISA protocol that included a step of pre-coating the reaction plate with the antitoxin. Method Botulinum C 1 Of sandwich ELISA to detect type 1 neurotoxin ELISA plates are coated (100 μl, wells) with guinea pig antibodies (5-10 μg / ml) specific for Clostridium botulinum type C neurotoxin using phosphate buffered saline (PBS) as diluent. did. The antibody solution was added, the plate was shaken for 5 minutes and then incubated at 4 ° C overnight. 2. Plates were washed once with PBS containing 0.1% Tween 20 (PBS-T). 3. PBS-T containing 5% fetal bovine serum (FBS) was added as a blanking solution (100 μl / well) and the plate was incubated for 1 hour at 37 ° C. with continuous shaking. Unbound material was removed by washing as described above. 4. An antigen solution (10 μg / ml; diluted 1: 5) prepared using PBS-T containing 5% FBS was added (100 μl / well). Plates were incubated for 60-90 minutes at 37 ° C. with continuous shaking. 5. The plate was washed three times with PBS-T. 6. A second antibody-enzyme conjugate (100 μl / well horseradish peroxidase labeled guinea pig antibody) prepared using PBS-T containing 5% FBS was added. Plates were incubated for 60-90 minutes at 37 ° C. with continuous shaking. 7. The plate was washed three times with PBS-T. 8. Substrate * The solution (TMB) was added, and the enzyme was reacted. 9. 50 μl / well H Two SO Four After stopping the reaction at (2M), the absorbance at 450 mm was measured. * 10 mg of TMB was added to 1 ml of DMSO and dissolved in a dark glass test tube. 100 μl of TMB solution is mixed with 44 μl of 1% H Two O Two Was added to 10 ml of a phosphate / citrate buffer (pH 5.0). The results are shown in Table 12 below. Lethal stool exudate from 3/4 of horses affected by equine grass disease has lethal concentration of botulinum C 1 Demonstration of the presence of type 1 neurotoxin and, at the same time, serological evidence of contact with the Novy phenotype further demonstrated that the disease process was toxic in nature. From these things, C 1 It was also suggested that the source of neurotoxin was located in intestinal tissue or lumen. Example 6 Botulinum C in various tissues of horses infected with horse pasture 1 Confirmation of the location of type-toxin-producing organisms Given that the equine pasture disease neuropathy invariably affects the ileum, the ileum may be an important site for establishing toxin-infectious contacts Is high. At necropsy of five cases confirmed to be equine forage, a sample of approximately 20 g of ileum and / or spleen tissue was taken and immediately added to 50 ml of pre-reduced enrichment culture. The selected medium (referred to as AIM / CMB / SSG) is an improved cooked meat broth and contains glucose (0%) to optimize the primary isolation conditions for preferential anaerobic bacteria. 0.2%) and soluble starch (0.3%), and gentamicin (10 ml / l) was added to prevent the dominant or contaminating species from growing excessively. Sample bottles were incubated anaerobically at 30 ° C. for 5 days, supernatants were collected and examined for the presence of toxin by the ELISA method used in the previous example. The results are shown in the table below. Botulinum C 1 The presence of type I neurotoxin in the supernatant of 3/5 AIM / CMB / SSG broth indicates that viable serotype botulinum type C or D is present in the supernatant. confirmed. Combining the data presented in Examples 5 and 6 above, lethal concentrations of botulinum C in stool fluid and / or tissue culture supernatant of five cases confirmed to be equine pasture disease. 1 It can be seen that the presence of type neurotoxin is well exemplified by this immunoassay. The fact that a potent toxin and a toxin-producing anaerobic organism that produced the toxin in a clinical case of equine pasture disease have such a positive association has been presented herein as a method of the present invention. It supports the diagnostic effectiveness of differential serology tests.
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