JPH11318488A - Immobilization of nucleic acid and immobilized nucleic acid - Google Patents
Immobilization of nucleic acid and immobilized nucleic acidInfo
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- JPH11318488A JPH11318488A JP13926298A JP13926298A JPH11318488A JP H11318488 A JPH11318488 A JP H11318488A JP 13926298 A JP13926298 A JP 13926298A JP 13926298 A JP13926298 A JP 13926298A JP H11318488 A JPH11318488 A JP H11318488A
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Abstract
Description
【0001】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は核酸固定化法及び固
定化核酸に関する。本発明は、核酸のハイブリダイゼー
ションを利用した各種の検出法や精製法等に利用するこ
とができる。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for immobilizing a nucleic acid and an immobilized nucleic acid. INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention can be used for various detection methods and purification methods utilizing nucleic acid hybridization.
【0002】[0002]
【従来の技術】例えば固相担体に固定化されたプローブ
DNAを利用して標的DNAを捕捉・検出する方法のよ
うな、核酸のハイブリダイゼーションを利用する方法に
おいては、一般的に溶液中の標的核酸は低濃度であり、
しかも一本鎖となった標的核酸は固定化核酸とハイブリ
ダイズする前に自身の相補鎖核酸とアニーリングし易い
と言う問題がある。2. Description of the Related Art In a method using nucleic acid hybridization, for example, a method in which a target DNA is captured and detected using a probe DNA immobilized on a solid support, generally, a target in a solution is generally used. Nucleic acids are at low concentrations,
In addition, there is a problem that the single-stranded target nucleic acid easily anneals to its complementary nucleic acid before hybridizing with the immobilized nucleic acid.
【0003】このため、固定化核酸を増幅することによ
って標的核酸との反応率を高め、標的核酸検出の高感度
化や、標的核酸精製の高効率化を図ろうとする試みが種
々なされている。[0003] For this reason, various attempts have been made to increase the reaction rate with the target nucleic acid by amplifying the immobilized nucleic acid, thereby increasing the sensitivity of target nucleic acid detection and the efficiency of target nucleic acid purification.
【0004】例えば、特開平5−260972号公報に
係る「核酸増幅固相化アンカー及びその調製方法」の発
明では、固相担体に結合させた増幅基の分岐した末端に
設けた複数の結合基にそれぞれ核酸プローブを結合させ
ることにより、いわばクリスマスツリー状に核酸が増幅
された固相化アンカーを開示している。[0004] For example, in the invention of "anchors for immobilizing nucleic acid on a solid phase and a method for preparing the same" disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei 5-260972, a plurality of bonding groups provided at branched ends of an amplification group bonded to a solid support are disclosed. Discloses a solid-phased anchor in which nucleic acids are amplified in a so-called Christmas tree shape by binding nucleic acid probes to the respective anchors.
【0005】又、特表平5−508862号公報に係る
「大きな櫛型分岐状ポリヌクレオチド」の発明では、ポ
リヌクレオチドプローブが櫛状に複数結合され、プロー
ブがいわば櫛状に増幅されたポリヌクレオチドを開示し
ている。In the invention of "Large comb-shaped branched polynucleotide" according to Japanese Patent Publication No. 5-508862, a polynucleotide in which a plurality of polynucleotide probes are bonded in a comb-like manner and the probe is amplified in a so-called comb-like manner. Is disclosed.
【0006】[0006]
【発明が解決しようとする課題】しかし、これらの発明
による固定化核酸プローブの増幅では、結局の処、増幅
された核酸プローブの展開範囲が増幅基やポリヌクレオ
チド骨格の鎖長に規定されるのであって、本質的に有限
である。より実際的に言えば、核酸プローブの展開範囲
がハイブリダイズ反応液中の固相担体表面部近傍に止ま
る。However, in the amplification of the immobilized nucleic acid probe according to these inventions, after all, the development range of the amplified nucleic acid probe is defined by the chain length of the amplification group or the polynucleotide skeleton. Yes, it is essentially finite. More practically, the development range of the nucleic acid probe is stopped near the surface of the solid phase carrier in the hybridization reaction solution.
【0007】このため、特に高感度を要求される場合、
例えば医療分野での細菌検査等において一刻も早い診断
と治療が求められるような場合に対しては、その高感度
化が十分であるとは言えなかった。For this reason, especially when high sensitivity is required,
For example, in a case where diagnosis and treatment are required as soon as possible in a bacterial test or the like in the medical field, it cannot be said that the enhancement of the sensitivity is sufficient.
【0008】そこで本発明は、ハイブリダイゼーション
に供する固定化核酸を反応液中で本質的に無限に展開し
て増幅させることにより、標的核酸検出感度や標的核酸
精製効率を更に向上させることを、解決すべき課題とす
る。Accordingly, the present invention solves the problem of further improving the sensitivity for detecting a target nucleic acid and the efficiency of purifying a target nucleic acid by expanding and amplifying an immobilized nucleic acid to be subjected to hybridization essentially infinitely in a reaction solution. Tasks to be done.
【0009】[0009]
【課題を解決するための手段】(第1発明の構成)上記
課題を解決するための本願第1発明(請求項1に記載の
発明)の構成は、官能基Aを両端に備えた核酸と、前記
官能基Aと結合する官能基Bを3個以上備えた架橋化合
物とを、官能基Bを表面に固定した固相担体に対して作
用させることにより、前記核酸を固定化する、核酸固定
化法である。Means for Solving the Problems (Structure of the First Invention) The structure of the first invention of the present application (the invention of claim 1) for solving the above-mentioned problems is that a nucleic acid having a functional group A at both ends is provided. Immobilizing the nucleic acid by allowing a cross-linking compound having three or more functional groups B that binds to the functional group A to act on a solid support having the functional group B immobilized on the surface thereof; It is a chemical method.
【0010】(第2発明の構成)上記課題を解決するた
めの本願第2発明(請求項2に記載の発明)の構成は、
鎖状部を構成する核酸と分岐部を構成する架橋化合物と
の結合によって、本質的に無限に展開された3次元のネ
ットワークが形成されると共に、該ネットワークを構成
する前記核酸の一部の一端が固相担体と結合することに
よって、該固相担体に前記ネットワークが固定化されて
いる、固定化核酸である。(Structure of the Second Invention) The structure of the second invention (the invention described in claim 2) for solving the above-mentioned problem is as follows.
The bond between the nucleic acid constituting the chain portion and the cross-linking compound constituting the branch portion forms an essentially infinite three-dimensional network, and one end of a part of the nucleic acid constituting the network. Is an immobilized nucleic acid in which the network is immobilized on the solid-phase carrier by binding to the solid-phase carrier.
【0011】[0011]
【発明の作用・効果】(第1発明の作用・効果)第1発
明において、次の1)〜4)のプロセスが行われる。Operation and Effect of the Invention (Operation and Effect of First Invention) In the first invention, the following processes 1) to 4) are performed.
【0012】1)固相担体の表面に固定した官能基Bに
対して、まず最初の核酸の一端の官能基Aが結合し、続
いて該核酸の他端の官能基Aに対して架橋化合物の3個
以上の官能基Bの内の一つが結合する。なお、1分子の
核酸の両端の官能基Aが2個の上記官能基Bに結合して
架橋化合物と反応しなくなる可能性もあるが、実際問題
としては、その確率は小さい。1) First, a functional group A at one end of a nucleic acid binds to a functional group B immobilized on the surface of a solid support, and then a cross-linking compound is attached to the functional group A at the other end of the nucleic acid. Is bonded to one of the three or more functional groups B. In addition, there is a possibility that the functional groups A at both ends of one molecule of nucleic acid are bonded to the two functional groups B and do not react with the cross-linking compound, but as a practical matter, the probability is small.
【0013】2)次いで、上記架橋化合物の残り2個以
上の官能基Bに対して他の2分子以上の核酸の一端の官
能基Aが結合し、これらの核酸の他端の官能基Aに対し
てそれぞれ架橋化合物の3個以上の官能基Bの内の一つ
が結合する。なお、架橋化合物の残り2個以上の官能基
Bに対して、他の1分子の核酸の両端の官能基Aが結合
して次の架橋化合物と反応しなくなる可能性もあるが、
その確率は小さい。2) Next, the functional group A at one end of the other two or more nucleic acids binds to the remaining two or more functional groups B of the cross-linking compound, and the functional group A at the other end of these nucleic acids binds to the functional group A at the other end. On the other hand, one of the three or more functional groups B of the crosslinking compound is bonded. In addition, there is a possibility that the functional groups A at both ends of the other one molecule of nucleic acid bind to the remaining two or more functional groups B of the cross-linking compound and do not react with the next cross-linking compound,
The probability is small.
【0014】3)このような反応により核酸と架橋化合
物とが本質的に無限に連鎖結合して伸長する過程におい
て、架橋化合物が3個以上の官能基Bを有することか
ら、例えば固相担体の表面の異なる官能基Bから連鎖し
てきた核酸同士が同一の架橋化合物を介して連結したり
して、3次元の網状にネットワークが形成される。3) In the process in which the nucleic acid and the cross-linking compound are extended in a substantially infinite chain bond by such a reaction, the cross-linking compound has three or more functional groups B. Nucleic acids linked from functional groups B having different surfaces are linked via the same cross-linking compound, and a network is formed in a three-dimensional network.
【0015】4)こうして、固相担体に固定化され、か
つ本質的に無限に展開された3次元のネットワーク形成
が、反応液中に遊離する核酸と架橋化合物が消費され尽
くすまで行われる。核酸と架橋化合物との投与量を調整
することで、ハイブリダイズ反応液全体にわたってネッ
トワークを網羅することも容易である。4) Thus, the formation of a three-dimensional network, which is immobilized on the solid support and is essentially infinitely developed, is performed until the nucleic acid and the crosslinking compound released in the reaction solution are consumed. By adjusting the dose of the nucleic acid and the cross-linking compound, it is easy to cover the network throughout the hybridization reaction solution.
【0016】(第2発明の作用・効果)第2発明の固定
化核酸は、標的核酸とのハイブリダイゼーションに供さ
れる核酸部分を本質的に無限量含むことができ、あるい
はかかる核酸部分を組み込んだネットワークをハイブリ
ダイズ反応液全体に網羅することができるので、標的核
酸との反応率を極限にまで高めることが可能となる。(Function / Effect of the Second Invention) The immobilized nucleic acid of the second invention can contain an essentially infinite amount of a nucleic acid portion to be subjected to hybridization with a target nucleic acid, or incorporates such a nucleic acid portion. Since the entire network can be covered in the entire hybridization reaction solution, the reaction rate with the target nucleic acid can be maximized.
【0017】又、核酸が3次元のネットワーク状に固定
化されているので、前記クリスマスツリー型や櫛型構造
に比較して、核酸を高濃度に固定しても核酸相互間のス
ペースは確保され易く、標的核酸が容易にネットワーク
中に侵入して固定化核酸とハイブリダイズすることがで
きる。Further, since the nucleic acids are fixed in a three-dimensional network, a space between the nucleic acids can be secured even if the nucleic acids are fixed at a high concentration as compared with the Christmas tree type or comb type structure. Thus, the target nucleic acid can easily enter the network and hybridize with the immobilized nucleic acid.
【0018】その結果、前記従来技術に比較して、標的
核酸検出感度や標的核酸精製効率を更に向上させること
ができる。As a result, the sensitivity of target nucleic acid detection and the efficiency of target nucleic acid purification can be further improved as compared with the above-mentioned conventional techniques.
【0019】[0019]
【発明の実施の形態】次に、第1発明及び第2発明の実
施の形態について説明する。以下において単に「本発
明」と言う時は、第1発明及び第2発明を一括して指し
ている。Next, embodiments of the first invention and the second invention will be described. In the following, the term “the present invention” simply refers to the first invention and the second invention collectively.
【0020】〔本発明の用途〕本発明は、固相担体に固
定化した核酸のハイブリダイゼーション反応を利用し
て、サンプル液中の標的核酸を検出、精製その他の目的
のために捕捉する場合に、限定なく利用することができ
る。標的核酸を検出する場合における検出用標識として
は、公知の任意の標識方法を用いれば良い。[Use of the Present Invention] The present invention relates to a method for detecting a target nucleic acid in a sample solution, capturing the target nucleic acid in a sample solution for other purposes by utilizing a hybridization reaction of a nucleic acid immobilized on a solid support. , Can be used without limitation. As a detection label for detecting a target nucleic acid, any known labeling method may be used.
【0021】本発明の代表的な用途として、細菌検査や
遺伝子診断等のために、調製したサンプル液中における
特定塩基配列の核酸断片の存否をプローブDNAのハイ
ブリダイゼーション反応を利用して検出する技術や、D
NA結合蛋白質の分離・精製技術等を挙げることができ
る。A typical application of the present invention is a technique for detecting the presence or absence of a nucleic acid fragment having a specific base sequence in a prepared sample solution by using a hybridization reaction of a probe DNA for a bacterial test, genetic diagnosis, or the like. And D
Examples include separation / purification techniques for NA-binding proteins.
【0022】〔核酸〕本発明に用いる核酸は、少なくと
も標的核酸とのハイブリダイゼーションに供される相補
的塩基配列部分と、両端の官能基Aとを備えている必要
がある。但し、その他に任意の構成部分、例えば官能基
Aを導入するための化合物部分等を含んでいても良い。[Nucleic acid] The nucleic acid used in the present invention must have at least a complementary base sequence portion to be subjected to hybridization with a target nucleic acid and functional groups A at both ends. However, it may contain an arbitrary constituent part, for example, a compound part for introducing the functional group A, and the like.
【0023】核酸としてはDNAが代表的であるが、R
NAを用いることもできる。As a typical nucleic acid, DNA is used.
NA can also be used.
【0024】核酸の両端に備えさせる官能基Aは、架橋
化合物に備えさせる官能基Bと互いに共有結合やイオン
結合あるいは水素結合等を形成する性質を有する官能基
であれば良い。とりわけ、ハイブリダイゼーション反応
後の固相担体の洗浄操作に耐える結合強度と言う点か
ら、互いに共有結合を形成するものであることが好まし
い。官能基A,Bが特定の反応条件下で結合するもので
ある場合には、第1発明においてその反応条件を調整す
る必要がある。The functional group A provided at both ends of the nucleic acid may be a functional group having a property of forming a covalent bond, an ionic bond or a hydrogen bond with the functional group B provided in the cross-linking compound. In particular, it is preferable that they form a covalent bond with each other in terms of bond strength that can withstand the washing operation of the solid support after the hybridization reaction. When the functional groups A and B bind under specific reaction conditions, it is necessary to adjust the reaction conditions in the first invention.
【0025】官能基Aの代表的な例として、官能基Bが
アミノ基である場合に、これとカルボジイミド反応によ
って結合するカルボキシル基が、又、官能基Bがカルボ
キシル基である場合に、これとカルボジイミド反応によ
って結合するアミノ基が、それぞれ挙げられる。As a typical example of the functional group A, when the functional group B is an amino group, a carboxyl group bonded to the amino group by a carbodiimide reaction, and when the functional group B is a carboxyl group, Each of the amino groups bonded by the carbodiimide reaction is exemplified.
【0026】核酸に対するカルボキシル基の導入は、そ
の3’末端側に対しては、例えばモノヌクレオチドに予
めカルボキシアルキルアミン塩酸塩等を反応させてカル
ボキシル基を連結し、このモノヌクレオチドを核酸の
3’末端に結合させる、と言う方法で行うことができ
る。核酸の5’末端側に対しては、一旦アミノ基を導入
したのち、このアミノ基に対してジカルボン酸化合物の
一方のカルボキシル基を結合させる、と言う方法で行う
ことができる。For the introduction of a carboxyl group into a nucleic acid, a carboxyl group is linked to the 3 'end of the nucleic acid by, for example, reacting a mononucleotide with a carboxyalkylamine hydrochloride or the like in advance, and connecting the mononucleotide to the 3' end of the nucleic acid. It can be carried out by a method of binding to the terminal. The method can be carried out by introducing an amino group into the 5 'end of the nucleic acid and then bonding one carboxyl group of the dicarboxylic acid compound to the amino group.
【0027】その他に、官能基Bと共有結合を形成する
官能基Aとして、N−スクシニイミジル−3−(2−ピ
リジルジチオ)プロピオネートを用いて官能基B(チオ
ール基)に結合するアミノ基や、カルボジイミド反応に
よって官能基B(水酸基)に結合するカルボキシル基等
を利用することもできる。In addition, as a functional group A forming a covalent bond with the functional group B, an amino group bonded to the functional group B (thiol group) using N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithio) propionate; A carboxyl group or the like bonded to the functional group B (hydroxyl group) by a carbodiimide reaction can also be used.
【0028】〔架橋化合物〕本発明の架橋化合物は、前
記官能基Aと結合する官能基Bを3個以上備えている限
りにおいて、化学構造上、特段の限定はない。官能基B
は、官能基Aとの対応において任意に限定なく選択され
る。官能基Bが例えばアミノ基である場合における架橋
化合物の代表例として、1,4,7,10−テトラアザ
シクロドデカン−テトラハイドロクロライド等を挙げる
ことができる。[Cross-Linking Compound] The cross-linking compound of the present invention is not particularly limited in chemical structure as long as it has three or more functional groups B bonded to the functional group A. Functional group B
Is selected without any limitation in correspondence with the functional group A. When the functional group B is, for example, an amino group, typical examples of the crosslinking compound include 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-tetrahydrochloride and the like.
【0029】〔固相担体〕固相担体は、例えばプラスチ
ックプレートその他の容器の壁部や、ビーズ状の固体粒
子等、本発明の用途次第で任意に決定される。固相担体
の表面には前記官能基Bが固定されている必要がある。
その固定手段には限定がなく、例えば官能基Bを固相担
体の表面に化学結合させることもできるし、より簡易な
手段として、プラスチック製の固相担体に対して官能基
Bを備えた疎水性の有機化合物を疎水結合力によって吸
着・固定化することもできる。[Solid Phase Carrier] The solid phase carrier is arbitrarily determined depending on the use of the present invention, for example, the wall of a plastic plate or other container, or solid beads. The functional group B needs to be fixed on the surface of the solid support.
There is no limitation on the fixing means. For example, the functional group B can be chemically bonded to the surface of the solid phase carrier. Organic compounds can be adsorbed and immobilized by hydrophobic binding force.
【0030】第1発明の反応、即ち、官能基Bを表面に
固定した固相担体に対して、官能基Aを両端に備えた核
酸と、官能基Aと結合する官能基Bを3個以上備えた架
橋化合物とを作用させる反応は、液相下で行うことが、
作用効率が高いためにより好ましいが、これに限定され
ない。The reaction of the first invention, that is, a solid support having a functional group B immobilized on its surface, a nucleic acid having a functional group A on both ends, and three or more functional groups B binding to the functional group A The reaction for reacting with the provided cross-linking compound can be performed in a liquid phase,
Although it is more preferable because of high action efficiency, it is not limited to this.
【0031】〔ネットワーク〕第2発明のネットワーク
は、鎖状部を構成する核酸と分岐部を構成する架橋化合
物との結合によって、本質的に無限に展開された3次元
のネットワークであって、固相担体に固定化されている
ものである。これらの結合や固定化は、官能基Aと官能
基Bとの結合に基づいている。[Network] The network of the second invention is a three-dimensional network which is essentially infinitely developed by the bond between the nucleic acid constituting the chain and the cross-linking compound constituting the branch. It is immobilized on a phase carrier. These bonding and immobilization are based on the bonding between the functional groups A and B.
【0032】ネットワークは、本質的に無限に展開され
得る構造の3次元のものであれば良く、実際にはネット
ワークが必ずしも無限に近く展開されていたり、ハイブ
リダイズ反応液全体に網羅されていたりしていなくても
構わない。The network only needs to be a three-dimensional structure having an essentially infinitely expandable structure. In practice, the network may be expanded almost infinitely, or may be covered over the entire hybridization reaction solution. You don't have to.
【0033】[0033]
【実施例】次に、本発明の一実施例を説明する。Next, an embodiment of the present invention will be described.
【0034】(1.dUTPへのカルボキシル基の導
入)10mLのナスフラスコ中で、1mLの水にカルボ
キシメトキシルアミン塩酸塩26mg(0.23m mo
l)を溶解した。これにジデオキシウリジン3リン酸
(ddUTP)42mg(0.09m mol)を加え、5
0°Cにおいて3時間加温攪拌することにより、次の
「化1」式に示すように、カルボキシル基が導入された
ddUTPを生成させた。( 1. Introduction of carboxyl group to dUTP )
ON) in a recovery flask 10 mL, of water 1mL carboxymethoxylamine hydrochloride 26 mg (0.23 m mo
l) was dissolved. To this, 42 mg (0.09 mmol) of dideoxyuridine triphosphate (ddUTP) was added, and 5
By heating and stirring at 0 ° C. for 3 hours, ddUTP into which a carboxyl group had been introduced was generated as shown in the following “Formula 1”.
【0035】[0035]
【化1】 次に、上記反応液を高速液体クロマトグラフィーにか
け、目的物のピークを回収した。収量は29mg(60
%)であった。Embedded image Next, the reaction solution was subjected to high performance liquid chromatography, and the peak of the target substance was collected. The yield is 29 mg (60
%)Met.
【0036】(2.プローブDNAの3’末端、5’末
端へのカルボキシル基の導入)ベーリンガー社の5’末
端標識キット「DIGオリゴヌクレオチド5’末端標識
セット」を用い、DNA合成機によって、サンプルDN
Aにハイブリダイズ可能な塩基配列を有すると共に5’
末端がアミノ基置換されたプローブDNAを合成した。( 2. 3 'end, 5' end of probe DNA
Introduction of a carboxyl group to the end ) Using a Boehringer's 5 'end labeling kit "DIG oligonucleotide 5' end label set", use a DNA synthesizer to prepare sample DN.
A having a base sequence capable of hybridizing to A and 5 ′
A probe DNA whose terminal was substituted with an amino group was synthesized.
【0037】次に、ベーリンガー社の3’末端標識キッ
ト「DIGオリゴヌクレオチド3’末端標識セット」を
用い、オリゴヌクレオチドである上記プローブDNAの
3’末端に、上記のカルボキシル基導入型ddUTPを
結合した。Next, the above-mentioned carboxyl group-introduced ddUTP was bound to the 3 ′ end of the probe DNA, which is an oligonucleotide, using a Boehringer 3 ′ end labeling kit “DIG oligonucleotide 3 ′ end label set”. .
【0038】更に、プローブDNAの上記5’末端のア
ミノ基に、ジカルボン酸化合物であるグルタミン酸ナト
リウム塩の一方のカルボキシル基をカルボジイミド反応
により結合させることにより、5’末端の官能基をカル
ボキシル基に転換した。Further, one of the carboxyl groups of sodium glutamate, which is a dicarboxylic acid compound, is bonded to the amino group at the 5 'end of the probe DNA by a carbodiimide reaction, thereby converting the functional group at the 5' end into a carboxyl group. did.
【0039】(3.プラスチックプレート器壁へのアミ
ノ基の導入)飽和1級アミンであるn−ヘキシルアミン
1gを水20mLに溶解した液を、96穴プラスチック
プレートに100μmずつ加え、37°Cで一晩放置す
ることにより、プラスチックプレートの器壁に上記n−
ヘキシルアミンを吸着させた。その後水洗して、乾燥さ
せた。( 3. Netting on plastic plate container wall
A ) A solution of 1 g of n-hexylamine, a saturated primary amine, dissolved in 20 mL of water was added to a 96-well plastic plate at 100 μm each, and the plate was allowed to stand overnight at 37 ° C. The above n-
Hexylamine was adsorbed. Thereafter, it was washed with water and dried.
【0040】(4.3次元ネットワークの形成)上記
3.のプラスチックプレートに、前記2.のプローブD
NAの10μg/mL水溶液を10μL、架橋化合物と
しての1,4,7,10−テトラアザシクロドデカン−
テトラハイドロクロライドの1mg/mL水溶液を10
μL、架橋化剤としてのジシクロヘキシルカルボジイミ
ド及びN−ヒドロキシスクシンイミドのそれぞれ1mg
/mL水溶液を各10μL、及び水50μLを加え、室
温下で一晩放置することにより、第2発明に係る核酸の
3次元ネットワークを形成させた。その後水洗して、乾
燥させた。(4. Formation of three- dimensional network ) Into the plastic plate of 2. Probe D
10 μL of a 10 μg / mL aqueous solution of NA, 1,4,7,10-tetraazacyclododecane as a crosslinking compound
10 mg / mL aqueous solution of tetrahydrochloride
μL, 1 mg each of dicyclohexylcarbodiimide and N-hydroxysuccinimide as crosslinking agents
10 μL / water solution and 50 μL of water were added, and the mixture was allowed to stand at room temperature overnight to form a three-dimensional network of nucleic acids according to the second invention. Thereafter, it was washed with water and dried.
【0041】(5.標的核酸の検出)上記4.の3次元
ネットワークを形成させたプラスチックプレートに対し
て、そのネットワークを構成する固定化プローブDNA
にハイブリダイズ可能であり、PCRによってDIG
(ジゴキシゲニン)標識されたサンプルDNAを、表1
に示すように0.1〜20ng/プレートの範囲で7通
りの投与量に分けて加え、ハイブリダイゼーション反応
を起こさせた。( 5. Detection of Target Nucleic Acid ) Immobilized probe DNA that forms a three-dimensional network formed on a plastic plate
To DIG by PCR.
(Digoxigenin) -labeled sample DNA was prepared as shown in Table 1.
As shown in Table 7, the dosage was divided into seven doses in the range of 0.1 to 20 ng / plate to cause a hybridization reaction.
【0042】その後、アルカリフォスファターゼで標識
した抗DIG抗体を反応させて、固定されたアルカリフ
ォスファターゼをパラニトロフェニルホスフェートを用
いて405nmにおける吸光度測定により検出した。Thereafter, an anti-DIG antibody labeled with alkaline phosphatase was reacted, and the immobilized alkaline phosphatase was detected by measuring the absorbance at 405 nm using paranitrophenyl phosphate.
【0043】又、対照例として、従来の核酸増幅固相化
技術に係る製品であるヌンク社製のヌクレオリンク(商
品名)を用いて、上記同様の検出試験を行った。これら
の試験結果を表1に示す。なお、表1中、○はブランク
(水)に対して吸光度に有意の差があったもの、×はブ
ランクに対して吸光度に有意の差がなかったものを示
す。As a control, a detection test similar to that described above was conducted using Nucleolink (trade name) manufactured by Nunc, which is a product related to the conventional nucleic acid amplification solid phase technology. Table 1 shows the test results. In Table 1, ○ indicates that there was a significant difference in absorbance with respect to the blank (water), and X indicates that there was no significant difference in absorbance with respect to the blank.
【0044】表1の結果より、本発明の実施例は対照例
に比較して、5倍の検出感度を示すことが分かった。From the results shown in Table 1, it was found that the examples of the present invention exhibited a detection sensitivity five times that of the control example.
【0045】[0045]
【表1】 [Table 1]
Claims (2)
能基Aと結合する官能基Bを3個以上備えた架橋化合物
とを、官能基Bを表面に固定した固相担体に対して作用
させることにより、前記核酸を固定化することを特徴と
する核酸固定化法。1. A nucleic acid having a functional group A at both ends and a cross-linking compound having three or more functional groups B binding to the functional group A are mixed with a solid support having the functional group B immobilized on the surface thereof. A nucleic acid immobilization method, wherein the nucleic acid is immobilized by allowing the nucleic acid to act.
る架橋化合物との結合によって、本質的に無限に展開さ
れた3次元のネットワークが形成されると共に、該ネッ
トワークを構成する前記核酸の一部の一端が固相担体と
結合することによって、該固相担体に前記ネットワーク
が固定化されていることを特徴とする固定化核酸。2. The bond between the nucleic acid constituting the chain portion and the cross-linking compound constituting the branch portion forms an essentially infinite three-dimensional network, and the nucleic acid constituting the network. Immobilized nucleic acid, wherein the network is immobilized on the solid-phase carrier by binding one end of the nucleic acid to the solid-phase carrier.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP13926298A JPH11318488A (en) | 1998-05-21 | 1998-05-21 | Immobilization of nucleic acid and immobilized nucleic acid |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP13926298A JPH11318488A (en) | 1998-05-21 | 1998-05-21 | Immobilization of nucleic acid and immobilized nucleic acid |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH11318488A true JPH11318488A (en) | 1999-11-24 |
Family
ID=15241199
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP13926298A Pending JPH11318488A (en) | 1998-05-21 | 1998-05-21 | Immobilization of nucleic acid and immobilized nucleic acid |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH11318488A (en) |
-
1998
- 1998-05-21 JP JP13926298A patent/JPH11318488A/en active Pending
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