JPH11242074A - 横緩和最適化分光法（ｔｒｏｓｙ） - Google Patents
横緩和最適化分光法（ｔｒｏｓｙ）Info
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- JPH11242074A JPH11242074A JP10315399A JP31539998A JPH11242074A JP H11242074 A JPH11242074 A JP H11242074A JP 10315399 A JP10315399 A JP 10315399A JP 31539998 A JP31539998 A JP 31539998A JP H11242074 A JPH11242074 A JP H11242074A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 横緩和速度をかなり低減可能な新規なアプロ
ーチである「横緩和最適化分光法」（ＴＲＯＳＹ）を導
入することにより、より大きい分子（７）の溶液ＮＭＲ
に対する重要な障害を克服する。 【解決手段】異種核スピン系であって、スピン系は、均
一な磁場Ｂ0におかれ、一連の無線周波数（ｒｆ）パル
スの照射を受ける方法は、スピン系が、互いに結合され
ている少なくとも２種類のスピン１／２核Ｉ及びＳから
成り、それにより、一連のｒｆパルスは、横緩和
（Ｔ2）により観察されたスペクトル中で広がる線がス
ピンの双極子−双極子（ＤＤ）カップリングと化学シフ
ト異方性（ＣＳＡ）の交差相関のため大幅に低減し、ス
ピン系の個別の多重線成分の異なる緩和速度を生じるよ
うに選択され、また、２つの異なるメカニズムの緩和効
果が大きく互いにうち消し合うように選択される。
ーチである「横緩和最適化分光法」（ＴＲＯＳＹ）を導
入することにより、より大きい分子（７）の溶液ＮＭＲ
に対する重要な障害を克服する。 【解決手段】異種核スピン系であって、スピン系は、均
一な磁場Ｂ0におかれ、一連の無線周波数（ｒｆ）パル
スの照射を受ける方法は、スピン系が、互いに結合され
ている少なくとも２種類のスピン１／２核Ｉ及びＳから
成り、それにより、一連のｒｆパルスは、横緩和
（Ｔ2）により観察されたスペクトル中で広がる線がス
ピンの双極子−双極子（ＤＤ）カップリングと化学シフ
ト異方性（ＣＳＡ）の交差相関のため大幅に低減し、ス
ピン系の個別の多重線成分の異なる緩和速度を生じるよ
うに選択され、また、２つの異なるメカニズムの緩和効
果が大きく互いにうち消し合うように選択される。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、異種核スピン系で
あって、特に、大きい分子、とりわけ溶液中の生物学的
巨大分子からなる異種核スピン系の核磁気共鳴（ＮＭ
Ｒ）相関スペクトルを得る方法に関する。
あって、特に、大きい分子、とりわけ溶液中の生物学的
巨大分子からなる異種核スピン系の核磁気共鳴（ＮＭ
Ｒ）相関スペクトルを得る方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】天然に存在するあるいは部位特異的な同
位体標識付け等の技術により導入された顕著な分光特性
を有する少数のスピンの観察に基づくタンパク質の核磁
気共鳴（ＮＭＲ）分光法からは、生物学的に関係のある
情報が、ヒトヘモグロビン（Ｍ＝６５０００）に関して
既に１９６１年に得られており（１）、その後、例えば
免疫グロブリン（２）などのかなりより大きい系につい
ても得られていた。対照的に、デノボ構造決定（３，
４）用のＮＭＲの使用は、現在までのところ、比較的小
さな分子サイズに限定されており、最大ＮＭＲ構造は分
子量３００００以下である。なお、本明細書中の記述に
おいて、（ ）を用いて挿入された数字は、この説明の
末尾に一括して示す参考文献の番号を示す。
位体標識付け等の技術により導入された顕著な分光特性
を有する少数のスピンの観察に基づくタンパク質の核磁
気共鳴（ＮＭＲ）分光法からは、生物学的に関係のある
情報が、ヒトヘモグロビン（Ｍ＝６５０００）に関して
既に１９６１年に得られており（１）、その後、例えば
免疫グロブリン（２）などのかなりより大きい系につい
ても得られていた。対照的に、デノボ構造決定（３，
４）用のＮＭＲの使用は、現在までのところ、比較的小
さな分子サイズに限定されており、最大ＮＭＲ構造は分
子量３００００以下である。なお、本明細書中の記述に
おいて、（ ）を用いて挿入された数字は、この説明の
末尾に一括して示す参考文献の番号を示す。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】構造生物学におけるＮ
ＭＲは、Ｘ線結晶学との協調使用（５）という実際的な
理由のため、将来においてもより小さい分子サイズに焦
点を合わせているが、かなりの努力がより大きい分子へ
サイズの限界を広げる試みに注がれている（例えば、６
〜８）。
ＭＲは、Ｘ線結晶学との協調使用（５）という実際的な
理由のため、将来においてもより小さい分子サイズに焦
点を合わせているが、かなりの努力がより大きい分子へ
サイズの限界を広げる試みに注がれている（例えば、６
〜８）。
【０００４】本発明は、上記問題に鑑みてなされたもの
で、横緩和速度をかなり低減可能な新規なアプローチで
ある「横緩和最適化分光法」（ＴＲＯＳＹ）を導入する
ことにより、より大きい分子の溶液ＮＭＲに対する重要
な障害（７）を克服することを目的とする。
で、横緩和速度をかなり低減可能な新規なアプローチで
ある「横緩和最適化分光法」（ＴＲＯＳＹ）を導入する
ことにより、より大きい分子の溶液ＮＭＲに対する重要
な障害（７）を克服することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】双極子−双極子カップリ
ングおよび化学シフト異方性の相互の打ち消しによる減
衰Ｔ2緩和は、溶液中の非常に大きい生物学的巨大分子
のＮＭＲ構造への道を示す。
ングおよび化学シフト異方性の相互の打ち消しによる減
衰Ｔ2緩和は、溶液中の非常に大きい生物学的巨大分子
のＮＭＲ構造への道を示す。
【０００６】なお、本明細書中においては下記の略語が
用いられる。
用いられる。
【０００７】ＮＭＲ： 核磁気共鳴； ｒｆ： 無線周
波数； ２Ｄ： ２次元； ＦＩＤ：自由誘導減衰 Ｄ
Ｄ： 双極子−双極子； ＣＳＡ： 化学シフト異方
性；ＣＯＳＹ： 相関分光法； ＴＲＯＳＹ： 横緩和
最適化分光法； ＰＦＧ：パルス場勾配； ｆｔｚホメ
オドメイン： 位置３−６２にホメオドメインを有する
７０アミノ酸残基のフシタラズホメオドメインポリペプ
チド。
波数； ２Ｄ： ２次元； ＦＩＤ：自由誘導減衰 Ｄ
Ｄ： 双極子−双極子； ＣＳＡ： 化学シフト異方
性；ＣＯＳＹ： 相関分光法； ＴＲＯＳＹ： 横緩和
最適化分光法； ＰＦＧ：パルス場勾配； ｆｔｚホメ
オドメイン： 位置３−６２にホメオドメインを有する
７０アミノ酸残基のフシタラズホメオドメインポリペプ
チド。
【０００８】双極子−双極子（ＤＤ）カップリング及び
回転分子運動により変調された化学シフト異方性による
1Ｈ、15Ｎ及び13Ｃの高速の横緩和は、溶液中でＮＭＲ
分光法により研究可能な生物巨大分子構造のサイズの限
界に決定的な影響を与える。ＴＲＯＳＹ（横方向最適化
分光法）は、多次元ＮＭＲ実験における横緩和の抑制へ
の新しいアプローチであり、ＤＤカップリング及びＣＳ
Ａ間の干渉を建設的に利用することに基づいている。例
えば、７５０ＭＨｚの1Ｈ周波数での分子量１７ｋＤａ
のＤＮＡ複合体中の均一に15Ｎ標識付けされたタンパク
質を用いたＴＲＯＳＹ型２次元1Ｈ，15Ｎ相関実験によ
れば、15Ｎ化学シフト展開中の15Ｎ緩和及び信号取り込
み中の1ＨN緩和はともにＤＤ及びＣＳＡ相互作用による
相互の補償によりかなり低減されることが示されてい
る。従来の２次元1Ｈ，15Ｎ相関実験と比較して、線幅
の低減は、それぞれ６０％及び４０％であり、残存線幅
は、４℃で15Ｎの場合５Ｈｚ、1ＨNの場合１５Ｈｚであ
った。ＤＤ及びＣＳＡ緩和速度の比率は、分子のサイズ
からはほとんど独立しているので、全体の横緩和速度の
同様のパーセントの低減がより大きいタンパク質に関し
て予期される。７５０ＭＨｚ及び２０℃での15Ｎ標識付
けされたタンパク質の場合、15Ｎについては１０Ｈｚ及
び1ＨNについては４５Ｈｚの残存線幅が予測され、対応
する均一に15Ｎ，2Ｈ標識付けされたタンパク質の場
合、残存線幅は、それぞれ５Ｈｚ及び１５Ｈｚより小さ
いことが予測される。ＴＲＯＳＹ原理は様々の多次元溶
液ＮＭＲ実験、特に現在利用可能なものよりもさらに若
干高い分極化磁場の将来の使用に役立つはずであり、か
くしてより巨大な分子についての作業を制限する重要な
要因の一つを大きく除去する。
回転分子運動により変調された化学シフト異方性による
1Ｈ、15Ｎ及び13Ｃの高速の横緩和は、溶液中でＮＭＲ
分光法により研究可能な生物巨大分子構造のサイズの限
界に決定的な影響を与える。ＴＲＯＳＹ（横方向最適化
分光法）は、多次元ＮＭＲ実験における横緩和の抑制へ
の新しいアプローチであり、ＤＤカップリング及びＣＳ
Ａ間の干渉を建設的に利用することに基づいている。例
えば、７５０ＭＨｚの1Ｈ周波数での分子量１７ｋＤａ
のＤＮＡ複合体中の均一に15Ｎ標識付けされたタンパク
質を用いたＴＲＯＳＹ型２次元1Ｈ，15Ｎ相関実験によ
れば、15Ｎ化学シフト展開中の15Ｎ緩和及び信号取り込
み中の1ＨN緩和はともにＤＤ及びＣＳＡ相互作用による
相互の補償によりかなり低減されることが示されてい
る。従来の２次元1Ｈ，15Ｎ相関実験と比較して、線幅
の低減は、それぞれ６０％及び４０％であり、残存線幅
は、４℃で15Ｎの場合５Ｈｚ、1ＨNの場合１５Ｈｚであ
った。ＤＤ及びＣＳＡ緩和速度の比率は、分子のサイズ
からはほとんど独立しているので、全体の横緩和速度の
同様のパーセントの低減がより大きいタンパク質に関し
て予期される。７５０ＭＨｚ及び２０℃での15Ｎ標識付
けされたタンパク質の場合、15Ｎについては１０Ｈｚ及
び1ＨNについては４５Ｈｚの残存線幅が予測され、対応
する均一に15Ｎ，2Ｈ標識付けされたタンパク質の場
合、残存線幅は、それぞれ５Ｈｚ及び１５Ｈｚより小さ
いことが予測される。ＴＲＯＳＹ原理は様々の多次元溶
液ＮＭＲ実験、特に現在利用可能なものよりもさらに若
干高い分極化磁場の将来の使用に役立つはずであり、か
くしてより巨大な分子についての作業を制限する重要な
要因の一つを大きく除去する。
【０００９】タンパク質及び核酸の研究に一般的に用い
られる高い電磁場では、1Ｈ、15Ｎ及び13Ｃの化学シフ
ト異方性（ＣＳＡ）相互作用は、双極子−双極子（Ｄ
Ｄ）緩和に加えて、タンパク質及び核酸における緩和の
大きなソースを形成する。これにより、分極化磁場Ｂ0
の増大にともなって全体の横緩和速度が増大することに
なる。それでもなお、高磁場におけるより大きなタンパ
ク質のアミド陽子の横緩和は、非置換活性水素原子を重
陽子に完全に又は部分的に置き換えることにより成功裡
に低減でき、かくして、例えば、９０％以上の15Ｎ13Ｃ
α及び1ＨN化学シフトがサイズ６４０００のタンパク質
−ＤＮＡ複合体のポリペプチド鎖に割り当てられた。Ｔ
ＲＯＳＹは、ＤＤ及びＣＳＡの干渉により生じる交差相
関緩和が、例えばペプチド結合の15Ｎ−1Ｈフラグメン
トなどの２つの結合されたスピン１／２、Ｉ及びＳ、の
系中の個々の多重線成分の異なる緩和速度を生じると言
う事実に基づいて、Ｔ2緩和をさらに低減するために分
光学的手段を用いるものである（９，１０）。理論的に
は、１ＧＨｚ近傍の1Ｈ周波数で、15Ｎ−1Ｈ部分中にお
ける全ての横緩和効果のほとんど完全な打ち消しが４つ
の多重線成分の１つに対して達成可能である。ＴＲＯＳ
Ｙは、もっぱらこの狭い成分を観察するが、その残存線
幅は、その場合、ほとんど全てがタンパク質中の遠隔水
素原子とのＤＤ相互作用による。これらは、2Ｈ標識付
けにより効率的に抑制することができ、その結果、ＴＲ
ＯＳＹ型実験においては、溶液ＮＭＲ研究用にアクセス
可能な分子サイズは、もはや、主としてＴ2緩和によっ
て制限されることはない。
られる高い電磁場では、1Ｈ、15Ｎ及び13Ｃの化学シフ
ト異方性（ＣＳＡ）相互作用は、双極子−双極子（Ｄ
Ｄ）緩和に加えて、タンパク質及び核酸における緩和の
大きなソースを形成する。これにより、分極化磁場Ｂ0
の増大にともなって全体の横緩和速度が増大することに
なる。それでもなお、高磁場におけるより大きなタンパ
ク質のアミド陽子の横緩和は、非置換活性水素原子を重
陽子に完全に又は部分的に置き換えることにより成功裡
に低減でき、かくして、例えば、９０％以上の15Ｎ13Ｃ
α及び1ＨN化学シフトがサイズ６４０００のタンパク質
−ＤＮＡ複合体のポリペプチド鎖に割り当てられた。Ｔ
ＲＯＳＹは、ＤＤ及びＣＳＡの干渉により生じる交差相
関緩和が、例えばペプチド結合の15Ｎ−1Ｈフラグメン
トなどの２つの結合されたスピン１／２、Ｉ及びＳ、の
系中の個々の多重線成分の異なる緩和速度を生じると言
う事実に基づいて、Ｔ2緩和をさらに低減するために分
光学的手段を用いるものである（９，１０）。理論的に
は、１ＧＨｚ近傍の1Ｈ周波数で、15Ｎ−1Ｈ部分中にお
ける全ての横緩和効果のほとんど完全な打ち消しが４つ
の多重線成分の１つに対して達成可能である。ＴＲＯＳ
Ｙは、もっぱらこの狭い成分を観察するが、その残存線
幅は、その場合、ほとんど全てがタンパク質中の遠隔水
素原子とのＤＤ相互作用による。これらは、2Ｈ標識付
けにより効率的に抑制することができ、その結果、ＴＲ
ＯＳＹ型実験においては、溶液ＮＭＲ研究用にアクセス
可能な分子サイズは、もはや、主としてＴ2緩和によっ
て制限されることはない。
【００１０】次に、本発明の理論を詳細に述べる。
【００１１】本発明者等は、タンパク質分子中に位置す
る、スカラーカップリング定数ＪISを有する２つのスカ
ラーカップリングスピン１／２、Ｉ及びＳ、の系を検討
した。このスピン系のＴ2緩和は、Ｉ及びＳのＤＤカッ
プリングと各個別のスピンのＣＳＡにより支配されてい
る。なぜならば、ポリペプチド鎖の立体化学は、Ｉ及び
Ｓの付加的相互作用を制限し、少数の遠隔陽子Ｉkとの
スカラー及びＤＤカップリングを弱めるからである。単
一量子スペクトル中のスピンＳの個々の多重線成分の緩
和速度は、その時、大きく異なっていてよい（９、１
１、１２）。それらは、単一遷移ベース演算子（下記化
学式［１］及び［２］）（１３）を用いて説明できる
が、それは、２つのスピン１／２の系の場合の基準エネ
ルギー準位図における遷移１→２及び３→４に言及し、
対応する共鳴周波数（下記数式［１］及び［２］）と組
み合わされている（１３〜１６）：
る、スカラーカップリング定数ＪISを有する２つのスカ
ラーカップリングスピン１／２、Ｉ及びＳ、の系を検討
した。このスピン系のＴ2緩和は、Ｉ及びＳのＤＤカッ
プリングと各個別のスピンのＣＳＡにより支配されてい
る。なぜならば、ポリペプチド鎖の立体化学は、Ｉ及び
Ｓの付加的相互作用を制限し、少数の遠隔陽子Ｉkとの
スカラー及びＤＤカップリングを弱めるからである。単
一量子スペクトル中のスピンＳの個々の多重線成分の緩
和速度は、その時、大きく異なっていてよい（９、１
１、１２）。それらは、単一遷移ベース演算子（下記化
学式［１］及び［２］）（１３）を用いて説明できる
が、それは、２つのスピン１／２の系の場合の基準エネ
ルギー準位図における遷移１→２及び３→４に言及し、
対応する共鳴周波数（下記数式［１］及び［２］）と組
み合わされている（１３〜１６）：
【００１２】
【化１】
【００１３】
【化２】
【００１４】
【数１】
【００１５】
【数２】
【００１６】
【数３】 式中、ωS及びωIはスピンＳ及びＩのラーモア周波数で
あり、Ｔ2S及びＴ1Iは、スピンＳ及びＩ間のＤＤカップ
リング及びスピンＳ及びＩのＣＳＡを除く全ての緩和の
メカニズムによるスピンＳの横緩和及びスピンＩの縦緩
和時間をそれぞれ説明する。上記数式［３］において、
あり、Ｔ2S及びＴ1Iは、スピンＳ及びＩ間のＤＤカップ
リング及びスピンＳ及びＩのＣＳＡを除く全ての緩和の
メカニズムによるスピンＳの横緩和及びスピンＩの縦緩
和時間をそれぞれ説明する。上記数式［３］において、
【００１７】
【数４】
【００１８】
【数５】
【００１９】
【数６】 であり、式中、γI及びγSはＩ及びＳの磁気回転比であ
り、ｈは、２πで除算したプランク定数であり、ｒ
ISは、ＳとＩ間の距離であり、Ｂ0は、分極磁場であ
り、ΔσS及びΔσIは、それぞれ、スピンＳ及びＩの線
対称化学シフトテンソルの軸方向及び垂直方向主成分間
の差である。Ｒ1212及びＲ3434は、下記の数式［６］及
び［７］によって与えられるＳ二重線の個々の成分の横
緩和速度である（１１）。
り、ｈは、２πで除算したプランク定数であり、ｒ
ISは、ＳとＩ間の距離であり、Ｂ0は、分極磁場であ
り、ΔσS及びΔσIは、それぞれ、スピンＳ及びＩの線
対称化学シフトテンソルの軸方向及び垂直方向主成分間
の差である。Ｒ1212及びＲ3434は、下記の数式［６］及
び［７］によって与えられるＳ二重線の個々の成分の横
緩和速度である（１１）。
【００２０】
【数７】
【００２１】
【数８】 式中、Ｊ（ω）は、示された周波数のスペクトル密度関
数を表す。
数を表す。
【００２２】
【数９】 数式［７］及び［８］を導くときには、化学シフトテン
ソルの主対称軸とベクトルｒISの平行配向が想定されて
いた。これらの数式は、ＣＳＡ及びＤＤカップリングは
互いに匹敵し、即ち、ｐ≒δであり、下記化学式［３］
の周波数の共鳴は、非常に大きい分子の場合でもゆっく
りした横緩和を示してよいということを示している。
ソルの主対称軸とベクトルｒISの平行配向が想定されて
いた。これらの数式は、ＣＳＡ及びＤＤカップリングは
互いに匹敵し、即ち、ｐ≒δであり、下記化学式［３］
の周波数の共鳴は、非常に大きい分子の場合でもゆっく
りした横緩和を示してよいということを示している。
【００２３】
【化３】 数式［３］によるスピンＩの緩和の処理の場合は、記号
ＩとＳを単に交換すればよい。単一遷移演算子（下記化
学式［４］及び［５］）は、その時、エネルギー準位の
遷移１→３及び２→４にそれぞれ言及し、それらは対応
する共鳴周波数（下記数式［１０］及び［１１］）と組
み合わされており、緩和速度Ｒ1313及びＲ2424は、前記
数式［７］及び［８］中のＳ及びＩ指標の並べ替えによ
って得られる等式によって、それぞれ決定される。
ＩとＳを単に交換すればよい。単一遷移演算子（下記化
学式［４］及び［５］）は、その時、エネルギー準位の
遷移１→３及び２→４にそれぞれ言及し、それらは対応
する共鳴周波数（下記数式［１０］及び［１１］）と組
み合わされており、緩和速度Ｒ1313及びＲ2424は、前記
数式［７］及び［８］中のＳ及びＩ指標の並べ替えによ
って得られる等式によって、それぞれ決定される。
【００２４】
【化４】
【００２５】
【化５】
【００２６】
【数１０】
【００２７】
【数１１】 緩和の他のメカニズムからの影響を評価するために、本
発明者らは、Ｉ及びＳを15Ｎ−1Ｈ部分における1ＨN及
び15Ｎスピンとして同定した。15Ｎの緩和は、その時、
15ＮのＣＳＡ及び直接に付着している陽子とのＤＤ相互
作用によって主として決定され、その結果、他の相互作
用、１／Ｔ1S及び１／Ｔ2Sからの影響は、略無視でき
る。1ＨNの場合、１／Ｔ1I及び１／Ｔ2Iは、距離ｒkに
おける他の陽子ＩkとのＤＤ相互作用によって支配され
る。これらは、スペクトル密度関数Ｊｋ（ω）によって
説明することができ、それは、個別の1ＨN−1Ｈkスピン
ペアに結合するベクトルの動きを説明する（１７）。
発明者らは、Ｉ及びＳを15Ｎ−1Ｈ部分における1ＨN及
び15Ｎスピンとして同定した。15Ｎの緩和は、その時、
15ＮのＣＳＡ及び直接に付着している陽子とのＤＤ相互
作用によって主として決定され、その結果、他の相互作
用、１／Ｔ1S及び１／Ｔ2Sからの影響は、略無視でき
る。1ＨNの場合、１／Ｔ1I及び１／Ｔ2Iは、距離ｒkに
おける他の陽子ＩkとのＤＤ相互作用によって支配され
る。これらは、スペクトル密度関数Ｊｋ（ω）によって
説明することができ、それは、個別の1ＨN−1Ｈkスピン
ペアに結合するベクトルの動きを説明する（１７）。
【００２８】
【数１２】
【００２９】
【数１３】 ここに、数式［３］、［７］、［８］、［９］、［１
２］及び［１３］は、緩和パラメータの所定の組のスピ
ン多重線の理論的線形を計算するために用いられ、それ
らは、次に実験によるＮＭＲデータと比較された。特
に、同相吸収スペクトルは、下記の数式［１４］により
計算された。
２］及び［１３］は、緩和パラメータの所定の組のスピ
ン多重線の理論的線形を計算するために用いられ、それ
らは、次に実験によるＮＭＲデータと比較された。特
に、同相吸収スペクトルは、下記の数式［１４］により
計算された。
【００３０】
【数１４】 式中、Ｖ＝（１，１）であり、緩和マトリックスＡは、
数式［３］の右辺の（２ｘ２）マトリックスである。
数式［３］の右辺の（２ｘ２）マトリックスである。
【００３１】
【発明の実施の形態】以下図面を参照して実際の実験に
基づいて本発明の実施の形態を詳細に説明する。
基づいて本発明の実施の形態を詳細に説明する。
【００３２】実験手順 ＮＭＲスペクトルをBruker DRX 750及びVarian Unitypl
us 400 分光計に、ｐＨ６．０、４℃の９５％1Ｈ2Ｏ／
５％2Ｈ2Ｏの溶液中の、均一に15Ｎ標識付けされた７０
残基フシタラズ（ｆｔｚ）ホメオドメインポリペプチド
と標識付けされていない１４−ベースペアＤＮＡ二重鎖
（１８，１９）間で形成される特殊な１：１複合体の２
ｍＭ溶液を用いて記録した。
us 400 分光計に、ｐＨ６．０、４℃の９５％1Ｈ2Ｏ／
５％2Ｈ2Ｏの溶液中の、均一に15Ｎ標識付けされた７０
残基フシタラズ（ｆｔｚ）ホメオドメインポリペプチド
と標識付けされていない１４−ベースペアＤＮＡ二重鎖
（１８，１９）間で形成される特殊な１：１複合体の２
ｍＭ溶液を用いて記録した。
【００３３】複合体の同位体回転相関時間τcは、バッ
クボーン15Ｎ核の緩和時間（２０）のＴ1／Ｔ2比から推
定された。Farrow等の実験スキーム（２１）をバックボ
ーン窒素原子のＴ1（15Ｎ）と／Ｔ2（15Ｎ）の測定に用
いた。
クボーン15Ｎ核の緩和時間（２０）のＴ1／Ｔ2比から推
定された。Farrow等の実験スキーム（２１）をバックボ
ーン窒素原子のＴ1（15Ｎ）と／Ｔ2（15Ｎ）の測定に用
いた。
【００３４】ＴＲＯＳＹ（横緩和最適化分光法）のアプ
ローチ（図１）及び従来の［15Ｎ，1Ｈ］−ＣＯＳＹ
（２２，２３）実験は、1Ｈ及び15Ｎの共鳴を相関させ
るのに用いられた。全てのスペクトルについて、ｔ1max
＝９０ｍｓ及びｔ2max＝１７１ｍｓが用いられた。ＴＲ
ＯＳＹにおいては、Ｉ，Ｓスピン系の1ＪISスカラーカ
ップリングによる展開は、ｔ1及びｔ2中には、再集束化
（rejocus）することをせず、これらの期間中の交差相
関緩和の抑制を回避した。２Ｄ多重線のもっともゆっく
り緩和する成分のみ含む純粋な吸収スペクトルを得るた
めに、図１のスキームが用いられた（付録：ＴＲＯＳＹ
の定量分析も参照）。
ローチ（図１）及び従来の［15Ｎ，1Ｈ］−ＣＯＳＹ
（２２，２３）実験は、1Ｈ及び15Ｎの共鳴を相関させ
るのに用いられた。全てのスペクトルについて、ｔ1max
＝９０ｍｓ及びｔ2max＝１７１ｍｓが用いられた。ＴＲ
ＯＳＹにおいては、Ｉ，Ｓスピン系の1ＪISスカラーカ
ップリングによる展開は、ｔ1及びｔ2中には、再集束化
（rejocus）することをせず、これらの期間中の交差相
関緩和の抑制を回避した。２Ｄ多重線のもっともゆっく
り緩和する成分のみ含む純粋な吸収スペクトルを得るた
めに、図１のスキームが用いられた（付録：ＴＲＯＳＹ
の定量分析も参照）。
【００３５】結果 １４−ベースペアＤＮＡ二重鎖で複合化され均一に15Ｎ
標識付けされたｆｔｚホメオドメインを用いたＮＭＲ実
験を４℃で行った。15ＮのＴ1／Ｔ2比を用いて、複合体
の有効な全域相関時間τc（２０）を推定した。バック
ボーンアミド基の場合は、４００ＭＨｚで、それぞれ
０．７２０(０．０３及び０．０４２(０．００５ｓの平
均Ｔ1（15Ｎ）及びＴ2（15Ｎ）値を測定し、その結果、
全域回転相関時間τc＝２０(２ｎｓが得られた。このτ
c値は、３５℃のＨ2Ｏ中のサイズ４０ｋＤａの球形タン
パク質について予期された値に対応する。
標識付けされたｆｔｚホメオドメインを用いたＮＭＲ実
験を４℃で行った。15ＮのＴ1／Ｔ2比を用いて、複合体
の有効な全域相関時間τc（２０）を推定した。バック
ボーンアミド基の場合は、４００ＭＨｚで、それぞれ
０．７２０(０．０３及び０．０４２(０．００５ｓの平
均Ｔ1（15Ｎ）及びＴ2（15Ｎ）値を測定し、その結果、
全域回転相関時間τc＝２０(２ｎｓが得られた。このτ
c値は、３５℃のＨ2Ｏ中のサイズ４０ｋＤａの球形タン
パク質について予期された値に対応する。
【００３６】図２は、タンパク質のコアに埋め込まれた
Ｔｒｐ４８のインドール15Ｎ−1Ｈ部分の共鳴を含むｆ
ｔｚホメオドメイン−ＤＮＡ複合体の15Ｎ−1Ｈ相関ス
ペクトルの小さい領域を示す。従来の［15Ｎ，1Ｈ］−
ＣＯＳＹ実験（２２，２３）においては、それぞれ期間
ｔ1及びｔ2中の1Ｈ及び15Ｎのデカップリングは、15Ｎ
−1Ｈ部分あたり単一の相関ピークの検出に至る（図２
a）。もし、同じ［15Ｎ，1Ｈ］−ＣＯＳＹスペクトルが
デカップリングせずに記録されたら、15Ｎ−1Ｈ部分あ
たり、４個の交差ピークが観察されるが、それらは大き
く異なる線幅を示す（図２ｂ）。（ω1＝１３０．７ｐ
ｐｍ，ω2＝１０．７８ｐｐｍ）での交差ピークは、両
方の次元においてもっとも広い線幅を示すが、そのこと
はそれが1ＨN及び１５N両方の急速に緩和する成分から
発生していることを示す。
Ｔｒｐ４８のインドール15Ｎ−1Ｈ部分の共鳴を含むｆ
ｔｚホメオドメイン−ＤＮＡ複合体の15Ｎ−1Ｈ相関ス
ペクトルの小さい領域を示す。従来の［15Ｎ，1Ｈ］−
ＣＯＳＹ実験（２２，２３）においては、それぞれ期間
ｔ1及びｔ2中の1Ｈ及び15Ｎのデカップリングは、15Ｎ
−1Ｈ部分あたり単一の相関ピークの検出に至る（図２
a）。もし、同じ［15Ｎ，1Ｈ］−ＣＯＳＹスペクトルが
デカップリングせずに記録されたら、15Ｎ−1Ｈ部分あ
たり、４個の交差ピークが観察されるが、それらは大き
く異なる線幅を示す（図２ｂ）。（ω1＝１３０．７ｐ
ｐｍ，ω2＝１０．７８ｐｐｍ）での交差ピークは、両
方の次元においてもっとも広い線幅を示すが、そのこと
はそれが1ＨN及び１５N両方の急速に緩和する成分から
発生していることを示す。
【００３７】図２のスペクトル中の矢印で示された位置
のω2及びω1に沿って切った１次元の断面は、（ω1＝
１３２．１ｐｐｍ，ω2＝１０．７８ｐｐｍ）及び（ω1
＝１３０．７ｐｐｍ，ω2＝１０．６５ｐｐｍ）での２
つの交差ピークがω１又はω２のいずれかに沿って広げ
られたことを示している（図３）。（ω1＝１３２．１
ｐｐｍ，ω2＝１０．６５ｐｐｍ）で交差ピークは両方
の次元において狭い線幅を示し、そのことは、それが、
15Ｎ−1Ｈ二重線の２つのゆっくり緩和する成分から発
生していることを示している。ＴＲＯＳＹ型相関実験
は、ｔ1又はｔ2のいずれの期間中にもデカップリングを
使用しないが、このもっとも狭い相関ピーク（図２ｃ）
のみを含み、それは、従来の広帯域デカップリングされ
たスペクトルにおける崩壊した交差ピークと比べて、15
Ｎ及び1Ｈの共鳴の線幅におけるそれぞれ約６０％及び
４０％の減少を示す。
のω2及びω1に沿って切った１次元の断面は、（ω1＝
１３２．１ｐｐｍ，ω2＝１０．７８ｐｐｍ）及び（ω1
＝１３０．７ｐｐｍ，ω2＝１０．６５ｐｐｍ）での２
つの交差ピークがω１又はω２のいずれかに沿って広げ
られたことを示している（図３）。（ω1＝１３２．１
ｐｐｍ，ω2＝１０．６５ｐｐｍ）で交差ピークは両方
の次元において狭い線幅を示し、そのことは、それが、
15Ｎ−1Ｈ二重線の２つのゆっくり緩和する成分から発
生していることを示している。ＴＲＯＳＹ型相関実験
は、ｔ1又はｔ2のいずれの期間中にもデカップリングを
使用しないが、このもっとも狭い相関ピーク（図２ｃ）
のみを含み、それは、従来の広帯域デカップリングされ
たスペクトルにおける崩壊した交差ピークと比べて、15
Ｎ及び1Ｈの共鳴の線幅におけるそれぞれ約６０％及び
４０％の減少を示す。
【００３８】図３に示す実験による線形の適合は、化学
シフト異方性ΔσＨ及びΔσＮが最良の適合に調節され
た場合のパラメータτc＝２０ｎｓ及び1Ｊ（1Ｈ，
15Ｎ）＝１０５Ｈｚを用いた線形計算で得られた。他に
は説明できないローレンツの線幅からの逸脱があったの
で、本発明者らは、遠隔スカラーカップリング2Ｊ（1Ｈ
δ1，15Ｎε1）＝−５Ｈｚ（２４）を計算に含め、他の
陽子との双極子−双極子カップリングによる1ＨNのＴ1
及びＴ2緩和を３個の陽子を1ＨNから０．２４ｎｍの距
離に置くことによりモデル化した。スピンＳの展開中の
スピンＩへの１個又は一連の１８０°パルスの印加は、
Ｓ多重線の緩慢に及び急速に緩和する成分を交換し、そ
の結果、緩慢な及び急速な緩和速度が平均化されＣＳＡ
／ＤＤ干渉が除去される（２５，２６）。確かに、従来
の［15Ｎ，1Ｈ］−ＣＯＳＹを用いて測定した1ＨN及び
15Ｎ共鳴の線形は、もし前記２つの緩和速度の平均がシ
ミュレーション（図３、a1及びb1）において用いられる
ならば、良好に再現される。最も適合した値ΔσH＝−
１６ｐｐｍ及びΔσＮ＝−１６０ｐｐｍは、15Ｎ−1Ｈ
部分における1Ｈ及び15Ｎの実験的に測定された化学シ
フト異方性に密接に対応している：15Ｎ−2Ｄ部分の固
体ＮＭＲ研究を用いて、ΔσDの場合は、−１４ｐｐｍ
（２７）近傍の値及びΔσHの場合は、−１６０ｐｐｍ
（２８）が決定され；独立に、溶液ＮＭＲ実験によっ
て、バックボーンアミド陽子のΔσHについては、−８
〜−１７ｐｐｍの値（Ａ．Ｂａｘ．ｐｅｒｓｏｎａｌ
Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）、ΔσＮの場合は−１７
０ｐｐｍ（１０）近傍の値が得られた。
シフト異方性ΔσＨ及びΔσＮが最良の適合に調節され
た場合のパラメータτc＝２０ｎｓ及び1Ｊ（1Ｈ，
15Ｎ）＝１０５Ｈｚを用いた線形計算で得られた。他に
は説明できないローレンツの線幅からの逸脱があったの
で、本発明者らは、遠隔スカラーカップリング2Ｊ（1Ｈ
δ1，15Ｎε1）＝−５Ｈｚ（２４）を計算に含め、他の
陽子との双極子−双極子カップリングによる1ＨNのＴ1
及びＴ2緩和を３個の陽子を1ＨNから０．２４ｎｍの距
離に置くことによりモデル化した。スピンＳの展開中の
スピンＩへの１個又は一連の１８０°パルスの印加は、
Ｓ多重線の緩慢に及び急速に緩和する成分を交換し、そ
の結果、緩慢な及び急速な緩和速度が平均化されＣＳＡ
／ＤＤ干渉が除去される（２５，２６）。確かに、従来
の［15Ｎ，1Ｈ］−ＣＯＳＹを用いて測定した1ＨN及び
15Ｎ共鳴の線形は、もし前記２つの緩和速度の平均がシ
ミュレーション（図３、a1及びb1）において用いられる
ならば、良好に再現される。最も適合した値ΔσH＝−
１６ｐｐｍ及びΔσＮ＝−１６０ｐｐｍは、15Ｎ−1Ｈ
部分における1Ｈ及び15Ｎの実験的に測定された化学シ
フト異方性に密接に対応している：15Ｎ−2Ｄ部分の固
体ＮＭＲ研究を用いて、ΔσDの場合は、−１４ｐｐｍ
（２７）近傍の値及びΔσHの場合は、−１６０ｐｐｍ
（２８）が決定され；独立に、溶液ＮＭＲ実験によっ
て、バックボーンアミド陽子のΔσHについては、−８
〜−１７ｐｐｍの値（Ａ．Ｂａｘ．ｐｅｒｓｏｎａｌ
Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）、ΔσＮの場合は−１７
０ｐｐｍ（１０）近傍の値が得られた。
【００３９】検討 本明細書において記述したｆｔｚホメオドメイン−ＤＮ
Ａ複合体を用いた実験において、埋め込まれたトリプト
ファンのインドール15Ｎ−1Ｈ部分中の15Ｎ及び1ＨNの
全体の横緩和速度は、従来の［15Ｎ，1Ｈ］−ＣＯＳＹ
スキームの代わりにＴＲＯＳＹ型［15Ｎ，1Ｈ］相関実
験を用いた場合、それぞれ６０％及び４０％低減され
た。一見、地味な改善と思えるかもしれないが、子細に
見ると、非置換活性水素原子を2Ｈで置き換えること
（例えば、６，８）によりほとんど完全に抑制可能であ
る遠隔陽子とのＤＤカップリングによって、残存Ｔ2（1
ＨN）緩和の９５％及び残存Ｔ2（15Ｎ）緩和の７５％が
説明される。過重水素化ｆｔｚホメオドメインを有する
対応ＤＮＡ複合体中において、７５０ＭＨｚでのＴＲＯ
ＳＹを用いた15Ｎ−1Ｈ部分のＴ2緩和速度の低減は、1
ＨNの場合約４０倍及び15Ｎの場合約１０倍であろう。
Ａ複合体を用いた実験において、埋め込まれたトリプト
ファンのインドール15Ｎ−1Ｈ部分中の15Ｎ及び1ＨNの
全体の横緩和速度は、従来の［15Ｎ，1Ｈ］−ＣＯＳＹ
スキームの代わりにＴＲＯＳＹ型［15Ｎ，1Ｈ］相関実
験を用いた場合、それぞれ６０％及び４０％低減され
た。一見、地味な改善と思えるかもしれないが、子細に
見ると、非置換活性水素原子を2Ｈで置き換えること
（例えば、６，８）によりほとんど完全に抑制可能であ
る遠隔陽子とのＤＤカップリングによって、残存Ｔ2（1
ＨN）緩和の９５％及び残存Ｔ2（15Ｎ）緩和の７５％が
説明される。過重水素化ｆｔｚホメオドメインを有する
対応ＤＮＡ複合体中において、７５０ＭＨｚでのＴＲＯ
ＳＹを用いた15Ｎ−1Ｈ部分のＴ2緩和速度の低減は、1
ＨNの場合約４０倍及び15Ｎの場合約１０倍であろう。
【００４０】ΔσH＝−１６ｐｐｍ，ΔσN＝−１６０ｐ
ｐｍ、ｒHN＝０．１０１ｎｍである場合の数式［３］、
［７］、［８］、［９］、［１２］及び［１３］と、ベ
クトルｒHNとＣＳＡテンソルの主軸との平行配向とを用
いて、分極化磁場Ｂ0及び分子サイズに対するＴＲＯＳ
Ｙ型実験における15Ｎ及び1Ｈの残存Ｔ２緩和速度の依
存度を評価した。これらの計算によれば、15Ｎ−1Ｈ部
分中のＤＤ及びＣＳＡによるＴ2緩和の略完全な補償
が、１１００ＭＨｚ近傍の1Ｈ周波数に対応するＢ0強度
で得られること、即ち、この磁界強度において、数式
［７］の式中（ｐ−δS）≡０及び（ｐ−δI）≡０であ
ることが示された。理論によれば、さらに、15Ｎ−1Ｈ
フラグメント内のＤＤ及びＣＳＡ相互作用による残存Ｔ
ＲＯＳＹＴ2緩和速度は、ほとんど分子サイズとは独立
であることが予測される。過重水素化タンパク質の場
合、ＴＲＯＳＹ型［15Ｎ，1Ｈ］相関実験に対するサイ
ズの制限は、かくしてＴ2緩和によって大きく決定され
ることはないが、それでもなお、非置換活性タンパク質
部位の重水素化の効果は立体配座に依存していることを
考慮する必要がある。βシート二次構造における15Ｎ−
1Ｈ部分の場合、15Ｎ−1ＨNフラグメント内のＤＤ及び
ＣＳＡ相互作用は、考慮する必要のある横緩和唯一のソ
ースであり、一方αらせんにおいて、二つの連続する1
ＨN陽子（３）は15Ｎ及び1ＨNスピンの横緩和に大きく
寄与する。
ｐｍ、ｒHN＝０．１０１ｎｍである場合の数式［３］、
［７］、［８］、［９］、［１２］及び［１３］と、ベ
クトルｒHNとＣＳＡテンソルの主軸との平行配向とを用
いて、分極化磁場Ｂ0及び分子サイズに対するＴＲＯＳ
Ｙ型実験における15Ｎ及び1Ｈの残存Ｔ２緩和速度の依
存度を評価した。これらの計算によれば、15Ｎ−1Ｈ部
分中のＤＤ及びＣＳＡによるＴ2緩和の略完全な補償
が、１１００ＭＨｚ近傍の1Ｈ周波数に対応するＢ0強度
で得られること、即ち、この磁界強度において、数式
［７］の式中（ｐ−δS）≡０及び（ｐ−δI）≡０であ
ることが示された。理論によれば、さらに、15Ｎ−1Ｈ
フラグメント内のＤＤ及びＣＳＡ相互作用による残存Ｔ
ＲＯＳＹＴ2緩和速度は、ほとんど分子サイズとは独立
であることが予測される。過重水素化タンパク質の場
合、ＴＲＯＳＹ型［15Ｎ，1Ｈ］相関実験に対するサイ
ズの制限は、かくしてＴ2緩和によって大きく決定され
ることはないが、それでもなお、非置換活性タンパク質
部位の重水素化の効果は立体配座に依存していることを
考慮する必要がある。βシート二次構造における15Ｎ−
1Ｈ部分の場合、15Ｎ−1ＨNフラグメント内のＤＤ及び
ＣＳＡ相互作用は、考慮する必要のある横緩和唯一のソ
ースであり、一方αらせんにおいて、二つの連続する1
ＨN陽子（３）は15Ｎ及び1ＨNスピンの横緩和に大きく
寄与する。
【００４１】具体的な図（図４）を提供するために、本
発明者等は、それぞれ１５０ｋＤａ及び８００ｋＤａの
分子量に対応する回転相関時間τc６０及び３２０ｎｓ
を有する1Ｈ2Ｏ溶液中の２つの過重水素化球形タンパク
質に関して1ＨN及び15Ｎ線形を算出した。陽子に関する
共鳴周波数７５０ＭＨｚに対応する磁場Ｂ0が仮定され
た。遠隔陽子とのＤＤ相互作用にとっての可能な最悪の
状態を明らかにするために、二つの陽子が1ＨNから０．
２９ｎｍのところに配置された。15Ｎ二重線の狭い成分
の線幅は、分子量とともにわずかに増大し、１５０ｋＤ
ａの場合５Ｈｚであり、８００ｋＤａタンパク質の場合
１５Ｈｚであった（図４）。1ＨNの線幅は、遠隔陽子と
の残存ＤＤ相互作用にもっと強く影響され、１５０ｋＤ
ａの場合約１５Ｈｚ、８００ｋＤａの場合５０Ｈｚであ
った。１５０ｋＤａタンパク質の場合、これらの数字は
15Ｎ及び1Ｈの広帯域デカップリングを用いた従来の［
15Ｎ，1Ｈ］−ＣＯＳＹ実験と較べて、それぞれ15Ｎ及
び1ＨNＴＲＯＳＹ線幅の１０倍及び４倍に対応する。よ
り大きい分子サイズの場合、図１の実験スキームは、原
則として、ＩＮＥＰＴ移動中のｒｆパルスの１８０°再
集束を除去することによりさらに改善してもよい。なぜ
ならば、ＩＮＥＰＴ混合時間中においては、これらのパ
ルスは、従来の［15Ｎ，1Ｈ］−ＣＯＳＹの全実験中と
同様に、多重線成分を緩慢な及び急速なＴ2緩和で混合
するからである。デカップリングシーケンス及び１８０
°パルスのＴＲＯＳＹ型ＮＭＲパルスシーケンスからの
除去は、将来の試験設計との関連も有していてよい。な
ぜならば、最小の無線周波数発熱及び最大のＢ1均一性
への要請という制約が、その場合、緩和されてよく、感
度又は試料直径などの他のパラメータのよりよい最適化
が可能になるからである。
発明者等は、それぞれ１５０ｋＤａ及び８００ｋＤａの
分子量に対応する回転相関時間τc６０及び３２０ｎｓ
を有する1Ｈ2Ｏ溶液中の２つの過重水素化球形タンパク
質に関して1ＨN及び15Ｎ線形を算出した。陽子に関する
共鳴周波数７５０ＭＨｚに対応する磁場Ｂ0が仮定され
た。遠隔陽子とのＤＤ相互作用にとっての可能な最悪の
状態を明らかにするために、二つの陽子が1ＨNから０．
２９ｎｍのところに配置された。15Ｎ二重線の狭い成分
の線幅は、分子量とともにわずかに増大し、１５０ｋＤ
ａの場合５Ｈｚであり、８００ｋＤａタンパク質の場合
１５Ｈｚであった（図４）。1ＨNの線幅は、遠隔陽子と
の残存ＤＤ相互作用にもっと強く影響され、１５０ｋＤ
ａの場合約１５Ｈｚ、８００ｋＤａの場合５０Ｈｚであ
った。１５０ｋＤａタンパク質の場合、これらの数字は
15Ｎ及び1Ｈの広帯域デカップリングを用いた従来の［
15Ｎ，1Ｈ］−ＣＯＳＹ実験と較べて、それぞれ15Ｎ及
び1ＨNＴＲＯＳＹ線幅の１０倍及び４倍に対応する。よ
り大きい分子サイズの場合、図１の実験スキームは、原
則として、ＩＮＥＰＴ移動中のｒｆパルスの１８０°再
集束を除去することによりさらに改善してもよい。なぜ
ならば、ＩＮＥＰＴ混合時間中においては、これらのパ
ルスは、従来の［15Ｎ，1Ｈ］−ＣＯＳＹの全実験中と
同様に、多重線成分を緩慢な及び急速なＴ2緩和で混合
するからである。デカップリングシーケンス及び１８０
°パルスのＴＲＯＳＹ型ＮＭＲパルスシーケンスからの
除去は、将来の試験設計との関連も有していてよい。な
ぜならば、最小の無線周波数発熱及び最大のＢ1均一性
への要請という制約が、その場合、緩和されてよく、感
度又は試料直径などの他のパラメータのよりよい最適化
が可能になるからである。
【００４２】ＴＲＯＳＹ原理は、信号取り込みを含む全
ＮＭＲ実験を通じて、緩和の主要なソースの全てを急激
に低減し、以前タンパク質中における3ＪHαHβスカラ
ーカップリングの測定（３０）に使用された、異種核間
の双極性緩和を低減するために異種核多量子コヒーレン
スを用いること（２９）とは明瞭に異なっている。異種
核多量子コヒーレンスは、遠隔スピンとの双極性緩和及
びＣＳＡ緩和との影響を受け、それが高分極磁場でのこ
れらのコヒーレンスの使用を制限している。さらに、多
量子コヒーレンスの緩慢な緩和は、信号取り込み中には
使用することができず（１４）、それは、大きい分子の
場合は致命的である。
ＮＭＲ実験を通じて、緩和の主要なソースの全てを急激
に低減し、以前タンパク質中における3ＪHαHβスカラ
ーカップリングの測定（３０）に使用された、異種核間
の双極性緩和を低減するために異種核多量子コヒーレン
スを用いること（２９）とは明瞭に異なっている。異種
核多量子コヒーレンスは、遠隔スピンとの双極性緩和及
びＣＳＡ緩和との影響を受け、それが高分極磁場でのこ
れらのコヒーレンスの使用を制限している。さらに、多
量子コヒーレンスの緩慢な緩和は、信号取り込み中には
使用することができず（１４）、それは、大きい分子の
場合は致命的である。
【００４３】以下は、ＴＲＯＳＹ原理の実際的な応用に
ついてのいくつかの最初の考察である。（ｉ）15Ｎ−1
Ｈ部分の４つの多重線成分のうちのたった１つがＴＲＯ
ＳＹ型実験においては保持されるので、従来の［15Ｎ，
1Ｈ］−ＣＯＳＹは本来的にもっと感度がよい。しか
し、５００ＭＨｚより高い1Ｈ周波数でのタンパク質を
用いた測定の場合、ＴＲＯＳＹははるかに良好なＳＮ比
を示すであろう。（ｉｉ）Ｔｙｒ、Ｐｈｅ及びＴｒｐの
芳香環の13Ｃ−1Ｈ部分を用いたＴＲＯＳＹ型［13Ｃ，1
Ｈ］相関実験は、15Ｈ−1Ｈ部分の場合のもの（未公刊
結果）と比肩しうる結果を与える。（ｉｉｉ）アミド陽
子と芳香族陽子を相関させる２次元ＮＯＥＳＹ実験は、
ＴＲＯＳＹ型異種核相関実験により引き継ぐことが可能
である。好ましい場合、これは現在までアクセス可能で
あったものの数倍の大きさのタンパク質の低解像度構造
が得られる結果となる。（ｉｖ）本発明者等は、共鳴の
割当及び多くの立体配置上の制約のために現在用いられ
ている多様なＮＭＲ実験は、１乃至数次元でのＴＲＯＳ
Ｙアプローチの使用によりより大きい分子サイズに最適
化可能であると予測するものである。
ついてのいくつかの最初の考察である。（ｉ）15Ｎ−1
Ｈ部分の４つの多重線成分のうちのたった１つがＴＲＯ
ＳＹ型実験においては保持されるので、従来の［15Ｎ，
1Ｈ］−ＣＯＳＹは本来的にもっと感度がよい。しか
し、５００ＭＨｚより高い1Ｈ周波数でのタンパク質を
用いた測定の場合、ＴＲＯＳＹははるかに良好なＳＮ比
を示すであろう。（ｉｉ）Ｔｙｒ、Ｐｈｅ及びＴｒｐの
芳香環の13Ｃ−1Ｈ部分を用いたＴＲＯＳＹ型［13Ｃ，1
Ｈ］相関実験は、15Ｈ−1Ｈ部分の場合のもの（未公刊
結果）と比肩しうる結果を与える。（ｉｉｉ）アミド陽
子と芳香族陽子を相関させる２次元ＮＯＥＳＹ実験は、
ＴＲＯＳＹ型異種核相関実験により引き継ぐことが可能
である。好ましい場合、これは現在までアクセス可能で
あったものの数倍の大きさのタンパク質の低解像度構造
が得られる結果となる。（ｉｖ）本発明者等は、共鳴の
割当及び多くの立体配置上の制約のために現在用いられ
ている多様なＮＭＲ実験は、１乃至数次元でのＴＲＯＳ
Ｙアプローチの使用によりより大きい分子サイズに最適
化可能であると予測するものである。
【００４４】付録：ＴＲＯＳＹの定量分析 図１のパルスシーケンス中のコヒーレンス移動は、プロ
グラムＰＯＭＡ（３２）において手段を与えられた製品
オペレータ形式（product operator formalism）（３
１）を用いて評価し、ｒｆパルス及び受信機のその結果
の位相は（３３）に応じて実験パルスプログラム中に転
送された。最初の９０°パルスの陽子への印加（図１に
おけるａ）後の横方向陽子磁化は、次に、下記の数式
［１５］により与えられる： σ（ａ）＝−Ｉy ［１５］ 遅延２τ1の間、スカラーカップリング1Ｊ（1Ｈ，
15Ｎ）が展開し、その結果、最初の９０°（15Ｎ）パル
スは２スピンコヒーレンスを発生させる。τ1＝１／
（４1Ｊ（1Ｈ、15Ｎ））を用いて、時間ｂにおいて、位
相サイクル（図１）の第１のステップについて、下記を
得た：σ1（ｂ）＝２ＩzＳx＝ＩzＳ- ＋ ＩZＳ
+ （ψ１ ＝ ｙ） ［１６］緩和を含む期間ｔ１中の
これらの項の展開は、前記単一遷移ベース演算子（前記
化学式［１］及び［２］）を用いて評価した：
グラムＰＯＭＡ（３２）において手段を与えられた製品
オペレータ形式（product operator formalism）（３
１）を用いて評価し、ｒｆパルス及び受信機のその結果
の位相は（３３）に応じて実験パルスプログラム中に転
送された。最初の９０°パルスの陽子への印加（図１に
おけるａ）後の横方向陽子磁化は、次に、下記の数式
［１５］により与えられる： σ（ａ）＝−Ｉy ［１５］ 遅延２τ1の間、スカラーカップリング1Ｊ（1Ｈ，
15Ｎ）が展開し、その結果、最初の９０°（15Ｎ）パル
スは２スピンコヒーレンスを発生させる。τ1＝１／
（４1Ｊ（1Ｈ、15Ｎ））を用いて、時間ｂにおいて、位
相サイクル（図１）の第１のステップについて、下記を
得た：σ1（ｂ）＝２ＩzＳx＝ＩzＳ- ＋ ＩZＳ
+ （ψ１ ＝ ｙ） ［１６］緩和を含む期間ｔ１中の
これらの項の展開は、前記単一遷移ベース演算子（前記
化学式［１］及び［２］）を用いて評価した：
【００４５】
【数１５】
【００４６】
【数１６】 これらの演算子の予期値の時間的展開は、数式［３］に
数式［１６］から導き出された初期状態と１／Ｔ1I≪1
Ｊ（1Ｈ，15Ｎ）という想定を組み込むことにより得ら
れ、その結果、時間ｃにおける下記の密度マトリックス
が得られる。
数式［１６］から導き出された初期状態と１／Ｔ1I≪1
Ｊ（1Ｈ，15Ｎ）という想定を組み込むことにより得ら
れ、その結果、時間ｃにおける下記の密度マトリックス
が得られる。
【００４７】
【数１７】 緩和因子Ｒijは下記の数式［２０］及び［２１］により
多重線成分の個々の緩和速度に関連づけられる： Ｒjk ＝ Ｒjkjk ＋ １／Ｔ2S ＋ １／（２Ｔ1I） （ｊｋ ＝ １２， ３４） ［２０］ Ｒjk ＝ Ｒjkjk ＋ １／Ｔ2I ＋ １／（２Ｔ1S） （ｊｋ ＝ １３， ２４） ［２１］ その後の分極化移動段階（図１における期間ｃ〜ｄ）
は、展開期ｔ1を検出（データ取り込み）期ｔ2とリンク
づける。時点ｃにおける濃度マトリックスは下記の数式
［２２］により表され、式中、データ取り込み時の検出
可能な信号となるΓ及びΓＳzのコヒーレンスのみが保
持される。
多重線成分の個々の緩和速度に関連づけられる： Ｒjk ＝ Ｒjkjk ＋ １／Ｔ2S ＋ １／（２Ｔ1I） （ｊｋ ＝ １２， ３４） ［２０］ Ｒjk ＝ Ｒjkjk ＋ １／Ｔ2I ＋ １／（２Ｔ1S） （ｊｋ ＝ １３， ２４） ［２１］ その後の分極化移動段階（図１における期間ｃ〜ｄ）
は、展開期ｔ1を検出（データ取り込み）期ｔ2とリンク
づける。時点ｃにおける濃度マトリックスは下記の数式
［２２］により表され、式中、データ取り込み時の検出
可能な信号となるΓ及びΓＳzのコヒーレンスのみが保
持される。
【００４８】
【数１８】 図１の位相サイクルのその他の段階は類似の仕方で分析
可能である。パルスシーケンスの８個の遷移状態の積算
によりインターフェログラムの実数部分に関し下記のス
ペクトル濃度マトリックスが得られる：
可能である。パルスシーケンスの８個の遷移状態の積算
によりインターフェログラムの実数部分に関し下記のス
ペクトル濃度マトリックスが得られる：
【００４９】
【数１９】 位相ψ１を各離散値ｔ1で９０°だけインクリメントす
ることにより対応する虚数部分が得られる：
ることにより対応する虚数部分が得られる：
【００５０】
【数２０】 式［２３］及び［２４］は組み合わされて、ω1次元に
おける純粋な位相相関を表す多元インターフェログラム
になる。
おける純粋な位相相関を表す多元インターフェログラム
になる。
【００５１】検出期ｔ2中の1ＨNコヒーレンスの緩和の
処理は、ｔ1中（「理論」参照）の15Ｎの処理と類似し
ている。期間ｔ2中に受信されるΓ及びΓＳZのコヒーレ
ンスによって発生する信号は、下記の数式［２５］及び
［２６］によりそれぞれ記述される：
処理は、ｔ1中（「理論」参照）の15Ｎの処理と類似し
ている。期間ｔ2中に受信されるΓ及びΓＳZのコヒーレ
ンスによって発生する信号は、下記の数式［２５］及び
［２６］によりそれぞれ記述される：
【００５２】
【数２１】
【００５３】
【数２２】 式中Ａは、比例定数である。数式［２５］及び［２６］
を数式［２３］及び［２４］に代入すると1Ｈ，15Ｎス
ピン系の１→２及び２→４遷移に対応する多次元インタ
ーフェログラムが得られる：
を数式［２３］及び［２４］に代入すると1Ｈ，15Ｎス
ピン系の１→２及び２→４遷移に対応する多次元インタ
ーフェログラムが得られる：
【００５４】
【数２３】 最後に、数式［２７］により表される多次元インターフ
ェログラムのフーリエ変換により、15Ｎ−1Ｈの多重線
の所望の個別的成分に対応するω1及びω2において共鳴
周波数を有する純粋な吸収相関スペクトルが得られる。 参考文献 1. Shulman, R.G., Ogawa, S., Wuthrich, K., Yaman
e, T., Peisach, J. & Blumberg, W.E. (1969) Science
165, 251-257. 2. Arata, Y., Kato, K., Takahashi, H. & Shimada,
I. (1994) Methods in Enzymology 239, 440-464. 3. Wuthrich, K. (1986) NMR of Proteins and Nuclei
c Acids (Wiley, New York). 4. Wuthrich, K. (1995) NMR in Structural Biology
(World Scientific, Singapore). 5. Wuthrich, K. (1995) Acta Cryst. D 51, 249-270. 6. Shan, X., Gardner, K.H., Muhandiram, D.R., Ra
o, N.S., Arrowsmith, C.H. & Kay, L.E. (1996) J. A
m. Chem. Soc. 118, 6570-6579. 7. Wagner, G. (1993) J. Biomol. NMR 3, 375-385. 8. Nietlispach, D., Clowes, R.T., Broadhurst, R.
W., Ito, Y., Keeler, J., Kelly, M., Ashurst, J., O
schkinat, H., Domaille, P.J. & Laue, E.D. (1996)
J. Am. Chem. Soc. 118, 407-415. 9. Gueron, M., Leroy, J.L. & Griffey, R.H. (1983)
J. Am. Chem. Soc. 105, 7262-7266. 10. Tjandra, N., Szabo, A. & Bax, A. (1996) J. Am.
Chem. Soc. 118, 6986-6991. 11. Farrar, T.C. & Stringfellow, T.C. (1996) in En
cyclopedia of NMR, eds. Grant, D.M. & Harris, R.K.
(Wiley, New York), vol. 6, pp.4101-4107. 12. Vold, R.R. & Vold, R.L. (1978) Prog. NMR Spect
rosc. 12, 79-133. 13. Ernst, R.R., Bodenhausen, G. & Wokaun, A. (198
7) The Principles of Nuclear Mangetic Resonance in
One and Two Dimensions (Clarendon Press, Oxford). 14. Abragam, A. (1961) The Principles of Nuclear M
agnetism. (Clarendon Press, Oxford). 15. Goldman, M. (1984) J. Magn. Reson. 60, 437-45
2. 16. London, R.E. (1990) J. Magn. Reson. 86, 410-41
5. 17. Peng, J.W. & Wagner, G. (1992) J. Magn. Reson.
98, 308-332. 18. Percival-Smith, A., Muller, M., Affolter, M. &
Gehring, W.J. (1990)EMBO J. 9, 3967-3974. 19. Qian, Y.Q., Furukubo-Tokunaga, K., Resendez-Pe
rez, D., Muller, M., Gehring, W.J. & Wuthrich, K.
(1994) J. Mol. Biol. 238, 333-345. 20. Kay, L.E., Torchia, D.A. & Bax, A. (1989) Bioc
hemistry 28, 8972-8979. 21. Farrow, N.A. Muhandiram, R., Singer, A.U., Pas
cal, S.M., Kay, C.M.,Gish, G., Shoelson, S.E., Paw
son, T., Forman-Kay, J.D., & Kay, L.E. (1994) Bioc
hemistry 33, 5984-6003. 22. Muller, L., (1979) J. Am. Chem. Soc. 101, 4481
-4484. 23. Bodenhausen, G. & Ruben, D.J. (1980) Chem. Phy
s. Lett. 69, 185-189. 24. Bystrov, V.F. (1976) Prog. NMR Spectrosc. 10,
41-81. 25. Palmer, A.G., Skelton, N.J., Chazin, W.J., Wri
ght, P.E. & Rance, M.(1992) Mol. Phys. 75, 699-71
1. 26. Kay, L.E., Nicholson, L.K., Delaglio, F., Bax,
A. & Torchia, D.A. (1992) J. Magn. Reson. 87, 359
-375. 27. Michal, C.A., Wehman, J.C., Jelinski, L.W., (1
996) J. Magn. Reson. Ser. B. 111, 31-39. 28. Hiyama, Y., Niu, C., Silverton, J.V., Bavoso,
A. & Torchia, D.A. (1988) J. Am. Chem. Soc. 110, 2
378-2383. 29. Griffey, R.H. & Redfield, A.G. (1987) Quart. R
ev. Biophys. 19, 51-82. 30. Grzesiek, S., Kuboniwa, H., Hinch, A.P. & Bax
A. (1995) J. Am. Chem.Soc. 117, 5312-5315. 31. Sorensen. O.W., Eich, G.W., Levitt, M.H., Bode
nhausen, G. & Ernst R.R. (1983) Prog. NMR Spectros
c. 16, 163-192. 32. Guntert, P., Schaefer, N., Otting., G & Wuthri
ch, K. (1993) J. Magn.Reson. 101, 103-105. 33. Levitt, M.H. (1997) J. Magn, Reson, 126, 164-1
82. 34. Piotto, M., Saudek, V. & Sklenar, V.J. (1992)
J. Biomol. NMR 2, 661-665.
ェログラムのフーリエ変換により、15Ｎ−1Ｈの多重線
の所望の個別的成分に対応するω1及びω2において共鳴
周波数を有する純粋な吸収相関スペクトルが得られる。 参考文献 1. Shulman, R.G., Ogawa, S., Wuthrich, K., Yaman
e, T., Peisach, J. & Blumberg, W.E. (1969) Science
165, 251-257. 2. Arata, Y., Kato, K., Takahashi, H. & Shimada,
I. (1994) Methods in Enzymology 239, 440-464. 3. Wuthrich, K. (1986) NMR of Proteins and Nuclei
c Acids (Wiley, New York). 4. Wuthrich, K. (1995) NMR in Structural Biology
(World Scientific, Singapore). 5. Wuthrich, K. (1995) Acta Cryst. D 51, 249-270. 6. Shan, X., Gardner, K.H., Muhandiram, D.R., Ra
o, N.S., Arrowsmith, C.H. & Kay, L.E. (1996) J. A
m. Chem. Soc. 118, 6570-6579. 7. Wagner, G. (1993) J. Biomol. NMR 3, 375-385. 8. Nietlispach, D., Clowes, R.T., Broadhurst, R.
W., Ito, Y., Keeler, J., Kelly, M., Ashurst, J., O
schkinat, H., Domaille, P.J. & Laue, E.D. (1996)
J. Am. Chem. Soc. 118, 407-415. 9. Gueron, M., Leroy, J.L. & Griffey, R.H. (1983)
J. Am. Chem. Soc. 105, 7262-7266. 10. Tjandra, N., Szabo, A. & Bax, A. (1996) J. Am.
Chem. Soc. 118, 6986-6991. 11. Farrar, T.C. & Stringfellow, T.C. (1996) in En
cyclopedia of NMR, eds. Grant, D.M. & Harris, R.K.
(Wiley, New York), vol. 6, pp.4101-4107. 12. Vold, R.R. & Vold, R.L. (1978) Prog. NMR Spect
rosc. 12, 79-133. 13. Ernst, R.R., Bodenhausen, G. & Wokaun, A. (198
7) The Principles of Nuclear Mangetic Resonance in
One and Two Dimensions (Clarendon Press, Oxford). 14. Abragam, A. (1961) The Principles of Nuclear M
agnetism. (Clarendon Press, Oxford). 15. Goldman, M. (1984) J. Magn. Reson. 60, 437-45
2. 16. London, R.E. (1990) J. Magn. Reson. 86, 410-41
5. 17. Peng, J.W. & Wagner, G. (1992) J. Magn. Reson.
98, 308-332. 18. Percival-Smith, A., Muller, M., Affolter, M. &
Gehring, W.J. (1990)EMBO J. 9, 3967-3974. 19. Qian, Y.Q., Furukubo-Tokunaga, K., Resendez-Pe
rez, D., Muller, M., Gehring, W.J. & Wuthrich, K.
(1994) J. Mol. Biol. 238, 333-345. 20. Kay, L.E., Torchia, D.A. & Bax, A. (1989) Bioc
hemistry 28, 8972-8979. 21. Farrow, N.A. Muhandiram, R., Singer, A.U., Pas
cal, S.M., Kay, C.M.,Gish, G., Shoelson, S.E., Paw
son, T., Forman-Kay, J.D., & Kay, L.E. (1994) Bioc
hemistry 33, 5984-6003. 22. Muller, L., (1979) J. Am. Chem. Soc. 101, 4481
-4484. 23. Bodenhausen, G. & Ruben, D.J. (1980) Chem. Phy
s. Lett. 69, 185-189. 24. Bystrov, V.F. (1976) Prog. NMR Spectrosc. 10,
41-81. 25. Palmer, A.G., Skelton, N.J., Chazin, W.J., Wri
ght, P.E. & Rance, M.(1992) Mol. Phys. 75, 699-71
1. 26. Kay, L.E., Nicholson, L.K., Delaglio, F., Bax,
A. & Torchia, D.A. (1992) J. Magn. Reson. 87, 359
-375. 27. Michal, C.A., Wehman, J.C., Jelinski, L.W., (1
996) J. Magn. Reson. Ser. B. 111, 31-39. 28. Hiyama, Y., Niu, C., Silverton, J.V., Bavoso,
A. & Torchia, D.A. (1988) J. Am. Chem. Soc. 110, 2
378-2383. 29. Griffey, R.H. & Redfield, A.G. (1987) Quart. R
ev. Biophys. 19, 51-82. 30. Grzesiek, S., Kuboniwa, H., Hinch, A.P. & Bax
A. (1995) J. Am. Chem.Soc. 117, 5312-5315. 31. Sorensen. O.W., Eich, G.W., Levitt, M.H., Bode
nhausen, G. & Ernst R.R. (1983) Prog. NMR Spectros
c. 16, 163-192. 32. Guntert, P., Schaefer, N., Otting., G & Wuthri
ch, K. (1993) J. Magn.Reson. 101, 103-105. 33. Levitt, M.H. (1997) J. Magn, Reson, 126, 164-1
82. 34. Piotto, M., Saudek, V. & Sklenar, V.J. (1992)
J. Biomol. NMR 2, 661-665.
【００５５】
【発明の効果】以上説明したように、本発明の横緩和最
適化分光法(ＴＲＯＳＹ)は様々の多次元溶液ＮＭＲ実
験、特に現在利用可能なものよりもさらに若干高い極性
化磁場の将来の使用について役立つはずであり、かくし
てより巨大な分子を用いた作業を制限する重要な要因を
大きく除去することができる。
適化分光法(ＴＲＯＳＹ)は様々の多次元溶液ＮＭＲ実
験、特に現在利用可能なものよりもさらに若干高い極性
化磁場の将来の使用について役立つはずであり、かくし
てより巨大な分子を用いた作業を制限する重要な要因を
大きく除去することができる。
【図１】本発明の実施の一形態に係るＴＲＯＳＹ型２次
元1Ｈ，15Ｎ相関分光法の実験的スキームを示す図であ
る。1Ｈ及び15Ｎで示された列中、狭い及び広いバー
は、それぞれ非選択的９０°及び１８０°ｒｆパルスを
表す。曲線状の形状で示されている二つのオフレゾナン
スｒｆパルスを用いて、ＷＡＴＥＲＧＡＴＥ（３４）に
より水抑制（Water suppression）が達成された。1Ｈ及
び15Ｎキャリヤー周波数は、それぞれ９及び１２７ｐｐ
ｍに配された。遅延τ1は、１／４（４1Ｊ（1Ｈ，
15Ｎ））＝２．７ｍｓに対応する。使用された位相は、
ψ1＝｛ｙ，−ｙ，−ｘ，ｘ，ｙ，−ｙ，−ｘ，ｘ｝；
ψ2＝｛４（ｘ），４（−ｘ）｝；φ1＝｛４（ｙ），４
（−ｙ）｝；φ2（受信機）＝｛ｘ，−ｘ，−ｙ，ｙ，
ｘ，−ｘ，ｙ，−ｙ｝；その他全てのパルスに対してｘ
である。ＰＦＧで示された列は、ｚ軸に沿って印加され
た磁場の勾配を示し、Ｇ1，振幅＝３０Ｇ／ｃｍ，持続
時間＝０．４ｍｓ；Ｇ2，−６０Ｇ／ｃｍ，１ｍｓ；
Ｇ3，５０Ｇ／ｃｍ，０．４ｍｓ；Ｇ4，４８Ｇ／ｃｍ，
０．６ｍｓであった。２つのＦＩＤは、ｔ1遅延毎に、
ψ1を中間で９０°インクリメントして記録され、ｔ1に
おけるインターフェログラムの実数及び虚数部として保
存された。フーリエ変換により、両方の核に対してもっ
とも緩慢なＴ2緩和速度を有する４つの線の15Ｎ−1Ｈ多
重線の成分のみを含む２次元1Ｈ，15Ｎ相関スペクトル
が得られた。
元1Ｈ，15Ｎ相関分光法の実験的スキームを示す図であ
る。1Ｈ及び15Ｎで示された列中、狭い及び広いバー
は、それぞれ非選択的９０°及び１８０°ｒｆパルスを
表す。曲線状の形状で示されている二つのオフレゾナン
スｒｆパルスを用いて、ＷＡＴＥＲＧＡＴＥ（３４）に
より水抑制（Water suppression）が達成された。1Ｈ及
び15Ｎキャリヤー周波数は、それぞれ９及び１２７ｐｐ
ｍに配された。遅延τ1は、１／４（４1Ｊ（1Ｈ，
15Ｎ））＝２．７ｍｓに対応する。使用された位相は、
ψ1＝｛ｙ，−ｙ，−ｘ，ｘ，ｙ，−ｙ，−ｘ，ｘ｝；
ψ2＝｛４（ｘ），４（−ｘ）｝；φ1＝｛４（ｙ），４
（−ｙ）｝；φ2（受信機）＝｛ｘ，−ｘ，−ｙ，ｙ，
ｘ，−ｘ，ｙ，−ｙ｝；その他全てのパルスに対してｘ
である。ＰＦＧで示された列は、ｚ軸に沿って印加され
た磁場の勾配を示し、Ｇ1，振幅＝３０Ｇ／ｃｍ，持続
時間＝０．４ｍｓ；Ｇ2，−６０Ｇ／ｃｍ，１ｍｓ；
Ｇ3，５０Ｇ／ｃｍ，０．４ｍｓ；Ｇ4，４８Ｇ／ｃｍ，
０．６ｍｓであった。２つのＦＩＤは、ｔ1遅延毎に、
ψ1を中間で９０°インクリメントして記録され、ｔ1に
おけるインターフェログラムの実数及び虚数部として保
存された。フーリエ変換により、両方の核に対してもっ
とも緩慢なＴ2緩和速度を有する４つの線の15Ｎ−1Ｈ多
重線の成分のみを含む２次元1Ｈ，15Ｎ相関スペクトル
が得られた。
【図２】1Ｈ周波数の７５０ＭＨｚで測定された、４°
Ｃ，ｐＨ＝６．０の９５％Ｈ2Ｏ／５％2Ｈ2Ｏにおける
非標識１４−ｂｐＤＮＡ二重鎖で複合化した２ｍＭの均
一に15Ｎ標識付けされたｆｔｚホメオドメインの溶液中
で記録されたＴｒｐ４８のインドール15Ｎ−1Ｈスピン
系を示す15Ｎ，1Ｈ相関スペクトルの外形プロットであ
る。（ａ）従来の広域デカップリングされた［15Ｎ，1
Ｈ］−ＣＯＳＹスペクトル（２２，２３）を示す。1Ｊ
（1Ｈ，15Ｎ）スカラーカップリングによる展開は、15
Ｎ展開時期ｔ1の１８０°陽子パルスによりそしてデー
タ取り込み中の15ＮのＷＡＬＴＺ複合パルスデカップリ
ングによりω1及びω2次元で再集束された。（ｂ）期間
ｔ１及びｔ２中のデカップリングなしで記録された従来
の［15Ｎ，1Ｈ］−ＣＯＳＹスペクトルを示す。（ｃ）
図１のパルススキームを用いて記録されたＴＲＯＳＹ型
15Ｎ，1Ｈ相関スペクトルを示す。ｐｐｍでのＤＳＳに
対する化学シフト及び多重線の中心に対するＨｚでのシ
フトは両方の次元で示される。矢印は、図３に示す断面
の位置を同定する。
Ｃ，ｐＨ＝６．０の９５％Ｈ2Ｏ／５％2Ｈ2Ｏにおける
非標識１４−ｂｐＤＮＡ二重鎖で複合化した２ｍＭの均
一に15Ｎ標識付けされたｆｔｚホメオドメインの溶液中
で記録されたＴｒｐ４８のインドール15Ｎ−1Ｈスピン
系を示す15Ｎ，1Ｈ相関スペクトルの外形プロットであ
る。（ａ）従来の広域デカップリングされた［15Ｎ，1
Ｈ］−ＣＯＳＹスペクトル（２２，２３）を示す。1Ｊ
（1Ｈ，15Ｎ）スカラーカップリングによる展開は、15
Ｎ展開時期ｔ1の１８０°陽子パルスによりそしてデー
タ取り込み中の15ＮのＷＡＬＴＺ複合パルスデカップリ
ングによりω1及びω2次元で再集束された。（ｂ）期間
ｔ１及びｔ２中のデカップリングなしで記録された従来
の［15Ｎ，1Ｈ］−ＣＯＳＹスペクトルを示す。（ｃ）
図１のパルススキームを用いて記録されたＴＲＯＳＹ型
15Ｎ，1Ｈ相関スペクトルを示す。ｐｐｍでのＤＳＳに
対する化学シフト及び多重線の中心に対するＨｚでのシ
フトは両方の次元で示される。矢印は、図３に示す断面
の位置を同定する。
【図３】図２（実線）のスペクトル中の断面を示す。異
なるスペクトル中の線幅の比較を容易にするために、断
面を同じ最大信号振幅に正規化した。（ａ１），（ａ
２），．．．図２の矢印に関する。シミュレートされた
線形（（ａ）及び（ｂ）中の破線）は、1Ｊ（1Ｈ，
15Ｎ）＝−１０５Ｈｚ、回転相関時間τc＝２０ｎｓ、
及び化学シフト異方性ΔσH＝−１６ｐｐｍ及びσΔN＝
−１６０ｐｐｍを用いて算出された。遠隔スカラーカッ
プリング2Ｊ（1Ｈδ1，15Ｎε1）＝−５Ｈｚが15Ｎ線形
（２４）のシミュレーションに含められたが、小さなス
カラーカップリング3Ｊ（1Ｈδ1，1Ｈε1）及び3Ｊ（1
Ｈζ2，15Ｎε1）の可能な効果は無視された。1ＨNの場
合は、非重水素化複合体中の他の陽子とのＤＤカップリ
ングによる緩和は、1ＨNから０．２４ｎｍの距離に配置
された３個の陽子によって、概算された。
なるスペクトル中の線幅の比較を容易にするために、断
面を同じ最大信号振幅に正規化した。（ａ１），（ａ
２），．．．図２の矢印に関する。シミュレートされた
線形（（ａ）及び（ｂ）中の破線）は、1Ｊ（1Ｈ，
15Ｎ）＝−１０５Ｈｚ、回転相関時間τc＝２０ｎｓ、
及び化学シフト異方性ΔσH＝−１６ｐｐｍ及びσΔN＝
−１６０ｐｐｍを用いて算出された。遠隔スカラーカッ
プリング2Ｊ（1Ｈδ1，15Ｎε1）＝−５Ｈｚが15Ｎ線形
（２４）のシミュレーションに含められたが、小さなス
カラーカップリング3Ｊ（1Ｈδ1，1Ｈε1）及び3Ｊ（1
Ｈζ2，15Ｎε1）の可能な効果は無視された。1ＨNの場
合は、非重水素化複合体中の他の陽子とのＤＤカップリ
ングによる緩和は、1ＨNから０．２４ｎｍの距離に配置
された３個の陽子によって、概算された。
【図４】２０°Ｃ、1Ｈ周波数の７５０ＭＨｚでの、Ｈ2
Ｏ溶液中の大きいタンパク質について、図３b1及びｂ２
のタイプの［15Ｎ，1Ｈ］−ＣＯＳＹ実験における15Ｎ
−1Ｈ部分の1ＨN及び15Ｎの広い及び狭い多重線成分に
ついて予測された1Ｈ及び15Ｎ線形を示す。（ａ１）及
び（ａ２）：サイズ１５０ｋＤＡの球形タンパク質を示
す。計算には、回転相関時間６０ｎｓ、ΔσH＝−１６
ｐｐｍ及びΔσN＝−１６０ｐｐｍが使用され、全ての
非置換活性化陽子は、重陽子により置き換えられた。他
の置換活性陽子とのＤＤカップリングによる緩和は、２
つの陽子を1ＨNから０．２９ｎｍの距離におくことによ
りモデル化された。半分の高さの全線幅が示される。
（ｂ１）及び（ｂ２）：サイズ８００ｋＤａの球形タン
パク質を示す。計算には、τc＝３２０ｎｓ及びその他
の点では（ａ）と同じパラメータが使用された。
Ｏ溶液中の大きいタンパク質について、図３b1及びｂ２
のタイプの［15Ｎ，1Ｈ］−ＣＯＳＹ実験における15Ｎ
−1Ｈ部分の1ＨN及び15Ｎの広い及び狭い多重線成分に
ついて予測された1Ｈ及び15Ｎ線形を示す。（ａ１）及
び（ａ２）：サイズ１５０ｋＤＡの球形タンパク質を示
す。計算には、回転相関時間６０ｎｓ、ΔσH＝−１６
ｐｐｍ及びΔσN＝−１６０ｐｐｍが使用され、全ての
非置換活性化陽子は、重陽子により置き換えられた。他
の置換活性陽子とのＤＤカップリングによる緩和は、２
つの陽子を1ＨNから０．２９ｎｍの距離におくことによ
りモデル化された。半分の高さの全線幅が示される。
（ｂ１）及び（ｂ２）：サイズ８００ｋＤａの球形タン
パク質を示す。計算には、τc＝３２０ｎｓ及びその他
の点では（ａ）と同じパラメータが使用された。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１１年１月１４日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３４】ＴＲＯＳＹ（横緩和最適化分光法）のアプ
ローチ（図１）及び従来の［15Ｎ， 1Ｈ］−ＣＯＳＹ
（２２，２３）実験は、1Ｈ及び15Ｎの共鳴を相関させ
るのに用いられた。全てのスペクトルについて、ｔ1max
＝９０ｍｓ及びｔ2max＝１７１ｍｓが用いられた。ＴＲ
ＯＳＹにおいては、Ｉ，Ｓスピン系の1ＪISスカラーカ
ップリングによる展開は、ｔ1及びｔ2中には、再集束化
（refocus）することをせず、これらの期間中の交差相
関緩和の抑制を回避した。２Ｄ多重線のもっともゆっく
り緩和する成分のみ含む純粋な吸収スペクトルを得るた
めに、図１のスキームが用いられた（付録：ＴＲＯＳＹ
の定量分析も参照）。
ローチ（図１）及び従来の［15Ｎ， 1Ｈ］−ＣＯＳＹ
（２２，２３）実験は、1Ｈ及び15Ｎの共鳴を相関させ
るのに用いられた。全てのスペクトルについて、ｔ1max
＝９０ｍｓ及びｔ2max＝１７１ｍｓが用いられた。ＴＲ
ＯＳＹにおいては、Ｉ，Ｓスピン系の1ＪISスカラーカ
ップリングによる展開は、ｔ1及びｔ2中には、再集束化
（refocus）することをせず、これらの期間中の交差相
関緩和の抑制を回避した。２Ｄ多重線のもっともゆっく
り緩和する成分のみ含む純粋な吸収スペクトルを得るた
めに、図１のスキームが用いられた（付録：ＴＲＯＳＹ
の定量分析も参照）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ローラント リーク スイス国 リッケンバッハ ツェー・ハー −6432 アラーハイリゲン 17 (72)発明者 クルト ビュートリッヒ スイス国 バリゼーリン ツェー・ハー− 8304 フリーダーシュトラーセ ７
Claims (10)
- 【請求項１】 異種核スピン系であって、特に、大きい
分子、とりわけ溶液中の生物学的巨大分子からなる異種
核スピン系の核磁気共鳴（ＮＭＲ）相関スペクトルを得
る方法であって、前記スピン系は、均一な磁場Ｂ0にお
かれ、一連の無線周波数（ｒｆ）パルスの照射を受ける
方法において、 前記スピン系は、互いに結合されている少なくとも２種
類のスピン１／２核Ｉ及びＳから成り、それにより、前
記一連のｒｆパルスは、観察されたスペクトル中で横緩
和（Ｔ2）によって線の広がりが前記スピンの双極子−
双極子（ＤＤ）カップリングと化学シフト異方性（ＣＳ
Ａ）との交差相関のため大幅に低減し、前記スピン系の
個別の多重線成分の異なる緩和速度を生じるように選択
され、また、前記２つの異なるメカニズムの緩和効果が
大きく互いにうち消し合うように選択されることを特徴
とする方法。 - 【請求項２】 前記一連のｒｆパルスは、第１の種類の
スピン１／２核Ｉに影響を与える第１の非選択的９０°
パルスと、それに続く遅延時間τ1と、それぞれスピン
１／２核Ｉ及びＳに影響を与える２つの非選択的１８０
°パルスと、それに続くもう一つの遅延時間τ1と、前
記第１の種類の核Ｉに影響を与える第２の非選択的９０
°パルスと、第２の種類の核Ｓに作用する第１の位相サ
イクル化された９０°パルスψ1と、それに続く展開時
間ｔ1と、前記第１の種類の核Ｉに作用する第１の位相
サイクル化されたψ1と、それに続く遅延時間τ1と、両
方の種類の核Ｉ及びＳにそれぞれ影響を与える２つの非
選択的１８０°パルスと、それに続くもう一つの遅延時
間τ1と、それぞれ核Ｉ及びＳに影響を与える２つの非
選択的９０°パルスと、それに続く遅延時間τ1と、そ
れぞれ核Ｉ及びＳに影響を与える２つの非選択的１８０
°パルスと、それに続く遅延時間τ1と、前記第２の種
類の核Ｓに作用する第２の位相サイクル化されたパルス
ψ2とからなり、期間ｔ2内のデータ検出が続くことを特
徴とする請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 異なる強さの磁場勾配Ｇ1，Ｇ2，Ｇ3、
Ｇ4が前記遅延時間間隔τ1の少なくとも一部の期間中に
印加され、前記磁場勾配Ｇ２は、前記第２の種類の核Ｓ
に作用する前記第１の位相サイクル化されたパルスψ1
を照射する直前に印加されることを特徴とする請求項２
の方法。 - 【請求項４】 再集束化は前記展開期ｔ1及び前記検出
期ｔ2中には、前記Ｉ，Ｓスピン系に関して実行され
ず、かくして異なる緩和速度の平均化とこれらの期間中
のＤＤ及びＣＳＡ干渉の除去を回避することを特徴とす
る請求項２又３記載の方法。 - 【請求項５】 ＩＮＥＰＴ移動中の１８０°再集束ｒｆ
パルス及び全ての展開期が、好適なｒｆパルスシーケン
ス中で除去されることを特徴とする請求項４記載の方
法。 - 【請求項６】 前記一連のｒｆパルスは、溶液のＮＭＲ
信号を抑制するのに適合した部分を含むことを特徴とす
る請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項７】 前記一連のｒｆパルスは、水のＮＭＲ信
号を抑制するのに適合した部分、特にデータ検出の直前
の前記シーケンスの終わりの２つのオフレゾナンスｒｆ
パルスからなるいわゆる“ＷＡＴＥＲＧＡＴＥ"サブシ
ーケンスを含んで成ることを特徴とする請求項６記載の
方法。 - 【請求項８】 もっぱら多重線成分のＮＭＲ信号を記録
し、その残存線幅は、ほとんど全て、タンパク質中の遠
隔水素原子とのＤＤ相互作用によることを特徴とする請
求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項９】 前記ＤＤ相互作用は、2Ｈ標識付けによ
り低減されることを特徴とする請求項８項に記載の方
法。 - 【請求項１０】 得られた異種核相関スペクトルは、第
２の実験により引き継ぐために用いられ、特に、アミド
陽子と芳香族陽子とを相関させるＮＯＥＳＹ実験により
引き継ぐために用いられることを特徴とする請求項１〜
９のいずれか１項に記載の方法。
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